ES2272333T3 - Procedimiento para aumentar el nivel de una sustancia de fermentacion. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia de fermentación en un producto de fermentación, comprendiendo el procedimiento la etapa de fermentar un material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta mediante una célula de levadura, sobreexpresando dicha planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en la ID SEC Nº 2, teniendo dicho polipéptido una actividad catalítica beta-glucosidasa, aumentando de este modo, el nivel de la al menos una sustancia de fermentación en el producto de fermentación.

Description

Procedimiento para aumentar el nivel de una sustancia de fermentación.

La presente invención se refiere a un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia de fermentación en un producto de fermentación según las reivindicaciones 1 y 10, un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia aromática en un producto derivado de una planta según las reivindicaciones 2 y 12, un procedimiento para aumentar el nivel de glucosa libre en un material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta según las reivindicaciones 4 y 15, un procedimiento para aumentar el nivel de glucosa libre en una planta según las reivindicaciones 5 y 17, un procedimiento para producir un alcohol según las reivindicaciones 6 y 19, un procedimiento para producir una planta aromática según las reivindicaciones 7 y 21.

Las abreviaturas usadas en este documento incluyen: BGL1 - \beta-glucosidasa de Aspergillus niger B1, bgl1 - un ADNc que codifica ésta, 2FGlcF - fluoruro de 2-desoxi-2-fluoro-\beta-glucosilo, DNP - 2,4,-dinitrofenol; DNPGlc - 2,4-dinitrofenil \beta-D-glucopiranósido; pNP - p-nitrofenol; pNPGlc - p-nitrofenil \beta-D-glucopiranósido; MUGlc - 4-metilumbeliferil-\beta-D-glucopiranósido; YNB - base de nitrógeno para levaduras sin aminoácidos; y X-glu - 5-bromo-4-cloro-3-indolil \beta-D-glucopiranósido.

Las \beta-glucosidasas (EC 3.2.1.21; \beta-D-glucósido glucohidrolasa) juegan varios papeles importantes diferentes en biología, que incluyen la degradación de la biomasa celulósica por hongos y bacterias, la degradación de glucolípidos en lisosomas de mamíferos y la escisión de flavonoides glicosilados en plantas. Estas enzimas son, por tanto, de considerable interés industrial, no sólo como constituyentes de los sistemas de degradación de celulosa, sino también en la industria alimentaria (2,3).

Se sabe que las especies de Aspergillus son fuentes útiles de \beta-glucosidasas (4-6), y Aspergillus niger es con diferencia el productor más eficaz de \beta-glucosidasa entre los microorganismos investigados (4). Shoseyov y col. (7) han descrito previamente una \beta-glucosidasa de Aspergillus niger B1 (CMI CC 324626) que es activa a pH bajos, así como en presencia de elevadas concentraciones de etanol. Esta enzima hidroliza de forma eficaz glucósidos de compuestos aromáticos en ciertos productos a pH bajo, tales como el vino y el zumo de maracuyá, potenciando así su sabor (8-12), y es especialmente atractivo para su uso en la industria alimentaria, ya que A. niger se considera como no tóxico (3). Además, se encontró que la \beta-glucosidasa era útil en la síntesis enzimática de glucósidos (13-15). También se han purificado otras \beta-glucosidasas de A. niger (16-18), sin embargo, se han descrito diferencias entre sus propiedades, incluyendo intervalos de pesos moleculares (116-137 kDa), puntos isoeléctricos (valores de pI de 3,8-4) y pH óptimos (3,4-4,5). De hecho, se han identificado al menos dos \beta-glucosidasas, con especificidades de sustrato diferentes en preparaciones comerciales de \beta-glucosidasa de A. niger. Previamente se han descrito intentos de aclarar esta confusión clonando y expresando un gen funcional de \beta-glucosidasa de A. niger en S. cerevisiae (20), sin embargo, no se ha caracterizado la proteína y no se ha publicado la secuencia.

Las glucosidasas se han asignado a familias en función de las similitudes de secuencia, existiendo ahora unas 77 familias diferentes definidas que contienen más de 2.000 enzimas diferentes (21, véase también http://afmb.cnrs-mrs.fr/-pedro/CAZY/db.html). Con la excepción de las glucosilceramidasas (Familia 30), todas las \beta-glucosidasas sencillas pertenecen a las Familias 1 ó 3. La Familia 1 contiene enzimas de bacterias, plantas y mamíferos, que incluyen también a las 6-fosfoglucosidasas y a las tioglucosidasas. Además, la mayoría de las enzimas de la Familia 1 también tienen una actividad galactosidasa significativa. La Familia 3 contiene \beta-glucosidasas y hexosaminidasas de origen fúngico, bacteriano y vegetal. Las enzimas de ambas familias hidrolizan sus sustratos con la retención neta de la configuración anomérica, presumiblemente a través de un mecanismo en dos etapas de desplazamiento doble, que implica a dos restos de ácido carboxílico claves del centro activo (para revisiones del mecanismo, véanse 22-24). En la primera etapa, uno de los ácidos carboxílicos (el nucleófilo) ataca al centro anomérico del sustrato, mientras que el otro (el catalizador ácido/base) protona el oxígeno glucosídico, ayudando de este modo a la salida de la aglucona. Esto da lugar a la formación de un intermedio covalente \alpha-glucosil-enzima. En una segunda etapa este intermedio se hidroliza mediante el ataque general catalizado por una base del agua en el centro anomérico del glucosil-enzima, para liberar el producto \beta-glucosa y regenerar la enzima libre. Tanto la formación como la hidrólisis de este intermedio tienen lugar a través de estados de transición con un carácter sustancial de ión oxocarbenio.

Ya que la Familia 3 contiene enzimas fúngicas de masa similar, incluyendo las de otros Aspergillus sp., es probable que la \beta-glucosidasa de Aspergillus niger pudiera ser miembro de esta familia. La información mecanicista sobre esta familia es relativamente escasa, siendo la mejor caracterizada la \beta-glucosidasa de 170 kDa glucosilada de Aspergillus wentii. Marcando el centro activo con epóxido de conduritol B, se demostró que esta enzima lleva a cabo la hidrólisis, con retención neta de la configuración anomérica. Este estudio ha demostrado que el resto de ácido aspártico marcado era el mismo que el que se derivatizaba mediante el sustrato lento D-glucal (1, 25). Además, se ha demostrado que el 2-desoxiglucosil-enzima, atrapado mediante el uso del D-glucal, era cinéticamente idéntico al formado durante la hidrólisis de PNP-2-desoxi-\beta-D-glucopiranósido (26). Legler y col. (27), realizaron análisis cinéticos más detallados de la enzima, que incluían medidas de relaciones de Hammett, efectos isotópicos cinéticos y estudios de la unión de potentes inhibidores reversibles, tales como gluconolactona y nojirimicina.

Reduciendo la presente invención a la práctica, la proteína \beta-glucosidasa se aisló de Aspergillus niger, se purificó, clonó, secuenció, expresó en células hospedadoras de levaduras y se caracterizó su función enzimática. Además, la proteína, así como el péptido señal fusionado con ésta y, opcionalmente, un péptido de retención en el retículo endoplásmico fusionado con ésta, se expresaron en plantas transgénicas y se controló la liberación de sustancias aromáticas a partir de éstas tras la homogeneización. La enzima codificada por el gen aislado, según se describe anteriormente, es de utilidad conocida en la planta y/o en productos de la planta, así como en procedimientos biotecnológicos, que incluyen a la industria alimentaria. Se descubrieron varias ventajas inesperadas que incluían, pero sin limitaciones, la estabilidad de pH y temperatura de la \beta-glucosidasa de Aspergillus niger y el requerimiento de un péptido señal para obtener actividad catalítica cuando se expresa en plantas. La ventaja de un péptido de retención endoplásmica o de su carencia cuando se expresa en plantas depende de la aplicación.

Pentilla y col., 1984; Cloning of Aspergillus niger genes in yeast; Expression of the gene coding Aspergillus beta-glucosidase, Mol Gen. Genet. 194:494-499; describen la posibilidad de clonar genes de hongos filamentosos mediante la expresión en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Se hizo un banco genómico de Aspergillus niger en E. coli usando un vector lanzadera de cósmidos de levadura y se aislaron individualmente aproximadamente 10.000 clones cósmidos diferentes. Se analizó la expresión de los genes de las glicoproteínas, \beta-glucosidasas y amiloglucosidasa fúngicas secretadas en los transformantes de levaduras portadores del ADN de Aspergillus y la expresión de los genes fúngicos que complementan las mutaciones ura3 y leu2 de levadura.

De los cinco genes de Aspergillus estudiados, se descubrió que sólo uno, la \beta-glucosidasa, se expresaba en levadura y esto a un nivel bajo. Esto sugiere que hay diferencias esenciales entre los genes de levadura y los de hongos filamentosos.

Iwashita y col., 1997, número de acceso del EMBL: AB003470 se refiere al "gen bg1A de Aspergillus kawachii que codifica tanto beta-glucosidasas extracelulares como unidas a la pared celular".

Bhat M. K. y col., 1997: Cellulose degrading enzymes and their potencial industrial applications; Biotechnology Advances 15:583-620; describen la bioconversión de la celulosa en azúcares solubles y en glucosa catalizada por un grupo de enzimas denominadas celulasas. Los microorganismos que incluyen hongos, bacterias y actinomicetos producen principalmente tres tipos de componentes celulasas (endo-1,4-\beta-D-glucanasa, exo-1,4-\beta-D-glucanasa y \beta-glucosidasa) por separado o en forma de complejo. En las últimas décadas, las celulasas se han entendido mejor a nivel básico; sin embargo, queda mucho por aprender. El tremendo potencial comercial de las celulasas en diversas aplicaciones permanece como la fuerza motriz para la investigación en este área. Esta revisión resume el estado del conocimiento actual sobre las celulasas microbianas y sus aplicaciones.

Dekker R. F. H. 1986, 28:1438-1442, describe las propiedades cinéticas de inhibición y estabilidad de una preparación comercial de celobiasa, \beta-d-glucosidasa de Aspergillus niger y su idoneidad para la hidrólisis de la lignocelulosa, biotecnología y biomanipulación genética.

Zhou S. y col., 1999: Engineering endoglucanase-secreting strains of ethanologenic Klebsiella oxytoca P2. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 22:600-607 se refiere a la Klebsiella oxytoca P2 recombinante desarrollada como un biocatalizador para la sacarificación y fermentación simultáneas (SFS) de la celulosa mediante la integración cromosómica de genes de Zymomonas mobilis (pdc, adhB) que codifican la ruta del etanol. Esta cepa contiene la capacidad nativa para transportar y metabolizar la celobiosa, eliminando la necesidad de suplementar con \beta-glucosidasa durante la SFS. Para aumentar la utilidad de este biocatalizador, ahora hemos integrado cromosómicamente el gene ceIZ que codifica la endoglucanasa principal de Erwinia chrysantemi. Este gen se expresaba a niveles elevados sustituyendo el promotor nativo por un promotor sustituto derivado del ADN de Z. mobilis. Con la adición de genes externos que codifican el sistema de secreción de proteínas de tipo II de E. chrysanthemi, más de la mitad de la endoglucanasa activa (EGZ) se secretaba al medio extracelular. Las dos cepas más activas, SZ2(pCPP2006) y SZ6(pCPP2006), producían aproximadamente 24.000 U.l^{-1} de actividad CMCasa, equivalente al 5% de la proteína celular total. La EGZ recombinante despolimerizaba parcialmente la celulosa empapada en ácido y permitía la producción de pequeñas cantidades de etanol por SZ6(pCPP2006) sin la adición de celulosa fúngica. Sin embargo, se requerirán actividades endoglucanasa adicionales para completar la despolimeración de la celulosa en pequeños productos solubles que puedan ser metabolizados de forma eficaz a etanol.

Shoseyov y col., 1990; Immobilized endo-beta-glucosidase enriches flavor of wine and passion fruit juice, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 38:1387-1390, se refieren a una endo-\beta-glucosidasa de Aspergillus niger inmovilizada en perlas acrílicas, así como en partículas de celulosa de hojas y troncos de maíz. La eficacia de la inmovilización a pH 6,5 en las partículas acrílicas, con respecto a la actividad era mayor que la de la celulosa, pero seguía siendo baja (10%). Sin embargo, se lograba una eficacia de inmovilización mayor para la celulosa (30%) a pH 4,5. La estabilidad térmica de la enzima se mejoraba mediante su inmovilización por ambos procedimientos. Se usaron endo-\beta-glucosidasas libres e inmovilizadas para tratar vino Muscat Roy y zumo de maracuyá (pH 2,45). El análisis por CG-EM, así como la evaluación sensorial, indicaba un aumento significativo en los compuestos aromáticos, en alcoholes monoterpernos y en óxidos de linalool del benzaldehido, que es un glucósido cianogénico como evidencia de la evolución de la cianida que sigue al tratamiento enzimático.

El procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia de fermentación en un producto de fermentación se define en las reivindicaciones 1 y 10, un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia aromática en un producto derivado de una planta se define en las reivindicaciones 2 y 12, un procedimiento para aumentar el nivel de glucosa libre en un material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta se define en las reivindicaciones 4 y 15, un procedimiento para aumentar el nivel de glucosa libre en una planta se define en las reivindicaciones 5 y 17, un procedimiento para producir un alcohol se define en las reivindicaciones 6 y 19, un procedimiento para producir una planta aromática se define en las reivindicaciones 7 y 21.

Según aspectos adicionales en realizaciones preferidas de la invención descrita a continuación, el polinucleótido es como se nuestra en las ID SEC Nº 1, 3 o una porción de las mismas.

Según aún aspectos adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la construcción de ácido nucleico además comprende al menos un elemento de control que actúa en cis para regular la expresión del polinucleótido.

Según aún aspectos adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la célula hospedadora se selecciona entre el grupo constituido por una célula procariota y una célula eucariota.

Según aún aspectos adicionales en las realizaciones preferidas descritas la célula procariota es E. coli.

Según aún aspectos adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la célula eucariota se selecciona entre el grupo constituido por una célula de levadura, una célula fúngica, una célula vegetal y una célula animal.

Según aún aspectos adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el polipéptido es como se muestra en la ID SEC Nº 2 o una porción de la misma que tiene la actividad catalítica \beta-glucosidasa.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir \beta-glucosidasa recombinante, comprendiendo el procedimiento la etapa de introducir, en una forma expresable, una construcción de ácido nucleico en una célula hospedadora, incluyendo la construcción de ácido nucleico un polinucleótido genómico, complementario o compuesto, derivado preferiblemente de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa y preferiblemente además codifica, en fase, un péptido señal y un péptido de retención en el retículo endoplásmico.

Según aspectos adicionales en realizaciones preferidas de la invención descrita a continuación, el procedimiento además comprende la etapa de extraer el polipéptido que tiene actividad catalítica \beta-glucosidasa.

Según aún un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir una célula que sobreexpresa \beta-glucosidasa recombinante, comprendiendo el procedimiento la etapa de introducir, en una forma expresable, una construcción de ácido nucleico en una célula hospedadora, incluyendo la construcción de ácido nucleico un polinucleótido genómico, complementario o compuesto, derivado preferiblemente de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa y, preferiblemente además codifica, en fase, un péptido señal y un péptido de retención en el retículo endoplásmico.

Según aún un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia de fermentación en un producto de fermentación, comprendiendo el procedimiento la etapa de fermentar un material inicial de fermentación que contiene glucosa mediante una célula de levadura que sobreexpresa una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto, derivado preferiblemente de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene actividad catalítica \beta-glucosidasa y preferiblemente además codifica, en fase, un péptido señal y un péptido de retención en el retículo endoplásmico, aumentando, de este modo, el nivel de la al menos una sustancia de fermentación en el producto de
fermentación.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia de fermentación en un producto de fermentación, comprendiendo el procedimiento la etapa de fermentar un material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta mediante una célula de levadura, sobreexpresando la planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto, preferiblemente derivado de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene actividad catalítica \beta-glucosidasa y preferiblemente además codifica, en fase, un péptido señal y un péptido de retención en el retículo endoplásmico, aumentando, de este modo, el nivel de la al menos una sustancia de fermentación en el producto de fermentación.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia aromática en un producto derivado de una planta, comprendiendo el procedimiento la etapa de incubar un material inicial de una planta que contiene glucosa con una célula de levadura que sobreexpresa una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto, preferiblemente derivado de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene actividad catalítica \beta-glucosidasa y preferiblemente además codifica, en fase, un péptido señal y un péptido de retención en el retículo endoplásmico, aumentando, de este modo, el nivel de la al menos una sustancia aromática en el producto derivado de la planta.

Según aún un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia aromática en un producto derivado de una planta, comprendiendo el procedimiento la etapa de incubar un material inicial de una planta que contiene glucosa con una célula de levadura, sobreexpresando dicha planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto, preferiblemente derivado de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene actividad catalítica \beta-glucosidasa y preferiblemente además codifica, en fase, un péptido señal y un péptido de retención en el retículo endoplásmico, aumentado de este modo el nivel de al menos una sustancia aromática en el producto derivado de la planta.

Según otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el producto derivado de la planta es un producto de fermentación, tal como, pero sin limitaciones, una bebida alcohólica.

Según aún un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el nivel de glucosa libre en un material inicial de fermentación que contiene glucosa, comprendiendo el procedimiento la etapa de fermentar el material inicial de fermentación que contiene glucosa mediante una célula que sobreexpresa una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto, preferiblemente derivado de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa y preferiblemente además codifica, en fase, un péptido señal y un péptido de retención en el retículo endoplásmico, aumentado de este modo el nivel de la glucosa libre en el material inicial de fermentación que contiene glucosa.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el nivel de glucosa libre en un material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta, comprendiendo el procedimiento la etapa de fermentar el material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta mediante una célula, sobreexpresando la planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto, preferiblemente derivado de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa y preferiblemente además codifica, en fase, un péptido señal y un péptido de retención en el retículo endoplásmico, aumentando, de este modo, el nivel de glucosa libre en la planta.

Según todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el nivel de glucosa libre en una planta, comprendiendo el procedimiento la etapa de sobreexpresar en la planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto, preferiblemente derivado de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa y preferiblemente además codifica, en fase, un péptido señal y un péptido de retención en el retículo endoplásmico, aumentando, de este modo, el nivel de glucosa libre en la planta.

Según aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir un alcohol, comprendiendo el procedimiento la etapa de fermentar un material inicial de fermentación que contiene glucosa mediante una célula que sobreexpresa una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto, derivado preferiblemente de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa y, preferiblemente, además codifica, en fase, un péptido señal y un péptido de retención en el retículo endoplásmico, y extraer el alcohol de la misma.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir un alcohol, comprendiendo el procedimiento la etapa de fermentar un material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta, sobreexpresando la planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto, derivado preferiblemente de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa y preferiblemente, además codifica, en fase, un péptido señal y un péptido de retención en el retículo endoplásmico, y extraer el alcohol de la misma.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir una planta aromática, comprendiendo el procedimiento la etapa de sobreexpresar en la planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto, derivado preferiblemente de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa y, preferiblemente además codifica, en fase, un péptido señal y un péptido de retención en el retículo endoplásmico, aumentando, de este modo, el aroma que difunde la planta.

Según características adicionales en realizaciones preferidas de la invención descritas a continuación, la sobreexpresión de la construcción de ácido nucleico se realiza de manera específica de tejido.

Según otras características adicionales de las realizaciones preferidas descritas, la sobreexpresión de la construcción de ácido nucleico se limita a al menos un tejido seleccionado entre el grupo constituido por la flor, el fruto, la semilla, la raíz, el tronco, el polen y las hojas.

Las presente invención aborda con éxito las deficiencias de las configuraciones actualmente conocidas proporcionando un polipéptido que tiene actividad enzimática \beta-glucosidasa, un polinucleótido que codifica el polipéptido, construcciones de ácido nucleico que llevan el polinucleótido, células transformadas o infectadas, tales como células de levadura, y organismos que expresan el polinucleótido y diversos usos del polipéptido, el polinucleótido, las células y/u organismos, que incluyen, pero sin limitaciones, la producción de un polipéptido recombinante que tiene actividad enzimática \beta-glucosidasa, aumentar el nivel de compuestos aromáticos en las bebidas alcohólicas, así como en otros productos de fermentación de material de la planta, hidrolizar la celobiosa y, de este modo, aumentar el nivel de glucosa fermentable y/o libre, para aumentar la producción de un producto de fermentación, tal como el etanol a partir de material de la planta, aumentado el aroma que se libera de una planta o de un producto de la planta, y la hidrólisis o transglicosilación de glucósidos.

La invención se describe en este documento, sólo a modo de ejemplo, en referencia a los dibujos que la acompañan. Ahora, con referencia específica a los dibujos en detalle, se enfatiza que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y sólo con el fin de ilustrar la descripción de las realizaciones preferidas de la presente invención, y se presentan por el hecho de proporcionar lo que se cree que es la descripción más útil y fácil de entender de los principios y aspectos conceptuales de la invención. A este respecto, no se pretende mostrar detalles estructurales de la invención en más detalle que lo necesario para un entendimiento básico de la invención, haciendo aparente a los expertos en la materia la descripción con los dibujos de como pueden expresarse en la práctica las diversas formas de la
invención.

En los dibujos:

Las Figuras 1a-c muestran los mapas de los plásmidos empleados como vectores de expresión para el ADNc de bgl1. Figura 1a - vector de expresión de E. coli que contiene el ADNc de bgl1 insertado en los sitios NcoI/BamHI de pET3d. Figura 1b - vector de expresión de S. cerevisiae que contiene el ADNc de bgl1 insertado en los sitios HindIII/BamHI del plásmido pYES2-bgl1. Figura 1c - vector de expresión de P. pastoris que contiene el ADNc de bgl1 insertado en los sitios EcoRI/BamHI de pHIL-S1.

Las Figuras 2a-b muestran el análisis en SDS-PAGE de las muestras de proteína activa eluidas de una columna Mono-Q, teñidas con azul de Coomassie (Figura 2a) o el zimograma de \beta-glucosidasa (Figura 2b) usando como sustrato MUGlc. Carriles (para ambas Figuras, 2a y 2b): 1 - banda de BGL1 electroeluida a partir de fragmentos de un gel SDS-PAGE preparativo; 2, 3, 4, 5 - precipitados con acetona de la separación en Mono-Q de BGL1.

La Figura 3 muestra el análisis por SDS-PAGE de la \beta-glucosidasa purificada mediante Mono-Q y Resource-S. Carriles: 1. - extracto en bruto (27,5 \mug de proteína); 2- fracción activa después de Mono-Q (7 \mug de proteína); y 3 - fracción activa después de Resource-S (10 \mug de proteína).

La Figura 4 muestra el análisis por SDS-PAGE de la \beta-glucosidasa desglicosilada con N-glicosidasa-F. Carriles: 1 -
marcadores de peso molecular; 2 - \beta-glucosidasa nativa y 3 - proteína desglicosilada.

La Figura 5a muestra las secuencias de ADN y de aminoácidos de bgl1. Se subrayan las secuencias de aminoácidos determinadas mediante degradación de Edman. Se subrayan las secuencias de ADN de los intrones. El péptido señal se indica con letras cursivas.

La Figura 5b muestra la organización del gen bgl1. Los exones (E1-7) se indican mediante recuadros rellenos, los intrones mediante líneas continuas, los sitios de restricción y el codón de parada mediante flechas.

La Figura 6a muestra un análisis por inmunotransferencia del BGL1 recombinante expresada en S. cerevisiae. Carriles: 1 - BGL1 nativo (control positivo); 2 - extracto de proteína total de S. cerevisiae que expresa la BGL1 recombinante; 3 - extracto de proteína total de S. cerevisiae sin el vector de expresión de bgl1 (control negativo).

La Figura 6b muestra un análisis por inmunotransferencia de la BGL1 recombinante secretada a partir de P. pastoris. Carriles: 1- marcadores de peso molecular; 2 - sobrenadante del medio de P. pastoris que expresa la BGL1 recombinante; 3 - sobrenadante del medio del huésped P. pastoris sin el vector (control negativo).

La Figura 7 muestra un espectro de RMN de protón, que ilustra el curso estereoquímico de la hidrólisis de pNPGlc por la \beta-glucosidasa de A. niger. Los espectros son de la región del protón anomérico del sustrato a diferentes intervalos de tiempo con respecto a la adición de la enzima.

La Figura 8 muestra la inactivación de BGL1 recombinante por 2FGlcF. La enzima pura se incubó en presencia de diversas concentraciones del inactivador y se determinó la actividad enzimática residual a diferentes intervalos de tiempo. Se presenta la actividad residual, semilogarítmicamente, frente al tiempo, en presencia de las concentraciones indicadas de inactivador.

La Figura 9 muestra la reactivación de 2-desoxi-2-fluoroglucosil - BGL1 recombinante por linamarina. La actividad se representa frente al tiempo de incubación en presencia de las concentraciones indicadas de linamarina.

La Figura 10 muestra la estabilidad de la \beta-glucosidasa recombinante de A. niger a diversas temperaturas. La actividad se calcula como el porcentaje de una solución de enzima recombinante mantenida a 4ºC.

Las Figuras 11a-c muestran esquemas de los casetes de expresión usados para la expresión de la \beta-glucosidasa de A. niger en plantas de tabaco. Figura 11a - un casete que codifica BGL1 sin péptido señal (véase, la ID SEC Nº 13 para la secuencia de nucleótidos y la ID SEC Nº 14 para la secuencia de aminoácidos); Figura 11b - un casete que codifica una BGL1 fusionada con un péptido señal Cel1 para la secreción dentro del apoplasto (véase, la ID SEC Nº 15 para la secuencia de nucleótidos y la ID SEC Nº 16 para la secuencia de aminoácidos) y Figura 11c - un casete que codifica una BGL1 fusionada con el péptido señal Cel1 como en la Figura 11b y además con el péptido de retención en el RE, HDEL (ID SEC Nº 17) en el extremo C-terminal para la acumulación en el RE (véase, la ID SEC Nº 18 para la secuencia de nucleótidos y la ID SEC Nº 19 para la secuencia de aminoácidos).

La Figura 12 muestra los resultados de la amplificación por PCR del ADNc de bgl1 que indica la presencia del ADNc de bgl1 en las plantas transgénicas. CB10 y CB11 - plantas transgénicas transformadas con bgl1 y con el péptido señal Cel1 sin el péptido de retención en el RE, HDEL. CBT3, CBT8 y CBT15 - diferentes líneas transgénicas transformadas con bgl1, péptido señal Cel1 y HDEL. B1 - plantas transgénicas transformadas con bgl1. 1 kb - marcador de ADN de 1 kb. TS - planta de tipo natural no transgénica. pETB1 - ADN plasmídico de bgl1.

Las Figuras 13a-b muestran los análisis por inmunoelectroforesis de plantas transgénicas que contiene BGL1 sin el péptido señal (13a), y BGL1 con el péptido señal Cel1 (13b), con y sin el péptido de retención en el RE, HDEL. An gluco - \beta-glucosidasa de A. niger purificada. TS - planta no transgénica control. B1, B15, B16, B20, B27, B33 y
B34 - diferentes líneas transgénicas transformadas con bgl1. CBT1, CBT3, CBT7 y CBT8 - diferentes líneas transgénicas transformadas con bgl1, el péptido señal Cel1 y HDEL. CB10 y CB12 - plantas transgénicas transformadas con bgl1 y el péptido señal Cel1 sin el péptido de retención en el RE, HDEL.

La Figura 14 muestra el análisis en gel de la actividad de extractos de plantas transgénicas de tabaco en SDS-PAGE incubado con MUGlu. TS - planta no transgénica control. CB10 y CB11 - dos líneas independientes de plantas transgénicas que expresan BGL1 fusionada con el péptido señal Cel1 (sin HDEL). CBT3, CBT8 y CBT15 - líneas independientes de plantas transgénicas que expresan BGL1 fusionada con el péptido señal Cel1 en el extremo N-terminal y con el péptido de retención en el RE, HDEL, en el extremo C-terminal. B1 y B34 - plantas transgénicas que expresan BGL1 sin péptido señal o péptido de retención en el RE, HDEL, y que eran positivas para la proteína BGL1 en el análisis por inmunotransferencia. An gluco - control de \beta-glucosidasa nativa de A. niger.

La Figura 15 muestra el nivel de actividad BGL1 en diferentes plantas transgénicas. TS - planta no transgénica control. B1 y B2 - plantas transgénicas que expresan BGL1 sin el péptido señal o el péptido de retención en el RE, HDEL y que eran positivos para BGL1 en el análisis por inmunoelectroforesis. CBT8, CBT21, CBTO y CBT15 - líneas independientes de plantas transgénicas que expresan BGL1 fusionada con el péptido señal Cel1 en el extremo N-terminal y con el péptido de retención en el RE, HDEL en el extremo C-terminal. CB12, CB13, CB14 y CB15 -
cuatro líneas independientes de plantas transgénicas que expresan BGL1 fusionada con el péptido señal Cel1 (sin HDEL).

Los principios y el funcionamiento de la presente invención pueden entenderse mejor con referencia a los dibujos y descripciones que la acompañan.

Antes de explicar en detalle al menos una realización de la invención, debe entenderse que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles de los componentes mostrados en la siguiente descripción o ilustrados en los siguientes ejemplos. La invención es apta para otras realizaciones o para ponerse en práctica o realizarse de diversas formas. También, se entenderá que la fraseología y terminología empleadas en este documento es para los fines de la descripción y no debe considerarse como limitante.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido genómico, complementario o compuesto que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa. Preferiblemente, el polinucleótido deriva de Aspergillus niger, sin embargo puede aplicarse a otras fuentes. Estas incluyen todos los polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos que tiene actividad catalítica \beta-glucosidasa. Estos polinucleótidos y polipéptidos identificados mediante sus números de Acceso a GenBank, se enumeran en la Tabla 1 a continuación, todos los cuales pueden usarse en el desarrollo de la presente
invención.

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TABLA 1 Números de acceso de los ADNc y sus beta-glucosidasas codificadas (EC.3.2.1.21)

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1

2

3

4

5

6

Según se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones que sigue, el término "aislado" se refiere a un componente biológico (tal como un ácido nucleico o proteína u orgánulo) que se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos de la célula del organismo en el que el componente aparece de forma natural, es decir, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, proteínas y orgánulos. Los ácidos nucleicos y proteínas que se han "aislado" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificadas mediante procedimientos de purificación convencionales. El término también incluye a ácidos nucleicos y proteínas preparados mediante expresión recombinante en una célula hospedadora así como ácidos nucleicos sintetizados químicamente.

Según se usa en este documento y en la sección de reivindicaciones que sigue, los términos y expresiones "polinucleótido" y "secuencia polinucleotídica" se usan de forma indistinta y se refieren a una secuencia de nucleótidos que puede ser ADN o ARN de, por ejemplo, origen genómico o sintético, que puede ser de cadena sencilla o doble y que puede representar la cadena sentido o la complementaria. De forma similar, las expresiones "polipéptido" y "secuencia polipeptídica" se usan de forma indistinta en este documento y se refieren a una secuencia de aminoácidos de cualquier longitud.

Según se usa en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones que sigue, la expresión "secuencia polinucleotídica complementaria" incluye secuencias, que originalmente proceden de la transcripción inversa de un ARN mensajero usando una transcriptasa inversa o cualquier otra ADN polimerasa dependiente de ARN. Estas secuencias pueden amplificarse posteriormente in vivo o in vitro usando una ADN polimerasa dependiente de ADN.

Según se usa en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones que sigue, la expresión "secuencia polinucleotídica genómica" incluye secuencias que originalmente derivan de un cromosoma y reflejan una porción contigua de un cromosoma.

Según se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones que sigue, la expresión "secuencia polinucleotídica compuesta" incluye secuencias que son al menos parcialmente complementarias y al menos parcialmente genómicas. Una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias exónicas requeridas para codificar el polipéptido que tiene la actividad catalítica \beta-glucosidasa, así como algunas secuencias intrónicas interpuestas entre ellas. Las secuencias intrónicas pueden ser de cualquier fuente, incluyendo de otros genes, y típicamente incluirán secuencias señales de empalme conservadas. Estas secuencias intrónicas pueden además incluir elementos reguladores de la expresión que actúan en cis, como se describen más adelante en este documento.

Según se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones que sigue, la expresión "que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa " se refiere a una secuencia polipeptídica, proteína o fragmentos de la misma capaces de servir como catalizadores de una reacción química que implica la hidrólisis del enlace O-glucosídico de los glucósidos, cuyo resultado es la liberación de restos \beta-D-glucosa o una aglucona, además del resto \beta-D-glucosa. Específicamente, la hidrólisis mediante enzimas de retención se realiza mientras que se mantiene la configuración \beta del centro anomérico del hidrato de carbono. Existe una amplia especificidad por \beta-glucósidos, de este modo, algunos ejemplos también hidrolizan uno o más de los siguientes: \beta-D-galactósidos, \alpha-L-arabinósidos, \beta-D-xilósidos y \beta-D-fucósidos.

Según se usa en este documento, el término "catalizador" se refiere a una sustancia que acelera una reacción química, pero no se consume o cambia de forma permanente por ella.

Según se usa en este documento, el término "glucósido" se refiere a un compuesto de al menos dos monómeros, al menos uno de los cuales es una glucosa, que incluye un enlace glucósido. Los ejemplos de glucósidos incluyen, pero sin limitaciones, esqueletos que contienen glucosa, tales como la diglucosa celobiosa y el polímero de glucosa, celulosa.

Según las realizaciones preferidas, el polinucleótido según este aspecto de la presente invención codifica un polipéptido como se muestra en la ID SEC Nº 2 o una porción de la misma que retiene la actividad catalítica \beta-glucosidasa.

Alternativa o adicionalmente, el polinucleótido según este aspecto de la presente invención es como se muestra en las ID SEC Nº 1, 3 o una porción de las mismas, la porción codifica un polipéptido que retiene la actividad catalítica \beta-glucosidasa.

En un aspecto más amplio, los polinucleótidos según la presente invención codifican un polipéptido que es al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o más, es decir el 95%-100% homólogo con la ID SEC Nº 2 según se determina usando el programa BestFit del paquete de análisis de secuencia de Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, en el que la penalización por creación de huecos es igual a 8 y la penalización por extensión de huecos es igual a 2.

Según las realizaciones preferidas, los polinucleótidos según el aspecto más amplio de la presente invención codifican un polipéptido como se muestra en las ID SEC Nº 1 ó 3 o una porción de las mismas que retiene la actividad.

Alternativa o adicionalmente, los polinucleótidos según este aspecto más amplio de la presente invención se hidrolizan con las ID SEC Nº 1 ó 3.

La hibridación para ácidos nucleicos largos (por ejemplo, de más de 200 pb de longitud) se lleva a cabo según realizaciones preferidas de la presente invención mediante hibridación rigurosa o moderada, en la que la hibridación rigurosa se lleva a cabo mediante una solución de hibridación que contiene sulfato de dextrano al 10%, NaCl 1 M, SDS al 1% y 5 x 10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P, a 65ºC, con una solución de lavado final de 0,2 x SSC y SDS al 0,1% y un lavado final a 65ºC, mientras que la hibridación moderada se lleva a cabo mediante una solución de hibridación que contiene sulfato de dextrano al 10%, NaCl 1 M, SDS al 1% y 5 x 10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P, a 65ºC, con una solución de lavado final de 1 x SSC y SDS al 0,1%, y un lavado final a 50ºC.

Además alternativa o adicionalmente, los polinucleótidos según este amplio aspecto de la presente invención son preferiblemente al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o más, es decir el 95%-100%, idénticas a la ID SEC Nº 1 ó 3 según se determina usando el programa BestFit del paquete de análisis de secuencia de Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, en el que el peso del hueco es igual a 50, el peso de la longitud es igual a 3, la coincidencia media es igual a 10 y la falta de coincidencia media es igual a -9.

De ese modo, este amplio aspecto de la presente invención abarca (i) polinucleótidos como se muestra en las ID SEC Nº 1 ó 3; (ii) fragmentos de los mismos; (iii) secuencias hibridables con éstas; (iv) secuencias homólogas a éstas; (v) secuencias que codifican polipéptidos similares con un uso de codones diferente; (vi) secuencias alteradas caracterizadas por mutaciones, tales como deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, naturales o inducidos por el hombre, aleatorios o de manera dirigida.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico aislado descrito en este documento.

Según una realización preferida, la construcción del ácido nucleico según este aspecto de la presente invención además comprende al menos un elemento de control (regulador) que actúa en cis para regular la expresión del ácido nucleico aislado. Estos elementos reguladores que actúan en cis incluyen, por ejemplo, promotores que se sabe son elementos de secuencia requeridos para la transcripción ya que sirven para unirse a la ARN polimerasa dependiente de ADN, que transcribe las secuencias después del extremo 3' de ésta. Detalles adicionales relativos a diversos elementos reguladores se describen más adelante en este documento.

Mientras que el ácido nucleico aislado descrito en este documento es un elemento esencial de la invención, éste es modular y puede usarse en diferentes contextos. El promotor elegido que se usa junto con esta invención es de importancia secundaria y comprenderá cualquier promotor adecuado. Sin embargo, un experto en la materia apreciará que es necesario asegurarse de que los sitios de inicio de la transcripción estén localizados antes del extremo 5' de una fase de lectura abierta. En una realización preferida de la presente invención, el promotor que se selecciona comprende un elemento que está activo en las células hospedadoras en particular de interés. Estos elementos pueden seleccionarse a partir de reguladores transcripcionales que activan la transcripción de genes esenciales para la supervivencia de estas células en condiciones de estrés o falta de nutrientes, incluyendo las proteínas de choque térmico.

Una construcción según la presente invención preferiblemente incluye además un marcador seleccionable apropiado. En una realización más preferida según la presente invención, la construcción además incluye un origen de replicación. En otra realización más preferida según la presente invención, la construcción es un vector lanzadera, que puede tanto propagarse en E. coli (en la que la construcción comprende un marcador seleccionable y un origen de replicación apropiados) como ser compatible para su propagación en células, o integración en el genoma de un organismo de elección, como una planta. Según este aspecto de la presente invención, la construcción puede ser, por ejemplo, un plásmido, un bácmido, un fagémido, un cósmido, un fago, un virus o un cromosoma artificial.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una proteína recombinante que comprende una proteína recombinante que comprende un polipéptido que tiene actividad catalítica \beta-glucosidasa. El polipéptido preferiblemente deriva de un Aspergillus niger y, preferiblemente, incluye un péptido señal y opcionalmente un péptido de retención en el retículo endoplásmico.

Según realizaciones preferidas, el polipéptido según este aspecto de la presente invención es como se muestra en la ID SEC Nº 2 o una porción del mismo que retiene la actividad catalítica \beta-glucosidasa.

La ID SEC Nº 2 de la \beta-glucosidasa de A. niger es similar a la secuencia de aminoácidos de la \beta-glucosidasa de A. kawachii. Sin embargo, mientras que la primera es muy estable a un amplio intervalo de temperaturas y tratamientos de pH, la última es relativamente inestable y, por tanto, tiene ciertas desventajas, que hacen que su uso, para el fin de la presente invención según se detalla a continuación y se describe a partir de aquí, sea inviable y/o mucho menos atractivo.

Recientemente, Iwashita y colaboradores han publicado la secuencia de una \beta-glucosidasa (GenBank/EMBL AB003470) obtenida de la cepa IF04308 de Aspergillus kawachii. La comparación de secuencias entre la \beta-glucosidasa de Aspergillus kawachii y la \beta-glucosidasa de A. niger reveló que las dos comparten un 98% de homología.

Las enzimas de los dos Aspergillus sp., contienen siete restos de cisteína y un número idéntico de sitios de glucosilación, mientras que difieren en su grado de glucosilación (35).

Se describieron las propiedades físicas y cinéticas de tres \beta-glucosidasas de Aspergillus kawachii (35) y se demostró que las tres son productos del mismo gen, que difieren únicamente en el grado de glucosilación. Las tres \beta-glucosidasas purificadas de A. kawachii se inactivaban fácilmente, incluso en condiciones de pH y temperatura moderadas. En clara distinción, el examen de la estabilidad de la \beta-glucosidasa recombinante de A. niger según la presente invención en condiciones idénticas a las descritas por Iwashita y col. y como se describe a continuación en este documento en la sección de Ejemplos, reveló que la enzima es muy estable, reteniendo la mayoría de la actividad enzimática incluso tras 1 hora de incubación a 60ºC (el 68% de actividad, definido por el porcentaje de actividad de una enzima mantenida a 4ºC).

De este modo, a pesar de la similitud entre las \beta-glucosidasas de A. kawachii y de A. niger, la enzima de A. niger mostraba de forma inesperada una estabilidad térmica y de pH significativamente mayor.

Según aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula hospedadora que comprende una construcción de ácido nucleico como se describe en este documento. La expresión "célula hospedadora" se refiere al receptor de un ácido nucleico heterólogo, esta célula hospedadora puede ser una célula procariota, tal como E. coli, o una célula eucariota, tal como una célula de levadura, una célula de un hongo filamentoso, una célula vegetal o una célula animal. Ejemplos de célula de levadura incluyen, pero sin limitaciones, Pichia sp., tal como P. pastoris, y Saccharomyces sp., tal como S. cerevisiae.

Según se usa en este documento y en la sección de reivindicaciones que sigue, el término "heterólogo" cuando se usa en el contexto de una secuencia de ácido nucleico o de una proteína encontrada en una planta, tejido derivado de una planta o en células de una planta, o alternativamente, en una célula eucariota, tal como una levadura, o en una célula procariota, tal como bacterias, se refiere a secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos generalmente no nativos de la planta, del tejido derivado de la planta o de las células de la planta, o alternativamente, de la célula eucariota, tal como una levadura, o de la célula procariota, tal como bacterias. De forma indistinta, las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos generalmente no nativas de la planta, del tejido derivado de la planta o de las células de la planta, o alternativamente, de la célula eucariota, como una levadura, o de la célula procariota, como bacterias, se denominan "ácido nucleico recombinante" y "proteína recombinante", respectivamente. De este modo, un ácido nucleico recombinante es aquel que tiene una secuencia que no aparece de forma natural o que tiene una secuencia que se hace mediante una combinación artificial de cualesquiera otros dos segmentos de secuencia separados. Esta combinación artificial a menudo se logra mediante síntesis química o, más frecuentemente, mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética.

Según se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones que sigue, la expresión "célula eucariota" se refiere a una célula que contiene un genoma diploide durante al menos una porción de su ciclo vital, teniendo un núcleo rodeado de una membrana con cromosomas compuestos de ADN, con una división celular que implica una forma de mitosis en la que están implicados husos. La posesión de un tipo eucariota de célula es característica de los cuatro reinos, Protoctista, Fungi, Plantae y Animalia.

Según se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones que sigue, la expresión "célula procariota" se refiere a diversas bacterias y algas verdeazuladas, caracterizadas por la ausencia de la organización nuclear, capacidades mitóticas y orgánulos complejos que tipifican al superreino eucariota. Ejemplos de células procariotas según la presente invención son las bacterias, tales como, pero sin limitaciones, E. coli.

Según aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un organismo que comprende una construcción de ácido nucleico según se describe en este documento, tal como, pero sin limitaciones, una planta. Se dice que este organismo está transformado o infectado por un virus.

Según se usa en este documento, el término "transformado" y sus conjugaciones, tales como transformación, transformando y transformar, se relacionan todas con el procedimiento de introducción de secuencias de ácido nucleico heterólogo en una célula o en un organismo, de modo que estas secuencias de nucleótidos se propagan a la descendencia. De este modo, el término incluye, por ejemplo, "modificado genéticamente", "transgénico" y "transfectado", el cual puede usarse en este documento para describir adicionalmente y/o reivindicar la presente invención. El término se refiere a la introducción de una secuencia de ácido nucleico heterólogo en el genoma de un organismo y/o en el geno-
ma de un orgánulo de éste que contiene ácido nucleico, tal como en el genoma de un cloroplasto o una mitocondria.

Según se usa en este documento, la expresión "infectado por virus" incluye la infección por un virus portador de una secuencia de ácido nucleico heterólogo. Típicamente, esta infección da lugar a una expresión transitoria de la secuencia de ácido nucleico, cuya secuencia de ácido nucleico generalmente no está integrada en un genoma y, por tanto, no se propaga a la descendencia, a no ser que esta descendencia experimente una infección adicional.

Hay diversos procedimientos para introducir genes extraños tanto en plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto y col., Nature (1989) 338:274-276). Los procedimientos principales para provocar una integración estable del ADN exógeno en el ADN genómico incluyen dos aproximaciones principales:

(i) transferencia génica mediada por Agrobacterium: Klee y col. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee y Rogers en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Volumen 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, editores Schell, J. y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) pág. 2-25; Gatenby, en Plant Biotechnology, editores Kung, S. y Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) pág. 93-112.

(ii) captación directa del ADN: Paszkowski y col., en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Volumen 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes editores Schell, J. y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) pág. 52-68; que incluye los procedimientos para la captación directa del ADN dentro de los protoplastos, Toriyama, K. y col. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. La captación del ADN inducida por un choque eléctrico breve de las células de la planta: Zhang y col. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm y col. Nature (1986) 319:791-793. Inyección de ADN en las células o tejidos de la planta mediante bombardeo de partículas, Klein y col. Bio/Technology (1988) 6:559- 563; McCabe y col. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; mediante el uso de sistemas de micropipetas: Neuhaus y col., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus y Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; o mediante la incubación directa del ADN con polen en germinación, DeWet y col en Experimental Manipulation of Ovule Tissue, editores Chapman, G. P. Mantell, S. H. y Daniels, W. Longman, London, (1985) pág. 197-209; y Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.

El sistema de Agrobacterium incluye el uso de vectores plasmídicos que contienen segmentos de ADN definidos que se integran en el ADN genómico de la planta. Los procedimientos de inoculación del tejido de la planta varían dependiendo de la especie vegetal y del sistema de suministro de Agrobacterium. Una aproximación ampliamente usada es el procedimiento de discos de hojas, que puede realizarse con cualquier explante de tejido que proporcione una buena fuente para iniciar la diferenciación de la planta completa. Horsch y col., en Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academia Publishers, Dordrecht (1988) pág. 1-9. Una aproximación complementaria emplea el sistema de suministro de Agrobacterium en combinación con una infiltración al vacío. El sistema de Agrobacterium es especialmente viable para la creación de plantas dicotiledóneas transgénicas.

Hay diversos procedimientos para la transferencia directa de ADN dentro de las células de la planta. En la electroporación, los protoplastos se exponen brevemente a un potente campo eléctrico. En la microinyección, el ADN se inyecta de forma mecánica directamente dentro de las células usando micropipetas muy pequeñas. En el bombardeo de micropartículas, el ADN se adsorbe en microproyectiles, tales como cristales de sulfato de magnesio o partículas de wolframio, y los microproyectiles se aceleran físicamente dentro de los tejidos o células de la
planta.

Tras la transformación se pone en práctica la propagación de la planta. El procedimiento más común de propagación de una planta es por semillas. La regeneración mediante propagación por semillas, sin embargo, tiene la deficiencia de que debido a la heterocigosis el cultivo carece de uniformidad, ya que las plantas producen semillas según las varianzas genéticas regidas por las leyes de Mendel. Básicamente, cada semilla es genéticamente diferente y cada una crecerá con sus propios rasgos específicos. Por tanto, se prefiere que las plantas transformadas se produzcan de modo que la planta regenerada tenga rasgos y características idénticas a la planta transgénica parental. Por tanto, se prefiere que la planta transformada se regenere mediante micropropagación, que proporciona una reproducción rápida y uniforme de las plantas transformadas.

La micropropagación es un procedimiento de crecimiento de plantas de nueva generación a partir de un único fragmento de tejido que se ha cortado de una planta o cultivo parental seleccionado. Este procedimiento permite la reproducción en masa de plantas que tienen el tejido preferido que expresa la proteína. Las plantas de nueva generación que se producen son genéticamente idénticas y tienen todas las características de la planta original. La micropropagación permite la producción en masa de material vegetal de calidad en un corto periodo de tiempo y ofrece una multiplicación rápida de los cultivos seleccionados para preservar las características de la planta transgénica o transformada original. Las ventajas de la clonación de plantas son la velocidad de la multiplicación de la planta y la calidad y uniformidad de las plantas producidas.

La micropropagación es un procedimiento por etapas que requieren la alteración del medio de cultivo o de las condiciones de crecimiento entre las etapas. De este modo, el procedimiento de micropropagación implica cuatro etapas básicas: etapa uno, cultivo inicial del tejido; etapa dos, multiplicación del cultivo tisular; etapa tres, diferenciación y formación de la planta; y etapa cuatro, cultivo y endurecimiento en un invernadero. Durante la etapa uno, cultivo inicial del tejido, se establece el cultivo tisular y se certifica que está libre de contaminaciones. Durante la etapa dos, el cultivo tisular inicial se multiplica hasta que se produce un número suficiente de muestras de tejido para alcanzar los objetivos de producción. Durante la etapa tres, las muestras de tejido crecidas en la etapa dos se dividen y cultivan como plántulas individuales. En la etapa cuatro, las plántulas transformadas se transfieren a un invernadero para su endurecimiento en el que se aumenta gradualmente la tolerancia de las plantas a la luz de modo que puedan cultivar en un ambiente natural.

Se recomiendan secuencias adecuada que permitan la integración de la secuencia heteróloga en el genoma de la planta. Estas podrían incluir secuencias de transposones y similares para la recombinación homóloga, así como secuencias Ti que permiten la inserción aleatoria de un casete de expresión heteróloga en el genoma de una planta.

Los marcadores seleccionables de procariotas adecuados incluyen la resistencia a antibióticos, tales como ampicilina o tetraciclina. Como se conoce en la técnica, el vector también puede presentar otras secuencias de ADN que codifican funciones adicionales.

Las construcciones de la presente invención incluirán un casete de expresión para la expresión de la proteína de interés. Normalmente, tendrán sólo un casete de expresión, aunque son viables dos o más. El casete de expresión recombinante contendrá además de la secuencia heteróloga uno o más de los elementos de secuencia siguientes, una región promotora, secuencias no traducidas 5' de la planta que pueden incluir elementos reguladores, codón de inicio dependiendo o no de que el gen estructural venga equipado con uno, y una secuencia de terminación de la transcripción y de la traducción. Los sitios de restricción únicos en los extremos 5' y 3' del casete permiten una inserción fácil en un vector preexistente.

Según se usa en este documento, la expresión "elemento regulador" se refiere a una secuencia de nucleótidos que típicamente se incluye en el casete de expresión y funciona regulando (es decir, potenciando o inhibiendo) la expresión de una secuencia codificadora de ésta. Esta regulación puede afectar a las etapas de transcripción o de traducción. Los ejemplos de elementos reguladores incluyen, pero sin limitaciones, potenciadores, supresores y terminadores de la transcripción.

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Según se usa en este documento, el término "promotor" se refiere a una secuencia de nucleótidos que pueden dirigir la expresión génica en las células. Este promotor puede derivar de una planta, un virus vegetal o de cualquier otro organismo vivo incluyendo bacterias y animales.

Un promotor vegetal puede ser un promotor constitutivo, tal como, pero sin limitaciones, los promotores CaMV35S y CaMV19S, el promotor FMV34S, el promotor del badnavirus baciliforme de la caña de azúcar, el promotor CsVMV, el promotor de la actina ACT2/ACT8 de Arabidopsis, el promotor UBQ1 de la ubiquitina de Arabidopsis, el promotor BTH6 de la tionina de hojas de cebada y el promotor de la actina de arroz.

Alternativamente, el promotor puede ser un promotor específico de tejido. Los ejemplos de promotores de plantas específicos de tejido incluyen, sin limitaciones, el promotor de la proteína de almacenamiento de judías, la faseolina, el promotor DLEC, promotor PHS\beta, el promotor de la proteína zeína, el promotor de la conglutina gamma de soja, el promotor del gen AT2S1, el promotor de la actina ACT11 de Arabidopsis, el promotor napA de Brassica napus, el promotor del gen patatina de la patata y el promotor Tob.

El promotor también puede ser un promotor que se activa en una etapa específica del desarrollo del ciclo vital de una planta, por ejemplo, un promotor activo en la embriogénesis tardía, tal como: el promotor LEA; el promotor de expresión específico de Endosperma (la prolamina de almacenamiento en semillas de arroz se expresa en semillas de tabaco durante la etapa del desarrollo aproximadamente 20 días después de la floración) o el promotor que controla el gen FbL2A durante las etapas de síntesis de la pared de fibra.

En el caso de un promotor específico de tejido, se asegura que la proteína heteróloga se expresa sólo en el tejido deseado, por ejemplo, sólo en la flor, el fruto, la raíz, la semilla, etc.

Tanto los promotores específicas de tejido como los no específicos pueden ser constitutivos, es decir, pueden dar lugar a una expresión continua de la proteína heteróloga.

El promotor también puede ser un promotor inducible, es decir, un promotor que se activa en presencia de un agente inductor y sólo tras dicha activación, da lugar a la expresión de la proteína heteróloga. Un agente inductor puede ser, por ejemplo, la luz, agentes químicos, sequía, salinidad elevada, choque osmótico, condiciones oxidantes o en caso de patogenicidad, e incluye, sin limitaciones, el promotor inducible por la luz derivado del gen rbcS de guisante, el promotor del gen rbcS de la alfalfa, los promotores DRE, MYC y MYB activos durante la sequía; los promotores INT, INPS, prxEa, Ha hps17.7GA y RD21 activos con salinidad elevada y estrés osmótico, los promotores hsr303J y str246C activos con estrés patogénico, el sistema de expresión génica controlable por cobre y el sistema génico inducible por esteroides.

Alternativamente, un agente inductor puede ser un agente endógeno que normalmente está presente sólo en ciertos tejidos de la planta o se produce sólo en ciertos periodos de tiempo del ciclo vital de la planta, tales como etileno o esteroides. Usando estos agentes endógenos inductores específicos de tejido, es posible controlar la expresión a partir de estos promotores inducibles sólo en aquellos tejidos específicos. Usando un agente inductor producido sólo durante un periodo específico del ciclo vital, es posible controlar la expresión a partir de un promotor inducible en la fase específica del ciclo vital en el que se produce el agente inductor.

En la técnica son bien conocidos los promotores derivados de bacterias y levaduras.

Los virus son una clase única de agentes infecciosos cuyas características distintivas son su organización sencilla y su mecanismo de replicación. De hecho, una partícula viral completa, o virión, puede considerarse principalmente como un bloque de material genético (de ADN o ARN) con capacidad de replicación autónoma, rodeado de una cubierta proteica y, algunas veces, por una envuelta membranosa adicional, tal como en el caso de los virus alfa. La cubierta protege al virus del ambiente y le sirve como vehículo para la transmisión de una célula hospedadora a otra.

Los virus que se han mostrado útiles para la transformación de plantas hospedadoras incluyen CaV, TMV y BV. La transformación de plantas usando virus vegetales se describe en la Patente de EE.UU. Nº 4.855.237 (BGV), documento EP-A 67.553 (TMV), publicación de la solicitud japonesa Nº 63-14693 (TMV), documento EPA 194.809 (BV), documento EPA 278.667 (BV) y Gluzman, Y. y col., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, pág. 172-189 (1988). Las partículas de pseudovirus para su uso en la expresión de ADN extraño en muchos hospedadores, incluyendo plantas, se describen en el documento WO 87/06261.

La construcción de virus vegetales de ARN para la introducción y expresión de genes extraños no virales en plantas se demuestra por las referencias anteriores así como por Dawson, W.O. y col., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu y col. EMBO J. (1987) 6:307-311; French y col. Science (1986) 231:1294-1297, y Takamatsu y col. FEBS Letters (1990) 269:73-76.

Cuando el virus es un virus de ADN, las construcciones pueden hacerse a partir del propio virus. Alternativamente, el virus puede clonarse primero en un plásmido bacteriano para facilitar la construcción del vector viral deseado con el ADN extraño. A continuación, el virus n se escinde del plásmido. Si el virus es un virus de ADN, puede unirse al ADN viral un origen bacteriano de replicación, que a continuación se replica en la bacteria. La transcripción y traducción de este ADN producirá la proteína de la cubierta que encapsulará al ADN viral. Si el virus es un virus de ARN, generalmente el virus se clona como un ADNc y se inserta en un plásmido. A continuación, el plásmido se usa para hacer todas las construcciones. Entonces el virus de ARN se produce transcribiendo la secuencia viral del plásmido y traduciendo los genes virales para producir las proteínas de la cubierta que encapsulan al ARN viral.

La construcción de virus de ARN vegetales para la introducción y expresión de genes extraños no virales en plantas se demuestra mediante las referencias anteriores así como en la patente de EE.UU. Nº 5.316.931.

En una realización, se proporciona un ácido nucleico de virus vegetal en el que la secuencia que codifica la proteína nativa de la cubierta se ha delecionado del ácido nucleico viral y se ha insertado una secuencia que codifica una proteína de la cubierta del virus vegetal no nativa y un promotor no nativo, preferiblemente el promotor subgenómico de la secuencia que codifica la proteína de la cubierta no nativa, capaz de expresarse en la planta hospedadora, empaquetar el ácido nucleico del virus vegetal recombinante y asegurar una infección sistémica del hospedador por el ácido nucleico del virus vegetal recombinante. Alternativamente, el gen de la proteína de la cubierta puede inactivarse mediante la inserción en él de la secuencia del ácido nucleico no nativo, de modo que se produzca esa proteína. El ácido nucleico del virus vegetal recombinante puede contener uno o más promotores subgenómicos no nativos adicionales. Cada promotor subgenómico no nativo es capaz de transcribir o expresar genes o secuencias de ácido nucleico adyacentes en la planta hospedadora e incapaz de recombinación entre sí y con promotores subgenómicos nativos. Pueden insertarse secuencias de ácido nucleico no nativo (extraño) adyacentes al promotor subgenómico del virus vegetal nativo o a los promotores subgenómicos del virus vegetal nativos y no nativos si se incluyen más de una secuencia de ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico no nativas se transcriben o expresan en la planta hospedadora bajo el control del promotor subgenómico para producir los productos deseados.

En una segunda realización, se proporciona un ácido nucleico de virus vegetal recombinante como en la primera realización excepto porque la secuencia que codifica la proteína nativa de la cubierta se sitúa junto a uno de los promotores subgenómicos de la proteína no nativa de la cubierta en lugar de una secuencia que codifica la proteína no nativa de la cubierta.

En una tercera realización, se proporciona un ácido nucleico de virus vegetal recombinante en el que el gen de la proteína nativa de la cubierta está junto a su promotor subgenómico y se han insertado uno o más promotores subgenómicos no nativos en el ácido nucleico viral. Los promotores subgenómicos no nativos insertados son capaces de transcribir o expresar genes adyacentes en una planta hospedadora y son incapaces de recombinar entre sí y con promotores subgenómicos nativos. Pueden insertarse secuencia de ácido nucleico no nativas adyacentes a los promotores subgenómicos no nativos de virus vegetales de modo que dichas secuencias se transcriban o expresen en la planta hospedadora bajo el control de los promotores subgenómicos para producir el producto deseado.

En una cuarta realización, se proporciona un ácido nucleico de virus vegetal como en la tercera realización excepto porque la secuencia que codifica la proteína de la cubierta nativa se sustituye por una secuencia que codifica la proteína no nativa de la cubierta.

Los vectores virales se encapsulan con las proteínas de la cubierta codificadas por el ácido nucleico de virus vegetal recombinante para producir un virus vegetal recombinante. El ácido nucleico de virus vegetal recombinante o el virus vegetal recombinante se usan para infectar plantas hospedadoras adecuadas. El ácido nucleico de virus vegetal recombinante es capaz de replicarse en el hospedador, difundirse sistémicamente en el hospedador y transcribir o expresar genes extraños en el hospedador para producir la proteína deseada.

En muchos casos, es deseable dirigir la expresión de una proteína recombinante. Esta dirección puede ser dentro de un orgánulo celular o fuera de la célula. Esto puede realizarse, como se conoce bien en la técnica, mediante péptidos señal apropiados que se fusionan con el polipéptido que va a ser dirigido, típicamente, en el extremo N-terminal.

De este modo, según se usa en este documento y en la sección de reivindicaciones que sigue, la expresión "péptido señal" se refiere a una extensión de aminoácidos que es eficaz para dirigir a una proteína expresada en una célula a una localización diana. Diferentes péptidos señal, que son conocidos en la técnica, son eficaces para secretar una proteína a partir de células de bacterias, levaduras, plantas y animales.

Debe apreciarse a este respecto que los péptidos señal sirven a la función de la translocación de la proteína producida a través de la membrana del retículo endoplásmico. De forma similar, los segmentos transmembranales detienen la translocación y proporcionan el anclaje de la proteína a la membrana plasmática, véase, Johnson y col. The Plant Cell (1990) 2:525-532; Sauer y col. EMBO J. (1990) 9:3045-3050; Mueckler y col. Science (1985) 229:941-945. Para señales diana de mitocondrias, núcleo, cloroplasto o vacuolas que expresan correctamente la proteína en el orgánulo correspondiente a través de la ruta secretora, véase, Von Heijne, Eur. J. Biochem. (1983) 133:17-21; Yon Heijne, J. Mol. Biol. (1986) 189:239-242; Iturriaga y col. The Plant Cell (1989) 1:381-390; McKnight y col., Nucl. Acids Res. (1990) 18:4939-4943; Matsuoka y Nakamura, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:834-838. Un reciente libro de Cunninghan y Porter (Recombinant proteins from plants, editores C. Cunningham y A.J.R. Porter, 1998 Humana Press Totowa, N. J.), describen procedimientos para la producción de proteínas recombinantes en plantas y procedimientos para dirigir las proteínas a diferentes compartimentos de la célula vegetal. En especial, dos capítulos del mismo (14 y 15) describen diferentes procedimientos para introducir secuencias dirigidas que dan lugar a la acumulación de proteínas recombinantes en compartimentos tales como el RE, vacuolas, plástidos, núcleo y citoplasma. El libro de Cunningham y Porter se incorpora a este documento por referencia. Actualmente, el sitio preferido de acumulación de la proteína de fusión según la presente invención es el RE usando un péptido señal, tal como Cel1 o el péptido señal de la amilasa de arroz en el extremo N-terminal y un péptido de retención en el RE (HDEL, ID SEC Nº 17 o KDEL, ID SEC Nº 24) en el extremo C-terminal.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir \beta-glucosidasa recombinante. El procedimiento según este aspecto de la presente invención se lleva a cabo introduciendo, en una forma expresable o sobreexpresable, una construcción de ácido nucleico en una célula hospedadora. La construcción de ácido nucleico incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto preferiblemente derivado de Aspergillus niger y que codifica un polipéptido que tiene actividad catalítica \beta-glucosidasa. Preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido señal en fase con el polipéptido. Todavía preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico en fase con el polipéptido.

Según se usa en este documento, el término "introduciendo" se refiere tanto a la transformación como a la infección vírica, según se definen adicionalmente estos términos previamente en este documento. Según se usa en este documento, las expresiones "forma expresable" y "forma sobreexpresable" se refieren a una forma recombinante que incluye los elementos reguladores requeridos para llevar a cabo la expresión o sobreexpresión de una región codificadora, todo como se ha detallado además previamente en este documento.

Según una realización preferida de este aspecto de la presente invención, después de que se ha detectado suficiente expresión, el polipéptido que tiene la actividad catalítica \beta-glucosidasa se extrae a partir de la célula hospedadora que lo expresa.

De este modo, las células hospedadoras que expresan el polipéptido según la presente invención, proporcionan una fuente inmediata, fácil e indefinida del polipéptido.

Puede usarse cualquier referencia de medio de cultivo líquido o sólido bien conocido para cultivar apropiadamente las células hospedadoras de la presente invención, aunque se prefiere el cultivo en medios líquidos, ya que la secreción del polipéptido al medio simplifica la recuperación de polipéptido. Como se detalla además previamente en este documento, esta secreción puede llevarse a cabo mediante la incorporación de un péptido señal adecuado. La \beta-glucosidasa puede aislarse o separarse o purificarse a partir de las preparaciones de la célula hospedadora usando técnicas bien conocidas en la materia, tales como, pero sin limitaciones, centrifugación, filtración, cromatografía, electroforesis y diálisis. La concentración y/o purificación adicionales de la \beta-glucosidasa puede llevarse a cabo usando técnica convencionales que incluyen, pero sin limitaciones, ultrafiltración, diálisis adicional, cromatografía de intercambio iónico, HPLC, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de afinidad a celobiosa-sefarosa y electroforesis, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Usando estas técnicas, puede recuperarse la \beta-glucosidasa en forma pura o sustancialmente pura.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia de fermentación en un producto de fermentación. El procedimiento según este aspecto de la presente invención se lleva a cabo fermentando un material inicial de fermentación que contiene glucosa mediante una célula de levadura que sobreexpresa una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto derivado preferiblemente de Aspergillus niger y que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa, aumentado así el nivel de al menos la sustancia de fermentación en el producto de fermentación. Preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido señal en fase con el polipéptido. Todavía preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico en fase con el polipéptido.

Según un aspecto alternativo de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia de fermentación en un producto de fermentación. El procedimiento según este aspecto de la presente invención se lleva a cabo fermentando un material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta mediante una célula de levadura, sobreexpresando la planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto derivado preferiblemente de Aspergillus niger y que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa, aumentado así el nivel de al menos la sustancia de fermentación en el producto de fermentación. Preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido señal en fase con el polipéptido. Todavía preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico en fase con el polipéptido.

Según se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones que sigue, el término "fermentación" se refiere a un cambio químico inducido en un compuesto orgánico complejo por la acción de una enzima, por lo cual la sustancia se divide en compuestos más simples. Específicamente, el término "fermentación" incluye la desasimilación anaeróbica de sustratos con la producción de energía y de compuestos reducidos, los productos finales de éstos son ácidos orgánicos, alcoholes, tales como etanol, isopropanol, butanol, etc., y CO_{2}. Típicamente, estos productos se secretan y cada uno de ellos se denominan en este documento como una "sustancia de fermentación", es decir, cualquier resultante de fermentación conocido de fermentación microbiana o de
levadura.

Según se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones que sigue, la expresión "producto de fermentación" se refiere al material resultante de un proceso de fermentación. Los ejemplos incluyen, pero sin limitaciones, medio de fermentación que contiene alcohol y bebidas alcohólicas, tales como, pero sin limitaciones, bebidas que contiene alcohol a base de frutas, vinos y cervezas.

Cuando se usa junto con, por ejemplo, una \beta-glucanasa, la \beta-glucosidasa hidroliza eficazmente diversos materiales que contienen celulosa para dar glucosa. La glucosa producida mediante la hidrólisis enzimática de la celulosa y otros sacáridos que contienen glucosa, puede recuperarse y conservarse, o puede fermentarse posteriormente para dar etanol usando técnicas convencionales. Se conocen bien muchos procesos para la fermentación de glucosa generada a partir de celulosa y son adecuados para su uso en este documento. Brevemente, el hidrolizado que contiene la glucosa de la reacción enzimática se pone en contacto con un microorganismo apropiado en condiciones eficaces para la fermentación de la glucosa a etanol. Esta fermentación puede separarse y seguir a la hidrólisis enzimática de la celulosa (procesada secuencialmente) o la hidrólisis y la fermentación pueden ser simultánea y realizarse en el mismo recipiente (procesada simultáneamente). Los detalles de las diversas técnicas de fermentación, condiciones y microorganismos adecuados se han descrito, por ejemplo, en Wyman (1994, Bioresource Technol., 50:3-16) o en Olsson y Hahn-Hagerdal (1996, Enzyme Microbial Technol., 18:312-331), cuyos contenidos se incorporan en este documento por referencia. Tras completar una fermentación, el alcohol puede recuperarse mediante extracción y opcionalmente purificarse, por ejemplo, mediante destilación.

De este modo, según aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir un alcohol. El procedimiento según este aspecto de la presente invención se lleva a cabo fermentando un material inicial de fermentación que contiene glucosa con una célula que sobreexpresa una construcción de un ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto, preferiblemente derivado de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa, y extraer el alcohol de la misma. Preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido señal en fase con el polipéptido. Todavía preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico en fase con el polipéptido.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir un alcohol. El procedimiento según este aspecto de la presente invención se lleva a cabo fermentando un material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta mediante una célula, sobreexpresando la planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto, preferiblemente derivado de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa, y extraer el alcohol de la misma. Preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido señal en fase con el polipéptido. Todavía preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico en fase con el polipéptido.

En las plantas que contienen compuestos de aroma y sabor de naturaleza glucosídica, sus propiedades aromáticas inherentes pueden liberarse mediante degradación enzimática, transformando un compuesto aromático no volátil en su forma volátil. De este modo, por ejemplo, las \alpha-L-arabinofuranosidasas ayudan a la liberación de compuestos aromáticos a partir de sustratos tales como zumos o vinos, como se describe en Gunata y col. (solicitud de patente europea Nº 332.281, 1989; y "purification and some properties of an alpha-L-arabinofuranosidase from A. niger action on grape monoterpenyl arabinofuranosylglucosides". J. Agric. Food Chem. 38:772-776, 1990). Este resultado se obtiene, por ejemplo, en un proceso en dos etapas en el que la primera etapa comprende el uso de una \alpha-L-arabinofuranosidasa, para catalizar la liberación de restos de arabinosa de monoterpenil \alpha-L-arabinofuranosil glucósidos contenidos, por ejemplo, en el zumo de frutas o vegetales, mediante la escisión del enlace (1\rightarrow6) entre una unidad arabinofuranosilo terminal y la glucosa intermedia de un monoterpenil \alpha-L-arabinofuranosil glucósido. La \alpha-L-arabinofuranosidasa preferiblemente está en forma purificada para evitar así la degradación no deseada de otros componentes del zumo que podría ser perjudicial para su calidad final. En la segunda etapa, se requiere la \beta-glucosidasa para producir el terpenol libre a partir del monoterpenil glucósido desarabinosilado. Si se desea, ambas etapas de la reacción pueden realizarse en el mismo recipiente de reacción sin la necesidad de aislar los productos intermedios (Gunata y col. (1989), supra). De este modo, la \beta-glucosidasa es una contribución esencial cuando se desea la liberación de estos compuestos aromáticos para mejorar el aroma del zumo o del vino. Además, en el caso del vino, el control de la liberación de compuestos aromáticos proporciona vinos con un aroma más consistente, reduciendo o eliminando, de este modo, el efecto no deseado de "años de mala cosecha". Aparece información adicional en: "Cloning and expression of DNA molecules encoding arabinan degrading enzyme of fungal origin", Patente de EE.UU. Nº 5.863.783; Y. Gueguen, y col. "A Very Efficient \beta-Glucosidase Catalyst for the Hydrolysis of Flavor Precursors of Wines and Fruit Juices", J. Agric. Food Chem. 44:2336-2340, 1996, cuya descripción se incorpora en este documento por referencia.

De este modo, según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia aromática en un producto derivado de una planta, tal como, pero sin limitaciones, una bebida alcohólica. El procedimiento según este aspecto de la presente invención se lleva a cabo incubando un material inicial de una planta que contiene glucosa con una célula de levadura que sobreexpresa una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto, preferiblemente derivado de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa, aumentado así el nivel de al menos una sustancia aromática en el producto derivado de la planta. Preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido señal en fase con el polipéptido. Todavía preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico en fase con el polipéptido.

Reduciendo la presente invención a la práctica, se ha descubierto que para obtener la actividad de una \beta-glucosidasa en una planta transgénica, la construcción de expresión deberá incluir un péptido señal. Además, se ha descubierto que la retención de la enzima en el retículo endoplásmico da lugar a una liberación mayor de compuestos aromáticos tras la homogeneización e incubación. Se asume que la compartimentalización de la enzima, por ejemplo en el RE, evita que ésta interaccione con sus sustratos que están principalmente fuera de las células, limitando esta interacción tras la homogeneización. De hecho, la dirección de la enzima hacia el apoplasto da lugar a un aumento de la liberación de aroma in vivo. De este modo, dependiendo de la aplicación específica, se puede elegir incluir o no en la construcción un péptido de retención en el retículo endoplásmico.

Según aún un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia aromática en un producto derivado de una planta, tal como, pero sin limitaciones, una bebida alcohólica. El procedimiento según este aspecto de la presente invención se lleva a cabo incubando un material inicial de una planta que contiene glucosa con una célula de levadura, sobreexpresando dicha planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto preferiblemente derivado de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa, aumentado así el nivel de al menos una sustancia aromática en el producto derivado de la planta. Preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido señal en fase con el polipéptido. Todavía preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico en fase con el polipéptido.

Según se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones que sigue, la expresión "material inicial que contiene glucosa" se refiere a cualquier fuente de energía, en forma de compuestos que contienen glucosa, distintos de glucosa libre, que incluye, pero sin limitaciones, material de una planta, planta o porciones de la misma machacado, picado, cortado en dados o extraído, tales como frutos, ejemplos de los cuales son las frutas tropicales y uvas.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir una planta aromática. Según se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones que sigue, la expresión "planta aromática" se refiere sustancialmente a cualquier parte de una planta en la que se generan compuestos volátiles por la actividad catalítica del polipéptido \beta-glucosidasa de la presente invención, liberando compuestos volátiles de ésta que se perciben por el sistema olfativo de un organismo, tal como un humano.

El procedimiento según este aspecto de la presente invención se lleva a cabo mediante la sobreexpresión en la planta de una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto derivado de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa, aumentando, de este modo, el aroma que difunde la planta. Esta sobreexpresión se realiza preferiblemente de forma específica de tejido empleando, por ejemplo, un promotor específico de tejido, como se ha descrito anteriormente en este documento, para sobreexpresar así una proteína heteróloga en una porción seleccionada de la planta. El tejido en el que se lleva a cabo esta sobreexpresión se selecciona según la disponibilidad en ésta de sustratos aromáticos no volátiles que contengan glucosa. De este modo, esta sobreexpresión causará la liberación de un constituyente volátil y aromático del sustrato. De este modo, según realizaciones preferidas, la sobreexpresión de la construcción de ácido nucleico se limita al menos a un tejido, tal como una flor, un fruto, una semilla, una raíz, un tallo, polen y hojas.

Según otro aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el nivel de glucosa libre en un material inicial de fermentación que contiene glucosa. El procedimiento según este aspecto de la presente invención se lleva a cabo fermentando el material inicial de fermentación que contiene glucosa con una célula que sobreexpresa una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto derivado preferiblemente de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa, aumentando, de este modo, el nivel de la glucosa libre en el material inicial de fermentación que contiene glucosa. Preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido señal en fase con el polipéptido. Todavía preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico en fase con el polipéptido.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el nivel de glucosa libre en un material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta. El procedimiento según este aspecto de la presente invención se lleva a cabo fermentando el material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de la planta mediante una célula, sobreexpresando la planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto preferiblemente derivado de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa, aumentado así el nivel de la glucosa libre en la planta. Preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido señal en fase con el polipéptido. Todavía preferiblemen-
te, el polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico en fase con el polipéptido.

Según se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones que sigue, la expresión "glucosa libre" se refiere a restos de glucosa en forma de monosacárido, cuyos niveles aumentan mediante la actividad catalítica de la \beta-glucosidasa.

Según se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones que sigue, la expresión "material inicial de fermentación que contiene glucosa" se refiere a cualquier fuente de energía, en forma de compuestos que contienen glucosa, distintos de glucosa libre, que incluye, pero sin limitaciones, material de una planta, planta o porciones de la misma prensado, picado, cortado en dados o extraído usado en procesos de fermentación industrial.

Según aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el nivel de glucosa libre extra o intracelular en una planta. El procedimiento según este aspecto de la presente invención se lleva a cabo mediante la sobreexpresión en la planta de una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto derivado de Aspergillus niger, que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa, aumentando, de este modo, el nivel de glucosa libre en la planta. De este modo, pueden producirse frutas más dulces. Preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido señal en fase con el polipéptido. Todavía preferiblemente, el polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico en fase con el polipéptido.

Las glucosidasas, incluyendo la \beta-glucosidasa, catalizan reacciones que implican la hidrólisis del enlace O-glucosídico de los glucósidos y sintetizan oligosacáridos cuando la reacción se desarrolla en dirección inversa a la normal, un resultado logrado, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida a sitio e inversión de Km. Como se describe anteriormente en este documento en la sección de Antecedentes, el mecanismo de reacción de hidrólisis de las glucosidasas implica dos etapas catalíticas, la segunda de las cuales implica un ataque con H_{2}O catalizado por una base, dando lugar a la regeneración de la enzima y la liberación del resto sacárido. De este modo, además, puede conseguirse la síntesis del oligosacárido añadiendo un segundo sacárido a la mezcla de reacción, que compite con la molécula de H_{2}O, y reacciona en este lugar con el primer sacárido en lo que se conoce como una reacción de transglucosilación. Por tanto, ya que las glucosidasas generalmente están disponibles y se manejan fácilmente, estas enzimas tienen potencial para catalizar la producción de muchos productos diferentes usando sustratos baratos. Para más detalles, véase la patente de EE.UU. Nº 5.716.812, que se incorpora en este documento por referencia.

Por tanto, según aún un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para sintetizar oligosacáridos. El procedimiento según este aspecto de la presente invención se lleva a cabo mezclando un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa con las moléculas primera y segunda de sacárido para unir así las moléculas primera y segunda de sacárido en un oligosacárido.

Objetivos adicionales, ventajas y características nuevas de la presente invención serán aparentes a un experto en la materia tras examinar los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes. Adicionalmente, cada una de las diversas realizaciones y aspectos de la presente invención como se apunta anteriormente en este documento y como se reivindica a continuación en la sección de reivindicaciones encuentra apoyo experimental en los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención de forma no limitante.

Generalmente, la nomenclatura usada en este documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de recombinación de ADN. Estas técnicas se explican ampliamente en la literatura. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook y col., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R.M., editor (1994); Ausubel y col., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley e Hijos, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley e Hijos, Nueva York (1988); Watson y col., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren y col.(editores) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como se explican en las Patentes de EE.UU. Nº 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E., editor (1994); "Current Protocols in" Volúmenes I-III Coligan J. E., editor (1994); Stites y col. (editores), "Basic and Clinical Immunology" (8ª edición), Appleton y Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (editores), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman y Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la literatura de patentes y científica, véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., editor (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., editores (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., editores (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., editor (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Volumen 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Application", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y col., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todas las cuales se incorporan por referencia como si se explicaran completamente en este documento. A lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales. Los procedimientos en éste se cree que son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector. Toda la información contenida en él se incorpora en este documento como referencia.

Materiales y procedimientos experimentales Purificación de la \beta-glucosidasa de A. niger

Se obtuvo una preparación en bruto de \beta-glucosidasa de A. niger B1 (CMI CC 324626) de Shaligal Ltd. (Tel-Aviv, Israel). Se diafiltró primero una muestra (10 ml) del extracto enzimático (140 unidades/ml) a través de una membrana Amicon de 50 kDa de punto de corte (Amicon Corp., Danvers, MA), con tampón citrato 20 mM, pH=5. Las proteínas se separaron a continuación en un FPLC equipado con una columna Mono-Q RH 5/5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia), equilibrada con el mismo tampón. La enzima se eluyó con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 350 mM. Se controlaron y mezclaron (entre NaCl 80-110 mM) las fracciones activas (véase más adelante, ensayos enzimáticos). Se dializó la enzima parcialmente purificada frente a tampón citrato 20 mM, pH=3,5, se aplicó a una columna Resource-S equilibrada con el mismo tampón y se eluyó con un gradiente de NaCl 0-1 mM. La enzima purificada (eluida con NaCl 155 mM) se concentró mediante untrafiltración (membrana de 50 kDa de punto de corte, Amicon).

Ensayos enzimáticos

Se controló la actividad enzimática de \beta-glucosidasa usando un ensayo en placa como sigue. Se disolvió 4-metil-umbeliferil \beta-D-glucopiranósido (MUGlc, Sigma Chemical Inc. San Luis, Missouri) a una concentración final de 0,5 mM en tampón PC (fosfato 50 mM, ácido cítrico 12 mM, pH=3,4) a 45ºC. La solución se mezcló con agar al 3% en agua, previamente llevado a ebullición y luego enfriado a 45ºC. La solución resultante (20 ml) se vertió sobre una placa petri y tras solidificar, se depositaron 10 \mul de las muestras de enzima. Las placas se incubaron a 50ºC durante una hora y a continuación se iluminaron con UV de onda larga. Una fluorescencia intensa indicaba actividad \beta-glucosidasa.

La detección de \beta-glucosidasa en los geles de poliacrilamida se realizó lavando el gel de SDS-poliacrilamida con 1:1 de isopropanol:tampón PC para eliminar el SDS y renaturalizar la proteína. El gel se lavó una vez en tampón PC y se incubó en una capa fina de una solución de MUGlc 0,5 mM. Después de incubar a 50ºC durante una hora, se visualizó la banda de proteína activa con luz UV.

Los ensayos cuantitativos se realizaron usando pNPGlc como sustrato, según Shoseyov (7).

Determinación de la estabilidad térmica de la \beta-glucosidasa de A. niger

Se disolvió enzima recombinante (40 \mug/ml) en tampón citrato-fosfato 20 mM, pH=5. Cada muestra analizada
(8 \mul) se cubrió con 15 \mul de aceite mineral. La actividad se determinó mediante el ensayo pNPGlc convencional (7).

Desglicosilación de la \beta-glucosidasa de A. niger por N-glicosidasa-F

Se incubó una mezcla de reacción de N-glicosidasa-F (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) que contenía 0,125 \mug de \beta-glucosidasa pura (previamente desnaturalizada mediante 3 minutos de ebullición en SDS al 1% y \beta-mercaptoetanol al 5%), 0,2 unidades de N-glicosidasa-F, tampón fosfato sódico (50 mM, pH=7,5), EDTA (25 mM), Triton X-100 al 1% y azida sádica al 0,02%, en un volumen total de 12,5 \mul durante 4 horas a 37ºC. La reacción se detuvo mediante la adición de tampón de aplicación de la muestra en PAGE, seguido por 3 minutos de ebullición.

Proteolisis y secunencias N-terminal de la \beta-glucosidasa de A. niger B1

La proteolisis enzimática parcial con proteasa V8 de Staphylococcus aureus se realizó como describe Cleveland (28). Brevemente, se concentró la \beta-glucosidasa purificada por FPLC (5 \mug) mediante precipitación con acetona. La proteína se separó en un gel SDS-PAGE al 10% preparativo. Se tiñó el gel con azul de Coomassie, de destiñó y se lavó con agua fría, y se escindió la banda de proteína \beta-glucosidasa. El fragmento resultante del gel se aplicó a un segundo gel SDS-PAGE (15% de acrilamida) y se cubrió con proteasa V8 de Staphylococcus aureus. La digestión se realizó en el gel concentrador desconectando la corriente durante 30 min. Cuando el colorante azul de bromofenol estaba cerca del final del gel concentrador, se restableció la corriente. Los productos escindidos sometidos a electroforesis se electrotransfirieron a membranas de PVDF. La proteína nativa se transfirió a PVDF en paralelo. La secuencia N-terminal de la proteína nativa y dos de los numerosos productos escindidos se analizaron mediante la degradación de Edman usando un secuenciador de proteínas de fase gaseosa (microsecuenciador modelo 475A de Applied
Biosystems).

Clonación del ADNc y del gen genómico de bgl1

Aislamiento del ARN total: El ARN total se aisló de Aspergillus niger B1 como sigue: se cultivó A. niger B1 en cultivo líquido compuesto por medio mineral (NH_{4})_{2}SO_{4}\cdot3H_{2}O (0,5 g/l), KH_{2}PO_{4} (0,2 g/l), MgSO_{4} (0,2 g/l), CaCl_{2}\cdotH_{2}O (0,1 g/l), FeSO_{4}\cdot6H_{2}O (0,001 g/l), ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O (0,001 g/l) y ácido cítrico 2 mM, a pH=3,5 con 1% p/v de salvado como fuente de carbono. El medio se esterilizó en autoclave, se enfrió y se inoculó con A. niger B1 (10^{6} esporas/ml). Se usaron matraces con deflectores con agitación constante (200 RPM) a 37ºC. Se controló la aparición de actividad \beta-glucosidasa colocando 5 \mul de medio de cultivo sobre placas con agar al 1% que contenían MUGlc 0,5 mM, como se describe anteriormente. La actividad se detectó después de 15 horas de incubación. El micelio se recogió después de un periodo de crecimiento de 24 horas y se eliminó el medio mediante filtración a través de microfibra de vidrio GFA (Whatman Inter. Ltd., Maidstone, Inglaterra). A continuación se congeló el micelio en nitrógeno líquido y se trituró con un mortero hasta conseguir un polvo fino. El ARN total se extrajo a partir de este polvo mediante el procedimiento del tiocianato de guanidina (TriReagent^{TM}) (Molecular Research Center, Inc.).

Reacción de transcripción inversa de ARN: El ADNc se obtuvo por transcripción inversa del ARN total (10 \mug) usando el kit Stratagene RT-PCR (Stratagene, La Jolla, CA). La mezcla de reacción (50 \mul) estaba compuesta adicionalmente de: oligo dT18 (1 \mug), inhibidor de la ribonucleasa RNasa Block (20 unidades), tampón 1x (Tris HC1 50 mM, pH=8,3, KCl 75 mM, DTT 10 mM, MgCl_{2} 3 mM), dNTP (500 \muM cada uno) y transcriptasa inversa (300 unidades). Se desnaturalizó inicialmente el ARN total a 70ºC, se dejó enfriar a temperatura ambiente (para la hibridación de los cebadores) y se añadió a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se incubó durante 1 hora a 37ºC, seguido por el calentamiento (95ºC, 5 minutos) y conservación a -70ºC hasta su uso adicional.

Amplificación de ADN: Se sintetizaron cebadores degenerados para la reacción de amplificación de ADN por procedimientos de PCR, basados en parte en la secuencia N-terminal de aminoácidos y en una secuencia interna, como se determinó por la degradación de Edman, siguiendo la proteolisis con V8 (más adelante en este documento, resultados experimentales). La secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos derivada del extremo N-terminal de \beta-glucosidasa era Ser-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Pro (ID SEC Nº 4), produciendo el siguiente cebador: 5'- (C/G)(A/C/G/T)CC(A/C/G/T)CC(A/C/G/T)TA(C/T) TA(C/T)CC-3' (ID SEC Nº 5). La secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos del producto de escisión interna E2 era Gln-Pro-Ile-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly (ID SEC Nº 6), produciendo el siguiente cebador: 5'- TCCIGC(T/G/C/A)GG(T/G/C/A)A(G/A)(T/G/A)AT(T/G/C/A)GG(T/C) TG-3' (ID SEC Nº 7).

La mezcla de reacción de amplificación de ADN (25 \mul) contenía: el producto de reacción de la transcriptasa inversa (1 \mul), tampón de PCR 10x (2,5 \mul, Promega Corp., Madison, WI), dNTP (250 \muM cada uno), MgCl_{2} (2,0 mM), cebadores degenerados (250 pmol cada uno), ADN polimerasa (3 unidades, Stratagene, La Jolla, CA) y cubierto con aceite mineral (25 \mul). La reacción se realizó en un bloque calentador automático (controlador térmico programable, MJ Research, Inc.). Las condiciones de los ciclos de PCR fueron desnaturalización durante 30 segundos a 94ºC, hibridación durante 60 segundos a 50ºC y elongación durante 150 segundos a 72ºC, repetido 36 veces. El producto amplificado resultante se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,2% (p/v)/TBE, dando lugar a un fragmento génico de ADNc de 2,2 kb, que fue adicionalmente aislado usando el kit de extracción de gel (QIAGEN; Hilden, Alemania) y clonado directamente en el sitio de inserción único 3'-T PCR del vector de clonación pGEM-T (Promega Corp., Madison, WI).

Preparación de sondas: El ADNc parcial de 2,2 kb se digirió con PstI para producir una sonda del fragmento de ADN de 1,2 kb. Una muestra (25 ng) del fragmento se marcó con [^{32}]dCTP usando el sistema de marcaje de ADN Rediprime con nanonucleótido de secuencia aleatoria (Amersham Pharmacia Biotech AB, Buckinghamshire, Inglaterra).

Preparación de la biblioteca plasmídica del ADN genómico: Se construyó una biblioteca genómica de A. niger B1 en el vector lanzadera de levadura/E. coli pYEAUra3 (Clontech Lab. Inc., Palo Alto, CA). Se cultivó A. niger B1 en cultivo líquido como se describe anteriormente, el micelio se recogió después de 48 horas de crecimiento, se congeló en nitrógeno líquido y se trituró. El micelio en polvo se usó para extraer el ADN genómico por el procedimiento CTAB de Murray y Thompson (29). La biblioteca se construyó a partir del ADN genómico digerido parcialmente con Sau3, clonado en el sitio BamHI del vector lanzadera de levadura pYEUra3 (Clontech Lab. Inc., Palo Alto, CA). El vector lanzadera de levadura/E. coli pYEAUra3 se digirió con BamHI y se desfosforiló con CIP para prevenir el autoligamiento. El ADN genómico parcialmente digerido se clonó en el vector lanzadera con ligasa de T4 y se usó para transformar células electrocompetentes TOP10 de E. coli, que a continuación se sembraron sobre una placa de LB-agar que contenía ampicilina (50 \mug/ml). Un total de 4 x 10^{4} colonias crecidas en placas de LB-agar se transfirieron a membranas Hybond-N (Amersham Pharmacia Biotech AB, Buckinghamshire, Inglaterra) y se analizaron usando la sonda de 1,2 kb descrita anteriormente. Los clones positivos se subclonaron en pUC18 y se secuenciaron (Biological Services, The Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel).

Expresión del ADNc de bgl1 en E. coli

Se diseñaron dos cebadores específicos de acuerdo a las secuencias 5' y 3', correspondientes a la región N-terminal y C-terminal de la proteína madura: cebador sentido: 5'- (ID SEC Nº 8). Cebador complementario: 5'- AAAG
GATCCTTAGTGAACAGTAGGCAGAGACGC-3' (ID SEC Nº 9). El ADNc aislado se digirió con NcoI y BamHI y se clonó en el vector de expresión pET3d (Figura 1A, Novagen Inc., Madison, WI). Las colonias de E. coli BL21(DE3) pLysS positivas, que contenían el ADNc de bgl1 se confirmaron mediante digestión con enzimas de restricción y análisis de secuencia. La BGL1 recombinante se expresó según el protocolo del fabricante.

Expresión del ADNc de bgl1 en Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris

Se usó el vector pYES2 (Invitrogen Inc., San Diego, CA) para clonar eficazmente el gen de ADNc de bgl1 en los sitios HindIII/BamHI del plásmido pYES2-bgl1 (Figura 1b) y transformar Saccharomyces cerevisiae usando el procedimiento del acetato de litio (30). La BGL1 se expresó induciendo el promotor Gal1 según el protocolo del fabricante. La cepa INVSc2 de Saccharomyces cerevisiae (MATa, his3-D200, ura3-167) se usó como hospedador. La cepa GS115 de Pichia pastoris (mutante his4) se usó como hospedador para el vector plasmídico lanzadera y de expresión pHIL-S1 (Invitrogen Inc., San Diego, CA). El ADNc de bgl1 se clonó en los sitios EcoRI/BamHI de pHIL-S1, produciendo el vector de expresión y secreción pHIL-S1-bgl1 (Figura 1c). La expresión en P. pastoris de realizó según el protocolo del fabricante. La selección de clones que expresaban \beta-glucosidasa se hizo mediante top-agar que contenía 50 mg de X-Glc, 30 ml de metanol y agar al 1% por litro. El color azul indicaba una colonia productora de \beta-glucosidasa activa.

Análisis por inmunotransferencia

Los anticuerpos se obtuvieron a partir de suero de conejo 36 días después de una segunda inyección de 100 \mug de proteína purificada y adyuvante (AniLab Biological Services, Tal-Sachar, Israel). El marcador de peso molecular alto era de Sigma Chemical Inc., San Luis, Missouri. Las condiciones de la inmunotransferencia se describen en la referencia 36.

Determinación del curso estereoquímico de la hidrólisis

El procedimiento fue esencialmente como describen Wong y col. (31). Se disolvieron PNPGlc (10 \mumoles) en 0,5 ml de tampón acetato 25 mM pH=3,5 en D2O en un tubo de RMN. Se liofilizó la \beta-glucosidasa y se redisolvió en 100 \mul de D20 (35 unidades/ml). Se registró el espectro de RMN-^{1}H del sustrato, se añadió la enzima (10 \mul) y se registró el espectro a intervalos especificados de tiempo en un Bruker AMX400 a 25ºC.

Estudios de inactivación y reactivación

Se incubó la enzima \beta-glucosidasa de A. niger pura (0,47 mg/ml) en presencia de diversas concentraciones de fluoruro de 2-deoxi-2-fluoro-\beta-glucosilo (2FGlcF, 0,5-6 mM) en tampón citrato 30 mM pH=4,8 a 50ºC. Se determinó la actividad enzimática residual a diferentes intervalos de tiempo mediante la adición de una alícuota (10 \mul) de la mezcla de inactivación, a una solución que contenía tampón citrato (30 mM, pH=4,8), BSA (8 \mug) y 2,4-dinitrofenil \beta-D-glucopiranósido (DNPGlc, 0,625 mM, 830 \mul). La liberación de DNP se determino espectrofotométricamente midiendo la absorbancia a 400 nm un minuto después de la adición del sustrato.

Las velocidades de reactivación se determinaron como sigue: se preincubó la \beta-glucosidasa de A. niger pura (0,34 mg/ml) con 2FGlcF (5 mM) durante 15 min, tras lo cual se diafiltró el exceso de inactivador mediante concentradores de centrífuga de punto de corte de 20 kDa de peso molecular nominal (Sartorius Inc., Goettingen, Alemania). Las muestras de la enzima purificada inactivada se incubaron en presencia de linamarina (0-16 mM) en tampón citrato (30 mM, pH=4,8) a 50ºC durante 0, 10, 20 y 30 minutos y se determinó la actividad de cada muestra usando p-nitrofenil \beta-D-glucopiranósido (pNPGlc) como sustrato.

Expresión del ADNc de bgl1 en plantas de tabaco Construcciones genéticas

Se clonó el ADNc de bgl1 en pETB1 (37). Se usaron pJD330 y pBINPlus (38) como vector intermedio y binario, respectivamente. La secuencia señal Cel1, así como el fragmento Q de 35S plus se recuperaron a partir de pB21, pBluescript SK modificado (39). Se usó Nicotiana tobacum cv. Samson como planta modelo para la transformación génica. Se emplearon tres construcciones génicas (Figuras 11a-c): (i) bgl1 sin ningún péptido señal que sirvió para la expresión citoplásmica (Figura 11a, plásmido pJDB1); (ii) bgl1 que incluye un péptido señal Cel1 en el extremo N-terminal para la secreción en el apoplasto (Figura 11b, plásmido pJDCB1) y (iii) bgl1 que incluye el péptido señal Cel1 y el péptido de retención en el RE, KDEL (ID SEC Nº 24)en el extremo C-terminal para la acumulación en el RE (Figura 11c, plásmido pJDCB1T).

Con este fin, se liberó el ADNc de bgl1 (2,5 kb) de pETB1 (37) con NcoI y BamHI y se insertó en pJD330 entre el fragmento \Omega del promotor 35S y el terminador nos, eliminando el gen gus, dando lugar al plásmido pJDB1. Se sintetizó el tetrapéptido señal de retención en el retículo endoplásmico, HDEL (ID SEC Nº 17) y se fusionó con bgl1 en el extremo C-terminal en pJDB1 mediante una reacción de PCR de alta fidelidad con el siguiente par de cebadores: cebador sentido (23 mer), comenzando desde el nucleótido 1.248 del ADNc de bgl1 5'-(1.248)- CAGTGACCGTGGATGCGACAATG-(1.270')-3' (ID SEC Nº 20); cebador complementario (40 mer), comenzando en el nucleótido 2.506 del ADNc de bgl1 que codifica también el péptido HDEL (ID SEC Nº 17) 5'-(2.506)- AGA
GACGGATGACAAGTACTACTTGAAATTGGGCCCAAAA-3' (ID SEC Nº 21). Para pJDCB1T (35S \Omega + Cel1 + bgl1 + HDEL), el fragmento \Omega de 35S de pJDB1 se sustituyó por un fragmento 35S \Omega + Cel1 digerido a partir de pB21 con BamHI y XbaI. Para pJDCB1 (35S \Omega + Cel1 + bgl1), el fragmento que contenía 35S \Omega y Cel1, así como parte de bgl1, se cortaron de pJDCB1T con HindIII y NruI y se ligaron con el vector de pJDB1 digerido con el mismo par de enzimas de restricción. La secuencia nucleotídica de todas las construcciones genéticas se confirmó mediante secuenciación de ADN.

Los casetes génicos en los vectores intermedios de pJDB1, pJDCB1 y pJDCB1T se aislaron adicionalmente con HindIII y EcoRI y se insertaron en sitios de clonación múltiples del vector binario pBINPlus. Se transformó Agrobacterium LB4404 desactivado con pBINPlus con casetes génicos de bgl1.

Transformación de plantas de tabaco

Se escindieron las hojas jóvenes de plántulas crecidas in vitro y se cortaron en trozos de 0,5 cm^{2} y posteriormente se sumergieron durante 5 minutos en un medio de cultivo de una noche de Agrobacterium. Después de secarlas con papel de filtro Whatman estéril, las hojas infectadas se cocultivaron durante 2 días con Agrobacterium en medio MS más 2,0 mg/l de Zeatin y 0,1 mg/l de AIA, así como 0,35% (p/v) de fitagel y a continuación se transfirieron al mismo medio pero con 300 mg/l de kanamicina y 300 mg/l de carbenicilina. Los regenerados se transfirieron entonces a medios de enraizamiento que contenían sólo sales de MS, vitaminas y los mismos antibióticos. Las plantas enraizadas se transfirieron a un invernadero tras el análisis por PCR.

Selección de las plantas transgénicas

Se extrajeron el ADN y las proteínas de las plantas según Nagy y col. (40). La verificación por PCR de la inserción génica en el genoma de la planta se realizó con el siguiente par de cebadores, que cubrían el fragmento de ADN desde la posición 1.248 hasta el final de bgl1: 5'-CAGTGACCGTGGATGCGACAATG-3' (ID SEC Nº 22) y 5'- AAAGGATCCTTAGTGAACAGTAGGCAGAGACGC-3' (ID SEC Nº 23).

Identificación de las plantas transgénicas que expresan la proteína y la actividad BGL1

Se emplearon la inmunotransferencia (40) y la tinción del gel de SDS-PAGE por actividad (37) para seleccionar las líneas transgénicas con éxito, usando la proteína BGL1 de A. niger purificada como controles positivos y una planta no transgénica como control negativo.

Análisis por MEFS-CG/EM

Se estudió el efecto de bgl1 en la evolución y composición de compuestos aromáticos. Se escindieron las hojas frescas de las plantas transgénicas y de plantas control de tipo natural y se trituraron en nitrógeno líquido. Se añadió tampón de extracción enfriado en hielo, que contenía EDTA 10 mM, DTT 4 mM en tampón fosfato 50 mM, pH 4,3, a una relación 1:3 p/p. A continuación se agitó la mezcla durante 0,5 horas. Se tomaron 0,75 ml del sobrenadante de cada una de las mezclas centrifugadas en un vial de vidrio. Todas las manipulaciones se realizaron a 4ºC. Después de 9 horas de incubación a 37ºC, se analizaron los compuestos volátiles del vial según Clark y col. (41) usando un aparato de MEFS-CG/EM Saturn Varian 3800 equipado con una columna capilar DB-5. La temperatura de las inyecciones no fraccionadas era de 250ºC y la línea de transferencia se mantenía a 280ºC. Se utilizo helio como gas portador. El horno se programó como sigue: 1 minuto a 40ºC con calentamiento gradual hasta 250ºC a una velocidad de 5ºC/minuto.

Resultados experimentales Purificación de la \beta-glucosidasa de A. niger de tipo natural

Se purificó una preparación enzimática de \beta-glucosidasa de A. niger mediante FLPC con Mono-Q. Las muestras de proteína activa eluidas de la columna Mono-Q se separaron en un gel de SDS-PAGE al 10%, se tiñeron con azul de Coomassie y se incubaron en presencia de MUGlc para demostrar la actividad de la enzima. En esta etapa de purificación, se pudo detectar una banda discreta que tenía una masa molecular aparente de aproximadamente 160 kDa y actividad \beta-glucosidasa (Figura 2b, líneas 1-5: 1, banda electroeluida de BGL1 procedente del fragmento de gel de SDS-PAGE preparativo; 2-5, precipitados con acetona procedentes de la separación en Mono-Q de BGL1). Sin embargo, la masa aparente de la enzima desnaturalizada (llevada a ebullición durante 10 minutos en presencia de \beta-mercaptoetanol), se demostró que era de 120 kDa en SDS-PAGE 10% (Figura 2a). La enzima designada BGL1 se purificó adicionalmente hasta la homogeneidad en una columna Resource-S (Figura 3). La desglicosilación de la \beta-glucosidasa de A. niger se realizó con N-glicosidasa-F. Como se demuestra en la Figura 4, el análisis en SDS-PAGE indicaba que
aproximadamente 20 kDa de la masa de la \beta-glucosidasa de A. niger pueden atribuirse a carbohidratos unidos en N.

Proteolisis y secuencias N-terminal de BGL1

Se llevó a cabo la proteolisis enzimática parcial de BGL1 purificada con la proteasa V8 de Staphylococcus aureus. La proteína sin digerir y los productos de escisión se separaron mediante SDS-PAGE, seguido por la electrotransferencia en membranas de PVDF y la determinación de la secuencia N-terminal de la proteína nativa y de dos de los productos escindidos. Las secuencias de aminoácidos obtenidas eran las siguientes:

Proteína nativa N-terminal: Asp-Glu-Leu-Ala-Tyr-Ser-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Pro-Ser-Pro-Trp-Ala-Asn-Gly-Gln-Gly-Asp (ID SEC Nº 10). La parte subrayada representa la ID SEC Nº 4.

Producto de escisión interna: polipéptido El: Val-Leu-Lys-His-Lys-Asn-Gly-Val-Phe-Thr-Ala-Thr-Asp-Asn-Trp-Ala-Ile-Asp-Gln-Ile-Glu-Ala-Leu-Ala-Lys (ID SEC Nº 11).

Producto de escisión interna: polipéptido E2: Gly-Ala-Thr-Asp-Gly-Ser-Ala-Gln-Pro-Ile-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Gly-Asn-Pro (ID SEC Nº 12). La parte subrayada representa la ID SEC Nº 6.

El análisis con FastA (32) indicaba que la secuencia N-terminal, así como las secuencias internas tienen similitudes de secuencia con secuencias de la \beta-glucosidasa de la levadura Saccharomyces fibuligera que pertenece a la familia 3 de las glicosil hidrolasas.

Aislamiento y caracterización del ADNc y del ADN genómico de bgl1

Con el fin de clonar el gen de la \beta-glucosidasa de A. niger, se diseñaron cebadores degenerados según la secuencia de los fragmentos digeridos del polipéptido. Estos oligonucleótidos se usaron para amplificar un fragmento de ADNc del gen de la \beta-glucosidasa mediante RT-PCR. Se escindió una sonda de 1,2 kb a partir del producto de amplificación de 2,2 kb resultante, y se usó para analizar una biblioteca genómica construida en el vector lanzadera de levadura/E.coli pYEUra3. Los clones positivos se subclonaron y secuenciaron con éxito, dando lugar a una secuencia genómica de bgl1 de longitud completa (ID SEC Nº 3, Figura 5a). A continuación se generaron cebadores de amplificación, según la secuencia de ADN genómico, correspondientes a los extremos N y C-terminales de la proteína madura. Se usó entonces la RT-PCR para amplificar la secuencia de ADNc de \beta-glucosidasa de longitud completa (ID SEC Nº 1, Figura 5a, Nº de acceso del GenBank, AJ132386). La secuencia de ADNc coincidía perfectamente con la secuencia de ADN de los exones combinados. Se encontró que la fase de lectura abierta codificaba un polipéptido con un peso molecular predicho de 92 kDa. El gen incluye 7 exones interrumpidos por 6 intrones (Figura 5b). El análisis de la secuencia de ADN antes de la secuencia que codifica la proteína madura reveló una probable secuencia líder, interrumpida por un intrón de 82 pb.

Producción de la rBGL1 en E. coli

La proteína BGL1 recombinante se sobreexpresó en E. coli. No se pudo detectar actividad \beta-glucosidasa aparente en los extractos de E. coli, sin embargo, el análisis en SDS-PAGE reveló una banda de proteína relativamente intensa expresada con el peso molecular esperado. El análisis por inmunotransferencia usando anticuerpos policlonales de conejo anti-BGL1 nativa (AniLab Biological Services, Tal-Sachar, Israel), identificó positivamente la banda de proteína de 90 kDa (no mostrado). Un análisis adicional reveló que la proteína se acumulaba en los cuerpos de inclusión. Se realizaron varios experimentos de replegamiento, sin embargo, los esfuerzos para producir la proteína activa a partir de E. coli no tuvieron éxito (no mostrado).

Expresión de la BGL1 recombinante en S. cerevisiae y P. pastoris

La proteína BGL1 recombinante se expresó eficazmente tanto en S. cerevisiae como en P. pastoris, En S. cerevisiae se encontró un nivel relativamente bajo de expresión. La proteína recombinante se detectó mediante un análisis por inmunotransferencia (Figura 6a). El extracto proteico total de S. cerevisiae que expresaba el ADNc de bgl1 tenía una actividad \beta-glucosidasa de 1,9 unidades/mg de proteína. No se detectó actividad \beta-glucosidasa en S. cerevisiae control, transformada sólo con vector, en las mismas condiciones de ensayo. Sin embargo, no se pudo detectar ninguna banda de proteína correspondiente a la proteína BGL1 recombinante mediante tinción con azul de Coomassie. P. pastoris transformada con bgl1 secretaba niveles relativamente altos de BGL1 recombinante al medio (aproximadamente 0,5 g/l), que aparecía como una proteína casi pura en el sobrenadante del cultivo (Figura 6b). Esta enzima recombinante era muy activa (124 unidades/mg de proteína) y sin purificación adicional, producía una actividad específica similar a la de la enzima nativa pura.

Determinación por RMN-^{1}H del resultado estereoquímíco

El espectro de RMN-^{1}H de una mezcla de reacción que contenía pNPGlc y BGL1 reveló que el anómero beta de glucosa se formaba primero (H-1 = 4,95 ppm), con aparición retardada del anómero alfa (H-1, 5,59 ppm), consecuencia de la mutarrotación (Figura 7). Por tanto, BGL1 es de hecho, una glucosidasa de retención, como se ha observado para otros miembros de la familia (33, 34).

Inactivación y reactivación de la \beta-glucosidasa de A. niger

Se incubó la enzima en presencia de varias concentraciones de 2FGlcF y se controló la actividad enzimática residual a diferentes intervalos de tiempo. La actividad enzimática disminuía de manera dependiente del tiempo, según una cinética de pseudoprimer orden, permitiendo la determinación de las constantes de velocidad de pseudoprimer orden: K_{i} = 4,5 min^{-1} y K_{I} = 35,4 mM, para la inactivación a cada concentración de inactivador (0, 0,5, 1, 2, 4 y 6 mM, Figura 8).

Las velocidades de reactivación de 2-deoxi-2-fluoroglucosil-BGL1 se determinaron en presencia de diferentes concentraciones de linamarina controlando la recuperación de actividad después de 0, 10, 20 y 30 min (Figura 9). La recuperación de actividad seguía un proceso de primer orden a cada concentración de linamarina.

Estabilidad térmica de la \beta-glucosidasa de A. niger

Se evaluó la estabilidad térmica de la enzima recombinante a diferentes temperaturas, presentándose como el porcentaje de actividad enzimática respecto a una solución enzimática mantenida a 4ºC. Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 2 y se ilustran en la Figura 10. La enzima purificada mostraba una alta estabilidad térmica, manteniéndose la mayoría (aproximadamente el 50%) de la actividad a una temperatura que oscilaba de 4-60ºC.

TABLA 2

Temp. ºC	% de actividad
4	100
50	91,5
55	83,5
60	68
65	17,8

Expresión de BGL1 en plantas de tabaco

La transformación de discos de hoja mediada por Agrobacterium dio lugar a plantas transgénicas de tabaco, como se demostró por PCR (Figura 12) para la presencia del transgen, por inmunotransferencia (Figura 13a-b) para la presencia de la proteína y por ensayos de actividad (Figura 14 y 15) para la presencia de actividad proteica. La tabla 3 a continuación resume los resultados.

TABLA 3

Construcción génica	BGL1	Célula + BGL1 + HDEL	Célula + BGL1
Número de regenerados	33	14	27
Positivos por PCR	29	9	23
Positivos en inmunotransferencia	4	9	18
Actividad positiva en gel	0	9	18

De los 29 regenerados positivos por PCR transformados con el ADNc que codifica BGL1, los cuales no codifican un péptido señal, sólo en 4 la proteína BGL1 era detectable por medio de inmunotransferencia, sin embargo, no se detectaba actividad de BGL1 en ninguno de ellos. Se encontró que BGL1 era más pequeña en peso molecular en comparación con la beta-glucosidasa de A. niger de tipo natural y que la BGL1 recombinante procesada que contenía un péptido señal. Su tamaño aparente de aproximadamente 95 kDa está muy próximo a 92 kDa que es el peso molecular calculado de la beta-glucosidasa de A. niger sin glicosilar. Este resultado coincide con el hecho de que una proteína sin péptido señal se espera que se libere desde los ribosomas y permanezca en el citoplasto (42) sin glicosilar, ya que la glicosilación de la proteína se lleva a cabo en el lumen del retículo endoplásmico (43).

De los 9 regenerados positivos por PCR transformados con un ADNc que codifica BGL1 y el péptido señal Cel1 y que además codifica el péptido de retención en el RE, HDEL, todas las plantas expresaban cantidades detectables de proteína y actividad BGL1.

De los 23 regenerados positivos por PCR transformados con un ADNc que codifica la proteína BGL1 y el péptido señal Cel1, pero no el péptido de retención en el RE, HDEL, 18 plantas expresaban cantidades detectables de proteína y actividad BGL1.

El efecto de la BGL1 sobre la evolución y composición de compuestos aromáticos en plantas transgénicas de tabaco

Se incubaron extractos de plantas transgénicas (CB14 y CBT21 con similar actividad BGL1, véase la Figura 15) durante 9 horas a 37ºC, y se analizaron los compuestos aromáticos mediante MEFS-CG/EM. Los resultados, que se resumen en la Tabla 4 a continuación, muestran que con excepción del alcohol oleico, la concentración de los diferentes compuestos aromáticos aumenta en plantas transgénicas que expresan BGL1 activa en comparación con el control. Además, parece que la compartimentalización de BGL1 en el RE (o en realidad, cualquier otro orgánulo subcelular), antes que su secreción al apoplasto, da como resultado la mayor liberación de los compuestos aromáticos. Es probable que esto sea el resultado de la localización de muchos compuestos aromáticos en el apoplasto, de este modo, la secreción de BGL1 al apoplasto provoca la liberación in vivo de compuestos aromáticos, mientras que la compartimentalización de BGL1 en el RE da como resultado la liberación de compuestos aromáticos sólo en caso de rotura y descompartimentalización de la célula.

TABLA 4

7

8

CB14 - planta transgénica con péptido señal Cel1 + BGL1;

CBT21 - planta transgénica con péptido señal Cel1 + BGL1 + péptido de retención en el RE, HDEL. a - "-" significa que no hay diferencia significativa en la concentración en comparación con el tipo natural. b - "+" significa un incremento significativo en comparación con el tipo natural. c - "- -" significa un descenso significativo en comparación con el tipo natural, d - "++" significa un incremento significativo en comparación con la respectiva marca "+". ? - compuesto desconocido.

\vskip1.000000\baselineskip

Aunque la invención se ha descrito junto con realizaciones específicas de la misma, es evidente que serán aparentes muchas alternativas, modificaciones y variaciones a los expertos en la materia. Por consiguiente, se pretende abarcar todas estas alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del espíritu y amplio alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y secuencias identificadas por los números de acceso del GenBank mencionados en esta memoria descriptiva se incorporan en este documento en su totalidad por referencia en la memoria descriptiva, al mismo grado como si cada publicación, patente, solicitud de patente o secuencia individual se indicara específica o individualmente para ser incorporada en este documento mediante referencia. Además, la cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no se interpretará como una admisión de que esta referencia está disponible como técnica anterior a la presente invención.

Bibliografía

1. Bause, E., y Legler, G. (1974) Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 355, 438-442.

2. Beguin, P. y Aubert, J. P. (1994) FEMS Microbiol. Rev. 13, 25-58.

3. Rombouts, F. M. y Pilnik, W. (1978), Proc. Biochem. 8, 9-13.

4. Sternberg, D., Vijayakumar, P. y Reese, E. T. (1977), Can. J. Microbiol. 23, 139-147.

5. Woodward, J. y Wiseman, A. (1982), Enz. Microbiol. Technol. 4, 73-79.

6. Kerns, G., Dalchow, E., Klappach, G. y Meyer, D. (1986), Acta. Biotechnol. 6 (4), 355-359.

7. Shoseyov, O., Bravdo, B., kan, R. y Chet, 1. (1988), Phytochem. 27 (7), 1973-1976.

8. Shoseyov, O., Bravdo, B., Siegel, D., Goldman, A., Cohen, S. y Shoseyov, L. (1990), J. Agric. Food. Chem. 39, 1387-1390.

9. Dekker, R. F. H. (1986), Biotechnol. Bioengin. 26, 1438-1442.

10. Kitpreechavanich, V. M., Hayashi, M. y Nagai, S. (1986), Agric. Biol. Chem. 50,1703-1711.

11. Yeoh, H. H., Tan, T. K. y Koh, S. K. (1986), Appl. Microbiol. Biotechnol. 25, 25-28.

12. Crouzet, J. y Chassagne, D. (1999) in Naturally Occurring Glycosides (Ikan. R., editor) pág. 225-274, Wiley Press.

13. Prade, H., L. F. Mackenzie y S. G. Withers (1998) Carbohyd. Res. 305, 371-381.

14. Zarevucka M., Vacek, M., Wimmer, Z., Demnerova, K. y Mackova, M. (1998) Chirality 10, 676-68.

15. Yi, Q., Sarney, D. B., Khan, J. A. y Vulfson, E. N. (1998) Biotechnol. Bioeng. 60, 385-390.

16. McCleary, B. V. y Harrington, J. (1988), Methods Enzymology, 160, 575-583.

17. Watanabe, T., Sato, T., Yoshioka, S., Koshijima, T. y Kuwahara, M. (1992), Eur. J. Biochem. 209, 651-659.

18. Unno, T., Ide, K., Yazaki, T., Tanaka, Y., Nakakuki, T. y Okada, G. (1993), Biosci. Biotech. Biochem. 57 (12), 2172-2173.

19. Le Traon, M. M. P. y Pellerin P., (1998) Enz. Micro. Technol., 22 (5) 374-382.

20. Penttila, M. E., Nevalainen, H. K. M., Raynal, A. y Knowles, J. K. C., (1984), Mol. Gen. Genet. 194,
494-499.

21. Henrissat, B. y Bairoch, A. (1996) Biochem. J. Lett. 316, 695-696.

22. Sinnott, M. L. (1990) Chem. Rev. 90,1171-1202.

23. McCarter, J. y Withers, S. G. (1994) Curr. Opin. Struct. Biol. 4, 885-892.

24. Davies, G., Sinnott, M. L. y Withers, S. G. (1998) en Biological Catalysis (Sinnott, M. L., editor) Volumen 1, pág. 119-208, Academic Press.

25. Legler, G., Roeser, K. R. e Illig, H. K. (1979) Eur. J. Biochem. 101, 85-92.

26. Roeser, K. R. y Legler, G. (1981) Biochem. Biophys. Acta. 657, 321-333.

27. Legler, G., Sinnott, M. L. y Withers, S. G. (1980) J. Chem. Soc., Perkin Trans. II, 1376-1383.

28. Cleveland, D. W., Fischer, S. G., Kirschner, M. W. y Laemmli, U. K. (1977), J. Biol. Chem. 252 (3),
1102-1106.

29. Murray, M. G. y Thompson, W. F. (1980), Nucl. Acids Res. 8, 4321-4325.

30. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. y Kimura, A. (1983), J. Bacteriol. 153(1), 163-168.

31. Wong, A. W., He, S., Grubb, J. H., Sly, W. S. y Withers S. G. (1998), J. Biol. Chem. 273, 34057-34062.

32. Lipman, D. J. y Pearson, W. R. (1985) Science, 227, 1435-1441.

33. Legler, G. (1968) Hoppe-Zeyler's Z. Physiol. Chem. 349, 767-774.

34. Hrmova, M. y Fincher, G. B. (1996) J. Biol. Chem. 271, 5277-5286.

35. Iwashita K., Todoroki, M., Kimura, H., Shimoi, H. e Ito, K.(1998) Biosci. Biotechnol. and Biochem. 62 (10), 1938-1946.

36. Rlow E. y Lane D. (1988) Antibodies, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York.

37. Siegel D., Marton I., Dekel M., Bravdo B. A., He S. M., Wither S. G., Shoseyov O., 2000, Cloning, expression, characterization, and nucleophile identification of family 3, Aspergillus niger beta-glucosidase. J. Biol. Chem. 275 (7), 4973-4980.

38. Engelen F. A. V., Molthoff J. W., Conner A. J., Nap J. P., Pereira A y Stiekema W., 1995, pBINPLUS: an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Res. 4, 288-290.

39. Shani Z., Dekel M., Tsabary G., Shoseyov, 1997, Cloning and characterization of elongation specific endo-1 4-beta-glucanase (Cel1) from Arabidopsis thaliana, Plant Molecular Biol. 34: 837-842.

40. Nagy F., Kay S. A. K., Chua N. H., 1989, Analysis of gene expression in transgenic plants. In Plant Molecular Biology: manual editado por Gelvin y col., Kluwer Academic Publishers.

41. Clark T. J., Bunch J. E., 1997, Qualitative and quantitative analysis of flavor additives on tobacco products using SPME-GC-Mass Spectroscopy. J. Aagric. Food Chem. 45 (3), 844-849.

42. Lewin B., 1994, The apparatus for protein localization, en Gene V, Oxford University Press. Pág.: 279-314.

43. Prodi J. A., 2000, The role of N-oligosaccharide endoplasmic reticulum processing reactions in glycoprotein folding and degradation. Biochem. J., 348, 1-13.

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2.583

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 860

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3.885

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Pro Pro Tyr Tyr Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

SNCCNCCNTA YTAYCC

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Pro Ile Leo Pro Ala Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCIGCNGGN ARDATNGGYT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAACCATGGC TGATGAATTG GCATACTCCC CACC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGGATCCT TAGTGAACAG TAGGCAGAGA CGC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Glu Leo Ala Tyr Ser Pro Pro Tyr Tyr Pro Ser Pro Trp Ala}

\sac{Asn Gly Gln Gly Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Lys His Lys Asn Gly Val Pise Thr Ala Thr Asp Asn Trp}

\sac{Ala Ile Asp Gln Ile Glu Ala Leo Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ala Thr Asp Gly Ser Ala Gln Pro Ile Leu Pro Ala Gly Gly}

\sac{Gly Pro Gly Gly Asn Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3.212

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 13:

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 841

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3.329

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 880

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Asp Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3.338

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 883

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 19:

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTGACCGT GGATGCGACA ATG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAGACGGAT GACAAGTACT ACTTGAAATT GGGCCCAAAA

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTGACCGT GGATGCGACA ATG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGGATCCT TAGTGAACAG TAGGCAGAGA CGC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Asp Glu Leu}

Claims (24)

1. Un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia de fermentación en un producto de fermentación, comprendiendo el procedimiento la etapa de fermentar un material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta mediante una célula de levadura, sobreexpresando dicha planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en la ID SEC Nº 2, teniendo dicho polipéptido una actividad catalítica \beta-glucosidasa, aumentando de este modo, el nivel de la al menos una sustancia de fermentación en el producto de fermentación.

2. Un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia aromática en un producto derivado de una planta, comprendiendo el procedimiento la etapa de incubar un material inicial de una planta que contiene glucosa con una célula de levadura, sobreexpresando dicha planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en la ID SEC Nº 2, teniendo dicho polipéptido una actividad catalítica \beta-glucosidasa, incrementando, de este modo, el nivel de la al menos una sustancia aromática en el producto derivado de la planta.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho producto derivado de la planta es un producto de fermentación.

4. Un procedimiento para aumentar el nivel de glucosa libre en un material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta, comprendiendo el procedimiento la etapa de fermentar el material inicial de fermentación que contiene glucosa derivada de planta mediante una célula, sobreexpresando dicha planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en la ID SEC Nº 2, teniendo dicho polipéptido una actividad catalítica \beta-glucosidasa, incrementando, de este modo, el nivel de glucosa libre en la planta.

5. Un procedimiento para aumentar el nivel de glucosa libre en una planta, comprendiendo el procedimiento la etapa de sobreexpresar en la planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en la ID SEC Nº 2, teniendo dicho polipéptido una actividad catalítica \beta-glucosidasa, incrementando, de este modo, el nivel de glucosa libre en la planta.

6. Un procedimiento para producir un alcohol, comprendiendo el procedimiento la etapa de fermentar un material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta mediante una célula, sobreexpresando dicha planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en la ID SEC Nº 2, teniendo dicho polipéptido una actividad catalítica \beta-glucosidasa, y extraer el alcohol de la misma.

7. Un procedimiento para producir una planta aromática, comprendiendo el procedimiento la etapa de sobreexpresar en la planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en la ID SEC Nº 2, teniendo dicho polipéptido una actividad catalítica \beta-glucosidasa, aumentando, de este modo, el aroma que difunde la planta.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la sobreexpresión de dicha construcción de ácido nucleico se realiza de manera específica de tejido.

9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la sobreexpresión de dicha construcción de ácido nucleico se limita a al menos un tejido seleccionado entre el grupo constituido por la flor, el fruto, la semilla, la raíz, el polen y las hojas.

10. Un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia de fermentación en un producto de fermentación, comprendiendo el procedimiento la etapa de fermentar un material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta mediante una célula de levadura, sobreexpresando dicha planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa y además codifica un péptido señal que está en fase con dicho polipéptido, aumentando, de este modo, el nivel de la al menos una sustancia de fermentación en el producto de fermen-
tación.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico que está en fase con dicho polipéptido.

12. Un procedimiento para aumentar el nivel de al menos una sustancia aromática en un producto derivado de una planta, comprendiendo el procedimiento la etapa de incubar un material inicial de una planta que contiene glucosa con una célula de levadura, sobreexpresando dicha planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa y que además codifica un péptido señal que está en fase con dicho polipéptido, aumentando, de este modo, el nivel de la al menos una sustancia aromática en el producto derivado de una planta.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico que está en fase con dicho polipéptido.

14. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho producto derivado de una planta es un producto de fermentación.

15. Un procedimiento para aumentar el nivel de glucosa libre en un material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta, comprendiendo el procedimiento la etapa de fermentar el material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta mediante una célula, sobreexpresando dicha planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa y que además codifica un péptido señal que está en fase con dicho polipéptido, incrementando, de este modo, el nivel de glucosa libre en la planta.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicho polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico que está en fase con dicho polipéptido.

17. Un procedimiento para aumentar el nivel de glucosa libre en una planta, comprendiendo el procedimiento la etapa de sobreexpresar en la planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa y que además codifica un péptido señal que está en fase con dicho polipéptido, incrementando, de este modo, el nivel de glucosa libre en la planta.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicho polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico que está en fase con dicho polipéptido.

19. Un procedimiento para producir un alcohol, comprendiendo el procedimiento la etapa de fermentar un material inicial de fermentación que contiene glucosa derivado de una planta mediante una célula, sobreexpresando dicha planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa y que además codifica un péptido señal que está en fase con dicho polipéptido, y extraer el alcohol de la misma.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicho polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico que está en fase con dicho polipéptido.

21. Un procedimiento para producir una planta aromática, comprendiendo el procedimiento la etapa de sobreexpresar en la planta una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido genómico, complementario o compuesto que codifica un polipéptido que tiene una actividad catalítica \beta-glucosidasa y que además codifica un péptido señal que está en fase con dicho polipéptido, incrementando, de este modo, el aroma que difunde la planta.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicho polinucleótido además codifica un péptido de retención en el retículo endoplásmico que está en fase con dicho polipéptido.

23. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la sobreexpresión de dicha construcción de ácido nucleico se realiza de manera específica de tejido.

24. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la sobreexpresión de dicha construcción de ácido nucleico se limita a al menos un tejido seleccionado entre el grupo constituido por flor, fruto, semilla, raíz, polen y hojas.