ES2272099T3 - Composicion estable en el almacenamiento que comprende un soporte activado por acido escuarico utilizable para la inmovilizacion de compuestos que contienen grupos de amina. - Google Patents

Composicion estable en el almacenamiento que comprende un soporte activado por acido escuarico utilizable para la inmovilizacion de compuestos que contienen grupos de amina. Download PDF

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Abstract

Una composición estable en el almacenamiento que comprende un soporte que presenta grupos amina primaria y secundaria y es utilizable para la inmovilización de compuestos que contienen grupo amina, estando activado el citado medio soporte para exhibir grupos derivados de ácido escuárico electrófilos unidos al citado medio, estando el citado medio de soporte en contacto con un medio acuoso, estando comprendida la citada composición en un recipiente cerrado que no permite la evaporación del citado medio acuoso.

Description

Composición estable en el almacenamiento que comprende un soporte activado por ácido escuárico utilizable para la inmovilización de compuestos que contienen grupos de amina.
La presente invención se refiere a un soporte activado estable en almacenamiento en la forma de matrices que incluyen superficies. En particular se refiere a aquellas matrices adecuadas como soporte a las que pueden unirse covalentemente compuestos que contienen un grupo amina.
La invención se refiere también a un estuche de equipo que comprende el citado soporte activado, siendo posible expedir el estuche de equipo a los usuarios en virtud del largo tiempo de estabilidad del citado soporte.
En el contexto de esta descripción de la invención, los términos soporte/soportes, matriz/matrices y medio/medios se emplean intercambiable-mente si no se dice otra cosa.
Antecedentes de la invención
La inmovilización de biomoléculas sobre varios soportes encuentra una gran utilidad en la investigación y en la industria, y en la bibliografía están descritos muchos métodos. Estos métodos comprenden la activación de un soporte, por ejemplo, una matriz en forma de gel, una superficie de una perla de polímero, etc. El proceso de activación generalmente comprende someter el soporte a un agente reactivo que reacciona con grupos -OH o grupos amina del soporte, con lo que, ya directamente o subsiguientemente a posteriores etapas, se forman estructuras/sedes reactivas intermediarias. Estas estructuras se pueden hacer reaccionar entonces con el compuesto en cuestión, con lo que se inmoviliza el compuesto.
Ejemplos ilustrativos de tales métodos son el método de CNBr, y activación de epóxido. Los intermediarios activados obtenidos por estos métodos deben liofilizarse con el fin de poderse expedir a los usuarios. La liofilización es bastante complicada y además requiere elaboración por parte del usuario antes de poder utilizar los intermediarios liofilizados.
Estos y otros métodos de activación e inmovilización están descritos en "Técnicas de ligandos de afinidad inmovilizados" de G.T. Hermanson, Academic Press, 1992.
En la Patente internacional WO 95/15983 (Glüsenkamp y col) se describe un procedimiento de inmovilización de biomoléculas y ligandos de afinidad sobre soportes. Este procedimiento comprende la reacción de un soporte polímero aminado con un derivado ácido escuárico electrófilo bifuncional como agente de activación para formar un intermediario activado (matriz activada o medio activado o soporte activado) y la copulación de una biomolécula al soporte activado.
Se sabe comúnmente que para la mayor parte de los procesos de activación antes mencionados, los soportes activados son relativamente inestables frente a hidrólisis. Teniendo en cuenta que los medios de soporte activados comercialmente disponibles deberán tener un tiempo de vida en depósito lo más largo posible, por ejemplo de uno a varios meses, no sorprende que los productos comerciales que comprenden matrices activadas se hayan vendido típicamente en forma de composiciones liofilizadas. Los autores de la presente invención no tienen conocimiento de ningún producto comercial para medio soporte activado por escuarato que difiera del señalado antes. Al examinar la bibliografía científica, se puede ver que la mayoría de las vías sintéticas en que se obtiene material activado por escuarato, se obtienen típicamente como producto final un material cristalizado y/o desecado. En la alternativa, el material activado se usa más o menos directamente como se sintetiza. Véase, por ejemplo, Kamath y col., Gycoconjugate J. 13 (1996) 315-319; y Ola Blixt, Tesis: "Síntesis de hidratos de carbono en fase sólida enzimática". Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas, Upsala, Suecia (1999) (véase en particular la página 50); Patente DE 434 1524 (Glüsenkamp y col.); y Patente DE 19624990 (Glüsenkamp y col.). Se ha publicado una investigación de la hidrólisis de materiales activados por escuarato solubles (monoamidas) (Glüsenkamp y col. Z. Naturforsch. 46c (1991 498-501). En la parte experimental de la Patente WO 9515983 (Glüsenkamp y col.) En la parte experimental de la Patente WO 9515983 (Glüsenkamp y col.) se describe el almacenamiento de matrices aminadas activadas con escuarato humedecidas con metanol o en atmósfera de etanol. Es de esperar que la reactividad sea retenida durante estas condiciones de almacenamiento porque la reacción con metanol y etanol, respectivamente, solo significa una transesterificación que retiene el estatus éster del grupo activado y por tanto retiene su reactividad.
Sería ventajoso proporcionar un producto comercial en forma de un soporte activado que comprenda grupos escuarilo reactivos, que se suministre el citado soporte activado en medio acuoso y que tenga una vida en depósito de 1-2 meses a varios meses sin mostrar ninguna pérdida de actividad significativa. Esto es así en particular en el caso de utilización para inmovilización de compuestos hidrosolubles al medio activado, por ejemplo biomoléculas que contienen amina tales como proteínas. El medio acuoso es típicamente un líquido acuoso.
Sería ventajoso también en el caso de que de que estas composiciones estables en el almacenamiento sean resistentes frente al crecimiento microbiano.
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Otras publicaciones relacionadas con materiales activados con escuarato son las de Tietze y col. Chem. Ber. 124(5) (1991) 1215-1221, Tietze y col., Bioconjugate Chem. 2 (1991) 148-153; Hällgren y col. J. Carbohidrate Chem. 14 (4 y 5) (1995) 453-46; Ausanneau y col., Bioorganic and Medicinal Chemistry 4 (1996) 2003-2010; y Pozsgay y col. J. Org. Chem. 62 (1997) 2832-2846.
Compendio de la invención
El objeto de la presente invención es, por tanto proporcionar un soporte activado estable en el almacenamiento que comprende grupos escuarilo reactivos, suministrándose el citado soporte en un medio acuoso para utilizarlo en la inmovilización de compuestos nucleófilos, típicamente compuestos que contienen amina. El medio activado deberá ser estable durante el almacenamiento y/o resistente frente a crecimiento bacteriano a lo largo de prolongados períodos de tiempo.
Para el propósito de la invención, el término "medio activado" o "soporte activado" significa un soporte para ser utilizado como soporte para un compuesto nucleófilo. El citado soporte ha sido provisto de grupos escuarilo reactivos que permiten una fácil copulación del citado compuesto al citado soporte. El soporte activado deberá considerarse como un intermediario en el proceso de obtención de formas inmovilizadas de los citados compuestos.
Los compuestos nucleófilos contemplados en el contexto de la invención contienen típicamente un grupo amina primaria y/o secundaria, por ejemplo, proteínas u otros compuestos que presentan estructura de péptido u otras biomoléculas o compuestos orgánicos que presentan este tipo de grupos amina.
El autor de la presente invención ha descubierto ahora que sorprendentemente un soporte como el definido antes que comprende grupos amina activado con un derivado de ácido escuárico electrófilo puede permanecer estable en medio acuoso. Se ha visto, inesperadamente, que la velocidad de hidrólisis de los grupos escuarato reactivos es lo suficientemente lenta para permitir el almacenamiento de los soportes activados en medio acuoso.
Según esto, de acuerdo con la presente invención se proporciona una composición estable en el almacenamiento que comprende un soporte como el definido antes y que es utilizable para la inmovilización de compuestos nucleófilos. El soporte comprende grupos amino primarios o secundarios que han sido activados para llevar grupos derivados de ácido escuárico reactivo unidos a las citadas sedes amina primaria o secundaria sobre el citado soporte, estando el citado soporte en contacto con un medio acuoso, por ejemplo un líquido acuoso.
En un segundo aspecto de la invención se proporciona un método de preparación de tal composición. Este método se define en la reivindicación 9.
Además, de acuerdo con la invención, se proporciona un estuche de equipo (kit) para almacenamiento de la composición a lo largo de períodos de tiempo prolongados, que se define en la reivindicación 10.
La composición según la presente invención es estable a lo largo de un prolongado período de tiempo como se ha definido antes, por ejemplo, durante una semana, un mes o incluso períodos de tiempo más largos, tales como dos, tres o más meses.
En las reivindicaciones adjuntas se definen modos de realización preferidos.
Descripción detallada de la invención
Los derivados de ácido escuárico útiles para la obtención de los soportes activados se pueden seleccionar entre derivados de ácido escuárico electrófilos bifuncionales, tales como di-alcoxiésteres (por ejemplo éster dimetílico, éster dietílico, éster dibutílico y también los correspondientes diésteres mixtos (escuaratos), dihaluros y dimidazolidas. También se pueden emplear otros derivados reactivos. La reacción de activación tiene lugar normalmente en medio inerte. Véase Glüsenkamp, Patente WO 9515983. En el caso en que el grupo reactivo formado sobre el soporte sea demasiado reactivo para ser almacenado en el medio acuoso contemplado, se puede transformar fácilmente en un grupo de reactividad más baja. Por ejemplo, en el caso de emplear un dihaluro de ácido escuárico para preparar los soportes activados, el grupo monohaluro formado se puede transformar a la correspondiente función éster, por ejemplo por llevar a cabo la reacción en presencia de alcohol.
Un intermediario reactivo según la presente invención se puede representar por la fórmula general
1 
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donde
* P representa una matriz (soporte) que contiene grupos amina primaria y/o secundaria que se unen a la estructura derivada de ácido escuárico (grupo escuarilo, por ejemplo estructura escuarato) que a su vez constituye el grupo reactivo en la fórmula anterior. Frecuentemente hay varios grupos derivados de ácido escuárico reactivos (por ejemplo grupos escuarato) sobre una misma matriz P.
* A y B, independientemente uno de otro, pueden ser O ó S;
* X puede ser O ó S; y
* R puede representar un grupo orgánico inerte que junto con X y el grupo escuarilo forma una estructura electrófila.
R es, por ejemplo, un grupo hidrocarburo de C_{1} a C_{30} que comprende una o más cadenas de hidrocarburo lineales, ramificadas o cíclicas que pueden estar interrumpidas en una o más posiciones por un azufre de tioéter o un oxígeno de éter y/o estar sustituidas con uno o más grupos R'O- donde R' es hidrógeno y/o alquilo de C_{1} a C_{6} o los correspondientes análogos de azufre (R'S-). Los Rs preferidos son alquilo de C_{1} a C_{6}, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, y también pueden ser isoformas de butilo. Preferiblemente, hay como máximo un átomo de O ó de S sobre cada átomo de carbono en R.
R puede ser también un grupo imidazolida u otro grupo que dé lugar a estructura escuarato en la fórmula general que sea un grupo escuarato reactivo electrófilo sobre el soporte. En este caso la estabilidad del soporte activado será comparable a la estabilidad de los grupos mono-amida o mono-éster alquílico del ácido escuárico definidos antes (R= alquilo).
Por el término "inerte" se entiende que el R no contiene ningún grupo que afecte adversamente a la reactividad del grupo escuarilo activado mostrado. Los grupos estabilizantes en R pueden ser, por ejemplo, aminas primarias y secundarias.
Por el término "estable" se entiende que la capacidad de reaccionar con aminas primarias y secundarias queda retenida durante un tiempo prolongado sin que quede reducida significativamente o irreproduciblemente. Esto significa a su vez que el intermediario activado puede ser estable incluso si el intermediario activado participa en transesterificaciones con grupos alcohol presentes en el medio de almacenamiento, el soporte o el grupo inerte R.
Como soportes para ser activados con derivados de ácido escuárico antes definidos, se pueden utilizar matrices que presentan grupos amina primaria y/o secundaria.
Ha de entenderse que el término "matriz" abarca cualquier forma física tal como partículas, monolitos, fibras, membranas, paredes de tubos, capilares, superficies, etc. La matriz puede ser porosa o no porosa y soluble, insoluble o insolubilizable en medio acuoso u otros líquidos.
En los modos de realización preferidos de la invención, la matriz se basa en un polímero que expone una superficie hidrófila al medio acuoso utilizado, es decir, expone grupos hidroxi (-OH), carboxi (-COOH), carboxamido (-CONH_{2}, que puede estar como formas N-sustituidas), amino (-NH_{2}, que puede estar en forma sustituida). grupos oligo- o poli-etilenoxi, en su superficie externa y, si la hay, también en su superficie interna. Típicamente la matriz es de la misma clase que las normalmente utilizadas como matrices cromatográficas. El polímero puede basarse, por ejemplo, en polisacáridos, tales como dextrano, almidón, celulosa, pululano, agarosa, etc. que, si es necesario han sido reticulados, por ejemplo con bis-epóxidos, epihalohidrinas, hidrocarburos inferiores 1,2,3-trihalo-sustituidos, para proporcionar una porosidad y rigidez adecuadas. La matriz puede basarse también en polímeros sintéticos, tales como poli alcohol vinílico, poli acrilatos de hidroxialquilo, polimetacrilatos de hidroxialquilo, poli acrilamidas, poli metacrilamidas, etc. En el caso de polímeros hidrófobos, tales como los basados en bencenos divinil- o monovinil-sustituidos, las superficies de la matriz están frecuentemente hidrofilizadas para exponer grupos hidrófilos como se han definido antes a líquido acuoso circundante.
Las matrices pueden ser también de naturaleza inorgánica, por ejemplo, sílice, óxido de zirconio, etc.
Si las matrices, como tales, no presentan funcionalidad amina, se pueden derivar por métodos conocidos por los especialistas en la técnica.
El método de activación está descrito con detalle en la publicación de Patente WO citada, y no se discutirá aquí.
El medio de almacenamiento para los intermediarios en cuestión es acuoso, típicamente en forma de un líquido acuoso. Comprende preferiblemente un componente antibacterianamente activo. Este componente se selecciona preferiblemente entre los disolventes orgánicos adecuadamente miscibles con agua.
Una clase preferida de componentes son los alcoholes, en particular alcanoles, tales como metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, sec-butanol, terc-butanol. El alcohol preferido en primer lugar es etanol.
La cantidad del componente antibacteriano necesaria es una cantidad suficiente para evitar el crecimiento bacteriano o microbiano en la composición.
La composición del medio acuoso puede comprender agua, en una cantidad de 5-100%, preferiblemente 20-95%, más preferiblemente 40-85%. La cantidad de disolvente orgánico adecuadamente miscible con agua está en el intervalo 5-95%, preferiblemente 5-80%, más preferiblemente 10-60% tal como 25-60%. El porcentaje contemplado es en volumen (v/v). El disolvente orgánico es preferiblemente un alcohol miscible con agua.
El pH del medio acuoso puede estar en el intervalo de 5-9. Se pueden utilizar sistemas tampón normales que no afecten adversamente la estabilidad, por ejemplo tampón borato 0,3 M. Deberán evitarse tampones amina, en particular ajustados a un pH por debajo de 1 menos de su pKa.
Al utilizarlo, el soporte activado se pone en contacto con un compuesto orgánico que contiene un grupo amina bajo condiciones que permiten la unión del compuesto amina al soporte a través de una estructura de escuarato amida nuevamente formada. El compuesto que contiene la función amina es, preferiblemente, una molécula bioorgánica. Típicamente, el compuesto amina es un miembro de un llamado par de afinidad. Entre los ejemplos de pares de afinidad están antígeno/hapteno-anticuerpo, estructura de hidrato de carbono-lectina, secuencias de ácido nucleico complementarias y cualquier otro par ligando-receptor natural o sintético en que el ligando y el receptor son capaces de unirse entre sí por vía de afinidad. Una clase especial de pares de afinidad tiene origen biológico. Son, por tanto, conocidos como pares de bioafinidad.
La invención se describirá a continuación con detalle a través de ejemplos y con referencia al Esquema A y a la Figura 1.
Esquema A
2
En el esquema A, RNH_{2} es el compuesto que ha de inmovilizarse en la matriz. El esquema está enfocado a una clase de grupos amino introducidos. La reacción será en principio la misma para los otros grupos amino.
La Figura 1 es una gráfica que muestra la estabilidad a largo plazo de una composición según la invención. Los datos del análisis de aminoácidos mostrados corresponden a rendimientos de copulación de 75-85%. Los autores de la presente invención han inmovilizado otros ligandos con rendimientos similares o más altos.
Ejemplo 1 Preparación de perlas que contienen amina
Se introdujo la función amina en perlas de polímero (Sephacryl S-200. Amsterdam Pharmacia Biotec AB, Upsala, Suecia) de la forma dada a continuación.
Se lavaron con agua perlas epoxi-activadas y se drenaron, y se introdujeron entonces en una vasija de reacción y se añadió a la vasija un volumen igual de NH_{3} 1M. Se cerró la vasija y se sacudió en círculo en baño María a 50ºC durante 23 horas. Se lavaron las perlas con agua (>10 x volumen de gel) y se almacenaron en etanol al 20% en agua a +2 - +8ºC.
Después de la aminación, las perlas contendrán diferentes grupos amino -CH_{2}CHOHCH_{2}NH_{2} (obtenido por reacción de amoníaco con grupos epóxido), -NHCOCH_{2}CHNH_{2} (obtenido por reacción de amoniaco con grupos acrilamido) y los correspondientes grupos de reticulación obtenidos por posterior reacción con grupos epóxido y acrilamido.
Ejemplo 2 Activación de matriz aminada con 3,4-dietoxi-escuarato
El Sephacryl funcionalizado con amina (100 ml, del Ejemplo 1) almacenado en EtOH al 20% se lavó con etanol absoluto (10x1 volúmenes de gel). Las perlas se introdujeron en un matraz con tapón de rosca. Se añadió un volumen igual de etanol absoluto seguido de alcohol bencílico (unos 250 \mul/50 ml de etanol) y el escuarato (unos 1,5-2 equivalentes respecto al contenido de amina de las perlas). Se mezclaron los reactivos y se tomó inmediatamente una pequeña muestra de la fase líquida utilizada como referencia para cromatografía HPLC. Se sacudió el matraz en baño de agua a 20-60ºC. Se siguió el progreso de la reacción por cromatografía HPLC tomando pequeñas muestras de la fase líquida a intervalos regulares, diluidas 50 veces con EtOH (30 \mul en 1,5 ml) y análisis en HPLC Shimadzu. Se utilizó alcohol bencílico como patrón interno en análisis por HLPC. El grado de substitución se supuso aproximadamente igual a la cantidad consumida del reactivo escuarato.
Las perlas se lavaron con etanol al 99,5% seguido por etanol al 20%. Las perlas activadas se dividieron en muestras de 10 ml dispersas espesamente en etanol al 20% y almacenadas a 2-8ºC.
Ejemplo 3 Copulación de tripsina porcina
Las perlas activadas, almacenadas en EtOH al 20%, se lavaron con agua (unos 5x1 volumen de gel, gv), seguido de tampón borato de borato 0,3 M Na_{2}SO_{4} 1,5 M, pH 9. La solución de enzima se hizo por disolución de 100 mg de tripsina porcina en unos 10 ml Na_{2}SO_{4} 9,5 M, y tampón borato 0,3 M, pH 9 que se añadió a las perlas. La mezcla se sacudió a temperatura ambiente durante 6 horas. Las perlas se lavaron con tampón tris (0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8) 4x1 volúmenes de gel. Seguido alternativamente cuatro veces con tampón tris y acetato (0,1 M, pH 5) y por último con agua cinco veces. Se almacenó en EtOH al 20%.
Ejemplo 4 Ensayo de estabilidad
Se hicieron ensayos de estabilidad sobre los intermediarios en el modo de almacenamiento según la presente invención (el medio de almacenamiento utilizado en los ejemplos es etanol al 20% en agua, temperatura 2-8ºC) tomando muestras de los intermediarios a intervalos irregulares durante 66 semanas (más precisamente a 1, 6, 10, 12, 18, 26, 40 y 66 semanas).
Estas muestras se utilizaron para inmovilización de tripsina porcina sobre la matriz según el Ejemplo 3. El grado de substitución se investigó por análisis de aminoácidos.
La Figura 1 muestra los resultados del ensayo de almacenamiento. De esta figura se puede deducir que, dentro de los errores experimentales, los intermediarios son estables en el medio de almacenamiento acuoso a lo largo de un prolongado período de tiempo, es decir, al menos aproximadamente 66 semanas.
La composición según la invención se prepara adecuadamente por reemplazamiento del medio líquido de reacción del medio de soporte activado, por ejemplo por lavado, con el medio acuoso que en último término se utilizará para el almacenamiento de la composición.
La composición se suministra al usuario como un kit que comprende un recipiente de almacenamiento que contiene la composición, es decir, el medio activado en contacto con el medio acuoso. Este almacenamiento puede comprender frascos, ampollas, matraces y otros recipientes cerrados que no permiten la evaporación. En el caso de medios soporte en la forma de superficies abiertas (por ejemplo pocillos de una placa de microvaloración), y matrices monolíticas porosas y no porosas, tiras y similares, el propio medio puede funcionar como medio de almacenamiento, siempre que un medio con cubierta apropiada evite la evaporación de la superficie activada.

Claims (11)

1. Una composición estable en el almacenamiento que comprende un soporte que presenta grupos amina primaria y secundaria y es utilizable para la inmovilización de compuestos que contienen grupo amina, estando activado el citado medio soporte para exhibir grupos derivados de ácido escuárico electrófilos unidos al citado medio, estando el citado medio de soporte en contacto con un medio acuoso, estando comprendida la citada composición en un recipiente cerrado que no permite la evaporación del citado medio acuoso.
2. La composición según la reivindicación 1, donde el citado medio soporte activado está representado por la fórmula
3
donde:
* P representa un soporte.
* A y B, independientemente uno de otro pueden ser O ó S;
* X puede ser O ó S; y
* R representa un grupo orgánico inerte que junto con X y el grupo escuarilo forma una estructura electrófila.
3. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende además un componente antibacterianamente activo.
4. La composición según la reivindicación 3, donde el componente bacterianamente activo es un disolvente miscible con agua, preferiblemente un alcohol, en particular metanol, etanol, propanol, iso-propanol, butanol, sec-butanol, terc-butanol o etilen glicol.
5. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el medio acuoso comprende agua en una cantidad de 5-100%, preferiblemente 20-95%, más preferiblemente 40-85%, y/o un alcohol en una cantidad de 95-5%, preferiblemente 80-5%, más preferiblemente 60-25%.
6. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el citado medio acuoso comprende un alcohol en una cantidad de 5-95%, preferiblemente 5-80%, más preferiblemente 10-60%, tal como 25-60%.
7. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que es estable durante al menos 1 semana, preferiblemente durante al menos 66 semanas.
8. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el citado soporte está en forma de perlas.
9. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el pH del medio acuoso es 5-9.
10. Un método de producción de una composición estable en el almacenamiento que comprende una matriz que lleva un grupo escuarilo electrófilo reactivo, comprendiendo el citado método:
i)
reacción de la matriz que comprende grupos amina primarios y/o secundarios con un derivado de ácido escuárico nucleófilo bi-funcional con lo que se introducen grupos escuarilo sobre la matriz para dar una matriz activada
ii)
lavado de la matriz activada con un medio acuoso; y
iii)
almacenado de dicha matriz activada, en dicho medio acuoso de lavado durante al menos una semana.
11. Un estuche de equipo (kit) que comprende un medio para almacenado de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, y esta composición contenida en el citado medio de almacenado.
ES99970668T 1998-10-16 1999-10-14 Composicion estable en el almacenamiento que comprende un soporte activado por acido escuarico utilizable para la inmovilizacion de compuestos que contienen grupos de amina. Expired - Lifetime ES2272099T3 (es)

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