ES2270758T3 - Construccion de adn para la expresion especifica de tejido de un factor de coagulacion de la sangre. - Google Patents
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Abstract
La construcción de ADN para la expresión específica de tejido de un factor de coagulación de la sangre que comprende un ADN que codifica una secuencia aminoacídica de un factor de coagulación de la sangre y un ADN que codifica un promotor, que es específico para la expresión en las células del linaje de las plaquetas.
Description
Construcción de ADN para la expresión específica
de tejido de un factor de coagulación de la sangre.
El sujeto del invento es una construcción de ADN
para la expresión específica de tejido de un factor de coagulación
de la sangre.
Es sabido que el factor IX (FIX) es una
glicoproteína dependiente de la vitamina K que es producida por
hepatocitos y secretado en la circulación sanguínea (Karachi y
otros, 1995; Salier y otros, 1990). El gen FIX está
localizado en el cromosoma X y contiene 8 exones y 7 intrones
(Camerino y otros, 1984; Boyd y otros, 1984; Yoshitake y
otros, 1985). La ausencia o deficiencia del factor IX causa un
trastorno de sangramiento severo llamado hemofilia B (Roberts y
otros, 1993).
La hemofilia B es un trastorno que surge de las
modificaciones de un único gen conocido. Fue por tanto propuesto
anteriormente como una diana potencial para la terapia génica. Las
células elegidas como diana tienen que ser accesibles fácilmente
para la transferencia de genes y tienen que ser capaces de expresar
el factor IX en un nivel significante. En estas células diana, la
molécula FIX tiene que ser modificada para convertirse en un factor
de coagulación activo (\gamma-carboxilación y
corte del propéptido). Varias células diana potenciales fueron
ensayadas tales como células hepáticas (Nakai y otros, 1998),
queratinocitos (White y otros, 1998), células musculares
(Baru y otros, 1995; Wang y otros 1997), células de
estroma de médula ósea (Cherington y otros, 1998). In
vitro, la línea celular de leucemia mieloide humana (HL60)
transfectadas con un vector retroviral que lleva un cADN se mostró
que era capaz de producir un FIX biológicamente activo (Hao y
otros, 1995). Este invento está dirigido a la expresión de los
factores de coagulación sanguínea en las células hematopoyéticas y
específicamente en las plaquetas.
Como células hematopoyéticas la línea celular de
eritroleucemia humana HEL ha sido ya usada, la cual expresa
principalmente un fenotipo eritroide (Martin y otros, 1982)
pero también algunos marcadores megacariocíticos como las
glicoproteínas de membrana de plaquetas (Tabilio y otros,
1984). Después de la inducción por acetato de
forbol-12-miristato-13
(PMA), la línea celular HEL expresa cantidades crecientes de
proteínas megacariocíticas como el complejo de glicoproteína
IIb/IIIa, el factor 4 de plaquetas, o el factor de von Willebrand
(Long y colaboradores, 1990). Los efectos del PMA son mediados por
medio de la activación de la proteína quinasa C (Nishizuka y
otros, 1984; Hong y otros, 1996).
La glicoproteína IIb (GPIIb) de plaquetas humana
es una subunidad de la integrina \alphaIIb®3 de plaquetas también
conocida como complejo IIb-IIIa que funciona como un
receptor específico para fibrinógeno, fibronectina y del factor de
von Willebrand (Haas y Plow, 1994). El cADN de GPIIb fue aislado
inicialmente de las librerías del mARN de las células HEL y de los
megacariocitos humanos (Uzan y otros, 1988; Frachet y otros,
1990). El gen GPII humano fue identificado por Prandini y otros,
(1988).
El documento de patente WO 9300438 describe los
elementos reguladores del promotor GPIIb. Hao y otros (1995)
expresaron el FIX en células hematopoyéticas humanas. Jallat y
otros (1990) expresaron el FIX en ratones transgénicos y
Karachi y otros (1995) describieron como por integración de
versiones truncadas del intrón I de FIX en el cADN de FIX los
niveles de expresión de FIX podían ser aumentados.
La especificidad del tejido del promotor GPIIb
fue evaluada usando el gen reportero de cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT). Bajo el promotor testigo GPII, solo fue
detectada una expresión CAT en la línea celular hematopoyética HEL
(Uzan y otros, 1991).
Para tratar la hemofilia B por terapia génica es
necesario tener una expresión específica de tejido del factor IX.
El presente invento proporciona una solución al problema de expresar
los factores de coagulación sanguínea en tales células
hematopoyéticas.
Se ha encontrado ahora que una construcción de
ADN es adecuada para una expresión específica de tejido de un
factor de coagulación de sangre si comprende un ADN que codifica una
secuencia de aminoácidos de un factor de coagulación de sangre y un
ADN que codifica un promotor que es específico para la expresión en
células hematopoyéticas. La solución al problema anteriormente
mencionado ha sido demostrado con una construcción de ADN en la que
como promotor ha sido usado el ADN que codifica la glicoproteína IIb
(=GPIIb) de plaquetas humana.
El desarrollo de dicha construcción de ADN fue
realizado como sigue:
El gen FIX de tipo silvestre contiene 3 codones
ATG en marco agrupados en el aminoácido -46, -41 y -39. Para
intentar mejorar la producción de FIX, cinco vectores de expresión
de cADN de FIX con diferentes sitios ATG han sido producidos,
dirigidos por el promotor CMV. El intrón 1 de FIX truncado, mostrado
previamente que tiene una expresión que aumenta la actividad en la
línea celular HepG2 (Karachi y otros, 1995) fue clonado e
introducido en los cADN de FIX. En una parte inicial de este
proyecto, las transfecciones estables de las células CHO con
construcciones CMV-FIX (-41S) y
CMV-FIX (-41S.l1) conducen a la mejor producción de
FIX en los sobrenadantes de cultivos. Estas dos construcciones cADN
de FIX (-41S) y FIX (-41S.l1) que son sólo consecuencia del ATG -41
fueron por tanto las primeras construcciones FIX usadas para
transfectar la línea celular hematopoyética. El extremo 5'
modificado del cADN de FIX (-41S) (SEQ. ID.N°1) es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, todos los resultados obtenidos con
los cADN de FIX (-41S) fueron además confirmados con los cADN de
FIX (Silvestre) y de FIX (silvestre.l1). El extremo 5' del cADN de
FIX silvestre de (SEQ. ID.N°2) es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El promotor específico de linaje GPII fue
elegido para expresar los transgenes FIX en las células
hematopoyéticas. El vector pBLCAT-GPII que
relaciona el promotor -643/+33 GPII y el gen reportero de
cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) fue obtenido de G. Uzan.
Para usar los vectores pcDNA3 (Invitrogen,
Holanda) como un vector de expresión para FIX (que tiene más sitios
de restricción de enzimas y un gen de resistencia a la neomicina y
parece, por tanto, mas conveniente para los siguientes estudios),
el promotor CMV endógeno fue reemplazado por el promotor GPIIb. Este
promotor fue sacado del vector pBLCAT-GBIIb después
de la digestión del HindIII-BamHI. Este producto
abarca el fragmento -597 al +33 del promotor GPIIb (SEQ.ID.No.3)
que comprende los dominios cruciales para la especificidad del
promotor (Uzan y otros, 1991 y 1995). Fue introducido en un
pcDNA3 con el CMV delecionado abierto por las mismas enzimas. La
construcción obtenida es la así llamada pcDNA3-GPIIb
(SEQ.ID. No 4 y la Figura 1). Todos los cADN de FIX fueron
subclonados en un plásmido pcDNA3-GPIIb usando la
digestión de BamHI-Xhol.
Para ensayar la actividad del promotor GPIIb
truncado (-597/+33) en la línea celular HEL, se eligió el gen
reportero de \beta-Galactosidasa. Se eligió el
vector pUT535 (Cayla, Toulouse, Francia), en el que la expresión
del gen \beta-Gal es dirigida por el promotor y el
potenciador de CMV (Figura 2). Para intercambiar las secuencias CMV
por el promotor GPIIb truncado, el promotor GPIIb fue digerido por
HindIII-BamHI, tratado con la ADN polimerasa Klenow
para obtener extremos romos y después introducido en
BstEII-Ncol abierto pUT535 tratado con ADN
polimerasa Klenow. El vector
GPIIb-\beta-Gal fue llamado:
pUT535-GPIIb (Figura 2). El plásmido de testigo
negativo (pUT535-\deltaCMV) fue el pUT535
delecionado de las secuencias CMV por digestión de
BstEII-Ncol.
Los construcciones pUT535, pUT535^{TM}CMV y
pUT535-GPII fueron ensayados en dos líneas celulares
diferentes: células HEL y HeLa. La línea celular HEL (Células de
Eritroleucemia Humana) es una línea celular clásica usada para
ensayar la expresión del promotor megacariocítico. Las células HeLa
(carcinoma epiteloide de cerviz humano) son sus homólogas de
testigo negativo clásicas.
Las células HEL fueron mantenidas en un medio
RPMI/FCS 10% con 5% de CO_{2}. Los vectores ®-Gal (2 \mug de
ADN) fueron transfectados en las células HEL (1x10^{6} células)
usando FUGENE™ 6 (Boehringer, Mannheim). Después de una incubación
durante la noche, las células fueron recogidas y colocadas en 10 ml
de RPMI/BSA 1% (Boehringer, Mannheim). El PMA (Sigma) fue añadido
al medio en uno de los dos ensayos (concentración final: 1 nM). Las
células HeLa fueron mantenidas en DMEM- FCS 10% con 5% de CO_{2}.
Las placas petri de 90 mm con células 5x10^{6} fueron preparadas
el día antes de la transfección. Las células fueron tratadas con 20
\mug de ADN y 20 \mul de un reactivo Lipofectin™ (Gibco)
durante 5 horas. Después de este tiempo de incubación, las células
fueron lavadas y colocadas en un DMEM- BSA 1% con o sin 1 nM de PMA.
Las células fueron recogidas 40 horas más tarde, incubadas con un
tampón de lisis, y los lisados fueron diluidos hasta una
concentración de proteína final de 1,5 mg/ml. El kit de ensayo del
gen reportero de quimoluminiscencia de \beta-Gal
(Boehringer, Mannheim) fue usado como se describe por el fabricante
para cuantificar la \beta-Galactosidasa.
En las células HeLa, el gen reportero de ®-Gal
fue expresado solamente cuando las células fueron transfectadas con
un vector que contenía el promotor CMV, sin y con inducción de PMA.
Ninguna expresión de ®-Gal fue encontrada con la construcción
dirigida por el promotor GPIIb (Figura 3, panel A).
En las células HEL (Figura 3, panel B), el CMV
dio la producción más alta de ®-Gal (Tabla 1 más adelante). Sin
embargo, el promotor GPIIb condujo a la producción de una cantidad
significante de \beta-Gal con un incremento en
la producción después del tratamiento de PMA. Cuando la cantidad de
\beta-Gal obtenida con pUt535 en las células HEL
fue tomada como 100%, la cantidad de \beta-Gal con
el promotor GPIIb truncado fue del 13% en las células sin
tratamiento de PMA. En comparación, Uzan y otros (1991) encontró que
la actividad CAT con el promotor GPIIb correspondió al 15% de la
actividad CAT obtenida con el testigo promotor RSV en la misma
línea celular.
En conclusión, el promotor -597/+33 indujo una
expresión del gen reportero específica de tejido en la línea
celular hematopoyética puesto que ninguna expresión de ®-Gal fue
detectada en las células HeLa. En estas transfecciones transitorias
de las células HEL, la producción de ®-Gal obtenida con este
promotor específico hematopoyético fue baja en comparación con los
resultados medidos con el promotor CMV. Sin embargo, los resultados
obtenidos in vitro son similares a los resultados publicados
por Uzan y otros (1991).
Para ensayar la posibilidad de producir FIX en
las células hematopoyéticas, las células HEL fueron transfectadas
transitoriamente con los vectores FIX que tienen relación bien con
los promotores CMV o con los GPIIb, llamados
CMV-FIX y GPIIb-FIX,
respectivamente. El estudio fue realizado primero con los
construcciones FIX (-41S) y los resultados fueron confirmados con
las construcciones FIX silvestres.
Las células HEL 7,5x10^{6} fueron
transfectadas con 20 \mug de ADN usando 20 \mul del reactivo de
transfección Superfect (Qiagen). Después de 6 horas, las células
fueron recogidas y colocadas en RPMI/BSA 1% \pm 1 nM de PMA a una
concentración final de 2,5x10^{5} células/ml. Los sobrenadantes
fueron recogidos después de 96 horas y las células fueron
contadas.
Para las construcciones de FIX silvestre, el
pcDNA3-FIX silvestre y el pcDNA3 silvestre.I1 han
sido transfectados en las células HEL (células 1x10^{6}) usando 6
\mug, Fugene 6 y 2 \mug de ADN. Siguiendo a la incubación
durante la noche, las células fueron recogidas y colocadas en 5 ml
de RPMI/ BSA 1%/PMA 1 nM para las transfecciones de
CMV-FIX y en 2,5 ml de medio de inducción para las
transfecciones GPIIb-FIX. Cuatro días después de la
transfección, los sobrenadantes fueron recuperados y las células
fueron contadas.
Cuando las células fueron incubadas sin PMA, la
producción de FIX obtenida con el construcción
CMV-FIX fue muy baja y no detectable de manera
precisa por ELISA (Asserachrom FIX, Stago, Asnières, Francia). Los
resultados presentados en la Figura 4 fueron obtenidos después de
la inducción con 1 nM de PMA. Bajo el promotor CMV testigo, la
secreción de FIX por las células HEL transfectadas con
CMV-FIX (-41S) fue baja (408,66 pg/ml) y no
significativa. La mejor producción fue obtenida con las células
transfectadas con FIX (-41S.I1). La producción media fue 2 veces
mayor que con el cADN de FIX (-41S) y fue significativamente
diferente del resultado obtenido con cADN de FIX (-41S)
(p<0,05). Un resultado similar fue obtenido cuando se ajustó por
número de células. Ciertamente, las células HEL transfectadas con
FIX (-41S.I1) produjeron 4,5 \pm 2,5 ng/1x10^{6} células y este
resultado fue significativamente diferente del resultado obtenido
con FIX (-41S)-células transfectadas HEL (1,5 \pm
0,9 ng/1x10^{6} células; p<0,01).
Experimentos similares fueron realizados con las
construcciones GPIIb-FIX, y en este caso
(2,5x10^{5} células/ml después de la transfección), la producción
de FIX fue demasiado débil para ser detectada en los sobrenadantes.
Los microconcentradores Microsep™ (Pall Gelman Sciences) con un
límite de 30 Kd fueron usados para concentrar las proteínas. En el
sobrenadante concentrado GPIIb-FIX (-41S.I1)
obtenido con, células HEL estimuladas con PMA, la proteína FIX fue
apenas detectable. Este resultado estuvo de acuerdo con los
resultados obtenidos con el gen reportero de
\beta-Gal (Tabla 1), confirmando que el potencial
de GPIIb fue bajo en comparación con el promotor CMV.
La Figura 5 presenta la producción de FIX
obtenida con el FIX Silvestre. Estos resultados confirman que:
- Las células HEL son capaces de producir FIX
tras una transfección transitoria.
- Los mejores niveles de producción fueron
obtenidos con las construcciones FIX Silvestre.I1 y fueron
significativamente diferentes de los correspondientes resultados de
FIX silvestre.
- Después de las transfecciones transitorias, el
promotor GPIIb fue menos eficaz para la producción de FIX que el
promotor CMV en las células HEL. Las células HEL transfectadas con
GPIIb-FIX silvestre.I1 produjeron alrededor del 30
por ciento de la producción FIX obtenida con el mismo cADN bajo el
testigo promotor CMV (257,71 \pm 85,38 pg/1x10^{6} células
versus 881,28 \pm 288,32 pg/1x10^{6} células).
Como se mencionó anteriormente, en el sistema de
expresión transitorio, una producción de FIX baja fue obtenida. Por
lo tanto, las células que expresan FIX de modo estable fueron
generadas.
Las células: células HEL (1x10^{6} células)
fueron transfectadas con 2 \mug del plásmido Pvul linearizado
durante 5 horas usando un sistema de transfección FUGENE 6
(Boehringer, Mannheim). Después de la incubación, las células
fueron recogidas y colocadas en un medio fresco suplementado con 0,6
mg/ml de G418.
Para comparar la producción de FIX, las células
resistentes a G418 fueron colocadas en RPMI/BSA 1% suplementado con
1 ng/ml de vitamina K \pm 1 nM de PMA (2,5x10^{5} células/mL).
Después de 1, 2, 3 ó 4 días de incubación, las células fueron
contadas y los sobrenadantes fueron congelados. Las concentraciones
de FIX fueron medidas usando un kit de ELISA para FIX (Asserachrom
FIX, Otago, Asnières, Francia).
Análisis por inmunotransferencia: los
sobrenadantes (1 ml) fueron diluidos cuatro veces en un tampón de
equilibrado (Hepes 10 mM, KCl 100 mM, MgCl_{2} 2 mM, Tritón X100
0,1%). Cincuenta microlitros de un anticuerpo anti factor IX humano
unido a Sephadex DEAE A50 proporcionado amablemente por Centeon™
(USA) fueron añadidos a las disoluciones sobrenadantes e incubadas
durante 1 hora a 4°C. El DEAE fue luego recogido por centrifugación
(2 min a 2500 rpm) y lavado tres veces con el tampón de equilibrado.
El factor IX fue eluido mediante el tampón Laemmli (Laemmli, 1970).
Las muestras que contenían el Factor IX fueron sujetas a
electroforesis en gel de poliacrilamida 10%
SDS-PAGE y transferidas mediante una transferencia
semiseca sobre una membrana Hybond™ C Pure (Amersham). Las
transferencias fueron bloqueadas con TBS-(0,15 M de NaCl, 10 mM de
Tris-HCI, pH 7,5) Tween (0,1%) durante 1 hora a
temperatura ambiente y luego incubadas con una disolución de 1:3000
de un anticuerpo policlonal de conejo anti FIX humano (Dako™). Las
membranas fueron lavadas 3 veces en TBS-T y luego
incubadas con una disolución 1:10000 de un anticuerpo anti conejo
marcado con peroxidasa (Biorad) durante 30 min.
Después de lavarlas 3 veces, una señal
quimioluminiscente fue detectada mediante autoradiografía usando el
sistema ECL (Amersham™).
Actividad procoagulante: La actividad del
Factor IX fue determinada por un ensayo de coagulación de una etapa.
Cincuenta microlitros del plasma testigo fueron diluidos (1/10) en
un tampón de imidazole (Diagnostica Stago, Asnières, Francia).
Cincuenta microlitros de sobrenadante diluido fueron añadidos a 50
\mul de plasma deficiente en Factor IX (Immuno, Illkirch.
Francia) y a 50 \mul de Silimat® cephalin
(Bio-merieux™, Marcy l'Etoile, Francia). Después de
4 min de incubación a 37°C, la coagulación fue iniciada mediante
adición de 50 \mul de un tampón CaCl_{2}50 mM. Los tiempos de
coagulación fueron medidos en un coagulómetro STA Compact®
(Diagnostica Stago™ Asnières, Francia) y la actividad del Factor IX
fue determinada a partir de una curva estándar
log-log.
Activación FIX por el factor XIa: El FIX
fue inmunoprecipitado y activado adicionalmente in vitro por
el factor XIa (Enzyme Research Lab., Swansea, UK) con una relación
enzima/sustrato de 1/40. El tampón de activación que consiste en 50
mM de Tris HCL, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCL_{2}, 0,01% de
polietilénglicol, pH 7,5. Las reacciones fueron incubadas durante
30 min y 1 hora a 37°C, y las muestras hechas reaccionar fueron
después diluidas en un tampón Laemmli.
Análisis de transferencia Northern: Los
mARN totales fueron preparados de 7x10^{6} células HEL
transfectadas establemente usando el mini kit Rneasy (Qiagen,
Courtaboeuf, Francia). Después de la electroforesis en gel de
agarosa 1,2% en tampón fosfato (NaH_{2}PO_{4} 10 mM,
Na_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7), los mARN fueron transferidos a una
membrana de nylon (Hybond N, Amersham, Les Ulis, France). Las sondas
de ARN que consisten en el factor IX humano de longitud completa o
GAPDH de rata fueron generadas y marcadas con NTP que contenían
UTP-digoxigenina usando el sistema de transcripción
in vitro con un kit de polimerasa ARN T7 (Boehringer Mannheim
Meylan, Francia). Tras la hibridación, las señales fueron
detectadas mediante quimioluminiscencia usando el kit de detección
luminiscente DIG de Boehringer Mannheim (Meylan, Francia).
Ningún FIX fue detectado en los sobrenadantes de
las células HEL transfectadas de pcDNA3 (Figura 6). Después de 4
días, 11,65 ng/ml de FIX fueron detectados en el medio condicionado
de las células tansfectadas con CMV-FIX (-41S.I1).
Tras la inducción de PMA, la producción de FIX (259,87 ng/ml) fue 23
veces mayor que la producción obtenida sin el PMA y fue 250 veces
mayor que el resultado obtenido con las transfecciones
transitorias.
Cuando las células HEL fueron transfectadas con
el vector pcDNA3-GPIIb, no se detectó ningún FIX en
el medio condicionado. Con las células HEL
GPIIb-FIX (-41S.I1), el FIX aumentó regularmente
durante los 4 días de incubación (Figura 7). Después de 4 días de
cultivo, los grupos de GPIIb-FIX (-41S.I1)
produjeron 35,0 \pm 7,8 ng/ml de FIX en el sobrenadante. Tras la
inducción de PMA, la producción de FIX alcanzó los 165,0 \pm 32,52
ng/ml.
La actividad procoagulante de FIX fue
directamente correlacionada con el antígeno FIX en los sobrenadantes
de las células HEL (Figura 8). La actividad específica de FIX
producido por las células HEL que expresan GPIIb-FIX
(-41S.I1) (medio de cultivo: RPMI/BSA 1%) fue de 0,34 \pm 0,07
mU/ng.
Los sobrenadantes de las células HEL
transfectadas fueron inmunoprecipitados y sometidas a transferencia
Western para verificar el peso molecular de la proteína secretada.
Se usó como testigo el Factor IX recombinante purificado
(Mononine™). En los sobrenadantes de células que expresan
pcDNA3-GPIIb, no se detectó ningún FIX. En los
sobrenadantes de celulas HEL GPIIb-FIX (-41S.I1)
sin o con inducción de PMA, se detectó una banda específica con un
peso molecular aproximado de 60 kDa. Esta proteína migró al mismo
nivel que el FIX inmunopurificado (Mononine™).
Las células fueron transfectadas establemente
con las construcciones siguientes: pcDNA3,1 y
pcDNA3-GPIIb usados como testigos negativos, el
GPIIb-FIX (Silvestre), GPIIb-FIX
(Silvestre.I1), y también las construcciones CMV correspondientes
(CMV-FIX (Silvestre) y CMV-FIX
(silvestre.I1)). La Figura 9 representa los resultados obtenidos
con las células HEL CMV-FIX y
GPIIb-FIX. Como era de esperar, en los dos testigos
negativos (pcDNA3 y pcDNA3-GPIIb), ningún FIX fue
detectado en los sobrenadantes. Cuando la expresión del FIX
(silvestre) fue dirigida por el promotor GPIIb, una producción de
FIX significativamente mayor fue medida en los sobrenadantes
comparado con el CMV-FIX. El
GPIIb-FIX (Silvestre) que expresa las células HEL
produjo cantidades de alrededor de 5 a 10 veces mayores de FIX que
las células HEL transfectadas con GPIIb-FIX
(Silvestre) en las mismas condiciones (\pm PMA).
Se estudió la capacidad del FIX (Silvestre.I1)
dirigido por el promotor GPIIb para aumentar la producción de FIX
en las células HEL. La evaluación de la concentración del factor IX
en los sobrenadantes demostró que la mayor producción fue obtenida
con la construcción FIX (Silvestre.I1). Ciertamente, después de 4
días de cultivo, las células HEL transfectadas con
GPIIb-FIX (Silvestre.I1) secretaron cantidades
alrededor de 30 veces superiores de FIX que las células HEL que
expresaban GPIIb-FIX (Figura 10). Cuando las células
fueron estimuladas con PMA, las células transfectadas con
GPIIbFIX.I1 produjeron también cantidades de FIXC mayores (x12) en
comparación con las células que expresaban GPIIb-FIX
(valores a día 4: 398,04 \pm 94,23 ng/mL versus 32,12
\pm 14,85 ng (mL de FIX).
Para caracterizar adicionalmente la proteína FIX
en los sobrenadantes de las células HEL, el FIX fue
inmunoprecipitado y las muestras fueron sujetas a la electroforesis
y transferidas. En las células HEL que expresan
pcDNA3-GPIIb, una banda específica única fue
detectada con el anticuerpo secundario solo. En las células HEL
transfectadas con GPIIb-FIX (silvestre) y el
GPIIb-FIX (silvestre.I1), se detectó una banda
específica de alrededor de 60 kDa. Este peso molecular fue similar
al FIX (-41SI1) detectado anteriormente, al testigo y al FIX
producido por células HepG2 que expresan
pcDNA3.CMV/FIX(silvestre.I1). La diferencia en la intensidad
de las bandas en los análisis de inmunotransferencia fue
directamente correlacionada con la cantidad de antígeno presente en
la Figura 10.
Se mostró anteriormente que el FIX necesita ser
procesado adecuadamente para ser completamente activo. La actividad
coagulante del Factor IX fue medida en el sobrenadante de las
células HEL transfectadas con GPIIb-FIX
(Silvestre.I1) estimuladas con PMA (Figura 11). La actividad
procoagulante del FIX estuvo directamente correlacionada con la
concentración del antígeno, indicando un procesamiento correcto de
la molécula. La actividad media específica de FIX en los
sobrenadantes fue de 160 \pm 69 U/mg. Durante la cascada de
coagulación, el FIX necesita ser activado por el FXIa. El corte de
FIX después de la incubación con el FXIa, es decir, la activación
del FIX inmunoprecipitado de las células HEL dio como resultado la
aparición de dos bandas correspondientes a la cadena pesada (29
kDa) y a la cadena ligera (19 kDa). La velocidad de la activación y
el perfil de la proteína de los sobrenadantes HEL fueron similares
a los resultados obtenidos con Mononina.
Se ha mostrado que la cantidad de proteína FIX
producida por las células HEL estuvo estrechamente relacionada con
la presencia del intrón 1 FIX en el cADN de FIX. Los autores han
analizado los mARN de FIX de diferentes transfecciones de las
células HEL. Ningún mARN hibridó con la sonda de mARN de FIX en las
células HEL transfectadas con el pcDNA3-GPIIb sin o
con inducción de PMA. En las células transfectadas con las
construcciones FIX (silvestre.I1), se detectó una banda específica,
la cual exhibió el tamaño correcto de mARN de 1,4 Kb. En las células
HEL GPIIb-FIX (silvestre), el mARN de FIX fue
detectado sólo tras la inducción de PMA. Estos mARN tienen el mismo
tamaño que los detectados en las células HEL
GPIIb-FIX (silvestre.I1). Las cantidades de mARN en
los diferentes lisados estuvieron directamente correlacionadas con
las cantidades de antígeno detectadas en los sobrenadantes,
explicando por tanto la ausencia de detección en las células HEL
GPIIb-FIX (silvestre) no estimuladas. Sin embargo,
se confirmó que el mARN esperado fue detectado en estas células
cuando se usaban cantidades mayores del mARN total.
Los resultados anteriormente mencionados
muestran que la línea celular HEL hematopoyética puede producir y
secretar un FIX completamente activo. Después de las transfecciones
transitorias, la producción más alta fue obtenida con las células
HEL CMV-FIX.I1 en comparación con las células HEL
CMV-FIX, demostrando que la actividad
incrementadora de la expresión del intrón 1 de FIX en esta línea
celular hematopoyética. Usando el promotor GPIIb, la producción de
FIX fue específica de tejido. Las transfecciones estables han
demostrado que el promotor GPIIb fue eficaz en la inducción de la
transcripción FIX en las células HEL y que el intrón 1 del FIX tuvo
una importante actividad incrementadora de la expresión. La proteína
FIX secretada tiene un peso molecular de alrededor de 60 kDa,
similar al del FIX contenido en la Mononina™ y luego parece
experimentar un proceso normal de maduración. Finalmente, la
actividad coagulante de FIX, usando un ensayo de coagulación de una
etapa, correspondió a la del antígeno del FIX. El perfil proteíco
después de la activación FXIa fue similar al del perfil obtenido
con Mononina, indicando que la molécula recombinante fue
completamente activa. Estos resultados obtenidos con las células
HEL refuerzan la hipótesis de que la proteína FIX puede ser
producida por células madre hematopoyéticas CD34+.
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<211> 32
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<212> ADN
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<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. La construcción de ADN para la expresión
específica de tejido de un factor de coagulación de la sangre que
comprende un ADN que codifica una secuencia aminoacídica de un
factor de coagulación de la sangre y un ADN que codifica un
promotor, que es específico para la expresión en las células del
linaje de las plaquetas.
2. La construcción de ADN como se reivindica en
la reivindicación 1, en la que como promotor el ADN que codifica la
glicoproteína IIb de plaquetas humana (GPIIb) es insertada.
3. La construcción de ADN como se reivindica en
las reivindicaciones 1 y 2, en las que el ADN que codifica la
secuencia de aminoácido de un factor de coagulación de sangre es el
cADN que codifica el Factor IX.
4. La construcción de ADN como se reivindica en
las reivindicaciones 1 a 3, en la que un primer intrón expresión
que aumenta el primer intrón truncado (Intrón 1) del gen humano FIX
ha sido insertado adicionalmente en el cADN FIX.
5. El uso de una construcción de ADN según
cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de
un trastorno de coagulación sanguínea.
6. El uso según la reivindicación 5, en la que
el tratamiento comprende terapia génica humana.
7. El uso según la reivindicación 6, en la que
el trastorno de coagulación sanguínea es hemofilia.
8. El uso según la reivindicación 7, en la que
el trastorno de coagulación sanguínea es hemofilia B.
9. El uso según la reivindicación 5, en la que
la producción del Factor IX es estimulada por un inductor.
10. El uso como se reivindica en la
reivindicación 6, en la que la producción del Factor IX es
estimulada por acetato de forbol-12
miristato-13 (PMA).
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