PL206385B1 - Cząsteczka kwasu nukleinowego, kodowany przez nią peptyd, ich zastosowanie, rekombinacyjny wektor DNA lub RNA oraz zawierający go niebędący człowiekiem organizm - Google Patents
Cząsteczka kwasu nukleinowego, kodowany przez nią peptyd, ich zastosowanie, rekombinacyjny wektor DNA lub RNA oraz zawierający go niebędący człowiekiem organizmInfo
- Publication number
- PL206385B1 PL206385B1 PL362774A PL36277401A PL206385B1 PL 206385 B1 PL206385 B1 PL 206385B1 PL 362774 A PL362774 A PL 362774A PL 36277401 A PL36277401 A PL 36277401A PL 206385 B1 PL206385 B1 PL 206385B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- seq
- lual
- luciferase
- rlu
- luciferases
- Prior art date
Links
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 title claims abstract description 81
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N Oplophorus luciferin Chemical class C1=CC(O)=CC=C1CC(C(N1C=C(N2)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)=NC1=C2CC1=CC=CC=C1 YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 9
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 6
- 101150051188 Adora2a gene Proteins 0.000 claims description 5
- 108010089579 neuropeptide Y2 receptor Proteins 0.000 claims description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000029748 Neuropeptide Y2 receptor Human genes 0.000 claims description 4
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 claims description 3
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 claims description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 241000186140 Metridia longa Species 0.000 description 14
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 9
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 241000238584 Vargula Species 0.000 description 6
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 5
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 5
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108090000363 Bacterial Luciferases Proteins 0.000 description 3
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 3
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 3
- 241000238583 Vargula hilgendorfii Species 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-aminopropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 2
- 101100460776 Arabidopsis thaliana NPY2 gene Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000201986 Cassia tora Species 0.000 description 2
- 241000239250 Copepoda Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BDISFWMLMNBTGP-NUMRIWBASA-N Glu-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BDISFWMLMNBTGP-NUMRIWBASA-N 0.000 description 2
- VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCCN VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- XFBBBRDEQIPGNR-KATARQTJSA-N Lys-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O XFBBBRDEQIPGNR-KATARQTJSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- DMKWYMWNEKIPFC-IUCAKERBSA-N Pro-Gly-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O DMKWYMWNEKIPFC-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- 108010041089 apoaequorin Proteins 0.000 description 2
- 238000000225 bioluminescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- HFJRKMMYBMWEAD-UHFFFAOYSA-N dodecanal Chemical compound CCCCCCCCCCCC=O HFJRKMMYBMWEAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- CJIIERPDFZUYPI-UHFFFAOYSA-N oxidized Oplophorus luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC(=O)NC1=NC=C(C=2C=CC(O)=CC=2)N=C1CC1=CC=CC=C1 CJIIERPDFZUYPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NCAIGTHBQTXTLR-UHFFFAOYSA-N phentermine hydrochloride Chemical compound [Cl-].CC(C)([NH3+])CC1=CC=CC=C1 NCAIGTHBQTXTLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 2
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 2
- AXFMEGAFCUULFV-BLFANLJRSA-N (2s)-2-[[(2s)-1-[(2s,3r)-2-amino-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound CC[C@@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AXFMEGAFCUULFV-BLFANLJRSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FATXTKJILXPNJL-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[2-[(2-amino-3-methylpentanoyl)amino]propanoylamino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(=O)NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 FATXTKJILXPNJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050000203 Adenosine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009346 Adenosine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 1
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- YAXNATKKPOWVCP-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asn-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YAXNATKKPOWVCP-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- XEXJJJRVTFGWIC-FXQIFTODSA-N Ala-Asn-Arg Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N XEXJJJRVTFGWIC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ZIBWKCRKNFYTPT-ZKWXMUAHSA-N Ala-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ZIBWKCRKNFYTPT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N Ala-Asp-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- MPLOSMWGDNJSEV-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MPLOSMWGDNJSEV-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- NINQYGGNRIBFSC-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NINQYGGNRIBFSC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WEZNQZHACPSMEF-QEJZJMRPSA-N Ala-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 WEZNQZHACPSMEF-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- MMLHRUJLOUSRJX-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN MMLHRUJLOUSRJX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- DQNLFLGFZAUIOW-FXQIFTODSA-N Arg-Cys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DQNLFLGFZAUIOW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PPPXVIBMLFWNSK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)CN=C(N)N PPPXVIBMLFWNSK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- XZFONYMRYTVLPL-NHCYSSNCSA-N Asn-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N XZFONYMRYTVLPL-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- CTWCFPWFIGRAEP-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CTWCFPWFIGRAEP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BWJZSLQJNBSUPM-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BWJZSLQJNBSUPM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- WAEDSQFVZJUHLI-BYULHYEWSA-N Asp-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WAEDSQFVZJUHLI-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- VBPGTULCFGKGTF-ACZMJKKPSA-N Cys-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VBPGTULCFGKGTF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ANRWXLYGJRSQEQ-CIUDSAMLSA-N Cys-His-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ANRWXLYGJRSQEQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WAJDEKCJRKGRPG-CIUDSAMLSA-N Cys-His-Ser Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N WAJDEKCJRKGRPG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NXTYATMDWQYLGJ-BQBZGAKWSA-N Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS NXTYATMDWQYLGJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UCSXXFRXHGUXCQ-SRVKXCTJSA-N Cys-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N UCSXXFRXHGUXCQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- RJPKQCFHEPPTGL-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RJPKQCFHEPPTGL-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- YWEHYKGJWHPGPY-XGEHTFHBSA-N Cys-Thr-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O YWEHYKGJWHPGPY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- SZXSSXUNOALWCH-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SZXSSXUNOALWCH-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- SBYVDRJAXWSXQL-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SBYVDRJAXWSXQL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- IESFZVCAVACGPH-PEFMBERDSA-N Glu-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O IESFZVCAVACGPH-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LHIPZASLKPYDPI-AVGNSLFASA-N Glu-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LHIPZASLKPYDPI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- VIPDPMHGICREIS-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VIPDPMHGICREIS-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- MHHUEAIBJZWDBH-YUMQZZPRSA-N Gly-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CN MHHUEAIBJZWDBH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YYQGVXNKAXUTJU-YUMQZZPRSA-N Gly-Cys-His Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O YYQGVXNKAXUTJU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)CN CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- PDAWDNVHMUKWJR-ZETCQYMHSA-N Gly-Gly-His Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 PDAWDNVHMUKWJR-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N Gly-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)CNC(=O)C[NH3+] XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- YFGONBOFGGWKKY-VHSXEESVSA-N Gly-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)CN)C(=O)O YFGONBOFGGWKKY-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- SWQALSGKVLYKDT-UHFFFAOYSA-N Gly-Ile-Ala Natural products NCC(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(C)C(O)=O SWQALSGKVLYKDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YLEIWGJJBFBFHC-KBPBESRZSA-N Gly-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 YLEIWGJJBFBFHC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N H-Lys-Trp-OH Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGZIJZJBXRVBGJ-SXTJYALSSA-N Ile-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N BGZIJZJBXRVBGJ-SXTJYALSSA-N 0.000 description 1
- PARSHQDZROHERM-NHCYSSNCSA-N Ile-Lys-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)O)N PARSHQDZROHERM-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- BCISUQVFDGYZBO-QSFUFRPTSA-N Ile-Val-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O BCISUQVFDGYZBO-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N L-Prolyl-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 241001484259 Lacuna Species 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N Leu-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N Leu-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N Leu-Val-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- WXJKFRMKJORORD-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Ala Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN WXJKFRMKJORORD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VQXAVLQBQJMENB-SRVKXCTJSA-N Lys-Glu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O VQXAVLQBQJMENB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ULUQBUKAPDUKOC-GVXVVHGQSA-N Lys-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ULUQBUKAPDUKOC-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WVJNGSFKBKOKRV-AJNGGQMLSA-N Lys-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WVJNGSFKBKOKRV-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- LMGNWHDWJDIOPK-DKIMLUQUSA-N Lys-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O LMGNWHDWJDIOPK-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- CRIODIGWCUPXKU-AVGNSLFASA-N Lys-Pro-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O CRIODIGWCUPXKU-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- YCJCEMKOZOYBEF-OEAJRASXSA-N Lys-Thr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O YCJCEMKOZOYBEF-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- KXYLFJIQDIMURW-IHPCNDPISA-N Lys-Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)=CNC2=C1 KXYLFJIQDIMURW-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- RAAVFTFEAUAVIY-DCAQKATOSA-N Met-Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N RAAVFTFEAUAVIY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BMHIFARYXOJDLD-WPRPVWTQSA-N Met-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BMHIFARYXOJDLD-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- WXXNVZMWHOLNRJ-AVGNSLFASA-N Met-Pro-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O WXXNVZMWHOLNRJ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- JADDQZYHOWSFJD-FLNNQWSLSA-N N-ethyl-5'-carboxamidoadenosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C(=O)NCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 JADDQZYHOWSFJD-FLNNQWSLSA-N 0.000 description 1
- 108010087066 N2-tryptophyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108070000018 Neuropeptide receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000028517 Neuropeptide receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001455233 Obelia Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- BBDSZDHUCPSYAC-QEJZJMRPSA-N Phe-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BBDSZDHUCPSYAC-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- UHRNIXJAGGLKHP-DLOVCJGASA-N Phe-Ala-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UHRNIXJAGGLKHP-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- SEPNOAFMZLLCEW-UBHSHLNASA-N Phe-Ala-Val Chemical compound N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O SEPNOAFMZLLCEW-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- VZFPYFRVHMSSNA-JURCDPSOSA-N Phe-Ile-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 VZFPYFRVHMSSNA-JURCDPSOSA-N 0.000 description 1
- CDHURCQGUDNBMA-UBHSHLNASA-N Phe-Val-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 CDHURCQGUDNBMA-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 241000254058 Photinus Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000242743 Renilla reniformis Species 0.000 description 1
- JJKSSJVYOVRJMZ-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)CN=C(N)N JJKSSJVYOVRJMZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- UGHCUDLCCVVIJR-VGDYDELISA-N Ser-His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CO)N UGHCUDLCCVVIJR-VGDYDELISA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- SKHPKKYKDYULDH-HJGDQZAQSA-N Thr-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SKHPKKYKDYULDH-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- VXMHQKHDKCATDV-VEVYYDQMSA-N Thr-Asp-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O VXMHQKHDKCATDV-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- UZJDBCHMIQXLOQ-HEIBUPTGSA-N Thr-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O UZJDBCHMIQXLOQ-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- OQCXTUQTKQFDCX-HTUGSXCWSA-N Thr-Glu-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N)O OQCXTUQTKQFDCX-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 1
- UQCNIMDPYICBTR-KYNKHSRBSA-N Thr-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UQCNIMDPYICBTR-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 1
- SNJAPSVIPKUMCK-NWLDYVSISA-N Trp-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SNJAPSVIPKUMCK-NWLDYVSISA-N 0.000 description 1
- GWBWCGITOYODER-YTQUADARSA-N Trp-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N GWBWCGITOYODER-YTQUADARSA-N 0.000 description 1
- DLZKEQQWXODGGZ-KWQFWETISA-N Tyr-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DLZKEQQWXODGGZ-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- OVLIFGQSBSNGHY-KKHAAJSZSA-N Val-Asp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O OVLIFGQSBSNGHY-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- XJFXZQKJQGYFMM-GUBZILKMSA-N Val-Cys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N XJFXZQKJQGYFMM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- URIRWLJVWHYLET-ONGXEEELSA-N Val-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)C(C)C URIRWLJVWHYLET-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N Valylglycine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(O)=O IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N [(3r,4ar,10ar)-6-methoxy-1-methyl-3,4,4a,5,10,10a-hexahydro-2h-benzo[g]quinolin-3-yl]-[4-(4-nitrophenyl)piperazin-1-yl]methanone Chemical compound O=C([C@@H]1C[C@H]2[C@H](N(C1)C)CC=1C=CC=C(C=1C2)OC)N(CC1)CCN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 108010009297 diglycyl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N flavin mononucleotide Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 108010090037 glycyl-alanyl-isoleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010074027 glycyl-seryl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 1
- 108010089433 obelin Proteins 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108010005834 tyrosyl-alanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
- C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
- C12Y113/12007—Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) (1.13.12.7), i.e. firefly-luciferase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/90241—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
(21) Numer zgłoszenia: 362774 (22) Data zgłoszenia: 22.11.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
22.11.2001, PCT/EP01/013597 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
30.05.2002, WO02/42470 (11) 206385 (13) B1 (51) Int.Cl.
C12N 15/53 (2006.01) C12N 9/02 (2006.01) C12N 1/15 (2006.01) C12N 1/19 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C12Q 1/66 (2006.01)
Cząsteczka kwasu nukleinowego, kodowany przez nią peptyd, (54) ich zastosowanie, rekombinacyjny wektor DNA lub RNA oraz zawierający go niebędący człowiekiem organizm
| (73) Uprawniony z patentu: | |
| BAYER SCHERING PHARMA | |
| (30) Pierwszeństwo: | AKTIENGESELLSCHAFT, Berlin, DE |
| 23.11.2000, DE, 10058091.2 | (72) Twórca(y) wynalazku: |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: 02.11.2004 BUP 22/04 | STEFAN GOLZ, Essen, DE BERND KALTHOF, Wuppertal, DE SVETLANA MARKOVA, Krasnoyarsk, RU LUDMILA FRANK, Krasnoyarsk, RU |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: | EUGENE VYSOTSKI, Krasnoyarsk, RU |
| 31.08.2010 WUP 08/10 | (74) Pełnomocnik: |
| rzecz. pat. Agnieszka Żebrowska-Kucharzyk |
PL 206 385 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są cząsteczka kwasu nukleinowego, kodowany przez nią peptyd, ich zastosowanie, rekombinacyjny wektor DNA lub RNA oraz zawierający go niebędący człowiekiem organizm.
Luminescencja to określenie nadane emisji fotonów w widzialnym zakresie widma, przy czym ta emisja jest powodowana przez wzbudzone cząsteczki będące źródłem promieniowania. W odróżnieniu od fluorescencji, potrzebna do tego energia nie jest dostarczana z zewnątrz w postaci promieniowania o krótszej długości fali.
Rozróżnia się chemiluminescencję i bioluminescencję. Chemiluminescencja to określenie nadane reakcji chemicznej, która prowadzi do cząsteczki wzbudzonej, która sama emituje światło, gdy wzbudzone elektrony wracają do normalnego poziomu energetycznego. Bioluminescencja to określenie stosowane, gdy ta reakcja jest katalizowana przez enzym. Enzymy, które uczestniczą w reakcji, nazywa się ogólnie lucyferazami.
Przegląd organizmów luminescencyjnych można znaleźć w publikacji Hastingsa i in., 1995.
Lucyferazy to peroksydazy lub monooksygenazy i dioksygenazy. Substraty enzymów, które tworzą substancje wyjściowe dla produktów emitujących światło, nazywa się lucyferynami. Różnią się one między gatunkami. Wydajność kwantowa układów zawiera się między 0,1 i 0,9 fotonu na przekształconą cząsteczkę substratu (Idelgaufts, 1993).
Lucyferazy można sklasyfikować na podstawie ich pochodzenia lub ich właściwości enzymatycznych. Przegląd niektórych typów lucyferaz jest podany poniżej:
Lucyferaza bakteryjna
| Produkt genowy | Organizm | Substrat | λ | Ekspresja | Odnośniki/patenty |
| Geny Lux | Vibrio fischerii | FMN, dodekanal, NADH | 495 nm | w cytosolu | Apley i in., 1985 Gustafson G., US 5196524 |
Tab. 1: Lucyferazy bakteryjne
Lucyferazy eukariotyczne zależne od koelenterazyny
| Produkt genowy | Organizm | Substrat | λ | Ekspresja | Odnośniki/patenty |
| Lucyferaza Renilla | Renilla reniformis | Koelenterazy- na | 480 nm | w cytosolu | Mathews i in., 1977Lorenz i in., 1991 Lorenz i in., 1996 Alan, P., WO 0020619 Milton J., US 5418155 Roelant C., WO 9938999 |
| Lucyferaza Var- gula/Cypridia | Vargula hilgendorferii | Lucyferyna Vargula | 460 nm | wydzielnicza | Thomspon i in.,1989 Thompson i in., 1990 Tora, JP 05064583 Tora, JP 08027200 Renard i in., WO 9520653 |
| Lucyferaza Watasemia | Watasemia scintillans | Lucyferyna Watasemia | ? | w cytosolu | Inoue i in., 1976 |
| Lucyferaza Olophorus | Olophorus gracillirostris | Koelenterazy- na | 454 | wydzielnicza | Inouye i in., 2000 |
| Ekworyna | Aequoria aequoria | Koelenterazy- na (aktywowana Ca2+) | 470 nm | w cytosolu | Head i in., 2000 Shimomura i in., 2000 Jones i in., 1999 Kendall i in., 1998 Inouye i in., 1985 Shimomura i in., 1969 Cormier i in., US 5798441 Cormier i in., US 5422266 |
| Obelin | Obelia | Koelenterazy- na | 470 nm | w cytosolu | Matveev i in., 1999 Berestovskaya, 1999 |
Tab. 2: Lucyferazy eukariotyczne zależne od koelenterazyny
PL 206 385 B1
Lucyferaza eukariotyczna niezależna od koelenterazyny
| Produkt genowy | Organizm | Substrat | λ | Ekspresja | Odnośniki |
| Lucyferaza świetlika | Photinus piralis | Lucyferyna świetlika, ATP | 550 nm | w cytosolu | Webster i in., 1980 Gould i in., 1988 Sala-Newby i in., 1992 Bonin i in., 1994 Sherf B., US 5670356 KIKK, JP 09 187281 |
Tab. 3: Lucyferazy eukariotyczne niezależne od koelenterazyny
Lucyferazy można także odróżniać od siebie na podstawie swoistości ich substratów. Najważniejsze substraty obejmują koelenterazynę (Jones i in., 1999) i lucyferynę, a także pochodne tych dwóch substancji. Poniżej zamieszczono wzory substratów oraz ich przekształcenie przez lucyferazę:
Niektóre z substratów lucyferazy oraz ich przekształcenia są dla przykładu przedstawione poniżej. Wszystkie pokazane substraty są przekształcane enzymatycznie czemu towarzyszy wydzielenie światła i dwutlenku węgla (CO2) oraz zużycie tlenu (O2). Zależność reakcji od kofaktorów lub nośników energii (np. ATP w przypadku lucyferazy świetlika) jest specyficzna dla danego enzymu.
Koelenterazyna
Przekształcenie koelenterazyny w koelenteramid przez ekworynę z emisją światła o długości fali 470 nm.
Przekształcenie lucyferyny w oksylucyferynę przez lucyferazę świetlika z emisją światła o długości fali 560 nm.
PL 206 385 B1
Przekształcenie lucyferyny Vargula w oksylucyferynę Vargula przez lucyferazę Vargula z emisją światła o długości fali 460 nm.
Gen reporterowy lub gen wskaźnikowy stanowi określenie, które ogólnie nadaje się genom, których genowe produkty można łatwo wykryć stosując proste sposoby biochemiczne lub histochemiczne. Rozróżnia się, co najmniej 2 typy genów reporterowych.
1. Geny oporności. Geny oporności to określenie nadane genom, których ekspresja nadaje komórce oporność na antybiotyki lub inne substancje, których obecność w pożywce wzrostowej prowadzi do śmierci komórki, gdy gen oporności jest nieobecny.
2. Gen reporterowy. W technologii rekombinowanego DNA produkty genów reporterowych stosuje się jako fuzyjne lub niefuzyjne wskaźniki. Najpospolitsze geny reporterowe obejmują geny betagalaktozydazy (Alam i in., 1990), alkalicznej fosfatazy (Yang i in., 1997; Cullen i in., 1992), lucyferazy i innych fotoprotein (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne i in., 1984).
Klasyfikacja gatunku Metridia longa
Stawonogi Skorupiaki Widłonogi
Gatunek Metridia longa należy do skorupiaków, szczególnie widłonogów lub zooplanktonu.
Izolowanie cDNA
W celu zbadania aktywności bioluminescencji gatunku Metridia longa, okazy złowione w Morzu Białym (Stacja Biologiczna Karteż, Rosja) przechowywano w ciekłym azocie. Dla wytworzenia bibliotek cDNA Metridia longa wyizolowano RNA metodą Kriega (Krieg i in., 1996) przy użyciu izotiocyjanianu.
Przeprowadzono RT-PCR w celu wytworzenia cDNA. W tym celu inkubowano 10 μg RNA z odwrotną transkryptazą (Superscript Gold II) zgodnie z następującym schematem:
PCR 1. 30 sekund 95°C
2. 6 minut 68°C
3. 10 sekund 95°C
4. 6 minut 68°C cykli obejmujących etap 4 po etapie 3
W celu inaktywowania polimerazy produkty reakcji inkubowano z proteinazą K w temperaturze 37°C przez 30 minut, a cDNA strącano etanolem. Stracony cDNA rozpuszczano w wodzie i inkubowano w temperaturze 37°C przez jedną godzinę z Sfil. Produkty reakcji poddawano filtracji na żelu w celu oddzielenia małych fragmentów. Frakcjonowany cDNA następnie ligowano w miejsce cięcia dla Sfil defosforylowanego wektora λTriplEx2. W celu wytworzenia biblioteki ekspresyjnej na fagu λ, sklonowane fragmenty cDNA z kolei pakowano do fagów λ stosując system do pakowania in vitro SMART cDNA Library Construction Kit (Clontech).
Rekombinowane fagi, które zawierały wstawkę cDNA mającą możliwość ekspresji lucyferaz zależnych od koelenterazyny, identyfikowano poprzez przeszukiwanie biblioteki.
W tym celu murawy bakteryjne złożone z E. coli XL1-Blue umieszczono na szalkach do hodowli 90 mm i inkubowano w temperaturze 37°C przez 10 godzin. Następnie infekowano je stosując 2500 fagów na szalkę, po czym następowała faza inkubacji trwająca 8 godzin w temperaturze 37°C dla umożliwienia utworzenia łysinek. Następnie szalki z hodowlą przechowywano w temperaturze 4°C przez jedną godzinę w celu utwardzenia miękkiego agaru.
W celu wykonania repliki płytek membrany nitrocelulozowe nasycono zawiesinami E. coli XL1-Blue i osuszono. Suche membrany położono na 60 sekund na łysinkach fagowych, a następnie położono na świeżych płytkach agarowych. Następnie płytki agarowe inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny i dodano 4 ml pożywki SOB (+10 mM MgSO4, 0,2% maltozy). Murawę bakteryjną oddzielano, ponownie zawieszano w pożywce LB (+20 mM IPTG) i inkubowano w temperaturze 37°C przez jedną godzinę. Bakterie zbierano przez odwirowanie i otwierano działaniem ultradźwięków, zaś aktywność bioluminescencji oznaczano w luminometrze po dodaniu koelenterazyny.
Płytki hodowlane dające dodatni sygnał bioluminescencji podzielono na skrawki i wykonano świeżą replikę na płytkach. Wykonywanie repliki na płytkach kontynuowano, aż zidentyfikowano osobne aktywne łysinki. W celu subklonowania cDNA wstawki w fagach dających dodatnie łysinki [lacuna] wstawiano do wektora pTriplEx2 w E. coli BM25.8 zgodnie z procedurą producenta do zestawu SMART cDNA Library Construction Kit. Bakterie E. coli transfekowane PTriplEx2 cDNA inkubowano przez noc w temperaturze 37°C w pożywce LB zawierającej stężenie ampicyliny 100 μg/ml. W celu osiągnięcia nadekspresji nocną hodowlę rozcieńczono 1:150 pożywką LB i inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Następnie dokonano indukcji przez dodanie IPTG (izopropylotiogalaktozydu) do stężenia końcowego 20 mM. Indukowaną hodowlę inkubowano w temperaturze 37°C przez
PL 206 385 B1 godzinę i bakterie zebrano przez odwirowanie. Komórki otwierano stosując ultrasonikację w 0,5 ml buforu SM. Chemiluminescencję mierzono w luminometrze po dodaniu 10 μΐ koelenterazyny (10-4 M w metanolu).
W oparciu o przeprowadzone badania zidentyfikowano trzy lucyferazy, które wykazywały aktywność lucyferazy zależnej od koelenterazyny. Lucyferazy te oznaczono jako Lu164, LuAL i Lu22. Lucyferazy te są kodowane przez określone, szczegółowo opisane poniżej, sekwencje nukleotydowe.
Przedmiotem wynalazku jest więc cząsteczka kwasu nukleinowego wybrana z grupy cząsteczek kwasu nukleinowego obejmującej:
a) cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą sekwencję peptydu przedstawioną w SEK. NR
ID.: 2, SEK. NR ID.: 4 lub SEK. NR ID.: 6;
b) cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą sekwencję peptydu o przynajmniej 90% identyczności wobec sekwencji peptydu przedstawionej w SEK. NR ID.: 2, SEK. NR ID.: 4 lub SEK. NR ID.: 6, przy czym peptyd jest wydzielany przez lucyferazę;
c) cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą cząsteczkę kwasu nukleinowego przedstawioną w SEK. NR ID.: 1, SEK. NR ID.: 3, SEK. NR ID.: 5, SEK. NR ID.: 7, SEK. NR ID.: 8, SEK. NR ID.: 9 lub SEK. NR ID.: 10, gdzie kwasy nukleinowe kodują lucyferazę. Korzystnie sekwencja zawiera funkcjonalny promotor w położeniu 5' do sekwencji.
Lucyferazy są przydatne do stosowania jako geny reporterowe dla systemów komórkowych, zwłaszcza dla receptorów, dla kanałów jonowych, dla transporterów, dla czynników transkrypcyjnych lub dla układów indukowalnych.
Lucyferazy mogą być stosowane w systemach bakteryjnych, na przykład do oznaczania miana lub jako substraty dla układów biochemicznych, zwłaszcza dla proteinaz.
Lucyferazy mogą także być stosowane jako enzymy reporterowe, które są sprzężone z przeciwciałami lub innymi białkami, np. do testów ELISA, w immunohistochemii lub w metodzie typu Western.
Lucyferazy mogą być stosowane w układach BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer).
Lucyferazy są przydatne również do stosowania jako białka fuzyjne do mikroskopii współogniskowej lub do analizy oddziaływań białko-białko.
Lucyferazy mogą być stosowane także jako enzymy reporterowe, które są sprzężone z biotyną, NHS, CN-Br lub innymi mediatorami sprzęgania, np. do testów ELISA lub do immobilizacji.
Lucyferazy mogą ponadto być wykorzystywane jako enzymy reporterowe, które są sprzężone z oligonukleotydami DNA lub RNA, np. w metodach hybrydyzacji typu Northern i Southern lub do metody PCR w czasie rzeczywistym.
Wynalazek dotyczy również rekombinacyjnego wektora DNA lub RNA zawierającego cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku.
Ponadto wynalazek dotyczy także niebędącego człowiekiem zawierającego wektor według wynalazku organizmu.
Zgodnie z kolejnym aspektem przedmiot wynalazku stanowi peptyd kodowany przez sekwencję nukleotydową określoną przez cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również zastosowanie cząsteczki według wynalazku lub peptydu według wynalazku jako układów reporterowych w układach komórkowych.
W niniejszym opisie opisano także funkcjonalne równoważniki lucyferaz kodowanych przez cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku. Równoważniki funkcjonalne stanowią te lucyferazy, które mają porównywalny zakres substratów, które są wydzielane i które są, co najmniej w 70% homologiczne. Szczególnie użyteczna jest homologia o wielkości 80% lub 90%. Homologia o wielkości 95% jest szczególnie pożądana.
Poniżej opisano także oczyszczanie lucyferaz jako białek typu dzikiego lub ze znacznikiem, oraz zastosowanie lucyferaz w układach translacji in vitro.
Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe LuAL
Lucyferaza LuAL to białko mające masę cząsteczkową 23,7 kDa i punkt izoelektryczny 8,32. Kodująca sekwencja nukleotydowa to:
PL 206 385 B1
5'atggatatgagggttatctttgctcttgttttctcatcattggttcaggccaaatcaactgaattcgatccta acattaacattgttggtttagaaggaaaatttggtataacaaaccttgagacggatttattcacaatatgggaga caatggatgtcatcaaatcagatattacagatactgatagagtcagcaactttgttgcaactgaaaccgatgcta accgtgggaaaatgcctggcaaaaaactgccactggcagttatcatggaaatggaagccaatgctttcaaagctg gctgcaccaggggatgccttatctgtctttcaaaaataaagtgtacagccaaaatgaaggtgtacattccaggaa gatgtcatgattatggtggtgacaagaaaactggacaggcaggaatagttggtgcaattgttgacattcccgaaa tctctggatttaaggagatggcacccatggaacagttcattgctcaagttgatctttgcgctacctgcactactg gatgtctcaaaggtcttgccaatgttaagtgctctgaactcctgaagaaatggctgcctggcagatgtgcaagtt ttgctgacaagattcaaaaagaagttcacaatatcaaaggcatggctggagatcgttga 3' która daje następującą sekwencję aminokwasową:
MDMRVIFALVFSSLVQAKSTEFDPNINIVGLEGKFGITNLETDLFTIWETMDVIKSDITDTD
RVSNFVATETDANRGKMPGKKLPLAVIMEMEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIPG
RCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMAPMEQFIAQVDLCATCTTGCLKGLANVKCS
ELLKKWLPGRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR o następującym składzie aminokwasowym:
| Ala: | 18 | (8,3%) | Cys: | 10 | (4,6%) | Asp: | 14 | (6,4%) | Glu: | 12 | (5,5%) |
| Phe: | 10 | (4,6%) | Gly: | 19 | (8,7%) | His: | 2 | (0,9%) | Ile: | 18 | (8,3%) |
| Lys: | 21 | (9,6%) | Leu: | 15 | (6,9%) | Met: | 10 | (4,6%) | Asn: | 8 | (3,7%) |
| Pro: | 7 | (3,2%) | Gln: | 5 | (2,3%) | Arg: | 7 | (3,2%) | Ser: | 9 | (4,1%) |
| Thr: | 15 | (6,9%) | Val: | 14 | (6,4%) | Trp: | 2 | (0,9%) | Tyr: | 2 | (0,9%) |
Lu164
Lucyferaza Lu164 to białko mające masę cząsteczkową 23,8 kDa i punkt izoelektryczny 7,81. Kodująca sekwencja nukleotydowa to:
5'atggatataaaggttgtctttactcttgttttctcagcattggttcaggcaaaatcaactgaattcgatccta acattgacattgttggtttagaaggaaaatttggtataacaaaccttgagacggatttattcacaatatgggaga caatggaggtcatgatcaaagcagatattgcagatactgatagagccagcaactttgttgcaactgaaaccgatg ctaaccgtggaaaaatgcctggcaaaaaactgccactggcagttatcatggaaatggaagccaatgctttcaaag ctggctgcaccaggggatgccttatctgtctttcaaaaataaagtgtacagccaaaatgaaggtgtacattccag gaagatgtcatgattatggtggtgacaagaaaactggacaggcaggaatagttggtgcaattgttgacattcccg aaatctctggatttaaggagatggcacccatggaacagttcattgctcaagttgaacgttgcgcttcctgcacta ctggatgtctcaaaggtcttgccaatgttaagtgctctgaactcctgaagaaatggctgcctgacagatgtgcaa gttttgctgacaagattcaaaaagaagttcacaatatcaaaggcatggctggagatcgttga 3'
PL 206 385 B1 która daje następującą sekwencję aminokwasową:
MDIKWFTLVFSALVQAKSTEFDPNIDIVGLEGKFGITNLETDLFTIWETMEVMIKADIADT
DRASNFVATETDANRGKMPGKKLPLAVIMEMEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIP
GRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMAPMEQFIAQVDRCASCTTGCLKGLANVKC
SELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR o następującym składzie aminokwasowym:
| Ala: | 21 | (9,6%) | Cys: | 10 | (4,6%) | Asp: | 15 | (6,8%) | Glu: | 13 | (5,9%) |
| Phe: | 10 | (4,6%) | Gly: | 18 | (8,2%) | His: | 2 | (0,9%) | Ile: | 18 | (8,2%) |
| Lys: | 22 | (10,0%) | Leu: | 14 | (6,4%) | Met: | 10 | (4,6%) | Asn: | 7 | (3,2%) |
| Pro: | 7 | (3,2%) | Gln: | 5 | (2,3%) | Arg: | 7 | (3,2%) | Ser: | 8 | (3,7%) |
| Thr: | 14 | (6,4%) | Val: | 14 | (6,4%) | Trp: | 2 | (0,9%) | Tyr: | 2 | (0,9%) |
Lu22
Lucyferaza Lu22 to białko mające masę cząsteczkową 20,2 kDa i punkt izoelektryczny 7,89. Kodująca sekwencja nukleotydowa to:
5'atgggagtcaaacttatttttgctgttgtttgtgtcgcagttgcccaggctgccacaattcaggaaaattttg aagacattgatcttgtagccataggtggcagctttgcatcagatgttgatgctaacagaggtggacatggtggac atcctggcaaaaagatgccaaaagaagtacttatggaaatggaagccaatgctaaacgagctggctgccacaggg gttgtctggtttgtctgtcacacatcaagtgcacagcacaaatgcagaagtttatcccaggaagatgccatagtt atgcaggagacaaggattctgctcagggaggaattgccggtggtgccattgttgatatacctgaaattgccggat ttaaagaaatgaagcccatggaacagttcattgctcaagttgatctctgtgaagattgcacaactggatgcctca aaggtcttgccaatgttcattgctctgatctcctgaagaagtggctgccatcaagatgtaagacatttgcttcca aaattcaatctcaagtggataccatcaaaggtttggctggagatcgttga 3' która daje następującą sekwencję aminokwasową:
MGVKLIFAWCVAVAQAATIQENFEDIDLVAIGGSFASDVDANRGGHGGHPGKKMPKEVLME
MEANAKRAGCHRGCLVCLSHIKCTAQMQKFIPGRCHSYAGDKDSAQGGIAGGAIVDIPEIAG
FKEMKPMEQFIAQVDLCEDCTTGCLKGLANVHCSDLLKKWLPSRCKTFASKIQSQVDTIKGL
AGDR o następującym składzie aminokwasowym:
| Ala: | 21 | (11,1%) | Cys: | 11 | (5,8%) | Asp: | 12 | (6,3%) | Glu: | 9 | (4,7%) |
| Phe: | 7 | (3,7%) | Gly: | 21 | (11,1%) | His: | 6 | (3,2%) | Ile: | 13 | (6,8%) |
| Lys: | 16 | (8,4%) | Leu: | 12 | (6,3%) | Met: | 7 | (3,7%) | Asn: | 4 | (2,1%) |
| Pro: | 6 | (3,2%) | Gln: | 9 | (4,7%) | Arg: | 6 | (3,2%) | Ser: | 9 | (4,7%) |
| Thr: | 6 | (3,2%) | Val: | 13 | (6,8%) | Tip: | 1 | (0,5%) | Tyr: | 1 | (0,5%) |
PL 206 385 B1
Aktywność enzymatyczna i charakterystyka biochemiczna lucyferaz
Białka LuAL, Lu164 i Lu22 stanowią enzymy, które wyzwalają światło, przekształcając koelenterazynę. Należą one więc do lucyferaz. Lucyferazy mogą być aktywnie wyrażane w komórkach zarówno bakteryjnych jak i eukariotycznych. Lucyferazy LuA1, Lu164 i Lu22, które są wyrażane w komórkach eukariotycznych, są wydzielane. Wydzielanie nie zachodzi przy ekspresji w bakteriach.
Aktywność lucyferaz jest zależna od temperatury. Optima temperatury wynoszące 22°C (dla LuAL) i 27°C (dla Lu164) zostały określone odpowiednio dla lucyferaz LuAL i Lu164. Optimum temperatury dla aktywności lucyferazy Lu22 wynosi 4°C lub mniej.
P r z y k ł a d y
Plazmidy/Konstrukty
Wektorami wykorzystywanymi do wytworzenia konstruktów, które są opisane poniżej, były wektory pcDNA3.1(+) i pTriplEx2 z firmy Clontech oraz wektor pASMplr (własny konstrukt posiadający elementy promotorowe wrażliwe na cAMP; cre). Pochodne wektorów oznaczono jako pcDNA3-x, pTriplEx2-x oraz pASM-x.
LuAL
Fig. 1 pokazuje mapy plazmidowe wektorów pTriplEX2-LuAL, pcDNA3-LuAL i pASM-LuAL
Fig. 2 pokazuje mapy plazmidowe wektorów pTriplEX2-Lu164, pcDNA3-Lu164 i pASM-Lu164
Fig. 3 pokazuje mapy plazmidowe wektorów pTriplEX2-Lu22, pcDNA3-Lu22 i pASM-Lu22
Pochodne koelenterazyny jako substraty Lu164
W celu zidentyfikowania substratów dla Lu164, w każdym przypadku 10 μl roztworów różnych pochodnych koelenterazyny (10-4 M) inkubowano z 10 μl supernatantu z linii komórkowych CHO-pcDNA3-Lu164 i mierzono luminescencję. Koelenterazyny otrzymano z firmy Molecular Probes (USA).
W porównaniu z lucyferazą Lu164 nie zaobserwowano różnic w przypadku lucyferaz LuAL i Lu22. Niezmodyfikowana koelenterazyna (Fig. B, koelenterazyna a) została zidentyfikowana jako optymalny substrat dla Lu164, LuA1 i Lu22.
Fig. 4 pokazuje pochodne koelenterazyny jako potencjalne substraty dla Lu164 i wykres pomiaru luminescencji przez 30 sekund przy 8,7 kV w luminometrze (RLU: względne jednostki światła); a także wzory strukturalne cząsteczek pochodnych koelenterazyny.
Aktywność enzymatyczna lucyferaz Lu164, LuAL i Lu22 w zależności od koelenterazyny
Ekspresja bakteryjna
Ekspresja bakteryjna zachodziła w szczepie E. coli BL21(DE3) wskutek transformowania bakterii plazmidami ekspresyjnymi pTriplEX2-Lu164, pTriplEX2-LuAL oraz pTriplEX2-Lu22. Transformowane bakterie inkubowano w temperaturze 37°C przez 3 godziny w pożywce LB a ekspresję indukowano przez 4 godziny przez dodanie IPTG do uzyskania stężenia końcowego 1 mM. Indukowane bakterie zebrano przez odwirowanie, ponownie zawieszono w PBS i otwierano poprzez ultrasonikację. Koelenterazynę (10-4 M w metanolu) lub lucyferynę (lucyferyna świetlika) dodawano do 5 μl lizatu (5 mg/ml) i mierzono chemiluminescencję.
Pomiar, w RLU (względne jednostki światła), wykonywano przy 9,5 kV przez 30 sekund. Wartości równe 230000, 320000 oraz 260000 RLU zmierzono odpowiednio dla Lu164, LuAL oraz Lu22. Enzymy wyrażano w E. coli BL21(DE3) przy użyciu wektorów pTriplEx2-Lu164, pTriplEx2-LuAL oraz pTriplEx2-Lu22.
Ekspresja eukariotyczna
Konstytutywną ekspresję eukariotyczną uzyskano w komórkach CHO przez transfekowanie komórek plazmidami ekspresyjnymi pcDNA3-Lu164, pcDNA3-LuAL i pcDNA3-Lu22 w doświadczeniach przejściowych. W tym celu 10000 komórek na studzienkę w pożywce DMEM-F12 naniesiono na płytki mikrotitracyjne o 96 studzienkach i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Transfekcję uzyskano stosując zestaw Fugene 6 (Roche) zgodnie z instrukcją producenta. Transfekowane komórki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C w pożywce DMEM-F12. Chemiluminescencję w pożywce (5 μθ i lizacie komórkowym (5 μθ mierzono przez 30 sekund przy 9,5 kV w luminometrze, w temperaturze pokojowej, po dodaniu koelenterazyny (10-4 M w metanolu).
Wartości równe 680000, 670000 oraz 510000 RLU (względnych jednostek światła) zmierzono odpowiednio dla Lu164, LuAL oraz Lu22. Ekspresję uzyskano w komórkach CHO przy użyciu wektorów pcDNA3-Lu164, pcDNA3-LuAL oraz pcDNA3-Lu22.
Widma emisyjne lucyferaz Lu164, LuAL i Lu22
W celu zmierzenia widm emisyjnych, komórki E. coli BL21(DE3) transformowano plazmidami pTriplEx2-Lu164, pTriplEx2-LuAL oraz pTriplEx2-Lu22 i poddano nadekspresji jak opisano w punkcie
PL 206 385 B1
3.1. 50 μ! koelenterazyny (10-4 M) dodano do 100 μ! objętości lizatów bakteryjnych i mierzono widma emisyjne. Wykresy widm emisyjnych lucyferaz są pokazane poniżej.
W przypadku lucyferaz LuAL, Lu164 oraz Lu22, maksimum emisji otrzymanej z przekształcenia substratów ma miejsce przy długości fali wynoszącej około 490 nm.
Fig. 5 pokazuje widma emisyjne lucyferaz Lu164 (A), LuAL (B) i Lu22 (C) po ekspresji bakteryjnej (RLU: względne jednostki światła)
Wydzielanie lucyferaz Lu164, LuAL i Lu22 z komórek CHO, na przykładach Lu164 i LuAL
W celu scharakteryzowania ekspresji lucyferaz LuAl, Lu164 i Lu22 w komórkach eukariotycznych komórki CHO trwale transfekowano plazmidami pcDNA3-LuA1, pcDNA3-Lu164, pcDNA3-Fireluc oraz pcDNA3.1(+). Otrzymane klony hodowano w pożywce DMEM-F12. Lucyferazę świetlika stosowano jako dodatnią próbę kontrolną dla lucyferazy niewydzielonej. Plazmid pcDNA3.1(+) stosowano jako plazmid kontrolny do wykrywania potencjalnej aktywności endogennej w macierzystej komórce CHO.
W celu wykrycia wydzielania lucyferaz 2000 komórek naniesiono na płytki mikrotitracyjne o 384 studzienkach. Po upływie 24 godzin pożywkę usunięto i komórki przemyto roztworem Tyrode i dodano 30 μ! świeżej pożywki. Wtedy nastąpił pierwszy pomiar (0 h), w luminometrze przy 9,5 kV przez 30 sekund, po dodaniu 5 μ! koelenterazyny (10-4 M), lub lucyferyny w przypadku lucyferazy świetlika. Pomiary 1 h do 5 h nastąpiły po upływie jednej do pięciu godzin.
Figura 6 przedstawia wzrost aktywności lucyferazy w pożywce w zależności od czasu. Lucyferaza świetlika nie była wydzielana. Lucyferazy LuAL, Lu164 i Lu22 to lucyferazy wydzielnicze.
Fig. 6 pokazuje aktywność lucyferazy w pożywce komórek CHO (5 μθ po transfekowaniu komórek CHO przy użyciu pcDNA3-LuAL, pcDNA3-świetlik, pcDNA3-Lu164 lub pcDNA3 jako wektora kontrolnego bez żadnej wstawki cDNA. (RLU: względne jednostki światła; h, godziny; Świetlik: Lucyferaza świetlika)
Zależność aktywności lucyferazy od temperatury
W celu określenia zależności temperaturowej lucyferaz Lu22, Lu164 i LuAL, komórki CHO przejściowo transfekowano wektorami pcDNA3-Lu22, pcDNA3-Lu164 oraz pcDNA3-LuA1, i oznaczano aktywność lucyferazy w supernatantach w temperaturach między 0 a 47°C. W tym celu, supernatant komórek i roztwór koelenterazyny doprowadzano do temperatury pomiaru przez 5 minut. Pomiar następował przy 9,5 kV przez 30 sekund w luminometrze.
Figura 7 pokazuje luminescencję, którą mierzono w zależności od temperatury, w przypadku lucyferaz LuA1, Lu164 i Lu22. Optimum temperatury dla aktywności lucyferazy LuAL wynosi 27°C. Optima temperatury wynoszące 22°C i 4°C lub niżej wyznaczono odpowiednio dla Lu164 i Lu22,.
Fig. 7 pokazuje zależną od temperatury aktywność lucyferazy w pożywce komórek CHO (5 μθ po transfekcji przy użyciu pcDNA3-LuAL, pcDNA3-świetlik i pcDNA3-Lu164. (RLU: względne jednostki światła; pożywka: DMEM-F12+10% FCS)
Indukowana ekspresja lucyferaz Lu164, LuAL i Lu22 w komórkach CHO na przykładzie LuAL
Ekspresję eukariotyczną indukowano w komórkach CHO przez transfekowanie komórek plazmidem ekspresyjnym pASM-LuAL w doświadczeniach przejściowych. W tym celu 10000 komórek na studzienkę w pożywce DMEM-F12 naniesiono na płytki mikrotitracyjne o 96 studzienkach i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Transfekcję uzyskano stosując zestaw Fugene 6 (Roche) zgodnie z instrukcją producenta. Transfekowane komórki inkubowano przez noc, w temperaturze 37°C, w pożywce DMEM-F12. Następnie indukowano je forskoliną (10-5 M) przez 5 godzin. Wtedy zmierzono chemiluminescencję w pożywce i w lizacie komórkowym, przy 9,5 kV przez 30 sekund, w luminometrze po dodaniu koelenterazyny (10-4 M w metanolu).
Fig. 8 pokazuje indukowaną ekspresję LuAL w komórkach CHO. Ekspresję indukowano przez 5 godzin forskoliną (10-5 M) w temperaturze 37°C. Aktywność mierzono w 10 μ! supernatantu komórkowego (RLU: względne jednostki światła; współczynnik indukcji: stosunek RLU dla indukowanych do RLU dla nieindukowanych).
Zastosowanie lucyferaz Lu164, LuAL i Lu22 jako genów reporterowych w układach komórkowych na przykładzie receptorów NPY2 oraz A2A i przy użyciu LuAL jako genu reporterowego
Dla umożliwienia analizy aktywacji receptorów sprzężonych z białkiem G przez ligand swoisty dla receptora w układach opartych na systemach komórkowych, sekwencję cDNA dla lucyferazy LuAL sklonowano do wektora ekspresyjnego pASMplr. Wektor ekspresyjny pASMplr zawiera elementy promotorowe wrażliwe na cAMP (CRE), które umożliwiają pośredni pomiar wewnątrzkomórkowego stężenia cAMP. Lucyferaza służy w układzie jako gen reporterowy.
PL 206 385 B1
Zastosowanie lucyferaz Lu22, Lu164 i Lu22 jako genów reporterowych w układach komórkowych wykazano biorąc dla przykładu sprzężone z białkiem G receptory NPY2 (receptor neuropeptydowy 2) i A2A (receptor adenozynowy 2a). W tym celu stabilny klon CHO-pASM-LuAL przejściowo transfekowano wektorem pcDNA3-NPY2 lub wektorem pcDNA3-A2A. Receptor NPY2 stanowi receptor sprzężony z Gi, zaś receptor A2A stanowi receptor sprzężony z Gs.
Receptor A2A aktywowano przez 4 h dodając 1 μΜ NECA. Receptor NPY2 aktywowano dodając 10 μΜ peptydu NPY2 w obecności 10-5 M forskoliny. Aktywność lucyferazy w pożywce (30 μΐ) zmierzono przy 9,5 kV przez 30 sekund w luminometrze po dodaniu koelenterazyny (10-4 M).
Fig. 9 pokazuje zastosowanie lucyferaz jako genów reporterowych w układach komórkowych na przykładzie sprzężonych z białkiem G receptorów A2A i NPY2. (RLU: względne jednostki światła).
Odnośniki/patenty
Apley EC, Wagner R, Engelbrecht S., Rapid procedure for the preparation of ferredoxin-NADP+ oxidoreductase in molecularly pure form at 36 kDa, Anal. Biochem., październik 1985; 150(1) : 145-54 .
Berestovskaya NG, Shaloiko LA, Gorokhovatsky AY, Bondar VS, Vysotski ES, Maximov JE, von Doehren H, Alakhov YB. Cotranslational formation of active photoprotein obelin in a cell-free translation system: direct ultrahigh sensitive measure of the translation course. Anal. Biochem., 1 marca 1999; 268(1):72-8.
Bonin i in. Photinus pyralis luciferase. Gene, 1994 141:75-77
Alam J, Cook JL. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription. Anal. Biochem., 1 sierpnia 1990; 188 (2): 245-54
Cullen Bryan R., Malim Michael H., Secreted placental alkaline phosphatase as a eukaryotic reporter gene. Methods in Enzymology, 216:362ff
Hastings, Cell Physiology: Source book, Sperelakis N. (red.), Academic Press, str. 665-681, 1995
Head JF, Inouye S, Teranishi K, Shimomura O., The crystal structure of the photoprotein aequorin at 2.3 A resolution. Nature. 18 maja 2000; 405(6784):372-6.
Gould S., Suresh S., Firefly luciferase as a tool in molecular and cell biology. Anal. Biochem., 1988, 161:501-507
Idelgaufts H., Gentechnologie von A-Z [Recombinant DNA Technology from A-Z]. VCH Verlag, Weinheim, 1993
Inouye S, Noguchi M, Sakaki Y, Takagi Y, Miyata T, Iwanaga S, Miyata T, Tsuji FI. Cloning and sequence analysis of cDNA for the luminescent protein aequorin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, maj 1985; 82 (10): 3154-8
Inouye, S., Kakoi, H., Goto, T., Tetrahedron Lett., 34, 2971-2974 (1976)
Inouye, S., Watanebe, H., Nakamura, H. i Shimomura, O., FEBS Letters, 481 (2000) 19-25
Jones Keith, Hibbert Frank, Keenan Martine. Glowing jellyfish, luminescence and a molecule called coelenterazine. Tibtech. 1999. 17: 477ff
Kendall Jonathan M., Badminton Michael N. Aequoria victoria bioluminescence moves into an exciting new era. Tibtech. 1998 16:216
Krieg, S., Castles, C, Allred, D., Benedix, M., Fuqua S., RNA from air-dried frozen sections for RT-PCR and differential display. Biotechniques. wrzesień 1996; 21(3) : 425-8.
Lorenz WW, McCann RO, Longiaru M, Cormier MJ., Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis luciferase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991 May 15; 88 (10): 4438-42.
Lorenz WW, Cormier MJ, O' Kane DJ, Hua D, Escher AA, Szalay AA., Expression of the Renilla reniformis luciferase gene in mammalian cells. J. Biolumin. Chemilumin., styczeń-luty 1996; 11(1): 31-7.
Mathews J. C. i in. Purification and properties of Renilla reniformis luciferase. Biochemistry. 1977, 16(1): 85-91
Matveev SV, Lewis JC, Daunert S., Genetically engineered obelin as a bioluminescent label in an assay for a peptide. Anal. Biochem. 15 maja 1999; 270 (1): 69-74.
Phillips GN. Structure and dynamics of green fluorescent protein. Curr. Opin. Struct. Biol., grudzień 1997; 7(6): 821-7
Sala-Newby i in., Expression of recombinant firefly luciferase. Biochem. Soc. Transact. 1992,20:1438
Shimomura O, Johnson FH., Properties of the bioluminescent protein aequorin. Biochemistry, październik 1969; 8 (10): 3991-7.
Shimomura O., Bioluminescence in the sea: photoprotein systems. Symp. Soc. Exp. Biol. 1985; 39:351-72.
PL 206 385 B1
Shimomura O, Teranishi K., Light-emitters involved in the luminescence of coelenterazine. Luminescence, styczeń-luty 2000; 15 (1): 51-8.
Snowdowne KW, Borle AB. Measurement of cytosolic free calcium in mammalian cells with aequorin. Am. J. Physiol., listopad 1984; 247(5 cz. l):C396-408.
Thompson EM, Nagata S, Tsuji FI., Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., wrzesień 1989; 86(17): 6567-71.
Thompson EM, Nagata S, Tsuji FI., Vargula hilgendorfii luciferase: a secreted reporter enzyme for monitoring gene expression in mammalian cells. Gene. 15 grudnia 1990; 96 (2) - 57-62.
Ungrin MD, Singh LM, Stocco R, Sas DE, Abramovitz M., An automated aequorin luminescence-based functional calcium assay for G-protein-coupled receptors. Anal. Biochem., 15 lipca 1999; 272(1) : 34-42.
Webster JJ, Chang JC, Manley ER, Spivey HO, Leach FR., Buffer effects on ATP analysis by firefly luciferase. Anal. Biochem. 15 lipca 1980 15; 106(1): 7-11.
Yang Te-Tuan, Sinai Parisa, Kitts Paul A. , Kain Seven R., Quantification of gene expression with a secreted alkaline phosphatase reporter system. Biotechnique. 1997 23(6) 1110ff
JP 05064583, Tora, (TORAY IND Inc.), Luciferase modified with antigen, antibody, hapten or hormone, etc. - is isolated from Vargula hilgendorfii, useful in bioluminescent analysis
JP 08027200, Tora, (TORAY IND Inc.), Protein comprising luciferase fused to IgG binding domain - useful as diagnostic reagent in chemiluminescent immunoassays
JP 09187281, Kikk, (KIKKOMAN Corp.), Antibody-firefly luciferase fused protein - and related products i.e. firefly luciferase fused gene, recombinant DNA and its preparation
US 5196524, Gustafson G.; Ingolia T.; Kirchner G.; Roberts J., (Lilly & Co), Recombinant DNA encoding fusion protein with bacterial luciferase activity - comprises coding regions of lux A and B genes isolated from specific naturally bioluminescent bacteria, and DNA linker of specified restriction enzyme recognition site
US 5418155, Milton J., Cornier; William W. Lorenz, Isolated Renilla Luciferase and Method of use thereof
US 5422266, Cormier M. J.; Prasher D., (UNIV GEORGIA RES FOUND INC), DNA coding for apo-aequorin - useful for recombinant prodn. of apo-aequorin which is a bioluminescent marker in chemical and biochemical assays
US 5670356, Sherf B.; Wood K. (Promega Corp.), Modified firefly luciferase gene-encoding cytoplasmic form of luciferase enzyme
US 5798441 Cormier M. J.; Prasher D., (UNIV GEORGIA RES FOUND INC), New isolated apoaquorin polypeptide-useful as a luminescent marker in bio/chemical assays
WO 0020619, Alan P.; Liu Jingxue, Secreted renilla luciferase
WO 9520653, Renard J P; Thompson E. M.; Thompson E., (INRA, INST. NAT. RECH. AGRONOMIQUE), Detecting transgenic embryos using Vargula luciferase gene as a marker - allows identification of such embryos at the blastocyst stage, also transgenic animals, embryos and cell line contg. this gene
WO 9938999, Roelant C. (Packard Instr. Co. Inc.), Detecting the presence of renilla luciferase in a sample by detecting luminescence of the sample.
PL 206 385 B1 <110> Bayer AG <12O> Wyizolowane Lucyferazy i ich zastosowanie <130> LeA34790 <150> 10058091.2 <151> 2000-11-23 <160> 10 <170> Patentln wersja 3.1 <210> 1 <211> 660 <212> DNA <213> Metridia longa <400> 1
| atggatataa | aggttgtctt | tactcttgtt | ttotcagcat | tggttcaggc | aaaatcaact | 60 |
| gaattcgatc | ctaacattga | cattgttggt | ttagaaggaa | aatttggtat | aacaaacctt | 120 |
| gagacggatt | tattcacaat | atgggagaea | atggaggtoa | tgatcaaagc | agatattgca | 180 |
| gatactgata | gagccagcaa | ctttgttgca | actgaaaccg | atgctaaccg | tggaaaaatg | 240 |
| cctggoaaaa | aaotgccact | ggcagttatc | atggaaatgg | aagccaatgc | tttcaaagct | 300 |
| ggctgaacoa | ggggatgcct | tatctgtett | tcaaaaataa | agtgtacagc | caaaatgaag | 360 |
| gtgtacattc | caggaagatg | tcatgattat | ggtggtgaca | agaaaactgg | acaggcagga | 420 |
| atagttggtg | caattgttga | cattcccgaa | atctctggat | ttaaggagat | ggcacccatg | 480 |
| gaacagttca | ttgcteaagt | tgaacgttgc | gettcctgca | ctactggatg | tctcaaaggt | 540 |
| cttgccaatg | ttaagtgctc | tgaactcctg | aagaaatggc | tgcctgacag | atgtgcaagt | 600 |
| tttgctgaca | agattcaaaa | agaagttcao | aatatcaaag | gcatggctgg | agatcgttga | 660 |
<210> 2 <211> 219 <212> PRT <213> Metridia longa <400> 2
Met Asp Ile Lys Val Val Phe Thr Leu Val Phe Ser Ala Leu Val Gin
X 5 10 15
Ala Lys Ser Thr Glu Phe Asp Pro Asn Ile Asp Ile Val Gly Leu^Glu
PL 206 385 B1
<210> 3 <211> 573 <212> DNA <213> Metridia longa
PL 206 385 B1
| <400> 3 atgggagtca | aacttatttt | tgctgttgtt | tgtgtcgcag | ttgcccaggc | tgccacaatt | 60 |
| caggaaaatt | ttgaagacat | tgatcttgta | gccataggtg | gcagctttgc | atcagatgtt | 120 |
| gatgctaaca | gaggtggaca | tggtggacat | cctggcaaaa | agatgccaaa | agaagtactt | 180 |
| atggaaatgg | aagccaatgc | taaacgagct | ggctgccaca | ggggttgtct | ggtttgtctg | 240 |
| tcacacatca | agtgcacagc | acaaatgcag | aagtttatcc | caggaagatg | ccatagttat | 300 |
| gcaggagaca | aggattctgc | tcagggagga | attgccggtg | gtgccattgt | tgatatacct | 360 |
| gaaattgccg | gatttaaaga | aatgaagooc | atggaacagt | tcattgctca | agttgatctc | 420 |
| tgtgaagatt | gcacaactgg | atgcctcaaa | ggtcttgcca | atgttcattg | ctctgatctc | 480 |
| ctgaagaagt | ggctgccatc | aagatgtaag | acatttgctt | ccaaaattca | atctcaagtg | 540 |
| gataccatca | aaggtttggc | tggagatcgt | tga | 573 |
<210> 4 <211> 218 <212> PRT <213> Metridia longa <400> 4
| Met 1 | Asp | Met | Arg | Val 5 | Ile | Phe | Ala | Leu | Val 10 | Phe | Ser | Ser | Leu | Val 15 | Gin |
| Ala | Lys | Ser | Thr 20 | Glu | Phe | Asp | Pro | Asn 25 | Ile | Asn | Ile | Val | Gly 30 | Leu | Glu |
| Gly | Lys | Phe 35 | Gly | Ile | Thr | Asn | Leu 40 | Glu | Thr | Asp | Leu | Phe 45 | Thr | Ile | Trp |
| Glu | Thr 50 | Met | Asp | Val | Ile | Lys 55 | Ser | Asp | Ile | Thr | Asp 60 | Thr | Asp | Arg | Val |
| Ser 65 | Asn. | Phe | Val | Ala | Thr 70 | Glu | Thr | Asp | Ala | Asn 75 | Arg | Gly | Lys | Met | Pro 80 |
| Gly | Lys | Lys | Leu | Pro 85 | Leu | Ala | Val | Ile | Met 90 | Glu | Met | Glu | Ala | Asn 95 | Ala |
| Phe | Lys | Ala | Gly 100 | Cys | Thr | Arg | Gly | Cys 105 | Leu | Ile | Cys | Leu | Ser 110 | Lys | Ile |
PL 206 385 B1
| Lys | Cys | Thr 115 | Ala | Lys | Met | Lys | Val 120 | Tyr | Ile | Pro | Gly | Arg 125 | Cys | His | Asp |
| Tyr | Gly 130 | Gly Asp | Lys | Lys | Thr 135 | Gly | Gin | Ala | Gly | Ile 140 | Val | Gly | Ala | Ile | |
| Val 145 | Asp | Ile | Pro | Glu | Ile 150 | Ser | Gly | Phe | Lys | Glu 155 | Met | Ala | Pro | Met | Glu 160 |
| Gin | Phe | Ile | Ala | Gin 165 | Val | Asp | Leu | Cys | Ala 170 | Thr | Cys | Thr | Thr | Gly 175 | Cys |
| Leu | Lys | Gly | Leu 180 | Ala | Asn | Val | Lys | Cys 185 | Ser | Glu | Leu | Leu | Lys 190 | Lys | Trp |
| Leu | Pro | Gly 195 | Arg | Cys | Ala | Ser | Phe 200 | Ala | Asp | Lys | Ile | Gin 205 | Lys | Glu | Val |
| His | Asn | Ile | Lys | Gly | Met | Ala | Gly | Asp | Arg |
210 215 <210> 5 <211> 657 <212> DNA <213> Metridia longa <400> 5
| atggatatga | gggttatctt tgotottgtt ttotoatoat tggttoaggc caaatcaact | 60 |
| gaattcgatc | ctaacattaa cattgttggt ttagaaggaa aatttggtat aacaaacctt | 120 |
| gagacggatt | tattcacaat atgggagaca atggatgtca tcaaatcaga tattacagat | 180 |
| actgatagag | tcagcaaett tgttgcaact gaaaccgatg ctaaccgtgg gaaaatgcct | 240 |
| ggcaaaaaac | tgccactggc agttatcatg gaaatggaag ccaatgcttt caaagctggc | 300 |
| tgcaccaggg | gatgcottat ctgtctttca aaaataaagt gtacagccaa aatgaaggtg | 360 |
| tacattccag | gaagatgtca tgattatggt ggtgacaaga aaactggaca ggcaggaata | 420 |
| gttggtgcaa | ttgttgaeat tcccgaaatc tctggattta aggagatggc acccatggaa | 480 |
| cagttcattg | ctcaagttga tctttgcgct acctgcacta ctggatgtct caaaggtctt | 540 |
| gccaatgtta | agtgctctga actcctgaag aaatggctgc ctggoagatg tgcaagtttt | 600 |
| gctgacaaga | ttcaaaaaga agttcacaat atcaaaggca tggctggaga tcgttga | 657 |
PL 206 385 B1
| <210> <211> <212> <213> | 6 190 PRT Metridia | longa |
| <400> | 6 | |
| Met Gly Val Lys | Leu Ile Phe Ala Val Val Cys Val Ala Val Ala Gin |
10 15
Ala Ala Thr Ile Gin Glu Asn Phe Glu Asp Ile Asp Łeu Val Ala Ile 20 25 30
Gly Gly Ser Phe Ala Ser Asp Val Asp Ala Asn Arg Gly Gly His Gly 35 40 45
Gly His Pro Gly Lys lys Met Pro Lys Glu Val Leu Met Glu Met Glu 50 55 60
Ala Asn Ala Lys Arg Ala Gly Cys His Arg Gly Cys Leu Val Cys Leu 65 70 75 80
Ser His Ile Lys Cys Thr Ala Gin Met Gin Lys Phe Ile Pro Gly Arg 85 90 95
Cys His Ser Tyr Ala Gly Asp Lys Asp Ser Ala Gin Gly Gly Ile Ala 100 105 110
Gly Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ala Gly Phe Lys Glu Met 115 120 125
Lys Pro Met Glu Gin Phe Ile Ala Gin Val Asp Leu Cys Glu Asp Cys 130 135 140
Thr Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val His Cys Ser Asp Leu 145 150 155 160
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Ser Arg Cys Lys Thr Phe Ala Ser Lys Ile 165 170 175
Gin Ser Gin Val Asp Thr Ile Lys Gly Leu Ala Gly Asp Arg 180 185 190
PL 206 385 B1 <210> 7 <211> 657 <212> DNA <213> Metridia longa <400> 7 atggatatga aggttatctt tgctcttatt ttctcagcat tggttcaggc caaatcaact 60 gaattcgatc ctaacattga cattgttggt ttagaaggaa aatttggtat aacaaacctt 120 gagacggatt tattcacaat atgggagaca atggaggtca tcaaatcaga tattgcagat 180 actgatagag tcagcaactt tgttgcaact gaaacogatg ctaaccgtgg gaaaatgcct 240 ggcaaaaaac tgccactggc agttatcatg gaaatggaag ccaatgcttt caaagctggc 300 tgcaccaggg gatgccttat ctgtctttca aaaataaagt gtaoagocaa aatgaaggtg 360 taoattccag gaagatgtca tgattatggt ggtgacaaga aaaotggaca ggcaggaata 420 gttggtgcaa ttgttgacat tcccgaaatc tctggattta aggagatggc acccatggaa 480 cagttcattg ctcaagttga tcgttgcaot tcotgcacta ctggatgtct caaaggtctt 540 gccaatgtta agtgotctga actcctgaag aaatggctgc ctgacagatg tgcaagtttt 600
| gctgacaaga ttcaaaaaga agttcacaat atcaaaggca tggctggaga tcgttga | 657 |
| <210> 8 <211> 630 <212> DNA <213> Metridia longa <400> 8 atggatatca aagttctttt tgctcttatt tgcattgcat tggtccaggc caatccaact | 60 |
| gaaaacaatg atcacattaa tattgttggt atagaaggga aatttggtat aacagatott | 120 |
| gaaacggatt tattcaccat atgggagaca aaccgtatga tcagtacaga taatgaacaa | 180 |
| gccaacacag attctaaccg tggtaaaatg cctgggaaaa aattaccact ggcagtactc | 240 |
| atagaaatgg aagccaatgc ttttaaagct ggctgcacca ggggatgtct tatttgtctt | 300 |
| tctaaaatca agtgtacagc caaaatgaag aagtacattc caggaagatg tcatgattac | 360 |
| ggaggagaca agaaaactgg acaggcaggc atagttggag ctattgttga cattcctgat | 420 |
| atctctggat ttaaagagat gggacceatg gagcagttca ttgctcaagt tgatcgctgc | 480 |
| accgactgca ctactggctg cctcaaaggt cttgccaatg tcaagtgctc tgaactcctc | 540 |
| aaaaaatggc tgccagacag atgtgcaagt tttgctgaca aaattcaaag tgaagtgcac | 600 |
PL 206 385 B1
| aacattaagg gccttgctgg agatcgttga | 630 |
| <210> 9 <211> 657 <212> DNA <213> Metridia longa <400> 9 atggatataa aggttgtctt tgctcttgtt ttctctgoat tggttcaggo caaatcaact | 60 |
| gaattcgatc ctaacattga oattgttggt ttagaaggaa aatttggtat aacaaacctt | 120 |
| gagacggatt tattcacaat atgggagaca atggaggtca tcaaaacaga tattgcagat | 180 |
| actgatagag ccagaagctt tgttgcaact gaaaccgatg ctaaccgtgg gaaaatgcct | 240 |
| ggcaaaaaac tgccactggc agttatcatg gaaatggaag ccaatgcttt caaagctggc | 300 |
| tgcaccaggg gatgccttat ctgtctttca aaaataaagt gtacagccaa aatgaaggtg | 360 |
| tacattccag gaagatgcca tgattatggt ggtgacaaga aaactggaca ggcaggaata | 420 |
| gtaggtgcaa ttgttgacat tccegaaatc totggattta aggagatgga acccatggaa | 480 |
| cagttcattg ctcaagttga tcgttgcgct toctgcacta ctggatgtct caaaggtctt | 540 |
| gccaatgtta agtgctctga actcctgaag aaatggctgc ctgacagatg tgcaagtttt | 600 |
| gctgacaaga ttcaaaaaga agttcacaat atcaaaggca tggctggaga tcgttga | 657 |
<210> 10 <211> 657 <212> DNA <213> Metridia longa
| <400> 10 atggatataa aggttgtctt | tgctcttgtt ttctctgcat tggttcaggc caaatcaact | 60 |
| gaattcgatc ctaacattga | cgttgttggt ttagaaggaa aatttggtat aacaaacctt | 120 |
| gagacggatt tattcacaat | atgggagaca atggaggtca tcaaaacaga tattgcagat | 180 |
| actgatagag ccagaaactt | tgttgcaact gaaaccgatg ctaaccgtgg gaaaatgcct | 240 |
| ggcaaaaaac tgccactggc | agttatcatg gaaatggaag ccaatgcttt caaagctggc | 300 |
| tgcaccaggg gatgccttat | ctgtctttca aaaataaagt gtacagccaa aatgaaggtg | 360 |
| tacattccag gaagatgcca | tgattatggt ggtgacaaga aaactggaca ggcaggaata | 420 |
| gtaggtgcaa ttgttgacat | tcccgaaatc tctggattta aggagatgga acccatggaa | 480 |
| cagttcattg ctcaagttga | tcgttgcgct tcctgcaata otggatgtct caaaggtctt | 540 |
PL 206 385 B1 gccaatgtta agtgctctga actcctgaag aaatggctgc ctgacagatg tgcaagtttt 600 gctgacaaga ttcaaaaaga agttcacaat atcaaaggca tggctggaga tcgttga 657
Claims (9)
1.0E+08
O.OE+OO
Lu22
1.0E+08
O.OE+OO
8.0E+08
1. Cząsteczka kwasu nukleinowego wybrana z grupy cząsteczek kwasu nukleinowego obejmującej:
a) cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą sekwencję peptydu przedstawioną w SEK. NR ID.: 2, SEK. NR ID.: 4 lub SEK. NR ID.: 6;
b) cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą sekwencję peptydu o przynajmniej 90% identyczności wobec sekwencji peptydu przedstawionej w SEK. NR ID.: 2, SEK. NR ID.: 4 lub SEK. NR ID.: 6, przy czym peptyd jest wydzielany przez lucyferazę;
c) cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą cząsteczkę kwasu nukleinowego przedstawioną w SEK. NR ID.: 1, SEK. NR ID.:3, SEK. NR ID.: 5, SEK. NR ID.: 7, SEK. NR ID.: 8, SEK. NR ID.: 9 lub SEK. NR ID.: 10, gdzie kwasy nukleinowe kodują lucyferazę.
2.0E+08
2.0E+08
2. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja zawiera funkcjonalny promotor w poł oż eniu 5' do sekwencji.
3.0E+08
3.0E+08
3. Rekombinacyjny wektor DNA lub RNA, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę określoną w zastrz. 2.
4.0E+08
4.0E+08
4. Niebędący człowiekiem organizm, znamienny tym, że zawiera wektor określony w zastrz. 3.
5.0E+08
5.0E+08
5. Peptyd kodowany przez sekwencję nukleotydową określoną w zastrz. 1.
6.OE+O8
6.0E+08
6. Zastosowanie cząsteczek określonych w zastrz. 1 do 3 lub peptydu określonego w zastrz. 5 jako układów reporterowych w układach komórkowych.
PL 206 385 B1
Rysunki
Fig. 1: Mapy plazmidowe wektorów pTriplEX2-LuAL, pcDNA3LuAL i pASM-LuAL
PL 206 385 B1
Fig. 2: Mapy plazmidowe wektorów pTriplEX2-Lul64, pcDNA3Lul64 i pASM-Lul64
PL 206 385 B1
Fig. 3: Mapy plazmidowe wektorów pTriplEX2-Lu22, pcDNA3Lu22 i pASM-Lu22
PL 206 385 B1
Pochodne koelenterazyny jako substraty dla Lul64
Koelenterazyny
Fig. 4: Pochodne koelenterazyny jako potencjalne substraty dla Lul64. a. wykres luminescencji, którą zmierzono przy 8,7 kV przez 30 sekund w luminometrze (RLU: względne jednostki światła); b. wzory strukturalne pochodnych koelenterazyny.
PL 206 385 B1
LuAL
Fig.
(C) tła) lucyfera
Lul
A
Widma emi
Yl ne ględne edno tki bakteryjnej
RLU kspresg swi wz po
LuAL
7.0E+08
8.0E+07 7.0E+07 6.0E+07 5.0E+07 3 4.0E+07 3.0E+07 2.0E+07 1.0E+07 O.OE+OO
0 100 200 300 400 500 600 700 [nm]
Lu 164
Λ
J.\
/ \
1* ,
0 100 200 300 400 500 600 700 [nm]
f \
i
\
L
\
0 100 200 300 400 500 600 700 [nm]
PL 206 385 B1
PL 206 385 B1
LuAL-1 LuAL-2 LuAL-3
Klon
Fig. 8: Indukowana ekspresja LuAL w komórkach CHO. Komórki indukowano forskoliną (10~5 M) przez 5 godzin w temperaturze 37 °C. Aktywność mierzono w 10 μΐ supernatantu komórkowego (RLU: względne jednostki światła; współczynnik indukcji: stosunek RLU dla indukowanych do RLU dla nieindukowanych) -Ligand +Ligand
Receptor
Fig.
9: Zastosowanie lucyferaz jako genów reporterowych dla układów komórkowych na przykładzie sprzężonych z białkiem G receptorów A2A i NPY2. (RLU: względne jednostki światła)
Departament Wydawnictw UP RP
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10058091A DE10058091A1 (de) | 2000-11-23 | 2000-11-23 | Isolierte Luziferasen Lu164, LuAL und Lu22, sowie deren Verwendung |
| PCT/EP2001/013597 WO2002042470A1 (de) | 2000-11-23 | 2001-11-22 | Isolierte luziferasen sowie deren verwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL362774A1 PL362774A1 (pl) | 2004-11-02 |
| PL206385B1 true PL206385B1 (pl) | 2010-08-31 |
Family
ID=7664340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL362774A PL206385B1 (pl) | 2000-11-23 | 2001-11-22 | Cząsteczka kwasu nukleinowego, kodowany przez nią peptyd, ich zastosowanie, rekombinacyjny wektor DNA lub RNA oraz zawierający go niebędący człowiekiem organizm |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7297483B2 (pl) |
| EP (1) | EP1339853B1 (pl) |
| JP (2) | JP4179877B2 (pl) |
| KR (1) | KR100841808B1 (pl) |
| CN (4) | CN1847399B (pl) |
| AT (1) | ATE335824T1 (pl) |
| AU (3) | AU2002220697A1 (pl) |
| BR (2) | BR0115534A (pl) |
| CA (1) | CA2429451C (pl) |
| DE (2) | DE10058091A1 (pl) |
| DK (1) | DK1339853T3 (pl) |
| ES (1) | ES2271111T3 (pl) |
| IL (2) | IL155878A0 (pl) |
| MX (1) | MXPA03004539A (pl) |
| PL (1) | PL206385B1 (pl) |
| PT (1) | PT1339853E (pl) |
| WO (2) | WO2002042469A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA200303928B (pl) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10058091A1 (de) | 2000-11-23 | 2002-06-06 | Bayer Ag | Isolierte Luziferasen Lu164, LuAL und Lu22, sowie deren Verwendung |
| DE102007005803A1 (de) * | 2007-02-06 | 2008-08-07 | Bayer Healthcare Ag | Sekretierte Luziferase MLuc7 und deren Verwendung |
| DE102007005804A1 (de) | 2007-02-06 | 2008-08-07 | Bayer Healthcare Ag | Sekretierte Luziferase Lu164M3 und deren Verwendung |
| JP5605727B2 (ja) * | 2010-04-06 | 2014-10-15 | Ｊｎｃ株式会社 | セレンテラジン類縁体及びセレンテラミド類縁体 |
| WO2012071631A1 (en) * | 2010-12-03 | 2012-06-07 | Gene Stream Pty Ltd | Improved light-emitting molecules |
| US8435777B1 (en) | 2012-01-20 | 2013-05-07 | Cayla | CPG-free gene for a new secreted reporter protein |
| JP6132350B2 (ja) * | 2012-10-26 | 2017-05-24 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 人工生物発光酵素 |
| WO2014065047A1 (ja) * | 2012-10-26 | 2014-05-01 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 人工生物発光酵素 |
| AU2013359166B2 (en) * | 2012-12-12 | 2019-09-19 | Promega Corporation | Recognition of cellular target binding by a bioactive agent using intracellular bioluminescence resonance energy transfer |
| US10214766B2 (en) | 2013-10-18 | 2019-02-26 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Luminescent substrate for use in artificial bioluminescent enzyme |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5604123A (en) * | 1988-08-09 | 1997-02-18 | Toray Industries, Inc. | Luciferase, gene encoding the same and production process of the same |
| US5838313A (en) * | 1995-11-20 | 1998-11-17 | Siemens Corporate Research, Inc. | Multimedia-based reporting system with recording and playback of dynamic annotation |
| JP2002507410A (ja) * | 1998-03-27 | 2002-03-12 | プロルーム・リミテッド | ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質をコードする核酸および、診断、高処理スクリーニングおよび新規アイテムにおけるその使用 |
| US6995768B2 (en) * | 2000-05-10 | 2006-02-07 | Cognos Incorporated | Interactive business data visualization system |
| DE10058091A1 (de) * | 2000-11-23 | 2002-06-06 | Bayer Ag | Isolierte Luziferasen Lu164, LuAL und Lu22, sowie deren Verwendung |
| US6643635B2 (en) * | 2001-03-15 | 2003-11-04 | Sagemetrics Corporation | Methods for dynamically accessing, processing, and presenting data acquired from disparate data sources |
| US8036939B2 (en) * | 2001-06-08 | 2011-10-11 | Servigistics, Inc. | Reporting in a supply chain |
| US7587755B2 (en) * | 2004-07-02 | 2009-09-08 | Citrix Systems, Inc. | System and method for executing interactive applications with minimal privileges |
| US20060230234A1 (en) * | 2005-03-30 | 2006-10-12 | Sap Ag. | Browser cache management |
| US7779347B2 (en) * | 2005-09-02 | 2010-08-17 | Fourteen40, Inc. | Systems and methods for collaboratively annotating electronic documents |
| US7831464B1 (en) * | 2006-04-06 | 2010-11-09 | ClearPoint Metrics, Inc. | Method and system for dynamically representing distributed information |
-
2000
- 2000-11-23 DE DE10058091A patent/DE10058091A1/de not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-11-12 WO PCT/EP2001/013057 patent/WO2002042469A1/de not_active Ceased
- 2001-11-12 AU AU2002220697A patent/AU2002220697A1/en not_active Withdrawn
- 2001-11-22 BR BR0115534-2A patent/BR0115534A/pt active IP Right Grant
- 2001-11-22 EP EP01994705A patent/EP1339853B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 MX MXPA03004539A patent/MXPA03004539A/es active IP Right Grant
- 2001-11-22 CN CN200510118849XA patent/CN1847399B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 JP JP2002545175A patent/JP4179877B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 PT PT01994705T patent/PT1339853E/pt unknown
- 2001-11-22 CA CA2429451A patent/CA2429451C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 ES ES01994705T patent/ES2271111T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 KR KR1020037006911A patent/KR100841808B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 PL PL362774A patent/PL206385B1/pl unknown
- 2001-11-22 DK DK01994705T patent/DK1339853T3/da active
- 2001-11-22 DE DE50110723T patent/DE50110723D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 CN CN2010105056541A patent/CN101979586B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 CN CNB018194338A patent/CN1303214C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 WO PCT/EP2001/013597 patent/WO2002042470A1/de not_active Ceased
- 2001-11-22 IL IL15587801A patent/IL155878A0/xx active IP Right Grant
- 2001-11-22 CN CN2012102094057A patent/CN102732537A/zh active Pending
- 2001-11-22 AU AU2002224876A patent/AU2002224876B2/en not_active Expired
- 2001-11-22 US US10/416,752 patent/US7297483B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 AT AT01994705T patent/ATE335824T1/de active
- 2001-11-22 AU AU2487602A patent/AU2487602A/xx active Pending
- 2001-11-22 BR BRPI0115534-2A patent/BRPI0115534B1/pt unknown
-
2003
- 2003-05-13 IL IL155878A patent/IL155878A/en unknown
- 2003-05-21 ZA ZA200303928A patent/ZA200303928B/en unknown
-
2007
- 2007-10-10 JP JP2007264492A patent/JP4519163B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2007-10-22 US US11/975,752 patent/US8236540B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-07-18 US US13/552,486 patent/US20130115641A1/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-05-15 US US14/714,166 patent/US9745557B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9745557B2 (en) | Isolated luciferases and the use thereof | |
| Inouye et al. | Secretional luciferase of the luminous shrimp Oplophorus gracilirostris: cDNA cloning of a novel imidazopyrazinone luciferase | |
| TW200846469A (en) | Secreted MLuc7 luciferase and use thereof | |
| EP1945761A1 (en) | Arachnocampa luciferases | |
| EP3358010B1 (en) | Novel artificial bioluminescent enzymes | |
| HK1154623B (en) | Isolated luciferases and the use thereof | |
| US7544484B2 (en) | Nucleic acids encoding membrane-binding proteins and methods of using same | |
| HK1096423B (en) | Isolated luciferases and the use thereof | |
| HK1177476A (en) | Isolated luciferases and the use thereof |