JP2000333687A - 血液凝固因子の組織特異的発現のためのｄｎａ構築体 - Google Patents
血液凝固因子の組織特異的発現のためのｄｎａ構築体Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 血液凝固因子の組織特異的発現のためのＤＮ
Ａ構築体の提供。 【解決手段】 本ＤＮＡ構築体は、血液凝固因子のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡおよび造血細胞における発
現に特異的なプロモーターをコードするＤＮＡからな
る。
Ａ構築体の提供。 【解決手段】 本ＤＮＡ構築体は、血液凝固因子のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡおよび造血細胞における発
現に特異的なプロモーターをコードするＤＮＡからな
る。
Description
【０００１】
【技術分野】本発明の主題は血液凝固因子の組織特異的
な発現のためのＤＮＡ構築体である。
な発現のためのＤＮＡ構築体である。
【０００２】
【背景技術】血液凝固第IX因子（ＦIX）は肝細胞によっ
て産生され、血液循環中に分泌されるビタミンＫ依存性
糖タンパク質であることは知られている（Kurachiら, 1
995;Salierら, 1990）。ＦIX遺伝子はＸ染色体上に存在
し、８個のエキソンおよび７個のイントロンを含有する
（Camerinoら, 1984; Boydら, 1984; Yoshitakeら,198
5）。第IX因子の不存在または欠乏は、血友病Ｂと呼ば
れる重篤な出血性障害を生じる（Robertsら, 1993）。
て産生され、血液循環中に分泌されるビタミンＫ依存性
糖タンパク質であることは知られている（Kurachiら, 1
995;Salierら, 1990）。ＦIX遺伝子はＸ染色体上に存在
し、８個のエキソンおよび７個のイントロンを含有する
（Camerinoら, 1984; Boydら, 1984; Yoshitakeら,198
5）。第IX因子の不存在または欠乏は、血友病Ｂと呼ば
れる重篤な出血性障害を生じる（Robertsら, 1993）。
【０００３】血友病Ｂは単一の既知遺伝子の変化により
生じる。したがって、それは遺伝子療法の標的の可能性
が早くから提案されていた。標的として選択される細胞
は、遺伝子導入のために容易に利用できるものでなけれ
ばならず、有意なレベルで第IX因子を発現できる必要が
ある。これらの標的細胞中で、ＦIX分子は活性な凝固因
子になるように修飾される必要がある（γ−カルボキシ
ル化およびプロペプチドの切断）。数種の標的細胞の可
能性が、たとえば肝細胞（Nakaiら, 1998）、角化細胞
（Whiteら, 1998）、筋細胞（Baruら, 1995; Wangら, 1
997）または骨髄ストローマ細胞（Cheringtonら, 199
8）で試験された。インビトロにおいてはヒトＦIX ｃＤ
ＮＡを有するレトロウイルスベクターでトランスフェク
トされたヒト骨髄性白血病細胞系（ＨＬ60）が生物学的
に活性なＦIXを産生できることが示された（Haoら, 199
5）。本発明は造血細胞、とくに血小板における血液凝
固因子の発現を意図するものである。
生じる。したがって、それは遺伝子療法の標的の可能性
が早くから提案されていた。標的として選択される細胞
は、遺伝子導入のために容易に利用できるものでなけれ
ばならず、有意なレベルで第IX因子を発現できる必要が
ある。これらの標的細胞中で、ＦIX分子は活性な凝固因
子になるように修飾される必要がある（γ−カルボキシ
ル化およびプロペプチドの切断）。数種の標的細胞の可
能性が、たとえば肝細胞（Nakaiら, 1998）、角化細胞
（Whiteら, 1998）、筋細胞（Baruら, 1995; Wangら, 1
997）または骨髄ストローマ細胞（Cheringtonら, 199
8）で試験された。インビトロにおいてはヒトＦIX ｃＤ
ＮＡを有するレトロウイルスベクターでトランスフェク
トされたヒト骨髄性白血病細胞系（ＨＬ60）が生物学的
に活性なＦIXを産生できることが示された（Haoら, 199
5）。本発明は造血細胞、とくに血小板における血液凝
固因子の発現を意図するものである。
【０００４】造血細胞としては、主として赤血球表現型
を発現する（Martinら, 1982）が、一部血小板膜糖タン
パク質様の巨核球マーカーも発現する（Tabilioら, 198
4）ヒト赤白血病細胞系ＨＥＬがすでに使用されてい
る。ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテー
ト（ＰＭＡ）による誘導後ＨＥＬ細胞系は、巨核球タン
パク質様糖タンパク質IIｂ／IIIａ複合体、血小板因子
４またはフォンビルブラント因子の発現量の増大を示す
（Long & 共同研究者, 1990）。ＰＭＡの作用はプロテ
インキナーゼＣの活性化に仲介される（Nishizukaら, 1
984; Hongら, 1996）。
を発現する（Martinら, 1982）が、一部血小板膜糖タン
パク質様の巨核球マーカーも発現する（Tabilioら, 198
4）ヒト赤白血病細胞系ＨＥＬがすでに使用されてい
る。ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテー
ト（ＰＭＡ）による誘導後ＨＥＬ細胞系は、巨核球タン
パク質様糖タンパク質IIｂ／IIIａ複合体、血小板因子
４またはフォンビルブラント因子の発現量の増大を示す
（Long & 共同研究者, 1990）。ＰＭＡの作用はプロテ
インキナーゼＣの活性化に仲介される（Nishizukaら, 1
984; Hongら, 1996）。
【０００５】ヒト血小板糖タンパク質IIｂ（ＧＰIIｂ）
は、フィブリノーゲン、フィブロネクチンおよびフォン
ビルブラント因子の特異的受容体として機能するIIｂ−
IIIａ複合体としても知られている血小板インテグリンI
Iｂβ３のαサブユニットである（Haas & Plow, 199
4）。ＧＰIIｂ ｃＤＮＡは最初、ＨＥＬ細胞およびヒト
巨核球からのｍＲＮＡライブラリーより単離された（Uz
anら, 1988; Frachetら，1990）。ヒトＧＰIIｂ遺伝子
は Prandiniら（1988）によって同定された。
は、フィブリノーゲン、フィブロネクチンおよびフォン
ビルブラント因子の特異的受容体として機能するIIｂ−
IIIａ複合体としても知られている血小板インテグリンI
Iｂβ３のαサブユニットである（Haas & Plow, 199
4）。ＧＰIIｂ ｃＤＮＡは最初、ＨＥＬ細胞およびヒト
巨核球からのｍＲＮＡライブラリーより単離された（Uz
anら, 1988; Frachetら，1990）。ヒトＧＰIIｂ遺伝子
は Prandiniら（1988）によって同定された。
【０００６】ＧＰIIｂプロモーターの組織特異性はクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）レポーター遺伝子を用いて評価された。ＧＰIIｂプ
ロモーターの制御下においては、ＣＡＴの発現は造血細
胞系ＨＥＬにおいてのみ検出された（Uzanら, 1991）。
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）レポーター遺伝子を用いて評価された。ＧＰIIｂプ
ロモーターの制御下においては、ＣＡＴの発現は造血細
胞系ＨＥＬにおいてのみ検出された（Uzanら, 1991）。
【０００７】血友病Ｂを遺伝子療法によって処置するた
めには、第IX因子の組織特異的発現を有することが必要
である。本発明は、このような造血細胞における血液凝
固因子の発現の問題に解決を提供する。
めには、第IX因子の組織特異的発現を有することが必要
である。本発明は、このような造血細胞における血液凝
固因子の発現の問題に解決を提供する。
【０００８】今般、ＤＮＡ構築体は、それが血液凝固因
子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよび造血細胞に
おける発現に特異的なプロモーターをコードするＤＮＡ
からなる場合は、血液凝固因子の組織特異的発現に適当
であることが見出された。上述の問題に対する解決は、
プロモーターとしてヒト血小板糖タンパク質IIｂ（ＧＰ
IIｂ）コードするＤＮＡを用いるＤＮＡ構築体によって
証明されたのである。
子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよび造血細胞に
おける発現に特異的なプロモーターをコードするＤＮＡ
からなる場合は、血液凝固因子の組織特異的発現に適当
であることが見出された。上述の問題に対する解決は、
プロモーターとしてヒト血小板糖タンパク質IIｂ（ＧＰ
IIｂ）コードするＤＮＡを用いるＤＮＡ構築体によって
証明されたのである。
【０００９】
【発明の開示】上記ＤＮＡ構築体の開発は次のように実
施された。 Ａ．キメラ分子の構築 １．ＦIX ｃＤＮＡの発生 野生型ＦIX遺伝子は、アミノ酸−46、−41および−39に
密集するインフレームな３つのＡＴＧコドンを含有す
る。ＦIXの産生の改良を試みるために、様々なＡＴＧ部
位をもつ５つのＦIX ｃＤＮＡ発現ベクターをＣＭＶプ
ロモーターによる指揮下に作成した。ＨepＧ２細胞系に
おいて以前に発現増大活性を有することが示された部分
切断ＦIXイントロン１（Kurachiら, 1995）をクローン
化し、ＦIXｃＤＮＡ中に導入した。このプロジェクトの
初期の頃には、ＣＭＶ−ＦIX（−41Ｓ）およびＣＭＶ−
ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）構築体で安定にトランスフェクシ
ョンされたＣＨＯ細胞が培養上清における最良のＦIX産
生を招来した。−41ＡＴＧしかもたないこれらの２つの
構築体ＦIX（−41Ｓ）およびＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）ｃＤ
ＮＡは、したがって、造血細胞系のトランスフェクショ
ンに使用された最初のＦIX構築体であった。ＦIX（−41
Ｓ）ｃＤＮＡの修飾された５′末端（配列番号１）は
施された。 Ａ．キメラ分子の構築 １．ＦIX ｃＤＮＡの発生 野生型ＦIX遺伝子は、アミノ酸−46、−41および−39に
密集するインフレームな３つのＡＴＧコドンを含有す
る。ＦIXの産生の改良を試みるために、様々なＡＴＧ部
位をもつ５つのＦIX ｃＤＮＡ発現ベクターをＣＭＶプ
ロモーターによる指揮下に作成した。ＨepＧ２細胞系に
おいて以前に発現増大活性を有することが示された部分
切断ＦIXイントロン１（Kurachiら, 1995）をクローン
化し、ＦIXｃＤＮＡ中に導入した。このプロジェクトの
初期の頃には、ＣＭＶ−ＦIX（−41Ｓ）およびＣＭＶ−
ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）構築体で安定にトランスフェクシ
ョンされたＣＨＯ細胞が培養上清における最良のＦIX産
生を招来した。−41ＡＴＧしかもたないこれらの２つの
構築体ＦIX（−41Ｓ）およびＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）ｃＤ
ＮＡは、したがって、造血細胞系のトランスフェクショ
ンに使用された最初のＦIX構築体であった。ＦIX（−41
Ｓ）ｃＤＮＡの修飾された５′末端（配列番号１）は
【化１】 である。
【００１０】しかしながら、ＦIX（−41Ｓ）ｃＤＮＡで
得られた結果はすべてＦIX（ＷＴ）およびＦIX（ＷＴ.
Ｉ１）ｃＤＮＡによってさらに確認された。ＦIX ＷＴ
ｃＤＮＡの５′末端（配列番号２）は
得られた結果はすべてＦIX（ＷＴ）およびＦIX（ＷＴ.
Ｉ１）ｃＤＮＡによってさらに確認された。ＦIX ＷＴ
ｃＤＮＡの５′末端（配列番号２）は
【化２】 である。
【００１１】２．ＧＰIIｂプロモーターベクターの発生 系統特異的プロモーターＧＰIIｂは造血細胞中でＦIX導
入遺伝子を発現させるために選択された。−643／＋33
ＧＰIIｂプロモーターおよびクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子を
もつｐＢＬＣＡＴ−ＧＰIIｂベクターが G. Uzan から
得られた。
入遺伝子を発現させるために選択された。−643／＋33
ＧＰIIｂプロモーターおよびクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子を
もつｐＢＬＣＡＴ−ＧＰIIｂベクターが G. Uzan から
得られた。
【００１２】ＦIXの発現ベクターとしてｐｃＤＮＡ３ベ
クター（Invitrogen, the Netherlands）を用いるため
には（これはさらに制限酵素部位とネオマイシン抵抗性
遺伝子を有し、したがって、次の試験にさらに便利であ
ると思われる）、内因性ＣＭＶプロモーターをＧＰIIｂ
プロモーターにより置換した。このプロモーターはｐＢ
ＬＣＡＴ−ＧＢIIｂベクターからＨind III−ＢamＨＩ
消化ののちに選択された。この生成物は、プロモーター
の特異性に重要なドメイン（Uzanら, 1991 および 199
5）からなるＧＰIIｂプロモーターの−597／＋33フラグ
メント（配列番号３）を包含する。それは同じ酵素で開
裂されたＣＭＶ−欠失ｐｃＤＮＡ３に導入された。得ら
れた構築体がいわゆるｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂであった
（配列番号４および図１）。すべてのＦIX ｃＤＮＡ
は、ＢamＨＩ−ＸhoＩ消化を用いてｐｃＤＮＡ３−ＧＰ
IIｂプラスミドにサブクローニングされた。
クター（Invitrogen, the Netherlands）を用いるため
には（これはさらに制限酵素部位とネオマイシン抵抗性
遺伝子を有し、したがって、次の試験にさらに便利であ
ると思われる）、内因性ＣＭＶプロモーターをＧＰIIｂ
プロモーターにより置換した。このプロモーターはｐＢ
ＬＣＡＴ−ＧＢIIｂベクターからＨind III−ＢamＨＩ
消化ののちに選択された。この生成物は、プロモーター
の特異性に重要なドメイン（Uzanら, 1991 および 199
5）からなるＧＰIIｂプロモーターの−597／＋33フラグ
メント（配列番号３）を包含する。それは同じ酵素で開
裂されたＣＭＶ−欠失ｐｃＤＮＡ３に導入された。得ら
れた構築体がいわゆるｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂであった
（配列番号４および図１）。すべてのＦIX ｃＤＮＡ
は、ＢamＨＩ−ＸhoＩ消化を用いてｐｃＤＮＡ３−ＧＰ
IIｂプラスミドにサブクローニングされた。
【００１３】３．β−ガラクトシダーゼベクターの発生 ＨＥＬ細胞系における部分切断（−597／＋33）ＧＰII
ｂプロモーターの活性を試験するために、β−ガラクト
シダーゼレポーター遺伝子を選択した。β−Galの遺伝
子発現がＣＭＶプロモーターおよびエンハンサー（図
２）によって指揮されているｐＵＴ535ベクター（Cayl
a, Toulouse, France）を選んだ。ＣＭＶ配列を部分切
断ＧＰIIｂプロモーターにより交換するために、ＧＰII
ｂプロモーターをＨind III−ＢamＨＩで消化し、クレ
ノウＤＮＡポリメラーゼで処理してブラント末端を得
て、ついでＢstＥII−ＮcoＩ開裂したクレノウＤＮＡポ
リメラーゼ処理ｐＵＴ535に導入した。ＧＰIIｂ−β−G
alベクターはｐＵＴ535−ＧＰIIｂと命名した（図
２）。陰性対照プラスミド（ｐＵＴ535−δＣＭＶ）は
ＢstＥII−ＮcoＩ消化によってＣＭＶ配列を欠失させた
ｐＵＴ535であった。
ｂプロモーターの活性を試験するために、β−ガラクト
シダーゼレポーター遺伝子を選択した。β−Galの遺伝
子発現がＣＭＶプロモーターおよびエンハンサー（図
２）によって指揮されているｐＵＴ535ベクター（Cayl
a, Toulouse, France）を選んだ。ＣＭＶ配列を部分切
断ＧＰIIｂプロモーターにより交換するために、ＧＰII
ｂプロモーターをＨind III−ＢamＨＩで消化し、クレ
ノウＤＮＡポリメラーゼで処理してブラント末端を得
て、ついでＢstＥII−ＮcoＩ開裂したクレノウＤＮＡポ
リメラーゼ処理ｐＵＴ535に導入した。ＧＰIIｂ−β−G
alベクターはｐＵＴ535−ＧＰIIｂと命名した（図
２）。陰性対照プラスミド（ｐＵＴ535−δＣＭＶ）は
ＢstＥII−ＮcoＩ消化によってＣＭＶ配列を欠失させた
ｐＵＴ535であった。
【００１４】Ｂ．造血細胞におけるＧＰIIｂプロモータ
ーの組織特異性 ｐＵＴ535、ｐＵＴ535δＣＭＶおよびｐＵＴ535−ＧＰI
Iｂ構築体は２つの異なる細胞系：ＨＥＬおよびＨeＬa
細胞で試験した。ＨＥＬ細胞系（ヒト赤白血病細胞）
は、巨核球プロモーター発現の試験に用いられたクラシ
カルな細胞系である。ＨeＬa細胞（ヒト子宮頚部上皮
癌）はそれらのクラシカルな陰性対照カウンターパート
である。
ーの組織特異性 ｐＵＴ535、ｐＵＴ535δＣＭＶおよびｐＵＴ535−ＧＰI
Iｂ構築体は２つの異なる細胞系：ＨＥＬおよびＨeＬa
細胞で試験した。ＨＥＬ細胞系（ヒト赤白血病細胞）
は、巨核球プロモーター発現の試験に用いられたクラシ
カルな細胞系である。ＨeＬa細胞（ヒト子宮頚部上皮
癌）はそれらのクラシカルな陰性対照カウンターパート
である。
【００１５】材料および方法：ＨＥＬ細胞は５％ＣＯ2
を含有するＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ培地中に維持した。
β−Galベクター（２μg ＤＮＡ）は、ＦＵＧＥＮＥ
（登録商標）６（Boehringer Mannheim）を用いてＨＥ
Ｌ細胞（１×１０6）にトランスフェクトした。一夜イ
ンキュベートしたのち、細胞を収穫し、１０mlのＲＰＭ
Ｉ／１％ＢＳＡ（Boehringer Mannheim）中に置いた。
２つのアッセイの１つでは、ＰＭＡ（Sigma）を培地に
加えた（最終濃度：１nM）。ＨeＬa細胞は５％ＣＯ2を
含有するＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中に維持した。５×１
０6個の細胞を含む９０mmのペトリ皿をトランスフェク
ションの前日に調製した。細胞を２０μgのＤＮＡおよ
び２０μｌのリポフェクチン（登録商標）試薬（Gibc
o）で５時間処理した。このインキュベーション時間後
に、細胞をＰＭＡ １nMを含むかまたは含まないＤＭＥ
Ｍ−１％ＢＳＡで洗浄し、その中に置いた。細胞を４０
時間後に収穫し、溶解緩衝液とインキュベートし、溶解
物を最終タンパク質濃度１.５mg／mlに希釈した。化学
ルミネッセントβ−Galレポーター遺伝子アッセイキッ
ト（Boehringer Mannheim）を製造業者によって記載さ
れたように使用してβ−ガラクトシダーゼを定量した。
を含有するＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ培地中に維持した。
β−Galベクター（２μg ＤＮＡ）は、ＦＵＧＥＮＥ
（登録商標）６（Boehringer Mannheim）を用いてＨＥ
Ｌ細胞（１×１０6）にトランスフェクトした。一夜イ
ンキュベートしたのち、細胞を収穫し、１０mlのＲＰＭ
Ｉ／１％ＢＳＡ（Boehringer Mannheim）中に置いた。
２つのアッセイの１つでは、ＰＭＡ（Sigma）を培地に
加えた（最終濃度：１nM）。ＨeＬa細胞は５％ＣＯ2を
含有するＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中に維持した。５×１
０6個の細胞を含む９０mmのペトリ皿をトランスフェク
ションの前日に調製した。細胞を２０μgのＤＮＡおよ
び２０μｌのリポフェクチン（登録商標）試薬（Gibc
o）で５時間処理した。このインキュベーション時間後
に、細胞をＰＭＡ １nMを含むかまたは含まないＤＭＥ
Ｍ−１％ＢＳＡで洗浄し、その中に置いた。細胞を４０
時間後に収穫し、溶解緩衝液とインキュベートし、溶解
物を最終タンパク質濃度１.５mg／mlに希釈した。化学
ルミネッセントβ−Galレポーター遺伝子アッセイキッ
ト（Boehringer Mannheim）を製造業者によって記載さ
れたように使用してβ−ガラクトシダーゼを定量した。
【００１６】結果：ＨeＬa細胞では、β−Galレポータ
ー遺伝子は、細胞がＣＭＶプロモーターを含むベクター
でトランスフェクトされた場合にのみ、ＰＭＡの誘導な
しでまたは誘導により発現された。ＧＰIIｂプロモータ
ーによって指揮された構築体では、β−Galの発現は見
出せなかった（図３、パネルＡ）。
ー遺伝子は、細胞がＣＭＶプロモーターを含むベクター
でトランスフェクトされた場合にのみ、ＰＭＡの誘導な
しでまたは誘導により発現された。ＧＰIIｂプロモータ
ーによって指揮された構築体では、β−Galの発現は見
出せなかった（図３、パネルＡ）。
【００１７】ＨＥＬ細胞では（図３、パネルＢ）ＣＭＶ
が最高のβ−Gal産生を与えた（以下の表１）。しかし
ながら、ＧＰIIｂプロモーターは有意な量のβ−Galの
産生を導き、ＰＭＡ処置後に産生は増大した。ＨＥＬ細
胞中ｐＵｔ535で得られたβ−Gal量を１００％とすると
部分切断ＧＰIIｂプロモーターによるβ−Gal量はＰＭ
Ａ処理しない細胞中では１３％であった。比較により、
Uzanら（1991）は、ＧＰIIｂプロモーターによるＣＡＴ
活性は同じ細胞系においてＲＳＶプロモーターの制御下
に得られたＣＡＴ活性の１５％に相当することを見出し
ている。
が最高のβ−Gal産生を与えた（以下の表１）。しかし
ながら、ＧＰIIｂプロモーターは有意な量のβ−Galの
産生を導き、ＰＭＡ処置後に産生は増大した。ＨＥＬ細
胞中ｐＵｔ535で得られたβ−Gal量を１００％とすると
部分切断ＧＰIIｂプロモーターによるβ−Gal量はＰＭ
Ａ処理しない細胞中では１３％であった。比較により、
Uzanら（1991）は、ＧＰIIｂプロモーターによるＣＡＴ
活性は同じ細胞系においてＲＳＶプロモーターの制御下
に得られたＣＡＴ活性の１５％に相当することを見出し
ている。
【００１８】
【表１】
【００１９】結論として、ＨeＬa細胞ではβ−Gal発現
は検出されなかったから、造血細胞系では−597／＋33
ＧＰIIｂプロモーターがレポーター遺伝子の組織特異的
発現を誘発した。ＨＥＬ細胞のこれらの一過性のトラン
スフェクションにおいては、この造血細胞特異的プロモ
ーターで得られるβ−Gal産生はＣＭＶプロモーターで
測定された結果と比較して低かった。しかしながら、イ
ンビトロで得られた結果はUzanら（1991）により公開さ
れた結果に類似している。
は検出されなかったから、造血細胞系では−597／＋33
ＧＰIIｂプロモーターがレポーター遺伝子の組織特異的
発現を誘発した。ＨＥＬ細胞のこれらの一過性のトラン
スフェクションにおいては、この造血細胞特異的プロモ
ーターで得られるβ−Gal産生はＣＭＶプロモーターで
測定された結果と比較して低かった。しかしながら、イ
ンビトロで得られた結果はUzanら（1991）により公開さ
れた結果に類似している。
【００２０】Ｃ．ＨＥＬ細胞におけるＦIXの一過性発現 造血細胞におけるＦIX産生の可能性を試験するため、Ｈ
ＥＬ細胞を、それぞれＣＭＶ−ＦIXおよびＧＰIIｂ−Ｆ
IXと呼ばれるＣＭＶまたはＧＰIIｂプロモーターのいず
れかを有するＦIXベクターで一過性にトランスフェクト
した。試験は最初にＦIX（−41Ｓ）構築体で行い、この
結果をＦIX ＷＴ構築体で確認した。
ＥＬ細胞を、それぞれＣＭＶ−ＦIXおよびＧＰIIｂ−Ｆ
IXと呼ばれるＣＭＶまたはＧＰIIｂプロモーターのいず
れかを有するＦIXベクターで一過性にトランスフェクト
した。試験は最初にＦIX（−41Ｓ）構築体で行い、この
結果をＦIX ＷＴ構築体で確認した。
【００２１】１．材料および方法 ７.５×１０6ＨＥＬ細胞を２０μｌのSuperfect Transf
ection 試薬（Qiagen）を使用して２０μgのＤＮＡでト
ランスフェクトした。６時間後に細胞を収穫し、ＲＰＭ
Ｉ／１％ＢＳＡ±ＰＭＡ １nM中に置き、最終濃度を２.
５×１０6細胞／mlとした。９６時間後に上清を集め、
細胞を計数した。
ection 試薬（Qiagen）を使用して２０μgのＤＮＡでト
ランスフェクトした。６時間後に細胞を収穫し、ＲＰＭ
Ｉ／１％ＢＳＡ±ＰＭＡ １nM中に置き、最終濃度を２.
５×１０6細胞／mlとした。９６時間後に上清を集め、
細胞を計数した。
【００２２】ＦIX ＷＴ構築体については、ｐｃＤＮＡ
３−ＦIX ＷＴおよびｐｃＤＮＡ３ＷＴ.Ｉ１を６μgのF
ugeneおよび２μgのＤＮＡを用いてＨＥＬ細胞（１×１
０6細胞）にトランスフェクトした。一夜インキュベー
トしたのち細胞を収穫し、ＣＭＶ−ＦIXトランスフェク
ションについては５mlのＲＰＭＩ／１％ＢＳＡ／ＰＭＡ
１nM中に、ＧＰIIｂ−ＦIXトランスフェクションにつ
いては２.５mlの誘導培地中に置いた。トランスフェク
ション４日後に上清を回収し、細胞を数えた。
３−ＦIX ＷＴおよびｐｃＤＮＡ３ＷＴ.Ｉ１を６μgのF
ugeneおよび２μgのＤＮＡを用いてＨＥＬ細胞（１×１
０6細胞）にトランスフェクトした。一夜インキュベー
トしたのち細胞を収穫し、ＣＭＶ−ＦIXトランスフェク
ションについては５mlのＲＰＭＩ／１％ＢＳＡ／ＰＭＡ
１nM中に、ＧＰIIｂ−ＦIXトランスフェクションにつ
いては２.５mlの誘導培地中に置いた。トランスフェク
ション４日後に上清を回収し、細胞を数えた。
【００２３】２．ＦIX（−41Ｓ）構築体での結果 細胞をＰＭＡなしでインキュベートした場合は、ＣＭＶ
−ＦIX構築体で得られたＦIXの産生はきわめて低く、Ｅ
ＬＩＳＡ（Asserachrom ＦIX, Stago, Asnieres, Franc
e）によって正確に検出することはできなかった。図４
に示した結果は、１nM ＰＭＡとインキュベートしたの
ちに得られた。ＣＭＶプロモーターの制御下にはＣＭＶ
−ＦIX（−41Ｓ）でトランスフェクトされたＨＥＬ細胞
によるＦIXの分泌は低く（４０８.６６pg／ml）有意で
はなかった。最良の産生はＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）でトラ
ンスフェクトされた細胞により得られた。平均産生量は
ＦIX（−41Ｓ）ｃＤＮＡによる場合より２倍高く、ＦIX
（−41Ｓ）ｃＤＮＡで得られた結果と有意に（ｐ＜０.
０５）異なっていた。細胞数を調整した場合にも類似の
結果が得られた。実際、ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）によって
トランスフェクトされたＨＥＬは、４.５±２.５ng／１
×１０6細胞を産生し、この結果はＦIX（−41Ｓ）でト
ランスフェクトされたＨＥＬ細胞で得られた結果と有意
に相異した（１.５±０.９ng／１×１０6細胞；ｐ＜０.
０１）。
−ＦIX構築体で得られたＦIXの産生はきわめて低く、Ｅ
ＬＩＳＡ（Asserachrom ＦIX, Stago, Asnieres, Franc
e）によって正確に検出することはできなかった。図４
に示した結果は、１nM ＰＭＡとインキュベートしたの
ちに得られた。ＣＭＶプロモーターの制御下にはＣＭＶ
−ＦIX（−41Ｓ）でトランスフェクトされたＨＥＬ細胞
によるＦIXの分泌は低く（４０８.６６pg／ml）有意で
はなかった。最良の産生はＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）でトラ
ンスフェクトされた細胞により得られた。平均産生量は
ＦIX（−41Ｓ）ｃＤＮＡによる場合より２倍高く、ＦIX
（−41Ｓ）ｃＤＮＡで得られた結果と有意に（ｐ＜０.
０５）異なっていた。細胞数を調整した場合にも類似の
結果が得られた。実際、ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）によって
トランスフェクトされたＨＥＬは、４.５±２.５ng／１
×１０6細胞を産生し、この結果はＦIX（−41Ｓ）でト
ランスフェクトされたＨＥＬ細胞で得られた結果と有意
に相異した（１.５±０.９ng／１×１０6細胞；ｐ＜０.
０１）。
【００２４】ＧＰIIｂ−ＦIX構築体についても類似の実
験を行った。この場合は（トランスフェクション後、
２.５×１０6細胞／ml）、ＦIXの産生は弱すぎて、上清
に検出できなかった。３０kdカットオフのMicrosep（登
録商標）マイクロコンセントレーター（Pall Gelman Sc
iences）を使用してタンパク質を濃縮した。ＰＭＡ−刺
激ＨＥＬ細胞によって得られた濃縮ＧＰIIｂ-ＦIX（−4
1Ｓ.Ｉ１）上清中ではＦIXタンパク質はわずかに検出可
能であった。この結果はβ−Galレポ−ター遺伝子で得
られた結果と一致し（表１）、ＣＭＶプロモーターに比
べてＧＰIIｂの能力は低いことが確認された。
験を行った。この場合は（トランスフェクション後、
２.５×１０6細胞／ml）、ＦIXの産生は弱すぎて、上清
に検出できなかった。３０kdカットオフのMicrosep（登
録商標）マイクロコンセントレーター（Pall Gelman Sc
iences）を使用してタンパク質を濃縮した。ＰＭＡ−刺
激ＨＥＬ細胞によって得られた濃縮ＧＰIIｂ-ＦIX（−4
1Ｓ.Ｉ１）上清中ではＦIXタンパク質はわずかに検出可
能であった。この結果はβ−Galレポ−ター遺伝子で得
られた結果と一致し（表１）、ＣＭＶプロモーターに比
べてＧＰIIｂの能力は低いことが確認された。
【００２５】３．ＦIX ＷＴ構築体による結果 図５はＦIX ＷＴによって得られたＦIXの産生を示す。
これらの結果は以下を確認するものである。 - ＨＥＬ細胞は一過性トランスフェクション後にＦIXを
産生できる。 - 最良の産生レベルはＦIX ＷＴ.Ｉ１構築体で得られ、
相当するＦIX ＷＴの結果とは有意差があった。 - ＨＥＬ細胞において一過性トランスフェクション後、
ＧＰIIｂプロモーターはＦIXの産生についてＣＭＶプロ
モーターより有効性が劣った。ＧＰIIｂ−ＦIXＷＴ.Ｉ
１−トランスフェクトＨＥＬ細胞は、ＣＭＶプロモータ
ーの制御下に同じｃＤＮＡで得られたＦIX産生の約３０
％を産生した（２５７.７１±８５.３８pg／１×１０6
細胞 vs ８８１.２８±２８８.３２pg／１×１０6細
胞）。
これらの結果は以下を確認するものである。 - ＨＥＬ細胞は一過性トランスフェクション後にＦIXを
産生できる。 - 最良の産生レベルはＦIX ＷＴ.Ｉ１構築体で得られ、
相当するＦIX ＷＴの結果とは有意差があった。 - ＨＥＬ細胞において一過性トランスフェクション後、
ＧＰIIｂプロモーターはＦIXの産生についてＣＭＶプロ
モーターより有効性が劣った。ＧＰIIｂ−ＦIXＷＴ.Ｉ
１−トランスフェクトＨＥＬ細胞は、ＣＭＶプロモータ
ーの制御下に同じｃＤＮＡで得られたＦIX産生の約３０
％を産生した（２５７.７１±８５.３８pg／１×１０6
細胞 vs ８８１.２８±２８８.３２pg／１×１０6細
胞）。
【００２６】Ｄ．安定にトランスフェクトされたＨＥＬ
細胞中におけるＦIXの発現 上述のように、一過性発現システムで低いＦIXの産生が
得られた。したがって、安定にＦIXを発現する細胞を発
生させた。
細胞中におけるＦIXの発現 上述のように、一過性発現システムで低いＦIXの産生が
得られた。したがって、安定にＦIXを発現する細胞を発
生させた。
【００２７】１．材料および方法 細胞：ＨＥＬ細胞（１×１０6細胞）を、FUGENE（登録
商標）６トランスフェクションシステム（Boehringer，
Mannheim）を用いて５時間、ＰvuＩ線状化プラスミド２
μgによりトランスフェクトした。インキュベーション
後細胞を収穫し、０.６mg／mlのＧ418を補充した新鮮な
培地中に置いた。
商標）６トランスフェクションシステム（Boehringer，
Mannheim）を用いて５時間、ＰvuＩ線状化プラスミド２
μgによりトランスフェクトした。インキュベーション
後細胞を収穫し、０.６mg／mlのＧ418を補充した新鮮な
培地中に置いた。
【００２８】ＦIXの産生を比較するため、Ｇ418−抵抗
性細胞をビタミンＫ １ng／ml±ＰＭＡ １nM（２.５×
１０5細胞／ml）を補充したＲＰＭＩ／１％ＢＳＡ中に
置いた。１、２、３または４日間インキュベートしたの
ち、細胞を計数し、上清を凍結した。ＦIXの濃度はＦIX
ＥＬＩＳＡキット（Asserachrom ＦIX, Stago, Asnier
es, France）を用いて測定した。
性細胞をビタミンＫ １ng／ml±ＰＭＡ １nM（２.５×
１０5細胞／ml）を補充したＲＰＭＩ／１％ＢＳＡ中に
置いた。１、２、３または４日間インキュベートしたの
ち、細胞を計数し、上清を凍結した。ＦIXの濃度はＦIX
ＥＬＩＳＡキット（Asserachrom ＦIX, Stago, Asnier
es, France）を用いて測定した。
【００２９】イムノブロッティング分析：上清（１ml）
を、平衡緩衝液（Hepes １０mM，ＫＣｌ １００mM，Ｍ
ｇＣｌ2 ２mM，Triton×100 ０.１％）中に４倍希釈し
た。Centeon（登録商標、USA）によって恵与されたDEAE
A50 Sephadexに結合した抗−ヒト第IX因子抗体５０μ
ｌを上清溶液に加え、４℃で１時間インキュベートし
た。ＤＥＡＥをついで遠心分離（２５００rpmで２分）
により集め、平衡緩衝液で３回洗浄した。第IX因子はLa
emmli緩衝液（Laemmli, 1970）で溶出した。第IX因子を
含有するサンプルをSDS-PAGE／１０％ポリアクリルアミ
ドゲル上電気泳動に付し、Hybond（登録商標）C Pure膜
（Amersham）上にセミドライブロットした。ブロット
を、ＴＢＳ（０.１５Ｍ ＮａＣｌ，１０mM Tris-ＨＣ
ｌ，pH７.５）−Tween（０.１％）によって室温で１時
間ブロックし、ついでポリクローナルウサギ抗−ヒトＦ
IX抗体（Dako，登録商標）の１：３,０００希釈液とイ
ンキュベートした。膜をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、つい
でペルオキシダーゼ標識抗−ウサギ抗体（Biorad）の
１：１０,０００希釈液と３０分間インキュベートし
た。３回洗浄後、化学ルミネッセントシグナルを、ＥＣ
Ｌシステム（Amersham，登録商標）を用いオートラジオ
グラフィーによって検出した。
を、平衡緩衝液（Hepes １０mM，ＫＣｌ １００mM，Ｍ
ｇＣｌ2 ２mM，Triton×100 ０.１％）中に４倍希釈し
た。Centeon（登録商標、USA）によって恵与されたDEAE
A50 Sephadexに結合した抗−ヒト第IX因子抗体５０μ
ｌを上清溶液に加え、４℃で１時間インキュベートし
た。ＤＥＡＥをついで遠心分離（２５００rpmで２分）
により集め、平衡緩衝液で３回洗浄した。第IX因子はLa
emmli緩衝液（Laemmli, 1970）で溶出した。第IX因子を
含有するサンプルをSDS-PAGE／１０％ポリアクリルアミ
ドゲル上電気泳動に付し、Hybond（登録商標）C Pure膜
（Amersham）上にセミドライブロットした。ブロット
を、ＴＢＳ（０.１５Ｍ ＮａＣｌ，１０mM Tris-ＨＣ
ｌ，pH７.５）−Tween（０.１％）によって室温で１時
間ブロックし、ついでポリクローナルウサギ抗−ヒトＦ
IX抗体（Dako，登録商標）の１：３,０００希釈液とイ
ンキュベートした。膜をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、つい
でペルオキシダーゼ標識抗−ウサギ抗体（Biorad）の
１：１０,０００希釈液と３０分間インキュベートし
た。３回洗浄後、化学ルミネッセントシグナルを、ＥＣ
Ｌシステム（Amersham，登録商標）を用いオートラジオ
グラフィーによって検出した。
【００３０】プロコアギュラント活性：第IX因子活性を
一段階凝血アッセイによって測定した。対照血漿５０μ
ｌを、イミダゾール緩衝液（Diagnostica Stago, Asnie
res,France）に希釈した（１／１０）。希釈した上清５
０μｌを５０μｌの第IX因子欠乏血漿（Immuno Illkirc
h, France）および５０μｌのSilimat（登録商標）セフ
ァリン（Bio-merieux；登録商標、Marcy l'Etoile, Fra
nce）に加えた。４分間３７℃でインキュベートしたの
ち、５０μｌの５０mM ＣａＣｌ2緩衝液を加えて凝血を
開始させた。凝血時間をSTA Compact（登録商標）コア
ギュロメーター（Diagnostica Stago（登録商標）, Asn
ieres, France）で測定し、第IX因子活性をｌｏｇ−ｌ
ｏｇ標準曲線から測定した。
一段階凝血アッセイによって測定した。対照血漿５０μ
ｌを、イミダゾール緩衝液（Diagnostica Stago, Asnie
res,France）に希釈した（１／１０）。希釈した上清５
０μｌを５０μｌの第IX因子欠乏血漿（Immuno Illkirc
h, France）および５０μｌのSilimat（登録商標）セフ
ァリン（Bio-merieux；登録商標、Marcy l'Etoile, Fra
nce）に加えた。４分間３７℃でインキュベートしたの
ち、５０μｌの５０mM ＣａＣｌ2緩衝液を加えて凝血を
開始させた。凝血時間をSTA Compact（登録商標）コア
ギュロメーター（Diagnostica Stago（登録商標）, Asn
ieres, France）で測定し、第IX因子活性をｌｏｇ−ｌ
ｏｇ標準曲線から測定した。
【００３１】第XIａ因子によるＦIXの活性化：ＦIXを免
疫沈降させ、インビトロにおいて第XIａ因子（Enzyme R
esearch Lab., Swansea, UK）により、酵素／基質比１
／４０でさらに活性化させた。活性化緩衝液の組成は、
Tris-ＨＣｌ ５０mM、ＮａＣｌ １５０mM、ＣａＣｌ2
５mM、ポリエチレングリコール０.０１％、pH７.５であ
った。反応混合物を１時間３０分間３７℃でインキュベ
ートし、反応したサンプルをついでLaemmli緩衝液に希
釈した。
疫沈降させ、インビトロにおいて第XIａ因子（Enzyme R
esearch Lab., Swansea, UK）により、酵素／基質比１
／４０でさらに活性化させた。活性化緩衝液の組成は、
Tris-ＨＣｌ ５０mM、ＮａＣｌ １５０mM、ＣａＣｌ2
５mM、ポリエチレングリコール０.０１％、pH７.５であ
った。反応混合物を１時間３０分間３７℃でインキュベ
ートし、反応したサンプルをついでLaemmli緩衝液に希
釈した。
【００３２】ノーザンブロット分析：７×１０6の安定
にトランスフェクトされたＨＥＬ細胞からRneasy Mini
キット（Qiagen, Courtaboeuf, France）を使用して総
ＲＮＡを調製した。リン酸緩衝液（１０mM ＮａＨ2ＰＯ
4、１０mM Ｎａ2ＰＯ4、pH７）中１.２％アガロースゲ
ル上電気泳動に付したのち、ｍＲＮＡをナイロン膜（Hy
bond N, Amersham, Les Ulis, France）上にトランスフ
ァーした。完全長のヒト第IX因子またはラットＧＡＰＤ
ＨからなるＲＮＡプローブを発生させ、Ｔ７ ＲＮＡポ
リメラーゼキット（Boehringer Mannheim, Meylan, Fra
nce）でインビトロトランスクリプションシステムを用
いて、ジゴキシゲニン−ＵＴＰを含有するＮＴＰで標識
した。ハイブリダイゼーションしたのち、Boehringer M
annheim（Meylan,France）からのＤＩＧルミネッセント
検出キットを用い、化学ルミネッセンスによりシグナル
を検出した。
にトランスフェクトされたＨＥＬ細胞からRneasy Mini
キット（Qiagen, Courtaboeuf, France）を使用して総
ＲＮＡを調製した。リン酸緩衝液（１０mM ＮａＨ2ＰＯ
4、１０mM Ｎａ2ＰＯ4、pH７）中１.２％アガロースゲ
ル上電気泳動に付したのち、ｍＲＮＡをナイロン膜（Hy
bond N, Amersham, Les Ulis, France）上にトランスフ
ァーした。完全長のヒト第IX因子またはラットＧＡＰＤ
ＨからなるＲＮＡプローブを発生させ、Ｔ７ ＲＮＡポ
リメラーゼキット（Boehringer Mannheim, Meylan, Fra
nce）でインビトロトランスクリプションシステムを用
いて、ジゴキシゲニン−ＵＴＰを含有するＮＴＰで標識
した。ハイブリダイゼーションしたのち、Boehringer M
annheim（Meylan,France）からのＤＩＧルミネッセント
検出キットを用い、化学ルミネッセンスによりシグナル
を検出した。
【００３３】２．ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）発現ＨＥＬ細胞
の１日ＦIX産生 2.1．ＣＭＶ−ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）トランスフェクトＨ
ＥＬ細胞 ｐｃＤＮＡ３−トランスフェクトＨＥＬ細胞の上清中に
ＦIXは検出されなかった（図６）。４日後、ＣＭＶ−Ｆ
IX（−41Ｓ.Ｉ１）でトランスフェクトされた細胞の条
件培地中に１１.６５ng／mlのＦIXが検出された。ＰＭ
Ａ誘導後、ＦIXの産生（２５９.８７ng／ml）はＰＭＡ
なしで得られた産生より２３倍高く、一過性トランスフ
ェクションで得られた結果よりも２５０倍高かった。
の１日ＦIX産生 2.1．ＣＭＶ−ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）トランスフェクトＨ
ＥＬ細胞 ｐｃＤＮＡ３−トランスフェクトＨＥＬ細胞の上清中に
ＦIXは検出されなかった（図６）。４日後、ＣＭＶ−Ｆ
IX（−41Ｓ.Ｉ１）でトランスフェクトされた細胞の条
件培地中に１１.６５ng／mlのＦIXが検出された。ＰＭ
Ａ誘導後、ＦIXの産生（２５９.８７ng／ml）はＰＭＡ
なしで得られた産生より２３倍高く、一過性トランスフ
ェクションで得られた結果よりも２５０倍高かった。
【００３４】2.2．ＧＰIIｂ−ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）トラ
ンスフェクトＨＥＬ細胞 ＨＥＬ細胞をｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂベクターでトラン
スフェクトした場合には、条件培地中に、ＦIXは検出さ
れなかった。ＧＰIIｂ−ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）でＨＥＬ
細胞をトランスフェクトした場合、ＦIXはインキュベー
ションの４日間に規則的に増加した（図７）。培養４日
後、ＧＰIIｂ−ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）のプールは、上清
中に３５.０±７.８ng／mlのＦIXを産生した。ＰＭＡ誘
導後には、ＦIXの産生は１６５.０±３２.５２ng／mlに
達した。
ンスフェクトＨＥＬ細胞 ＨＥＬ細胞をｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂベクターでトラン
スフェクトした場合には、条件培地中に、ＦIXは検出さ
れなかった。ＧＰIIｂ−ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）でＨＥＬ
細胞をトランスフェクトした場合、ＦIXはインキュベー
ションの４日間に規則的に増加した（図７）。培養４日
後、ＧＰIIｂ−ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）のプールは、上清
中に３５.０±７.８ng／mlのＦIXを産生した。ＰＭＡ誘
導後には、ＦIXの産生は１６５.０±３２.５２ng／mlに
達した。
【００３５】2.3．プロコアギュラント活性 ＦIXのプロコアギュラント活性はＨＥＬ細胞からの上清
中のＦIX抗原と正相関した（図８）。ＧＰIIｂ−ＦIX
（−41Ｓ.Ｉ１）発現ＨＥＬ細胞（培養培地：ＲＰＭＩ
／１％ＢＳＡ）により産生されるＦIXの比活性は０.３
４±０.０７mU／ngであった。
中のＦIX抗原と正相関した（図８）。ＧＰIIｂ−ＦIX
（−41Ｓ.Ｉ１）発現ＨＥＬ細胞（培養培地：ＲＰＭＩ
／１％ＢＳＡ）により産生されるＦIXの比活性は０.３
４±０.０７mU／ngであった。
【００３６】2.4．ＦIX免疫沈降 トランスフェクトされたＨＥＬ細胞の上清を免疫沈降さ
せ、ウエスタンブロットにより分泌タンパク質の分子量
を確証した。精製組換え第IX因子（Mononine，登録商
標）を対照として使用した。ｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂ発
現細胞の上清には、ＦIXは検出されなかった。ＰＭＡで
誘導したかまたは誘導しないＧＰIIｂ−ＦIX（−41Ｓ.
Ｉ１）ＨＥＬ細胞の上清には、分子量約６０kDaの１つ
の特異的なバンドが検出された。このタンパク質は免疫
精製したＦIX（Mononine，登録商標）と同じレベルで移
動した
せ、ウエスタンブロットにより分泌タンパク質の分子量
を確証した。精製組換え第IX因子（Mononine，登録商
標）を対照として使用した。ｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂ発
現細胞の上清には、ＦIXは検出されなかった。ＰＭＡで
誘導したかまたは誘導しないＧＰIIｂ−ＦIX（−41Ｓ.
Ｉ１）ＨＥＬ細胞の上清には、分子量約６０kDaの１つ
の特異的なバンドが検出された。このタンパク質は免疫
精製したＦIX（Mononine，登録商標）と同じレベルで移
動した
【００３７】３．ＦIX（ＷＴ）およびＦIX（ＷＴ.Ｉ
１）発現ＨＥＬ細胞の１日ＦIX産生 3.1．安定なトランスフェクション後におけるＣＭＶお
よびＧＰIIｂプロモーターの有効性の比較 ＨＥＬ細胞を、ｐｃＤＮＡ３.１およびｐｃＤＮＡ３−
ＧＰIIｂを陰性対照として用い以下の構築体：ＧＰIIｂ
−ＦIX（ＷＴ）、ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）および
相当するＣＭＶ構築体［ＣＭＶ−ＦIX（ＷＴ）およびＣ
ＭＶ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）］により安定にトランスフェ
クトした。図９はＣＭＶ−ＦIXおよびＧＰIIｂ−ＦIXＨ
ＥＬ細胞で得られた結果を示す。期待されたように２つ
の陰性対照（ｐｃＤＮＡ３およびｐｃＤＮＡ３−ＧＰII
ｂ）では、ＦIXは上清に検出されなかった。ＦIX（Ｗ
Ｔ）の発現がＧＰIIｂプロモーターによって指揮された
ときは、ＣＭＶ−ＦIXに比べ有意に高いＦIXの産生が上
清に測定された。ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ）発現ＨＥＬ細
胞は、同じ条件（±ＰＭＡ）でＣＭＶ−ＦIX（ＷＴ）に
よってトランスフェクトされたＨＥＬ細胞よりも約５〜
１０倍高いＦIX量を産生した。
１）発現ＨＥＬ細胞の１日ＦIX産生 3.1．安定なトランスフェクション後におけるＣＭＶお
よびＧＰIIｂプロモーターの有効性の比較 ＨＥＬ細胞を、ｐｃＤＮＡ３.１およびｐｃＤＮＡ３−
ＧＰIIｂを陰性対照として用い以下の構築体：ＧＰIIｂ
−ＦIX（ＷＴ）、ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）および
相当するＣＭＶ構築体［ＣＭＶ−ＦIX（ＷＴ）およびＣ
ＭＶ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）］により安定にトランスフェ
クトした。図９はＣＭＶ−ＦIXおよびＧＰIIｂ−ＦIXＨ
ＥＬ細胞で得られた結果を示す。期待されたように２つ
の陰性対照（ｐｃＤＮＡ３およびｐｃＤＮＡ３−ＧＰII
ｂ）では、ＦIXは上清に検出されなかった。ＦIX（Ｗ
Ｔ）の発現がＧＰIIｂプロモーターによって指揮された
ときは、ＣＭＶ−ＦIXに比べ有意に高いＦIXの産生が上
清に測定された。ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ）発現ＨＥＬ細
胞は、同じ条件（±ＰＭＡ）でＣＭＶ−ＦIX（ＷＴ）に
よってトランスフェクトされたＨＥＬ細胞よりも約５〜
１０倍高いＦIX量を産生した。
【００３８】3.2．イントロン１はＦIXの産生を増大さ
せる 本発明者らは、ＧＰIIｂプロモーターによって指揮され
たＦIX（ＷＴ.Ｉ１）がＨＥＬ細胞においてＦIXの産生
を増大させる能力について試験した。上清における第IX
因子の濃度の評価により最高の産生はＦIX（ＷＴ.Ｉ
１）構築体で得られることが証明された。実際、培養４
日後、ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）でトランスフェク
トされたＨＥＬ細胞は、ＧＰIIｂ−ＦIX発現ＨＥＬ細胞
よりも約３０倍高いＦIX量を分泌した（図１０）。細胞
をＰＭＡで刺激した場合には、ＧＰIIｂＦIX.Ｉ１でト
ランスフェクトされた細胞もまた、ＧＰIIｂ−ＦIX−発
現細胞と比較して高いＦIXＣ量（×１２）を産生した
（日４の値：３９８.０４±９４.２３ng／ml vs ３２.
１２±１４.８５ng／mlのＦIX）。
せる 本発明者らは、ＧＰIIｂプロモーターによって指揮され
たＦIX（ＷＴ.Ｉ１）がＨＥＬ細胞においてＦIXの産生
を増大させる能力について試験した。上清における第IX
因子の濃度の評価により最高の産生はＦIX（ＷＴ.Ｉ
１）構築体で得られることが証明された。実際、培養４
日後、ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）でトランスフェク
トされたＨＥＬ細胞は、ＧＰIIｂ−ＦIX発現ＨＥＬ細胞
よりも約３０倍高いＦIX量を分泌した（図１０）。細胞
をＰＭＡで刺激した場合には、ＧＰIIｂＦIX.Ｉ１でト
ランスフェクトされた細胞もまた、ＧＰIIｂ−ＦIX−発
現細胞と比較して高いＦIXＣ量（×１２）を産生した
（日４の値：３９８.０４±９４.２３ng／ml vs ３２.
１２±１４.８５ng／mlのＦIX）。
【００３９】3.3．ＨＥＬ細胞の上清に産生された組換
えＦIXの性質 ＨＥＬ細胞の上清におけるＦIXタンパク質の性質をさら
に明らかにするため、ＦIXを免疫沈降させ、サンプルを
電気泳動に付し、ブロットした。ｐｃＤＮＡ３−ＧＰII
ｂ発現ＨＥＬ細胞においては二次抗体単独で単一の非特
異的バンドが検出された。ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ）およ
びＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）でトランスフェクトさ
れたＨＥＬ細胞では、約６０kDaに特異的なバンドが検
出された。この分子量は以前に検出されたＦIX（−41Ｓ
Ｉ１）、対照およびｐｃＤＮＡ３−ＣＭＶ／ＦIX（Ｗ
Ｔ.Ｉ１）発現ＨepＧ２細胞によって産生されるＦIXに
類似した。イムノブロット分析におけるバンドの強度の
差は図１０に示した抗原量と正相関した。
えＦIXの性質 ＨＥＬ細胞の上清におけるＦIXタンパク質の性質をさら
に明らかにするため、ＦIXを免疫沈降させ、サンプルを
電気泳動に付し、ブロットした。ｐｃＤＮＡ３−ＧＰII
ｂ発現ＨＥＬ細胞においては二次抗体単独で単一の非特
異的バンドが検出された。ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ）およ
びＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）でトランスフェクトさ
れたＨＥＬ細胞では、約６０kDaに特異的なバンドが検
出された。この分子量は以前に検出されたＦIX（−41Ｓ
Ｉ１）、対照およびｐｃＤＮＡ３−ＣＭＶ／ＦIX（Ｗ
Ｔ.Ｉ１）発現ＨepＧ２細胞によって産生されるＦIXに
類似した。イムノブロット分析におけるバンドの強度の
差は図１０に示した抗原量と正相関した。
【００４０】3.4．ＦIXプロコアギュラント活性および
ＦXIａによるＦIX活性化 ＦIXは、完全な活性のためには適切にプロセッシングさ
れる必要のあることは以前に示されている。第IX因子の
コアギュラント活性を、ＰＭＡ−刺激ＧＰIIｂ−ＦIX
（ＷＴ.Ｉ１）でトランスフェクトされたＨＥＬ細胞の
上清において測定した（図１１）。ＦIXのプロコアギュ
ラント活性は抗原濃度に正相関し、分子の正しいプロセ
ッシングを指示した。上清の平均ＦIX比活性は１６０±
６９Ｕ／mgであった。凝血カスケードの間に、ＦIXはＦ
XIａによって活性化される必要がある。ＦXIａとのイン
キュベーション後におけるＦIXの切断、すなわちＨＥＬ
細胞から免疫沈降させたＦIXの活性化は重鎖（２９kD
a）および軽鎖（１９kDa）に相当する２つのバンドの出
現を生じた。活性化率およびＨＥＬ上清からのタンパク
質プロファイルはMononineで得られた結果と類似した。
ＦXIａによるＦIX活性化 ＦIXは、完全な活性のためには適切にプロセッシングさ
れる必要のあることは以前に示されている。第IX因子の
コアギュラント活性を、ＰＭＡ−刺激ＧＰIIｂ−ＦIX
（ＷＴ.Ｉ１）でトランスフェクトされたＨＥＬ細胞の
上清において測定した（図１１）。ＦIXのプロコアギュ
ラント活性は抗原濃度に正相関し、分子の正しいプロセ
ッシングを指示した。上清の平均ＦIX比活性は１６０±
６９Ｕ／mgであった。凝血カスケードの間に、ＦIXはＦ
XIａによって活性化される必要がある。ＦXIａとのイン
キュベーション後におけるＦIXの切断、すなわちＨＥＬ
細胞から免疫沈降させたＦIXの活性化は重鎖（２９kD
a）および軽鎖（１９kDa）に相当する２つのバンドの出
現を生じた。活性化率およびＨＥＬ上清からのタンパク
質プロファイルはMononineで得られた結果と類似した。
【００４１】3.5．ノーザンブロット分析 本発明者らは、ＨＥＬ細胞で産生されるＦIXタンパク質
の量がＦIX ｃＤＮＡ中のＦIXイントロン１の存在に密
接に関連することを示した。本発明者らはＨＥＬ細胞の
異なるトランスフェクションからのＦIX ｍＲＮＡを分
析した。ｍＲＮＡはＰＭＡによって誘導するかまたはし
ないでｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂでトランスフェクトした
ＨＥＬ細胞中のＦIX ｍＲＮＡプローブとはハイブリダ
イズしなかった。ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）構築体でトランス
フェクトされた細胞では、１.４kbｍＲＮＡの正しいサ
イズを示す１個の特異的なバンドが検出された。ＧＰII
ｂ−ＦIX（ＷＴ）ＨＥＬ細胞では、ＦIX ｍＲＮＡはＰ
ＭＡ誘導後にのみ検出可能であった。これらのｍＲＮＡ
はＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）ＨＥＬ細胞中に検出さ
れるものと同じサイズを有する。異なる溶解物中のｍＲ
ＮＡの量は上清中に検出される抗原の量に正相関し、し
たがって、非刺激ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ）ＨＥＬ細胞で
検出されないことが説明される。しかしながら、大量の
総ｍＲＮＡを用いた場合は、期待されたｍＲＮＡがこれ
らの細胞中に検出されることが確認された。
の量がＦIX ｃＤＮＡ中のＦIXイントロン１の存在に密
接に関連することを示した。本発明者らはＨＥＬ細胞の
異なるトランスフェクションからのＦIX ｍＲＮＡを分
析した。ｍＲＮＡはＰＭＡによって誘導するかまたはし
ないでｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂでトランスフェクトした
ＨＥＬ細胞中のＦIX ｍＲＮＡプローブとはハイブリダ
イズしなかった。ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）構築体でトランス
フェクトされた細胞では、１.４kbｍＲＮＡの正しいサ
イズを示す１個の特異的なバンドが検出された。ＧＰII
ｂ−ＦIX（ＷＴ）ＨＥＬ細胞では、ＦIX ｍＲＮＡはＰ
ＭＡ誘導後にのみ検出可能であった。これらのｍＲＮＡ
はＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）ＨＥＬ細胞中に検出さ
れるものと同じサイズを有する。異なる溶解物中のｍＲ
ＮＡの量は上清中に検出される抗原の量に正相関し、し
たがって、非刺激ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ）ＨＥＬ細胞で
検出されないことが説明される。しかしながら、大量の
総ｍＲＮＡを用いた場合は、期待されたｍＲＮＡがこれ
らの細胞中に検出されることが確認された。
【００４２】3.1Ｅ．結論 上述の結果は造血細胞系ＨＥＬが完全に活性なＦIXを産
生し分泌することを示している。一過性のトランスフェ
クション後、最高の産生はＣＭＶ−ＦIX ＨＥＬ細胞に
比べてＣＭＶ−ＦIX.Ｉ１ ＨＥＬ細胞で得られ、この造
血細胞系中のＦIXイントロン１の発現増加活性が証明さ
れた。ＧＰIIｂプロモーターを使用すると、ＦIX産生は
組織特異的であった。安定なトランスフェクションは、
ＧＰIIｂプロモーターがＨＥＬ細胞においてＦIX転写の
誘導に効果的であり、ＦIXイントロン１は重要な発現増
加活性を有することを証明した。分泌されるＦIXタンパ
ク質は約６０kDaの分子量を有し、Mononine（登録商
標）に含有されるＦIXに類似し、したがって正常な突然
変異プロセスを受けるものと思われる。最後に一段階凝
血アッセイを用いたＦIXコアギュラント活性はＦIX抗原
に相当した。ＦXIａ活性化後のタンパク質プロファイル
はMononineで得られたプロファイルに類似し、組換え分
子が完全に活性であることを指示している。ＨＥＬ細胞
で得られたこれらの結果は、ＦIXタンパク質がＣＤ３４
＋造血幹細胞によって産生され得るという仮説を支持す
るものである。
生し分泌することを示している。一過性のトランスフェ
クション後、最高の産生はＣＭＶ−ＦIX ＨＥＬ細胞に
比べてＣＭＶ−ＦIX.Ｉ１ ＨＥＬ細胞で得られ、この造
血細胞系中のＦIXイントロン１の発現増加活性が証明さ
れた。ＧＰIIｂプロモーターを使用すると、ＦIX産生は
組織特異的であった。安定なトランスフェクションは、
ＧＰIIｂプロモーターがＨＥＬ細胞においてＦIX転写の
誘導に効果的であり、ＦIXイントロン１は重要な発現増
加活性を有することを証明した。分泌されるＦIXタンパ
ク質は約６０kDaの分子量を有し、Mononine（登録商
標）に含有されるＦIXに類似し、したがって正常な突然
変異プロセスを受けるものと思われる。最後に一段階凝
血アッセイを用いたＦIXコアギュラント活性はＦIX抗原
に相当した。ＦXIａ活性化後のタンパク質プロファイル
はMononineで得られたプロファイルに類似し、組換え分
子が完全に活性であることを指示している。ＨＥＬ細胞
で得られたこれらの結果は、ＦIXタンパク質がＣＤ３４
＋造血幹細胞によって産生され得るという仮説を支持す
るものである。
【００４３】文献 Kurachi K, Kurachi S. Regulation mechanism of the
Factor IX gene. Thrombosis and Haemostasis. 1995,
73, 333-339.Salier J P, Hirosawa S, Kurachi K. Fun
ctional characterization of the5′regulatory regio
n of the human factor IX gene. J Biol Chem 1990, 2
65,7062-7068.Camerino G, Grzeschik K H, Jaye M, De
La Salle H, Tolstoshev P, LecocqJP, Hellig R, Man
del JL. Regional localization on the human X chrom
osome and polymorphism of the coagulation factor I
X gene (hemophilia B locus). ProcNatl Acad Sci USA
1984, 81, 498-502.Boyd Y, Buckle V J, Munro E A,
Migeon B R, Craig IW. Assignment of thehemophilia
B (factor IX) locus to the q26-qter region of the
X chromosome. Ann Hum Genet 1984, 48, 145-152.Yosh
itake S, Schach B, Foster DC, Davie EW, Kurachi K.
Nucleotide sequence of the gene for human factor
IX (antihemophilic factor B). Biochemistry 1985, 2
4, 3736-3750.Roberts H R. Molecular Biology of the
Hemophilia B. Thrombosis and Haemostasis 1993, 7
0, 1-9.Nakai H, Herzog R W, Hagstrom J N, Walter
J, Kung S H, Yang E Y, Tai SJ, Iwaki Y, Kurtzman G
J, Fisher KJ, Colosi P, Couto LB, High KA. Adeno-a
ssociated viral vector-mediated gene transfer of h
uman blood coagulation factor IX into mouse liver.
Blood 1998, 91, 4600-4607.
Factor IX gene. Thrombosis and Haemostasis. 1995,
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X gene (hemophilia B locus). ProcNatl Acad Sci USA
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Nucleotide sequence of the gene for human factor
IX (antihemophilic factor B). Biochemistry 1985, 2
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【００４４】White SJ, Page SM, Margaritis P, Brown
lee GG. Long-term expression ofhuman clotting fact
or IX from retrovirally transduced primary human k
eratinocytes in vivo, Hum Gene Ther 1998, 9, 1187-
1195.Baru M, Sha'anani J, Nur I. Retroviral-mediat
ed in vivo gene transferinto muscle cells and synt
hesis of human factor IX in mice. Intervirology 19
95, 38, 356-360.Wang JM, Zheng H, Blaivas M, Kurac
hi K.Persistent systemic productionof human factor
IX in mice by skeletal myoblast-mediated gene tra
nsfer:feasibility of repeat application to obtain
therapeutic levels. Blood 1997, 90, 1075-1082.Cher
ington V,Chiang GG, McGrath CA, Gaffney A, Galanop
oulos T, MeriillW, Bizinkauskas CB, Hansen M, Sobo
lewski J, Levine PH, Greenberger JS,Hurwitz DR. Re
troviral vector-modified bone marrow stromal cells
secretebiologically active factor IX in vitro and
transiently deliver therapeutic levels of human f
actor IX to the plasma of dogs after reinfusion. H
um Gene Ther 1998, 9, 1397-1407.Hao QL, Malik P, S
alazar R, Tang H, Gordon EM, Kohn DB. Expression o
fbiologically active human factor IX in human hema
topoietic cells after retroviral vector-mediated g
ene transduction. Hum Gene Ther 1995, 6, 873-880.M
artin P, Papayannopoulou T. HEL cells: a new human
erythroleukemiacell line with spontaneous and ind
uced globin expression. Science 1982,216, 1233-123
5.Tabilio A, Rosa J P, Testa U, Kieffer N, Nurden
A T, Del Canizo M C, Breton-Gorius J, Vainchenker
W. Expression of platelet membrance glycoproteins
and alpha-granule proteins by a human erythroleuke
mia cell line (HEL). EMBO J 1984, 3, 453-459.Long
MW, Heffner CH, Williams JL, Peters C, Prochownik
EV. Regulationof megakaryocyte phenotype in erythr
oleukemia cells. J Clin Invest 1990,85, 1072-1084.
Nishizuka Y. The role of protein kinase C in cell
surface signal transduction and tumor promotion. N
ature 1984, 308, 693-698.
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ington V,Chiang GG, McGrath CA, Gaffney A, Galanop
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troviral vector-modified bone marrow stromal cells
secretebiologically active factor IX in vitro and
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actor IX to the plasma of dogs after reinfusion. H
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【００４５】Hong Y, Martin J F, Vainchenker W, Eru
salimsky J D. Inhibition of protein kinase C suppr
esses megakaryocytic differentiation and stimulate
s erythroid differentiation in HEL cells. Blood 19
96, 87, 123-131.Haas TA, Plow EF. Integrin-ligand
interactions: a year in review. CurrOpin Cell Biol
1994, 6, 656-662.Uzan G, Frachet P, Lajmanovich
A, Prandini MH, Denarier E, Duperray A,Loftus J, G
insberg M, Plow E, Marguerie G. cDNAs clones for h
uman platelet GPIIb corresponding to mRNA from meg
akaryocytes and HEL cells. Evidence for an extensi
ve homology to other Arg-GlyAsp adhesion receptor
s. Eur J Biochem 1988, 171, 87-93.Frachet P, Uzan
G, Thevenon D, Denarier E, Prandini M H, Marguerie
G.GPIIb and GPIIIa amino acid sequences deduced f
rom human megakaryocyte cDNAs. Mol Biol Rep 1990,
14, 27-33.Prandini MH, Denarier E, Frachet P, Uzan
G, Marguerie G. Isolation ofthe human platelet gl
ycoprotein IIb gene and characterization of the
5′flanking region. Biochem Biophys Res Comm 1988,
156, 595-601.Bray P F, Rosa J P, Johnston G I, Sh
iu D T, Cook R G, Lau C, Kan Y W,McEver RP, Shuman
MA. Platelet glycoprotein IIb. Chromosomal locali
zation and tissue expression. J Clin Invest 1987,
80, 1812-1817.Uzan G, Prenant M, Prandini MH, Mart
in F, Marguerie G. Tissue specificexpression of th
e platelet GPIIb gene. J Biol Chem 1991, 266, 8932
-8939．Uzan G, Prandini MH, Beilhier R. Regulation
of gene transcription during the differentiation
of megakaryocytes. Thromb Haemost 1995, 74, 210-21
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【００４６】
【配列表】 <110> Aventis Behring GmbH <120> DNA-construct for the tissue-specific expression of a blood coagulation factor <130> HES-4064 <141> 2000-4-28 <150> 99107397.4 <151> 1999-4-29 <160> 4 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 TGGATCCTTG GAGCGCGTGA ACATGATCTT GG 32 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 TGGATCCATG CAGCGCGTGA ACATGATCAT GGCAGAA 37 <210> 3 <211> 674 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 -643 -597 TCACCACCCT GTCCCCAGCA CTGACTGCAC TGCTGTGGCC ACACTAAAGC TTGGCTCAAG 60 HindIII ACGGAGGAGG AGTGAGGAAG CTGCTGCACC AATATGGCTG GTTGAGGCCG CCCAAGGTCC 120 TAGAAGGAGG AAGTGGGTAA ATGCCATATC CAAAAAGATA CAGAAGCCTC AGGTTTTATC 180 GGGGGCAGCA GCTTCCTTCT CCTTCCCCGA CCTGTGGCCA AGTCACAAAG CACCACAGCT 240 GTACAGCCAG ATGGGGGAAG GGAGGAGATT AGAACTGTAG GCTAGAGTAG ACAAGTATGG 300 ACCAGTTCAC AATCACGCTA TCCCAAGCAG AAAGTGATGG TGGCTTGGAC TAGCACGGTG 360 GTAGTAGAGA TGGGGTAAAG ATTCAAGAGA CATCATTGAT AGGCAGAACC AATAGGACAT 420 GGTAATAAAC TATTCTCAGG AAAGGGGAGG AGTCATGGCT TTCAGCCATG AGCATCCACC 480 CTCTGGGTGG CCTCACCCAC TTCCTGGCAA TTCTAGCCAC CATGAGTCCA GGGGCTATAG 540 CCCTTTGCTC TGCCCGTTGC TCAGCAAGTT ACTTGGGGTT CCAGTTTGAT AAGAAAAGAC 600 +1 TTCCTGTGGA GGAATCTGAA GGGAAGGAGG AGGAGCTGGC CCATTCCTGC CTGGGAGGTT 660 +33 GTGGAAGAAG GAAG 674 <210> 4 <211> 127 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 +1 +33 GGCCCATTCC TGCCTGGGAG GTTGTGGAAG AAGGAAGACT AGAGGATCCA CTAGTCCAGT 60 BamHI GTGGTGGAAT TCTGCAGATA TCCAGCACAG TGGCGGCCGC TCGAGCTCAG AGGGCCCGTT 120 NotI XhoI TAAACCC 127
【図１】ｐｃＤＮＡ３ベクター中へのＧＰIIｂプロモー
ターのクローニングを示す。
ターのクローニングを示す。
【図２】β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子ベクタ
ーとして、ｐＵＴ535−δＣＭＶベクターよりｐＵＴ535
−ＧＰIIｂベクターの構築を示す。
ーとして、ｐＵＴ535−δＣＭＶベクターよりｐＵＴ535
−ＧＰIIｂベクターの構築を示す。
【図３】ＨeＬa細胞中（パネルＡ）およびＨＥＬ細胞中
（パネルＢ）中、ＧＰIIｂにより指揮されるβ−Gal一
過性発現を示す。
（パネルＢ）中、ＧＰIIｂにより指揮されるβ−Gal一
過性発現を示す。
【図４】ＨＥＬ細胞中、ＣＭＶプロモーターの制御下に
おける一過性ＦIXの産生を示す（ｐｃＤＮＡを統計処理
の対照として使用）。
おける一過性ＦIXの産生を示す（ｐｃＤＮＡを統計処理
の対照として使用）。
【図５】ＰＭＡ １nMによる誘導後、ＨＥＬ細胞中ＣＭ
ＶまたはＧＰIIｂプロモーターの制御下における一過性
ＦIX ＷＴの産生を示す（ｐｃＤＮＡ３およびｐｃＤＮ
Ａ３−ＧＰIIｂをそれぞれ統計処理の対照として使
用）。
ＶまたはＧＰIIｂプロモーターの制御下における一過性
ＦIX ＷＴの産生を示す（ｐｃＤＮＡ３およびｐｃＤＮ
Ａ３−ＧＰIIｂをそれぞれ統計処理の対照として使
用）。
【図６】安定にトランスフェクトされたＨＥＬ細胞中Ｃ
ＭＶプロモーターを用いた場合の１日ＦIX産生を示す。
ＭＶプロモーターを用いた場合の１日ＦIX産生を示す。
【図７】安定にトランスフェクトされたＨＥＬ細胞中、
ＰＭＡ誘導によりまたはよらないＧＰIIｂプロモーター
下におけるＦIXの産生を示す（ｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂ
構築体を統計処理の対照として使用）。
ＰＭＡ誘導によりまたはよらないＧＰIIｂプロモーター
下におけるＦIXの産生を示す（ｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂ
構築体を統計処理の対照として使用）。
【図８】ＨＥＬ細胞上清中のＦIXのプロコアギュラント
活性（ｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂ構築体を統計処理の対照
として使用）。
活性（ｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂ構築体を統計処理の対照
として使用）。
【図９Ａ】ＨＥＬ細胞中におけるＦIX（ＷＴ）構築体の
安定な発現を示す（パネルＡ：ＰＭＡなしで培養、ｐｃ
ＤＮＡ３およびｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂを統計処理の対
照として使用）。
安定な発現を示す（パネルＡ：ＰＭＡなしで培養、ｐｃ
ＤＮＡ３およびｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂを統計処理の対
照として使用）。
【図９Ｂ】ＨＥＬ細胞中におけるＦIX（ＷＴ）構築体の
安定な発現を示す（パネルＢ：ＰＭＡ １nMと培養、ｐ
ｃＤＮＡ３およびｐｃＤＮＡ３−ＧＰＩＩｂを統計処理
の対照として使用）。
安定な発現を示す（パネルＢ：ＰＭＡ １nMと培養、ｐ
ｃＤＮＡ３およびｐｃＤＮＡ３−ＧＰＩＩｂを統計処理
の対照として使用）。
【図１０】ＨＥＬ細胞中（ＰＭＡなしで培養）における
ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ）ならびにＧＰIIｂ−ＦIX（Ｗ
Ｔ.Ｉ１）構築体の安定な発現を示す（ｐｃＤＮＡ３−
ＧＰIIｂ／ＦIX（ＷＴ）を統計処理の対照として使
用）。
ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ）ならびにＧＰIIｂ−ＦIX（Ｗ
Ｔ.Ｉ１）構築体の安定な発現を示す（ｐｃＤＮＡ３−
ＧＰIIｂ／ＦIX（ＷＴ）を統計処理の対照として使
用）。
【図１１】ＰＭＡ刺激ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）発
現ＨＥＬ細胞からのＦIXプロコアギュラント活性を示す
（値は個々の３回の実験の平均を表す）。
現ＨＥＬ細胞からのＦIXプロコアギュラント活性を示す
（値は個々の３回の実験の平均を表す）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 マリー・エレン・ロードリーグ フランス国エフ−69008リヨン．リューマ リスバスティエ33 (72)発明者 ナタリー・アンジョルラ フランス国エフ−69300カリュイール．リ ューピエールブリュニエ29ビス
Claims (7)
- 【請求項１】 血液凝固因子のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡおよび造血細胞における発現に特異的なプロモ
ーターをコードするＤＮＡからなる血液凝固因子の組織
特異的発現のためのＤＮＡ構築体。 - 【請求項２】 プロモーターとしてヒト血小板糖タンパ
ク質IIｂ（ＧＰIIｂ）をコードするＤＮＡが挿入された
請求項１記載のＤＮＡ構築体。 - 【請求項３】 血液凝固因子のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡは血液凝固第IX因子をコードするｃＤＮＡであ
る請求項１または２に記載のＤＮＡ構築体。 - 【請求項４】 ヒト第IX因子遺伝子の最初の部分切断イ
ントロン（イントロン１）が第IX因子ｃＤＮＡにさらに
挿入されている請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤ
ＮＡ構築体。 - 【請求項５】 血液凝固第IX因子は、請求項１〜４のい
ずれか１項に記載のＤＮＡ構築体によってトランスフェ
クトされた造血細胞系内で発現される血液凝固第IX因子
の製造方法。 - 【請求項６】 血液凝固第IX因子の産生はインデューサ
ーによって刺激される請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 血液凝固第IX因子の産生はホルボール−
１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）によ
って刺激される請求項６記載の方法。
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