ES2233942T3

ES2233942T3 - Secuencias de adn que codifican una cinamoil coa reductasa, y sus aplicaciones en el sector de la regulacion de los contenidos de ligninas de las plantas.

Info

Publication number: ES2233942T3
Application number: ES95917378T
Authority: ES
Inventors: Alain Boudet; Jacqueline Pettenati; Deborah Goffner; Michel Romestant; Jean-Charles Leple; Ann O'connell; Wout Boerjan; Claire Halpin
Original assignee: Biogemma SAS
Current assignee: Biogemma SAS
Priority date: 1994-04-11
Filing date: 1995-04-11
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2015-04-11
Also published as: ATE283361T1; FR2718460A1; NZ284823A; ZA952980B; FR2718460B1; US6015943A; DE69533794T2; EP0755449A1; BR9507291A; EP0755449B1; CA2185334A1; WO1995027790A3; AU705401B2; DE69533794D1; JPH09511647A; WO1995027790A2; AU2347295A

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A CUALQUIER SECUENCIA DE ADN QUE COMPRENDE COMO REGION CODIFICANTE, TODA O PARTE DE LA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA UN ARNM QUE CODIFICA UNA CINNAMOIL COA REDUCTASA (CCR), O TODO O PARTE DE LA SECUENCIA NUCLEOTIDICA COMPLEMENTARIA DE ESTA ULTIMA Y QUE CODIFICA UN ARNM ANTISENTIDO SUSCEPTIBLE DE HIDRIDARSE CON EL ARNM ARRIBA MENCIONADO. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A LA UTILIZACION DE LAS SECUENCIAS ARRIBA MENCIONADAS PARA LA REALIZACION DE LOS PROCEDIMIENTOS DE REGULACION DE LA BIOSINTESIS DE LIGNINAS EN LAS PLANTAS.

Description

Secuencias de ADN que codifican una cinamoíl CoA reductasa, y sus aplicaciones en el sector de la regulación de los contenidos de ligninas de las plantas.

El presente invento tiene por objeto la utilización de secuencias de ADN que codifican una cinamoíl CoA reductasa (CCR) en las plantas, o de cualquier fragmento de estas secuencias, o también de cualquier secuencia derivada de estas últimas, o de sus secuencias complementarias, dentro del marco de la puesta en práctica de procedimientos de regulación de la tasa de lignina en las plantas.

La lignina es un polímero aromático heterogéneo complejo, que impermeabiliza y refuerza las paredes de ciertas células de las plantas.

La lignina es formada por polimerización de radicales libres que se derivan de monolignoles, tales como los alcoholes para-cumarílico, coniferílico y sinapílico (Higuchi, 1985, en Biosynthesis and degradation of wood components [Biosíntesis y degradación de componentes de la madera] (T. Higuchi, coordinador de edición), Academic Press, Orlando, FL, páginas 141-160).

Las ligninas presentan una gran variación en su contenido relativo de monolignoles, en función de las especies, y de los diferentes tejidos en el seno de una misma planta.

Esta variación es probablemente debida y controlada por las diferentes actividades y especificidades de substratos, a saber enzimas necesarias para la biosíntesis de los monómeros de la lignina (Higuchi, 1985, antes mencionado).

Más allá de su cometido en la estructura y en el desarrollo de las plantas, la lignina representa un componente principal de la biomasa terrestre y reviste una gran importancia económica y ecológica (Brown, 1985, J. Appl. Biochem. 7, 371-387; Whetten y Sederoff, 1991, Forest Ecology and Management, 43, 301-316).

En el plano de la explotación de la biomasa, es conveniente en primer lugar señalar que la lignina es un factor que limita la digestibilidad y el rendimiento nutritivo de las plantas forrajeras. En efecto, se ha demostrado con claridad que la digestibilidad de las plantas forrajeras por los rumiantes es inversamente proporcional al contenido de estas plantas en cuanto a ligninas, siendo la naturaleza de las ligninas igualmente un factor determinante en este fenómeno (Buxton y Roussel, 1988, Crop. Sci., 28, 553-558; Jung y Vogel, 1986, J. Anim., Sci., 62, 1703-1712).

Entre las principales plantas forrajeras, en las que sería interesante disminuir los contenidos de ligninas, se pueden citar: alfalfa, festuca, maíz, forraje utilizado para ensilar, etc.

Hemos de señalar igualmente que unos contenidos elevados de ligninas son responsables en parte de la calidad limitada de las tortas de girasol destinadas a la alimentación del ganado, y de la disminución de las capacidades germinativas de ciertas semillas en el sector de la horticultura.

Se puede subrayar igualmente que la lignificación intensa, que se produce al realizar la conservación de los órganos vegetales después de la cosecha, hace rápidamente inapropiadas para el consumo a producciones tales como las de espárragos, ñame, zanahorias, etc.

Por lo demás, es conveniente señalar igualmente que cada año se extraen más de 50 millones de toneladas de ligninas del material leñoso dentro del marco de la producción de la pasta de papel en la industria papelera. Esta operación de extracción, necesaria para la obtención de la celulosa, es costosa desde el punto de vista energético y secundariamente contaminante a través de los compuestos químicos que se ponen en juego para la extracción, y a los que se encuentra en el medio ambiente (Dean y Eriksson, 1992, Holzforschung, 46, 135-147; Whetten y Sederoff, 1991, cita antes mencionada).

El hecho de reducir las proporciones de ligninas (que, según las especies, representan de un 20 a 30% del material seco) en algunos tantos por ciento (de 2 a 5%), representaría una ganancia de rendimiento, una economía sustancial (de productos químicos) y contribuiría al mejoramiento del medio ambiente (por reducción de las contaminaciones). Dadas las escalas de utilización del material leñoso, estas disminuciones tendrían unas repercusiones extremadamente importantes. En este caso, las especies implicadas podrían ser el álamo, el eucalipto, la Acacia mangium, el género Casuarina y el conjunto de las angiospermas y gimnospermas utilizadas para la producción de pasta de papel.

Está claro que, en los dos sectores considerados, la reducción de las tasas de ligninas debe de ser moderada para conservar en la planta (o en el árbol) sus características de rigidez y su arquitectura normal, puesto que las ligninas que consolidan las paredes celulares desempeñan un cometido importante en el mantenimiento del porte erguido de los vegetales.

Las variaciones naturales en los contenidos de ligninas, que se han observado en la naturaleza para una misma especie (pudiendo llegar las desviaciones hasta a un 6-8% de la masa seca entre individuos), autorizan las disminuciones que se han mencionado más arriba.

La resistencia a la degradación de la lignina, al igual que las dificultades que se encuentran en el marco de su extracción, son debidas probablemente a la compleja estructura de este polímero, constituido por enlaces de éter y de carbono con carbono entre los monómeros, así como a los numerosos enlaces químicos que existen entre la lignina y otros componentes de la pared celular (Sarkanen y Ludwing, 1971, en Lignins: Ocurrence, Formation, Structure and Reactions [Ligninas: aparición, formación, estructura y reacciones] (K.V. Sarkanen y C.H. Kudwig, coordinadores de edición) Nueva York: Wiley - Interscience, páginas 1-18).

Partiendo de los cinamoílos-CoA, la biosíntesis de las ligninas en las plantas se efectúa de la manera siguiente:

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2

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Un enfoque, por la vía de la ingeniería genética, para intentar reducir la tasa de ligninas en las plantas, podría consistir en inhibir la síntesis de una de las enzimas de la cadena de la biosíntesis de estas ligninas indicadas anteriormente.

Una técnica, particularmente apropiada dentro del marco de tal enfoque, es la de la utilización de un ARNm (ácido ribonucleico mensajero) antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica estas enzimas y, por consiguiente, de impedir, por lo menos parcialmente, la producción de estas enzimas a partir del correspondiente ARNm de ellas.

Tal estrategia antisentido, realizada con ayuda del gen que codifica la CAD en el tabaco, ha constituido el objeto de la solicitud de patente europea nº 584.117, que describe la utilización de un ARNm antisentido susceptible de inhibir la producción de ligninas en las plantas, hibridándose con el ARNm que codifica la CAD en estas plantas.

Los resultados, obtenidos al nivel de las plantas así transformadas, demuestran una reducción de la actividad de la CAD, pero paradójicamente, los contenidos de ligninas no muestran ninguna evolución. Unos estudios complementarios indican que las ligninas de las plantas transformadas son diferentes de las ligninas testigos, puesto que los aldehídos cinamílicos se incorporan directamente en el polímero de lignina.

Una de las finalidades del presente invento es precisamente la de proporcionar un procedimiento que permita regular eficazmente los contenidos de ligninas en las plantas, ya sea en el sentido de una sensible disminución de estos contenidos con relación a los contenidos normales de las plantas, ya sea en el sentido de un aumento de estos contenidos.

Otra finalidad de este invento es la de proporcionar las herramientas para la puesta en práctica de tal procedimiento, y más particularmente unas construcciones (estructuras artificiales) utilizables para la transformación de plantas.

Otra finalidad del presente invento es la de proporcionar plantas transformadas genéticamente, en particular plantas forrajeras susceptibles de ser digeridas mejor que las plantas no transformadas, o también plantas o árboles que se hayan transformado para la producción de pasta de papel, y en las (los) que la extracción de las ligninas sería facilitada y menos contaminante que en el caso de los árboles no transformados.

Otra finalidad del presente invento es la de proporcionar plantas transformadas que sean más resistentes a los ataques del medio ambiente, en particular a los ataques por parásitos, que lo que son las plantas no transformadas, o también plantas transformadas de mayor tamaño, o de tamaño más reducido (que el de las plantas no transformadas).

El presente invento tiene como objeto la utilización de secuencias nucleotídicas recombinantes que contienen una (o varias) región (regiones) codificadora(s), estando constituidas esta(s) región (regiones) codificadora(s):

- por una secuencia nucleotídica que codifica un ARN mensajero (ARNm), codificando este ARNm, por su parte, una cinamoíl CoA reductasa (CCR) en las plantas, o por un fragmento de la secuencia nucleotídica que antes se ha mencionado, codificando este fragmento un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, un fragmento de una CCR en las plantas, presentando este fragmento de CCR una actividad enzimática equivalente a la de la CCR antes mencionada, o por una secuencia nucleotídica que se deriva de la secuencia nucleotídica antes mencionada, o que se deriva del fragmento antes mencionado, en particular por mutación y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, una proteína derivada que presenta una actividad enzimática equivalente a la de la CCR antes mencionada, o

- por una secuencia nucleotídica complementaria de la totalidad o una parte de la secuencia nucleotídica que codifica un ARNm, o del fragmento de esta secuencia, o de la secuencia derivada de estos últimos, tales como se definen anteriormente, codificando esta secuencia complementaria una secuencia nucleotídica antisentido (también designada ARNm antisentido) susceptible de hibridarse con uno de los ARNm antes mencionados,

para la transformación de células vegetales con vistas a la obtención de plantas transgénicas, en cuyo seno se regula la biosíntesis de las ligninas, ya sea en el sentido de un aumento, ya sea en el sentido de una disminución, de los contenidos de ligninas producidas, con relación a los contenidos normales de ligninas producidas en las plantas.

Por la expresión de "secuencia nucleotídica derivada", en lo que antecede y en lo que sigue, se entiende cualquier secuencia que presente por lo menos aproximadamente un 50% de nucleótidos homólogos con los de la secuencia de la que ella se derive.

Por "proteína derivada" en lo que antecede y en lo que sigue, se entiende cualquier proteína que presente por lo menos aproximadamente un 50% de aminoácidos homólogos con los de la proteína de la que ella se derive.

Entre las secuencias nucleotídicas susceptibles de utilizarse a título de regiones codificadoras en las secuencias nucleotídicas recombinantes, se pueden citar principalmente:

- la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 1, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR de eucalipto representada por SEQ ID NO 2,

- la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 3, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR de álamo representada por SEQ ID NO 4,

- la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 5, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR de festuca representada por SEQ ID NO 6,

- la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 7, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR de tabaco representada por SEQ ID NO 8,

- la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 7, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm codificado por las secuencias SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 7 respectivamente,

- la secuencia nucleotídica derivada de la secuencia representada por SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 7, en particular por mutación y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada ya sea un ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6 o SEQ ID NO 8 respectivamente, o una proteína derivada de estas últimas y que presenta una actividad enzimática equivalente a la de dichas CCR en las plantas, en particular la secuencia nucleotídica que se deriva de la secuencia SEQ ID NO 1, y representada por SEQ ID NO 9, codificando esta última un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, una proteína representada por SEQ ID NO 10 derivada de la CCR de eucalipto antes mencionada,

- la secuencia nucleotídica derivada de la secuencia nucleotídica complementaria antes mencionada, por mutación y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con uno de los ARNm antes mencionados.

El presente invento tiene más particularmente como objeto cualquier secuencia de ADN, que esté caracterizada porque comprende a título de región codificadora:

- la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 1, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 2, o

- un fragmento de la secuencia nucleotídica antes mencionada, codificando este fragmento un fragmento de la CCR representada por SEQ ID NO 2, presentando este fragmento de CCR una actividad enzimática equivalente a la de la CCR antes mencionada, o

- cualquier secuencia nucleotídica derivada de la secuencia representada por SEQ ID NO 1, antes mencionada, o de un fragmento, tal como se describe anteriormente, de esta secuencia, en particular por mutación y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 2, o una proteína derivada de esta última y que presenta una actividad enzimática equivalente a la de dicha CCR en las plantas, en particular la secuencia nucleotídica derivada de la secuencia SEQ ID NO 1, y representada por SEQ ID NO 9, codificando esta última un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, una proteína representada por SEQ ID NO 10 derivada de la CCR de eucalipto antes
mencionada.

El presente invento tiene más particularmente como objeto cualquier secuencia de ADN, caracterizada porque comprende a título de región codificadora:

- la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 3, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 4, o

- un fragmento de la secuencia nucleotídica antes mencionada, codificando este fragmento un fragmento de la CCR representada por SEQ ID NO 4, presentando este fragmento de CCR una actividad enzimática equivalente a la de la CCR antes mencionada, o

- cualquier secuencia nucleotídica derivada de la secuencia representada por SEQ ID NO 3, antes mencionada, o de un fragmento tal como se describe anteriormente de esta secuencia, en particular por mutación y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 4, o una proteína derivada de esta última y que presenta una actividad enzimática equivalente a la de dicha CCR en las plantas.

El presente invento tiene como objeto más particularmente cualquier secuencia de ADN, caracterizada porque comprende a título de región codificadora:

- la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 5, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 6, o

- un fragmento de la secuencia nucleotídica antes mencionada, codificando este fragmento un fragmento de la CCR representada por SEQ ID NO 6, presentando este fragmento de CCR una actividad enzimática equivalente a la de la CCR antes mencionada, o

- cualquier secuencia nucleotídica derivada de la secuencia representada por SEQ ID NO 5, antes mencionada, o de un fragmento tal como se describe anteriormente de esta secuencia, en particular por mutación y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 6, o una proteína derivada de esta última y que presenta una actividad enzimática equivalente a la de dicha CCR en las plantas.

- la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 7, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 8, o

- un fragmento de la secuencia nucleotídica antes mencionada, codificando este fragmento un fragmento de la CCR representada por SEQ ID NO 8, presentando este fragmento de CCR una actividad enzimática equivalente a la de la CCR antes mencionada, o

- cualquier secuencia nucleotídica derivada de la secuencia representada por SEQ ID NO 7, antes mencionada, o de un fragmento tal como se describe anteriormente de esta secuencia, en particular por mutación y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 8, o una proteína derivada de esta última y que presenta una actividad enzimática equivalente a la de dicha CCR en las plantas.

Por proteína que presenta una actividad enzimática equivalente a la de las CCR presentes en las plantas, y más particularmente de las CCR representadas por SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6 o SEQ ID NO 8, se entiende cualquier proteína que posea una actividad de CCR tal como se mide según el método de Luderitz y Grisebach publicado en Eur. J. Biochem. (1981), 119; 115-127.

A título de ilustración, este método se realiza por medición espectrofotométrica de la actividad reductora de la proteína (CCR o derivada), siguiendo la desaparición de las cinamoíl CoA a 366 nm. La reacción se desarrolla a 30ºC, durante 2 a 10 minutos. La composición del medio de reacción es la siguiente: tampón fosfato 100 mM, pH 6,25, 0,1 mM de NADPH, 70 \muM de Feruloíl CoA, de 5 a 100 \mul de extracto enzimático en un volumen total de 500 \mul.

El invento tiene igualmente como objeto cualquier secuencia de ADN, caracterizada porque comprende a título de región codificadora:

- la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 1, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 2, a saber el ARNm codificado por la secuencia representada por SEQ ID NO 1, o codificado por una secuencia derivada de esta última, tal como se define anteriormente, o

- un fragmento de la secuencia complementaria antes mencionada, codificando este fragmento de secuencia un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 2, tal como se define anteriormente, o

- cualquier secuencia nucleotídica derivada de la secuencia complementaria antes mencionada, o del fragmento de esta secuencia complementaria tal como se describe anteriormente, en particular por mutación, y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm antes mencionado, en particular la secuencia complementaria de la representada por SEQ ID NO 9.

- la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 3, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 4, a saber el ARNm codificado por la secuencia representada por SEQ ID NO 3, o codificado por una secuencia derivada de esta última, tal como se define anteriormente, o

- un fragmento de la secuencia complementaria antes mencionada, codificando este fragmento de secuencia un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 4, tal como se define anteriormente, o

- cualquier secuencia nucleotídica derivada de la secuencia complementaria antes mencionada, o del fragmento de esta secuencia complementaria tal como se define anteriormente, en particular por mutación, y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm antes mencionado.

- la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 5, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 6, a saber el ARNm codificado por la secuencia representada por SEQ ID NO 5, o codificado por una secuencia derivada de esta última, tal como se define anteriormente, o

- un fragmento de la secuencia complementaria antes mencionada, codificando este fragmento de secuencia un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 5, tal como se define anteriormente, o

- cualquier secuencia nucleotídica derivada de la secuencia complementaria antes mencionada, o del fragmento de esta secuencia complementaria tal como se describe anteriormente, en particular por mutación, y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm antes mencionado.

- la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 7, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 8, a saber el ARNm codificado por la secuencia representada por SEQ ID NO 7, o codificado por una secuencia derivada de esta última, tal como se define anteriormente, o

- un fragmento de la secuencia complementaria antes mencionada, codificando este fragmento de secuencia un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 7, tal como se define anteriormente, o

- cualquier secuencia nucleotídica derivada de la secuencia complementaria antes mencionada, o del fragmento de esta secuencia complementaria tal como se describe anteriormente, en particular por mutación y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm antes mencionado.

Es evidente que las secuencias representadas por SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7 y SEQ ID NO 9, las secuencias complementarias, las secuencias derivadas y los fragmentos de secuencias del invento, que se han mencionado anteriormente, se deben tomar en consideración como representadas en el sentido 5' \rightarrow 3'.

Así, el primer nucleótido de una secuencia complementaria en el sentido 5' \rightarrow 3', tal como se describe anteriormente, es el complemento del último nucleótido de la secuencia en el sentido 5' \rightarrow 3' que codifica una CCR (o un fragmento de CCR o una proteína derivada), el segundo nucleótido de esta secuencia complementaria es el complemento del penúltimo nucleótido de la secuencia que codifica una CCR, y así sucesivamente, hasta llegar al último nucleótido de dicha secuencia complementaria que es el complemento del primer nucleótido de la secuencia que codifica una CCR.

El ARNm codificado por la secuencia complementaria antes mencionada es tal que, cuando este ARNm se representa en el sentido 5' \rightarrow 3', su primer nucleótido corresponde al último nucleótido de la secuencia que codifica una CCR, y por lo tanto se hibrida con el último nucleótido del ARNm codificado por este último, mientras que su último nucleótido corresponde al primer nucleótido de la secuencia que codifica una CCR, y por lo tanto se hibrida con el primer nucleótido del ARNm codificado por este último.

Así, se entiende por ARNm antisentido, en lo que antecede y en lo que sigue, cualquier ARNm codificado por dicha secuencia complementaria y representado en el sentido inverso (3' \rightarrow 5') del sentido en el que se representa el ARNm codificado por la secuencia que codifica una CCR (o un fragmento de CCR o una proteína derivada), siendo este último ARNm también designado como ARNm del mismo sentido (5' \rightarrow 3').

El término de ARN antisentido se dirige por lo tanto a una secuencia de ARN complementaria de la secuencia en cuanto a bases del ARN mensajero, debiendo ser comprendido el término de complementaria en el sentido de que cada base (o una mayoría de las bases) de la secuencia antisentido (leída en el sentido 3' \rightarrow 5') es capaz de emparejarse con las bases correspondientes (G con C, A con U) del ARN mensajero (secuencia leída en el sentido 5' \rightarrow 3').

La estrategia de los ARN antisentido, en el marco del presente invento, es un enfoque molecular particularmente adaptado al objetivo de una modulación de las tasas de ligninas de las plantas. El ARN antisentido es un ARN producido por la transcripción de la hebra de ADN no codificadora (hebra sin sentido).

Esta estrategia antisentido se describe más particularmente en la patente europea nº 240.208.

Se piensa que la inhibición de la síntesis de una proteína según la estrategia antisentido, aquí la CCR en el caso presente, es la consecuencia de la formación de un duplex entre los dos ARN complementarios (del mismo sentido y antisentido) impidiendo así la producción de la proteína. El mecanismo, no obstante, sigue siendo confuso. El complejo de ARN-ARN puede interferir ya sea con una transcripción ulterior, ya sea con la maduración, el transporte o la traducción o bien conducir también a una degradación del ARNm.

Una combinación de estos efectos es igualmente posible.

El invento se refiere igualmente a cualquier ARNm codificado por una secuencia de ADN según el invento, y más particularmente:

- el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO 1, o codificado por un fragmento o una secuencia derivada, tales como se definen anteriormente, siendo susceptible dicho ARNm de codificar, por su parte, la CCR presente en el eucalipto, tal como se representa por SEQ ID NO 2, o un fragmento de esta CCR o una proteína derivada, tales como se definen anteriormente, en particular la proteína representada por SEQ ID NO 10,

- el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO 3, o codificado por un fragmento o una secuencia derivada, tales como se definen anteriormente, siendo susceptible dicho ARNm de codificar, por su parte, la CCR presente en el álamo, tal como se representa por SEQ ID NO 4, o un fragmento de esta CCR o una proteína derivada, tales como se definen anteriormente,

- el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO 5, o codificado por un fragmento o una secuencia derivada, tales como se definen anteriormente, siendo susceptible dicho ARNm de codificar, por su parte, la CCR presente en la festuca, tal como se representa por SEQ ID NO 6, o un fragmento de esta CCR o una proteína derivada, tales como se definen anteriormente,

- el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO 7, o codificado por un fragmento o una secuencia derivada, tales como se definen anteriormente, siendo susceptible dicho ARNm de codificar, por su parte, la CCR presente en el tabaco, tal como se representa por SEQ ID NO 8, o un fragmento de esta CCR o una proteína derivada, tales como se definen anteriormente.

El invento tiene igualmente como objeto cualquier ARNm antisentido, tal como se define anteriormente, caracterizado porque comprende los nucleótidos complementarios de la totalidad o de una parte solamente de los nucleótidos que constituyen un ARNm tal como se describe anteriormente según el invento, siendo dicho ARNm antisentido susceptible de hibridarse (o emparejarse) con este último.

En este título, el invento se refiere más particularmente a los ARNm antisentido codificados por unas secuencias de ADN según el invento, que comprenden por lo menos una región de 50 bases homólogas con las de una región de las secuencias complementarias de las secuencias de ADN antes mencionadas del invento.

No hay ningún límite superior de tamaño para las secuencias de ADN que codifican un ARN antisentido según el invento; ellas pueden ser tan largas como las del mensajero normalmente producido en las células, e incluso tan largas como la secuencia de ADN genómico que codifica el ARNm de la CCR.

Ventajosamente, tales secuencias de ADN que codifican un ARN antisentido según el invento, comprenden entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1.000 pares de bases.

El invento tiene más particularmente como objeto cualquier secuencia antisentido que comprenda uno (o varios) ARNm antisentido tal(es) como se describe(n) anteriormente, o uno (o varios) fragmento(s) de este (estos) ARNm antisentido, y una (o varias) secuencia(s) que corresponde(n) a uno (o varios) dominio(s) catalítico(s) de una ribozima.

En este título, el invento se refiere más particularmente a cualquier secuencia antisentido tal como se describe anteriormente, que comprenda el dominio catalítico de una ribozima flanqueada a una y otra parte por unos brazos de aproximadamente 8 bases complementarias de las secuencias que bordean a un motivo GUX (representando X C, U o A), comprendidas en uno de los ARNm del invento descritos anteriormente (también designados como ARN dianas) (Haseloff J., y Gerlach W.L., 1988, Nature, 334: 585-591).

El invento se refiere igualmente a cualquier secuencia de ADN susceptible de codificar una secuencia antisentido tal como se describe anteriormente, que comprende por lo menos un dominio catalítico de una ribozima unida con uno o varios ARNm antisentido del invento, o fragmento(s) de ARNm antisentido (ventajosamente unos fragmentos de aproximadamente 8 bases, tal como se describen anteriormente).

El invento tiene más particularmente como objeto también cualquier secuencia antisentido que comprenda:

El invento tiene más particularmente como objeto:

- cualquier ARNm antisentido, tal como se describe anteriormente, caracterizado porque es codificado por la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 1, siendo susceptible dicho ARNm antisentido de hibridarse con el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO 1,

- cualquier ARNm antisentido, tal como se describe anteriormente, caracterizado porque es codificado por la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 3, siendo susceptible dicho ARNm antisentido de hibridarse con el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO 3,

- cualquier ARNm antisentido, tal como se describe anteriormente, caracterizado porque es codificado por la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 5, siendo susceptible dicho ARNm antisentido de hibridarse con el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO 5,

- cualquier ARNm antisentido, tal como se describe anteriormente, caracterizado porque es codificado por la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 7, siendo susceptible dicho ARNm antisentido de hibridarse con el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO 7,

- cualquier ARNm antisentido, tal como se describe anteriormente, caracterizado porque es codificado por la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 9, siendo susceptible dicho ARNm antisentido de hibridarse con el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO 9.

El invento se refiere igualmente a los polipéptidos recombinantes codificados por las secuencias de ADN del invento, presentando dichos polipéptidos recombinantes una actividad enzimática equivalente a la de las CCR en las plantas, y más particularmente las CCR recombinantes codificadas por las secuencias representadas por SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 7, o por unas secuencias derivadas de estas últimas según el invento, particularmente por SEQ ID NO 9.

El invento tiene más particularmente como objeto los polipéptidos recombinantes, y en particular las CCR recombinantes, tales como se obtienen por transformación de células vegetales integrando de manera estable, en su genoma, una secuencia nucleotídica recombinante tal como se define seguidamente, que contiene una secuencia de ADN según el invento, en particular con la ayuda de un vector tal como se describe seguidamente.

Por la expresión de "polipéptidos recombinantes", se debe entender cualquier molécula que posea una cadena polipeptídica susceptible de ser producida por ingeniería genética, por intermedio de una fase de transcripción del ADN del gen correspondiente, lo que conduce a la obtención de un ARN que a continuación es transformado en un ARNm (por supresión de los intrones), siendo este último traducido seguidamente por los ribosomas, en forma de proteínas, efectuándose la totalidad bajo el control de elementos de regulación apropiados en el interior de una célula anfitriona. Como consecuencia, la expresión "polipéptidos recombinantes" utilizada no excluye la posibilidad de que dichos polipéptidos comprendan otras agrupaciones, tales como las agrupaciones glicosiladas.

Desde luego, el término "recombinante" indica que el polipéptido ha sido producido por ingeniería genética, puesto que él resulta de la expresión, en un anfitrión celular apropiado, de la secuencia nucleotídica correspondiente que anteriormente se ha introducido en un vector de expresión utilizado para transformar a dicho anfitrión celular. No obstante, este término "recombinante" no excluye la posibilidad de que el polipéptido sea producido por un procedimiento diferente, por ejemplo por una síntesis química clásica según los métodos conocidos que se utilizan para la síntesis de proteínas, o por disociación proteolítica de moléculas de mayor tamaño.

El invento se refiere más particularmente a la CCR tal como se presenta en las células de eucalipto y se representa por SEQ ID NO 2, a la CCR tal como se presenta en las células de álamo y se representa por SEQ ID NO 4, a la CCR tal como se presenta en las células de festuca alta y se representa por SEQ ID NO 6, o a la CCR tal como se presenta en las células de tabaco y se representa por SEQ ID NO 8, o cualquier otra proteína derivada de estas últimas, en particular por adición, y/o supresión, y/o sustitución de uno o varios aminoácidos, en particular la proteína derivada de la CCR de eucalipto y representada por SEQ ID NO 10, o cualquier fragmento procedente de dichas CCR o de sus secuencias derivadas, siendo dichos fragmentos y dichas secuencias derivadas susceptibles de poseer una actividad enzimática equivalente a la de las CCR antes mencionadas.

El invento tiene igualmente como objeto las secuencias nucleotídicas que codifican la CCR representada por SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, o SEQ ID NO 10, o cualquier secuencia derivada o fragmento de estas últimas, tales como se definen anteriormente, estando caracterizadas dichas secuencias nucleotídicas porque corresponden a la totalidad o a una parte de las secuencias representadas por SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7 o SEQ ID NO 9 respectivamente, o a cualquier secuencia derivada de estas últimas por degeneración del código genético, y siendo no obstante susceptibles de codificar las CCR o cualquier secuencia derivada o fragmento de estas últimas, tales como se definen anteriormente.

El invento se refiere igualmente a los complejos formados entre los ARNm antisentido, tales como se describen anteriormente, y los ARNm según el invento, susceptibles de codificar la totalidad o una parte de una CCR en las plantas.

El invento tiene más particularmente como objeto el complejo formado entre el ARNm codificado por la secuencia SEQ ID NO 1 y el ARNm antisentido codificado por la secuencia complementaria de la secuencia SEQ ID NO 1, el ARNm codificado por la secuencia SEQ ID NO 3 y el ARNm antisentido codificado por la secuencia complementaria de la secuencia SEQ ID NO 3, el ARNm codificado por la secuencia SEQ ID NO 5 y el ARNm antisentido codificado por la secuencia complementaria de la secuencia SEQ ID NO 5, el ARNm codificado por la secuencia SEQ ID NO 7 y el ARNm antisentido codificado por la secuencia complementaria de la secuencia SEQ ID NO 7, el ARNm codificado por la secuencia SEQ ID NO 9 y el ARNm antisentido codificado por la secuencia complementaria de SEQ ID NO 9.

El invento tiene igualmente como objeto cualquier secuencia nucleotídica recombinante que contenga una (o varias) región (regiones) codificadora(s), estando constituida(s) esta(s) región (regiones) codificadora(s):

- por una secuencia nucleotídica que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, una CCR en las plantas, o por un fragmento de la secuencia nucleotídica antes mencionada, codificando este fragmento un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, un fragmento de una CCR en las plantas, presentando este fragmento de CCR una actividad enzimática equivalente a la de la CCR antes mencionada, o de una secuencia nucleotídica derivada de la secuencia nucleotídica antes mencionada, o derivada del fragmento antes mencionado, en particular por mutación y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, una proteína derivada que presenta una actividad enzimática equivalente a la de la CCR antes mencionada, o

- por una secuencia nucleotídica complementaria de la totalidad o una parte de la secuencia nucleotídica que codifica un ARNm, o por el fragmento de esta secuencia, o por la secuencia derivada de estas últimas, tales como se definen anteriormente, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con uno de los ARNm antes mencionados.

El invento tiene más particularmente como objeto cualquier secuencia nucleotídica recombinante (o ADN recombinante), caracterizada porque comprende por lo menos una secuencia de ADN según el invento, escogida entre las descritas anteriormente, siendo insertada dicha secuencia de ADN en una secuencia heteróloga.

El invento se refiere más particularmente a cualquier secuencia nucleotídica recombinante tal como se describe anteriormente, que comprende, a título de región codificadora, la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 1, o por SEQ ID NO 3, o por SEQ ID NO 5, o por SEQ ID NO 7, o cualquier fragmento o una secuencia nucleotídica derivada de estas últimas, tales como se definen anteriormente, habiéndose insertado dichas secuencias nucleotídicas o dicho fragmento en una secuencia heteróloga, y siendo susceptibles de codificar la CCR representada por SEQ ID NO 2, o por SEQ ID NO 4, o por SEQ ID NO 6, o por SEQ ID NO 8, respectivamente, o un fragmento de estas CCR, o una proteína derivada de estas últimas, tales como se definen anteriormente.

El invento se refiere, todavía más particularmente, a cualquier secuencia nucleotídica recombinante que comprenda, a título de región codificadora, una secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 1, o por SEQ ID NO 3, o por SEQ ID NO 5, o por SEQ ID NO 7, o cualquier fragmento o cualquier secuencia nucleotídica derivada de esta secuencia complementaria, tales como se definen anteriormente, habiéndose insertado dichas secuencias complementarias o dicho fragmento en una secuencia heteróloga, y siendo susceptibles de codificar un ARNm antisentido capaz de hibridarse con la totalidad o una parte del ARNm que codifica una CCR en las plantas, y más particularmente con la totalidad o una parte del ARNm que codifica una CCR representada por SEQ ID NO 2, o por SEQ ID NO 4, o por SEQ ID NO 6, o por SEQ ID NO 8, respectivamente.

Los ADN recombinantes según el invento están caracterizados aún más porque comprenden los elementos necesarios para regular la expresión de la secuencia nucleotídica que codifica una CCR, o de su secuencia complementaria que codifica un ARNm antisentido según el invento, en particular un promotor y un terminador de la transcripción de estas secuencias.

Entre los diferentes promotores susceptibles de ser utilizados en las construcciones de ADN recombinantes según el invento, se pueden citar:

- el promotor endógeno que controla la expresión de la CCR en el seno de una planta, en particular el promotor situado más arriba de la secuencia representada por SEQ ID NO 1 en el eucalipto, o

- unos promotores de tipo constitutivo con fuerte expresión, de los que son ejemplos: el ^{35}S CAMV (descrito en la cita de Benfey y colaboradores (1990), EMBO J., 9 (6), 1677-1684), el EF1\alpha (promotor del gen de un factor de elongación en la síntesis proteínica descrita por Curie y colaboradores (1991), Nucl. Acids Res., 19, 1305-1310).

- unos promotores de tipo específico con expresión particular en unos tejidos individuales, de los que son ejemplos: el promotor CAD (descrito por Feuillet C. (1993), Tesis de la Universidad de Toulouse III), el promotor GRP 1-8 (descrito por Keller y Baumgartner (1991), Plant Cell., 3, 1051-1061) con expresión en unos tejidos vasculares específicos.

El invento se refiere igualmente a cualquier secuencia nucleotídica recombinante tal como se describe anteriormente, y que comprende igualmente a título de región codificadora por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica la totalidad o una parte de un ARNm que codifica, por su parte, una enzima distinta de la CCR, que se encuentra estar implicada en una etapa de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, en particular el ARNm que codifica la alcohol cinamílico deshidrogenasa (CAD), o que comprende igualmente a título de región codificadora por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica la totalidad o una parte de un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm antes mencionado, en particular con el ARNm que codifica la CAD.

Las secuencias nucleotídicas recombinantes antes mencionadas del invento se obtienen ventajosamente a partir de vectores en los que se insertan las secuencias de ADN que codifican una enzima necesaria para la biosíntesis de las ligninas en las plantas.

En este título, el invento tiene más particularmente como objeto el vector denominado pEUCCR, que comprende la secuencia representada por SEQ ID NO 1 clonada en el vector Bluescript, y depositado en cultivo en células de E. coli DH5\alpha en la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes (CNCM = Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos) del Institut Pasteur en París (Francia), el 17 de marzo de 1994 con el nº I-1405.

Los vectores antes mencionados se digieren con la ayuda de enzimas de restricción apropiadas, a fin de recuperar dichas secuencias de ADN que se encuentran insertadas allí.

Estas últimas se insertan seguidamente más abajo de un promotor apropiado, y más arriba de un apropiado terminador de la expresión, en el seno de los ADN recombinantes según el invento.

El invento se refiere más particularmente a los ADN recombinantes que comprenden la secuencia representada por SEQ ID NO 1, que codifican el ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 2, tales como se obtienen por digestión del vector pEUCCR antes mencionado, por recuperación de la secuencia de ADN del invento y por inserción de esta última en el sentido 5' \rightarrow 3', en el seno de una secuencia de ADN heterólogo que comprende un promotor y un terminador de la expresión de dicha secuencia.

El invento tiene como objeto igualmente, de modo más particular, los ADN recombinantes que comprenden la secuencia complementaria de la secuencia SEQ ID NO 1, que codifican un ARNm antisentido capaz de hibridarse con el ARNm que codifica la CCR representada por SEQ ID NO 2, tales como se obtienen por digestión del vector pEUCCR antes mencionado, por recuperación de la secuencia de ADN del invento y por inserción de esta última en el sentido inverso, es decir en el sentido 3' \rightarrow 5', en el seno de una secuencia de ADN heterólogo que comprende un promotor y un terminador de la expresión de la secuencia complementaria.

A título de ejemplo de un terminador utilizable en tales construcciones, se puede citar el extremo 3' del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens.

Así, de una manera general, las secuencias nucleotídicas recombinantes según el invento, que contienen una secuencia de ADN que codifica una CCR (o un fragmento de CCR o una proteína derivada), y/u otras enzimas necesarias para la biosíntesis de las ligninas, se obtienen por recuperación de dicha secuencia de ADN a partir de los vectores antes mencionados, y por inserción de esta secuencia en la secuencia heteróloga, mientras que las secuencias nucleotídicas recombinantes, que contienen una secuencia de ADN que codifica un ARNm antisentido según el invento, se obtienen por recuperación de la secuencia de ADN antes mencionada y por inserción en sentido inverso de esta última en dicha secuencia heteróloga.

A título de ilustración, se puede utilizar la totalidad o una parte del ADN complementario (ADNc) representado por SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7 o SEQ ID NO 9, para la construcción de los ADN recombinantes antes mencionados, o bien la totalidad o una parte del clon genómico correspondiente a una CCR (que corresponde a los ADNc antes mencionados + eventuales intrones). Este clon genómico se puede obtener utilizando los ADNc como sondas para escrutar un banco genómico, obteniéndose este último, por su parte, siguiendo el método descrito por Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989.

El invento tiene igualmente como objeto cualquier vector recombinante, utilizable para la transformación de plantas, que esté caracterizado porque comprende una secuencia nucleotídica recombinante escogida entre las descritas anteriormente, según el invento, integrada en uno de los sitios de su genoma que no son esenciales para su replicación.

Entre los vectores recombinantes antes mencionados, utilizables para la transformación de plantas, pueden citarse: los vectores binarios derivados de pBIN 19 (Bevan y colaboradores, (1984), Nucl. Acids Res., 12 (22), 8711-8721).

Unos ejemplos de construcción de vectores recombinantes según el invento se describen en la descripción detallada que sigue del invento.

El presente invento tiene igualmente como objeto un procedimiento de regulación de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, ya sea por disminución, ya sea por aumento, de las cantidades de ligninas producidas, con relación a las cantidades normales de ligninas producidas en estas plantas, comprendiendo dicho procedimiento una etapa de transformación de células de estas plantas con la ayuda de un vector que contiene:

- una secuencia nucleotídica que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, una CCR en las plantas, o de un fragmento de la secuencia nucleotídica antes mencionada, codificando este fragmento un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, un fragmento de una CCR en las plantas, presentando este fragmento de CCR una actividad enzimática equivalente a la de la CCR antes mencionada, o una secuencia nucleotídica derivada de la secuencia nucleotídica antes mencionada, o derivada del fragmento antes mencionado, en particular por mutación y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, una proteína derivada que presenta una actividad enzimática equivalente a la de la CCR antes mencionada, o

- una secuencia nucleotídica complementaria de la totalidad o una parte de la secuencia nucleotídica que codifica un ARNm, o del fragmento de esta secuencia, o de la secuencia derivada de estas últimas, tales como se definen anteriormente, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con uno de los ARNm antes mencionados, efectuándose dicha transformación en particular con la ayuda de un vector tal como se describe anteriormente.

El invento tiene más particularmente como objeto un procedimiento de disminución de la cantidad de ligninas producidas por biosíntesis en las plantas, siendo efectuado dicho procedimiento por transformación del genoma de estas plantas, incorporando en éste:

- por lo menos una secuencia de ADN según el invento, tal como se describe anteriormente, que codifica un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con la totalidad o una parte del ARNm que codifica la CCR representada por SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6 o SEQ ID NO 8, o una proteína derivada de estas últimas, tal como se define anteriormente, en particular la proteína representada por SEQ ID NO 10,

- y, llegado el caso, por lo menos una secuencia de ADN que codifica un ARNm antisentido capaz de hibridarse con un ARNm que codifica otra enzima distinta de la CCR, que se encuentra estar implicada en una etapa de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, en particular el ARNm que codifica la CAD,

realizándose dicha transformación:

- ya sea con la ayuda de un vector recombinante tal como se describe anteriormente, que contiene una secuencia de ADN que codifica un ARNm antisentido capaz de hibridarse con el ARNm que codifica la CCR o una proteína derivada, tal como se define anteriormente, y que, llegado el caso, contiene una o varias secuencias de ADN que codifican un ARNm antisentido capaz de hibridarse con un ARNm que codifica otra enzima distinta de la CCR, tal como se define anteriormente,

- ya sea con la ayuda de varios vectores recombinantes de los que por lo menos uno contiene una secuencia de ADN que codifica un ARNm antisentido capaz de hibridarse con el ARNm que codifica la CCR o una proteína derivada, tal como se define anteriormente, mientras que el (o los) otro(s) vector(es) recombinante(s) contiene(n) una secuencia de ADN que codifica un ARNm antisentido capaz de hibridarse con un ARNm que codifica otra enzima distinta de la CCR, tal como se define anteriormente.

Otro procedimiento de disminución de la cantidad de ligninas producidas por biosíntesis en las plantas, es el que se realiza por transformación del genoma de estas plantas, incorporando en éste:

- por lo menos una secuencia de ADN según el invento, representada por SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 7, o un fragmento o una secuencia derivada de esta última, tales como se definen anteriormente, en particular la secuencia representada por SEQ ID NO 9,

- y, llegado el caso, por lo menos una secuencia de ADN que codifica la totalidad o una parte de otra enzima distinta de la CCR, que se encuentra estar implicada en una etapa de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, en particular una secuencia de ADN que codifica la totalidad o unas parte de la CAD,

realizándose dicha transformación:

- ya sea con la ayuda de un vector recombinante tal como se describe anteriormente, que contiene la secuencia de ADN según el invento, antes mencionada, o un fragmento o una secuencia derivada de esta última, tales como se definen anteriormente, y que, llegado el caso, contienen una o varias secuencias de ADN que codifican la totalidad o una parte de una enzima distinta de la CCR, tal como se define anteriormente,

- ya sea con la ayuda de varios vectores recombinantes de los que por lo menos uno contiene una secuencia de ADN según el invento, antes mencionada, o un fragmento o una secuencia derivada de esta última, tales como se definen anteriormente, mientras que el (o los) otro(s) vector(es) recombinante(s) contiene(n) una secuencia de ADN que codifica la totalidad o una parte de una enzima distinta de la CCR, tal como se define anteriormente.

Este último método recurre al mecanismo de co-supresión (= supresión concomitante). La co-supresión se ha observado cuando se han introducido en el genoma unas copias del gen endógeno. Aunque el mecanismo de la co-supresión sea actualmente desconocido, una de las hipótesis, más frecuentemente retenida, es que la regulación negativa de la expresión del gen procedería de la producción de una pequeña proporción de ARN antisentido derivado de un transgén a través de la lectura de la hebra "mala" del transgén (Grierson y colaboradores, Trends Biotech., 9: 122-123).

El invento tiene igualmente como objeto un procedimiento de disminución de la cantidad de ligninas producidas por biosíntesis en las plantas, realizándose este procedimiento por transformación del genoma de estas plantas, incorporando en éste una secuencia de ADN tal como se describe anteriormente según el invento, que codifica una secuencia antisentido que comprende uno (o varios) dominio(s) catalítico(s) de una ribozima, unido(s) con uno (o varios) ARNm antisentido, o uno (o varios) fragmento(s) de ARNm antisentido del invento, realizándose dicha transformación con la ayuda de un vector recombinante que comprende una secuencia nucleotídica recombinante según el invento que, por su parte, contiene la secuencia de ADN antes mencionada.

Es importante señalar que los métodos antes mencionados permiten llegar a unas plantas transformadas que presentan niveles diferentes de reducción de la actividad de CCR (según cuáles sean el nivel de inserción de la secuencia de ADN que codifica el ARNm antisentido, el número de copias de esta secuencia de ADN que se ha integrado en el genoma, etc.), y por lo tanto los contenidos de ligninas.

La elección de los transformantes permitirá, por lo tanto, una modulación controlada de los contenidos en cuanto a ligninas, que sea compatible con un desarrollo normal de la planta.

De una manera general, si se considera que el contenido medio normal de una planta en cuanto a ligninas varía entre aproximadamente 15% y aproximadamente 35% en peso de material seco, en que la reducción del contenido de ligninas resulta de la puesta en práctica de uno de los procedimientos antes mencionados, es ventajosamente tal que las plantas así transformadas presentan un contenido medio de ligninas que varía entre aproximadamente 10% y aproximadamente 30%, o también entre aproximadamente 12% y aproximadamente 32%.

A título de ilustración, el contenido de una planta en cuanto a ligninas se puede medir según una variante del método de Johnson y colaboradores, (1961), T.A.P.P.I., 44, 793-798, que se describe con detalle en la cita de Alibert y Boudet (1979), Physiol., Veg., 17 (1), 67-74, y cuyas principales etapas son las siguientes: después de la obtención de un polvo de alcohol y benceno que contiene las ligninas del material vegetal, las ligninas son solubilizadas por el bromuro de acetilo y dosificadas en función de su absorción en la región ultravioleta.

El invento se refiere más particularmente a la aplicación de los procedimientos antes mencionados de disminución de los contenidos de ligninas en las plantas, a la obtención de plantas forrajeras transformadas genéticamente, que presentan unos contenidos de ligninas que se han reducido con relación a los contenidos normales de ligninas en estas plantas, y cuya digestibilidad se encuentra así mejorada con relación a estas mismas plantas no transformadas.

Entre las principales plantas forrajeras susceptibles de ser transformadas en el marco del presente invento, se pueden citar: alfalfa, festuca, maíz destinado a ensilar, etc.

El invento se refiere igualmente a la aplicación de los procedimientos antes mencionados de disminución de los contenidos de ligninas en las plantas, a la obtención de plantas, y más particularmente de árboles, que se han transformado genéticamente, y que presentan unos contenidos de ligninas que se han reducido con relación a los contenidos normales de ligninas en estas plantas, siendo estas plantas o estos árboles particularmente ventajosos para utilizarse en el marco de la producción de la pasta de papel.

Un tercer sector potencial de aplicación de los procedimientos antes mencionados de regulación negativa de la expresión del gen de la CCR, se refiere a la estimulación del crecimiento de las platas transformadas. Diversos argumentos subrayan (véase la cita de Sauter y Kende, 1992, Plant and Cell Physiology, 33 (8):1089), que una lignificación precoz y rápida es un freno para el aumento del tamaño de las células y, por lo tanto, para el crecimiento de los vegetales. Así, la puesta en práctica de los procedimientos antes mencionados es susceptible de permitir, para las plantas así transformadas con lignificación reducida, un mejor crecimiento y, por lo tanto, mejores rendimientos.

El invento se refiere igualmente a un procedimiento de aumento de la cantidad de ligninas producidas por biosíntesis en las plantas, efectuándose este procedimiento por transformación del genoma de estas plantas, incorporando en éste:

- y, llegado el caso, por lo menos una secuencia de ADN que codifica la totalidad o una parte de otra enzima distinta de la CCR, que se encuentra estar implicada en una etapa de biosíntesis de las ligninas en las plantas, en particular una secuencia de ADN que codifica la totalidad o una parte de la CAD,

realizándose dicha transformación:

- ya sea con la ayuda de un vector recombinante tal como se describe anteriormente, que contiene la secuencia de ADN según el invento, antes mencionada, o un fragmento o una secuencia derivada de esta última, tales como se definen anteriormente, y que, llegado el caso, contienen una (o varias) secuencia(s) de ADN que codifica(n) la totalidad o una parte de una enzima distinta de la CCR, tal como se define anteriormente,

De una manera general, siempre si se considera que el contenido medio normal de una planta en cuanto a ligninas varía entre aproximadamente 15% y aproximadamente 35% en peso del material seco, el aumento del contenido en cuanto a ligninas que resulta de la puesta en práctica del procedimiento antes mencionado, es ventajosamente tal que las plantas así transformadas presentan un contenido medio de ligninas que varía entre aproximadamente 20% y aproximadamente 40%, entre aproximadamente 18% y aproximadamente 38%.

El invento se refiere más particularmente a la aplicación del procedimiento antes mencionado de aumento de los contenidos de ligninas en las plantas (también denominado procedimiento de sobreexpresión del gen de la CCR), a la obtención de plantas transformadas genéticamente, que presentan unos contenidos de ligninas que se han aumentado con relación a los contenidos normales de ligninas en estas plantas, y cuyas propiedades de resistencia a los ataques del medio ambiente, en particular a los ataques por parásitos, se encuentran de esta manera haber mejorado con relación a estas mismas plantas no transformadas. Es particularmente ventajoso en este último caso utilizar, en asociación con el gen de CCR, o una secuencia derivada, en los vectores antes mencionados, unos promotores específicos particularmente expresados en los tejidos de superficie y/o como respuesta a la herida.

Por lo demás, el invento se refiere igualmente a la aplicación del procedimiento antes mencionado de sobre-expresión del gen de la CCR, para el mejoramiento del crecimiento de las plantas así transformadas genéticamente, en particular en ciertos sectores tales como la horticultura o la arboricultura, donde es deseable obtener plantas con dimensiones reducidas.

Finalmente, los anillos bencénicos de la lignina tienen una energía intrínseca mayor que la de las cadenas alifáticas de los residuos de glucosa de la celulosa. Así, el aumento de la proporción de ligninas en los vegetales utilizados como combustibles, según el procedimiento antes mencionado del invento, permite mejorar el potencial energético de estos vegetales combustibles, así transformados.

En los dos casos de regulación negativa o de sobreexpresión de la CCR, es del todo factible que la modulación de esta actividad repercuta sobre el contenido de las plantas transformadas en cuanto a ligninas. En efecto, la CCR cuyo nivel de actividad es muy bajo en la planta, parece constituir la enzima reguladora de la síntesis de las ligninas.

Al tratarse de las técnicas de transformación utilizadas para la puesta en práctica de uno de los procedimientos descritos anteriormente del invento, se recurrirá ventajosamente a las técnicas siguientes:

A) La tecnología de transformación por intermedio del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, descrita por Bevan (1984) Nucleic Acid Research, 12: 8711-8721. Ésta recurre esencialmente al método de cultivación concomitante, y hace intervenir una transformación concomitante con un gen de selección para poder marcar los transformantes.

Esta tecnología es particularmente aplicable a las plantas dicotiledóneas, p.ej.: tabaco, alfalfa, colza.

B) La tecnología de transferencia directa de genes por biolística, descrita con detalle por (Zumbrum y colaboradores, 1989, Technique 1, 204-216: Sanford y colaboradores, 1991, Technique 3, 3-16).

Esta técnica implica la asociación del ADN recombinante de acuerdo con el invento con unas micropartículas de oro o de wolframio, que son propulsadas con la ayuda de un cañón de partículas sobre el tejido que se ha de transformar. Ésta será aplicada particularmente a la transformación de especies que sean refractarias a las agrobacterias.

En los dos casos antes mencionados, la comprobación de la presencia del ADN recombinante según el invento se realizará mediante experiencias de hibridación del tipo de Southern y de amplificación génica (reacción en cadena de la polimerasa) con la ayuda de sondas y de cebos oligonucleotídicos procedentes en particular de la secuencia SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7 o SEQ ID NO 9.

El invento se refiere igualmente a las células de plantas transformadas por un vector según el invento, en particular por las técnicas descritas anteriormente, y que comprenden una secuencia de ADN según el invento, integrada de una manera estable en su genoma.

El invento se refiere igualmente a las plantas transformadas tales como se han obtenido por cultivación de las células transformadas antes mencionadas.

Las plantas transformadas pueden ser seguidamente propagadas por vía sexual o por vía vegetativa in vitro o in natura.

El invento tiene igualmente como objeto los fragmentos de plantas, en particular frutas, semillas, polen, que se han transformado por incorporación en su genoma de una secuencia de ADN según el invento, con la ayuda de los vectores recombinantes antes mencionados.

El invento se refiere igualmente a los anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos recombinantes del invento, y más particularmente los dirigidos contra las CCR recombinantes antes mencionadas.

Tales anticuerpos se pueden obtener por inmunización de un animal con estos polipéptidos, seguida por la recuperación de los anticuerpos formados.

Es evidente que esta producción no se limita a los anticuerpos policlonales.

Ésta se aplica también a cualquier anticuerpo monoclonal producido por cualquier hibridoma susceptible de ser formado, por unos métodos clásicos, a partir de las células esplénicas de un animal, en particular de un ratón o de una rata, inmunizados contra alguno de los polipéptidos purificados del invento, por una parte, y de las células de un mieloma apropiado, por otra parte, y de ser seleccionado, por su capacidad para producir anticuerpos monoclonales que reconozcan al polipéptido antes mencionado, inicialmente empleado para la inmunización de los animales.

El invento se refiere igualmente a la utilización de los anticuerpos antes mencionados dirigidos contra los polipéptidos recombinantes del invento, para la puesta en práctica de un método de detección o de dosificación de la CCR en las plantas, a partir de muestras tomadas en estas últimas.

El invento será detallado más aun en la descripción que sigue de la obtención de la CCR en forma purificada en el eucalipto, y del ADNc que codifica la CCR de eucalipto, de álamo, de la festuca alta y del tabaco.

A) Obtención de la CCR de eucalipto purificada, y del ADNc que codifica una CCR de eucalipto I Purificación de la CCR de eucalipto

La CCR ha constituido el objeto de un número muy restringido de estudios. Entre las algunas publicaciones que la conciernen, pueden citarse las de:

Wengenmayer H., Ebel J., Grisebach H., 1976 - Enzymatic synthesis of lignin precursors, purification and propertiers of a cinnamoyl CoA: NaDPH reductase from cell suspension cultures from soybean (Glycine max), [Síntesis enzimática de precursores de lignina, purificación y propiedades de una cinamoíl CoA: NaDPH reductasa procedente de cultivos en suspensión de células a partir de soja (Glycine max), Eur. J. Biochem., 65: 529-536.

Luderitz T., Grisebach H., 1981 - Enzymatic synthesis of lignin precursors, comparison of cinnamoyl: CoA reductase and cinnamoyl alcohol dehydrogenase: NADP dehydrogenase from spruce (Picea abies L.) and soybean (Glycine max L.), [Síntesis enzimática de precursores de lignina, comparación de la cinamoíl: CoA reductasa y de la alcohol cinamílico deshidrogenasa: NADP deshidrogenasa procedente de pícea (Picea abies L.) y de soja (Glycine max L.), Eur. J. Biochem., 119: 115-127.

Sarni F., Grand C., Boudet A.M., 1984 - Purification and properties of cinnamoyl: CoA reductase and cinnamoyl alcohol dehydrogenase from poplar stems (Populus x euramericana), [Purificación y propiedades de la cinamoíl: CoA reductasa y alcohol cinamílico deshidrogenasa procedente de tallos de álamo] (Populus x euramericana), Eur. J. Biochem., 139: 259-265.

El trabajo descrito seguidamente ha contribuido a definir un protocolo de purificación original, simple y rápido, de la CCR de eucalipto. Este protocolo es igualmente más eficaz que los descritos precedentemente en la bibliografía. En efecto, ha permitido por primera vez la obtención de unas cantidades de una enzima, purificada hasta homogeneidad, que son suficientes para obtener secuencias peptídicas internas y conducir dentro de plazo a la clonación del ADNc correspondiente.

Todas las etapas de purificación de la CCR se han realizado a 4ºC.

1. Obtención de un extracto bruto de xilema de eucalipto

El material vegetal se ha obtenido por "rascado" de una fracción tisular enriquecida en cuanto a xilema de ramas de Eucalyptus gunnii con una antigüedad de 5 años.

300 g de un xilema previamente congelado en nitrógeno líquido han sido reducidos al tamaño de polvo con la ayuda de un molino de café. El material triturado así obtenido se ha homogeneizado en un litro de un tampón para extracción (100 mM de Tris-HCl, pH 7,6, 2% de PEG 6000, 5 mM de DTT, 2% de PVPP), se ha filtrado sobre dos capas de Miracloth y se ha llevado al 30% de la saturación en sulfato de amonio. Después de una centrifugación durante 30 minutos a 15.000 xg, el sedimento obtenido se vuelve a poner en suspensión en 60 ml de un tampón 1 [20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM de DTT (ditiotreitol), 5% de etilen glicol]. El extracto así obtenido es "clarificado" por una centrifugación durante 15 minutos a 10.000 xg, y luego es desalinizado por paso a través de una columna de Sephadex G25 equilibrada en el tampón 1.

2. Cromatografía de afinidad sobre Red Sepharose

El extracto bruto desalinizado se deposita sobre una columna de afinidad con "Red Sepharose" (1,5 x 19 cm, Pharmacia), equilibrado en el tampón 1. Después de un primer enjuague de la columna con 50 ml del tampón 1, las proteínas son eluidas por un gradiente lineal de Tris desde 20 mM hasta 1,5 M de Tris-HCl, pH 7,5, que contiene 5 mM de DTT y 5% de etilen glicol. El volumen total del gradiente es de 200 ml y el caudal es de 36 ml/h, las fracciones que presentan una actividad de CCR son reagrupadas y desalinizadas por paso a través de una columna de Sephadex G25, equilibrado en el tampón 1.

3. Cromatografía por intercambio de aniones sobre monoQ

Las fracciones así reagrupadas y desalinizadas se cromatografían en una columna de intercambio de aniones MonoQ (HR 5/5, Pharmacia). La elución de las proteínas se efectúa mediante la aplicación de un gradiente lineal desde 20 a 300 mM de Tris-HCl, de pH 7,5, que contiene 5% de etilen glicol y 5 mM de DTT. El volumen total del gradiente es de 50 ml y el caudal es de 1 ml/min. Como en la etapa precedente, las fracciones que contienen la enzima CCR activa son reagrupadas y desalinizadas, pero en este caso el tampón de equilibración de las columnas de Sephadex G25 es un tampón de fosfato 20 mM de pH 7,6, que contiene 5 mM de DTT (tampón 2).

4. Cromatografía de afinidad sobre "Mimetic Red"

El grupo de fracciones de CCR, que así se ha obtenido, se deposita sobre una columna con Mimetic Red 2 A6XL (ACL, Cambridge). La columna es previamente lavada con 30 ml de un tampón 2 que contiene 8 mM de NAD. Este lavado tiene como finalidad la de eliminar unas enzimas que funcionan específicamente con la NAD como cofactor, tal como la malato deshidrogenasa que purifica concomitantemente con la CCR en las etapas precedentes. La elución específica de la CCR se obtiene por aplicación de un gradiente (15 ml) de NADP de 0-8 mM en el tampón 2. Las fracciones que contienen la CCR pura y activa se conservan a -80ºC después de la adición de un estabilizador (etilen glicol en la concentración final de 5%).

La enzima purificada, que así se ha obtenido, presenta una actividad específica de 451 nKat/mg de proteína, utilizando el feruloíl CoA como substrato. El rendimiento obtenido (36 \mug de proteína pura por 300 g de material vegetal de partida) no refleja la proporción de CCR in planta, en efecto, en un deseo principal de eliminar el máximo de los contaminantes en cada etapa de purificación, solamente las fracciones, que presentan una muy fuerte actividad de CCR, son tratadas por la etapa siguiente. El factor de purificación obtenido por este protocolo es de 282.

II Caracterización de la CCR

La CCR de eucalipto es un monómero de 38 kD tal como lo testimonian los resultados convergentes obtenidos para el tamaño de la enzima nativa por cromatografía de exclusión sobre Superose 6 (Pharmacia), y para el tamaño de la subunidad monomérica sobre un gel de electroforesis desnaturalizante. El punto isoeléctrico, estimado por cromatografía sobre MonoP (Pharmacia), es próximo a 7.

La investigación del pH y del tampón óptimo hace ponerse de manifiesto que la medición de la actividad de CCR, tal como se ha descrito inicialmente (por Luderitz y Grisebach, 1981), está adaptada perfectamente a la medición de la actividad de CCR de eucalipto (tampón fosfato 100 mM, pH 6,25).

La pureza de la CCR, presente en el estado de una banda única sobre un gel de electroforesis monodimensional (SDS PAGE), ha sido confirmada por la obtención de una sola mancha ("spot") después de una electroforesis bidimensional y de una coloración con plata.

III Obtención del ADNc que codifica la CCR de eucalipto

Con el fin de liberarse de un eventual problema de contaminación residual no detectable, la enzima pura ha sido sometida a una electroforesis preparativa en condiciones semi-desnaturalizadoras y ha sido digerida in situ en el gel. La digestión se ha realizado con la ayuda de endolisina C, que corta específicamente las proteínas con los residuos de lisina, permitiendo la obtención de péptidos relativamente largos. Los péptidos que resultan de la digestión han sido separados en fase inversa en una HPLC y ciertos de ellos han sido secuenciados con la ayuda de un aparato microsecuenciador de proteínas (Applied Biosystems 470). Las secuencias de estos péptidos internos figura seguidamente:

\newpage

péptido 8	(a)	Asn-Trp-Tyr-Cys-Tyr-Glys-Lys
	(b)	His-Leu-Pro-Val-Pro-X-Pro-Pro-Glu-Asp-Ser-Val-Arg

		representando X cualquier aminoácido

péptido 10		Thr-Tyr-Ala-Asn-Ser-Val-Gln-Ala-Tyr-Val-His-Val-Lys

péptido 13		Gly-Cys-Asp-Gly-Val-Val-His-Thr-Ala-Ser-Pro-Val-Thr-Asp-Asp

péptido 17		Leu-Arg-Asp-Leu-Gly-Leu-Glu-Phe-Thr-Pro-Val-Lys

péptido 18		Gly-Asp-Leu-Met-Asp-Tyr-Gly-Ser-Leu-Glu-Glu-Ala-Ile-Lys

El ADNc que codifica la CCR se ha obtenido por escrutinio con ayuda de oligonucleótidos de un banco de ADNc construido en el fago \lambda ZAPII (vector comercialmente disponible, de Stratagene) a partir de mensajeros extraídos del xilema de Eucaliptus gunnii. 600.000 fagos han sido escrutados con la ayuda de un grupo de oligonucleótidos degenerados, marcados en el extremo 3' con fósforo 32, con la ayuda de una transferasa terminal. Las secuencias de los oligonucleótidos que se utilizan para el escrutinio, se han determinado a partir de las secuencias peptídicas internas antes mencionadas. Al haber sido generados estos péptidos por corte con la endolisina C, se ha añadido una lisina en la primera posición para permitir la elaboración de oligonucleótidos con menor degeneración. En efecto, este aminoácido, que no puede ser codificado más que por dos codones, forma parte de los aminoácidos cuyo código es el menos degenerado y, como consecuencia, es del todo conveniente para la elaboración de oligonucleótidos a partir de secuencias peptídicas.

Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados para el escrutinio del banco de ADNc del eucalipto, derivados de los aminoácidos subrayados (I = inosina), se indican seguidamente:

péptido 8 (a)	Lys-Asn-Trp-Tyr-Cys-Tyr-Gly-Lys
oligonucleótido 8	AA(A/G)AA(C/T)TGGTA(C/T)TG(C/T)TA(T/C)GGIAA

péptido 13	Lys-Gly-Cys-Asp-Gly-Val-Val-His-Thr-Ala-Ser-Pro-Val-Thr-Asp- Asp
oligonucleótido 13	AA(G/A)GGITG(C/T)GA(C/T)GGIGTIGTICA

péptido 17	Lys-Leu-Arg-Asp-Leu-Gly-Leu-Glu-Phe-Thr-Pro-Val-Lys
oligonucleótido 17	GA(G/A)TT(C/T)ACICCIGTIAA

péptido 18	Lys-Gly-Asp-Leu-Met-Asp-Tyr-Gly-Ser-Leu-Glu-Glu-Ala-Ile-Lys
oligonucleótido 18	AA(G/A)GGIGA(C/T)(C/T)TIATGGA(C/T)TA(C/T)GG

Las condiciones de hibridación, utilizadas para el escrutinio son las siguientes: la hibridación preliminar se efectúa durante 6 a 7 horas en el 5XSSPE, 0,25% de polvo de leche desnatada, 0,05% de SDS (dodecil sulfato de sodio) a 42ºC. La hibridación se realiza en esta misma solución, en presencia de los 4 oligonucleótidos marcados en 3' en el ddATP\alpha^{32}P, durante 24 horas a 42ºC. Al cabo de estas 24 horas de hibridación, los filtros se lavan tres veces durante 15 minutos en el 2XSSC, 0,1% de SDS, y luego se ponen en contacto con una película autorradiográfica durante 24 horas a -80ºC. Los fagos, que se hibridan con el grupo de oligonucleótidos, se han purificado por 2 rondas suplementarias de escrutinio ("purificación de placas o calvas"). Una vez purificados, los seis clones positivos se han ensayado con cada uno de los oligonucleótidos tomados de manera independiente. Un fago ha reaccionado positivamente con los 4 oligo-nucleótidos, ha sido tratado de manera tal que "escinda" al plásmido Bluescript recombinante siguiendo las indicaciones del fabricante (Stratagene). El mapa de restricción del inserto (que codifica la CCR) contenido en este plásmido, se esquematiza en la figura 1.

IV Caracterización e identificación del ADNc de la CCR

La secuencia de aminoácidos (representada por SEQ ID NO 2) deducida de la secuencia nucleotídica (representada por SEQ ID NO 1) codifica una proteína de 335 aminoácidos cuyo peso molecular es de 36,5 kD y cuyo punto isoeléctrico es de aproximadamente 5,8. Es importante subrayar que todas las secuencias peptídicas obtenidas a partir de la CCR purificada se encuentran en la secuencia peptídica deducida de la secuencia nucleotídica del ADNc.

Unas investigaciones de homologías con unos clones ya existentes, se han efectuado utilizando los programas BLAST y FASTA en todos los bancos proteínicos y nucleicos disponibles. Se ha encontrado una homología significativa con otra reductasa del metabolismo de los compuestos fenólicos, la dihidroflavonol reductasa (DFR). La identidad es de aproximadamente 40% y la similaridad está próxima a 20% entre la secuencia peptídica deducida del ADNc de la CCR y las secuencias de las diversas dihidroflavonol reductasas que se han catalogado en los bancos, lo cual conforma que el clon identificado es diferente de un clon que codifica una DFR.

V Producción de una CCR recombinante activa en E. coli

Para ir más lejos en la identificación del ADNc de la CCR, la proteína recombinante se ha producido en E. coli y se ha investigado su actividad enzimática. Los detalles experimentales de este enfoque se describen seguidamente.

1 - Introducción del ADNc en el vector de expresión pT7-7

A fin de poder clonar el ADNc en el vector de expresión pT7-7 (disponible comercialmente), bajo el control del promotor de la polimerasa de T7, hemos tenido que introducir un sitio para N del en el ATG del ADNc. Esto se ha realizado con la ayuda de una polimerasa de Taq durante una reacción de amplificación génica por una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) entre un oligonucleótido mutado y un cebo comercial, el T7, situado sobre Bluescript más abajo del extremo 3' del ADNc. El producto de amplificación obtenido es digerido por Kpnl, este sitio se repara seguidamente con la ayuda del fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN, antes de someter el fragmento a una digestión por Ndel y luego el fragmento obtenido que comprende un sitio para Ndel en 5' y se inserta un extremo libre en 3' con la ayuda de un ligasa de T4 de ADN en el vector pT7-7 previamente abierto por Ndel y Small.

La secuencia del oligonucleótido mutado antes mencionado se indica a continuación.

Las bases subrayadas y escritas en letras cursivas se han modificado con relación a la secuencia inicial, permitiendo la creación de un sitio para Ndel (CATATG):

5'GGCAATCCC CAT ATGCCCGTCGACGC3'

2. Sobreexpresión de CCR en E. coli BL21

La construcción así obtenida se introduce en la cepa de E. coli BL21 (disponible comercialmente) que lleva en su cromosoma el gen de la polimerasa de T7 bajo el control del promotor lac UV5, promotor inducible por el IPTG. El cultivo recombinante se cultiva a 37ºC hasta la obtención de una DO (densidad óptica) de 1 medida a 600 nm, y luego se induce la producción de la CCR por la adición de IPTG (0,25% final) en el medio de cultivo. Unas tomas se realizan en diferentes momentos después de la inducción y las células se lisan de acuerdo con el protocolo descrito por Grima-Pettenati y colaboradores (1993). Después de una centrifugación, el material sobrenadante, que contiene las proteínas solubles, se utiliza para medir la actividad de CCR y para visualizar la producción de CCR después de una electroforesis en condiciones desnaturalizadoras. En la figura 2, se observa la aparición de un polipéptido de aproximadamente 38 kD cuya intensidad crece con el tiempo después de la inducción y que no existe en los testigos negativos (cepa BL21 que contiene solamente el vector pT7-7 sin ningún inserto). Además, la demostración final de la identidad del clon CCR es aportada por la medición de la actividad de CCR (aproximadamente 7 nKat/ml de cultivo después de una inducción durante 3 h a 37ºC) en los extractos proteínicos que provienen de las cepas BL21 que contienen el pT7-7 + ADNc de CCR, solamente.

Leyendas de las figuras

Figura 1: mapa de restricción del ADNc que codifica la CCR de eucalipto.

Figura 2: revelado con azul de Coomassie de un gel de electroforesis en condiciones desnaturalizadoras (SDS-PAGE) de extractos proteínicos totales de E. coli BL21 que contienen el vector pT7-7 sin ningún inserto (pista 6 en el momento 0 de la inducción por el IPTG; 7, 3 horas después de la inducción) y el vector pT7-7 que contiene el ADNc de la CCR (pistas 1, 2, 3, 4, 5, respectivamente, momento 0 de la inducción, 30 min, 1, 2, 3 horas después de la inducción), la flecha designa al monómero CCR.

Figura 3: representación esquemática del plásmido pEUCCR que contiene la secuencia representada por SEQ ID NO 1 (e identificada por CCR en el plásmido pEUCCR).

Figura 4: representación esquemática del plásmido de la construcción de un vector que contiene una secuencia de ADN que codifica la CCR de eucalipto según el invento (o vector CCR del mismo sentido).

Figura 5: representación esquemática de la construcción de un vector que contiene una secuencia de ADN que codifica un ARN antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica la CCR de eucalipto según el invento (o vector CCR antisentido).

En lo referente al ADN "de fuente" que sirve para la construcción de un vector antisentido (o del mismo sentido)

El ARN antisentido se deriva preferentemente de la secuencia contenida en el clon pEUCCR. Esta secuencia se puede obtener de diferentes maneras:

1) cortando con unas enzimas de restricción apropiadas la secuencia de ADN (ADNc) de la CCR contenida en pEUCCR,

2) realizando una amplificación génica (por PCR) con la ayuda de oligonucleótidos definidos de manera tal que se sintetice el deseado fragmento de ADN.

El fragmento de ADN, así obtenido, es clonado en un vector de expresión de las plantas situado más arriba de un promotor y más abajo de un terminador. La clonación se realiza de tal manera que el fragmento de ADN sea insertado en orientación inversa con relación al promotor. En este nuevo vector, la hebra que inicialmente era la hebra matriz se convierte en la hebra codificadora y viceversa.

El nuevo vector codifica un ARN cuya secuencia es complementaria de la secuencia del ARN mensajero deducido de la secuencia contenida en pEUCCR.

Así, los 2 ARN son complementarios en cuanto a su secuencia pero también en cuanto a su orientación (5'-3').

Como fuente de ADN para la transcripción del ARN antisentido es práctico utilizar un clon de ADNc tal como el que está contenido en pEUCCR.

Ejemplo de clonación (compárese la figura 5)

El ADNc de la CCR se obtiene por una doble digestión (con BamHI y KpnI) a partir del vector pEUCCR. El fragmento de ADN, que así se ha liberado, se separa físicamente del vector de clonación mediante una electroforesis en gel de agarosa (Bluescript).

La parte del gel, que contiene este fragmento de ADN, es cortada y tratada de tal manera que se obtenga el ADN purificado (se pueden utilizar varios métodos, entre los cuales se encuentra el de la "Low melting Agarose = agarosa de bajo punto de fusión", descrita en la cita de Sambrook y colaboradores, antes mencionada, el de Gene Clean [gen limpio], cuyo estuche está disponible comercialmente).

El fragmento que es portador de los extremos BamHI y KpnI es "ligado" con un vector de expresión de plantas, previamente digerido por estas mismas enzimas, escogidas de tal manera que el ADNc sea insertado en orientación inversa con relación al promotor ^{35}S. La hebra que será transcrita en las plantas, será en este caso la hebra no codificadora.

Ejemplo de clonación en el mismo sentido (compárese la figura 4)

En este caso, no existen sitios de restricción "prácticos" para realizar una fusión por traducción con el promotor ^{35}S del vector de expresión. Unos nuevos sitios más cómodos han sido insertados con la ayuda de la técnica de amplificación génica (por PCR). Dos oligonucleótidos han sido definidos en 5' y 3' del ADNc, a los cuales se han añadido las secuencias de los sitios reconocidos por KpnI y BamHI (nota de los autores: éstos son los mismos sitios que se han utilizado para la clonación antisentido antes mencionada, pero colocados de manera diferente con relación a la orientación 5'-3').

La amplificación génica conduce a la obtención de un fragmento que contiene la totalidad de la secuencia codificadora del ADNc flanqueado por 2 sitios de restricción. La continuación del proceso es idéntica a la descrita para la construcción antisentido.

No obstante, en este caso, se ha realizado una fusión del promotor en fase con la ATG de la CCR, que debe conducir a una sobreexpresión del ARN mensajero y, por lo tanto, de la proteína CCR.

B) Obtención del ADNc que codifica la CCR del álamo

El ADNc se ha obtenido por escrutinio de un banco de ADNc construido en el fago lambda ZAPII (de Stratagene) a partir de mensajeros extraídos de xilemas de álamos con una antigüedad de 2 años (Populus trichocarpa). Los fagos han sido escrutados con la ayuda del ADNc aislado en Eucalyptus gunnii (fragmento para Xhol de 804 pb (pares de bases) de pEUCCR) marcado por cebado aleatorio con dCTP\alpha^{32}P.

Las condiciones de hibridación utilizadas para el escrutinio son las siguientes: la hibridación previa se efectúa durante una noche a 68ºC en 6X SSC, 5 x de Denhart, 0,5% de SDS, 100 \mug de ADN de esperma de salmón. La hibridación se realiza en el mismo tampón sin adición de un reactivo de Denhart, durante una noche a 60ºC. Las membranas se lavan seguidamente 2 veces durante 30 minutos en 0,1X SSC, 0,5% de SDS a 60ºC.

Un clon que contiene el ADNc completo ha sido purificado, subclonado y secuenciado en las dos direcciones. La secuencia de ADNc es la representada por SEQ ID NO 3 y la secuencia de aminoácidos, deducida de esta última, es la representada por SEQ ID NO 4.

La comparación entre las secuencias de aminoácidos de la CCR de eucalipto y la del álamo muestra una identidad de 83% y una homología de 93% entre estas dos secuencias.

C) Obtención del ADNc que codifica la CCR de festuca

El ADNc se ha obtenido por escrutinio de un banco de ADNc construido en el fago lambda ZAPII (Stratagene) a partir de mensajeros extraídos de hojas de Festuca arundinacea. Se han escrutado 500.000 fagos con la ayuda del ADNc aislado en Eucalyptus gunnii (fragmento para Xhol de 804 pb de pEUCCR) marcado por cebado aleatorio con dCTP\alpha^{32}P.

Las condiciones de hibridación utilizadas para el escrutinio son las siguientes: la hibridación previa se efectúa durante 6 horas en el 5X SSPE, SDS 0,5%, ADN de esperma de salmón 0,1 mg/ml, Ficoll tipo 400 1 mg/ml, poli(vinil-pirrolidona) 1 mg/ml, BSA 1 mg/ml a 60ºC. La hibridación se realiza en esta misma solución, en presencia de la sonda marcada con dCTP\alpha^{32}P, durante 16 horas a 60ºC. Los filtros se lavan seguidamente 2 veces durante 15 minutos en el 2X SPPE, 0,1% de SDS a 60ºC y luego 2 veces en el 0,5X SSPE, 0,1% de SDS a 60ºC y finalmente se ponen en contacto con una película autorradiográfica durante 3 días a -80ºC. Los fagos se han purificado por 2 ó 3 rondas suplementarias de escrutinio.

Una vez purificados, se han analizado 3 clones después de que el plásmido pBluescript haya sido extinguido siguiendo las indicaciones del suministrador (Stratagene).

La secuenciación ha permitido eliminar un clon y mostrar que los otros 2 clones eran idénticos y correspondían a la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 5 que codifica la CCR de festuca, tal como se representa por SEQ ID NO 6.

D) Obtención del ADNc que codifica la CCR de tabaco

El ADNc se ha obtenido por escrutinio de un banco de ADNc construido en el fago lambda ZAPII (Stratagene) a partir de mensajeros extraídos de tallos de tabaco. Los fagos han sido escrutados con la ayuda del ADNc aislado en Eucalyptus gunnii (fragmento Xhol de 804 pb de pEUCCR) marcado por cebado aleatorio con dCTP\alpha^{32}P.

Las condiciones de hibridación utilizadas para el escrutinio son las siguientes: la hibridación previa se efectúa en 0,25% de Marvel, 5X SSPE, 0,05% de SDS a 58ºC. La hibridación se realiza en este mismo tampón, en presencia de 50 mg de una sonda marcada con dCTP\alpha^{32}P, a 58ºC. Los filtros son lavados entonces con 2X SSC/0,1% de SDS durante 20 minutos a la temperatura ambiente, con 2X SSC/0,1% de SDS durante 20 minutos a 58ºC, 1X SSC/0,1% de SDS durante 15 minutos a 58ºC.

El plásmido pBluescript SK^{-} que contiene el clon de ADNc clonado en el sitio para EcoR1, utilizando adaptadores de EcoR1), ha sido escindido in vivo.

El ADNc obtenido es representado por SEQ ID NO 7, y la secuencia de aminoácidos deducida de este ADNc es representa por SEQ ID NO 8.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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(B): CALLE: rue Michel-Ange

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(C): LOCALIDAD: PARÍS-75016

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(E): PAÍS: FRANCIA

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(F): CÓDIGO POSTAL: F-75016

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(ii): TÍTULO DEL INVENTO: SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN UNA CINAMOÍL CoA REDUCTASA Y SUS APLICACIONES EN EL SECTOR DE LA REGULACIÓN DE LOS CONTENIDOS DE LIGNINAS DE LAS PLANTAS

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(iii): NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 10

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(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): SOPORTE DE DATOS: Disquete

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATORIO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SISTEMA LÓGICO - SOFTWARE:

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: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25

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: (Oficina Europea de Patentes)

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1297 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): FORMA DE HEBRAS: doble

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(D): CONFIGURACIÓN: lineal

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(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARNm

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(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): EMPLAZAMIENTO: 136..1140

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

3

4

5

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 335 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(D): CONFIGURACIÓN: lineal

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(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

7

8

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1376 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): FORMA DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

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(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARNm

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(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): EMPLAZAMIENTO: 99..1112

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 338 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1273 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): EMPLAZAMIENTO: 66..1091

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

14

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 342 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

17

18

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1293 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): EMPLAZAMIENTO: 95..1108

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

19

20

21

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 338 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

22

23

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1297 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): EMPLAZAMIENTO: 136..1140

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

24

25

26

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 335 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

27

28

Claims

1. Utilización de secuencias nucleotídicas recombinantes que contienen una (o varias) región (regiones) codificadora(s), estando constituida(s) esta(s) región (regiones) codificadora(s):

a): por una secuencia nucleotídica que codifica un ARN mensajero (ARNm), codificando este ARNm, por su parte una cinamoíl CoA reductasa (CCR) en las plantas, o por una secuencia nucleotídica derivada de la secuencia nucleotídica antes mencionada, en particular por mutación y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, una proteína derivada que presenta un actividad de CCR, o

b): por una secuencia nucleotídica complementaria de la secuencia nucleotídica que codifica un ARNm, o de la secuencia derivada de esta última, tales como se definen en a), codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con uno de los ARNm antes mencionados, teniendo como efecto dicha hibridación inhibir la síntesis de la CCR

para la transformación de células vegetales, con vistas a la obtención de plantas transgénicas en cuyo seno se regula la síntesis de lignina, ya sea en el sentido de un aumento, ya sea en el sentido de una disminución, de los contenidos de lignina que se han producido, con relación a los contenidos normales de lignina que se han producido en las plantas.

2. Utilización de secuencias nucleotídicas recombinantes según la reivindicación 1, caracterizada porque éstas contienen, a título de región codificadora, la totalidad o una parte de una secuencia nucleotídica escogida entre las siguientes:

-: la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 1, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR de eucalipto representada por SEQ ID NO 2,

-: la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 3, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR de álamo representada por SEQ ID NO 4,

-: la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 5, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR de festuca representada por SEQ ID NO 6,

-: la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 7, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR de tabaco representada por SEQ ID NO 8,

-: la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 7, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm codificado por las secuencias SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 7 respectivamente, teniendo como efecto dicha hibridación inhibir la síntesis de la CCR,

-: la secuencia nucleotídica derivada de la secuencia representada por SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 7, en particular por mutación y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada ya sea un ARNm, que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6 o SEQ ID NO 8 respectivamente, o una proteína derivada de estas últimas y que presenta una actividad de CCR en las plantas, particularmente la secuencia derivada de la secuencia SEQ ID NO 1 y representada por SEQ ID NO 9, codificando esta última un ARNm que codifica, por su parte, una proteína representada por SEQ ID NO 10 derivada de la CCR de eucalipto antes mencionada,

-: la secuencia nucleotídica derivada de la secuencia nucleotídica complementaria antes mencionada, por mutación y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con uno de los ARNm antes mencionados, teniendo como efecto dicha hibridación inhibir la síntesis de la CCR.

3. Secuencia de ADN, caracterizada porque comprende, a título de región codificadora:

-: la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 1, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 2, o

-: la secuencia nucleotídica derivada de la SEQ ID NO 1 y representada por SEQ ID NO 9, codificando esta última un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, una proteína representada por SEQ ID NO 10, derivada de la CCR de eucalipto.

4. Secuencia de ADN, caracterizada porque comprende, a título de región codificadora, la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 3, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 4.

5. Secuencia de ADN, caracterizada porque comprende, a título de región codificadora, la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 5, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 6.

6. Secuencia de ADN, caracterizada porque comprende, a título de región codificadora, la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO 7, que codifica un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 8.

7. Secuencia de ADN, caracterizada porque comprende, a título de región codificadora, la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 1, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm, que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 2, a saber el ARNm codificado por la secuencia representada por SEQ ID NO 1, o la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 9, codificando esta secuencia un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm antes mencionado, teniendo como efecto dicha hibridación inhibir la síntesis de la CCR.

8. Secuencia de ADN, caracterizada porque comprende, a título de región codificadora, la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 3, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 4, a saber el ARNm codificado por la secuencia representada por SEQ ID NO 3, teniendo como efecto dicha hibridación inhibir la síntesis de la CCR.

9. Secuencia de ADN, caracterizada porque comprende, a título de región codificadora, la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 5, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm, que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 6, a saber el ARNm codificado por la secuencia representada por SEQ ID NO 5, teniendo como efecto dicha hibridación inhibir la síntesis de la CCR.

10. Secuencia de ADN, caracterizada porque comprende, a título de región codificadora, la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEQ ID NO 7, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica, por su parte, la CCR representada por SEQ ID NO 8, a saber el ARNm codificado por la secuencia representada por SEQ ID NO 7, teniendo como efecto dicha hibridación inhibir la síntesis de la CCR.

11. ARNm codificado por una secuencia de ADN según una de las reivindicaciones 3 a 10 y más particularmente:

-: el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO 1, siendo dicho ARNm susceptible de codificar, por su parte, la CCR presente en el eucalipto, tal como se representa por SEQ ID NO 2,

-: el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO 9, siendo dicho ARNm susceptible de codificar, por su parte, una proteína derivada de la CC de eucalipto, tal como se representa por SEQ ID NO 10,

-: el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO 3, siendo dicho ARNm susceptible de codificar, por su parte, la CCR presente en el álamo, tal como se representa por SEQ ID NO 4,

-: el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO 5, siendo dicho ARNm susceptible de codificar, por su parte, la CCR presente en la festuca, tal como se representa por SEQ ID NO 6,

-: el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO 7, siendo dicho ARNm susceptible de codificar, por su parte, la CCR presente en el tabaco, tal como se representa por SEQ ID NO 8.

12. ARNm antisentido, caracterizado porque comprende unos nucleótidos complementarios de los nucleótidos que constituyen un ARNm según la reivindicación 11, y porque es susceptible de hibridarse con este último, teniendo como efecto dicha hibridación inhibir la síntesis de la CCR.

13. Complejo formado entre un ARNm antisentido según la reivindicación 12, y un ARNm según la reivindicación 11.

14. Secuencia nucleotídica recombinante caracterizada porque comprende por lo menos una secuencia de ADN según una de las reivindicaciones 3 a 6, susceptible de codificar un ARNm, que, por su parte, es susceptible de codificar un CCR en las plantas, siendo insertada dicha secuencia según una de las reivindicaciones 3 a 6 en una secuencia heteróloga.

15. Secuencia nucleotídica recombinante caracterizada porque comprende por lo menos una secuencia de ADN complementaria según una de las reivindicaciones 7 a 10, insertada en una secuencia heteróloga, codificando dicha secuencia de ADN complementario un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica una CCR en las plantas, teniendo como efecto dicha hibridación inhibir la síntesis de la CCR.

16. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, caracterizada porque comprende los elementos necesarios para regular la expresión de la secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 3 a 6, de su secuencia complementaria según una de las reivindicaciones 7 a 10, particularmente un promotor y un terminador de la transcripción de estas secuencias, y llegado el caso por lo menos una secuencia de ADN que codifica la totalidad o una parte de otra enzima distinta de la CCR, que se encuentra estar implicada en una etapa de biosíntesis de las ligninas en las plantas, particularmente el ARNm que codifica, por su parte, la alcohol cinamílico deshidrogenasa (CAD), o por lo menos una secuencia que codifica la totalidad o una parte del ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm antes mencionado, particularmente con el ARNm que codifica la CAD.

17. Vector recombinante caracterizado porque comprende una secuencia nucleotídica recombinante según una de las reivindicaciones 14 a 16, integrada en uno de los sitios de su genoma que no son esenciales para su replicación.

18. Procedimiento de regulación de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, ya sea por disminución, ya sea por aumento, de los contenidos de ligninas producidas, con relación a los contenidos normales de ligninas producidas en las plantas, comprendiendo dicho procedimiento una etapa de transformación de células de estas plantas con la ayuda de un vector que contiene:

a): una secuencia nucleotídica que codifica un ARN mensajero (ARNm), codificando este ARNm, por su parte, una CCR en las plantas, o una secuencia nucleotídica derivada de la secuencia nucleotídica antes mencionada, particularmente por mutación y/o adición, y/o supresión y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm, codificando este ARNm, por su parte, una proteína derivada que presenta un actividad de CCR, o

b): una secuencia nucleotídica complementaria de la secuencia nucleotídica que codifica un ARNm, o de la secuencia derivada de esta última, tales como se definen en a), codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con uno de los ARNm antes mencionados, teniendo como efecto dicha hibridación inhibir la síntesis de la CCR,

particularmente con la ayuda de un vector según la reivindicación 17.

19. Procedimiento de disminución de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, y por lo tanto de disminución de los contenidos de ligninas producidas con relación a los contenidos normales de ligninas producidas en las plantas, caracterizado porque se efectúa por transformación del genoma de estas plantas, incorporando en éste:

-: por lo menos una secuencia de ADN según una de las reivindicaciones 7 a 10,

-: y, llegado el caso, por lo menos una secuencia de ADN que codifica otra enzima distinta de la CCR, que se encuentra estar implicada en una etapa de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, particularmente el ARNm que codifica la CAD,

realizándose dicha transformación:

-: ya sea con la ayuda de un vector recombinante según la reivindicación 17, que contiene una secuencia nucleotídica recombinante según la reivindicación 15 o la reivindicación 16,

-: ya sea con la ayuda de varios vectores recombinantes de los que por lo menos uno contiene una secuencia nucleotídica recombinante según la reivindicación 15, mientras que el (o los) otro(s) vector(es) recombinante(s) contiene(n) una secuencia de ADN que codifica un ARNm antisentido capaz de hibridarse con un ARNm que codifica otra enzima distinta de la CCR, tal como se define anteriormente.

20. Procedimiento de disminución de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, y por lo tanto de disminución de los contenidos de ligninas producidas con relación a los contenidos normales en cuanto a ligninas producidas en las plantas, caracterizado porque se efectúa por transformación del genoma de estas plantas, incorporando en éste:

-: por lo menos una secuencia de ADN según una de las reivindicaciones 3 a 6,

-: y, llegado el caso, por lo menos una secuencia de ADN que codifica la totalidad o una parte de otra enzima distinta de la CCR, que se encuentra estar implicada en una etapa de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, particularmente una secuencia de ADN que codifica la totalidad o una parte de la CAD,

realizándose dicha transformación:

-: ya sea con la ayuda de un vector recombinante según la reivindicación 17, que contiene una secuencia nucleotídica recombinante según la reivindicación 14 o la reivindicación 16,

-: ya sea con la ayuda de varios vectores recombinantes de los que por lo menos uno contiene una secuencia nucleotídica recombinante según la reivindicación 14, mientras que el (o los) otro(s) vector(es) recombinante(s) contiene(n) una secuencia de ADN que codifica la totalidad o una parte de una enzima distinta de la CCR, tal como se define anteriormente.

21. Procedimiento de aumento de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, y por lo tanto de aumento de los contenidos de ligninas producidas con relación a los contenidos normales de ligninas producidas en las plantas, caracterizado porque se efectúa por transformación del genoma de estas plantas, incorporando en éste:

-: y, llegado el caso, por lo menos una secuencia de ADN que codifica una enzima distinta de la CCR, que se encuentra estar implicada en una etapa de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, particularmente una secuencia de ADN que codifica la CAD,

realizándose dicha transformación:

-: ya sea con la ayuda de varios vectores recombinantes de los que por lo menos uno contiene una secuencia nucleotídica recombinante según la reivindicación 14, mientras que el (o los) otro(s) vector(es) recombinante(s) contiene(n) una secuencia de ADN que codifica la totalidad o una parte de una enzima distinta de la CCR, tal como se ha definido anteriormente.

22. Plantas o fragmentos de plantas, particularmente células, frutos, semillas, polen, que se han transformado por incorporación, en su genoma, de por lo menos una secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 3 a 10.

23. Polipéptidos recombinantes, particularmente CCR recombinantes representadas por SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, o SEQ ID NO 8, tal como se obtienen por transformación de células vegetales integrando de manera estable en su genoma, una secuencia nucleotídica recombinante según una de las reivindicaciones 14 a 16, particularmente con la ayuda de un vector según la reivindicación 17.