ES2272447T3 - Composicion farmaceutica para aplicar en superficies mucosas. - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica para la administración en superficies mucosas, comprendiendo la composición un agente que es capaz de generar un efecto biológico, estando encapsulada una primera cantidad de dicho agente en microesferas que comprenden un polímero que tiene un peso molecular por encima de 94 kDa y un diámetro máximo de 20 µm, y una segunda cantidad de dicho agente estando en una forma que presenta una mayor biodisponibilidad que dicha primera cantidad.

Description

Composición farmacéutica para aplicar en superficie mucosas.

La presente invención se refiere a una composición que es particularmente útil para la liberación de fármacos tales como vacunas en superficies mucosas, por ejemplo formulaciones intranasales. La invención comprende además el uso de la composición según la reivindicación 1 en la preparación de una vacuna para generar una respuesta inmune protectora en un mamífero y métodos para la preparación de la composición.

Un objetivo primordial en el campo de la vacunación es el desarrollo de un régimen de inmunización no parenteral que facilite la inducción de niveles de inmunidad sistémica comparables a aquellos obtenidos mediante inyecciones subcutáneas e intramusculares comunes.

Los conductos nasofaríngeos y las regiones pulmonares del tracto respiratorio representan objetivos potenciales para la liberación sistémica de fármacos y vacunas peptidérgicas. La relativa facilidad con la que se pueden inhalar los agentes terapéuticos, o con la que se pueden introducir dentro de la nariz, hace que estos modos de inmunización sean atractivos en relación a su aceptación por parte del posible paciente. Además, la mucosa respiratoria ofrece ciertas ventajas morfológicas, fisiológicas e inmunológicas sobre otras zonas no parenterales en términos de inmunización, particularmente contra entidades patógenas que afectan o utilizan las superficies mucosas como vías de entrada. Esto se debe a que la vacunación efectiva contra estos patógenos precisa normalmente de mucosas adecuadamente protegidas con anticuerpos producidos localmente IgA de isotipo secretor (sIgA). Si bien las superficies mucosas habitualmente están poco protegidas con IgA después de la administración parenteral de vacunas, ahora es evidente que la liberación satisfactoria de material antigénico en los elementos con respuesta inmune del tejido linfoide asociado a mucosas (MALT) puede resultar en una estimulación intensa de la parte del sistema inmunológico localizado en las mucosas. Por medio del sistema inmunológico ordinario de las mucosas (CMIS), es posible que varias superficies mucosas anatómicamente diferentes pudieran ser protegidas mediante la administración mucosa de una vacuna en un solo lugar. La vacunación mucosa ofrece la ventaja añadida de que se puede inducir cierto grado de inmunización sistémica conjuntamente con las respuestas locales debido a la translocación de material antigénico desde los compartimentos subepiteliales a los tejidos sistémicos con respuesta inmune como el
bazo.

A pesar de los factores logísticos e inmunológicos que favorecen la inmunización no parenteral, la simple aplicación mucosa de proteínas antigénicas, por ejemplo en los tractos gastrointestinal o respiratorio, normalmente no es efectiva en términos de vacunación. La destrucción química o enzimática, combinadas con la baja absorción en los compartimentos subepiteliales, determinan que las vacunas administradas en las mucosas requieran habitualmente algún tipo de adyuvante o vehículo de liberación. Una aproximación es la de encapsular el material antigénico en portadores poliméricos en forma de micropartículas, como son las microesferas de ácido poli-DL-láctico (PLA) (Vaccine 1994, 12, 5-11). Tales procedimientos sirven para proteger las vacunas lábiles de la degradación en el lumen y para mejorar la absorción en los compartimentos mucosos y sistémicos (J.H. Eldridge et al., Seminars in Hematology, (1993), 30, 16-25). Existe una buena evidencia de que la microencapsulación también puede tener un efecto adyuvante al convertir moléculas antigénicas solubles en especies particuladas, promoviendo de esta manera la asimilación de la vacuna por las células presentadoras de antígeno (APC) (Y. Tabata et al., Adv. Polym. Sci. (1990), 94, 107-141, L. Vidard et al., J. Immunol. (1996), 156, 2809-2818, N. Van Rooijen, Immunol. Today (1990) 11, 436-439) o por las células con microinvaginaciones (células M) en los folículos linfoides (R.I. Walker et al., Vaccine, 12, 387, 1994, D.T. O’Hagan et al, Vaccine, 1989, 7, 421-424, P.G. Jenkins et al., J. Drug Targetting, 1995, 3, 79-81).

J.E. Eyles et al., J. Contr. Release, 63 (2000) 101-200, describe una composición farmacéutica (vacuna) para la administración en superficies mucosas (administración intranasal) que comprende los antígenos subunitarios recombinantes F1 y V de Yersinia Pestis que están coencapsulados en microesferas biodegradables de ácido poli(L-láctico) (PLLA).

Aunque, comparativamente, no se investigue lo suficiente en ella, la vía intranasal (i.n.) es atractiva para la liberación de vacunas en las mucosas. El epitelio nasal es accesible y menos exclusivo para las moléculas de peso molecular alto.

El grosor del manto mucoso que cubre el epitelio respiratorio es relativamente fino en comparación con otras mucosas, por ejemplo en el intestino es del orden de 500 veces más grueso. En el tracto respiratorio existen concentraciones sustancialmente reducidas de enzimas proteolíticos y extremos de pH en comparación con el tracto gastrointestinal.

Además, se ha descrito que los tejidos linfoides nasales asociados (NALT) tienen un epitelio linfático que, como los de la mucosa intestinal, contiene células M para la asimilación selectiva de antígeno (P. Brandenburg, Immunology of the Lung and Upper Respiratory Tract, (ed. Bienenstock J.) McGraw-Hill, New York, 1984, 28-95). Por lo tanto, NALT juega un papel análogo a otros MALT, tal como los tejidos linfoides intestinales asociados (GALT), en términos de reconocimiento de antígeno y de inducción de respuestas inmunológicas sistémicas y de las mucosas.

Se ha descrito el uso de polímeros de peso molecular alto para el encapsulado de una vacuna del tétanos de administración intramuscular (Vaccine 1994, 12, 4, 299-306). También se ha descrito una formulación de una vacuna toxoide de ricino microencapsulada que se aplica intranasalmente (Vaccine 1994, 14, 11 1031). Sin embargo, en ese caso, las microesferas de polímero de peso molecular alto (94 kDa) fueron menos efectivas que las preparadas a partir de un copolímero de peso molecular inferior (72 kDa).

En Immunology 1997, 92, Suppl. 1, 56 y J. Pharm. Pharmacol. 1997, 49, Suppl 4, 85, se había sido descrito previamente el uso de polímeros de peso molecular alto (PLA100KDa) en la preparación de microesferas para su uso en la generación de respuestas inmunes contra Yersinia Pestis. Sin embargo, en ese caso se administraron intranasalmente múltiples dosis de las composiciones (es decir, una dosis inicial seguida de una o dos dosis de refuerzo).

Es deseable minimizar o eliminar la necesidad de dosis de refuerzo de fármacos como las vacunas. Esto es debido a la inconveniencia de atender pacientes repetidamente y el gasto que ello supone.

Se han llevado a cabo intentos de mejorar la eficacia de composiciones farmacéuticas tales como las composiciones de las vacunas mediante el uso de adyuvantes. La patente US Nº 5.643.605 describe métodos y composiciones donde los adyuvantes principales están encapsulados en polímeros de baja viscosidad para formar microesferas con un diámetro medio de aproximadamente 20 a 100 \mum. Por lo tanto, dichas composiciones incluirán microesferas de un diámetro mayor a 20 \mum.

Los solicitantes han encontrado que una formulación microencapsulada particular produce niveles elevados de eficacia cuando se administra por la vía de una superficie mucosa. Por ejemplo, en el caso de las vacunas, generalmente pueden administrarse en una única dosis, sin la necesidad de adyuvantes.

Se entiende como "dosis única" que el fármaco y en particular una vacuna se administra sin dosis de refuerzo.

De esta manera, la invención proporciona una composición farmacéutica para la administración en superficies mucosas, comprendiendo la composición un agente que es capaz de generar un efecto biológico, estando encapsulada una primera cantidad de dicho agente en microesferas que comprenden un polímero que tiene un peso molecular por encima de 94 kDa y un diámetro máximo de 20 \mum, y una segunda cantidad de dicho agente que está en una forma que presenta una mayor biodisponibilidad que dicha primera cantidad.

El efecto biológico es, adecuadamente, uno que genera una respuesta inmune protectora, tal como una vacuna, aunque puedan utilizarse otros compuestos farmacéuticamente activos. En particular, otros compuestos farmacéuticamente activos apropiados son fármacos tales como fármacos activos del SNC, analgésicos tales como los analgésicos de acción central, fármacos para el alivio del dolor tales como los análogos de la morfina, y hormonas tales como la insulina.

La mayor biodisponibilidad de la segunda cantidad de agente activo significa que, cuando se administra, se incorpora muy rápidamente en el sistema del receptor. Por lo tanto ayuda en la generación de una respuesta inmunológica intensa y rápida, que se refuerza a continuación mediante la liberación más lenta del material procedente de las microesferas. Las microesferas de polímero de peso molecular alto tienden a retrasar la liberación del agente encapsulado en su interior.

Preferiblemente, dicha segunda cantidad de dicho agente está libre en la composición o está al menos parcialmente adsorbida, o débilmente asociada a la superficie de dichas microesferas.

Alternativamente, ésta puede estar encapsulada en una microesfera o vesícula fácilmente dispersable la cual puede rodear o puede estar separada de las microesferas de polímeros de peso molecular alto que forman parte de la composición de la invención.

Preferiblemente, el polímero tiene un peso molecular de 100 kDa o más. Preferiblemente, el polímero comprende un "polímero estructural" que es un polímero insoluble en agua, capaz de formar estructuras tales como microesferas. Dichos polímeros pueden consistir en materiales de matriz y ser solubles únicamente en disolventes orgánicos. Un polímero particularmente apropiado para su uso en las composiciones de la invención comprende ácido poli-(L-láctico) o PLA, pero se pueden usar otros materiales poliméricos de peso molecular alto tales como el poli-(ácido láctico/ácido glicólico) o PGLA. Se prefieren los polímeros estructurales y en particular el PLA altamente cristalino, por ejemplo el que es cristalino en más de un 70%. Dichos polímeros son de viscosidad elevada, por ejemplo con una viscosidad superior a 1,2 dL/g, y más preferiblemente superior a 1,5 dL/g.

Sin embargo, preferiblemente comprenden al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80% y lo más preferiblemente al menos un 95% de los polímeros de peso molecular alto como se describen arriba. En particular, el polímero utilizado es 100% PLA de peso molecular alto.

Opcionalmente, las microesferas pueden comprender además agentes que estabilicen emulsiones tales como el alcohol polivinílico o la metilcelulosa, y preferiblemente el alcohol polivinílico.

Preferiblemente las microesferas no incluyen polímeros estructurales de peso molecular bajo, como PLA o PGLA de peso molecular bajo tal como se menciona arriba.

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Las microesferas de este tipo son bastante pequeñas, con un diámetro máximo de 20 \mum y con unas buenas características de fluidez. Preferiblemente, las microesferas tienen un diámetro medio de al menos 2 \mum, preferiblemente de 2 a 15 \mum. más preferiblemente de 2 a 10 \mum, y lo más preferiblemente de 4 a 10 \mum. En una realización particular, las microesferas tienen un diámetro medio de aproximadamente 6 \mum. El diámetro máximo de las partículas es de manera adecuada 10 \mum, preferiblemente 7 \mum y preferiblemente 6 \mum.

La proporción de la primera y segunda cantidad de agente utilizado en la composición puede variar dependiendo de los agentes concretos utilizados, pero, en general, estarán en una proporción entre 1:2 y 2:1, preferiblemente aproximadamente 1:1.

Estas composiciones son efectivas para la administración de fármacos en general, pero en particular para la administración de un agente biológicamente activo que sea capaz de generar una respuesta inmune protectora en un animal, particularmente un mamífero, al cual le ha sido administrado. Ejemplos de tales agentes incluyen polipéptidos antigénicos así como secuencias de ácidos nucleicos que pueden codificar estos polipéptidos y que son conocidos como vacunas "de ADN".

Los polipéptidos adecuados son vacunas subunitarias y otras, tales como el toxoide de la difteria, el toxoide del tétanos, la toxina botulínica FHc y el antígeno protector (PA) del Bacillus anthracis.

Tal como se usa en el presente documento el término "polipéptido" incluye proteínas o fragmentos epitópicos de las mismas.

Preferiblemente los polipéptidos son vacunas subunitarias.

En una realización preferida, la composición de la invención comprende un agente biológicamente activo que es capaz de generar una respuesta inmune protectora contra Yersinia Pestis. Preferiblemente el agente es una vacuna subunitaria, por ejemplo como se describe en WO 96/28551. La vacuna descrita y reivindicada en dicho documento comprende una combinación del antígeno V de Y. pestis o un fragmento inmunológicamente activo del mismo o una variante de los mismos, y el antígeno F1 de Y. pestis o un fragmento inmunológicamente activo del mismo o una variante de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, el término "fragmento" se refiere a una porción de la secuencia básica que incluye al menos un determinante antigénico. Éstos pueden ser mutantes por deleción. Pueden estar unidas juntas una o más regiones epitópicas de la secuencia.

El término "variante" se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que difieren de la secuencia básica de la que derivan en que uno o más aminoácidos de la secuencia se han sustituido por otros aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden denominarse "conservativas" cuando un aminoácido se reemplaza por un aminoácido diferente con propiedades similares en términos generales. Las sustituciones de aminoácidos no conservativas son aquellas en que los aminoácidos se reemplazan por aminoácidos de diferente tipo. En general, serán posibles unas pocas sustituciones no conservativas sin alterar la actividad biológica del polipéptido. Preferiblemente, las variantes tendrán al menos un 60% de homología, más preferiblemente al menos un 75% de homología, y lo más preferiblemente al menos un 90% de homología con la secuencia base.

En particular, el agente biológicamente activo comprende una combinación del antígeno V de Y. pestis y el antígeno F1 de Y. pestis o un fragmento inmunológicamente activo de los mismos. Preferiblemente, ambos antígenos están presentes en la primera y en la segunda cantidad de la composición, preferiblemente en proporciones iguales.

Se ha encontrado que, en una realización particularmente preferida, cada administración de la preparación de microesferas a un ratón contiene entre 30 y 50 \mug y más preferiblemente aproximadamente 40 \mug de cada uno de dichos antígenos. Preferiblemente la dosis para humanos y mamíferos sería del mismo orden en términos de mg/kg.

Aunque la composición de la vacuna de la invención puede comprender además un adyuvante con el fin de mejorar la respuesta inmune al material biológicamente activo administrado, no se ha encontrado necesario y por lo tanto preferiblemente se ha prescindido de tales adyuvantes en las composiciones. En el caso de utilizarse, los adyuvantes apropiados incluyen adyuvantes farmacéuticamente aceptables tales como el adyuvante incompleto de Freund, Alhydrogel, compuestos de aluminio y preferiblemente adyuvantes que son conocidos por tener el efecto de regular positivamente las respuestas de las mucosas tales como la CTB, la subunidad pentamérica B no tóxica de la toxina del cólera (CT) o la toxina mutante lábil frente al calor (mLT) de E. coli.

En las solicitudes de patente internacionales No. WO 00/56282, WO 00/56362 y WO 00/56361 se describen otros tipos de adyuvantes.

Las composiciones de la invención son particularmente apropiadas para la aplicación intranasal. Éstas pueden comprender microesferas per se las cuales, opcionalmente, son conservadas, por ejemplo mediante liofilización, o pueden combinarse con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de portadores apropiados incluyen portadores sólidos o líquidos como se entiende en el estado de la técnica. En una realización particularmente preferida de la invención, la composición comprende una suspensión de las microesferas en un portador líquido y en particular en una solución salina tamponada con fosfatos.

La invención proporciona además un método de preparación de una composición farmacéutica, el cual comprende encapsular el agente farmacéuticamente activo en un material polimérico que tiene un peso molecular alto, y en particular un peso molecular de 100 kDa o superior, para formar microesferas con un diámetro máximo de 20 \mum, y a continuación combinar dichas microesferas con una cantidad adicional de dicho agente en una forma con una biodisponibilidad más alta.

La encapsulación se consigue de manera apropiada utilizando un método de evaporación del disolvente de una emulsión doble, en el cual se forma una primera emulsión con el agente farmacéuticamente activo, y el polímero estructural, mezclándolo con una fase acuosa (preferiblemente sin polímero estructural) para formar una emulsión secundaria, evaporando el disolvente y aislando pequeñas microesferas. En particular, el agente farmacéuticamente activo se disuelve o se suspende en una solución acuosa que opcionalmente incluye un emulsionante tal como el PVA. El emulsionante, cuando está presente se incluye preferentemente a bajas concentraciones, por ejemplo inferiores a 5% p/v. Esta solución o suspensión se mezcla a continuación con una solución del polímero estructural de alto peso molecular en un disolvente orgánico tal como diclorometano. A continuación se forma una emulsión primaria mediante la sonicación de la mezcla. A continuación, la emulsión primaria se añade a la fase acuosa secundaria, que preferiblemente incluye un emulsionante, con agitación intensa. A continuación, el disolvente preferiblemente se evapora, convenientemente a temperatura ambiente. A continuación, las microesferas pueden recuperarse, por ejemplo mediante centrifugación seguido de liofilización.

En particular, el método de la invención es un método de preparación de una vacuna profiláctica o terapéutica, el cual comprende encapsular un agente que es capaz de generar una respuesta inmune protectora en un material polimérico que tiene un peso molecular alto, y en particular un peso molecular de 100 kDa o mayor, para formar microesferas con un diámetro máximo inferior a 20 \mum, y a continuación combinar dichas microesferas con una cantidad adicional de dicho agente en una forma con una biodisponibilidad más alta.

Los métodos para formar microesferas son conocidos en el estado de la técnica. Éstos incluyen técnicas de emulsión y técnicas de secado por atomización.

Las microesferas de la invención se preparan preferiblemente utilizando un método de evaporación del disolvente de una emulsión doble. Brevemente, el agente biológicamente activo, preferiblemente en estado liofilizado, se suspende en una solución acuosa de un polímero tal como alcohol polivinílico (PVA) y metilcelulosa. Se añade, con agitación intensa, una solución del polímero de peso molecular alto en un disolvente orgánico tal como diclorometano. La emulsión resultante se añade, a continuación, sobre una fase acuosa secundaria, que también contiene el polímero (PVA o similar), con agitación intensa. Después de la adición, se deja evaporar el disolvente orgánico y se separan las microesferas resultantes.

Preferiblemente, las composiciones se presentan en forma de dosis unitarias. Esto variará dependiendo de la naturaleza del agente activo empleado, la naturaleza del paciente, la condición a tratar y otros factores clínicos. Sin embargo, en general, la composición de la invención comprende aproximadamente del 2 al 10% en peso de principio activo. En la composición, la cantidad de polímero de alto peso molecular será del orden de 70 a 98% en peso.

En uso, una dosis razonable para la administración nasal estaría en el orden de 0,05 g a 0,2 g.

Las composiciones de la invención incluyen composiciones de vacunas, y composiciones de vacunas de dosis única.

En un aspecto más, la invención proporciona el uso de la composición según la reivindicación 1 en la preparación de una vacuna para generar una respuesta inmune protectora en un mamífero.

Los solicitantes han demostrado que es posible proteger a animales de experimentación de la infección con Y. pestis mediante inhalación utilizando una única dosis i.n. de una vacuna subunitaria combinada en forma de una composición de la invención. El polímero de peso molecular alto utilizado en las composiciones de la invención parece que se ajusta particularmente bien a la administración intranasal.

La invención será descrita, en particular, a modo de ejemplo.

Ejemplo 1 Preparación de la composición de la vacuna

El antígeno V de Yersinia Pestis se expresó como una proteína de fusión con glutatión-s-transferasa (GST) en Escherischia coli. La proteína V se extrajo de la fusión con el factor Xa (Boehringer Mannheim UK Ltd) durante 18 horas a 22ºC y se purificó la proteína recombinante V mediante adsorción por afinidad, como se describe en S. Leary et al. (Infect. Immun. 1995, 255, 193-198). El antígeno F1 se hizo precipitar del sobrenadante de Y. pestis cultivado a 37ºC en un medio químicamente definido (pH 7,4), mediante la adición de sulfato de amonio al 40% (p/v) y se purificó mediante repetidas suspensiones en Tris-HC1 20 mM a pH 8 y la centrifugación del pellet.

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Ejemplo 2 Microencapsulación de subunidades

Se modificó el método de evaporación del disolvente de una emulsión doble (Y. Ogawa et al., Chem. Pharm. Bull., 36 (1988) 1095-1103) utilizando un ácido poli-L-láctico con un peso molecular de 100 kDa (Polysciences Inc. USA). Brevemente, se suspendieron 4,2 mg de V y 5,9 mg del antígeno F1 liofilizado en 0,5 ml de una solución acuosa al 2,5% en alcohol polivinílico (PVA) de 13-23 kDa (hidrolizado al 88%). Esta suspensión se mezcló con 250 mg de ácido poli-L-Láctico con un peso molecular de 100 kDa disuelto en 5 ml de diclorometano (DCM) para HPLC y se sonicó la mezcla durante 2 minutos a 60 W en hielo. La emulsión primaria resultante fue añadida a una fase acuosa secundaria (75 ml) que contenía PVA de 13-23 kDa (hidrolizado al 88%) en un 5% p/v, la cual se agitó intensamente utilizando un homogeneizador Silverson (Silverson, GB) a velocidad máxima durante 8 minutos. A continuación, el solvente se dejó evaporar a temperatura ambiente, y las microesferas resultantes (MDVF) se recogieron mediante ultracentrifugación y a continuación se liofilizaron.

Las microesferas liofilizadas fueron caracterizadas utilizando métodos estándar.

De esta manera, las proteínas F1 y V estaban coencapsuladas en cada una de las esferas, de manera que cada miligramo de esferas contenía 18-20 \mug de cada una de las proteínas (como máximo 40 \mug de proteína por miligramo de microesferas).

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Ejemplo 3 Caracterización de Microesferas

La morfología de las microesferas se determinó mediante un microscopio electrónico de barrido (Cambridge Instruments UK, Stereoscan 90). El tamaño de partícula se determinó mediante difracción láser (Malvern Instruments Ltd. Shropshire UK). Se encontró que las partículas formuladas presentaban un diámetro volumétrico medio de
6 \mum. Al visualizar las microesferas utilizando el microscopio electrónico de barrido se apreció que eran esféricas y regulares.

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Ejemplo 4 La liberación intranasal de una dosis única de F1+V microencapsuladas protege a los ratones de la infección con Y. pestis

Se añadieron proteínas libres F1 y V a la suspensión de las microesferas MDVF del Ejemplo 2 en solución salina estéril. Se prepararon unidades de dosis que comprendían esferas con 18-20 \mug de cada proteína (un máximo de 40 \mug de proteína) y 20 \mug de cada una de las proteínas libres.

Así, la dosis total de F1 y V administrada fue de 40 \mug por animal.

Los ratones fueron medicados nasalmente en una sola ocasión con la suspensión de estas microesferas, administradas en un volumen de 50 \mul de solución salina tamponada con fosfatos.

Los animales control recibieron esferas vacías que se prepararon de la misma manera que antes pero sin proteína encapsulada y que se mezclaron con la cantidad suficiente de proteínas F1 y V libres para llegar a una dosis total por ratón de 40 \mug de F1 + 40 \mug de V.

El día 60 después de la única dosis de cebado, los ratones inmunizados fueron desafiados subcutáneamente con 10^{4} cfu de Y. pestis virulento, y el día 74 con 10^{6} cfu de Y. pestis. La supervivencia de los ratones inmunizados se muestra en la tabla de abajo.

TABLA

1

Aparentemente, la formulación de la invención tuvo el efecto de administrar una "carga" inicial de inmunógenos F1+V, seguido de una liberación controlada más gradual de la proteína encapsulada que fue efectiva en asegurar buenos niveles de supervivencia.

Claims (20)

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   1. Composición farmacéutica para la administración en superficies mucosas, comprendiendo la composición un agente que es capaz de generar un efecto biológico, estando encapsulada una primera cantidad de dicho agente en microesferas que comprenden un polímero que tiene un peso molecular por encima de 94 kDa y un diámetro máximo de 20 \mum, y una segunda cantidad de dicho agente estando en una forma que presenta una mayor biodisponibilidad que dicha primera cantidad.
2. 2. Composición según la reivindicación 1 donde el agente que es capaz de generar un efecto biológico es un agente que es capaz de generar una respuesta inmune protectora en un animal al cual le ha sido administrado.
3. 3. Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 donde dicha segunda cantidad de dicho agente está libre en la composición o al menos está parcialmente adsorbida sobre la superficie de dichas microesferas.
4. 4. Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 donde dicha segunda cantidad de dicho agente está encapsulada en una microesfera o vesícula fácilmente dispersable.
5. 5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el polímero tiene un peso molecular de 100 kDa o superior.
6. 6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el polímero comprende ácido poli-(L-láctico).
7. 7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde las microesferas tienen un diámetro volumétrico medio de 2-15 \mum.
8. 8. Composición según la reivindicación 7, donde las microesferas tienen un diámetro volumétrico medio de 2-10 \mum.
9. 9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde las microesferas tienen un diámetro máximo de 10 \mum.
10. 10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el agente biológicamente activo es capaz de generar una respuesta inmune protectora contra Yersinia Pestis.
11. 11. Composición según la reivindicación 10 donde el agente biológicamente activo comprende una combinación del antígeno V de Y. pestis o un fragmento inmunológicamente activo del mismo, y el antígeno F1 de Y. pestis o un fragmento inmunológicamente activo del mismo.
12. 12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se presenta en forma de dosificación unitaria.
13. 13. Composición según la reivindicación 9 donde la forma de dosificación unitaria comprende una vacuna de dosis única.
14. 14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que está adaptada para la aplicación intranasal.
15. 15. Composición según la reivindicación 14 que comprende una suspensión de microesferas en solución salina tamponada con fosfatos.
16. 16. Método de preparación de una composición farmacéutica que comprende encapsular un agente farmacéuticamente activo en un material polimérico que tiene un alto peso molecular, de manera que se formen microesferas con un diámetro medio inferior a 20 \mum, y a continuación combinar dichas microesferas con una cantidad adicional de dicho agente en una forma más altamente biodisponible.
17. 17. Método según la reivindicación 16 que es un método de preparación de una vacuna profiláctica o terapéutica, y donde el agente farmacéuticamente activo es capaz de generar una respuesta inmune protectora.
18. 18. Método según la reivindicación 16 o la reivindicación 17 donde la encapsulación se lleva a cabo utilizando un método de evaporación del disolvente de una emulsión doble, donde se forma una primera emulsión con el agente farmacéuticamente activo y el polímero estructural, se mezclan con una fase acuosa (preferiblemente sin polímero estructural) para formar una emulsión secundaria, se evapora el disolvente y se aíslan las microesferas pequeñas.
19. 19. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 para utilizar en la generación de una respuesta inmune protectora en un mamífero mediante la administración en una superficie mucosa de dicho mamífero.
20. 20. Uso de la composición según la reivindicación 1 en la preparación de una vacuna para generar una respuesta inmune protectora en un mamífero.