ES2271010T3

ES2271010T3 - Conversion enzimatica de epoxidos.

Info

Publication number: ES2271010T3
Application number: ES01934641T
Authority: ES
Inventors: Jeffrey Harald Lutje Spelberg; Dick Barend Janssen
Original assignee: Codexis Inc
Current assignee: Codexis Inc
Priority date: 2000-05-25
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2007-04-16
Anticipated expiration: 2021-05-23
Also published as: DE60122505T2; EP1158054A1; ATE337408T1; DE60122505T3; DE60122505D1; EP1287155B2; EP1287155A1; US7695942B2; US20030124693A1; US20080220485A1; JP2004504015A; EP1287155B1; WO2001090397A1; AU2001260802A1

Abstract

Un procedimiento para convertir de manera enzimática, un epóxido, opcionalmente sustituido de la fórmula en la que R1 es hidrógeno o un grupo aromático o alifático opcionalmente sustituido, en una mezcla de un epóxido ópticamente enriquecido de fórmula (I) y un alcohol ópticamente enriquecido de fórmula: en la que R2 se elige entre el grupo de I, Cl, Br, CN, N3, NO2, NO3, SCN, OCN, OR'', NHR'', SR'', SnR'', SeR'', PR y CO2R'', en la que R'' se elige entre el grupo de hidrógeno, grupos amino, grupos hidroxilo, grupos alquilo, grupos arilo, grupos aralquilo, alquenilo, y cicloalquilo, o en la que R2 es OR'', estando R'' elegido entre el grupo constituido por grupos amino, grupos hidroxilo, grupos alquilo, grupos arilo, grupos aralquilo, alquenilo, y cicloalquilo, dicho procedimiento comprende hacer reaccionar el epóxido con un nucleófilo aniónico (R2-) en presencia de una halohidrin deshalogenasa.

Description

Conversión enzimática de epóxidos.

La invención se refiere a un procedimiento para convertir un epóxido en un alcohol. Más específicamente, la invención se refiere a un procedimiento enzimático para convertir un epóxido en un alcohol mediante sustitución nucleófila.

Una reacción en la que un epóxido se convierte en un alcohol mediante sustitución nucleófila se puede mostrar como sigue:

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En este esquema de reacción, R puede representar un amplio intervalo de grupos, tales como varios grupos alquilo sustituidos o no sustituidos, mientras que X representa un nucleófilo. El producto de esta conversión puede ser un bloque muy útil de conversión en la preparación de diversos productos químicos refinados, tales como ciertos productos farmacéuticos. La reacción puede producir dos diferentes enantiómeros. Como a menudo los productos se usan para aplicaciones en las que la pureza enantiomérica se de gran importancia, se han reseñado muchos intentos para encontrar formas enantioselectivas de llevar a cabo esta reacción.

Un ejemplo de tal reacción es la apertura de un anillo enantioselectiva de un epóxido mediante un anión azida (N_{3}), se puede denominar azidólisis. El producto de la reacción, un alcohol azido ópticamente activo es un precursor de compuestos farmacéuticos biológicamente activos tales como amino alcoholes. Se ha descrito una azidólisis altamente enantioselectiva de meso-epóxidos y diversos epóxidos terminales que usan complejos quirales se han descrito por el grupo de Jacobsen (Martínez y col., J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 5897; Farrow y col., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 7420). Las preparaciones los azidoalcoholes aromáticos ópticamente activos mediante una reacción biocatalizada se han reseñado también: por ejemplo, mediante reducción de una \alpha-azidocetona (Bese y col., J. Org. Chem., 1994, 59, 8288), resolución catalizada por lipasa (Foelsche y col., J. Org. Chem., 1990, 55, 1749), o monohidrohilación (Boyd y col., Tetrahedron: Asymetry, 1996, 7, 1559).

La reacción inversa, es decir, la formación de un epóxido a partir de por ejemplo, un haloalcohol, usando una reacción catalizada enzimáticamente, ha proporcionado mucha atención en la bibliografía, en particular usando la halohidrin deshalogenasa. Todas estas reacciones implicaban halohidrinas alifáticas, tales como 1,3-dihalopropanol, 2,3-dihalopropanol, y 3-halo-1,2-propanodiol, para producir halohidroinas y epóxidos ópticamente puros (Kasai y col., J. Mol. Cat: B, 1998, 4, 237). En general, una halohidrin deshalogenasa (también llamada haloin hidrogen.haluro-liasa, halohidrin epoxidasa o halo alcohol deshalogenasa) cataliza el cierre del anillo de una halohidrina a un epóxido. Para un número limitado de halohidrinas, se ha descrito que una halohidrin deshalogenasa también puede catalizar la reacción inversa. El equilibrio de ambas reacciones también se puede mostrar como sigue:

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en la que R se puede elegir entre un amplio intervalo de grupos, tales como diversos grupos arilo o alquilo sustituidos o no sustituidos y en la que X representa un halógeno tal como bromuro, cloruro o yoduro.

Un ejemplo que usa la halohidrin deshalogenasa y un nucleófilo diferente de un haluro se ha descrito por Nakamura y col., Tetrahedron, 1994, 50, 11821. En este reacción, una halohidrin deshalogenasa de Corynebacterium sp. cepa N-1074 se usó para abrir un epóxido con cianuro para producir un \beta-hidroxi nitrilo.

La apertura de un anillo asimétrico de un epóxido mediante azida se ha descrito usando una preparación de enzima bruta de Rhodococcus sp. (véase Faber y col., Tetrahedron Letters, 1994, 35, 81). La enzima responsable de la reacción se sugiere que sea una epóxido hidrolasa mejor que una halohidrin deshalogenasa.

Cuando se compara con las reacciones químicamente catalizadas, las reacciones catalizadas mediante el uso de enzimas implican el uso de menos disolventes orgánicos, u otros reactivos se podría pensar que fueran sospechosos ambientalmente tales como complejos metálicos y similares. Por ejemplo, la azidolisis catalítica química de epóxidos se realiza típicamente usando metales que no reúnen las condiciones ambientales, tales como complejos de cromo, cobalto o titanio, en disolventes orgánicos, tales como diclorometano, acetonitrilo o dimetilformamida. Además, las enzimas son a menudo catalizadores más selectivos y eficaces que sus parejas químicas diseñadas por el hombre, por ejemplo, Archer, Tetrahedron vol, 53 nº 46 (1997) p. 15617-15662 proporciona una visión de de conversiones que se llevan a cabo usando una epóxido hidrolasa. El documento EP-A 879 890 describe una epóxido hidrolasa recombinante obtenida a parir de Agrobacterium Radiobacter B101. Para una visión más completa de las ventajas de la catálisis enzimática, se hace referencia a Faber, Biotransformations on Organic Chemistry, edición 3ª, Springer-Verlag, Nueva York, 1997.

En la industria refinada química, las halohidrinas ópticamente puras y epóxidos se usan como bloques de construcción para diversos productos farmacéuticos. Las halohidrinas se consideran a menudo como precursores directos se los epóxidos. El cierre del anillo y una halohidrina ópticamente pura conduce a un epóxido ópticamente puro que generalmente conduce a un epóxido ópticamente puro. Recientemente, se ha descrito una resolución cinética de una halohidrina que contiene un grupo aromático, tal como 2-cloro-1-feniletanol, con una halohidrin deshalogenasa de Agrobacterium radiobacter AD1 (Lutje Spelberg y col., Tetrahedron: Asymmetry, 1999, 10, 2863).

La presente invención proporciona un procedimiento en el que, los epóxidos, opcionalmente sustituidos se pueden convertir a alcoholes de una manera altamente enantioselectiva. Se ha encontrado que la enantioselectividad deseada se puede llevar a cabo convirtiendo enzimáticamente un epóxido, opcionalmente sustituido, de la fórmula:

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en la que R_{1} es hidrógeno o un grupo aromático o alifático opcionalmente sustituido, en una mezcla de de un epóxido ópticamente enriquecido de fórmula (I) y un alcohol ópticamente enriquecido de fórmula:

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en la que R_{2} se elige entre el grupo de I, Cl, Br, CN, N_{3}, NO_{2}, NO_{3}, SCN, OCN, OR', NHR', SR', SnR', SeR', PR y CO_{2}R', el la que R' se elige entre el grupo de hidrógeno, grupos amino, grupos hidroxilo, grupos alquilo, grupos arilo, grupos aralquilo, alquenilo, y cicloalquilo, dicho procedimiento comprende hacer reaccionar el epóxido con un nucleófilo aniónico (R_{2}') en presencia de una halohidrin deshalogenasa.

Sorprendentemente, se ha encontrado que convirtiendo un epóxido de acuerdo a la invención se puede obtener un exceso muy alto enantiomérico. Incluso cuando el material de parida es una mezcla racémica de ambos enantiómeros del epóxido, principalmente, si no solamente, se obtiene uno de los posibles enantiómeros se los productos. De acuerdo con lo anterior, la invención permite no solamente una forma muy enantioselectiva de producir un alcohol, sino también una resolución enantioselectiva cinética del epóxido. Por ejemplo, en el caso de una reacción de (óxido de estireno sustituidos con una azida, se forma el (R)-enantiómero del azidoalcohol, dejando atrás el (S)-enantiómero que no ha reaccionado del epóxido.

Además, el presente procedimiento es altamente regioespecífico. Tras la apertura del anillo del epóxido, se pueden formar dos productos diferentes: uno de los cuales de los grupos -OH está presente en el átomo de carbono adyacente al grupo R_{1}, y uno en el que el grupo -OH está presente en el átomo de carbono sobre el extremo distal del grupo R_{1}. En un procedimiento de acuerdo con la invención, principalmente, si no solamente, se forma el isómero con el grupo -OH en el átomo de carbono adyacente al R_{1}.

El producto de la reacción, el alcohol con la fórmula (II), es un bloque de construcción para una amplia diversidad de compuestos farmacéuticos. Por ejemplo, 2-azido-1-feniletanol, que se puede formar mediante la reacción enzimática de azida de sodio y óxido de estireno, se puede convertir en el 2-aminofenil etanol biológicamente activo mediante hidrogenación catalítica.

En principio, se puede convertir cualquier tipo de epóxido de acuerdo con la invención. Como se ha mencionado, el grupo R_{1} es hidrógeno o un grupo aromático o alifático opcionalmente sustituido, que preferiblemente contiene entre 1 y 20 átomos de carbono. Preferiblemente, R_{1} se elige entre los grupos de alquilo, arilo, aralquilo, alquenilo, cicloalquilo, y alcoxi opcionalmente sustituido.

Los ejemplos preferidos del grupo alquilo representados por R_{1} incluyen grupos alquilo que tienen de 1 a 15 átomos de carbono tales como un grupo metilo, grupo etilo, grupo propilo, grupo isopropilo, grupo butilo, grupo pentilo, grupo hexilo, grupo heptilo o grupo dodecilo. Los epóxidos representativos de este grupo incluyen 1,2-epoxi propano, 1,2-epoxi-3-metilpentano y 1,2-epoxi hexano. El grupo alquilo puede tener sustituyentes tales como un átomo de halógeno, que conduce por ejemplo a epiclorohidrina, epifluorohidrina o epibromohidrina. El grupo alquilo puede tener un sustituyente tal como un grupo hidroxilo, por ejemplo, glicidol. El grupo alquilo puede tener un grupo amino no sustituido o sustituido tal como amino, metilamino o dimetilamino. Los ejemplos de grupos arilo representados por R_{1} incluyen los grupos fenilo y naftilo.Óxido de estireno u óxidos de estireno que tienen un sustituyente o múltiples sustituyentes en el anillo aromático del grupo fenilo. Los ejemplos representativos de epóxidos son óxido de estireno, óxido de 4-nitroestireno, óxido de 2-nitroestireno, óxido de 3-nitroestireno, óxido de 3-cloroestireno, óxido de 4-cloroestireno u óxido de 2,3-dicloroestireno. Los ejemplos de grupos aralquilo representados por R_{1} incluyen un grupo bencilo, grupo 2-feniletilo y un grupo 1-naftilmetilo. Los ejemplos de grupos alquileno representados por R_{1} incluyen un grupo vinilo, grupo alilo y grupo 5-hexenilo. Los ejemplos de grupos cicloalquilo representados por R_{1} incluyen un grupo ciclopropilo, grupo ciclobutilo, grupo ciclopentilo y grupo ciclohexilo. Los ejemplos de grupos alcoxi representados por R_{1} incluyen un grupo fenoxi, grupo 4-nitrofenoxi, grupo naftiloxi, grupo hexiloxi y grupo vinil oxi.

Una clase preferida de epóxidos que se pueden convertir tiene la siguiente fórmula:

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Esta clase de epóxidos se puede sustituir en el átomo de carbono que lleva el grupo R_{1} por un grupo -CH_{2}R_{4}, en la que el grupo R_{4} se puede elegir independientemente entre Cl, Br y I. Los ejemplos preferidos de esta clase de epóxidos son epiclorhidrina, epibromohidrina y 2-(clorometil)-2-metiloxirano. Se ha encontrado que durante la conversión a un alcohol, particularmente cuando se usa azida como el nucleófilo, el enantiómero del epóxido que no se convierte forma racémicos. Debido a esta formación de racémicos se logra una total conversión de epiclorohidrina y se obtiene el producto con una alta pureza óptica. Normalmente, en una resolución cinética el máximo rendimiento del producto se limita al 50%, pero debido a la racemización se puede lograr un rendimiento mayor que el 50%. Otra ventaja de este procedimiento, además del incremento de rendimiento, es una recuperación de producto mucho más simple ya que una separación del producto del sustrato estante no es necesaria.

En otra realización preferida, el epóxido es un óxido de estireno, que puede o no puede estar sustituido. Cuando se lleva a cabo esta conversión de manera química, es decir, en ausencia de una halohidrin deshalogenasa de acuerdo con la invención, el producto obtenido será una mezcla de dos compuestos que tienen la funcionalidad alcohol en su átomo de carbono \alpha o \beta en el anillo aromático. Por ejemplo, la apertura del anillo químico no catalizado de óxido de estireno por azida de sodio producirá una mezcla de regioisómeros con la funcionalidad alcohol en la posición \alpha y en la \beta en una relación molar de 2:98 (\alpha \beta). Sorprendentemente, cuando se convierte un óxido de estireno de acuerdo con la invención, el otro regioisómero (es decir, en el que la funcionalidad alcohol está presente en el átomo de carbono \alpha. El átomo de carbono \alpha del anillo aromático es el átomo de carbono dentro del epóxido que lleva el anillo aromático sustituido). Se obtiene de manera selectiva. Una separación de los dos posibles regioisómeros es muy difícil, esta regioespecificidad es una gran ventaja de la invención.

Particularmente preferida es una realización en la que el epóxido tiene la fórmula

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en la que R_{1} es un sustituyente orto-, meta-, o para- elegido entre el grupo de -NO_{2}, -NH_{2}, -CH_{3}, -OCH_{3}, -OCH_{2}CH_{3}, -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -COOH y -CN. Se he encontrado que la regioespecificidad es particularmente alta para la conversión de estos epóxidos.

El epóxido puede estar presente en una forma solubilidad en una concentración de 1 a 300 mM o una segunda fase sólida o líquida en una concentración de hasta 300 mM en el medio de reacción. El propio epóxido puede ser la segunda fase o se puede disolver en una segunda fase orgánica. Esto se puede hacer disolviendo el epóxido en un disolvente orgánico que es inmiscible con agua, tal como hexano u octano. La solución obtenida después se pone en contacto con la fase acuosa que contiene la enzima y las dos fases se mezclan vigorosamente. El uso de tal segunda fase tiene la ventaja de que la separación del epóxido y el alcohol después de la reacción se puede simplificar. En general, el alcohol se espera que permanezca solubilizado en la fase acuosa y el epóxido se puede recuperar típicamente a partir de la fase orgánica. Preferiblemente, el epóxido es anterior a su conversión en un medio acuoso en el que preferiblemente estará presente en una cantidad de 0,01 a 20% en peso, basándose en los pesos combinados del medio acuoso y el epóxido.

La naturaleza del nucleófilo elegido para convertir el epóxido en un procedimiento de acuerdo con la invención dependerá normalmente de la naturaleza del producto objetivo. Los nucleófilos adecuados incluyen I, Cl, Br, CN, N_{3}, NO_{2}, NO_{3}, SCN, OCN, OR', NHR', SR', SnR, SeR', PR' y CO_{2}R, en los que R' se elige entre hidrógeno, grupos amino, grupos hidroxilo, grupo alquilo, grupos arilo, aralquilo, alquenilo y grupos cicloalquilo. De hecho, los grupos alquilo, grupos arilo, aralquilo, alquenilo y grupos cicloalquilo también están abarcados. Cuando R' es un grupo alquilo, contiene preferiblemente entre 1 y 15, más preferiblemente entre 1 y 6 átomos de carbono. Cuando R' es un grupo arilo, es preferiblemente un grupo fenilo o uno naftilo. Los grupos aralquilo preferidos que se pueden representar por R' incluyen grupos bencilo, 2-feniletilo y 1-naftilmetilo. Los grupos alquenilo preferidos a partir de los que R' se pueden elegir son grupos vinilo y alilo. Cuando R' es un grupo cicloalquilo, puede ser adecuado tener entre 3 y 12 átomos de carbono. Los grupos cicloalquilo preferidos son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, y ciclohexilo.

Preferiblemente, particularmente cuando el epóxido es un óxido de estireno un óxido de estireno sustituido, el nucleófilo es NO_{2}^{-} o N_{3}^{-}. El nucleófilo se puede emplear en la forma de una sal, por ejemplo como una sal de sodio o potasio. Un exceso del reactivo nucleófilo puede conducir a la formación no enantioselectiva del regioisómero no deseado del producto objetivo. Esto se puede evitar o bien realizando la reacción en un tiempo más corto, realizando la reacción a una temperatura más baja, empleando una mayor cantidad de la enzima, añadiendo el reactivo nucleófilo a la mezcla de reacción de una manera más lenta. Típicamente, el nucleófilo se usará en una cantidad de 0,6 a 100 equivalentes molares con respecto al epóxido, dependiendo de la posición del equilibrio entre el epóxido y el alcohol. Por ejemplo, en el caso de azida de sodio como nucleófilo 0,6 equivalentes molares suficientes para lograr una resolución cinética suficientemente completa ya que la posición de equilibrio favorece la formación del alcohol sobre el epóxido. En el caso de cloruro de sodio como neutrófilo, un exceso (50-100 equivalentes molares) se añaden preferiblemente para favorecer la formación del alcohol.

Se prefiere que la reacción se lleve a cabo en un medio acuoso tamponado en el que el epóxido se solubiliza o se añade como una segunda fase sólida o líquida. Los tampones adecuados son por ejemplo, tampón tris (2-amino-2-(hidroximetil)-1,3 propanodiol ajustado hasta un pH deseado con H_{2}SO_{4}), tampón glicina (glicina ajustada hasta un pH deseado mediante NaOH), tampón fosfatos o tampón MOPS (ácido 4-niorfolinapropanosulfónico ajustado hasta un pH deseado con NaOH). Usan preferiblemente una concentración de 50 a 250 mM.

Opcionalmente, se pueden añadir codisolventes tales como dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano o acetonitrilo para incrementar la solubilidad del epóxido. Los codisolventes se pueden añadir en cantidades de 5% en volumen hasta 50% en volumen. Un incremento de porcentaje de codisolvente puede favorecer la solubilidad del epóxido. Sin embargo, una inactivación desventajosa de la enzima se puede observar a mayores concentraciones de codisolvente.

El pH del medio preferiblemente cae entre 3 y 12, más preferiblemente entre 6,5 y 8. La temperatura a la que la reacción se lleva a cabo preferiblemente cae entre 0 y 60ºC, más preferiblemente entre 20 y 30ºC.

La enzima usada es una halohidrin deshalogenasa. Una halohidrin deshalogenasa altamente adecuada es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID Nº 2 o un derivado homólogo o funcional del mismo. En el contexto de la invención, el término homólogo se refiere a una secuencia que es al menos un 90% homóloga, y preferiblemente al menos 90% idéntica, a la secuencia de la que es homóloga. Un derivado funcional es un polipéptido que se ha sometido a una derivación secundaria o modificación sustancialmente sin afectar de manera adversa a las propiedades enzimáticas y catalíticas del polipéptido. Los ejemplos adecuados de enzimas que se pueden usar son la halohidrin deshalogenasa de Agrobacterium radiobacter (CBS 750.97), Mycobacterium sp. cepa GP1 (Poelarends y col., J. Bacterial, 1999, 181, 2050) o Arthrobacter sp. cepa AD2 (van den Wijngaard y col., J. Bacterial., 1991, 124). Se han obtenido buenos resultados particulares usando una halohidrin deshalogenasa obtenida de de Agrobacterium radiobacter AD1 depositada en el Centraal Bureau voor de Schimmelcultures el 7 de mayo de 1997 bajo el número de depósito CBS 750.97. Otra enzima obtenida de este organismo se ha descrito de manera extensa en la solicitud de patente internacional nº 98/53081 para su actividad de la epóxido hidrolasa.

Se ha de indicar que una enzima usada de acuerdo con la invención una halohidrin deshalogenasa, se debe distinguir de las epóxido hidrolasas. Esto último se ha descrito de manera amplia en Archer, Tetrahedron, 53 (1997), p. 15617-15662. La única característica que ambos de enzimas de enzimas pueden tener en común es que se pueden aislar a partir de de Agrobacterium radiobacter cepa AD1. De manera similar, Lutje Spelberg y col., Tetrahedron: Asymmetry, 9 (1998)), p. 459-466 y la solicitud de patente europea nº 0 879 890 se refiere a las aplicaciones de una epóxido hidrolasa.

La enzima se puede añadir como células enteras, en forma liofilizada tal como un extracto bruto o como enzima purificada. La enzima se puede inmovilizar en unos vehículos macroscópicos tales como celulosa, sefadex o dextrano. La enzima también se puede aplicar como cristales de enzima reticulados (CLEC) o atrapada en micelas inversas. En un experimento típico, una solución de enzima se mezcla con una solución tampón que contiene un nucleófilo y un epóxido. Opcionalmente, se pueden añadir aditivos tales como etanol o glicerol a la mezcla de reacción para estabilizar la enzima.

Después de la reacción la mezcla de reacción completa se puede extraer usando disolventes orgánicos tales como dietil éter, acetato de etilo, diclorometano o tolueno. El epóxido y el alcohol se pueden separar posteriormente mediante técnicas, tales como cristalización (en el caso de sustancias sólidas), destilación fraccionada o cromatografía ultrarrápida sobre sílice 60H usando por ejemplo heptano/acetato de etilo (relación 7:3) como eluyente. La composición enantiomérica de los epóxidos y alcoholes se pueden determinar usando cromatografía quiral o HPLC quiral.

La invención se esclarecerá ahora mediante los siguientes ejemplos no restrictivos.

Ejemplo 1

Una librería génica de A. radiobacter AD1 se construyó en el vector cósmico pLAFR3. Después del empaquetamiento in vitro, la librería se tradujo a E. coli HB101. Los transconjugantes de seleccionaron para la actividad deshalogenasa con 1,3-dicloro-2-propanol. El gen de la halohidrin deshidrogenasa, llamada hheC, se secuenció y se amplificó posteriormente mediante PCR y se clonó más atrás del promotor T7 del vector de expresión pGEF^{+}, produciendo pGEFhheC. El gen de la halohidrin deshidrogenasa se sobreexpresó hasta un 30% de la proteína soluble mediante la introducción de pGEFhheC en E. coli BL21 (DE3). HheC tiene la secuencia mostrada como la SEQ ID Nº 1.

Para las resoluciones cinéticas descritas se usó la enzima purificada. Se transformó el AND del plásmido mediante electroporación a las células de E. coli BL21 (DE3) competente, que después se colocaron en un medio LB que contiene tetraciclina y se incubaron durante toda una noche a 30ºC. Se comenzó un precultivo inoculando 100 ml de medio LB que contiene tetraciclina con los transformantes de una placa a una DO_{600} inicial de 0,1. Se incubó el cultivo a 30ºC hasta que se alcanzó una DO_{600} de 1-2, se diluyó en 11 de medio LB que contenía tetraciclina y se incubó durante toda una noche a 20ºC. las células se centrifugaron posteriormente, se lavaron y se volvieron a suspender. Se preparó un extracto bruto mediante ruptura ultrasónica y centrifugación de las células. A esto siguió una etapa de purificación con una columna Resource Q produciendo la enzima que tiene la SEQ ID Nº 2.

El procedimiento anterior es análogo a un procedimiento que se ha descrito en más detalle en la solicitud de patente internacional 98/53801, en la que la enzima que se preparó era una epóxido hidrolasa.

Ejemplo 2

A 15 ml de tampón Tris-SO_{4} (50 mM, pH = 7,3) que contenía 2 mM de óxido de para nitro estireno y 10 mM de NaN_{3}, se añadieron 2,8 mg de la enzima purificada, obtenida de acuerdo con el ejemplo 1. La reacción se controló tomando periódicamente 200 \mul de muestras y se extrajeron con 2 ml de dietil éter. La reacción se detuvo cuando se alcanzó un e. e. mayor que 99% del enantiómero restante y la solución se extrajo dos veces con dietil éter. La fase orgánica se analizó mediante HPLC quiral usando una columna quiralpack AS de Daicel. El óxido de (S)-para-nitro estireno restante se obtuvo con un e. e. > de 99% y el producto (R)-2-azido-1-(para-nitrofenil)-etanol con un e. e. de 94%. El valor de E correspondiente se calculó que era mayor que 200 a partir del e. e. del epóxido y el azido alcohol (Straathol y col., Enzyme Microb. Technol. 1997, 21, 559). El otro 2-azido-2-(para-nitrofenil)-etanol regio isómero se formó también debido a una reacción lateral química en una reacción de 1:12 comparada con (R)-2-azido-2-(para-nitrofenil)-etanol.

Ejemplo 3

A 1 ml de tampón Tris-SO_{4} (50 mM, pH = 7,3) que contenía 0,25 mM de óxido de para nitro estireno y 0,5 mM de NaN_{3}, se añadieron 0,7 mg de la enzima purificada, obtenida de acuerdo con el ejemplo 1. La reacción se detuvo después de 15 minutos y se extrajo la solución con dietiléter. La fase orgánica se analizó mediante HPLC quiral. El óxido de (S)-para-nitro estireno restante se obtuvo con un e. e. > de 99% y el producto (R)-2-azido-1-(para-nitrofenil)-etanol con un e. e. de 96%. El otro 2-azido-2-(para-nitrofenil)-etanol regio isómero se formó una relación de 1:127 con comparada (R)-2-azido-2-(para-nitrofenil)-etanol. A partir de esto se concluyó que la acidolisis enzimática es casi absolutamente regioselectiva (selectividad \beta > 99%). La regioselectividad menor observada durante una resolución cinética en un tiempo mayor se debió la reacción secundaria no deseada.

Ejemplo 4

A 60 ml de tampón MOPS (50 mM, pH = 7,0), se añadieron 0,47 gramos (3,2 mmoles) de óxido de para nitro estireno y la suspensión se agitó durante 60 minutos. Se añadió la halohidrin deshalogenasa, obtenida como se ha descrito en el ejemplo 1, (39 mg en 6 ml de tampón). Se detuvo la reacción y la suspensión se extrajo tres veces con dietiléter. Después de separar, la fase orgánica se secó con MgSO_{4}, y se retiró mediante rotavapor produciendo un aceite naranja. Esta mezcla se volvió a disolver en dietiléter y se determinaron la composición y e. e. de los productos mediante HPLC quiral. La mezcla principalmente consistía en óxido de (S)-para-nitro estireno con un 45% de rendimiento (98% de e. e.) y (R)-2-azido-1-(para-nitrofenil)-etanol con un 47% de de rendimiento (97% de e. e.). El subproducto químico 2-azido-1-(para-nitrofenil)-etanol se formó hasta un total de un 4% de la mezcla de reacción. Se formó el producto se la hidrólisis química del epóxido, para-nitrofenil etanodiol con un 3%. Todos los rendimientos mencionados están calculados como rendimientos. La cromatografía ultrarrápida sobre sílice 60 H que usa heptano/acetato de etilo (relación 7:3) como eluyente produjo epóxido puro y azido alcoholes. Los resultados de la RMN eran idénticos a los compuestos racémicos sintetizados de referencia.

Ejemplo 5

A 20 ml de tampón Tris-SO_{4} (50 mM, pH = 7,3) que contenía 2 mM de óxido de para cloro estireno y 1,2 mM de NaN_{3}, se añadieron 1,0 mg de la enzima purificada, obtenida como se describe en el ejemplo 1. La fase orgánica se analizó mediante CG quiral. Se obtuvo el óxido de (S)-para-cloro estireno con un e. e. mayor que el 99% y (R)-2-azido-1-(para-clorofenil)-etanol con un e. e. de 98%.

Ejemplo 6

A 20 ml de tampón Tris-SO_{4} (50 mM, pH = 7,3) que contenía 2 mM de óxido de para cloro estireno y 1,2 mM de NaNO_{2}, se añadieron 1,0 mg de la enzima purificada, obtenida como se describe en el ejemplo 1. Se detuvo la reacción al 58% de conversión y la solución se extrajo con dietiléter. La fase orgánica se analizó mediante CG quiral. Se obtuvo el óxido de (S)-para-cloro estireno con un e. e. mayor que el 99%.

Ejemplo 7

A 20 ml de tampón Tris-SO_{4} (50 mM, pH = 7,3) que contenía 2 mM de epiclorohidrina y 20 mM de NaN_{3}, se añadieron 1,0 mg de la enzima purificada. Se detuvo la reacción al 66% de conversión y la solución se extrajo con dietiléter. La fase orgánica se analizó mediante CG. Además de la epiclorohidrina restante, la mezcla consistía en 1-azido-3-cloro-2-propanol con un 92% de e. e., 2-azidometil-oxirano con un 92% de e. e. y el 1,3-dicloro-2-propanol no quiral.

Ejemplo 8

A 20 ml de tampón Tris-SO_{4} (50 mM, pH = 7,3) que contenía 2 mM de epiclorohidrina y 20 mM de NaN_{3}, se añadieron 1,0 mg de la enzima purificada. Se detuvo la reacción a una conversión total de la epiclorohidrina y la solución se extrajo con dietiléter. La fase orgánica se analizó mediante CG quiral. El producto consistía en una mezcla de 1-azido-3-cloro-2-propanol con un 92% de e. e., y 2-azidometil-oxirano con un 92% de e. e. (Adición de una pequeña cantidad de NaOH proporcionó 2-azidometil-oxirano en forma de un sólo producto con un 92% de e. e.).

Ejemplo 9

A 20 ml de tampón Tris-SO_{4} (50 mM, pH = 6,5) que contenía 20 mM de epibromohidrina, 30 mM de NaN_{3}, 50 mM NaBr, se añadieron 1,0 mg de la enzima purificada. Después de la finalización de la reacción, la mezcla obtenida se extrajo con dietiléter y la fase orgánica se analizó mediante CG quiral. Se obtuvo el producto 1-azido-3-bromo-2-propanol con > 99% de e. e., y 75% de rendimiento.

7

70

<110> Enzis Patent B. V.

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<120> Conversión enzimática de epóxidos

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<130> documento P53029EP10

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<140> 01934641.0

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<141> 13 - 12 - 2002

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<150> documento EP 00201874.5

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<151> 25 - 05 - 2000

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<150> documento PCT/NL01/00403

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<151> 23 - 05 - 2001

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 880

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: pGEhheC, que comprende la secuencia de ADN del gen de la halohidrin deshalogenasa de AD1.

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<220>

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<221> misc _ característica

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<222> (1) .. (880)

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<223> /nota = ``Posición 1 a 49 y 815 a 880 es una parte de pGEF +, posición 50 a 814 es un gen de la halohidrin deshalogenasa de AD1.

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<400> 1

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8

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<210> 2

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<211> 254

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<212> PRT

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<213> Agrobacterium radiobacter

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<220>

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<221> SITIO

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<222> (1) .. (254)

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<223> /nota = "Secuencia de aminoácidos de la halohidrin deshalogenasa".

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<400> 2

9

Claims

1. Un procedimiento para convertir de manera enzimática, un epóxido, opcionalmente sustituido de la fórmula

10

en la que R_{1} es hidrógeno o un grupo aromático o alifático opcionalmente sustituido, en una mezcla de un epóxido ópticamente enriquecido de fórmula (I) y un alcohol ópticamente enriquecido de fórmula:

11

en la que R_{2} se elige entre el grupo de I, Cl, Br, CN, N_{3}, NO_{2}, NO_{3}, SCN, OCN, OR', NHR', SR', SnR', SeR', PR y CO_{2}R', en la que R' se elige entre el grupo de hidrógeno, grupos amino, grupos hidroxilo, grupos alquilo, grupos arilo, grupos aralquilo, alquenilo, y cicloalquilo, o en la que R_{2} es OR', estando R' elegido entre el grupo constituido por grupos amino, grupos hidroxilo, grupos alquilo, grupos arilo, grupos aralquilo, alquenilo, y cicloalquilo, dicho procedimiento comprende hacer reaccionar el epóxido con un nucleófilo aniónico (R_{2-}) en presencia de una halohidrin deshalogenasa.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se recupera el alcohol ópticamente enriquecido.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se recupera el epóxido ópticamente enriquecido.

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la halohidrin deshalogenasa es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 2, o un homólogo del mismo, teniendo dicho homólogo una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% homóloga a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 2.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la halohidrin deshalogenasa se deriva de Agrobacterium radiobacter (CBS 750.97), Arthrobacter sp., cepa AD2 o Mycobacterium sp. cepa GP1.

6. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el epóxido se convierte a partir de una mezcla que comprende ambos enantiómeros de dicho epóxido.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la mezcla es una mezcla racémica.

8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que R_{1} se elige entre el grupo de grupos alquilo, arilo, aralquilo, alquenilo, cicloalquilo, y alcoxi opcionalmente sustituidos.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que R_{1} comprende entre 1 y 20 átomos de carbono.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9 en el que R_{1} comprende un sustituyente elegido entre el grupo de grupos amino, halógenos, grupos hidroxilo, grupos ciano, grupos azida, grupos nitro, grupos haloalquilo, grupos acilo, grupos alcoxi, grupos fenoxi y grupos carboxilo.

11. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedente, en el que el epóxido tiene la fórmula

12

en la que R_{4} se elige entre Cl, Br y I.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el epóxido es epiclorhidrina, epiyodohidrina, o epibromohidrina.

13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, en el que el alcohol se obtiene con un rendimiento mayor que 10%.

14. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que R_{1} es un grupo aromático opcionalmente sustituido.

15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el epóxido tiene la fórmula

13

en la que R_{3} es un sustituyente orto-, meta-, o para- elegido entre el grupo de -NO_{2}, -NH_{2}, -CH_{3}, -OCH_{3}, -OCH_{2}CH_{3}, -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -COOH y -CN.

16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15, en el que el nucleófilo aniónico es N_{3}-, NO_{3}^{-}, o CN-.

17. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el epóxido se hace reaccionar en la forma de un sólido, suspensión, solución o dispersión.

18. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el epóxido está presente en un medio acuoso en una cantidad entre 0,01 y 20% en peso, basado en los pesos combinados del medio acuoso y el epóxido.

19. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la temperatura está entre 0 y 60ºC.

20. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el pH está entre 3 y 12.