ES2271994T3 - Hibridacion en dos pasos y captura de un polinucleotido. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para capturar un polinucleótido diana en una muestra sobre un soporte sólido con una sonda inmovilizada unida, mediante la utilización de una sonda de captura y dos estados de hibridación diferentes, que, preferiblemente, sólo se diferencian en temperatura. Los dos estados de hibridación controlan el orden de hibridación, permitiendo el primer estado de hibridación la hibridación de la sonda de captura y el polinucleótido objetivo y el segundo estado de hibridación permite la hibridación de la sonda de captura y la sonda inmovilizada, produciéndose un complejo de sonda inmovilizada, sonda de captura y polinucleótido objetivo. También se describe un procedimiento para determinar la presencia de un polinucleótido objetivo en una muestra, mediante la captura de un polinucleótido objetivo, amplificación del polinucleótido objetivo capturado y detección de secuencias amplificadas.

Description

Hibridación en dos pasos y captura de un polinucleótido.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos de captura en un soporte sólido de un polinucleótido que puede estar presente en una muestra. La invención es especialmente útil para la separación de un polinucleótido diana de otro material de una muestra y se utiliza de forma preferida como parte de un procedimiento diagnóstico para detectar la presencia del polinucleótido diana en una muestra.

Antecedentes de la invención

Un polinucleótido diana es un polinucleótido presente en una muestra que puede purificarse a partir de uno o más componentes de la muestra o cuya presencia puede detectarse utilizando diferentes técnicas. Tales técnicas se llevan a cabo habitualmente como parte de un procedimiento diagnóstico para detectar la presencia de un polinucleótido que es indicativo de la presencia de un agente infeccioso o de un estado patogénico.

La presencia de una región de secuencia de bases de polinucleótidos diana, presente en un polinucleótido diana, puede detectarse mediante métodos diversos, tales como aquellos que utilizan sondas de ácidos nucleicos que hibridan con una secuencia diana. Se pueden diseñar sondas para detectar secuencias diana diversas, tales como aquellas características de microorganismos, virus, genes humanos, genes de plantas o animales o estados patogénicos.

Una técnica para purificar un polinucleótido diana, que se utiliza frecuentemente en procedimientos diagnósticos, incluye la captura de un polinucleótido diana en un soporte sólido. El soporte sólido retiene al polinucleótido diana durante uno o más pasos de lavado del proceso de purificación del polinucleótido diana.

Ranki et al., n.º de Patente Estadounidense 4.486.539, describen una técnica de hibridación en sándwich para capturar y detectar la presencia de un polinucleótido diana. Esta técnica incluye la captura del polinucleótido diana mediante una sonda unida a un soporte sólido y la hibridación de una sonda de detección al polinucleótido diana capturado. Las sondas de detección que no están hibridadas al polinucleótido diana se separan fácilmente del soporte sólido mediante lavado. Así, se asocia el marcador remanente al polinucleótido diana presente inicialmente en la muestra.

Stabinsky, n.º de Patente Estadounidense 4.751.177, describe un método que utiliza un polinucleótido mediador que hibrida con un polinucleótido diana y con un polinucleótido fijado a un soporte sólido. El polinucleótido mediador une el polinucleótido diana al soporte sólido para producir una diana unida. Una sonda marcada puede hibridar con la diana unida y la sonda marcada no unida puede separarse del soporte sólido mediante lavado.

Collins et al., n.º de Pub de Patente Europea 0328829, describen un método para detectar un ácido nucleico diana incubándolo con una primera sonda a una primera temperatura, añadiendo una segunda sonda inmovilizada complementaria a la primera a una segunda temperatura, purificando la diana capturada, amplificándola y detectándola con una sonda marcada.

Englehardt et al., números de Patentes Estadounidenses 4.894.324 y 5.288.609, describen un método ara detectar un polinucleótido diana. El método utiliza dos segmentos polinucleotídicos de cadena simple complementarios a la misma cadena de la diana o a la opuesta y da lugar a la formación de un doble híbrido con el polinucleótido diana. En una realización, el doble híbrido puede capturarse en un soporte.

Cape et al., n.º de Pub de Patente Europea 0370694, describe métodos y equipos par detectar ácidos nucleicos utilizando medios de captura en fase sólida. Los métodos utilizan cebadores de oligonucleótido marcados con parejas de unión específicas para inmovilizar cebadores y productos de extensión de cebadores. El marcador forma un complejo específico con su receptor, el cual está unido a un soporte sólido.

Resumen de la invención

Según un aspecto de la invención, existe un método publicado para capturar un polinucleótido diana presente en una muestra, incluyendo los pasos de: incubar una mezcla que contiene un polinucleótido diana, una sonda de captura y una sonda inmovilizada en una primera condición de hibridación, que favorece la formación de un complejo de hibridación sonda de captura:diana formado por la sonda de captura y el polinucleótido diana, y desfavorece la formación de un complejo de hibridación sonda inmovilizada:sonda de captura formado por la sonda inmovilizada y la sonda de captura; e incubando entonces la mezcla en una segunda condición de hibridación que favorece la formación de un complejo de hibridación sonda inmovilizada:sonda de captura, capturando de ese modo al polinucleótido diana en un complejo de hibridación sonda inmovilizada:sonda de captura formado por la sonda inmovilizada, la sonda de captura y el polinucleótido diana. El primer paso de incubación utiliza una temperatura inferior a la T_{f} del complejo de hibridación sonda de captura:diana y superior a la T_{f} del complejo de hibridación sonda inmovilizada:sonda de captura, y el segundo paso de incubación utiliza una temperatura por debajo de la T_{f} del complejo de hibridación sonda de inmovilización:sonda de captura. De forma preferente, el segundo paso de incubación se consigue disminuyendo la temperatura de la primera condición de hibridación en al menos 10ºC o al menos alrededor de 20ºC. En una realización, el primer paso de incubación utiliza una temperatura de al menos 60ºC y un segundo paso de incubación utiliza una temperatura de al menos alrededor de 40ºC o inferior. El método también incluye el paso de purificación del complejo de hibridación sonda de inmovilización:sonda de captura:diana. Otras realizaciones del método incluyen el paso de detección de los polinucleótidos diana en el complejo de hibridación sonda de inmovilización:sonda de captura:diana mediante hibridación de una sonda marcada con el polinucleótido diana y detección de la sonda marcada. Asimismo, el método puede incluir el paso de amplificación del polinucleótido diana para producir un ácido nucleico amplificado, de forma preferida mediante amplificación asociada a la trascripción. Cuando se incluye el paso de amplificación, el método puede incluir asimismo el paso de detección del ácido nucleico amplificado, el cual, de forma preferida, incluye los pasos de hibridación de una sonda marcada al ácido nucleico amplificado que es complementario al polinucleótido diana y la detección de la sonda marcada. El método puede también incluir en el paso de detección un paso de eliminación de la sonda marcada no hibridada. En realizaciones preferidas, ambos pasos de incubación incluyen la utilización de la sonda inmovilizada, que incluye una región de unión a la sonda de captura de grupos de reconocimiento de al menos cinco bases nucleotídicas de longitud y la sonda de captura, que incluye una región de unión a la sonda inmovilizada de al menos cinco bases nucleotídicas de longitud, con la condición de que la región de unión a la sonda de captura sea complementaria a la región de unión a la sonda inmovilizada. De forma preferida, la región de unión a la sonda de captura incluye: (a) un primer esqueleto que contiene al menos un enlace glúcido-fosfodiéster o, al menos, un grupo de ácido nucleico peptídico, al menos un enlace fosforotioato, o una combinación de los mismos, y (b) grupos de reconocimiento de al menos diez bases nucleotídicas unidos al primer esqueleto, en los que cada grupo de reconocimiento de nucleótidos es capaz de formar puentes de hidrógeno con adenina, guanina, citosina, timina, uracilo o inosina. La región de unión a la sonda inmovilizada incluye: (a) un segundo esqueleto que contiene al menos un enlace glúcido-fosfodiéster o, al menos, un grupo de ácido nucleico peptídico, al menos un enlace fosforotioato, o una combinación de los mismos, y (b) grupos de reconocimiento de al menos diez bases nucleotídicas unidos al segundo esqueleto, que son capaces de formar puentes de hidrógeno con los grupos de reconocimiento de bases nucleotídicas unidos al primer esqueleto. En una realización del método la región de unión a la sonda de captura consiste en un homopolímero formado al menos por 10 nucleótidos y la región de unión a la sonda inmovilizada consiste en un homopolímero formado al menos por 25 nucleótidos, de los que al menos 10 nucleótidos son complementarios a los 10 nucleótidos de la región de unión a la sonda de captura. De forma preferida, la región de unión a la sonda de captura incluye alrededor de catorce bases contiguas A o T, y la región de unión a la sonda inmovilizada incluye una secuencia de al menos 30 bases complementarias a la misma. En realizaciones preferidas, los pasos de incubación utilizan una mezcla de la sonda inmovilizada y la sonda de captura, en las que cada sonda incluye desoxinucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos 2'-metoxi sustituidos, componentes de nucleótidos 2'-halo sustituidos, o combinaciones de los mismos.

Otro aspecto de la invención es un método para determinar la presencia de un polinucleótido diana en una muestra. Este método incluye los pasos de: proveer una sonda de captura capaz de hibridar con un polinucleótido diana presente en una muestra; mezclar la sonda de captura con una muestra sospechosa de contener el polinucleótido diana a una primera temperatura de incubación que favorezca la hibridación de la sonda de captura con el polinucleótido diana, produciendo así un complejo sonda de captura:polinucleótido diana; proporcionar una sonda inmovilizada capaz de hibridar con la sonda de captura; incubar el complejo sonda de captura:polinucleótido diana y la sonda de inmovilización a una segunda temperatura de incubación que favorezca la hibridación de la sonda inmovilizada con la sonda de captura, produciendo así un polinucleótido diana capturado que incluye un complejo sonda inmovilizada:sonda de captura:polinucleótido diana; purificar el polinucleótido diana capturado, produciendo así un polinucleótido diana purificado; amplificar el polinucleótido diana purificado, produciendo así un ácido nucleico amplificado; y detectar el ácido nucleico amplificado para determinar la presencia de un polinucleótido diana en la muestra. En una realización de este método, el paso de detección incluye la hibridación de una sonda marcada con el ácido nucleico amplificado que es complementario al polinucleótido diana, o a una porción del mismo, y la detección de la sonda marcada.

Breve descripción de las ilustraciones

Las Figs. 1A y B ilustran de forma esquemática la utilización de dos condiciones de hibridación diferentes para capturar a un polinucleótido diana señalado por "c", utilizando una sonda inmovilizada señalada por "a", unida a un soporte sólido 10 y una sonda de captura señalada por "b". En la Fig. 1A, la primera condición de hibridación permite la hibridación de la sonda de captura (b) y el polinucleótido diana (c) para formar un complejo sonda de captura:polinucleótido diana 15, pero no permite la hibridación de la sonda de captura (b) con la sonda inmovilizada (a). En la Fig. 1B la segunda condición de hibridación permite la hibridación de la sonda de captura (b) y de la sonda inmovilizada (a) para formar un complejo sonda inmovilizada:sonda de captura:polinucleótido diana 20.

La Fig. 2 ilustra los pasos de A a F de un método que incluye la amplificación de una secuencia polinucleotídica diana capturada (paso (A)) que utiliza la amplificación asociada a la trascripción (pasos (B) a (F)). En la Fig. 2, paso (A), una sonda inmovilizada (a) unida a un soporte sólido 10, una sonda de captura (b) y el polinucleótido diana (c) están señalados como en la Fig. 1. Una secuencia promotora reconocida por una RNA polimerasa está marcada como "P"; "(-)" indica el extremo 5' de un ácido nucleico y "(+)" indica el extremo 3' de un ácido nucleico complementario; y una línea discontinua "(- - -)" indica polimerización de ácidos nucleicos.

Las Figs. 3A, 3B y 3C ilustran la utilización de dos condiciones de hibridación para detectar la presencia de un polinucleótido diana (c), utilizando una sonda inmovilizada (a) unida a un soporte sólido 10, una sonda de captura (b), (señalados como en la Fig. 1) y sondas marcadas mostradas como "(d)". En la Fig. 3A, la primera condición de hibridación permite la formación del complejo sonda de captura:polinucleótido diana:sonda marcada 30. En la Fig. 3B, una segunda condición de hibridación permite la formación del complejo de sonda inmovilizada:sonda de captura:polinucleótido diana:sonda marcada 40, dejando sondas marcadas no unidas 50. En la Fig. 3C, las sondas marcadas no unidas han sido eliminadas mediante lavado, dejando el complejo sonda inmovilizada:sonda de captura:polinucleótido diana:sonda marcada 40 purificado.

La Fig. 4 ilustra un ejemplo de un soporte sólido 10 con sondas inmovilizadas unidas formadas por secuencias T_{14}; la sonda superior (adyacente a "(a)" en el lado derecho) está en el complejo sonda inmovilizada:sonda de captura, en el que la sonda_{ } inmovilizada T_{14} hibrida (mostrado como ":" entre bases) con la sonda de captura (3'A_{14}TTTGTCAGTAACCTTGATTCATCAAG 5' (ID. de SEC. n.º: 1)) que contiene una secuencia complementaria A_{14}; la sonda del medio (adyacente a "(b)" en el lado derecho) está en el complejo sonda inmovilizada:sonda de captura:polinucleótido diana que contiene la sonda inmovilizada hibridada con la sonda de captura, que está hibridada con una secuencia diana (5'CAGTCATTGGAACTAAGTAGTTC 3' (ID. de SEC. n.º: 2)), dentro de una secuencia mayor (mostrado mediante secuencias terminales "NNNNNN"); y la sonda inferior (adyacente a "(c)" en el lado derecho) es una sonda inmovilizada T_{14} no hibridada.

Descripción detallada de la invención

La presente invención pone de relieve métodos para capturar un polinucleótido diana en un soporte sólido utilizando una sonda de captura y dos condiciones de hibridación diferentes. Las condiciones de hibridación diferentes se utilizan para controlar el orden de hibridación en una muestra que contiene un polinucleótido diana mezclado con una sonda de captura y una sonda inmovilizada. Por una "condición de hibridación" se entiende el entorno acumulativo utilizado para una reacción en la que un ácido nucleico de cadena sencilla forma puentes de hidrógeno con un segundo ácido nucleico de cadena sencilla para formar un complejo de hibridación (al que se refiere aquí, en algunas ocasiones, como "complejo"). El entorno acumulativo incluye, por ejemplo, las concentraciones y componentes (p. ej., sales, agentes quelantes y ácidos nucleicos inhibidores no competitivos) de una solución acuosa u orgánica que contiene los ácidos nucleicos de cadena sencilla y la temperatura de la mezcla de reacción. Otros factores que pueden contribuir al entorno acumulativo incluyen, por ejemplo, el tiempo que se deja a la formación de los puentes de hidrógeno, la geometría física de la cámara que sostiene los reactivos y el uso del mezclado y agitado durante la hibridación. Todas estas condiciones ambientales son bien conocidas en la materia (véase, p. ej., Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ED. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)). En la presente invención, la primera condición de hibridación facilita la hibridación de la sonda de captura con el polinucleótido diana mientras excluye esencialmente la hibridación de la sonda de captura con la sonda inmovilizada y una segunda condición de hibridación facilita entonces la hibridación de la sonda de captura con la sonda inmovilizada.

Una sonda inmovilizada proporciona medios para unir una sonda de captura a un soporte inmovilizado. La sonda inmovilizada es una molécula de reconocimiento de secuencia de bases unida a un soporte sólido que facilita la separación del polinucleótido diana unido del material no unido. Puede utilizarse cualquier soporte sólido conocido, tales como matrices y partículas libres en solución. Por ejemplo, los soportes sólidos pueden ser nitrocelulosa, nylon, cristal, poliacrilato, polímeros mixtos, poliestireno, polipropileno de silano y, de forma preferida, partículas de atracción magnética. Los soportes especialmente preferidos son esferas magnéticas que sean monodispersas (es decir, uniformes en tamaño \pm alrededor de 5%), proveyendo así resultados coherentes, lo que es especialmente ventajoso para uso en ensayos automatizados.

La sonda inmovilizada se une directa o indirectamente a un soporte sólido mediante enlace o interacción que es estable durante la primera y segunda condiciones de hibridación utilizadas en la presente invención. La unión directa tiene lugar cuando la molécula de sonda inmovilizada se une al soporte sólido en ausencia de un grupo intermediario. Por ejemplo, la unión directa puede ser mediante enlace covalente, quelación, o interacción iónica. La unión indirecta tiene lugar cuando la sonda inmovilizada se une al soporte sólido mediante uno o más enlazantes. Un "enlazante" es un medio para unir al menos dos moléculas diferentes en un complejo estable y contiene uno o más componentes de un grupo de parejas de unión.

Los miembros de un grupo de parejas de unión son capaces de reconocerse y unirse entre ellos. Los grupos de parejas de unión pueden ser, por ejemplo, receptor y ligando, enzima y sustrato, enzima y cofactor, enzima y coenzima, anticuerpo y antígeno, glúcido y lectina, biotina y estreptavidina, ligando y agente quelante, níquel e histidina, moléculas de reconocimiento de bases nucleotídicas complementarias y ácidos nucleicos homopoliméricos complementarios o porciones homopoliméricas de ácidos nucleicos poliméricos. Los componentes de un grupo de parejas de unión son las regiones de los miembros que participan en la unión.

Los métodos de la presente invención tienen diferentes realizaciones. En una, un enlazante está unido directamente al soporte sólido y se une a la sonda inmovilizada mediante componentes de un grupo de parejas de unión. En otra realización, hay más de un enlazante presente, donde un primer enlazante está unido directamente al soporte sólido y al menos un segundo enlazante se une a la sonda inmovilizada mediante componentes de un grupo de parejas de unión. Pueden utilizarse enlazantes adicionales para unir los enlazantes primero y segundo.

Una "molécula de reconocimiento de secuencia de bases" es un polímero que contiene grupos de reconocimiento de secuencia de bases unidos mediante un esqueleto. Los grupos de reconocimiento de secuencia de bases proporcionan información de secuencias para hibridar con una molécula complementaria. Un grupo de reconocimiento de bases nucleotídicas individual puede formar puentes de hidrógeno con adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T), uracilo (U) o derivados de las mismas. El esqueleto de una molécula de reconocimiento de secuencia de bases proporciona los grupos de reconocimiento de secuencia de bases con la orientación y el espacio necesarios para formar puentes de hidrógeno durante la hibridación, especialmente con bases de un ácido nucleico. Las moléculas de reconocimiento de secuencia de bases pueden ser, p. ej., RNA, DNA, ácidos nucleicos peptídicos o derivados de los mismos.

Una sonda de captura proporciona medios para unir de forma estable un polinucleótido diana y una sonda inmovilizada. La sonda de captura incluye una o más porciones de reconocimiento de secuencia de bases: una región de unión a polinucleótidos diana y una región de unión a sondas inmovilizadas. Estas dos regiones de unión pueden estar presentes en una o más moléculas de reconocimiento de secuencia de bases pero se incluyen de forma preferida en una molécula de reconocimiento de secuencia de bases única que contiene las dos regiones de unión. En otra realización, la sonda de captura incluye una región de unión a polinucleótidos diana y una región de unión a sondas inmovilizadas, que están presentes en dos moléculas de reconocimiento de secuencia de bases diferentes unidas mediante uno o más enlazantes. Por ejemplo, una región de unión a sondas inmovilizadas puede estar presente en una primera molécula de reconocimiento de secuencia de bases, la región de unión a polinucleótidos diana puede estar presente en una segunda molécula de reconocimiento de secuencia de bases y las dos moléculas diferentes están unidas mediante un enlazante que es una molécula de reconocimiento de secuencia de bases, que hibrida con las moléculas primera y segunda de reconocimiento de secuencia de bases.

La presente invención incluye un método para capturar a un polinucleótido diana presente en una muestra. En primer lugar, se produce e incuba una mezcla que contiene la muestra, una sonda de captura y una sonda inmovilizada en una primera condición de hibridación para formar un complejo sonda de captura:diana, formado por la sonda de captura hibridada con el polinucleótido diana. La primera condición de hibridación utiliza una temperatura por debajo de la T_{f} del complejo sonda de captura:diana y por encima de la T_{f} del híbrido sonda inmovilizada:sonda de captura. De forma preferida, en la primera condición de hibridación menos de al menos el 50% de la sonda de captura es un complejo sonda inmovilizada:sonda de captura. De forma más preferida, en la primera condición de hibridación menos del 25%, de forma aún más preferida, menos del 10% y, de la forma más preferida menos del 1% de la sonda de captura es un complejo sonda inmovilizada:sonda de captura.

Entonces, se utiliza una segunda condición de hibridación para formar un complejo sonda inmovilizada:sonda de captura:polinucleótido diana formado por la sonda inmovilizada hibridada con la sonda de captura, que está hibridada con el polinucleótido diana. La temperatura de la segunda condición de hibridación está por debajo de la T_{f} del complejo de hibridación sonda inmovilizada:sonda de captura y por tanto es compatible con la formación de un complejo de sonda inmovilizada:sonda de captura. De forma preferida, la sonda inmovilizada está en exceso respecto a la sonda de captura.

"T_{f}" se refiere a la temperatura de fusión en la que se desnaturalizan el 50% de los complejos de hibridación formados entre dos moléculas de reconocimiento de secuencia de bases. A una temperatura por debajo de la T_{f}, se favorece la formación del complejo de hibridación, mientras que, por encima de la T_{f} no se favorece la formación del complejo.

La referencia a la T_{f} de un complejo de hibridación que contiene una sonda de captura o una sonda inmovilizada incluye complejos formados mediante hibridación con uno o más enlazantes, que pueden estar presentes. Si los enlazantes están presentes, entonces la T_{f} de un complejo de hibridación refleja la estabilidad global del complejo, como puede calcularse fácilmente por los expertos en la materia. Por ejemplo, en una sonda de captura formada por tres oligonucleótidos existe una T_{f} del primer oligonucleótido hibridado con el segundo oligonucleótido y una segunda T_{f} del segundo oligonucleótido hibridado con un tercer oligonucleótido. La más baja de estas T_{f} primera y segunda determina la estabilidad de la sonda de captura y si los tres oligonucleótidos que conforman la sonda de captura se mantienen hibridados bajo una condición de hibridación especial.

El complejo de hibridación sonda de captura: polinucleótido diana, como otros complejos que se describen aquí, puede contener grupos adicionales además de los componentes indicados. Tales grupos adicionales incluyen, por ejemplo, una sonda marcada hibridada con el polinucleótido diana o un oligonucleótido hibridado con la diana, lo que resulta de utilidad para la amplificación del polinucleótido diana. Grupos adicionales que no afectan el funcionamiento de la presente invención pueden estar también presentes.

Una sonda marcada es una molécula de reconocimiento de secuencia de bases que contiene un grupo detectable. Los grupos detectables pueden ser, por ejemplo, una subunidad fluorescente, una subunidad quimioluminiscente, un radio-isótopo, biotina, avidina, una enzima o sustrato enzimático, o un grupo reactivo.

Los métodos de la presente invención pueden incluir, además, un paso de purificación. Por "purificación" se entiende que uno o mas de los componentes que conforman la muestra antes de la purificación son eliminados de uno o más componentes de la muestra. Los componentes de la muestra incluyen ácidos nucleicos, y pueden incluir también materiales como proteínas, carbohidratos, lípidos y sondas marcadas. De forma preferida, el paso de purificación elimina al menos alrededor del 70%, de forma más preferida al menos alrededor del 90% y de forma incluso más preferida, al menos alrededor del 95% de los ácidos nucleicos no diana presentes en la muestra.

Los métodos de la presente invención pueden incluir, además, la amplificación del polinucleótido diana purificado después de la captura (referido aquí como "diana capturada") para producir un ácido nucleico amplificado. Se utiliza una polimerasa de ácido nucleico para amplificar el ácido nucleico diana para producir múltiples copias del polinucleótido diana entero o de fragmentos del mismo, o de un ácido nucleico complementario al polinucleótido diana entero o a los fragmentos del mismo. Las técnicas de amplificación adecuadas bien conocidas en la materia incluyen, por ejemplo, la amplificación asociada a la trascripción, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), amplificación mediada por replicasa y Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR).

La amplificación de "fragmentos del mismo" se refiere a la producción de un ácido nucleico amplificado que contiene menos que el polinucleótido diana completo o el complemento de este. Tales fragmentos pueden producirse amplificando un fragmento del polinucleótido diana, por ejemplo, utilizando un oligonucleótido de amplificación que hibrida con e inicia la polimerización a partir de una posición interna del polinucleótido diana. De forma preferida, el fragmento amplificado contiene una secuencia diana detectable. La presencia de ácidos nucleicos amplificados puede detectarse utilizando técnicas diferentes bien conocidas, tales como, por ejemplo, hibridar una sonda marcada a los ácidos nucleicos amplificados. Otras técnicas bien conocidas en la materia para detectar ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, filtración en gel, electroforesis en gel y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, siglas en inglés).

Se puede utilizar una sonda marcada para detectar la presencia de una diana capturada purificada. De forma preferida, se utiliza un paso de purificación para eliminar las sondas marcadas no unidas de las sondas marcadas unidas, que están hibridadas con polinucleótidos diana capturados. El paso de purificación puede utilizarse de forma simultánea con la purificación del polinucleótido diana capturado. De forma alternativa, las sondas marcadas pueden añadirse a polinucleótidos diana capturados purificados y las sondas marcadas no hibridadas pueden ser eliminadas en un paso de purificación sucesivo.

Por "eliminar" respecto al componente de una muestra o componente de reacción de hibridación (p. ej., sonda marcada no unida) se entiende que al menos el 70% del componente no deseado se separa del componente retenido. De forma más preferida al menos el 90% y, de forma incluso más preferida, al menos el 95% del componente no deseado se elimina. Los componentes pueden eliminarse utilizando procedimientos estándar tales como, por ejemplo, utilizando procedimientos de lavado.

La presencia del polinucleótido diana capturado puede detectarse utilizando un marcador detectable homogéneo que puede hallarse en la sonda de captura o en una sonda de detección separada. Un "marcador detectable homogéneo" se refiere a un marcador cuya presencia puede ser detectada de forma homogénea basándose en si el marcador se halla en una molécula hibridada al polinucleótido diana. Así, el marcador detectable homogéneo puede ser detectado sin eliminar físicamente las formas del marcador hibridadas de las no hibridadas. Los marcadores detectables homogéneos han sido descritos previamente, incluyendo ejemplos en Arnold et al., n.º de Patente Estadounidense 5.283.174; Woodhead et al., n.º de Patente Estadounidense 5.656.207; y Nelson et al., n.º de Patente Estadounidense 5.658.737.

La sonda inmovilizada puede contener una o más secuencias de bases redundantes que sean complementarias a una o más secuencias de bases redundantes de la sonda de captura. Estas secuencias redundantes complementarias son, de forma preferida, secuencias de al menos cinco bases de longitud y sirven como regiones de unión (es decir, una región de unión a la sonda de captura de la sonda inmovilizada y una región de unión a la sonda inmovilizada de la sonda de captura). Las secuencias redundantes complementarias de la sonda inmovilizada y de la sonda de captura facilitan la hibridación entre las dos sondas.

Una secuencia "redundante" se refiere a una secuencia de secuencias de bases repetidas de forma regular, tales como las formadas, por ejemplo, por homopolímeros de ácidos nucleicos de poliadenina (A_{n}), politimina (T_{n}), policitosina (C_{n}) y poliguanina (G_{n}). Las secuencias redundantes también incluyen aquellas de polímeros con mezclas de ácidos nucleicos, tales como las repeticiones de AT ([AT]_{n}).

De forma preferida, la secuencia de bases redundante de la sonda de captura es más larga que una secuencia de bases redundante complementaria a la sonda inmovilizada. Las longitudes de secuencias redundantes complementarias de las dos sondas determina la T_{f} del complejo sonda inmovilizada: sonda de captura. La secuencia de bases redundantes más larga de la sonda de captura facilita la unión a la secuencia de bases redundantes de la sonda inmovilizada, ya que la longitud adicional proporciona distancia entre la estructura secundaria de un polinucleótido diana, que de otra manera interferiría con la hibridación de la sonda inmovilizada. De forma preferida, la secuencia de bases redundantes de la sonda inmovilizada es de al menos alrededor de 10 bases, de forma aun más preferida de alrededor de 14 bases de longitud; y la secuencia de bases redundantes de la sonda de captura complementaria es de al menos de alrededor de 10 bases, de forma más preferida de al menos de alrededor de 14 bases, de forma aun más preferida de al menos de alrededor de 25 bases de longitud y de la forma más preferida es de alrededor de 30 bases de longitud.

Se utiliza un método de la presente invención para determinar si un polinucleótido diana está presente en una muestra. El método incluye un paso de captura de la diana que incluye dos hibridaciones, un paso de purificación, un paso de amplificación opcional y un paso de detección. En presencia de un polinucleótido diana, se produce un complejo sonda de captura: polinucleótido diana en la primera hibridación y en la segunda hibridación una sonda inmovilizada hibrida con la sonda de captura. Así, en presencia de un polinucleótido diana, el paso de captura de la diana tiene como consecuencia la formación de un complejo sonda de inmovilización:sonda de captura:diana que está formado por una sonda de inmovilización, una sonda de captura y un polinucleótido diana. Si no se halla ningún polinucleótido diana presente, entonces este complejo sonda de inmovilización:sonda de captura:diana no se forma y solo se produce el complejo sonda de inmovilización:sonda de captura de la segunda hibridación. El complejo formado durante el paso de captura se somete a purificación para producir un polinucleótido diana purificado para muestras que contengan el polinucleótido diana.

El polinucleótido diana purificado puede amplificarse y luego detectarse, o el polinucleótido diana purificado puede ser detectado sin el paso de amplificación. De forma preferida, la presencia del polinucleótido diana capturado purificado o ácido nucleico amplificado se detecta utilizando una sonda marcada. De forma más preferida, la sonda marcada hibrida con el polinucleótido diana para formar un complejo sonda marcada: polinucleótido diana que tiene una T_{f} por encima de la temperatura de la primera condición de hibridación. La detección de la sonda marcada en el complejo indica la presencia del polinucleótido diana en la muestra.

Cuando se incluye un paso de amplificación opcional en el método, el polinucleótido diana purificado se amplifica para producir un ácido nucleico amplificado, que se detecta entonces utilizando una sonda marcada, como se describe anteriormente o mediante alguna de las variedades de las técnicas conocidas para detectar ácidos nucleicos (p. ej., visualización utilizando un agente intercalante fluorescente). La detección del ácido nucleico amplificado indica que el polinucleótido diana estaba presente inicialmente en la muestra.

Durante la hibridación de la sonda de captura con un polinucleótido diana, resulta de utilidad disponer de la sonda de captura en solución más que unida a un soporte sólido para maximizar la concentración de la sonda de captura libre y utilizar cinéticas de hibridación de fase líquida favorables conocidas por los expertos en la materia. Esto es, la hibridación en fase de solución tiene lugar generalmente 100 veces más rápido que una hibridación en fase sólida que utilice las mismas secuencias de unión complementarias. Resulta también deseable añadir la sonda inmovilizada antes de la hibridación de la sonda de captura con el polinucleótido diana para minimizar el número de adiciones y separaciones de reactivos y la complejidad química. Estos aspectos de la invención son especialmente importantes para un ensayo automatizado.

En los métodos de la presente invención para capturar a un polinucleótido diana en un soporte sólido utilizando una sonda de captura y dos condiciones de hibridación diferentes, el soporte sólido con una sonda inmovilizada, sonda de captura y ácido nucleico diana pueden estar presentes durante ambas condiciones de hibridación. El ácido nucleico diana capturado puede purificarse de otro material que está presente mediante eliminación por lavado del otro material utilizando condiciones que retengan a la diana capturada. Entonces, el polinucleótido diana purificado puede eluirse del soporte sólido utilizando condiciones apropiadas, tales como la incubación a una temperatura superior a la T_{f} del complejo sonda de captura:sonda inmovilizada.

Estos métodos son especialmente útiles como parte de un ensayo diagnóstico en el cual el polinucleótido diana se amplifica para producir cantidades mayores de ácidos nucleicos amplificados libres en solución. Los ácidos nucleicos amplificados libres en solución pueden detectarse utilizando técnicas bien conocidas, tales como la hibridación de ácidos nucleicos.

Puede llevarse a cabo un ensayo diagnóstico automatizado utilizando los métodos de la presente invención, por ejemplo, mediante: (1) adición de una muestra sospechosa de contener un polinucleótido diana a un recipiente que contenga una sonda de captura específica para la diana y una sonda inmovilizada, la cual está unida a un soporte sólido; (2) llevar a cabo una hibridación en dos pasos para capturar al polinucleótido diana en un soporte sólido mediante incubación con una primera condición de hibridación y luego disminuyendo la temperatura a la de la segunda condición de hibridación; (3) eliminando los componentes de la muestra que no se hayan unido al soporte sólido, por ejemplo. mediante un paso de lavado; (4) añadiendo al soporte sólido una solución que contenga oligonucleótidos utilizados en la amplificación de ácidos nucleicos de toda o parte de la diana, los componentes de solución apropiados para llevar a cabo la amplificación y una sonda que hibrida con ácidos nucleicos amplificados y contiene un marcador detectable homogéneo; (5) produciendo ácidos nucleicos amplificados; y (6) detectando el ácido nucleico amplificado, tal como tratando la muestra para producir una señal del marcador hibridado con el ácido nucleico amplificado. La detección de la señal indica la presencia del polinucleótido diana en la muestra. Se pueden llevar a cabo diferentes variaciones del esquema anterior basados en las descripciones que aquí se proporcionan.

Las Figs. 1 a 3 proporcionan ilustraciones esquemáticas de la utilización de la presente invención para capturar un polinucleótido diana, para amplificar, de forma opcional, un polinucleótido diana y para detectar la presencia del polinucleótido diana. Aunque las Figs. 1 a 3 ilustran realizaciones preferidas, los expertos en la materia se darán cuenta de que pueden utilizarse otras variaciones y equivalentes para practicar la invención que se describe basada en las descripciones que se proporcionan aquí. La Fig. 4 muestra un ejemplo de los tipos de complejos que pueden unirse a un soporte sólido por medio de una sonda inmovilizada que es un homopolímero.

Las Figs. 1A y 1B ilustran la captura del polinucleótido diana. Al principio del ensayo, la sonda inmovilizada (a) se une a una partícula del soporte sólido 10 y la sonda de captura (b) y el polinucleótido diana (c) están libres en la solución. En referencia a la Fig. 1A, en la primera condición de hibridación, un complejo 15 sonda de captura:polinucleótido diana se forma en solución pero la sonda de captura (b) no se une, substancialmente, a la sonda inmovilizada (a). Entonces, la reacción se incuba en la segunda condición de hibridación, como se muestra en al Fig. 1B. En la segunda condición de hibridación, la sonda de captura (b) hibrida con la sonda inmovilizada (a), capturando, de ese modo, al polinucleótido diana (c) en un complejo 20 sonda inmovilizada: sonda de captura:polinucleótido diana. De forma preferida, la segunda condición de hibridación tiene lugar en la misma solución, disminuyendo la temperatura de la primera condición de hibridación. Un ejemplo específico de los ejemplos que pueden unirse a un soporte sólido por medio de una sonda inmovilizada se ilustra en la Fig. 4.

La Fig. 2 ilustra una realización que incluye además la amplificación se una secuencia de polinucleótido diana (c) utilizando amplificación asociada a la trascripción. Los extremos 5' y 3' de los ácidos nucleicos se indican con (-) y (+), respectivamente, en la parte derecha de la figura junto a las líneas que representan a los ácidos nucleicos¸ utilizando esta anotación, las hebras marcadas "(-)" indican hebras antisentido y las hebras marcadas "(+)" indican hebras sentido. La línea discontinua (- - -), que termina en una flecha (\rightarrow) indica la polimerización de ácidos nucleicos de la cadena complementaria de ácido nucleico.

En la Fig. 2, el paso (A) ilustra a un polinucleótido diana (c), como se describe en la Fig. 1B, que ha hibridado con un oligonucleótido que contiene una secuencia promotora "P" para formar un complejo 22 de hibridación de ácidos nucleicos. Utilizando una polimerasa como la transcriptasa inversa, se sintetiza un DNA complementario (mostrado como - - -). En el paso (B), la hebra (-) con un cebador 24 y se utiliza la transcriptasa inversa para formar un duplo 23 de DNA que contiene un promotor P de doble hebra mediante polimerización mostrado como - - -). En el paso (B), el complejo 23 se muestra libre en solución, aunque no necesita ser liberado del soporte sólido 10.Puede conseguirse disponer de la hebra (-) para la hibridación con un cebador 24 utilizando diferentes técnicas bien conocidas en la materia, tales como, utilizar un paso de desnaturalización, o la actividad RNasa H. De forma preferida, la actividad RNasa H se utiliza cuando la diana es un polinucleótido de RNA.

Los pasos (C) a (E) de la Fig. 2 ilustran la producción de ácidos nucleicos amplificados a partir del producto del paso (B). Una polimerasa de RNA, tal como la polimerasa de RNA T7, se usa para generar múltiples tránscritos de RNA sentido (paso (C)) a los cuales puede unirse el cebador 24 (paso (D)) para la extensión del cebador. La línea discontinua del paso (D) ilustra la extensión del cebador. El cebador 24, al que algunas veces se refiere como cebador del promotor, puede añadirse antes de empezar la amplificación.

Entre los pasos (C) a (F), las hebras (-) se disponen para la hibridación con un cebador-promotor 24. Los pasos (D) a (F) de la Fig. 2 ilustran la utilización del cebador-promotor para formar un promotor de doble hebra que es reconocido por una polimerasa de RNA y se utiliza para producir tránscritos de RNA adicionales. Los tráncritos producidos pueden utilizarse en otro ciclo de amplificación (lo que se indica mediante la flecha en la parte izquierda de los pasos intermedios (F) y (C) de la Fig. 2). Los pasos de amplificación se describen con más detalle a continuación como "Amplificación Asociada a la trascripción".

Las Figs. 3A a 3C ilustran la captura y la detección de un polinucleótido diana (c) con una sonda marcada (d). Al inicio del ensayo, la mezcla de reactivos incluye a la sonda inmovilizada (a) unida a una partícula sólida 10, a la sonda de captura (b), al polinucleótido diana (c) y a la sonda marcada (d) libres en solución. Como se muestra en la Fig. 3A, en la primera condición de hibridación se forma un complejo 30 de sonda de captura:polinucleótido diana:sonda marcada en solución. La sonda de captura (b) mostrada en la Fig. 3A, está formada por un enlazante 31 que une un primer polinucleótido 33 de reconocimiento de secuencia de bases y un segundo polinucleótido 35 de reconocimiento de secuencia de bases. El primer polinucleótido 33 de reconocimiento de secuencia de bases incluye una región 32 de unión al polinucleótido diana y el segundo polinucleótido 35 de reconocimiento de secuencia de bases incluye una región 34 de unión a la sonda inmovilizada.

Como se muestra en la Fig. 3B, en la segunda condición de hibridación el complejo 30 de sonda de captura:polinucleótido diana:sonda marcada hibrida con la sonda inmovilizada (a), produciendo, de este modo, un complejo 40 de sonda inmovilizada:sonda de captura:polinucleótido diana:sonda marcada (es decir, una sonda marcada unida). Este complejo 40 se forma cuando la sonda inmovilizada (a) hibrida con la región 34 de unión a la sonda inmovilizada. La segunda condición de hibridación podría conseguirse disminuyendo la temperatura de la primera condición de hibridación.

En relación a la Fig. 3C, podría utilizarse un paso de lavado para eliminar la sonda marcada no unida (no mostrada) de la sonda marcada unida (d) presente en le complejo 40 unida al soporte sólido 10. La detección de la sonda marcada unida (d) indica la presencia inicial del polinucleótido diana en la muestra.

La Fig. 4 ilustra un ejemplo del soporte sólido 10 al que están unidas las sondas inmovilizadas mostradas como secuencias T_{14}. La sonda inmovilizada superior (marcada como (a) en la parte derecha) se muestra en un complejo sonda inmovilizada:sonda de captura, en el que la sonda T_{14} hibrida (mostrada como ":" entre bases) con una secuencia A_{14} complementaria a la sonda de captura mostrada como 3'A_{14}TTTGTCAGTAACCTTGATTCATCAAG 5' (ID. de SEC. n.º: 1). La sonda inmovilizada del medio marcada como (b) en la parte derecha) se muestra en un complejo de sonda inmovilizada:sonda de captura:polinucleótido diana que contiene los componentes del complejo sonda inmovilizada:sonda de captura con la región 5' de la sonda de captura hibridada con una secuencia diana complementaria mostrada como 5'CAGTCATTGGAACTAAGTAGTTC 3' (ID. de SEC. n.º: 2). La secuencia diana ilustrada es una secuencia interna, como se indica mediante secuencias terminales "NNNNNN". La sonda inmovilizada más inferior (marcada como (c) en la parte derecha) no está hibridada.

Moléculas de Reconocimiento de Secuencia de Bases

Las moléculas de reconocimiento de secuencia de bases contienen información de secuencias que permite la hibridación con ácidos nucleicos con la suficiente complementariedad en condiciones de reacción apropiadas. Por "suficiente complementariedad" se entiende una secuencia de bases de ácido nucleico contigua capaz de hibridar con una molécula de reconocimiento de secuencia de bases (p. ej., otra secuencia de bases de ácido nucleico contigua) formando puentes de hidrógeno entre las bases complementarias. La secuencia de bases complementarias podría ser complementaria en cada posición en la molécula de reconocimiento de secuencia de bases utilizando el emparejamiento de bases estándar (p. ej., emparejamiento G:C, A:T o A:U). De forma alternativa, la secuencia de bases complementarias podría contener uno o más residuos que no son complementarios utilizando puentes de hidrógeno no estándar (incluyendo "nucleótidos" abásicos), pero la secuencia de bases complementaria entera es capaz de hibridar de forma específica con la molécula de reconocimiento de secuencia de bases en condiciones de hibridación apropiadas. Para los expertos en la materia, las condiciones de hibridación apropiadas son bien conocidas, pueden ser predichas fácilmente basándose en la composición de la secuencia o pueden determinarse de forma empírica utilizando pruebas de rutina (véase, p. ej., Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ED. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) en \NAK\NAK 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 y 11.47-11.57, especialmente en §§ 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 y 11.55-11.57). Estas moléculas de reconocimiento de secuencia de bases pueden contener grupos adicionales que no proporcionen información de la secuencia. Los grupos adicionales, si están presentes, no previenen la hibridación de una molécula de reconocimiento de secuencia de bases con ácidos nucleicos suficientemente complementarios en las condiciones de reacción.

Una molécula de reconocimiento de secuencia de bases está formada por grupos de reconocimiento de bases nucleotídicas unidas por un esqueleto. Los grupos de reconocimiento de bases nucleotídicas pueden formar puentes de hidrógeno con las bases nucleotídicas nitrogenadas presentes en un ácido nucleico. El esqueleto proporciona una conformación y distancia adecuadas para permitir que los grupos formen puentes de hidrógeno con los nucleótidos del ácido nucleico. Un grupo de reconocimiento de bases nucleotídicas dado puede ser complementario a un nucleótido concreto (p. ej., A, G, C, T y U) y, de esta forma, ser capaz de formar puentes de hidrógeno con este nucleótido presente en un ácido nucleico. Un grupo de reconocimiento de bases nucleotídicas también puede ser capaz de formar puentes de hidrógeno con nucleótidos diferentes. Por ejemplo, cuando el grupo de reconocimiento de bases nucleotídicas es inosina, puede formar puentes de hidrógeno con U, A, o C.

Los grupos de reconocimiento de bases nucleotídicas preferidos son bases purínicas o pirimidínicas nitrogenadas, o derivados de ambas, que son capaces de formar puentes de hidrógeno con A, G, C, T, U o Inosina (I). Los ejemplos de grupos de reconocimiento de bases incluyen A, G, C, T, U o I y derivados de estas. Los ejemplos de derivados incluyen bases purínicas o pirimidínicas modificadas, tales como N^{4}-metil desoxiguanosina, purinas desaza o aza y pirimidinas desaza o aza utilizadas en lugar de las bases purínicas o pirimidínicas naturales, bases pirimidínicas con grupos sustituyentes en la posición 5 o 6 y bases purínicas con un sustituyente modificado o sustituido en las posiciones 2, 6 o 8. Tales derivados y su síntesis son conocidos en la materia (véase Cook, n.º Pub PCT Inter. WO 93/13121). Son ejemplos adicionales: 2-amino-6-metilaminopurina, O^{6}-metilguanina, 4-tio-pirimidinas, 4-amino-pirimidinas, 4-dimetilhidrazina-pirimidinas, O^{4}-alquil-pirimidinas y otras conocidas en la materia.

El esqueleto de una molécula de reconocimiento de secuencia de bases puede estar formado por diferentes grupos o enlaces conocidos en la materia. De forma preferida, el esqueleto contiene uno o más enlaces azúcar-fosfodiéster, uno o más grupos de esqueleto de ácido nucleico peptídico, uno o más grupos de enlace fosfotiorato, o combinaciones de los mismos.

La estructura I ilustra un grupo de esqueleto del tipo azúcar-fosfodiéster, donde el grupo azúcar es un grupo pentofuranosilo. Los grupos de azúcar están unidos entre sí mediante un enlace fosfodiéster u otros enlaces adecuados.

Estructura I

1

En relación a la estructura I, X representa el grupo que une dos azúcares. Los ejemplos de X incluyen, P(O)_{3}-, NHP(O)_{3}-, -OCOO-, OCH_{2}CONH-, -OCH_{2}COO- Y –OCONH-. Como con los otros ejemplos proporcionados aquí, basados en la publicación proporcionada, podrían utilizarse otros equivalentes bien conocidos en la materia. Y_{1} y Y_{2} son grupos seleccionados de forma independiente. Los ejemplos Y_{1} y Y_{2} incluyen H, OH, un grupo alcoxi que contiene hasta 4 átomos de carbono, halógeno y alquilo C_{1}-C_{4}. De forma preferida, Y_{1} y Y_{2} son independientemente entre sí o H, OH, F, u OCH_{3}. Las Bases_{1} y Bases_{2} son grupos de reconocimiento de bases nucleotídicas seleccionados de forma independiente. De forma preferida, las Bases_{1} y Bases_{2} son independientemente entre sí o, A, G, C, T, U o inosina (I). R_{1} y R_{2} representan grupos seleccionados de forma independiente que pueden incluir grupos del tipo azúcar-fosfodiéster adicionales, ácido nucleico peptídico y subunidades que no proporcionan información de la secuencia, tales como "nucleótidos" abásicos (que contienen un esqueleto fosfodiéster, pero que carecen de un grupo de reconocimiento de bases nucleotídicas), polímeros tales como el polietilenglicol, polisacáridos, polipéptidos, péptidos y otros enlaces no nucleotídicos. Otros tipos de enlazantes no nucleotídicos son bien conocidos (véase Arnold et al., n.º de Patente Estadounidense 5.585.481).

Los derivados de la estructura I que pueden ser un componente de una molécula de reconocimiento de secuencia de bases son bien conocidos en la materia, tales como moléculas que tienen un tipo de azúcar diferente en el esqueleto. Por ejemplo, una molécula de reconocimiento de secuencia de bases puede tener subunidades ciclobutilo conectadas mediante subunidades enlazantes, donde las subunidades ciclobutilo tienen bases heterocíclicas unidas a ellas (véase, p. ej., Cook et al, n.º Pub PCT Inter. WO 94/19023).

Otro tipo de esqueleto de una molécula de reconocimiento de secuencia de bases es un enlace de tipo peptídico, tal como el presente en el ácido nucleico peptídico. El "ácido nucleico peptídico" se refiere a un análogo de DNA, donde el esqueleto de desoxirribofosfato está sustituido por un esqueleto pseudopeptídico como se describe previamente (Hyrup & Nielsen, 1996, Bioorg. & Med. Chem. 4:5-23; Hydig-Hielsen et al., n.º Pub PCT Inter. WO 95/32305). De forma preferida, el ácido nucleico peptídico está formado por unidades de N-(2-aminoetil) glicina como se ilustra en la estructura II, en la que R_{1}, R_{2} y Base_{1} son como se describe para el tipo de compuestos de la estructura I.

Estructura II

2

Las moléculas de reconocimiento de secuencia de bases pueden producirse según los métodos conocidos, tales como métodos de síntesis orgánica estándar para producir oligonucleótidos y oligonucleótidos modificados (véase, por ejemplo, Eckstein, F., Oligonucleótidos y Análogos, una aproximación Práctica, capítulos 1-5, 1991; Caruthers et al., Meth. In Enzymol., vol. 154, p.287, 1987; Bhatt, n.º de Patente Estadounidense 5.252.723; Klem et al., n.º Pub PCT Inter. WO 92/07864; Cook, n.º Pub PCT Inter. WO 93/13121; Miller et al., n.º Pub PCT Inter. WO 94/15619; McGee et al., n.º Pub PCT Inter. WO 94/02051; Cook et al., n.º Pub PCT Inter. WO 94/19023; Hyrup et al., Bioorg. Med. Chem. 4:5-23, 1996; y Hydig-Hielsen et al., n.º Pub PCT Inter. WO 94/19023); Ordoukhanian et al., Nuc. Acids Res. 25(19):3783.3786, 1997; Myer et al., Bioconjug. Chem. 7(4):401-412, 1996; Schultz et al., Nuc. Acids Res. 24(15):2966.2973, 1996; Woo et al., Nuc. Acids Res. 24(13):2470.2475,1996; Agris et al., Biochimie. 77:125-134, 1995 : Berressem et al., Nuc. Acids Res. 23(17):3465-3472, 1995; Seela et al., Nuc. Acids Res. 23(13):2499-2505, 1995; Vinayak et al., Nuc. Acids Symp. Ser. 33:123-125, 1995; Limbach et al., Nuc. Acids Res. 22(12):2183-2196, 1994; Gryaznov et al., Nuc. Acids Res. 20(8):1879-1882, 1992; Kawana et al., Nuc. Acids Symp. Ser. 25:93-94, 1991; Pfleiderer et al., Nuc. Acids Symp. Ser. 24:29-32, 1991; Wagner et al., Nuc. Acids Res. 19(21):5965-5971, 1991; Marquez et al., Nuc. Acids Symp. Ser. 22:35-36, 1990; Lin et al., Nuc. Acids Res. 17(24):10373-10383, 1989; Farrence et al., Anal. Biochem. 179(1):60-65, 1989; Gildea et al., Nuc. Acids Res. 17(6):2261-2281, 1989; Yeung et al., Nuc. Acids Res. 16(10):4539-4554, 1988; Pon et al., Nuc. Acids Res. 13(18):6447-6465, 1985; Millican et al., Nuc. Acids Res. 12(19):7435-7453, 1984; Schinazi et al., J. Med. Chem. 21(11):1141-1146, 1978).

Las moléculas de reconocimiento de secuencia de bases preferidas de forma independiente incluyen: (i) un esqueleto que incluye al menos un grupo del tipo azúcar-fosfodiéster, al menos un grupo de ácido nucleico peptídico, al menos un grupo fosfotiorato, o una combinación de los mismos y (ii) grupos de reconocimiento de bases nucleotídicas seleccionadas de forma independiente, que son capaces de formar puentes de hidrógeno con A, G, C, T, U o I, unidos al esqueleto. Las moléculas de reconocimiento de secuencia de bases pueden incluir componentes seleccionados que son desoxinucleótidos, ribonucleótidos, ribonucleótidos sustituidos 2'-metoxi, o ribonucleótidos sustituidos 2'-halo. De forma preferida, uno o más de los componentes referenciados conforman alrededor del 70%, de forma más preferida al menos alrededor del 80%, de forma aun más preferida al menos alrededor del 90% y de forma más preferida al menos alrededor del 100% de la molécula de reconocimiento de secuencia de bases.

Inmovilización en un Soporte Sólido

Una molécula de reconocimiento de secuencia de bases puede unirse mediante diferentes métodos a distintos tipos de soporte para formar una sonda inmovilizada. Previamente se ha descrito la unión covalente a un soporte sólido de oligonucleótidos sintetizados utilizando técnicas químicas estándar (Lund, et al., Nuc. Acids Res. 16:10861-10880, 1988, n.º de Pub de Patente Europea 0444120). De forma preferida, los soportes sólidos son partículas de atracción magnética, que son útiles en un paso de separación, porque las partículas pueden ser atraídas al lugar de un recipiente de reacción y mantenerse en el lugar, mientras los componentes de la solución no ligados se eliminan mediante lavado. Las partículas de atracción magnética pueden producirse utilizando técnicas estándar u obtenerse de fuentes comerciales disponibles.

T_{f} y Condiciones de Hibridación

Los métodos de la presente invención modifican las condiciones de hibridación para controlar el ritmo de la formación de un complejo sonda de captura:diana y de un complejo sonda inmovilizada:sonda de captura. La capacidad para que dos moléculas de reconocimiento de secuencia de bases hibriden depende de las estructuras y del ambiente alrededor de la reacción. El ambiente de la reacción incluye la composición de la solución que contiene dos o más moléculas de reconocimiento y la temperatura de la solución.

Si se utiliza una composición de ensayo concreta, un complejo de hibridación no es estable cuando la temperatura del ensayo es superior a la T_{f} del complejo. Los factores de la solución conocidos en la materia, tales como la concentración de sales y la presencia de agentes desnaturalizantes, puede afectar la T_{f} de un complejo dado. Dos moléculas de reconocimiento de secuencia de bases que forman un complejo de hibridación, pueden construirse de manera que tengan características de T_{f} adecuadas para ser utilizadas en la presente invención basados en las descripciones que aquí se proporcionan y en las técnicas conocidas en la materia (véase, p. ej., Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ED. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) en \NAK\NAK 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 y 11.47-11.57, especialmente en \NAK\NAK 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 y 11.55-11.57).

La estabilidad del complejo de hibridación se ve afectada por la longitud y el grado de complementariedad entre dos moléculas de reconocimiento de secuencia de bases, los grupos de reconocimiento de bases nucleotídicas y el esqueleto de la molécula de reconocimiento de secuencia de bases. Por ejemplo, la T_{f} de un complejo formado entre dos moléculas de reconocimiento de secuencia de bases puede disminuirse construyendo moléculas que tengan regiones internas de menos del 100% de complementariedad entre sí. Esto puede conseguirse incluyendo desparejamientos o componentes enlazantes, tales como enlazantes no nucleotídicos y "nucleótidos" abásicos. Los componentes enlazantes pueden colocarse de forma opuesta a la base de una hebra opuesta o pueden protruir de la hebra, disminuyendo de este método la estabilidad del complejo. El tipo de grupos de reconocimiento de secuencia de bases que están presentes en las hebras opuestas también afectarán a la estabilidad del complejo de hibridación de la sonda. Por ejemplo, el emparejamiento G:C es más fuerte que el emparejamiento A:T, debido a los puentes de hidrógeno incrementados en los emparejamiento G:C en comparación con los emparejamientos A:T.

La composición del esqueleto de una molécula de reconocimiento de secuencia de bases puede ajustarse de diferentes maneas para afectar a la estabilidad del complejo de hibridación. Los esqueletos preferidos son los enlaces peptídicos, tales como los que están presentes en los ácidos nucleicos peptídicos y enlaces del tipo azúcar-fosfodiéster, tales como los que están presentes en los ácidos ribonucleicos y desoxiribonucleicos, o derivados de los mismos. Los ácidos nucleicos peptídicos forman, generalmente, un complejo más estable con RNA que con el DNA correspondiente. De forma más preferida, el esqueleto está formado por enlaces del tipo azúcar-fosfodiéster, en los que tanto el grupo azúcar como el enlace que une al grupo puede afectar a la estabilidad del complejo. Por ejemplo, el efecto del azúcar puede demostrarse con grupos de RNA sustituido 2'-metoxi, en el que un complejo d hibridación formado entre el RNA sustituido 2'-metoxi y el RNA complementario 2'OH es generalmente más estable que el complejo DNA:RNA correspondiente. Un RNA 2'-fluoro sustituido tiene esencialmente el mismo tipo de efecto en la estabilidad del complejo que el RNA 2'-metoxi sustituido.

Un enlace que une dos grupos azúcar puede afectar a la estabilidad del complejo de hibridación al afectar la carga global de la densidad de carga, o por afectar la asociación estérica entre dos componentes moleculares. Las interacciones estéricas de enlaces voluminosos producen "protuberancias" que reducen la estabilidad del complejo. Los enlaces con grupos cargados (p. ej., fosfotionatos) o neutros (p. ej., metilfosfonatos) pueden afectar a la estabilidad del complejo.

La T_{f} puede predecirse utilizando cálculos estándar medidos utilizando técnicas de prueba rutinarias en la materia. Tales métodos se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ED. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) en \NAK\NAK 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 y 11.47-11.57, especialmente en \NAK\NAK 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 y 11.55-11.57) y Hogan et al., n.º de Patente Estadounidense 5.547.842. En la primera solución de hibridación de realizaciones preferidas de la presente invención, la T_{f} del complejo sonda de captura:polinucleótido diana es mayor que la T_{f} del complejo sonda inmovilizada:sonda de captura en al menos alrededor de 5ºC, de forma preferida en al menos alrededor de 10ºC, de forma aun más preferida en al menos alrededor de 20ºC y de la forma más preferida en al menos alrededor de 25ºC.

Cambio de las Condiciones de Hibridación

El método preferido para cambiar las condiciones de hibridación es cambiar la temperatura de la solución de hibridación que contiene los componentes del ensayo. Los cambios de temperatura pueden conseguirse fácilmente sin añadir los reactivos a la solución y, de esta manera, son más compatibles con la automatización. Un ensayo automatizado es una realización preferida de la presente invención. De forma preferida, el segundo paso de incubación se consigue disminuyendo la temperatura de la primera condición de hibridación, en al menos alrededor de 10ºC, de forma más preferida en al menos alrededor de 15ºC, de forma aun más preferida en al menos alrededor de 20ºC y de la manera más preferible en al menos alrededor de 25ºC. No obstante, puede utilizarse cualquier método conocido de disminución de la astringencia de una condición de hibridación, tales como aumentar la fuerza iónica de la solución o diluir la solución con desnaturalizantes, para conseguir la segunda condición e hibridación.

Amplificación

La amplificación aumenta el número de copias del polinucleótido diana. Las condiciones de amplificación son compatibles con la polimerización de ácidos nucleicos para producir una hebra de ácidos nucleicos complementaria a un molde de ácido nucleico utilizando al menos una polimerasa de ácidos nucleicos. Las condiciones de amplificación incluyen uno o más enzimas, oligonucleótidos de amplificación, sustratos de nucleósidos trifosfato, tampones e incubación a una temperatura apropiada. Las condiciones específicas son conocidas en la materia y dependen del tipo de amplificación de ácidos nucleicos utilizados.

Enzimas

Las polimerasas de ácidos nucleicos adecuados para llevar a cabo procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos están fácilmente disponibles comercialmente o pueden ser separados y purificados. Tales polimerasas incluyen, por ejemplo, polimerasas de DNA dependientes de DNA, tales como la DNA polimerasa I de Escherichia coli, la DNA polimerasa I de Bacillus stearothermophilus, la DNA polimerasa I de B. caldotenex, la DNA polimerasa T4 y la Taq polimerasa. Otros enzimas adecuados son las polimerasas de DNA dependientes de DNA, tales como, por ejemplo, la polimerasa de RNA T7, la polimerasa de RNA T3 y la polimerasa de RNA SP6. Los enzimas adecuados también incluyen las polimerasas de DNA dependientes de RNA, tales como, por ejemplo, la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (VMA) y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Molones (VLMM). La amplificación también puede llevarse a cabo utilizando replicasas (p. ej., la replicasa Q\beta), ligasas (p. ej., la ligasa de DNA de E. coli y la ligasa de DNA de T4), o combinaciones de enzimas.

Oligonucleótidos de Amplificación

Los "Oligonucleótidos de Amplificación" son oligonucleótidos que hibridan con un ácido nucleico diana, o su complemento y participan en la reacción de amplificación. Los ejemplos de oligonucleótidos de amplificación incluyen cebadores y cebadores-promotores.

La selección de los oligonucleótidos de amplificación depende del método de amplificación utilizado y del ácido nucleico utilizado. Los expertos en la materia pueden diseñar y sintetizar fácilmente un oligonucleótido de amplificación en particular dependiendo de la secuencia del ácido nucleico diana deseado y el método de amplificación utilizado por el practicante de la presente invención. Los ejemplos de oligonucleótidos de amplificación utilizados habitualmente incluyen aquellos que son análogos o complementarios a una secuencia de bases nucleotídicas y que pueden contener de forma opcional regiones de secuencias de ácidos nucleicos que no son complementarias al ácido nucleico diana. Por ejemplo, un oligonucleótido de amplificación puede incluir una secuencia promotora reconocida por una polimerasa de RNA, o una secuencia de bases reconocida por una replicasa.

Un oligonucleótido de amplificación análogo incluye una región capaz de hibridar con un ácido nucleico que sea perfectamente complementario a una región del ácido nucleico diana (p. ej., un cDNA cuando el ácido nucleico diana sea RNA). El oligonucleótido análogo puede hibridar con el ácido nucleico complementario, en una posición situada cerca del extremo 3' de la secuencia diana complementaria. El oligonucleótido análogo también puede contener una región no complementaria, tal como una región de secuencia promotora o una o más modificaciones, tales como una modificación que inhiba la actividad de la polimerasa de ácidos nucleicos. De forma preferida, el oligonucleótido análogo contiene al menos alrededor de 10 bases contiguas y de forma más preferida al menos alrededor de 12 bases contiguas, que son complementarias al ácido nucleico que es perfectamente complementario a una región del ácido nucleico diana. Las bases contiguas son complementarias de forma preferida al menos alrededor del 80%, de forma más preferida al menos alrededor del 90% y de la forma más preferida alrededor del 100% a una región de la secuencia del ácido nucleico diana.

De forma preferida, el oligonucleótido análogo tiene alrededor de 12 a 60 bases nucleotídicas de longitud y puede contener bases nucleotídicas modificadas, de forma opcional.

Un oligonucleótido de amplificación complementario al molde tiene una región capaz de hibridar con el ácido nucleico diana en una posición situada en el extremo 3' de la secuencia diana. El oligonucleótido complementario al molde puede contener una región no complementaria, tal como una región promotora 5'. De forma preferida, el oligonucleótido complementario a la diana contiene al menos alrededor de 10 bases contiguas y de forma más preferida al menos alrededor de 12 bases contiguas, que son complementarias a una región de la secuencia del ácido nucleico diana. Las bases contiguas son complementarias de forma preferida al menos alrededor del 80%, de forma más preferida al menos alrededor del 90% y de la forma más preferida alrededor del 100% a una región de la secuencia diana.

De forma preferida, el oligonucleótido complementario al molde tiene alrededor de 12 a 60 bases nucleotídicas de longitud y puede contener bases nucleotídicas modificadas, de forma opcional.

Un "cebador" se refiere a un oligonucleótido modificado de forma opcional, que es capaz de hibridar con un molde y que tiene un extremo 3' que puede extenderse de forma efectiva en una reacción de polimerización conocida. La región 5' del cebador puede no ser complementaria al ácido nucleico diana. Si la región 5' no complementaria contiene una secuencia promotora, se refiere a ella como "cebador-promotor". Un cebador o cebador-promotor puede ser análogo o complementario a un ácido nucleico diana.

Amplificación Asociada a la trascripción

La amplificación asociada a la trascripción utiliza una polimerasa de RNA para producir múltiples tránscritos de a partir de un molde de ácidos nucleicos. De forma general, la amplificación asociada a la trascripción utiliza una polimerasa de RNA, una polimerasa de DNA, desoxirribonucleósidos trifosfato, ribonucleósidos trifosfato y un oligonucleótido complementario a un molde del promotor. Frecuentemente se utiliza también un oligonucleótido
análogo.

Se conocen en la materia diferentes variaciones de la amplificación asociada a la trascripción.

En Burg et al., n.º de Patente Estadounidense 5.437.990; Kacian et al., Números de Patente Estadounidense 5.399.491 y 5.554.516; Kacian et al., n.º Pub PCT Inter. WO 93/22461; Gingeras et al., n.º Pub PCT Inter. WO 88/01302; Gingeras et al., n.º Pub PCT Inter. WO 88/10315; Malek et al., n.º de Patente Estadounidense 5.130.238; Urdea et al., Números de Patente Estadounidense 4.868.105 y 5.124.246; McDonough et al., n.º Pub PCT Inter. WO 94/03472; y Ryder et al., n.º Pub PCT Inter. WO 95/03430, se describen en detalle ejemplos de diferentes variaciones, que utilizan distintas condiciones de reacción y distintos números y tipos de oligonucleótidos de amplificación.

En resumen, la amplificación asociada a la transcripción utiliza de forma general un oligonucleótido complementario al molde del promotor que contiene una región de secuencia de bases 5', que, cuando hace de doble hebra, es reconocida por una RNA polimerasa (marcada "P" en la Fig. 2) y una región de secuencia 3' capaz de hibridar con un molde de ácidos nucleicos situado 3' de la secuencia diana (como se muestra en la Fig. 2). Tras la hibridación del oligonucleótido complementario al molde del promotor y el molde, se forma un promotor de doble hebra por encima del molde. El promotor de doble hebra puede sintetizarse mediante extensión de cebadores mediada por la polimerasa del oligonucleótido complementario al molde del promotor para producir una hebra complementaria a la diana (véase Fig. 2), seguido de la hibridación de un oligonucleótido análogo (p. ej., el cebador 24 de la Fig. 2) y extensión mediante cebadores del oligonucleótido análogo (véase Fig. 2). Otras técnicas conocidas son adecuadas para formar un promotor de doble hebra, tales como las que incluyen la extensión de cebadores del ácido nucleico
diana.

La amplificación asociada a la trascripción continua con la unión de una enzima con actividad RNA polimerasa a una región promotora y con la síntesis de tránscritos de RNA de hebra sencilla en una dirección 5' a 3' (véase Fig. 2). Pueden producirse múltiplos tránscritos de RNA (p. ej., alrededor de 100 a 3.000) mediante amplificación asociada a la trascripción utilizando un molde único (p. ej., repitiendo la Fig. 2)

En una realización preferida de la presente invención, un procedimiento de amplificación asociada a la trascripción que utiliza actividad RNasa H se usa para la amplificación de la diana. Esto genera grandes cantidades de ácidos nucleicos amplificados de cadena sencilla en un estado de reacción esencialmente constante. De forma más preferida, la actividad RNasa H se suministra mediante una transcriptasa inversa.

Otros Métodos de Amplificación

Pueden utilizarse otros procedimientos de amplificación bien conocidos en el paso de amplificación de los métodos de la presente invención, incluyendo Amplificación mediada por Replicasa, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), y la Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR). La Amplificación mediada por Replicasa utiliza moléculas de RNA autoreplicantes y una replicas, tal como la replicasa-QB (p. ej., véase Kramer et al., n.º de Patente Estadounidense 4.786.600; n.º Pub PCT Inter. WO 90/14439). La amplificación por PCR es bien conocida y utiliza DNA polimerasa, cebadores y ciclado térmico para sintetizar múltiples copias de las dos hebras complementarias de un DNA o cDNA (p. ej., véase Mullis et al., Números de Patente Estadounidense 4.683.195. 4.683.202 y 4.800.159; Methods in Enzymology, 1987, Vol. 155:335-350). La LCR utiliza al menos cuatro oligonucleótidos separados para amplificar una diana y su hebra complementaria utilizando múltiples ciclos de hibridación, ligación y desnaturalización (véase Sol. de Pat. Europea n.º Pub. 0 320 308).

Detección del Polinucleótido Diana

Puede detectarse la presencia de un oligonucleótido diana utilizando diferentes técnicas que utilizan una sonda de detección o detectan un ácido nucleico amplificado. De forma preferida, el polinucleótido diana se detecta utilizando una sonda marcada que hibrida con el polinucleótido diana o con un producto de amplificación del polinucleótido diana, especialmente un ácido nucleico amplificado que sea complementario al polinucleótido diana.

Las sondas marcadas pueden contener diferentes tipos de marcadores y pueden utilizarse distintas técnicas para detectar el marcador. Por ejemplo, los marcadores de sondas conocidos incluyen radioisótopos, subunidades fluorescentes, subunidades quimioluminiscentes y grupos catalíticos (p. ej., un enzima que participa en una reacción que resulta en un cambio de color). En Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ED. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Capítulo 10; Nelson et al., n.º de Patente Estadounidense 5.658.737; Woodhead et al., n.º de Patente Estadounidense 5.656.207; Hogan et al., n.º de Patente Estadounidense 5.547.842; Arnold et al., n.º de Patente Estadounidense 5.283.174; Kourilsky et al., n.º de Patente Estadounidense 4.581.333; y Becker et al., n.º de Pub de Patente Europea 0747706, se describen en detalle ejemplos de producción o utilización de tales sondas marcadas.

Las sondas marcadas pueden hibridar con un polinucleótido diana, un ácido nucleico amplificado, o una molécula intermediaria que hibrida de forma directa o indirecta con el polinucleótido diana o el ácido nucleico amplificado. La hibridación de forma indirecta puede llevarse a cabo utilizando múltiples moléculas intermediarias hibridadas juntas.

El ácido nucleico amplificado puede detectarse utilizando una sonda marcada o utilizando otros métodos conocidos para detectar ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ácido nucleico amplificado puede marcarse durante la amplificación utilizando agentes intercalantes fluorescentes (p. ej., bromuro de etidio). Los ácidos nucleicos amplificados marcados pueden detectarse utilizando procedimientos conocidos, tales como, filtración en gel, electroforesis en gel y HPLC.

Los ejemplos siguientes ilustran algunas realizaciones preferidas de la presente invención, aunque aquellos expertos en la materia se darán cuenta que pueden utilizarse otros reactivos y condiciones de reacción para practicar de igual forma los métodos de la presente invención.

Ejemplo 1

Ajuste de la T_{f} mediante Variación de la Longitud de Complementariedad

Un método para ajustar la T_{f} de un complejo de hibridación es variando la longitud de complementariedad entre dos ácidos nucleicos que forman el complejo. Este ejemplo ilustra cambios en la T_{f} debido a diferencias en las longitudes de complementariedad en un complejo.

Se formaron híbridos entre una primera y una segunda hebra de oligonucleótidos. La primera hebra era un homopolímero de 40 desoxitimidinas (dT_{40}) y la segunda hebra era un homopolímero de desoxiadenosinas de tamaños variables (dA_{n}). Estos oligonucleótidos se sintetizaron utilizando procedimientos de síntesis de ácidos nucleicos estándar.

Ambas hebras (350 pmol cada una) fueron mezcladas en un volumen de 40 \mul que contenía 20 \mul de Tampón de Hibridación X2 (200 mM succinato de litio (pH 5,1-5,2), 17% lauril sulfato de litio (LSL), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 3 mM y etilenglicol N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA)) 3 mM y se calentó a 55ºC durante 30 minutos. Entonces, cada complejo se diluyó a 300 \mul con Tampón de Hibridación 1X (es decir, la mitad de la concentración del Tampón de Hibridación 2X).

Se determinó la T_{f}, en esta solución, mediante la detección de un cambio hipercrómico. En resumen, se midió la absorbancia a 260 nm durante los cambios de incremento de temperatura de la mezcla de reacción y se detectó un cambio en la absorbancia de la solución por encima del rango de temperaturas. La T_{f} es la temperatura en el punto medio del cambio de absorbancia. La Tabla 1 muestra los resultados de los complejos de hibridación en los cuales la longitud de dA_{n} varió entre un rango de dA_{10} a dA_{40}.

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TABLA 1

Híbrido	T_{f}
dA_{40}:dT_{40}	70,3ºC
dA_{30}:dT_{40}	68,4ºC
dA_{25}:dT_{40}	64,5ºC
dA_{20}:dT_{40}	61,5ºC
dA_{15}:dT_{40}	56,0ºC
dA_{10}:dT_{40}	50,4ºC

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Como se observa en estos resultados, a medida que la longitud de complementariedad aumentaba, la T_{f} del complejo también aumentó. Los complejos de hibridación más largos (p. ej. dA_{30}:dT_{40}) tendieron a tener cambios de absorbancia relativamente amplios porque potencialmente hay muchos tipos de complejos de hibridación en la mezcla debido al apareamiento compensado (p. ej. apareamiento 30-mero, 29-mero, 28-mero y así sucesivamente). Las combinaciones de homopolímeros que resultaron de complejos de hibridación más cortos (p. ej. dA_{15}:dT_{40} que pueden formar un complejo de hasta 15-mero) tenían una T_{f} inferior a los 60ºC.

Esta propiedad fue examinada con más detalle mediante incubación de 100 µg de sonda poli-dT_{14} inmovilizada o sonda dT_{30} unida a microesferas magnéticas con 2,5 pmoles de una sonda de captura ^{32}P-marcada dA_{30} en solución. Los reactivos fueron incubados en un tampón de hibridación (EDTA 3 mM, EGTA 3 mM, LSL 17%, ácido succínico 190 mM, hidróxido de litio 250 mM, pH 5,1 \pm 0,1) durante 30 minutos o bien a 60ºC o a temperatura ambiente (alrededor de 25ºC) en cinco réplicas para cada condición de hibridación. A temperatura ambiente, los porcentajes promedio de las sondas marcadas dA_{30} hibridadas a las sondas dT_{14} y dT_{30} fueron del 90% y el 88% respectivamente, mientras que a 60ºC los porcentajes promedio de las sondas marcadas dA_{30} hibridadas a las sondas dT_{14} y dT_{30} fueron del 61% y el 1%, respectivamente.

Estas características de hibridación fueron aprovechadas en un ensayo de hibridación en dos pasos en el cual la sonda inmovilizada estaba presente durante las condiciones de hibridación a dos temperaturas diferentes, como se demuestra en el siguiente ejemplo.

Ejemplo 2

Hibridación en Dos Pasos

Este ejemplo ilustra el método de la hibridación en dos pasos utilizando dos temperaturas de hibridación para conseguir la captura del polinucleótido diana. En una de las condiciones de ensayo, la sonda de captura, el polinucleótido diana y la sonda inmovilizada fueron simultáneamente mezcladas a lo largo de ambas condiciones de hibridación. En otro ensayo, la sonda inmovilizada se añadió después de la hibridación de la sonda de captura al primer polinucleótido diana en la primera condición de hibridación. La mezcla simultánea del primer ensayo es ventajosa porque requiere menos pasos de adición de reactivo, pero la adición separada de la sonda inmovilizada generalmente tuvo como resultado una señal alrededor del doble de alta que la observada para la hibridación en dos pasos realizada con la mezcla simultánea.

El oligonucleótido de la sonda de captura y el polinucleótido diana marcado con éster de acridina (AE) fueron sintetizados y detectados utilizando técnicas estándar. Tales técnicas son conocidas en la materia, como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Capítulo 10; Nelson et al., n.º de Patente Estadounidense 5.658.737; Woodhead et al., n.º de Patente Estadounidense 5.656.207; Hogan et al., n.º de Patente Estadounidense 5.547.842; y Arnold et al., n.º de Patente Estadounidense 5.283.174.

La sonda de captura (1,25 pmol) y el polinucleótido diana marcado con AE fueron incubados inicialmente durante 30 minutos a 60ºC en un Tampón de Hibridación 1X (ver Ejemplo 1) con, o sin, 100 \mug de una sonda inmovilizada poli-T unida a microesferas magnéticas de Seradyn, y entonces cambiada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para las muestras incubadas a 60ºC sin la sonda inmovilizada unida a microesferas, este componente (en 50 \mul de Tampón de Hibridación 1X) se añadió al principio de la segunda incubación. Volúmenes de ambas muestras se mantuvieron de la misma manera mediante la adición de 50 \mul de Tampón de Hibridación 1X al ensayo que ya contenía la sonda inmovilizada. La sonda inmovilizada era un homopolímero de dT_{14} o dT_{30} unido al soporte sólido que eran microesferas magnéticas. La sonda de captura era un polinucleótido con una secuencia base complementaria a una secuencia del polinucleótido diana (una secuencia de rRNA 16S de N. gonorrhoeae) y una cola poli-A de dA_{15} o dA_{30}. La secuencia diana era rRNA 16S de N. gonorrhoeae marcada con AE. Utilizando esta combinación, una sonda inmovilizada:sonda de captura:complejo del polinucleótido diana se formó por hibridación de la secuencia diana con la secuencia complementaria a la diana de la sonda de captura durante la primera hibridación a 60ºC, y la hibridación de la región dA de la sonda de captura con la región dT de la sonda inmovilizada durante la segunda hibridación a temperatura ambiente.

El polinucleótido diana marcado con AE capturado fue purificado mediante aplicación de un campo magnético para atraer las microesferas con la sonda inmovilizada a una localización del recipiente de reacción, y entonces fue lavado dos veces con Tampón de Unión (succinato de litio 50 mM, LiCl 100 mM, LSL 1,5%, EDTA 1,5 mM, EGTA 1,5 mM, pH 5,2). Las microesferas fueron resuspendidas y el polinucleótido diana capturado fue detectado por medición de la quimioluminiscencia producida por la marca AE. La quimioluminiscencia fue detectada como Unidades de Luz Relativas (RLU) utilizando técnicas como las descritas anteriormente (Arnold et al. Clinical Chemistry 35:1588-1594 (1989); Nelson et al., n.º de Patente Estadounidense 5.658.737. Los resultados RLU presentados en la Tabla 2 son valores promedio de las muestras examinadas por triplicado.

TABLA 2

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Los resultados de la Tabla 2 muestran que una hibridación en dos pasos puede ser utilizada para capturar de manera efectiva el polinucleótido diana utilizando una sonda de captura y una sonda inmovilizada la cual, o bien está presente en la mezcla de reacción durante ambas hibridaciones o se añade antes de la segunda hibridación. De este modo, este método puede realizar la captura de la diana cuando todos los reactivos están presentes simultáneamente durante ambas hibridaciones, requiriendo, de este modo, menos pasos de adición de reactivos. Los resultados de la Tabla 2 también muestran que las secuencias complementarias relativamente cortas (dT_{14} y dA_{15}) fueron efectivas para la captura de la diana en el complejo de sonda inmovilizada:sonda de captura:polinucleótido diana. El uso de la sonda 14-mero inmovilizada dio sustancialmente la misma señal tanto si la sonda inmovilizada se añadió en la segunda hibridación o si estuvo presente en ambas hibridaciones. Un homopolímero de sonda inmovilizada más corto pareció ser más ventajoso que un homopolímero de sonda de captura más corto, como se había observado por la señal más alta obtenida con la combinación dT_{14}:dA_{30} comparada con la combinación dT_{30}:dA_{15}.

Ejemplo 3

Hibridación en Dos Pasos Con Secuencia Diana Amplificada

Este ejemplo muestra que el método de la hibridación en dos pasos de la presente invención puede ser utilizado para la detección de un polinucleótido diana de Mycobacterium tuberculosis presente en una muestra clínica. El ensayo también es capaz de detectar otras especies de Mycobacterium (p. ej. M. bovis, M. simiae, y M. africanum, frecuentemente referidos colectivamente como el complejo M. tuberculosis) pero, por simplificar, será descrito aquí con referencia a M. tuberculosis.

El protocolo básico incluyó los siguientes pasos. Un lisado de la muestra se preparó mediante adición de una muestra clínica (p. ej. 500 \mul de sedimento de esputo, lavado bronco alveolar o lavados bronquiales) a un volumen igual de un tampón de lisis (LiCl 2,2 M, de tampón HEPES 250 mM, pH 7,5, conteniendo LLS 4% (p/v) y los organismos del lisado de muestra fueron eliminados (95ºC durante 15 minutos). Si M. tuberculosis está presente en la muestra clínica, un polinucleótido diana (p. ej. secuencia rRNA) derivado de M. tuberculosis estará presente en el lisado. Una alícuota del lisado (250 \mul) se mezcló con un volumen igual de solución que contenía la sonda de captura específica para la secuencia diana de M. tuberculosis y una sonda inmovilizada unida a un soporte sólido. La sonda de captura era un oligonucleótido de 58 bases que contenía una secuencia 5' de 15 bases complementaria a una secuencia rRNA de M. tuberculosis, una T_{3} interna y una cola 3' dA_{40}. La sonda inmovilizada era una secuencia poli-dT_{14} unida utilizando carbodiimida química (sustancialmente como se describe previamente por Lund, et al., Nuc. Acids Res. 16:10861-10880, 1988) a un soporte sólido de partículas magnéticas (0,7 - 1,5 \mu partículas, Seradyn, Indianápolis, IN). En este ensayo, se utilizaron 5 pmol de partículas de la sonda de captura y 50 \mug de partículas de la sonda inmovilizada por reacción. La mezcla se incubó sucesivamente a dos temperaturas diferentes (60ºC durante 20 minutos, y 25ºC durante 15 minutos). A la primera temperatura la secuencia complementaria de M. tuberculosis de la sonda de captura hibridó a la secuencia diana porque la T_{f} del complejo de hibridación es superior a los 60ºC, y a la segunda temperatura la sonda inmovilizada homopolimérica hibridó con la región homopolimérica complementaria de la sonda de captura porque la T_{f} del complejo dA:dT es inferior a los 50ºC. Siguiendo ambas incubaciones, las microesferas magnéticas fueron separadas de la solución utilizando un campo magnético sustancialmente como se ha descrito en el Ejemplo 2. Si M. tuberculosis estaba presente en la muestra, estas microesferas magnéticas han unido un complejo de hibridación que consiste en una sonda inmovilizada:sonda de captura:polinucleótido diana. Si M. tuberculosis no estaba presente en la muestra, las microesferas han unido un complejo de hibridación que consiste en una sonda inmovilizada y una sonda de captura. Las microesferas se lavaron dos veces en 1 ml de tampón de lavado por lavado mediante resuspensión de las microesferas en el tampón y entonces repitiendo el paso de separación magnética. Las microesferas lavadas se resuspenden en 75 \mul de una solución de reactivo de amplificación de ácidos nucleicos para la amplificación asociada a la transcripción utilizando métodos sustancialmente descritos en Kacian et al., n.º de Patentes Estadounidenses 5.399.491 y 5.554.516. Las microesferas y 15 pmol de cada cebador específico para el polinucleótido diana de M. tuberculosis fueron incubados en una mezcla de reacción (base Trizma 40 mM, pH 7,5, KCl 17,5 mM, MgCl_{2} 20 mM, polivinilpirrolidona (PVP) 5%, 1 mM de cada dNTP, 4 mM de cada rNTP), cubierto por una capa de aceite inerte (200 \mul) para prevenir la evaporación, a 60ºC durante 10-15 minutos, y entonces 41,5 - 42ºC durante 5 minutos. La transcriptasa reversa (alrededor de 750 unidades y alrededor de 2000 unidades de RNA T7 polimerasa en 25 \mul) se añadió a cada reacción, se mezcló, y se procedió a la amplificación del polinucleótido diana a 41,5 - 42ºC durante 2 horas. Las secuencias diana amplificadas de M. tuberculosis se detectaron utilizando una sonda marcada con AE, la cual fue detectada como quimioluminiscencia y expresada en unidades relativas de luz (RLU) sustancialmente descritas previamente (n.º de Patente Estadounidense 5.658.737 en la columna 25, líneas 27-46: Nelson et al., 1996, Biochem. 35:8429-8438 en 8432). Para cada ensayo, un control negativo consistente en todos los mismos reactivos pero sustituyendo un volumen igual de esputo negativo por la muestra, y un control positivo consistente en todos los mismos reactivos pero incluyendo 50 \mul de extracto celular total de RNA de M. tuberculosis (conteniendo alrededor de 2000 copias de rRNA) en lugar de la muestra. Las muestras fueron examinadas por duplicado para cada ensayo (RLU n.º 1 y RLU n.º 2 en la Tabla 3).

Los resultados de este ensayo a partir de quince muestras clínicas que independientemente se determinaron como positivas por presencia de M. tuberculosis (basándonos en análisis clínico estándar de frotis o resultados de caldo de cultivo BACTEC) son presentados en la Tabla 3.

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TABLA 3

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Como se puede observar en los resultados mostrados en la tabla 3, todas las muestras que fueron positivas para M. tuberculosis basándonos en, al menos, un resultado clínico del ensayo, resultaron positivos en el ensayo de hibridación en dos pasos en relación con el control negativo. Los resultados positivos se basaron en muestras que tenían una lectura RLU al menos 10 veces mayor que la del control negativo. Para la mayoría de muestras, el resultado positivo se basó en una lectura RLU al menos 100 veces mayor que el control negativo. Generalmente, la quimioluminiscencia indicativa del polinucleótido diana de M. tuberculosis en la muestra era alrededor de 1000 veces mayor que la detectada en el control negativo y esencialmente igual o mayor que la del control positivo.

Ejemplo 4

Ensayo de hibridación en dos pasos para la detección de niveles variables de una diana de Neisseria gonorrhoeae

Este ejemplo muestra que el método de hibridación en dos pasos de la presente invención puede ser utilizado para detectar tan poco como 5 fg de polinucleótido diana indicador de una infección bacteriana. El polinucleótido diana era una secuencia específica de rRNA para N. gonorrhoeae (Hogan et al., n.º de Patente Estadounidense 5.541.308; Nelson et al., 1996, Biochem. 35:8429-8438). Es más, los resultados fueron reproducibles con muy pequeña variación cuando las muestras se almacenaron durante un período de tres días a 4ºC y ensayadas en el día 1, 2 y 3. Los 5 fg y 50 fg de polinucleótido diana N. gonorrhoeae ensayados corresponden al rRNA presente en 1 y 10 células, respectivamente.

El protocolo básico utilizado incluye los siguientes pasos. Para cada muestra ensayada, una solución acuosa de 20 \mul de 0 fg (control negativo), 5 fg o 50 fg de polinucleótido diana N. gonorrhoeae en 400 \mul de agua se mezcló con 400 \mul de control sintético de orina (KOVATROL ^{TM}; Hycor Biomedical, Inc.) y 200 \mul de un tampón de captura de diana (TBC; consistente en LiCl 2,2 M, tampón HEPES 250 mM, pH 7,5) conteniendo un oligonucleótido de captura (6,25 nM) teniendo una secuencia complementaria al polinucleótido diana de N. gonorrhoeae y una secuencia dT_{3}dA_{30}. La sonda dT_{14} inmovilizada unida a partículas magnéticas como el soporte sólido se añadieron a 100 \mug/ml y la mezcla se incubó sucesivamente a dos temperaturas diferentes (60ºC durante 20 minutos, y 25ºC durante 15 minutos). A la primera temperatura, la sonda de captura y el polinucleótido diana hibridaron porque la T_{f} del complejo sonda de captura:polinucleótido diana es superior a 60ºC, y en la segunda temperatura la sonda inmovilizada y la porción poli-dA de la sonda de captura hibridaron porque la T_{f} del complejo dA:dT es inferior a 52ºC. Siguiendo la incubación, las microesferas magnéticas se separaron de la solución utilizando un campo magnético descrito sustancialmente en el Ejemplo 2. Para las muestras que contienen el polinucleótido diana de N. gonorrhoeae, las microesferas magnéticas tienen unido el complejo sonda inmovilizada:sonda de captura:polinucleótido diana, mientras que para la muestra del control negativo las microesferas tienen unida la sonda inmovilizada:sonda de captura. Entonces las microesferas se lavaron dos veces sustancialmente como se ha descrito en el Ejemplo 3 y las microesferas lavadas se resuspendieron en 75 \mul de un reactivo de amplificación de ácidos nucleicos y se amplificaron sustancialmente como se ha descrito en el Ejemplo 3 utilizando un cebador específico para el polinucleótido diana de N. gonorrhoeae. Después de la amplificación, las secuencias diana amplificadas se detectaron utilizando una sonda marcada con AE la cual se detectó utilizando un ensayo de quimioluminiscencia como se ha descrito en el Ejemplo 3, y la señal se expresó en unidades relativas de luz (RLU). Para los ensayos de cada día, las RLU de fondo de los controles negativos y controles positivos se determinaron de la misma manera utilizando los mismos reactivos. Los resultados de los ensayos se muestran en la Tabla 4, incluyendo los resultados de RLU para cada muestra experimental, y los valores promedio de dos controles positivos y diez controles negativos obtenidos para cada día. Los valores de RLU de fondo (promedio de dos muestras) fueron 6,81 x 10^{2}, 1,18 x 10^{3} y 6,61 x 10^{2}, para los días 1, 2 y 3 respectivamente.

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TABLA 4

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Los resultados presentados en la Tabla 4 muestran que el ensayo de hibridación en dos pasos es capaz de detectar de manera reproducible tan poco como 5 fg de un polinucleótido diana de N. gonorrhoeae, produciendo quimioluminiscencia de manera significativa por encima de las muestras que no contienen el polinucleótido diana examinado bajo las mismas condiciones. Además, cuando las muestras se almacenaron y re-examinaron utilizando el método durante el transcurso de tres días hubo buena reproducibilidad de los resultados durante todo el período de tiempo. Los resultados también muestran buena reproducibilidad muestra a muestra durante el período de tres días.

Ejemplo 5

Ensayo de Hibridación en Dos Pasos para la Detección de Bacterias en Muestras Clínicas de Orina

Este ejemplo muestra que el método de la hibridación en dos pasos de la presente invención puede ser utilizado para la detección de una diana indicativa de infección bacteriana utilizando muestras clínicas de orina. El polinucleótido diana era una secuencia específica para Chlamydia trachomatis. Las muestras fueron examinadas independientemente para C. trachomatis utilizando un ensayo basado en PCR y los resultados obtenidos con el método de la hibridación en dos pasos fueron comparados con aquellos obtenidos con el ensayo basado en PCR. Las muestras de orina fueron examinadas por duplicado utilizando el método de la hibridación en dos pasos, con las muestras dispuestas en un orden aleatorio relativo a su clasificación (positiva o negativa) basada en los resultados del ensayo basado en PCR.

\newpage

En resumen, el protocolo del ensayo de hibridación en dos pasos era de la siguiente manera. Cada tubo de reacción contenía 200 \mul de TBC (como se ha definido en el Ejemplo 4) conteniendo 6,25 pmoles de un oligonucleótido de captura teniendo una secuencia complementaria al polinucleótido diana de C. trachomatis y una secuencia dT_{3}dA_{30}, a la cual se añadieron 800 \mul de muestra de orina preparada (400 \mul de orina más 400 \mul de tampón TM ((NH_{4})_{2}
SO_{4} 100 mM, Hepes 50 mM, pH 7,5, LSL 8%)) o 800 \mul de controles (los controles negativos fueron 400 \mul de KOVATROL^{TM} más 400 \mul de tampón TM; los controles positivos fueron 400 \mul de KOVATROL^{TM} más 400 \mul de tampón TM conteniendo 5 fg de RNA celular total de C. trachomatis (es decir, rRNA de polinucleótido diana). Los tubos fueron sellados, mezclados, e incubados a 60ºC durante 30 minutos, y luego a 40ºC durante 30 minutos. Entonces los tubos se sometieron a un campo magnético y las microesferas magnéticas con una sonda inmovilizada se separaron de la solución, y los componentes inmóviles se lavaron sustancialmente dos veces como se describe en el Ejemplo 2. A 60ºC, la sonda de captura y la secuencia del polinucleótido diana de C. trachomatis hibridaron porque la T_{f} del complejo sonda de captura:polinucleótido diana es superior a 60ºC, y a la segunda temperatura la sonda inmovilizada poli-dT y la porción de la sonda de captura poli-A hibridaron porque la T_{f} del complejo dA:dT es inferior a los 52ºC. El polinucleótido diana se amplificó utilizando un cebador específico para la secuencia diana de C. trachomatis y los reactivos para la amplificación asociada a la transcripción contenidos en un volumen de 75 \mul descrito sustancialmente en el Ejemplo 3 excepto que la amplificación duró 1 hora. La sonda marcada con AE específica para la secuencia diana de C. trachomatis se añadió (en 100 \mul), se mezcló, se incubó y se detectó como RLU (ver Ejemplo 3).

La Tabla 5 muestra los resultados de los ensayos de hibridación en dos pasos ("RLU" es el promedio de los exámenes por duplicado para 30 muestras de orina, y los promedios de cinco controles positivos y negativos) y las pruebas basadas en la PCR (positivas o negativas para la detección de ácidos nucleicos de C. trachomatis).

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TABLA 5

9

Como se puede observar en los resultados de la Tabla 5, en todas las muestras ensayadas el método de la hibridación en dos pasos aportó resultados positivos para aquellas muestras que independientemente habían resultado positivas utilizando un ensayo basado en la PCR, y en todos los casos que habían resultado negativas utilizando un ensayo basado en la PCR, la muestra también fue negativa cuando se ensayó mediante el método de la hibridación en dos pasos. Para aquellas muestras negativas que tenían una señal negativa relativamente alta (10^{3})(muestras 2, 8 y 22), los ensayos duplicados siempre incluyeron una señal RLU "0" y una señal de fondo relativamente alta. Por eso, el ensayo de la hibridación en dos pasos puede ser utilizado para detectar bacterias presentes en muestras clínicas de orina, y aportar resultados positivos o negativos comparativos a aquellos obtenidos en un ensayo mediante PCR.

Ejemplo 6

Ensayo de Hibridación en Dos Pasos para la Detección de Múltiples Dianas Bacterianas en una Muestra A

Este ejemplo muestra que el método de la hibridación en dos pasos de la presente invención puede ser utilizado para detectar múltiples dianas indicativas de infecciones bacterianas por diversas especies en una única muestra. Los polinucleótidos diana eran secuencias específicas para Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis y los ensayos fueron realizados sustancialmente como se describe en los Ejemplos 3-6. A estas muestras se les añadió también un contaminante (del 1% al 10% v/v de sangre).

Los ensayos se realizaron sustancialmente como se describe en los Ejemplos 3-6, en los que las muestras consistían en orina normal (sin contaminación bacteriana) que contenía o bien: ausencia de polinucleótido diana (controles negativos); 5 fg de polinucleótido diana de C. trachomatis; 5 fg de polinucleótido diana de N. gonorrhoeae; o una mezcla de 5 fg de polinucleótido diana de C. trachomatis y 5 fg de polinucleótido diana de N. gonorrhoeae. Para cada lote de muestras, los tubos de ensayo además incluían o bien el 0%, 1%, 5% o el 10% v/v de sangre. La detección simultánea de las dos secuencias diana utilizando sondas de quimioluminiscencia fue sustancialmente como se describe por Nelson et al. (1996, Biochem. 35:8429-8438 en 8432) utilizando una sonda marcada orto-F-AE específica para el polinucleótido diana de C. trachomatis y una sonda marcada 2-Me-AE específica para el polinucleótido diana de N. gonorrhoeae. Las muestras de orina se prepararon e incubaron a 60ºC durante 30 minutos, y entonces a 40ºC durante 30 minutos para los sucesivos pasos de hibridación sustancialmente descritos aquí en el Ejemplo 5, excepto que el contaminante sanguíneo fue incluido en algunas de las muestras como se describe anteriormente. Las sondas inmovilizadas en complejos de hibridación se purificaron utilizando el campo magnético y los pasos de lavado, y las secuencias diana purificadas se amplificaron utilizando procesos de amplificación asociada a la transcripción que incluyen cebadores específicos para el polinucleótido diana de C. trachomatis y el polinucleótido diana de N. gonorrhoeae como se describe en los Ejemplos 4 y 5 anteriores. El reactivo de detección se añadió y se detectó quimioluminiscencia simultánea en la sonda marcada específicamente para C. trachomatis y la sonda marcada específicamente para N. gonorrhoeae. Para cada tipo de muestra ensayada, cuatro réplicas fueron ensayadas y los resultados RLU (valores promedio para cada tipo de muestra) se presentan en la Tabla 6. En la Tabla 6, la señal (RLU) detectada para la sonda marcada específicamente para C. trachomatis está indicada mediante "CT" y la señal detectada para la sonda marcada específicamente para N. gonorrhoeae está indicada mediante "NG".

TABLA 6

10

Los resultados presentados en la Tabla 6 muestran que el ensayo de hibridación en dos pasos puede ser utilizado para detectar simultáneamente dos dianas en una única muestra. Los controles negativos dan señales esencialmente negligibles comparadas con aquellas de las muestras que contenían la diana de C. trachomatis sola, la diana de N. gonorrhoeae sola, o las dianas combinadas. La detección de cualquier diana no fue interferida por la contaminación sanguínea de hasta el 10% v/v, y ambas dianas fueron detectadas simultáneamente en una única muestra incluso con contaminación sanguínea de hasta el 10% v/v.

Mientras que varias realizaciones de la presente invención han sido descritas aquí, se pueden hacer varias modificaciones a las sondas concretas sin salirse del espíritu y el ámbito de la presente invención la cual está definida por las reivindicaciones que siguen.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Gen-Probe Incorporated

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Hibridación en dos pasos y captura de un polinucleótido

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Gen-Probe Incorporated

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(B)

CALLE: 10210 Genetic Center Drive

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(C)

CIUDAD: San Diego

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(D)

ESTADO: California

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CP: 92121-4362

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(v)

FORMA LEGIBLE POR COMPUTADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco de 3,5''; capacidad 1,44 Mb

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(B)

COMPUTADORA: IBM compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: Microsoft MS-DOS (Versión 6.0)

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(D)

PROGRAMA: FastSeq

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(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: Desconocido

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(B)

FECHA DE DEPÓSITO: 01 Mayo de 1998

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD: Solicitudes anteriores totales, incluyendo la solicitud descrita a continuación:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/045.430

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(B)

DATOS DE DEPÓSITO: 02 Mayo de 1997

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

DATOS DE DEPÓSITO:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL AGENTE/ABOGADO

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(A)

NOMBRE: Christine Gritzmacher

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 40.627

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/SUMARIO: GP088-PCT

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: 619 410-8926

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(E)

TELEFAX: 619 410-8928

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(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NÚM: 1

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 40

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NÚM: 1:

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\vskip0.400000\baselineskip

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GAACTACTTA GTTCCAATGA CTGTTTAAAA AAAAAAAAAA

\hfill

40

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(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NÚM: 2

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 23

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NÚM: 2:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTCATTGG AACTAAGTAG TTC

\hfill

23

Claims (18)

1. Un método de captura de un polinucleótido diana presente en una muestra, que comprende la unión de un polinucleótido diana a un soporte sólido, caracterizado por los pasos de:

proporcionar una mezcla que comprende un polinucleótido diana, una sonda de captura, y una sonda inmovilizada;

incubar la mezcla en una primera condición de hibridación que utiliza una temperatura por debajo de la T_{f} del complejo de hibridación sonda de captura:diana que comprende la sonda de captura y el polinucleótido diana, y por encima de la T_{f} de un complejo de hibridación sonda inmovilizada:sonda de captura, que comprende la sonda inmovilizada y la sonda de captura, favoreciendo por lo tanto la formación de un complejo de hibridación sonda de captura:diana, y desfavoreciendo la formación de un complejo de hibridación sonda inmovilizada:sonda de captura;

entonces, incubar la mezcla en una segunda condición de hibridación que utiliza una temperatura por debajo de la T_{f} del complejo de hibridación sonda inmovilizada:sonda de captura, y favoreciendo por lo tanto la formación de un complejo de hibridación sonda inmovilizada:sonda de captura y capturando el polinucleótido diana en un complejo de hibridación sonda inmovilizada:sonda de captura que comprende la sonda inmovilizada, la sonda de captura y el polinucleótido diana; y

purificar el complejo de hibridación sonda inmovilizada:sonda de captura:diana.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el paso de incubación de la segunda condición de hibridación comprende la disminución de la temperatura de la primera condición de hibridación en al menos 10°C.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el paso de incubación de la segunda condición de hibridación comprende la disminución de la temperatura de la primera condición de hibridación en al menos 20°C.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el paso de incubación de la primera condición de hibridación utiliza una temperatura de alrededor de 60ºC y el paso de incubación de la segunda condición de hibridación utiliza una temperatura de alrededor de 40ºC o inferior.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además por el paso de detectar el polinucleótido diana en un complejo de hibridación sonda inmovilizada:sonda de captura:diana hibridando una sonda marcada con el polinucleótido diana y detectar la sonda marcada hibridada.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además por el paso de amplificar un polinucleótido diana purificado del complejo de hibridación sonda inmovilizada:sonda de captura:diana para producir un ácido nucleico amplificado.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el paso de amplificación comprende un procedimiento de amplificación asociado a la transcripción.

8. El método de la reivindicación 6 o 7, caracterizado además por el paso de detectar el ácido nucleico amplificado.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el paso de detección comprende hibridar una sonda marcada con el ácido nucleico amplificado que es complementario con el polinucleótido diana y detectar la sonda marcada.

10. El método de la reivindicación 5 o 9, en el que la detección de la sonda marcada hibridada incluye retirar la sonda marcada no hibridada.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que los pasos proporcionados proporcionan una mezcla en la que la sonda inmovilizada comprende una región de unión de la sonda de captura de grupos de reconocimiento de bases de al menos cinco nucleótidos de longitud, y la sonda de captura comprende una región de unión de la sonda de captura de grupos de reconocimiento de bases de al menos cinco nucleótidos de longitud, en la que la región de unión de la sonda de captura es complementaria a la región de unión de sonda inmovilizada.

12. El método de la reivindicación 11, en el que en el paso proporcionado la región de unión de la sonda de captura de la sonda inmovilizada comprende:

(a)

un primer esqueleto que contiene al menos un enlace glúcido-fosfodiéster, al menos un grupo de ácido nucleico peptídico, al menos un enlace fosfotiorato, o una combinación de los mismos y

(b)

grupos de reconocimiento de al menos diez bases nucleotídicas unidos al primer esqueleto, en los que cada grupo de reconocimiento de nucleótidos es capaz de formar puentes de hidrógeno con adenina, guanina, citosina, timina, uracilo o inosina;

\newpage

y la región de unión a la sonda inmovilizada de la sonda de captura comprende:

(a)

un segundo esqueleto que contiene al menos un enlace glúcido-fosfodiéster, al menos un grupo de ácido nucleico peptídico, al menos un enlace fosfotioato, o una combinación de los mismos y

(b)

grupos de reconocimiento de al menos diez bases nucleotídicas unidos al segundo esqueleto, que son capaces de formar puentes de hidrógeno con los grupos de reconocimiento de bases de nucleótidos unidos al primer esqueleto.

13. El método de la reivindicación 11 o 12, en el que la región de unión de la sonda de captura consiste en un homopolímero que comprende al menos 10 nucleótidos, y la región de unión a la sonda inmovilizada consiste en un homopolímero que comprende al menos 25 nucleótidos, de los cuales al menos 10 nucleótidos son complementarios a 10 nucleótidos de la región de unión de la sonda de captura.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la región de unión de la sonda de captura comprende alrededor de catorce bases A o T contiguas, y la región de unión de la sonda inmovilizada comprende una secuencia de alrededor de 30 bases complementarias a las bases contiguas de la región de unión de la sonda de captura.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el paso proporcionado, proporciona una mezcla en la que la sonda de captura comprende desoxinucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos 2'-metoxi sustituidos, componentes de nucleótidos 2'-halo sustituidos, o una combinación de los mismos, y en la que la sonda inmovilizada comprende desoxinucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos 2'-metoxi sustituidos, componentes de nucleótidos 2'-halo sustituidos o una combinación de los mismos.

16. Un método para determinar la presencia de un polinucleótido diana en una muestra, que comprende la unión del polinucleótido a un soporte sólido, la amplificación del polinucleótido diana y la detección del polinucleótido diana amplificado, caracterizado por los pasos de:

proporcionar una sonda de captura capaz de hibridar con un polinucleótido diana presente en una muestra, y una sonda inmovilizada capaz de hibridar con la sonda de captura;

mezclar la sonda de captura y la sonda inmovilizada con una muestra que se sospecha que contiene el polinucleótido diana a una primera temperatura de incubación que favorece la hibridación de la sonda de captura con el polinucleótido diana y desfavorece la hibridación de la sonda inmovilizada con la sonda de captura, produciendo por lo tanto un complejo de sonda de captura:polinucleótido diana;

incubar el complejo de sonda de captura:polinucleótido diana y la sonda inmovilizada a una segunda temperatura de incubación que favorece la hibridación de la sonda inmovilizada y la sonda de captura, produciendo por lo tanto un polinucleótido diana capturado que comprende un complejo de sonda inmovilizada:sonda de captura:polinucleótido diana;

purificar el polinucleótido diana capturado de entre los otros componentes de la muestra, produciendo de esta manera un polinucleótido diana purificado;

amplificar el polinucleótido diana purificado utilizando un cebador específico para el polinucleótido diana, produciendo de esta manera un ácido nucleico amplificado; y

detectar el ácido nucleico amplificado para determinar que el polinucleótido diana está presente en la muestra.

17. El método de la reivindicación 16, en el que el paso de detección comprende hibridar una sonda marcada con el ácido nucleico amplificado que es complementario con el polinucleótido diana o una porción de la misma y detectar la sonda marcada.

18. El método de la reivindicación 16 o 17, en el que el paso de amplificación utiliza un procedimiento de amplificación asociado a la transcripción específico de diana.