ES2272074T3 - Procedimiento para la identificacion de fragmentos proteicos estimuladores de celulas t. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para identificar fragmentos proteicos estimuladores de células T que comprende las siguientes etapas: a) determinar la secuencia de aminoácidos de un antígeno, el cual es una proteína o un péptido, b) dividir la secuencia de aminoácidos encontrada del antígeno en fragmentos proteicos, c) sintetizar al menos un fragmento proteico con una longitud de 8 a 30 aminoácidos o escindir la secuencia de aminoácidos del antígeno en al menos un fragmento proteico con una longitud de 8 a 30 aminoácidos, siendo a este respecto el fragmento proteico una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos determinada del antígeno, d) incubar una suspensión que contiene células T con el fragmento o fragmentos proteicos en mezclas de reacción experimentales, e) identificar (i) al menos una citocina de célula T que fue inducida mediante el fragmento o fragmentos proteicos y sintetizada en las células T, estando a este respecto las citocinas de células T presentes en el interior de la célula o unidas a la membrana celular, y/o (ii) al menos un marcador de activación expresando o incrementando en su expresión por el o los fragmentos proteícos debido a la estimulación de las células T que fue inducido por el fragmento o fragmentos proteicos o se incrementó su expresión y se expresa en las células T, pudiendo estar presente a este respecto el marcador de activación en el interior de la célula o expresado en la superficie celular, Identificándose a este respecto la citocina o citocinas de células T o el marcador de activación por citometría de flujo y f) asignar las mezclas de reacción experimentales, en las que se estimularon las células T y se reconoció esta estimulación de células T mediante la identificación de una citocina de células T o varias citocinas de células T y/o uno o varios marcadores de activación a la secuencia o secuencias de aminoácidos de los fragmentos proteicos que se incubaron con las células T, caracterizado porque el tiempo de incubación es tan prolongado que el fragmento o fragmentos proteicos de las moléculas del MHC que se encuentran sobre la superficie celular se captan de forma suficiente, en el que la captación es suficiente cuando es posible una identificación inequívoca de células T estimuladas y porque el tiempo de incubación de la suspensión que contiene células T con el fragmento o fragmentos proteicos es tan corto que no se lleva a cabo una selección y proliferación que vaya acompañada de una eliminación dirigida de determinadas células T.
Description
Procedimiento para la identificación de
fragmentos proteicos estimuladores de células T.
La invención comprende un procedimiento para
identificar fragmentos proteicos estimuladores de células T con
ayuda de una inducción de células T.
Los fragmentos proteicos estimuladores de
células T comprenden epítopos de células T que son reconocidos
específicamente por receptores de células T y mediante este
reconocimiento entre otros, incitan a las células T a la biosíntesis
de citocinas, que son secretadas de forma habitual.
Un procedimiento conocido para la identificación
de fragmentos proteicos estimuladores de células T consiste en
dividir una proteína cuya secuencia de aminoácidos es conocida en
fragmentos proteicos individuales que se solapan. Los fragmentos
proteicos correspondientes que se preparan sintéticamente se incuban
individualmente o en grupos con células T. Al cabo de una a tres
semanas, aparecen dado el caso líneas celulares o clones celulares
que se pudieron estimular específicamente mediante el o al menos uno
de los fragmentos proteicos empleados. La especificidad de estas
líneas o clones se puede comprobar mediante ensayos de citotoxicidad
en células diana correspondientes (en inglés: target cells, células
diana). A causa de la disposición del experimento, se pueden
asignar las líneas celulares o clones celulares estimulados a los
fragmentos proteicos estimuladores de células T correspondientes.
Este procedimiento se describe detalladamente en P. WALDEN y col.
(1996) Current Opinion in Immunology, Vol. 8, páginas
68-74. Alternativamente, se puede determinar la
proliferación de células después de una semana mediante la
incorporación de timidita tritiada, lo que sin embargo se ve
afectado por una gran inespecifi-
cidad.
cidad.
Una desventaja de estos dos procedimientos es el
elevado gasto de equipamiento, personal y tiempo. Además es
probable que las células T estimuladas mueran durante al largo
tiempo de incubación, por ejemplo, por la muerte celular programada
(apoptosis) inducida por la activación y dé como resultado
resultados falsos negativos.
Un procedimiento para la identificación por
citometría de flujo de células T específicas de antígeno según S.
L. WALDROP y col., (1997) Determination of
antigen-specific memory/effector CD4+ T cell
frequencies by flow citometry: evidence for a novel
antigen-specific homeostatic mechanism in
HIV-associated immunodeficiency. J. Clin. Invest.
Vol. 99, páginas 1739-1750 consiste en incubar
proteínas como antígeno con células mononucleares periféricas (PBMC
= peripheral blood mononuclear cells, células mononucleares
sanguíneas periféricas). A este respecto, estas proteínas son
procesadas y presentadas por células presentadoras de antígenos.
Este procesamiento conduce a fragmentos proteicos con los que se
cargan moléculas del MHC de clase II y que son transportados a la
superficie celular (presentación antigénica). Las células T
respectivamente estimuladas mediante el reconocimiento de
fragmentos proteicos se identifican por citometría de flujo. A este
respecto no es posible ni determinar los fragmentos proteicos
estimuladores ni asignar las células T específicamente inducidas a
los fragmentos proteicos inductores. Por tanto, es objetivo de esta
disposición experimental fundamentalmente establecer si están
presentes epítopos del MHC de clase II presentados en una proteína o
antígeno complejo o si un individuo posee células T restringidas
frente a tales epítopos posible o seguramente presentes y con qué
frecuencia aparecen estas células (cuantificación de las células T
específicas de antígeno). Adicionalmente se pueden determinar otras
propiedades de las células T estimuladas (marcadores de superficie,
etc.). Sin embargo no se puede determinar ni la secuencia de
aminoácidos de epítopos presentes ni la frecuencia de tales
epítopos.
Además, R. P. Woitas describe en J. Immunol.
159(2):1012-1018 (1997) la inducción de CD30
y citocinas por el efecto de la proteína de la nucleocápside del
VHC o fragmentos de la misma sobre células mononucleares
periféricas de pacientes con hepatitis. El periodo de incubación de
los péptidos con las células asciende a 40 horas. Las citocinas de
células T como por ejemplo IL-2 e
IFN-\gamma se determinan por citometría de flujo
y por lo tanto a nivel de células individuales.
Es por lo tanto objetivo de la invención ofrecer
un procedimiento con el que se puedan identificar fragmentos
proteicos cuyas secuencias de aminoácidos son conocidas en poco
tiempo como fragmentos estimuladores. A este respecto, el
procedimiento debe trabajar con un número reducido de células T, sin
que deba disponerse de líneas o clones de células T. Además debe
ser posible descubrir, entre una pluralidad de fragmentos proteicos,
cuáles estimulan a las células T.
El objetivo se alcanza mediante un procedimiento
para identificar fragmentos proteicos estimuladores de células T
que comprende las siguientes etapas:
a) determinar la secuencia de aminoácidos de un
antígeno, el cual es una proteína o un péptido,
b) dividir la secuencia de aminoácidos
encontrada del antígeno en fragmentos proteicos,
c) sintetizar al menos un fragmento proteico con
una longitud de 8 a 30 aminoácidos o escindir la secuencia de
aminoácidos del antígeno en al menos un fragmento proteico con una
longitud de 8 a 30 aminoácidos, siendo a este respecto el fragmento
proteico una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos
determinada del antígeno,
d) incubar una suspensión que contiene células T
con el fragmento o fragmentos proteicos en mezclas de reacción
experimentales,
e) identificar
- (i)
- al menos una citocina de célula T, que fue inducida mediante el fragmento o fragmentos proteicos y sintetizada en las células T, estando a este respecto las citocinas de células T presentes en el interior de la célula o unidas a la membrana celular, y/o
- (ii)
- al menos un marcador de activación que fue inducido por el fragmento o fragmentos proteicos o se incrementó su expresión y se expresa en las células T, pudiendo estar presente a este respecto el marcador de activación en el interior de la célula o expresado en la superficie celular,
identificándose a este respecto la citocina o
citocinas de células T o el marcador de activación por citometría
de flujo y
f) asignar las mezclas de reacción
experimentales, en las que se estimularon las células T y se
reconoció esta estimulación de células T mediante la identificación
de una citocina de células T o varias citocinas de células T y/o
uno o varios marcadores de activación a la secuencia o secuencias de
aminoácidos de los fragmentos proteicos que se incubaron con las
células T, caracterizado porque el tiempo de incubación es tan
prolongado que el fragmento o fragmentos proteicos son captados de
forma suficiente por las moléculas del MHC que se encuentran sobre
la superficie celular, en el que la captación resulta suficiente
cuando es posible una identificación inequívoca de células T
estimuladas, y porque el tiempo de incubación de la suspensión que
contiene células T con el fragmento o fragmentos proteicos es tan
corto que no se produce una selección o proliferación que vaya
acompañada de una eliminación dirigida de determinadas células
T.
La ventaja de este procedimiento según la
invención consiste en que al cabo de muy poco tiempo, en comparación
con procedimientos convencionales, con muy poco esfuerzo se puede
identificar un fragmento proteico conocido respecto a la secuencia
como un fragmento proteico estimulador de células T. El tiempo entre
la primera incubación de células T y la valoración flujocitométrica
puede ascender a seis horas. A este respecto pueden ser suficientes
pequeñas cantidades de células. Cuando se comienza con una cantidad
de 1\cdot10^{6} glóbulos blancos periféricos aún se puede
establecer sin lugar a dudas una respuesta positiva, si el 0,1% de
las células T de partida son células T estimuladas. Por el
contrario, los procedimientos clásicos requieren una cantidad de
células de aproximadamente 8\cdot10^{6} glóbulos blancos
sanguíneos por fragmento proteico o una mezcla de fragmentos
proteicos para poder llevar a cabo un ensayo de citotoxicidad con
éxito. El procedimiento según la invención es, por lo tanto, un
procedimiento que se puede emplear con alta eficiencia para el mapeo
de epítopos de células T de antígenos proteicos.
Adicionalmente se pueden usar mezclas celulares
de células sanguíneas o titulares recién aisladas. Para este
procedimiento no son necesarias líneas de células T o clones de
células T. Gracias a esto resultan ventajas en cuanto al tiempo en
la incubación y además, muy importante, una ventaja respecto a la
viabilidad de las células T, que en el corto tiempo de incubación
están presentes como un gran conjunto con alta viabilidad. A causa
del corto tiempo de incubación en el procedimiento según la
invención la invención no se produce una selección y proliferación
que va acompañada de une eliminación dirigida de determinadas
células T.
Como fuente de células T que se van a estimular
se prefieren aquellos donantes que han desarrollado antes una
respuesta inmunológica primaria frente al antígeno. Esto puede haber
tenido lugar por ejemplo en el marco de una infección o también en
el marco de una inmunización. Esta situación también se da en caso
de una respuesta autoinmune.
Otra ventaja adicional consiste en que el tipo
de MHC del donante no debe ser conocido. Así por ejemplo se incuban
fragmentos proteicos con 9 aminoácidos de una proteína con las
células T, sin que se conozca el tipo de MHC del donante de sangre
o de células. No obstante se pueden identificar los fragmentos
proteicos estimuladores de las células T. Con ello, para la
identificación del epítopo no es necesario conocer el tipo de MHC.
En los ensayos clásicos por medio de líneas o clones de células T
citotóxicas, el MHC de las líneas celulares diana (líneas celulares
target) debe coincidir con el de las células efectoras.
Producir líneas celulares diana a partir de
sangre del donante significa un gasto de material y tiempo
adicional.
Adicionalmente, con el procedimiento según la
invención se pueden incubar una pluralidad de fragmentos proteicos
al mismo tiempo. Una pequeña cantidad de células y una detección
altamente sensible de células T estimuladas permiten una
identificación claramente ventajosa en términos de tiempo de los
fragmentos proteicos estimuladores de células T.
Dado que la cantidad de fragmentos proteicos que
se van a estudiar puede ser muy elevada a causa del escaso esfuerzo
de trabajo necesario, no es necesario restringir los posibles
epítopos por medio de previsiones teóricas. Los epítopos se
descubren de forma meramente empírica, y se pueden por lo tanto
descubrir aquellos epítopos de células T que no se producirían
basándose en una predicción teórica.
Con este procedimiento se pueden identificar
fácilmente las células T que se pueden estimular específicamente a
través de determinados fragmentos proteicos seleccionados.
Los fragmentos proteicos estimuladores de
células T se unen por un lado a moléculas del MHC definidas y por
otro lado contienen secuencias de aminoácidos (epítopos) que pueden
intervenir en una unión con la región de unión a antígeno del
receptor de célula T (parátopo).
Los términos proteína o péptido tienen como
característica esencial la secuencia de al menos nueve aminoácidos.
A este respecto resulta indiferente qué secuencia se haya
determinado. Así, en el caso de una proteína nueva se puede
analizar la secuencia por primera vez y en el caso de proteínas
conocidas, leerse a partir de un banco de datos. Sólo es importante
que la secuencia de aminoácidos del fragmento proteico sea
determinada. La división de la secuencia de la proteína o el
péptido también puede darse de forma diferente. Así se pueden
derivar los fragmentos proteicos en etapas con la variación de un
aminoácido a partir de una pro. También son imaginables otros
solapamientos. Se trata en este sentido del procedimiento clásico de
un mapeo de proteínas.
Las suspensiones que contienen células T en el
sentido de esta solicitud se distinguen porque contienen células
que pueden presentar péptidos unidos al MHC. Así, las células
presentadoras también pueden ser, además de células presentadoras
de antígenos, por ejemplo células T.
El procedimiento según la invención para
identificar fragmentos proteicos estimuladores de células T resulta
ventajoso, ya que se lleva a cabo la identificación de al menos una
citocina de célula T o un marcador de activación a nivel de las
células individuales. Son suficientes ya las más pequeñas cantidades
de células T que contengan citocinas en el interior celular o
unidas a la membrana celular.
Se prefiere un procedimiento según la invención
para identificar fragmentos proteicos estimuladores de células T,
en el que las suspensiones que contienen células T contengan células
que presentan el fragmento proteico esencialmente con MHC de clase
I o II (Complejo Principal de Histocompatibilidad, MHC = Major
Histocompatibility Complex). Además de los aminoácidos que sirven
para el anclaje en la hendidura de la molécula del MHC (anclaje de
unión), deben estar presentes determinadas secuencias que son
reconocidas de forma específica por un receptor de células T
(epítopo de células T), para que el fragmento proteico funcione como
un epítopo de célula T.
Se prefiere un procedimiento según la invención
para identificar fragmentos proteicos estimuladores de células T en
el que el fragmento proteico de la presentación restringida de clase
I comprenda 9 a 11 aminoácidos y el fragmento proteico de la
presentación restringida de la clase II comprenda al menos 11
aminoácidos. Se sabe que los fragmentos proteicos que se unen a
moléculas del MHC de clase I (Complejo Principal de
Histocompatibilidad, MHC = Major Histocompatibility Complex) por
regla general presentan una longitud de 9 aminoácidos, mientras que
los fragmentos proteicos que se unen a moléculas del MHC de clase II
son algo más largas y altamente variables en su longitud.
Es ventajoso que los fragmentos proteicos, a
pesar del escaso tiempo de incubación, son captados de forma
suficiente por las moléculas del MHC que se encuentran sobre la
superficie de la célula para posibilitar una identificación
inequívoca de células T estimuladas al cabo de por ejemplo seis
horas. En caso de que se usen fragmentos proteicos cortos (clase I
con 9 aminoácidos y clase II con preferiblemente
11-15 aminoácidos), se puede delimitar al máximo el
epítopo presente en una secuencia de aminoácidos estimulador.
Se prefiere un procedimiento según la invención
para identificar fragmentos proteicos estimuladores de células T en
el que la suspensión que contiene células T sea una suspensión de
sangre completa, glóbulos blancos de sangre periférica (PWBC),
células de bazo, células de timo, médula ósea, licor y/o de células
de ganglios linfáticos. El procedimiento se simplifica
considerablemente por el hecho de que las suspensiones que contienen
células T puedan obtenerse a partir de diferentes fuentes.
Adicionalmente, resulta especialmente ventajoso que no sea
necesario un procesamiento de las células T. De esta forma, las
células T no deben enriquecerse, además no es necesario retirar o
destruir otras células. Gracias a esto, el procedimiento según la
invención se puede manejar más fácilmente de forma rutinaria. El
procedimiento no es tan sensible a las condiciones de cultivo,
contaminaciones, selecciones dependientes del cultivo y selección de
clones específicos como el procedimiento convencional. Con este
procedimiento se puede determinar una imagen de las células T en
general y células T que son estimuladas por fragmentos
proteicos.
Se prefiere un procedimiento según la invención
para identificar fragmentos proteicos estimuladores de células T en
el que la suspensión que contiene células T proviene del paciente
que se debe someter a tratamiento, de donantes o de animales. En
caso de que la suspensión que contiene células T provenga de un
paciente, con la identificación se puede establecer frente a qué
fragmento proteico/epítopo de un antígeno vírico se puede inducir
la respuesta mediada por células T. Tal fragmento proteico/epítopo
puede emplearse de forma dirigida para la estimulación de otras
células T del paciente. Las células así inducidas e incitadas a la
proliferación pueden de esta forma multiplicarse y transfundirse de
nuevo al paciente. El procedimiento según la invención se puede
usar también en medicina veterinaria. A este respecto se puede
pensar en las más diferentes especies animales y también
constelaciones de pacientes animales y donantes como fuente de la
suspensión que contienen células T.
Resulta ventajoso un procedimiento según la
invención para identificar fragmentos proteicos estimuladores de
células T en el que los antígenos, que son proteínas o péptidos
provienen de microorganismos, de macroorganismos, de células,
cultivos celulares y/o tejidos de donantes o pacientes. Son por
ejemplo microorganismos virus, bacterias, hongos, organismos
unicelulares, parásitos. Entre los macroorganismos se cuentan por
ejemplo todos los organismos pluricelulares eucariotas.
Precisamente esta fuente es importante para la influencia de
alergias. Entre ellos se cuentan animales y plantas. Se pueden usar
células, cultivos celulares o también tejidos completos que se
componen de una o más capas o tipos celulares.
Se prefiere un procedimiento según la invención
para identificar fragmentos proteicos estimuladores de células T en
el que las citocinas de células T son del tipo
interferón-\gamma, TNF-\alpha
(Factor de Necrosis Tumoral alfa) o interleucina 2. No obstante,
también son posibles otras citocinas. En este sentido sólo es
relevante que estas citocinas de puedan marcar por
fluorescencia.
También se pueden identificar marcadores de
activación que se expresan o ven aumentada su expresión a causa de
la estimulación de las células T por medio de los fragmentos
proteicos. Un ejemplo de ello es el marcador CD69. En la
identificación de marcadores de activación que se encuentran en la
superficie celular o no son secretados ya no se necesita igualmente
dado el caso la inhibición de la secreción.
En Abul K. ABBAS y col., (1997) Cellular and
Molecular Immunology, Filadelfia, 3ª edición, ISBN
0-7216-4024-9 se
describen con más detalle citocinas y marcadores superficiales.
Es más preferido un procedimiento según la
invención para identificar fragmentos proteicos estimuladores de
células T en el que las citocinas de las células T después de una
inhibición de la secreción estén presentes en el interior de la
célula. Es significativo que la estimulación realizada se puede
asignar de forma inequívoca a células T.
Se prefiere un procedimiento según la invención
para identificar fragmentos proteicos estimuladores de células T en
el que la estimulación se detecta mediante un citómetro de flujo. A
este respecto resulta esencial el principio de que marcadores que
se encuentran en las células o sobre su superficie como por ejemplo
citocinas o marcadores superficiales entren en contacto con un
detector específico, como por ejemplo un anticuerpo, en el que el
detector está cargado con un colorante fluorescente. Después de
excitar por láser este colorante fluorescente sobre las células a
las que se enfoca en un líquido, el citómetro de flujo registra la
luz dispersa y las señales fluorescentes emitidas, lo que
posibilita el análisis simultáneo o posterior de las células.
Técnicas de este tipo se describen con mayor detalle en Howard M.
SAPHIRO (1995) Practical Flor Cytometry, Nueva York, 3ª edición,
ISBN 0-471-30376-3.
La detección de las citocinas intracelulares se describe en L. J.
PICKER y col., (1995) Blood, Vol. 86, página 1408.
El procedimiento según la invención comprende
adicionalmente la preparación de un fragmento proteico/péptido que
es estimulador de células T y cuya secuencia de aminoácidos o
secuencia de aminoácidos de partida se ha descubierto según el
procedimiento según la invención para identificar fragmentos
proteicos estimuladores de células T, en el que el fragmento
proteico/péptido se prepara con el procedimiento en fase sólida, con
el procedimiento en fase líquida o por medio de biosíntesis de
proteínas.
Síntesis en fase sólida: la síntesis en fase
sólida se describe detalladamente en Solid Phase Synthesis,
E.
ATHERTON y R.C. SHEPPARD (1989) IRL Press, ISBN 1-85221-133-4 y Amino Acid and Peptide Synthesis, J. JONES, Oxford Science Publication (1992) ISBN 0-19-855668-3.
ATHERTON y R.C. SHEPPARD (1989) IRL Press, ISBN 1-85221-133-4 y Amino Acid and Peptide Synthesis, J. JONES, Oxford Science Publication (1992) ISBN 0-19-855668-3.
Síntesis en fase líquida: La síntesis en fase
líquida o técnica en disolución se representa en Methoden der
Organischen Chemie (HOUBEN/WEYL), volumen 15/nº 1 y 2, E. WÜNSCH
(editor), Editorial Thieme, Stuttgart, 1974.
Adicionalmente resulta ventajoso un
procedimiento según la invención para preparar un fragmento
proteico/péptido que es estimulador de células T y cuya secuencia
de aminoácidos o secuencia de aminoácidos de partida se ha
descubierto según el procedimiento según la invención para
identificar fragmentos proteicos estimuladores de células T, en el
que el fragmento proteico/péptido se prepara con el procedimiento en
fase sólida, el procedimiento en fase líquida o por medio de
biosíntesis de proteínas en un huésped, a este respecto el fragmento
proteico/péptido presenta inserciones, deleciones o sustituciones
(modificaciones), en el que uno, dos, tres o varios aminoácidos se
intercambian, se eliminan o se insertan. en el que el fragmento
proteico/péptido modificado presenta esencialmente la misma función
respecto a la estimulación de células T que la que posee el
fragmento proteico/péptido no modificado.
Resulta especialmente ventajoso un procedimiento
para preparar un fragmento proteico/péptido del tipo mencionado
anteriormente, en el que el fragmento proteico/péptido posee en el
extremo N-terminal y/o C-terminal al
menos otro aminoácido natural o no natural y/o un grupo protector
(modificación ampliada), en el que el fragmento proteico/péptido
modificado de forma ampliada posee esencialmente la misma función
respecto a la estimulación de células T que el fragmento
proteico/péptido no modificado.
Abreviaturas: Las abreviaturas usadas en el
texto siguen las reglas que estableció la comisión para la
nomenclatura bioquímica de la IUPAC-IUB
(Biochemistry 11: 1176 (1972) y Biochem. J. 219 345 (1984)). Se usan
las siguientes abreviaturas habituales: Ala = A = alanina; Arg =
R = a arginina; Asn = N = asparagina; Cys = C = cisteína;
Gln = Q = glutamina; Glu = E = ácido glutámico; Gly = G =
glicina; His = H = histidina; Ile = I = isoleucina; Leu =
L = leucina; Lys = K = lisina; Met = M = metionina; Phe
= F = fenilalanina; Pro = P = prolina; Ser = S = serina;
Thr = T = treonina; Trp = W = triptófano; Tyr = Y =
tirosina y Val = V = valina.
Resulta ventajoso que los fragmentos proteicos
que se presentan unidos a moléculas del MHC de clase II presenten,
según el extremo, grupos protectores de amino o grupos protectores
de carboxilo o sus variantes. Los grupos protectores o sus
variantes para el extremo N-terminal pueden
componerse de: grupos alquilo, arilo, alquilarilo, aralquilo,
alquilcarbonilo o arilcarbonilo con 1 a 10 átomos de carbono, son
preferidos grupos naftoílo, naftilacetilo, naftilpropionilo,
benzoílo o un grupo acilo con 1 a 7 átomos de carbono. El grupo
protector o sus variantes para el extremo
C-terminal pueden componerse de: un grupo alcoxi o
ariloxi con 1 a 10 átomos de carbono o de un grupo amino.
El procedimiento según la invención comprende el
uso de un fragmento proteico/péptido, cuya secuencia de aminoácidos
o secuencia de aminoácidos de partida se ha descubierto según el
procedimiento según la invención para identificar fragmentos
proteicos estimuladores de células T y que se ha preparado según el
procedimiento de preparación según la invención, para la
preparación de un medicamento para la inmunoestimulación.
Lo más preferido es el uso de un fragmento
proteico/péptido en el que la inmunoestimulación es una vacunación
o una desensibilización. La vacunación consiste en que como antígeno
se dividen proteínas de virus, bacterias, organismos unicelulares o
pluricelulares eucariotas después de determinar su secuencia en
fragmentos proteicos que, según la invención se añaden a
suspensiones que contienen células T. Las mezclas de reacción
positivas, en las que se encuentra un fragmento proteico
estimulador de células T se usan como punto de partida para la
preparación de una vacuna.
La desensibilización consiste en determinar
fragmentos proteicos/péptidos que desencadenan la reacción
inmunológica no deseada. A continuación, los fragmentos
proteicos/péptidos estimuladores de células T o los medicamentos
preparados a partir de ellos de forma correspondiente al
procedimiento de preparación se administran al paciente. El efecto
deseado en cada caso (estimulación o desensibilización) se alcanza o
se refuerza mediante el tipo y el lugar de la aplicación así como
mediante la dosis (por ejemplo, inducción de tolerancia de dosis
alta o dosis baja) y la administración acompañante de citocinas
estimuladores o tolerizantes o medicamentos activos para la
modulación inmunológica. Ya se han empleado con éxito fragmentos
proteicos que o se han hallado según este procedimiento según la
invención como medicamentos, así por ejemplo en la vacunación de
terneros contra la fiebre aftosa (Collen y col.; J. Immunol. 1991;
146: 749-755). El péptido identificado en nuestro
ejemplo fue descubierto paralelamente mediante la técnica
convencional por otro grupo y se encuentra como vacuna en pruebas
(Diamond y col. Blood 1997; 5: 1751-1767).
(Véase el dibujo
1/2)
Se prepararon células mononucleares de sangre
periférica obtenida mediante punción venosa de una paciente con HLA
tipificados, que poseía el alelo para el MHC de clase I
HLA-A^{+}0201. La paciente poseía además
anticuerpos contra el virus de la citomegalia humano. Las células
preparadas según el procedimiento convencional se incubaron durante
seis horas en condiciones optimizadas con los péptidos indicados a
continuación. Éstos representan fracciones de rotura de un
fragmento conocido de la bibliografía de la proteína pp65 del virus
de la citomegalia humano (Swiss-Prot PO6725) de 15
aminoácidos de longitud (Ala Arg Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr
Val Gln Gly Asn, pp65_{493-507}). Este fragmento
proteico es conocido porque en el cultivo de Bula puede inducir
células T citotóxicas restringidas para HLA-A2, es
decir, contiene un epítopo de células T presentado con
HLA-A2 (M. R. WILLS y col. (1996) J. Virol. Vol. 70,
páginas 7569-5779). Se seleccionó la longitud de 9
aminoácidos para las fracciones de rotura que se van a ensayar, ya
que ésta es la longitud típica de epítopos que son presentados con
moléculas del MHC de clase I (H. G. RAMMENSEE y col. (1995)
Immunogenetics, Vol 41, páginas 178-228). Los
péptidos usados se solapan en 8 aminoácidos respectivamente y
representan por tanto todas las fracciones de rotura posibles de
esta longitud. Los péptidos se emplearon como mezcla de todos los
péptidos o individualmente. La concentración de péptidos en el
ejemplo mostrado ascendió a 1 \mug/ml por péptido.
Se emplearon los siguientes péptidos:
- 1)
- Ala Arg Asn Leu Val Pro Met Val Ala
- 2)
- Arg Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr
- 3)
- Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
- 4)
- Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val Gln
- 5)
- Val Pro Met Val Ala Thr Val Gln Gly
- 6)
- Pro Met Val Ala Thr Val Gln Gly Gln
- 7)
- Met Val Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn
La incubación con la mezcla de todos los
péptidos (dibujo: diagrama superior izquierdo) así como el péptido
3 solo (dibujo: diagrama central, segundo desde arriba) condujeron a
la producción de IFN-\gamma en células T, lo que
se comprobó mediante medición por citometría de flujo a nivel de
células individuales (J. L. PICKER y col., (1995) Blood, Vol 86,
páginas 1408-1419), ninguno de los demás péptidos
ensayados tuvo este efecto. Una investigación publicada en la
bibliografía identificó exactamente el mismo epítopo dentro del
mismo segmento proteico mediante procedimientos convencionales y
conformó inequívocamente nuestro resultado (D. J. DIAMOND y col.
(1997) Blood, Vol 90, páginas 1751-1767).
Detección de interferón-\gamma
presente en el interior de las células en linfocitos T CD8^{+}
tras la estimulación con la mezcla de los 7 péptidos indicados
(superior, extremo izquierda) o los péptidos individuales,
pp65_{493-501} a pp65_{499-507}.
El marcador CD69 se usó como marcador de activación. La
representación se limita a los casos CD3^{+}/CD8^{+}, se indica
la fluorescencia media.
(Véase el dibujo
2/2)
Se prepararon células mononucleares de sangre
periférica obtenida mediante punción venosa de una paciente con HLA
tipificados, que poseía el alelo para el MHC de clase II
HLA-DR 11. La paciente poseía además anticuerpos
contra el virus de la citomegalia humano. Las células preparadas
según el procedimiento convencional se incubaron durante seis horas
en condiciones optimizadas con mezclas de 11 ó 12 péptidos de 15
aminoácidos de longitud cada uno con 11 solapamientos
correspondientes a la secuencia de la proteína de la matriz pp65
(Swiss-Prot PO6725) (en total 138 péptidos). La
concentración de péptidos ascendió a 1 \mug/ml por péptido. Dos de
las 24 mezclas en total estimularon inequívocamente a células T
CD4^{+}. A causa de la disposición del experimento (aparición de
determinados péptidos en determinadas mezclas), se pudieron
identificar de forma inequívoca 2 péptidos que eran responsables de
esta estimulación. Este resultado se confirmó mediante la
estimulación con cada uno de los péptidos respectivos individuales
en las mismas condiciones. Los péptidos identificados fueron los
péptidos cercanos pp65_{365-379} y
pp65_{369-383}. Estas secuencias coinciden en gran
medida con las siguientes secuencias peptídicas descritas en la
bibliografía presentadas con HLA-DR11, que fueron
identificaron de forma convencional como secuencias estimuladores de
células T: pp65_{361-376} y
pp65_{369-384} (Khattab y col. (1998) Journal of
Medical Virology, Vol. 52, páginas 68-76), es decir,
los péptidos estimuladores se encuentran dentro de la sección
definida por los aminoácidos 361 y 384. Aún no se ha circunscrito la
secuencia del epítopo a la longitud que se va a postular de 11
aminoácidos.
Detección de interferón-\gamma
presente intracelularmente en CD3^{+}/CD8^{+} (izquierda) tras
la estimulación con las mezclas de péptidos 8, 9 y 20 o linfocitos
T CD3^{+}/CD4^{+} (derecha) tras la estimulación con los
péptidos individuales pp65_{365-379} y
pp65_{369-383}. En la detección selectiva
(derecha) se usaron mezclas de péptidos y CD3 y CD8 como marcadores
de células T. dado que las poblaciones
INF-\gamma^{+} izquierda son
CD3^{+}/CD8^{-}, se usó en la siguiente el marcador CD4. Las
células T estimuladores son inequívocamente CD4^{+}. Se
representan únicamente células CD3^{+}, se indica la intensidad de
fluorescencia media.
Claims (13)
1. Procedimiento para identificar
fragmentos proteicos estimuladores de células T que comprende las
siguientes etapas:
a) determinar la secuencia de aminoácidos de un
antígeno, el cual es una proteína o un péptido,
b) dividir la secuencia de aminoácidos
encontrada del antígeno en fragmentos proteicos,
c) sintetizar al menos un fragmento proteico con
una longitud de 8 a 30 aminoácidos o escindir la secuencia de
aminoácidos del antígeno en al menos un fragmento proteico con una
longitud de 8 a 30 aminoácidos, siendo a este respecto el fragmento
proteico una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos
determinada del antígeno,
d) incubar una suspensión que contiene células T
con el fragmento o fragmentos proteicos en mezclas de reacción
experimentales,
e) identificar
- (i)
- al menos una citocina de célula T que fue inducida mediante el fragmento o fragmentos proteicos y sintetizada en las células T, estando a este respecto las citocinas de células T presentes en el interior de la célula o unidas a la membrana celular, y/o
- (ii)
- al menos un marcador de activación expresando o incrementando en su expresión por el o los fragmentos proteícos debido a la estimulación de las células T que fue inducido por el fragmento o fragmentos proteicos o se incrementó su expresión y se expresa en las células T, pudiendo estar presente a este respecto el marcador de activación en el interior de la célula o expresado en la superficie celular,
identificándose a este respecto la citocina o
citocinas de células T o el marcador de activación por citometría
de flujo y
f) asignar las mezclas de reacción
experimentales, en las que se estimularon las células T y se
reconoció esta estimulación de células T mediante la identificación
de una citocina de células T o varias citocinas de células T y/o
uno o varios marcadores de activación a la secuencia o secuencias de
aminoácidos de los fragmentos proteicos que se incubaron con las
células T, caracterizado porque el tiempo de incubación es
tan prolongado que el fragmento o fragmentos proteicos de las
moléculas del MHC que se encuentran sobre la superficie celular se
captan de forma suficiente, en el que la captación es suficiente
cuando es posible una identificación inequívoca de células T
estimuladas y porque el tiempo de incubación de la suspensión que
contiene células T con el fragmento o fragmentos proteicos es tan
corto que no se lleva a cabo una selección y proliferación que vaya
acompañada de una eliminación dirigida de determinadas células
T.
2. Procedimiento para identificar
fragmentos proteicos estimuladores de células T según la
reivindicación 1, en el que se lleva a cabo la identificación de al
menos una citocina de células T o un marcador de activación a nivel
de células individuales.
3. Procedimiento para identificar
fragmentos proteicos estimuladores de células T según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que las suspensiones que
contienen células T contienen células que presentan el fragmento
proteico esencialmente unido a moléculas del MHC de clase I o clase
II.
4. Procedimiento para identificar
fragmentos proteicos estimuladores de células T según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que el fragmento proteico en la
presentación restringida de clase I comprende 9 a 11 aminoácidos y
el fragmento proteico en la presentación restringida de clase II
comprende al menos 11 aminoácidos.
5. Procedimiento para identificar
fragmentos proteicos estimuladores de células T según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que la suspensión que contiene
células T es una suspensión de sangre completa, glóbulos blancos de
sangre periférica (PWBC), células de bazo, células de timo, médula
ósea, licor y/o de células de ganglio linfático.
6. Procedimiento para identificar
fragmentos proteicos estimuladores de células T según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que la suspensión que contiene
células T proviene de los pacientes que deben someterse a
tratamiento, de donantes o de animales.
7. Procedimiento para identificar
fragmentos proteicos estimuladores de células T según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que los antígenos, que son
proteínas o péptidos provienen de eucariotas pluricelulares, de
células, cultivos celulares y/o tejidos de donantes o pacientes.
8. Procedimiento para identificar
fragmentos proteicos estimuladores de células T según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que las citocinas de células T
son de tipo interferón-\gamma,
TNF-\alpha o interleucina 2.
9. Procedimiento para identificar
fragmentos proteicos estimuladores de células T según una de las
reivindicaciones precedentes que comprende además la preparación de
fragmentos proteicos/péptidos identificados con el procedimiento en
fase sólida, el procedimiento en fase líquida o por medio de la
biosíntesis de proteínas en un huésped.
10. Procedimiento para identificar
fragmentos proteicos estimuladores de células T según la
reivindicación 9, en el que el fragmento proteico/péptido presenta
inserciones, deleciones o sustituciones (modificaciones), en el que
uno, dos, tres o más aminoácidos se han intercambiado, eliminado o
insertado, y en el que el fragmento proteico/péptido modificado
presenta esencialmente la misma función respecto a la estimulación
de células T que posee el fragmento proteico/péptido no
modificado.
11. Procedimiento para identificar
fragmentos proteicos estimuladores de células T según la
reivindicación 9 ó 10, en el que el fragmento proteico/péptido
posee en el extremo N-terminal y/o
C-terminal al menos otro aminoácido natural o no
natural y/o un grupo protector (modificación ampliada), y en el que
el fragmento proteico/péptido modificado de forma ampliada presenta
esencialmente la misma función respecto a la estimulación de células
T que posee el fragmento proteico/péptido no modificado.
12. Procedimiento para identificar
fragmentos proteicos estimuladores de células T según una o varias
de las reivindicaciones 9-11, en el que los
fragmentos proteicos/péptidos son adecuados para la preparación de
un medicamento para la inmunoestimulación.
13. Procedimiento para identificar
fragmentos proteicos estimuladores de células T según la
reivindicación 12, en el que la inmunoestimulación es una
vacunación o desensibilización.
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