ES2271111T3 - Luciferasas aisladas y su uso. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo de moléculas de ácido nucleico que comprende: a) Una molécula de ácido nucleico que codifica las secuencias peptídicas mostradas en las SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 4 o SEC Nº ID 6. b) Una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia peptídica que presenta al menos un 90% de identidad con una de las secuencias peptídicas mostradas en las SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 4 o SEC Nº ID 6, en la que en los péptidos se trata de luciferasas secretadas. c) Una molécula de ácido nucleico, que comprende una molécula de ácido nucleico como se representa en las SEC Nº ID 1, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5, SEC Nº ID 7, SEC Nº ID 8, SEC Nº ID 9 o SEC Nº ID 10, en la que los ácidos nucleicos codifican luciferasas.
Description
Luciferasas aisladas y su uso.
La invención se refiere a la secuencia de
nucleótidos y aminoácidos, así como a la actividad y al uso de las
luciferasas LuAL, Lu164, Lu16, Lu39, Lu45, Lu52 y Lu22.
Se designa como luminiscencia la irradiación de
fotones en el intervalo espectral visible, en la que ésta se realiza
mediante moléculas emisoras excitadas. A diferencia de la
fluorescencia, aquí no se proporciona la energía desde el exterior
en forma de radiación de longitud de onda más corta.
Se diferencia entre quimioluminiscencia y
bioluminiscencia. Se designa como quimioluminiscencia una reacción
química que conduce a una molécula excitada que emite luz por sí
sola cuando los electrones excitados vuelven al estado fundamental.
En caso de estar catalizada esta reacción mediante una enzima, se
habla de bioluminiscencia. Las enzimas participantes en la reacción
se designan generalmente como luciferasas.
Se encuentra una reseña sobre organismos
luminiscentes en Hastings et al., 1995.
En las luciferasas se trata de peroxidasas o
mono- y dioxigenasas. Los sustratos enzimáticos que forman las
sustancias de partida para los productos emisores de luz se llaman
luciferinas. Son distintos según la especie. El rendimiento cuántico
de los sistemas se encuentra entre 0,1-0,9 fotones
por molécula de sustrato reaccionado (Idelgaufts,
1993).
1993).
Las luciferasas pueden clasificarse debido a su
origen o a sus propiedades enzimáticas. A continuación se da una
revisión sobre algunos tipos de luciferasa:
\vskip1.000000\baselineskip
Las luciferasas pueden diferenciarse igualmente
entre sí mediante su especificidad de sustrato. Pertenecen a los
sustratos más importantes coelenterazinas (Jones et al.,
1999) y luciferina, así como derivados de ambas sustancias. A
continuación, se representan esquemáticamente los sustratos y su
reacción mediante luciferasas:
A continuación, se representan como ejemplos
algunos sustratos de luciferasa y su reacción. Todos los sustratos
aquí representados reaccionan enzimáticamente con liberación de luz
y dióxido de carbono (CO_{2}) y gasto de oxígeno (O_{2}). La
dependencia de la reacción de cofactores o portadores de energía
(por ejemplo, ATP para luciferasa de luciérnaga) es específica de
enzima.
Reacción de coelenterazina a coelenteramida
mediante aecuorina con emisión de luz de 470 nm de longitud de
onda.
Reacción de luciferina a oxiluciferina mediante
luciferasa de luciérnaga con emisión de luz de 560 nm de longitud de
onda.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Reacción de luciferina de Vargula a
oxiluciferina de Vargula mediante luciferasa de Vargula con emisión
de luz de 460 nm de longitud de onda.
Se designan generalmente como gen informador o
indicador genes cuyo producto génico puede examinarse fácilmente con
ayuda de procedimientos bioquímicos o histoquímicos sencillos. Se
diferencia entre al menos dos tipos de genes informadores.
- 1.
- Genes de resistencia. Se designan como genes de resistencia genes cuya expresión proporciona a una célula resistencia frente a antibióticos u otras sustancias cuya presencia en el medio de crecimiento conduce a la muerte celular cuando falta el gen de resistencia.
- 2.
- Gen informador. Los productos de los genes informadores se usan en la tecnología genética como indicadores fusionados o no fusionados. Pertenecen a los genes informadores corrientes beta-galactosidasa (Alam et al., 1990), fosfatasa alcalina (Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), luciferasas y otras fotoproteínas (Shimomura, 1985; Phillips G.N., 1997; Snowdowne et al., 1984).
Artrópodo\rightarrowcrustáceos\rightarrowcopépodos
La especie Metridia longa pertenece a los
crustáceos, a los cangrejos, especialmente a los copépodos o al
zooplancton.
Para investigar la actividad bioluminiscente de
la especie Metridia longa se capturaron ejemplares en el Mar
Blanco (Estación Biológica Kartesh, Rusia) y se almacenaron en
nitrógeno líquido. Para la elaboración de las bibliotecas de ADNc de
Metridia longa se aisló el ARN según el procedimiento de
Krieg (Krieg et al., 1996) mediante
isotiocianato.
isotiocianato.
Para la preparación del ADNc se llevó a cabo una
PCR-TI. Se incubaron para ello 10 \mug de ARN con
transcriptasa inversa (Superscribt Gold II) según el siguiente
esquema:
| PCR | 1º | 30 segundos | 95ºC |
| 2º | 6 minutos | 68ºC | |
| 3º | 10 segundos | 95ºC | |
| 4º | 6 minutos | 68ºC | |
| 17 ciclos de la etapa 4 a la etapa 3. |
Se incubaron los productos de reacción para la
inactivación de la polimerasa durante 30 minutos a 37ºC con
proteinasa K, y se precipitó el ADNc con etanol. Se disolvió en agua
el ADNc y se incubó con SfiI durante 1 hora a 37ºC. Se filtraron en
gel los productos de reacción para la separación de los fragmentos
pequeños. Se ligó a continuación el ADNc fraccionado en el vector
\lambdaTriplEx2 cortado y desfosforilado con SfiI. Para la
preparación de un banco de expresión de fagos \lambda se
empaquetaron a continuación los fragmentos de ADNc clonados en fagos
\lambda mediante el sistema de empaquetado in vitro de kit
de construcción de biblioteca de ADNc SMART (Clontech).
Para la identificación de los fagos
recombinantes que contenían una inserción de ADNc con expresión
potencial de luciferasas dependientes de coelenterazina se llevó a
cabo una "selección de biblioteca".
Para ello, se sembraron céspedes bacterianos de
XL1-Blue de E. coli en bandejas de cultivo de
90 mm y se incubaron durante 10 horas a 37ºC. A continuación, se
realizó la infección con 2.500 fagos por bandeja de cultivo y una
fase de incubación de 8 horas a 37ºC para la formación de placas.
Para el endurecimiento del agar blando, se almacenaron a
continuación las bandejas de cultivo durante una hora a 4ºC.
Para la realización de un sembrado de réplica se
embebieron membranas de nitrocelulosa con suspensiones de
XL-1 Blue de E. coli y se secaron. Se
dispusieron las membranas secadas durante 60 segundos sobre las
placas de fagos y a continuación sobre placas de agar fresco. A
continuación, se incubaron las placas de agar durante 2 horas a 37ºC
y se añadieron 4 ml de medio SOB (+ MgSO_{4} 10 mM, 0,2% de
maltosa). Se retiraron los céspedes bacterianos, se resuspendieron
en medio LB (+ IPTG 20 mM) y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Se
recogieron las bacterias mediante centrifugación, se disociaron
mediante ultrasonidos y se determinó en luminómetro la actividad
bioluminiscente tras la adición de coelenterazina.
Se organizaron las placas de cultivo con señal
bioluminiscente positiva en sectores y se llevó a cabo un nuevo
sembrado de réplica. El sembrado de réplica se continuó hasta la
identificación de las placas individuales activas. La subclonación
de las inserciones de ADNc de los fagos de placas positivas se
realizó en el vector pTriplEX2 en BM25.8 de E. coli según el
protocolo del fabricante para el kit de construcción de biblioteca
de ADNc SMART. Las E. coli transfectadas con ADNc de
pTriplEx2 se incubaron en medio LB con una concentración de
ampicilina 100 \mug/ml durante una noche a 37ºC. Para la
sobreexpresión, se diluyó el cultivo de una noche 1:150 con medio
LB y se incubó durante 1 hora a 37ºC. A continuación, se realizó la
inducción mediante la adición de IPTG (tiogalactósido de isopropilo)
hasta una concentración final 20 mM. El cultivo inducido se incubó
durante 1 hora a 37ºC y se recogieron las bacterias mediante
centrifugación. Se realizó la disociación celular mediante
ultrasonidos en 0,5 ml de tampón SM. Se midió la quimioluminiscencia
en luminómetro tras la adición de 10 \mul de coelenterazina
(10^{-4} M en
metanol).
metanol).
Se identificaron tres luciferasas que
presentaban una actividad luciferasa dependiente de coelenterazina.
Las luciferasas se designaron como Lu164, LuAL y Lu22. A
continuación, se representan individualmente las luciferasas.
La invención se refiere a moléculas de ácido
nucleico que codifican las secuencias peptídicas mostradas en las
SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 4 o SEC Nº ID 6 o que presentan al menos un
90% de identidad con estos ácidos nucleicos, y en las que los ácidos
nucleicos codifican péptidos que son luciferasas secretadas. Además,
la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que abarcan
una molécula de ácido nucleico como se representa en las SEC Nº ID
1, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5, SEC Nº ID 7, SEC Nº ID 8, SEC Nº ID 9 o
SEC Nº ID 10, en la que los ácidos nucleicos codifican
luciferasas.
Las luciferasas son adecuadas como genes
informadores para sistemas celulares, especialmente para receptores,
para canales iónicos, para transportadores, para factores de
transcripción o para sistemas inducibles.
Son utilizables las luciferasas en sistemas
bacterianos, por ejemplo, para la determinación de la titulación o
como sustratos para sistemas bioquímicos, especialmente para
proteinasas.
Pueden utilizarse las luciferasas también como
enzimas informadoras acopladas a anticuerpos u otras proteínas, por
ejemplo, para ELISA, para inmunohistoquímica o para transferencia
Western.
Son utilizables la luciferasas en sistemas BRET
(transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia).
Las luciferasas son adecuadas también como
proteína de fusión para microscopía confocal o para análisis de
interacción proteína-proteína.
Las luciferasas son utilizables como sistema
informador acoplado a biotina, NHS, CNBr u otros intermedios de
acoplamiento, por ejemplo, para ELISA o para inmovilización.
Además, las luciferasas son utilizables como
enzima informadora acoplada a oligonucleótidos de ADN o ARN, por
ejemplo, para transferencia Northern y Southern o para PCR a tiempo
real.
La invención se refiere también a la
purificación de luciferasas de tipo salvaje o proteínas de cola, así
como al uso de luciferasas en sistemas de traducción in
vitro.
\newpage
La luciferasa LuAL es una proteína con un peso
molecular de 23,7 kDa y un punto isoeléctrico de 8,32. La secuencia
de nucleótidos codificante es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
de la que resulta una secuencia de
aminoácidos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y una composición de
aminoácidos:
| Ala: | 18 (8,3%) | Cys: | 10 (4,6%) | Asp: | 14 (6,4%) | Glu: | 12 (5,5%) | |
| Phe: | 10 (4,6%) | Gly: | 19 (8,7%) | His: | 2 (0,9%) | Ile: | 18 (8,3%) | |
| Lys: | 21 (9,6%) | Leu: | 15 (6,9%) | Met: | 10 (4,6%) | Asn: | 8 (3,7%) | |
| Pro: | 7 (3,2%) | Gln: | 5 (2,3%) | Arg: | 7 (3,2%) | Ser: | 9 (4,1%) | |
| Thr: | 15 (6,9%) | Val: | 14 (6,4%) | Trp: | 2 (0,9%) | Tyr: | 2 (0,9%) |
\vskip1.000000\baselineskip
La luciferasa Lu164 es una proteína con un peso
molecular de 23,8 kDa y un punto isoeléctrico de 7,81. La secuencia
de nucleótidos codificante es:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
de la que resulta una secuencia de
aminoácidos:
y una composición de
aminoácidos:
| Ala: | 21 (9,6%) | Cys: | 10 (4,6%) | Asp: | 15 (6,8%) | Glu: | 13 (5,9%) | |
| Phe: | 10 (4,6%) | Gly: | 18 (8,2%) | His: | 2 (0,9%) | Ile: | 18 (8,2%) | |
| Lys: | 22 (10,0%) | Leu: | 14 (6,4%) | Met: | 10 (4,6%) | Asn: | 7 (3,2%) | |
| Pro: | 7 (3,2%) | Gln: | 5 (2,3%)6 | Arg: | 7 (3,2%) | Ser: | 8 (3,7%) | |
| Thr: | 14 (6,4%) | Val: | 14 (6,4%) | Trp: | 2 (0,9%) | Tyr: | 2 (0,9%) |
La luciferasa Lu22 es una proteína con un peso
molecular de 20,2 kDa y un punto isoeléctrico de 7,89. La secuencia
de nucleótidos codificante es:
de la que resulta una secuencia de
aminoácidos:
y una composición de
aminoácidos:
| Ala: | 21 (11,1%) | Cys: | 11 (5,8%) | Asp: | 12 (6,3%) | Glu: | 9 (4,7%) | |
| Phe: | 7 (3,7%) | Gly: | 21 (11,1%) | His: | 6 (3,2%) | Ile: | 13 (6,8%) | |
| Lys: | 16 (8,4%) | Leu: | 12 (6,3%) | Met: | 7 (3,7%) | Asn: | 4 (2,1%) | |
| Pro: | 6 (3,2%) | Gln: | 9 (4,7%) | Arg: | 6 (3,2%) | Ser: | 9 (4,7%) | |
| Thr: | 6 (3,2%) | Val: | 13 (6,8%) | Trp: | 1 (0,5%) | Tyr: | 1 (0,5%) |
Estas secuencias se encuentran de nuevo en el
listado de secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas LuAL, Lu164 y Lu22 son enzimas que
liberan luz mediante la reacción de coelenterazina. Pertenecen por
tanto a las luciferasas. Las luciferasas son expresables activas
tanto en células bacterianas como eucarióticas. Las luciferasas
LuAL, Lu164 y Lu22 expresables en células eucarióticas se secretan.
En la expresión bacteriana, no se realiza secreción.
La actividad de las luciferasas es dependiente
de la temperatura. Para las luciferasas LuAL y Lu164, las
temperaturas óptimas pudieron determinarse a 22ºC (para LuAL) o 27ºC
(para Lu164). La actividad de la luciferasa Lu22 tiene una
temperatura óptima de 4ºC o temperaturas menores.
Como vectores para la preparación de los
constructos representados a continuación, se usaron los vectores
pcDNA3.1(+) y pTriplEx2 de la compañía Clontech, así como el vector
pASMplr (constructo propio con elementos promotores sensibles al
AMPc, cre). Los derivados de los vectores se designaron como
pcDNA3-x, pTriplEx2-x y
pASM-x.
pASM-x.
La Fig. 1 muestra los mapas plasmídicos de los
vectores pTriplEX2-LuAL, pcDNA3-LuAL
y pASM-LuAL.
La Fig. 2 muestra los mapas plasmídicos de los
vectores pTriplEX2-Lu164,
pcDNA3-Lu164 y pASM-Lu164.
La Fig. 3 muestra los mapas plasmídicos de los
vectores pTriplEX2-Lu22, pcDNA3-Lu22
y pASM-Lu22.
Para la identificación de sustratos para Lu164
se incubaron 10 \mul de disoluciones de distintos derivados de
coelenterazina (10^{-4} M) con 10 \mul respectivamente de
sobrenadante de líneas celulares
CHO-pcDNA3-Lu164 y se midió la
luminiscencia. Se adquirieron las coelenterazinas en Molecular
Probes (EE.UU.).
Para las luciferasas LuAL y Lu22 no resultaron
diferencias en comparación con la luciferasa Lu164. Como sustrato
óptimo para Lu164, LuAL y Lu22, pudo identificarse la coelenterazina
no modificada (Fig. B, coelenterazina a).
La Fig. 4 muestra derivados de coelenterazina
como sustratos potenciales para Lu164 y una representación gráfica
de la medida de luminiscencia durante 30 segundos a 8,7 kV en
luminómetro (ULR, unidades de luz relativa), así como una
representación esquemática de la estructura molecular de los
derivados de coelenterazina.
La expresión bacteriana se realizó en la cepa de
E. coli BL21 (DE3) mediante transformación de las bacterias
con los plásmidos de expresión pTriplEX2-Lu164,
pTriplEX2-LuAL y pTriplEX2-Lu22. Las
bacterias transformadas se incubaron en medio LB a 37ºC durante 3
horas y se indujo la expresión durante 4 horas mediante la adición
de IPTG hasta una concentración final 1 mM. Se recogieron las
bacterias inducidas mediante centrifugación, se resuspendieron en
PBS y se disociaron mediante ultrasonidos. Se mezclaron 5 \mul del
lisado (5 mg/ml) con coelenterazina (10^{-4} M en metanol) o
luciferina (luciferina de luciérnaga) y se midió la
quimioluminiscencia.
La medida se realizó a 9,5 kV durante 30
segundos en ULR (unidades lumínicas relativas). Para Lu164, se
midieron 230.000, para LuAL 320.000 y para Lu22 260.000 ULR. La
expresión se realizó en BL21(DE3) de E. coli con los
vectores pTriplEx2-Lu164,
pTriplEx2-LuAL y pTriplEx2-Lu22.
La expresión eucariótica constitutiva se realizó
en células CHO mediante transfección de las células con los
plásmidos de expresión pcDNA3-Lu164,
pcDNA3-LuAL y pcDNA3-Lu22 en
experimentos transitorios. Para ello, se sembraron 10.000 células
por pocillo en medio DMEM-F12 en placas de
microvaloración de 96 pocillos y se incubó durante una noche a 37ºC.
La transfección se realizó con ayuda del kit Fugene 6 (Roche) según
los datos del fabricante. Las células transfectadas se incubaron
durante una noche a 37ºC en medio DMEM-F12. La
medida de la quimioluminiscencia en el medio (5 \mul) y el lisado
celular (5 \mul) se realizó después de la adición de
coelenterazina (10^{-4} M en metanol) durante 30 segundos a 9,5 kV
en luminómetro a temperatura ambiente.
Para Lu164 se midieron 680.000, para LuAL
670.000 y para Lu22 510.000 ULR (unidades lumínicas relativas). La
expresión se realizó en células CHO con los vectores
pcDNA3-Lu164, pcDNA3-LuAL y
pcDNA3-Lu22.
Para la medida del espectro de emisión se
transformaron BL21(DE3) de E. coli con los plásmidos
pTriplEx2-Lu164, pTriplEx2-LuAL y
pTriplEx2-Lu22 y se sobreexpresaron como se describe
en 3.1. Se mezclaron 100 \mul del lisado bacteriano con 50 \mul
de coelenterazina (10^{-4} M) y se midió el espectro de emisión. A
continuación, se representan gráficamente los espectros de emisión
de las luciferasas.
La emisión máxima mediante la reacción de
sustrato se realiza en las luciferasas LuAL, Lu164 y Lu22 a una
longitud de onda de aproximadamente 490 nm.
La Fig. 5 muestra espectros de emisión de las
luciferasas Lu164 (A), LuAL (B) y Lu22 (C) tras la expresión
bacteriana (ULR, unidades lumínicas relativas).
Para la caracterización de la expresión de las
luciferasas LuA1, Lu164 y Lu22 en células eucarióticas se
transfectaron establemente células CHO con los plásmidos
pcDNA3-LuAL, pcDNA3-Lu164,
pcDNA3-Fireluc y pcDNA3.1(+). Los clones obtenidos
se cultivaron en medio DMEM-F12. La luciferasa de
luciérnaga se usó como control positivo para una luciferasa no
secretada. El plásmido pcDNA3.1(+) sirvió como plásmido de control
para el examen de una actividad endógena potencial de las células
parentales CHO.
Para el examen de la secreción de las
luciferasas se sembraron 2.000 células en placas de microvaloración
de 384 pocillos. Después de 24 horas, se separó el medio, se lavaron
las células con disolución de Tyrode y se añadieron 30 \mul de
medio fresco. A continuación, se realizó la primera medida (0 h)
tras la adición de 5 \mul de coelenterazina (10^{-4} M) o
luciferina para la luciferasa de luciérnaga en luminómetro a 9,5 kV
durante 30 segundos. Después de una a cinco horas, se realizaron las
medidas de 1 a 5 h.
En la Figura 6, se representa el aumento de la
actividad luciferasa en el medio dependiendo del tiempo. No se
realizó una secreción de la luciferasa de luciérnaga. Las
luciferasas LuAL, Lu164 y Lu22 son luciferasas secretoras.
La Fig. 6 muestra actividad luciferasa en el
medio (5 \mul) de células CHO tras transfección con
pcDNA3-LuAL, pcDNA3-luciérnaga,
pcDNA3-Lu164 y pcDNA3 como vector de control sin
inserción de ADNc. (ULR: unidades lumínicas relativas, h; horas,
luciérnaga: luciferasa de luciérnaga).
Para la determinación de la dependencia de la
temperatura de las luciferasas Lu22, Lu164 y LuAL se transfectaron
transitoriamente células CHO con los vectores
pcDNA3-Lu22, pcDNA3-Lu164 y
pcDNA3-LuAL, y se determinó la actividad luciferasa
de los sobrenadantes a temperaturas entre 0 y 47ºC. Para ello, se
adaptó el sobrenadante celular, así como la disolución de
coelenterazina, durante 5 minutos a la temperatura de medida. La
medida se realizó durante 30 segundos a 9,5 kV en luminómetro.
En la Figura 7 se representa la luminiscencia
medida dependiente de la temperatura para las luciferasas LuAL,
Lu164 y Lu22. La actividad luciferasa de LuAL presenta una
temperatura óptima de 27ºC. Para Lu164, se determinó una temperatura
óptima de 22ºC y para Lu22 una temperatura óptima de 4ºC o
temperaturas menores.
La Fig. 7 muestra la actividad luciferasa
dependiente de la temperatura en el medio (5 \mul) de células CHO
tras transfección con pcDNA3-LuAL,
pcDNA3-luciérnaga y pcDNA3-Lu164.
(ULR, unidades lumínicas relativas, medio: DMEM-F12
+ 10% de FCS).
Se realizó la expresión eucariótica inducida en
células CHO mediante transfección de las células con el plásmido de
expresión pASM-LuAL en experimentos transitorios.
Para ello, se sembraron 10.000 células por pocillo en medio
DMEM-F12 sobre placas de microvaloración de 96
pocillos y se incubaron durante una noche a 37ºC. Se realizó la
transfección con ayuda del kit Fugene 6 (Roche) según los datos del
fabricante. Se incubaron las células transfectadas durante una noche
a 37ºC en medio DMEM-F12. Se realizó la inducción
durante 5 horas mediante forscolina (10^{-5} M). Se realizó la
medida de la quimioluminiscencia en el medio y el lisado celular
tras la adición de coelenterazina (10^{-4} M en metanol) durante
30 segundos a 9,5 kV en luminómetro.
La Fig. 8 muestra la expresión inducida de LuAL
en células CHO. Se realizó la inducción durante 5 segundos mediante
forscolina (10^{-5} M) a 37ºC. Medida de la actividad en los 10
\mul de sobrenadante celular. (ULR: unidades lumínicas relativas,
factor de inducción: cociente de las ULR inducidas entre las ULR no
inducidas).
Para poder analizar la activación de los
receptores acoplados a proteína G mediante ligando específico de
receptor en sistemas basados en célula, se clonó la secuencia de
ADNc de la luciferasa LuAL en el vector de expresión pASMplr. El
vector de expresión pASMplr contiene elementos promotores sensibles
al AMPc (CRE) que posibilitan una medida indirecta de la
concentración de AMPc intracelular. La luciferasa sirve en el
sistema como gen
informador.
informador.
Se ha mostrado el uso de las luciferasas Lu22,
Lu164 y Lu22 como genes informadores en sistemas celulares, por
ejemplo, para los receptores NPY2 (receptor de neuropéptido 2) y A2A
(receptor de adenosina 2a) acoplados a proteína G. Para ello, se
transfectó transitoriamente el clon estable
CHO-pASM-LuAL con el vector
pcDNA3-NPY2 o pcDNA3-A2A. En el
receptor NPY2, se trata de un receptor acoplado a Gi, en el receptor
A2A, acoplado a Gs.
La activación del receptor A2A se realizó
durante 4 h mediante la adición de NECA 1 \muM. La activación del
receptor NPY2 se realizó mediante la adición de péptido NPY2 10
\muM en presencia de forscolina 10^{-5} M. La medida de la
actividad luciferasa en el medio (30 \mul) se realizó tras la
adición de coelenterazina (10^{-4} M) durante 30 segundos a 9,5 kV
en luminómetro.
La Fig. 9 muestra el uso de las luciferasas como
gen informador para sistemas celulares, por ejemplo, los receptores
A2A y NPY2 acoplados a proteína G (ULR: unidades lumínicas
relativas).
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<211> 660
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<212> ADN
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<213> Metridia longa
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<210> 2
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<211> 219
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<212> PRT
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<211> 573
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<212> ADN
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<212> PRT
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<212> ADN
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<210> 9
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<212> ADN
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<400> 9
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<400> 10
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Claims (6)
1. Una molécula de ácido nucleico seleccionada
del grupo de moléculas de ácido nucleico que comprende:
a) Una molécula de ácido nucleico que codifica
las secuencias peptídicas mostradas en las SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 4
o SEC Nº ID 6.
b) Una molécula de ácido nucleico que codifica
una secuencia peptídica que presenta al menos un 90% de identidad
con una de las secuencias peptídicas mostradas en las SEC Nº ID 2,
SEC Nº ID 4 o SEC Nº ID 6, en la que en los péptidos se trata de
luciferasas secretadas.
c) Una molécula de ácido nucleico, que comprende
una molécula de ácido nucleico como se representa en las SEC Nº ID
1, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5, SEC Nº ID 7, SEC Nº ID 8, SEC Nº ID 9 o
SEC Nº ID 10, en la que los ácidos nucleicos codifican
luciferasas.
2. Moléculas según la reivindicación 1, en las
que la secuencia contiene un promotor funcional 5' de la
secuencia.
3. Vector de ARN o ADN recombinante que contiene
una molécula según la reivindicación 2.
4. Un organismo no humano que contiene un vector
según la reivindicación 3.
5. Péptidos que están codificados por las
secuencias de nucleótidos según la reivindicación 1.
6. Uso de luciferasas según las reivindicaciones
1-5 como genes informadores para sistemas
celulares.
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