ES2272471T3 - Regulacion de una variante de la proteina nip45 que interacciona con nf-at. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido seleccionado entre el grupo constituido por: i) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 8 que carece de los restos de aminoácidos 283 a 367 respecto a la proteína NIP45 de longitud completa, que son capaces de interaccionar con NFATp para potenciar la transcripción del gen de la IL-4; ii) polinucleótidos que comprenden la secuencia de la ID SEC Nº 2 que carece de la parte de la secuencia que codifica los restos de aminoácidos 283 a 367 respecto a la proteína NIP45 de longitud completa, en el que las proteínas codificadas son capaces de interaccionar con NFATp para potenciar la transcripción del gen de la IL-4.

Description

Regulación de una variante de la proteína NIP45 que interacciona con NF-AT.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de una nueva variante de la proteína NIP45 que interacciona con NF-AT y su uso en el diagnóstico y terapia para una enfermedad humana.

Antecedentes de la invención

En muchas enfermedades clínicas con mediación inmunológica, que incluyen enfermedades autoinmunes, enfermedades alérgicas y enfermedades infecciosas, se describe que es muy importante la proporción de linfocitos T CD4+ colaboradores de tipo 1 (Th1) respecto a los linfocitos T CD4+ colaboradores de tipo 2 (Th2) (Heinzel, F.P., y col., (1989) J. Exp. Med. 169: 59-72; Pearce, E.J., y col. (1991) J. Exp. Med. 173: 159-166; Shearer, G.M. y Clerici, M. (1992) Prog. Chem. Immunol. 54: 21-43). Por tanto, alterar o regular las proporciones de células Th1 y Th2, puede dar una pista para tratar o prevenir enfermedades con mediación inmunológica.

Los mecanismos por los que se determina la proporción entre Th1 y Th2 implican la diferenciación de las células precursoras de los linfocitos T colaboradores CD4 (Thp) que eligen diferenciarse en células efectoras Th1 o Th2.La diferenciación está parcialmente regulada por citocinas, tales como IL-2, IL-4 e IL-12, cuya expresión puede inducirse mediante factores de transcripción, siendo algunos de los más importantes proteínas de la familia NFAT (factor nuclear de células T activadas). Las proteínas NFAT se expresan en la mayoría de los tipos de células inmunes y juegan un papel importante en la transcripción de muchas citocinas, tales como IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-13,GM-CSF, IFN-\gamma y TNF-\alpha, así como otros genes implicados en las respuestas inmunes celulares. Aumentar o disminuir el nivel de la citocinas seleccionadas es una manera de regular la proporción entre Th1 y Th2.

Recientemente, se ha aislado una proteína de 45 kDa derivada de tejido murino que interacciona con miembros de la familia de proteínas NFAT y se ha denominado NIP45 (Hodge MR, Chun HJ, Rengarajan J, Alt A, Lieberson R, Glimcher LH. NF-AT-Driven interleukin-4 transcription potentiated by NIP45. Science, 13 de diciembre de 1996; 274 (5294):1903-5; Hodge MR y col., documentos WO 97/39721, USP 5.858.711 y USP 5.958.671). Adicionalmente, el documento WO 99/21993 describe las secuencias del polipéptido y el polinucleótido NIP45 humano.

Se ha demostrado que NIP45 interacciona con NFATp y potencia la transcripción del gen de la IL-4 inducido mediante la unión de NFATp con el promotor del gen de la IL-4. La naturaleza de esta interacción no está clara, pero una posibilidad es que NIP45 sea una proteína accesoria que esté implicada en el transporte de NFATp del citoplasma al interior del núcleo donde puede unirse al promotor del gen de la IL-4. En ausencia de esta proteína accesoria, NFATp puede inactivarse debido a su incapacidad para atravesar la membrana nuclear por sí misma. Los experimentos con ratones que no expresan NFATp han demostrado que la deficiencia en NFATp conduce a la acumulación de células T periféricas con fenotipo preactivado, a la potenciación de las respuestas inmunes de células T tras la estimulación secundaria in vitro y a defectos graves en la terminación adecuada de las respuestas antigénicas (Schuh, K. y col. (1998) Eur. J. Immunol. 28(8): 2456-66). En algunos de estos ratones, se desarrollan grandes centros germinales en el bazo y en los ganglios linfáticos periféricos y se da un marcado retraso de la involución del
timo.

Existe la necesidad en la técnica de identificar miembros adicionales de la variante proteica que interacciona con NFAT cuya actividad pueda regularse para proporcionar efectos terapéuticos, especialmente en enfermedades y dolencias que impliquen respuestas con mediación inmunológica.

Resumen de la invención

Un objetivo de la invención es proporcionar reactivos y procedimientos de regulación de las proteínas que interaccionan con NF-AT. Este y otros objetivos de la invención se proporcionan mediante una o más de las realizaciones descritas a continuación.

Una realización de la invención es un polipéptido NIP45V1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 8, que carece de los restos de aminoácidos 283 al 367 respecto a la proteína NIP45 de longitud completa.

Aún otra realización de la invención es un procedimiento de selección de agentes que disminuyen la actividad de NIP45V1. Un compuesto de ensayo se pone en contacto con un polipéptido NIP45V1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 8, que carece de los restos de aminoácidos 283 a 367 respecto a la proteína NIP45 de longitud completa. Se detecta la unión entre el compuesto de ensayo y el polipéptido NIP45V1. De este modo, se identifica un compuesto de ensayo que se une al polipéptido NIP45V1 como un posible agente para disminuir la actividad de NIP45V1.

Otra realización de la invención es un procedimiento de selección de agentes que disminuyen la actividad de NIP45V1. Un compuesto de ensayo se pone en contacto con un polinucleótido que codifica un polipéptido NIP45V1, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos como la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 2, que carece de la parte de la secuencia que codifica los restos de aminoácidos 283 a 367.

Se detecta la unión del compuesto de ensayo al polinucleótido. Se identifica un compuesto de ensayo que se une al polinucleótido como un posible agente para disminuir la actividad de NIP45V1. El agente puede funcionar disminuyendo la cantidad de NIP45V1 a través de la interacción con el ARNm de NIP45V1.

Otra realización de la invención es un procedimiento de selección de agentes que regulen la actividad de NIP45V1.a Un compuesto de ensayo se pone en contacto con un polipéptido NIP45V1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 8, que carece de los restos de aminoácidos 283 a 367 respecto a la proteína NIP45 de longitud completa.

Se detecta una actividad NIP45V1 del polipéptido. De este modo, un compuesto de ensayo que aumenta la actividad NIP45V1 del polipéptido en relación con la actividad de NIP45V1 en ausencia del compuesto de ensayo, se identifica como posible agente para aumentar la actividad de NIP45V1. De este modo, un compuesto de ensayo que disminuye la actividad NIP45V del polipéptido en relación con la actividad de NIP45V1 en ausencia del compuesto de ensayo, se identifica como posible agente para disminuir la actividad de NIP45V1.

Incluso otra realización de la invención es un procedimiento de selección de agentes que disminuyen la actividad de NIP45V1. Un compuesto de ensayo se pone en contacto con un producto NIP45V1 de un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 2, que carece de la parte de la secuencia que codifica los restos de aminoácidos 283 a 367.

Se detecta la unión del compuesto de ensayo al producto NIP45V1. De este modo, se identifica un compuesto de ensayo que se une al producto NIP45V1 como un posible agente para disminuir la actividad de NIP45V1.

Aun otra realización de la invención es un procedimiento para reducir la actividad de NIP45V1. Una célula se pone en contacto con un reactivo que se une específicamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido NIP45V1 o el producto codificado por el polinucleótido, en el que el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 2, que carece de la parte de la secuencia que codifica los restos de aminoácidos 283 a
367.

De este modo, desciende la actividad NIP45V1 en la célula.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de ADN que codifica un polipéptido NIP45V1.

La Figura 2 muestra la secuencia de ADN (ORF) que codifica un polipéptido NIP45V1.

La Figura 3 muestra la secuencia de ADN que codifica un polipéptido NIP45V2.

La Figura 4 muestra la secuencia de ADN que codifica un polipéptido NIP45V3.

La Figura 5 muestra la secuencia de ADN que codifica un polipéptido NIP45V4.

La Figura 6 muestra la secuencia de ADN que codifica NIP45.

La Figura 7 muestra la secuencia de ADN (ORF) que codifica NIP45.

La Figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN de la Figura 2.

La Figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN de la Figura 3.

La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN de la Figura 4.

La Figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN de la Figura 5.

La Figura 12 muestra la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN de la Figura 6.

La Figura 13 muestra las bandas amplificadas por PCR de NIP45 y NIP45V en diversos tejidos relacionados con el sistema inmune.

La Figura 14 muestra el alineamiento de NIP45V (proteínas v 1, 2, 3 y 4) y NIP45.

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Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido NIP45V1 que comprende:

a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 8, que carece de los restos de aminoácidos 283 a 367 respecto a la proteína NIP45 de longitud completa.

b) un polinucleótido que comprende la secuencia de la ID SEC Nº 2, que carece de la parte de la secuencia que codifica los restos de aminoácidos 283 a 367.

Adicionalmente, el presente solicitante ha descubierto que la actividad de una variante de empalme de NIP45, especialmente una variante de empalme de la NIP45 humana, puede ser regulada para controlar enfermedades autoinmunes, enfermedades alérgicas, enfermedades infecciosas y otras enfermedades inflamatorias crónicas. Estas enfermedades incluyen asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, urticaria, conjuntivitis, conjuntivitis primaveral, reumatismo articular crónico, lupus eritematoso sistémico, miastenia gravis, psoriasis, colitis diabrótica, síndrome de la respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), timitis linfofolicular, sepsis, polimiositis, dermatomiositis, poliateritis nodosa, enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD), síndrome de Sjoegren, gota y similares.

Se sabe que NIP45 interacciona con NFATp y potencia la transcripción del gen de la IL-4 inducido mediante la unión de NFATp al promotor del gen de la IL-4. La naturaleza de esta interacción no está clara, pero una posibilidad es que NIP45 sea una proteína accesoria que esté implicada en el transporte de NFATp del citoplasma al interior del núcleo donde puede unirse al promotor del gen de la IL-4. En ausencia de esta proteína accesoria, NFATp puede inactivarse debido a su incapacidad para atravesar la membrana nuclear por sí misma. Los experimentos con ratones que no expresan NFATp han demostrado que la deficiencia en NFATp conduce a la acumulación de células T periféricas con fenotipo preactivado, a la potenciación de las respuestas inmunes de células T tras la estimulación secundaria in vitro y a defectos graves en la terminación adecuada de las respuestas antigénicas. En algunos de estos ratones, se desarrollan grandes centros germinales en el bazo y en los ganglios linfáticos periféricos y se da un marcado retraso en la involución del timo.

La expresión de NIP45V1, una variante de empalme de NIP45, la en el timo, en el bazo y en ganglios linfáticos puede tener un papel importante en la formación normal de los centros germinales en estos órganos linfoides. La variante de empalme NIP45V1 carece de una porción grande de la proteína NIP45 de longitud completa, cuya parte más significativa son las regiones de homología con las moléculas de ubiquitina y sentrina. Las ubiquitinas están implicadas en el recambio regulado de proteínas necesarias para controlar la progresión del ciclo celular. Las sentrinas son pequeñas proteínas similares a la ubiquitina que se piensa se unen covalentemente a otras proteínas marcándolas para ser transportadas al núcleo. La falta del dominio de homología a ubiquitina y de parte del dominio de homología a sentrina puede hacer que NIP45V1 no pueda transportar de forma eficaz a NFATp dentro del núcleo (Kamitani, T. y col. (1997) J. Biol. Chem. 272 (22): 14001-4; Okura, T. y col. (1996) J. Immunol. 157, (10): 4277-81). De forma similar, la deleción en NIP45V1 puede alterar la interacción con NFATp de modo que la expresión conjunta de NIP45V1 y NFATp no siga teniendo un efecto sinérgico sobre la transcripción a través del promotor de la IL-4. Por tanto, el efecto de NIP45V1 en la célula puede inutilizar NFATp o bloquear la interacción entre NIP45 y NFATp y promover, de ese modo, la formación de centros germinales, preactivar células T, potenciar respuestas inmunes secundarias y retrasar la terminación de la respuestas al antígeno.

Por otro lado, la deleción en NIP45V1 puede reunir dos partes de la molécula de NIP45 para potenciar la función de NIP45v1 de tal forma que su interacción con NFATp tenga un efecto potenciador mayor en la transcripción de IL-4 que la de la molécula de NIP45 de longitud completa.

El aumento de la formación de centros germinales en el timo es una propiedad de pacientes humanos con timitis linfofolicular y a menudo está conectada con el desarrollo de enfermedades autoinmunes como miastenia gravis ((Muller-Hermelink, H.K., Marx, A. Kirchner, T. Thymus and mediastinum. En Damjanov, I, Linder, J (editores), Mosby Year Book. Mosby, St. Louis 1996, páginas 1218-43). Adicionalmente, los ratones deficientes en NFATp muestran una fuerte tendencia a desarrollar respuestas inmunes de tipo Th2, con una potenciación paradójicamente fuerte de la transcripción de varios genes de tipo Th2, incluyendo IL-4, IL-5 e IL-13 (Kiani, A. y col. (1997) Immunity 7(6): 849-60). Este desarrollo preferencial de las respuestas inmunes de tipo Th2 pueden conducir a respuestas alérgicas hiperactivas y a enfermedades autoinmunes y otros trastornos dependientes de Th2.

La variante de empalme alternativo 1 de NIP45 puede usarse como diana para el desarrollo de inhibidores o activadores selectivos dirigidos frente a la variante.

Polipéptidos NIP45V

Los polipéptidos NIP45V1 según la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 8, (NIP45V1) que carece de los restos de aminoácidos 283 al 367 respecto a la proteína NIP45 de longitud completa.

Variantes biológicamente activas

El porcentaje de identidad entre una posible variante de NIP45V y una secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 8 se determina usando el programa de alineamiento Blast2.

Las variaciones en el porcentaje de identidad pueden ser debidas, por ejemplo, a sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos se definen como reemplazos de un aminoácido por otro. Son de naturaleza conservadora si los aminoácidos sustituidos tienen propiedades estructurales y/o químicas similares. Ejemplos de reemplazos conservadores son la sustitución de una leucina por una isoleucina o una valina, un aspartato por un glutamato y una treonina por una serina.

Las inserciones o deleciones de aminoácidos son cambios de una secuencia de aminoácidos o dentro de la misma. Generalmente, están en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. Las directrices para determinar qué restos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin eliminar la actividad biológica o inmunológica de un polipéptido NIP45V1, pueden encontrarse usando programas de ordenador bien conocidos en la técnica, tales como el programa DNASTAR. Puede determinarse fácilmente si un cambio en un aminoácido da lugar a una variante polipeptídica de NIP45 biológicamente activa ensayando la actividad del polipéptido NIP45V1, como se describe, por ejemplo, en los ejemplos específicos a continuación.

Proteínas de fusión

Las proteínas de fusión puede comprender al menos 5, 6, 8, 10, 25 ó 50, o más aminoácidos contiguos de una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 8. Las proteínas de fusión son útiles para generar anticuerpos frente a las secuencias de aminoácidos del polipéptido NIP45V1 y para su uso en diversos sistemas de ensayo. Por ejemplo, las proteínas de fusión pueden usarse para identificar proteínas que interaccionan con porciones de un polipéptido NIP45V1. Pueden usarse con este fin la cromatografía de afinidad de proteínas o los ensayos basados en bibliotecas para interacciones proteína-proteína, tales como sistemas de doble híbrido de levadura o despliegue de fagos. Estos procedimientos son bien conocidos en la técnica y también pueden usarse para la selección de fárma-
cos.

Una proteína de fusión del polipéptido NIP45V1 comprende dos segmentos polipeptídicos fusionados entre sí mediante un enlace peptídico. El primer segmento polipeptídico comprende al menos 5, 6, 8, 10, 25 ó 50 o más aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº 8 o de una variante biológicamente activa, tal como las descritas anteriormente. El primer segmento polipeptídico también puede comprender la variante NIP45 de longitud completa.

El segundo segmento polipeptídico puede ser una proteína de longitud completa o un fragmento de la proteína. Las proteínas normalmente utilizadas en la construcción de proteínas de fusión incluyen \beta-galactosidasa, \beta-glucuronidasa, proteína fluorescente verde (GFP), proteínas autofluorescente, incluía la proteínas fluorescente azul (BFP), glutatión-S-transferasa (GST), luciferasa, peroxidasa de rábano picante (HRP) y cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Adicionalmente, se usan etiquetas de epítopos para las construcciones de proteínas de fusión, incluyendo etiquetas de histidina (His), etiquetas FLAG, etiquetas de hemaglutinina del virus influenza (HA), etiquetas Myc, etiquetas VSV-G y etiquetas de tiorredoxina (Trx). Otras construcciones de fusión pueden incluir proteínas de unión a maltosa (MBP), etiqueta-S, fusiones de Lex, un dominio de unión a ADN (DBD), fusiones del dominio de unión a ADN GAL4 y fusiones con la proteína BP16 del virus del herpes simple (VHS). Una proteína de fusión también puede manipularse genéticamente para que contenga un sitio de escisión localizado entre la secuencia que codifica el polipéptido NIP45V1 y la secuencia de la proteína heteróloga, de modo que el polipéptido NIP45V1 puede escindirse y purificarse del resto heterólogo.

Como se conoce en la técnica, la proteína de fusión puede sintetizarse químicamente. Preferiblemente, se produce una proteína de fusión uniendo covalentemente dos segmentos polipeptídicos o por procedimientos convencionales en la técnica de biología molecular. Pueden usarse procedimientos de recombinación de ADN para preparar proteínas de fusión, por ejemplo, haciendo una construcción de ADN que comprende secuencias codificantes seleccionadas a partir del grupo constituido por la ID SEC Nº 2 en fase de lectura apropiada con nucleótidos que codifican el segmento del segundo polipéptido y expresando la construcción de ADN en una célula hospedadora, según se conoce en la técnica. Se dispone de muchos kits para la construcción de proteínas de fusión de compañías tales como Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene (La Jolla, CA), CLONTECH (Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), MBL International Corporation (MIC; Watertown, MA) y Quantum Biotechnologies (Montreal, Canadá; 1-888-DNA-KITS).

Identificación de homólogos de especie

Pueden obtenerse homólogos de especie del polipéptido NIP45V1 usando los polinucleótidos del polipéptido NIP45V1 (descritos a continuación) para hacer sondas o cebadores adecuados para el análisis de bibliotecas de expresión de ADNc de otras especies, tales como ratones, monos o levaduras, para identificar ADNc que codifican homólogos del polipéptido NIP45V1 y expresar los ADNc según se conoce en la técnica.

Polinucleótidos de NIP45V

Un polinucleótido similar a NIP45 puede ser de hebra sencilla o doble y comprender una secuencia codificante o el complementario de una secuencia codificante de un polipéptido NIP45V1. La secuencia codificante del polipéptido NIP45V1 humano se muestra en la ID SEC Nº 2.

También son polinucleótidos de NIP45V1 las secuencias de nucleótidos degenerados que codifican polipéptidos NIP45V1 humano, así como las secuencias nucleotídicas homólogas que son al menos aproximadamente el 50, preferiblemente aproximadamente el 75, 85, 95, 96, 98 ó 99% idénticas a la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 2. El porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de dos polinucleótidos se determina usando programas de ordenador como ALIGN, que emplean el algoritmo FASTA, usando una búsqueda por penalización por hueco afín de -12 y una penalización por extensión de hueco de -2. También son polinucleótidos de NIP45V1 las moléculas de ADN complementario (ADNc), homólogos de especie y las variantes de los polinucleótidos de NIP45V1 que codifica los polipéptidos NIP45V1 biológicamente activos.

Identificación de variantes y homólogos de los polipéptidos NIP45V

También son polinucleótidos de NIP45V1 las variantes y homólogos de los polinucleótidos de NIP45V1 descritos anteriormente. Típicamente, pueden identificarse secuencias de polinucleótidos de NIP45V1 homólogas mediante hibridación de los polinucleótidos candidatos con polinucleótidos de NIP45V1 conocidos en condiciones rigurosas, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, usando las siguiente condiciones de lavado: SSC x2 (NaCl 0,3 M, citrato sódico 0,03 M, pH 7,0), SDS al 0,1%, a temperatura ambiente, dos veces 30 minutos cada uno; a continuación SSC x2, SDS al 0,1%, a 50ºC una vez, 30 minutos; a continuación, SSC x2, a temperatura ambiente, dos veces 10 minutos cada uno, pueden identificarse secuencias homólogas que contiene al menos aproximadamente el 25-30% de faltas de coincidencia en los pares de bases. Más preferiblemente, las hebras de ácidos nucleicos homólogas contienen el 15-25% de falta de coincidencia en las pares de bases.

Los homólogos de especie de los polinucleótidos de NIP45V1 descritos en este documento también pueden identificarse haciendo sondas o cebadores adecuados y analizando bibliotecas de expresión de ADNc de otras especies, tales como ratones, monos y levaduras. Pueden identificarse variantes humanas de los polinucleótidos de NIP45V1, por ejemplo, mediante análisis de bibliotecas de expresión de ADNc humano. Es bien conocido que la T_{m} de un ADN de doble hebra disminuye en 1-1,5ºC con cada descenso de homología del 1% (Bonner y col., J. Mol. Biol. 81, 123 (1973)). Por tanto, pueden identificarse variantes de los polinucleótidos de NIP45V1 humanos o de los polinucleótidos de NIP45V1 de otras especies mediante la hibridación de un posible polinucleótido de NIP45V1 homólogo con un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 21 o el complementario del mismo para formar un híbrido de ensayo. La temperatura de fusión del híbrido de ensayo se compara con la temperatura de fusión de un híbrido que comprenda polinucleótidos transformilasa que tengan secuencias de nucleótidos perfectamente complementarias y se calcula en número o porcentaje de falta de coincidencia entre pares de bases en el híbrido de ensayo.

También son polinucleótidos de NIP45V1 las secuencias de nucleótidos que hibridan con los polinucleótidos transformilasa o sus complementarios tras condiciones de hibridación y/o lavado rigurosas. Las condiciones de lavado rigurosas son bien conocidas y comprendidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, 1989, en las páginas 9.50-9.51.

Generalmente, para unas condiciones de hibridación rigurosas debe elegirse una combinación de temperatura y concentración de sales que esté aproximadamente 12-20ºC por debajo de la T_{m} calculada del híbrido en estudio. La T_{m} de un híbrido entre un polinucleótido NIP45V1 que tiene una secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 2 o la complementaria de la misma, y una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente el 50, preferiblemente aproximadamente el 75, 90, 96 ó 98% idéntica a una de las secuencias de nucleótidos puede calcularse, por ejemplo, usando la ecuación de Bolton y McCarthy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 48, 1390 (1962):

T_{m} = 81,5^{o}C - 16,6 \ (log_{10} \ [Na^{+}]) + 0,41 \ (% \ de \ G + C) - 0,63 \ (% \ de \ formamida)-600/l),

en la que l = la longitud del híbrido en pares de bases.

Las condiciones de lavado rigurosas incluyen, por ejemplo, SSC x 4 a 65ºC o formamida al 50%, SSC x 4 a 42ºC, o SSC x 0,5, SDS al 0,1% a 65ºC. Las condiciones muy rigurosas incluyen, por ejemplo, SSC x 0,2 a 65ºC.

Preparación de polinucleótidos NIP45V

Pueden aislarse polinucleótidos de NIP45V1 naturales sin otros componentes celulares, tales como componentes de la membrana, proteínas y lípidos. Los polinucleótidos pueden ser sintetizados por una célula y aislarse usando técnicas convencionales de purificación de ácidos nucleicos o sintetizarse usando una técnica de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o usando un sintetizador automático. Los procedimientos para aislar polinucleótidos son rutinarios y conocidos en la técnica. Puede usarse cualquier otra técnica de obtención de polinucleótidos para obtener polinucleótidos de NIP45V1 aislados. Por ejemplo, pueden usarse enzimas de restricción y sondas para aislar fragmentos polinucleotídicos que comprendan secuencias de nucleótidos NIP45V1. Los polinucleótidos aislados están en preparaciones libres o al menos el 70, 80 ó 90% libres de otras moléculas.

Pueden hacerse moléculas de ADNc de NIP45V1 con técnicas de biología molecular convencionales usando como molde el ARNm de la NIP45V1. A continuación, las moléculas de ADNc de NIP45V1 pueden replicarse usando técnicas de biología molecular conocidas en la materia y descritas en manuales tales como Sambrook y col. (1989). Puede usarse una técnica de amplificación, tal como PCR, para obtener copias adicionales de los polinucleótidos de la invención, usando como molde ADN genómico humano o ADNc.

Alternativamente, pueden usarse técnicas de síntesis química para sintetizar polinucleótidos de NIP45V1. La degeneración del código genético permite sintetizar secuencias de nucleótidos alternas que codificarán un polipéptido NIP45V1 que tenga, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 8 o una variante biológicamente activa de la misma.

Extensiones de los polinucleótidos NIP45V

Pueden usarse diversos procedimientos basados en la PCR para extender las secuencias de ácido nucleico que codifican las porciones descritas del polipéptido NIP45V1 humano para detectar secuencias antes del extremo 5', tales como promotores y elementos reguladores. Por ejemplo, la PCR para sitios de restricción usa cebadores universales para recuperar una secuencia desconocida adyacente a un locus conocido (Sarkar, PCR Methods Applic. 2, 318-322, 1993). El ADN genómico se amplifica primero en presencia de un cebador para una secuencia enlazadora y de un cebador específico de la región conocida. A continuación, las secuencias amplificadas se someten a un segundo ciclo de PCR con el mismo cebador enlazador y otro cebador específico interno al primero. Los productos de cada ronda de PCR se transcriben con una ARN polimerasa adecuada y se secuencian usando una transcriptasa inversa.

También puede usarse la PCR inversa para amplificar o extender secuencias usando cebadores divergentes basados en una región conocida (Triglia y col., Nucleic Acids Res. 16, 8186, 1988). Pueden diseñarse cebadores usando programas disponibles en el mercado, tales como el programa de Análisis de Cebadores OLIGO 4.06 (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), para que sean de una longitud de 22-30 nucleótidos, para que tengan un contenido en GC del 50% o más y para que hibriden con la secuencia diana a temperaturas de aproximadamente 68-72ºC. El procedimiento usa varias enzimas de restricción para generar un fragmento adecuado en la región conocida de un gen. A continuación, el fragmento se circulariza mediante un ligamiento intramolecular y se usa como molde para una PCR.

Otro procedimiento que puede usarse es la PCR de captura, que implica la amplificación por PCR de fragmentos de ADN adyacentes a una secuencia conocida en ADN humano o de cromosoma artificial de levadura (Lagerstrom y col., PCR Methods Applic. 1, 111-119, 1991). En este procedimiento, también pueden usarse digestiones y ligamientos con múltiples enzimas de restricción para colocar una secuencia de doble cadena modificada genéticamente en un fragmento desconocido de la molécula de ADN antes de realizar la PCR.

Otro procedimiento que puede usarse para recuperar secuencias desconocidas es el de Parker y col., Nucleic Acids Res. 19, 3055-3060, 1991). Adicionalmente, pueden usarse cebadores anidados de PCR y bibliotecas PROMOTERFINDER (CLONTECH, Palo Alto, California) para el desplazamiento sobre el ADN (CLONTECH, Palo Alto, California). Este procedimiento elimina la necesidad de analizar bibliotecas y es útil para encontrar las uniones entre intrones y exones.

Cuando se analizan ADNc de longitud completa, es preferible usar bibliotecas que se hayan seleccionado por tamaño para incluir ADNc mayores. Se prefieren las bibliotecas cebadas aleatoriamente, que contendrán más secuencias conteniendo las regiones 5' de los genes. Puede ser especialmente preferible el uso de una biblioteca cebada aleatoriamente en situaciones en las que una biblioteca de oligo d(T) no produzca un ADNc de longitud completa. Pueden ser útiles las bibliotecas genómicas para la extensión de secuencias dentro de las regiones reguladoras 5' no transcritas.

Pueden usarse sistemas de electroforesis capilar, disponibles en el mercado para analizar el tamaño o confirmar la secuencia de nucleótidos de PCR o de los productos de secuenciación. Por ejemplo, la secuenciación capilar puede emplear polímeros fluidos para la separación electroforética, cuatro colorantes fluorescentes diferentes (uno por cada nucleótido) que se activan con un láser y la detección de las longitudes de onda emitidas mediante una cámara de dispositivo de cara acoplada. La intensidad de luz producida puede convertirse en una señal eléctrica usando el programa apropiado (por ejemplo, GENOTYPER y Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer) y el procedimiento completo, desde la carga de las muestras hasta el análisis por ordenador y la visualización electrónica de los datos puede controlarse por ordenador. Se prefiere especialmente la electroforesis capilar para la secuenciación de pequeños fragmentos de ADN que podrían presentarse en cantidades limitadas en una muestra en particular.

Obtención de polipéptidos NIP45V1

Los polipéptidos NIP45V1 pueden obtenerse, por ejemplo, mediante purificación a partir de células humanas, mediante la expresión de polinucleótidos de NIP45V1 o mediante síntesis química directa.

Purificación de proteínas

Los polipéptidos NIP45V1 pueden purificarse a partir de cualquier célula humana que exprese la proteína, incluyendo células hospedadoras que han sido transfectadas con polinucleótidos de NIP45V1. Las fuentes especialmente útiles de polipéptidos NIP45V1 son el timo, el bazo, el ganglio linfático y otros tejidos relacionados con el sistema inmune. Un polipéptido de NIP45V1 purificado se separa de otros compuestos con los que normalmente el polipéptido de NIP45V1 se asocia en la célula, tal como ciertas proteínas, carbohidratos, o lípidos, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitaciones, cromatografía de exclusión molecular, fraccionamiento con sulfato amónico, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y electroforesis en gel preparativo.

Una preparación de polipéptidos NIP45V1 purificada está al menos el 80% pura; preferiblemente, las preparaciones están el 90%, 95% ó 99% puras. La pureza de las preparaciones puede evaluarse por cualquier medio conocido en la técnica, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS,

Expresión de los polinucleótidos de NIP45V

Para expresar un polipéptido de NIP45V1, puede insertarse un polinucleótido de NIP45V1 en un vector de expresión que contenga los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Pueden usarse procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contengan secuencias que codifican los polipéptidos NIP45V1 y los elementos de control de la transcripción y de la traducción adecuados. Estos procedimientos incluyen, técnicas de recombinación de ADN in vitro, técnicas de síntesis y de recombinación genética in vivo. Estas técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989) y en Ausubel y col., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, N. Y., 1989.

Pueden utilizarse diversos sistemas de vector de expresión/hospedador para contener y expresar secuencias que codifican un polipéptido de NIP45V1. Estos incluyen, pero sin limitaciones, microorganismos, tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes, plásmidos o vectores de expresión de ADN de cósmidos; levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras, sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión virales (por ejemplo, baculovirus), sistemas de células vegetales transformadas con vectores de expresión vírales (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322) o sistemas de células animales.

Los elementos de control o las secuencias reguladoras son aquellas regiones no traducidas de los vectores (potenciadores, promotores, regiones 5' y 3' no traducidas) que interaccionan con las proteínas de la célula hospedadora para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Estos elementos pueden variar en su potencia y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y del hospedador utilizado, puede usarse cualquiera de los diversos elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles, tales como el promotor híbrido LacZ del fagémido BLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) o del plásmido pSORT1 (Life Technologies) y similares. El promotor de polihedrina de baculovirus puede usarse en células de insecto. En el vector pueden clonarse promotores o potenciadores derivados del genoma de células vegetales (por ejemplo, genes de choque térmico, RUBISCO y de proteínas de almacenamiento) o de virus vegetales (por ejemplo, promotores virales o secuencias líder). En sistemas de células de mamíferos, se prefieren los promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Si es necesario generar una línea celular que contenga copias múltiples de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de NIP45V1, pueden usarse vectores basados en los virus SV40 o EBV con un marcador seleccionable apropiado.

Sistemas de expresión de bacterias y levaduras

En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse varios vectores de expresión dependiendo del uso previsto para el polipéptido de NIP45V1. Por ejemplo, cuando se necesita una gran cantidad de polipéptido de NIP45V1 para la inducción de anticuerpos, pueden usarse vectores que dirigen la expresión de elevados niveles de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Estos vectores incluyen, pero sin limitaciones, vectores multifuncionales de clonación y expresión en E. coli, tal como BLUESCRIPT (Stratagene). En un vector BLUESCRIPT puede ligarse una secuencia que codifique el polipéptido de NIP45V1 en fase con secuencias para la Met amino terminal y los 7 restos posteriores de la \beta-galactosidasa de modo que se produzca la proteína híbrida. También pueden usarse vectores pIN (Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509, 1989) o pGEX (Promega, Madison, Wis.) para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con la glutatión-S-transferasa (GST). En general, estas proteínas de fusión son solubles y puede purificarse fácilmente a partir de células lisadas por adsorción a perlas de glutatión-agarosa seguida de la elución en presencia de glutatión libre. Las proteínas obtenidas en estos sistemas pueden diseñarse para que incluya sitios de escisión de heparina, trombina o proteasa factor Xa de modo que el polipéptido clonado de interés pueda liberarse del resto GST cuando se desee.

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, pueden usarse varios vectores que contengan promotores constitutivos o inducibles tales como el factor alfa, alcohol oxidasa y PGH. Para una revisión, véase Ausubel y col. (1989) y Grant y col., Methods Enzymol. 153, 516-544, 1987.

Sistemas de expresión de plantas e insectos

Si se usan vectores de expresión en planta, la expresión de las secuencias que codifican los polipéptidos NIP45V1 puede estar dirigida por cualquier de los diversos promotores. Por ejemplo, pueden usarse promotores virales tales como los promotores 35S y 19S de CaMV solo o en combinación con la secuencia líder omega de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6, 307-313, 1987). Alternativamente, pueden usarse promotores vegetales tales como la subunidad pequeña de los promotores de RUBISCO o de las proteínas de choque térmico (Coruzzi y col., EMBO J. 3, 1671-1680, 1984; Broglie y col., Science 224, 838-843, 1984; Winter y col., Results Probl. Cell Differ. 17, 85-105, 1991). Estas construcciones pueden introducirse en células vegetales mediante transformación directa de ADN o mediante transfección mediada por patógeno. Estas técnicas se describen en varias revisiones generalmente disponibles (por ejemplo, Hobbs o Murray, en McGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, Nueva York, N. Y., pág. 191-196, 1992).

También puede usarse un sistema de insecto para expresar un polipéptido de NIP45V1. Por ejemplo, en uno de estos sistemas se usa el del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o de larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican los polipéptidos similares a NIP45 pueden clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de la polihedrina y colocarse bajo en control del promotor de la polihedrina. Las inserciones satisfactorias de los polipéptidos NIP45V1 producirán la inactivación del gen de la polihedrina y producirán virus recombinantes que carecen de la proteína de la cubierta. A continuación, los virus recombinantes pueden usarse para infectar células de S. frugiperda o de larvas de Trichoplusia en las que pueden expresarse los polipéptidos NIP45V1 (Engelhard y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 91, 3224-3227, 1994).

Sistemas de expresión de mamíferos

Pueden usarse varios sistemas de expresión basados en virus para expresar polipéptidos NIP45V1 en células hospedadoras de mamíferos. Por ejemplo, si se usa un adenovirus como vector de expresión, las secuencias que codifican los polipéptidos NIP45V1 pueden ligarse en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que comprende en promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Puede usarse la inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma del virus para obtener un virus viable que sea capaz de expresar un polipéptido NIP45V1 en células hospedadoras infectadas (Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3655-3659,1984). Si se desea, pueden usarse potenciadores de la transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para aumentar la expresión en células hospedadoras de mamíferos.

También pueden usarse cromosomas artificiales humanos (HAC) para suministrar fragmentos más grandes de ADN que los que puede contener y expresar un plásmido. Se construyen HAC de 6M a 10M y se suministran a células por procedimientos convencionales de suministro (por ejemplo, liposomas, polímeros amino policatiónicos o vesículas).

También pueden usarse señales de iniciación específicas para lograr una traducción más eficaz de las secuencias que codifican los polipéptidos NIP45V1. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En los casos en los que las secuencias codifican un polipéptido NIP45V1, su codón de iniciación y las secuencias antes del extremo 5' se insertan en el vector de expresión adecuado, puede que no se necesiten señales de control de la transcripción o de la traducción adicionales. Sin embargo, en los casos en los que sólo se inserta la secuencia codificante, o un fragmento de la misma, deberán proporcionarse señales exógenas de control de la traducción (incluyendo el codón de iniciación ATG). El codón de iniciación debe estar en la fase de lectura correcta para asegurar la traducción de la inserción completa. Los elementos exógenos de traducción y los codones de iniciación pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse incluyendo potenciadores que sean apropiados para el sistema celular en particular que se use (véase Scharf y col., Results Probl. Cell Differ. 20, 125-162, 1994).

Células hospedadoras

La cepa de la célula hospedadora puede elegirse por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar el polipéptido NIP45V1 expresado en la forma deseada. Estas modificaciones del polipéptido incluyen, pero sin limitaciones, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. También puede usarse un procesamiento postraduccional que escinda una forma "prepro" del polipéptido para facilitar la inserción, el plegamiento y/o la función correctos. En la American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) están disponibles diferentes células hospedadoras que tiene una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para las actividades postraduccionales (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293, células de linfoma B y WI38) y pueden elegirse de modo que se asegure la correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña.

Para una producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de forma estable los polipéptidos NIP45V1 pueden transformase usando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógena y un gen marcador seleccionables en el mismo vector o en un vector independiente. Tras la introducción del vector, puede permitirse que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan eficazmente las secuencias NIP45V1 introducidas. Los clones resistentes de las células transformadas estables pueden proliferar usando técnicas de cultivos tisulares apropiadas para el tipo de célula. Véase, por ejemplo, ANIMAL CELL CULTURE, R. I. Freshney, editores, 1986.

Puede usarse cualquiera de los diversos sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Estos incluyen, pero sin limitaciones, los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler y col., Cell 11, 223-32, 1977) y de la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y col., Cell 22, 817-23, 1980) que pueden emplearse en células tk^{-} o aprt^{-}, respectivamente. También, puede usarse como base para la selección de resistencia a antimetabolitos, antibióticos y herbicidas. Por ejemplo, dhrf confiere resistencia a metotrexato (Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 3567-70, 1980), npt confiere resistencia a los aminoglucósidos, neomicina y G-418 (Colbere-Garapin y col., J. Mol. Biol. 150, 1-14, 1981) y als y pat confieren resistencia a la clorosulfurona y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murray, 1992; anterior). Se han descrito genes seleccionables adicionales. Por ejemplo, trpB permite que las células utilicen el indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de la histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 8047-51, 1988). Pueden usarse marcadores visibles, tales como antocianinas, \beta-glucuronidasa y su sustrato GUS y luciferasa y su sustrato luciferina, para identificar transformantes y para cuantificar la cantidad de expresión de proteína transitoria o estable atribuible a un sistema de vector específico (Rhodes y col., Methods Mol. Biol. 55, 121-131, 1995).

Detección de la expresión de los polipéptidos HIP45V1

Aunque la presencia de la expresión del gen marcador sugiera que el polinucleótido de NIP45V1 también está presente, puede ser necesario confirmar su presencia y expresión. Por ejemplo, si se inserta una secuencia que codifica un polipéptido de NIP45V1 dentro de una secuencia de un gen marcador, las células transformadas que contienen las secuencias que codifican un polipéptido de NIP45V1 pueden identificarse por la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, puede colocarse un gen marcador en tándem con una secuencia que codifique un polipéptido de NIP45V1 bajo el control de un único promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección normalmente indica la expresión del polinucleótido de NIP45V1.

Alternativamente, las células hospedadoras que contienen un polinucleótido de NIP45V1 y que expresan un polipéptido NIP45V1 pueden identificarse mediante varios procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitaciones, hibridaciones ADN-ADN o ADN-ARN y técnicas de bioensayo o inmunoensayo de proteínas que incluyen tecnologías con membrana, solución o basadas en un chip para la detección y/o cuantificación del ácido nucleico o la proteína. Por ejemplo, puede detectarse la presencia de una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido NIP45V1 mediante la hibridación de ADN-ADN o de ADN-ARN o mediante amplificación usando sondas o fragmentos, o fragmentos de polinucleótidos que codifican un polipéptido NIP45V1. Los ensayos basados en la amplificación de ácidos nucleicos implican el uso de oligonucleótidos seleccionados a partir de las secuencias que codifican un polipéptido NIP45V1 para detectar transformantes que contienen un polinucleótido NIP45V1.

En la técnica se conocen varios protocolos para detectar y medir la expresión de un polipéptido NIP45V1, usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para el polipéptido. Los ejemplos incluyen ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activada por fluorescencia (FACS). Puede usarse un inmunoensayo de doble determinante basado en monoclonales, usando anticuerpos monoclonales que reaccionan con dos epítopos que no interfieren de un polipéptido NIP45V o puede emplearse un ensayo de unión competitivo. Estos y otros ensayos se describen en Hampton y col., SEROLOGICAL METHODS: A
LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, Min., 1990) y Maddox y col., J. Exp. Med. 158, 1211-1216,
1983).

El experto en la materia conoce una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación y puede usarse en varios ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir sondas marcadas para hibridación o de PCR para detectar secuencias relacionadas con los polinucleótidos que codifican los polipéptidos NIP45V1 incluyen el marcaje de oligos, desplazamiento de mellas, marcaje del extremo o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. Alternativamente, pueden clonarse las secuencias que codifican un polipéptido NIP45V1 en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Estos vectores son conocidos en la técnica, están disponibles en el mercado y puede usarse para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de nucleótidos marcados y una ARN polimerasa apropiada, tal como las del T7, T3 o SP6. Estos procedimientos pueden llevarse a cabo usando varios kits disponibles en el mercado (Amersham Pharmacia Biotech, Promega, y US Biochemical). Las moléculas indicadoras o marcadores adecuados que pueden usarse para facilitar la detección incluyen radionucleidos, enzimas y agentes fluorescentes, quimioluminiscentes y cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.

Expresión y purificación de polipéptidos NIP45V1

Las células hospedadoras transformadas con secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido NIP45V1 pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. El polipéptido producido por una célula transformada puede secretarse o quedar contenido intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o del vector usado. Como entenderán los expertos en la materia, pueden diseñarse vectores de expresión que contengan polinucleótidos que codifiquen polipéptidos NIP45V1 para que contengan secuencias señal que dirijan la secreción de los polipéptidos NP45V1 solubles a través de la membrana de la célula procariota o eucariota y que dirijan la inserción en la membrana del polipéptido de NIP45V1 unido a la membrana.

Como se describe anteriormente, pueden usarse otras construcciones para unir una secuencia que codifique un polipéptido NIP45V1 a una secuencia de nucleótidos que codifique un dominio que facilitará la purificación de proteínas solubles. Estos dominios que facilitan la purificación incluyen, pero sin limitaciones, péptidos quelantes de metales tales como los módulos de histidina y triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de la proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en sistemas de purificación por afinidad basados en la extensión de FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). También puede usarse la inclusión de secuencias enlazadores que puedan escindirse, tales como las específicas del factor Xa o de la enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y el polipéptido NIP45V1 para facilitar la purificación. Uno de estos vectores de expresión proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido NIP45V1 y 6 restos de histidina que preceden a un sitio de escisión para una tiorredoxina o una enteroquinasa. Los restos de histidina facilitan la purificación por IMAC (cromatografía de afinidad de metales iónicos inmovilizados, como se describe en Porath y col., Prot. Exp. Purif. 3, 263-281,19), mientras que el sitio de escisión para la enteroquinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido NIP45V1 a partir de la proteína de fusión. Los vectores que contienen las proteínas de fusión se describen en Kroll y col., DNA Cell Bol 12, 441-453,
1993.

Síntesis química

Las secuencias que codifican un polipéptido NIP45V1 pueden sintetizarse, por completo o en parte, usando procedimientos químicos bien conocidos en la técnica (véase Caruthers y col., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223,1980; Horn y col. Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232, 1980). Alternativamente, puede producirse un polipéptido NIP45V1 por si mismo, usando procedimientos químicos para sintetizar su secuencia de aminoácido, tal como mediante síntesis peptídica directa usando técnicas en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge y col., Science 269, 202-204, 1995). La síntesis proteica puede realizarse usando técnicas manuales o automáticas. La síntesis automática puede lograrse, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos Applied Biosystems 413A (Perkin Elmer). Opcionalmente, pueden sintetizarse por separado fragmentos de los polipéptidos NIP45V1 y combinarse usando procedimientos químicos para producir una molécula de longitud completa.

Los péptidos recién sintetizados pueden purificarse sustancialmente mediante cromatografía líquida de alta resolución preparativa (por ejemplo, Creighton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman y Cía. Nueva York, N. Y., 1983). La composición de un polipéptido NIP45V1 sintético puede confirmarse mediante el análisis o la secuenciación de aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman; véase Creighton, anterior). Adicionalmente, pueden alterarse cualquier porción de la secuencia de aminoácidos del polipéptido NIP45V1 durante la síntesis directa y/o combinada usando procedimientos químicos con secuencias de otras proteínas para producir una variante polipeptídica o una proteína de fusión.

Producción de polipéptidos NIP45V alterados

Como entenderá un experto en la materia, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifiquen polipéptidos NIP45V1 que posean codones que no aparecen en la naturaleza. Por ejemplo, pueden seleccionarse codones preferidos por un hospedador procariota o eucariota en particular para aumentar la tasa de expresión de la proteína o para producir una transcripción de ARN que tenga unas propiedades deseadas, tales como una semivida más larga que una transcripción generada a partir de la secuencia natural.

Las secuencias de nucleótidos descritas en este documento pueden manipularse genéticamente usando procedimientos generalmente conocidos en la técnica para alterar las secuencias que codifican el polipéptido NIP45V1 por varias razones, que incluyen, pero sin limitaciones, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento y/o la expresión de polipéptido o del producto del ARNm. Puede usarse la mezcla aleatoria de ADN mediante fragmentación al azar y el reensamblaje por PCR de los fragmentos del gen y de oligonucleótidos sintéticos para manipular genéticamente las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, puede usarse la mutagénesis dirigida a sitio para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glucosilación, cambiar la preferencia de codones, producir variantes de empalme, introducir mutaciones, etc.

Anticuerpos

Puede generarse cualquier tipo de anticuerpo conocido en la técnica que se una específicamente a un epítopo de un polipéptido NIP45V1. "Anticuerpo" como se usa en este documento, incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')_{2} y Fv, que son capaces de unirse a un epítopo de un polipéptido NIP45V1. Típicamente, se necesitan al menos 6, 8, 10 ó 12 aminoácidos contiguos para formar un epítopo. Sin embargo, los epítopos que implican a aminoácidos no contiguos pueden requerir más, por ejemplo al menos 15, 25 ó 50 aminoácidos.

Un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo de un polipéptido NIP45V1 puede usarse terapéuticamente, así como en ensayos inmunoquímicos, tales como inmunotransferencias, ELISA, radioinmunoensayos, ensayos de inmunohistoquímica, inmunoprecipitaciones u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en la técnica. Pueden usarse varios inmunoensayos para identificar anticuerpos que tengan la especificidad deseada. En la técnica se conocen bien numerosos protocolos para ensayos de unión competitivos inmunorradiométricos. Generalmente, estos inmunoensayos suponen la medida de la formación del complejo entre un inmunógeno y un anticuerpo que se une específicamente al inmunógeno.

Típicamente, un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido NIP45V1 proporciona una señal de detección al menos 5, 10 ó 20 veces superior que una señal de detección proporcionada por otras proteínas cuando se usan en un ensayo inmunoquímico. Preferiblemente, los anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos NIP45V no detectan otras proteínas en los ensayos inmunoquímicos y puede inmunoprecipitar un polipéptido NIP45V1 a partir de una solución.

Los polipéptidos NIP45V1 pueden usarse para inmunizar a un mamífero, tal como un ratón, rata, conejo, cobaya o humano, para producir anticuerpos policlonales. Si se desea puede conjugarse un polipéptido NIP45V1 con una proteína vehículo, tal como albúmina de suero bovina, tiroglobulina y hemocianina de lapa bocallave. Dependiendo de la especie hospedadora, pueden usarse varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Estos adyuvantes incluyen, pero sin limitaciones, adyuvantes de Freund, geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y sustancias activas de superficie (por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleicas, hemocianina de lapa bocallave y dinitrofenol). Entre los adyuvantes usados en humanos, son especialmente útiles el BCG (bacillos de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un polipéptido NIP45V1 pueden prepararse usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares en cultivo continuo. Estas técnicas incluyen, pero sin limitación, la técnica de hibridomas, la técnica de hibridomas de células B humanas y la técnica del hibridomas por inmortalización con EBV (Kohler y col., Nature 256, 495-497,1985; Kozbor y col., J. Immunol. Methods 81, 31-42,1985; Cote y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026-2030,1983; Cole y col., Mol. Cell Biol. 62, 109-120,1984).

Además, pueden usarse las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el empalme de genes de un anticuerpo de ratón con genes de un anticuerpo humano para obtener una molécula con la especificidad antigénica y la actividad biológica apropiadas (Morrison y col., Proc. Natl. Scad. Sc. 81, 6851-6855, 1984; Neuberger y col., Nature 312, 604-608, 1984; Takeda y col., Nature 314, 452-454, 1985). Tanto los anticuerpos monoclonales como otros anticuerpos también pueden "humanizarse" para prevenir que un paciente desarrolle una respuesta inmune frente al anticuerpo cuando se usa terapéuticamente. Estos anticuerpos pueden tener una secuencia suficientemente similar a los anticuerpos humanos para ser usados directamente en terapia o puede necesitar la alteración de algunos pocos restos clave. Las diferencias de secuencia entre las secuencias de los anticuerpos de roedor y los humanos pueden minimizarse sustituyendo los restos que difieren de los de las secuencias humanas mediante mutagénesis dirigida a sitio de restos individuales o intercalando regiones determinantes de complementariedad completas. Alternativamente, pueden producirse anticuerpos humanizados usando procedimientos recombinantes, como se describe en el documento GB2188638B. Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido NIP45V1 pueden contener sitios de unión a antígeno que estén humanizados parcial o completamente, como se describen en el documento U.S. 5.565.332.

Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única pueden adaptarse usando procedimientos conocidos en la técnica para producir anticuerpo de cadena sencilla que se unen específicamente a los polipéptidos NIP45V1. Los anticuerpos con especificidad relativa, pero de composición idiotípica diferente, pueden generarse mediante mezcla aleatoria de cadenas a partir de bibliotecas de inmunoglobulinas combinatorias aleatoria (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120-23. 1991).

También pueden construirse anticuerpos de cadena sencilla usando un procedimiento de amplificación de ADN, tal como PCR, usando ADNc del hibridoma como molde (Thirion y col., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11). Los anticuerpos de cadena sencilla pueden ser mono o biespecíficos, y pueden ser bivalentes o tetravalentes. La construcción de anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos tetravalentes se muestra, por ejemplo, en Coloma y Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15, 159-63. La construcción de anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos bivalentes se muestra en Mallender y Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269, 199-206.

Una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de cadena sencilla puede construirse usando síntesis manual o automática de nucleótidos, clonarse en una construcción de expresión usando procedimientos de recombinación de ADN convencionales e introducirse en una célula que exprese la secuencia codificante, como se describe a continuación. Alternativamente, pueden producirse directamente anticuerpos de cadena sencilla usando, por ejemplo, la tecnología de fagos filamentosos (Verhaar y col., 1995, Int. J. Cancer 61, 497-501; Nicholls y col., 1993, J. Immunol. Meth. 165, 81-91).

También pueden producirse anticuerpos que se unan específicamente a los polipéptidos NIP45V1 induciendo su producción in vivo en la población linfocitaria o analizando las bibliotecas o paneles de inmunoglobulinas de reactivos de unión altamente específicas como se describe en la literatura (Orlandi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833-3837, 1989; Winter y col., Nature 349, 293-299, 1991).

Pueden construirse y usarse terapéuticamente en procedimientos de la invención otros tipos de anticuerpos. Por ejemplo, pueden construirse anticuerpos quiméricos como se describe en el documento WO 93/03151. También pueden prepararse proteínas de unión que deriven de inmunoglobulinas y que sean multivalentes y multiespecíficas, tales como los "diabodies", descritos en el documento WO 94/13804.

Los anticuerpos según la invención pueden purificarse por procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden purificarse por afinidad pasándolos a través de una columna a la cual se ha unido un polipéptido NIP45V1. A continuación, los anticuerpos unidos pueden eluirse de la columna usando un tampón una alta concentración salina.

Oligonucleótidos complementarios

Los oligonucleótidos complementarios son secuencias de nucleótidos que son complementarias de una secuencia de ADN o ARN específica. Una vez introducidos en una célula, los nucleótidos complementarios se combinan con secuencias naturales producidas por la célula para formar complejos y bloquear la transcripción o la traducción. Preferiblemente, un oligonucleótido complementario tiene una longitud de al menos 11 nucleótidos, pero puede tener una longitud de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 o más nucleótidos. También pueden usarse secuencias más largas. Las moléculas de oligonucleótidos complementarias pueden proporcionarse en una construcción de ADN e introducirse en una célula como se describe anteriormente, para disminuir en la célula el nivel de los productos del gen de NIP45V1.

Los oligonucleótidos complementarios pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos o una combinación de ambos. Los oligonucleótidos pueden sintetizarse manualmente o mediante un sintetizador automático, uniendo covalentemente el extremo 5' de un nucleótido al extremo 3' de otro nucleótido con enlaces internucleotídicos no fosfodiéster, tales como alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos, alquilfosfonotioatos, alquilfosfonatos, fosforamidatos, ésteres de fosfato, carbamatos, acetamidatos, ésteres de carboximetilo, carbonatos y triésteres de fosfato. Véase Brown, Meth. Mol. Biol. 20, 1-8, 1994; Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26, 1-72, 1994; Uhlmann y col., Chem. Rev. 90, 543-583, 1990.

Pueden obtenerse modificaciones de la expresión del gen de NIP45V1 diseñando oligonucleótidos complementarios con los que formarán dupletes con las regiones de control, 5' o reguladoras del gen de NIP45V1. Se prefieren oligonucleótidos derivados del sitio de inicio de la transcripción, por ejemplo, entre las posiciones -10 y +10 del sitio de inicio. De forma similar, puede conseguirse la inhibición usando la metodología de formación de "triple hélice" por apareamiento de bases. El apareamiento de triple hélice es útil ya que causa la inhibición de la capacidad de la doble hélice para abrirse lo suficiente para la unión de polimerasa, factores de transcripción o carabinas moleculares. En la literatura se han descrito los avances terapeúticos usando ADN triple (por ejemplo, Gee y col., en Huber y Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N. Y., 1994). También puede diseñarse un oligonucleótido complementario para bloquear la traducción del ARNm mediante la prevención de la transcripción uniéndose a los ribosomas.

No se necesita una complementariedad precisa para la formación satisfactoria del complejo entre un oligonucleótido complementario y la secuencia complementaria de un polinucleótido de NIP45V1. Los oligonucleótidos complementarios que comprenden, por ejemplo, 2, 3, 4 ó 5 o más segmentos de nucleótidos contiguos que se complementan con precisión con un polinucleótido de NIP45V1, separadas entre sí por un segmentos de nucleótidos contiguos que no son complementarios con los nucleótidos adyacentes de NIP45V1, pueden proporcionar una especificidad dirigida suficiente para el ARNm de NIP45V1. Preferiblemente, cada segmento de nucleótidos contiguos complementarios tiene una longitud de al menos 4, 5, 6, 7 u 8 o más nucleótidos. Las secuencias intermedias no complementarias preferiblemente tienen una longitud de 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos. Un experto en la material puede usar fácilmente el punto de fusión calculado de un par complementario-sentido para determinar el grado de falta de coincidencia que se tolerará entre un oligonucleótido complementario en particular y una secuencia de polinucleótidos de NIP45V1 en particular. Los oligonucleótidos complementarios pueden modificarse sin afectar a su capacidad para hibridar con un polinucleótido de NIP45V1. Estas modificaciones pueden ser internas o estar en uno o ambos extremos de la molécula complementaria. Por ejemplo, los enlaces fosfato internucleósido pueden modificarse añadiendo restos de colesterilo o diamina con un número variable de restos de carbono entre los grupos amino y la ribosa terminal. También pueden emplearse en un oligonucleótido complementario modificado bases y/o azúcares modificados, tales como arabinosa en lugar de ribosa, o un oligonucleótido 3', 5' sustituido en los que se sustituye el grupo 3' hidroxilo o el grupo 5' fosfato. Estos oligonucleótidos modificados pueden preparase por procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Agrawal y col., Trends Biotechnol. 10, 152-158, 1992; Uhlmann y col., Chem. Rev. 90, 543-584, 1990; Uhlmann y col., Tetrahedron. Lett. 215, 3539-3542, 1987.

Ribozimas

Las ribozimas son moléculas de ARN con actividad catalítica. Véase, por ejemplo, Cech, Science 236, 1532-1539; 1987; Cech, Ann. Rev. Biochem. 59, 543-568; 1990, Cech, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 605-609; 1992, Couture y Stinchcomb, Trends Genet. 12, 510-515, 1996. Las ribozimas pueden usarse para inhibir la función de un gen escindiendo una secuencia de ARN, como se conocen en la técnica (por ejemplo, Haseloff y col., Patente de EE.UU. 5.641.673). El mecanismo de acción de la ribozima implica la hibridación específica de secuencia de la molécula de ribozima con el ARN diana complementario, seguido de la escisión endonucleolítica. Los ejemplos incluyen las moléculas de ribozimas modificadas genéticamente con motivo de cabeza de martillo que pueden catalizar específica y eficazmente la escisión endonucleolítica de secuencias de nucleótidos específica.

La secuencia codificante de un polinucleótido NIP45V1, tal como la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 2, puede usarse para generar ribozimas que se unirán específicamente al ARNm transcrito a partir del polinucleótido de NIP45V. Se han desarrollado procedimientos para diseñar y construir ribozimas que pueden escindir otras moléculas de ARN en posición trans, de forma altamente específica de secuencia y se describen en la técnica (Véase, Haseloff y col. Nature 334, 585-591, 1988). Por ejemplo, la actividad de escisión de las ribozimas puede ser dirigida hacia ARN específicos manipulando genéticamente una región de "hibridación" discreta en la ribozima. La región de hibridación contiene una secuencia complementaria al ARN diana y, de este modo, hibrida específicamente con la diana (véase, por ejemplo, Gerlach y col., documento EP 321.201).

Los sitios de escisión específicos de la ribozima en un ARN de NIP45V1 diana pueden identificarse mediante el barrido de los sitios de escisión de la ribozima en la molécula diana, lo que incluye las siguientes secuencias: GUA, GUU y GUC. Una vez identificados, pueden evaluarse las características estructurales secundarias de las secuencias de ARN cortas de entre 15 y 20 ribonucleótidos que corresponden con la región de ARN diana que contiene el sitio de escisión, que pueden hacer inoperable a la diana. También puede evaluarse la idoneidad de las dianas de ARN de NIP45V1 candidatas ensayando la accesibilidad para hibridar con oligonucleótidos complementarios usando ensayos de protección de ribonucleasa. La secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 2 y sus complementarios proporcionan una fuente de secuencias de regiones de hibridación adecuadas. Pueden usarse secuencias complementarias más largas para aumentar la afinidad de la secuencia de hibridación por la diana. Las regiones de hibridación y de escisión de la ribozima pueden estar integralmente relacionadas de modo que, tras la hibridación con el ARN diana a través de las regiones complementarias, la región catalítica de la ribozima puede escindir la diana.

Las ribozimas pueden introducirse en células como parte de una construcción de ADN. Para introducir una construcción de ADN que contiene la ribozima en las células en las que se desea que disminuya la expresión de NIP45V1 pueden usarse procedimientos mecánicos, tales como microinyección, transfección mediada por liposomas, electroporación o precipitación con fosfato cálcico. Alternativamente, si se desea que las células retengan de forma estable la construcción de ADN, ésta puede suministrarse en un plásmido y mantenerse como un elemento independiente o integrarse en el genoma de las células, como se conoce en la técnica. Una construcción de ADN que codifica la ribozima puede incluir elementos reguladores de la transcripción, tales como un elemento promotor, un potenciador o un elemento UAS y una señal de terminación de la transcripción para controlar la transcripción de las ribozimas en las células.

Como se explica en Haseloff y col., patente de EE.UU. 5.641.673, las ribozimas pueden manipularse genéticamente de modo que la expresión de la ribozima tendrá lugar en respuesta a factores que inducen la expresión de un gen diana. Las ribozimas también pueden manipularse genéticamente para proporcionar un nivel adicional de regulación, de modo que la destrucción del ARNm tenga lugar sólo cuando en las células se inducen tanto la ribozima como el gen diana.

Procedimientos de selección

La invención proporciona ensayos para seleccionar compuestos de ensayo que se unan o modulen la actividad de un polipéptido NIP45V1 o un polinucleótido de NIP45V1. Un compuesto de ensayo preferiblemente se une a un polipéptido o polinucleótido de NIP45V1. Más preferiblemente, un compuesto de ensayo disminuye o aumento el efecto de NIP45, o de un análogo de NIP45, mediado a través del NIP45V1 humano en al menos aproximadamente el 10, preferiblemente aproximadamente el 50, más preferiblemente aproximadamente el 75, 90 ó 100% en relación con la ausencia del compuesto de ensayo.

Compuestos de ensayo

Los compuestos de ensayo pueden ser agentes farmacológicos ya conocidos en la técnica o pueden ser compuestos de los que se desconoce actividad farmacológica alguna. Los compuestos pueden ser naturales o diseñados en el laboratorio. Pueden aislarse a partir de microorganismos, animales y plantas y pueden producirse de forma recombinante, o sintetizarse mediante procedimientos químicos conocidos en la técnica. Si se desea, pueden obtenerse compuestos de ensayo usando cualquiera de los numerosos procedimientos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica, que incluye, pero sin limitaciones, bibliotecas biológicas, bibliotecas de fase sólida paralela o de fase en solución direccionables, procedimientos de bibliotecas sintéticas que necesitan deconvolución, el procedimiento de biblioteca "una perla, un compuesto" y procedimientos de biblioteca sintética usando selección por cromatografía de afinidad. La estrategia de biblioteca biológica se limita a bibliotecas polipeptídica, mientras que las otras cuatro estrategias se aplican a polipéptidos, oligómeros no peptídicos o bibliotecas de pequeñas moléculas de compuestos. Véase Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145, 1997.

Los procedimientos para la síntesis de bibliotecas moleculares son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, DeWitt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb y col. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann y col., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho y col., Science 261, 1303, 1993; Carell y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop y col., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994). Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solución (véase, por ejemplo, Houghten, Biotechniques 13, 412-421, 1992), o en perlas ((Lam, Nature 354, 82-84, 1991), chips (Fodor, Nature 364, 555-556, 1993), bacterias o esporas (Ladner, Patente de EE.UU. 5.223.409), plásmidos (Cull y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1865-1869, 1992), o fagos (Scott y Smith, Science 249, 386-390, 1990; Devlin, Science 249, 404-406, 1990); Cwirla y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991 y Ladner, Patente de EE.UU. 5.223.409).

Selección de alto rendimiento

Puede seleccionarse la capacidad de los compuestos de ensayo para unirse a los polipéptidos NIP45V1 o a sus polinucleótidos o para afectar a la actividad de NIP45V1 o a la expresión génica de NIP45V1 usando una selección de alto rendimiento. Usando la selección de alto rendimiento, pueden analizarse muchos compuestos discretos en paralelo, de modo que pueden seleccionarse rápidamente grandes cantidades de compuestos de ensayo. Las técnicas más ampliamente establecidas utilizan placas de microvaloración de 96 pocillos. Típicamente, los pocillos de las placas de microvaloración requieren volúmenes de ensayo que oscilan de 50 a 500 \mul. Además de las placas, en el mercado se disponen de muchos instrumentos, materiales, pipeteadores, aparatos robotizados, lavadores de placas y lectores de placas que se adaptan al formato de las placas de 96 pocillos.

Alternativamente, pueden usarse "ensayos de formato libre" o ensayos que no tienen barreras físicas entre las muestras. Por ejemplo, Jayawickreme y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 19, 1614-18 (1994), describen un ensayo que utiliza células pigmentarias (melanocitos) en un ensayo sencillo homogéneo para bibliotecas peptídicas combinatorias. Los células se colocan bajo agarosa en placas de petri, a continuación se colocan en la superficie de la agarosa perlas que llevan compuestos combinatorios. Los compuestos combinatorios liberan parcialmente los compuestos de las perlas. Los compuestos activos pueden visualizarse como áreas de pigmento oscuro ya que, cuando los compuestos difunden localmente a la matriz del gel, los compuestos activos hacen que las células cambien de color.

Otro ejemplo de ensayo de formato libre se describen en Chelsky, "Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches," presentado en la Primera Conferencia Anual de la Sociedad para el Análisis Biomolecular, en Filadelfia, Pa. (Nov. 7-10,1995). Chelsky colocó un ensayo enzimático homogéneo sencillo para la anhidrasa carbónica dentro de un gel de agarosa, de modo que la enzima en el gel pudiera dar lugar a un cambio de color a lo largo del gel. A continuación se situaban dentro del gel perlas que llevaban compuestos combinatorios mediante un polienlazador y los compuestos se liberaban parcialmente mediante luz UV. Los compuestos que inhibían a la enzima se observaban como zonas locales de inhibición que tenían menos cambios de color.

En Salmon y col., Molecular Diversity 2, 57-63 (1996) aún se describe otro ejemplo. En este ejemplo, se analizan los compuestos de bibliotecas combinatorias que tienen efectos citotóxicos sobre células cancerígenas crecidas en agar.

Otro procedimiento de selección de alto rendimiento se describe en Beutel y col., Patente de EE.UU. Nº 5.976.813. En este procedimiento, las muestras de ensayo se colocan en una matriz porosa. A continuación, se colocan uno o más componentes de ensayo dentro, encima o debajo de una matriz, tal como un gel, una lámina de plástico, un filtro u otra forma de soporte sólido fácil de manipular. Cuando las muestras se introducen en la matriz porosa difunden lo suficientemente despacio para que pueden realizarse los ensayos sin que las muestras del ensayo se
mezclen.

Ensayos de unión

Para los ensayos de unión, el compuesto de ensayo preferiblemente es una molécula pequeña que se une y ocupa el centro activo del polipéptido NIP45V1, haciendo por tanto, el sitio activo inaccesible o accesible al sustrato (por ejemplo, NFATp) de modo que se impide la actividad biológica normal. Los ejemplos de estas moléculas pequeñas incluyen, pero sin limitaciones, péptidos pequeños o moléculas similares a péptidos.

En los ensayos de unión, el compuesto de ensayo o el polipéptido NIP45V1 puede comprender un marcador detectable, tal como un marcador de fluorescencia, radioisotópico, quimioluminiscente o enzimático, tal como la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina o la luciferasa. La detección de un compuesto de ensayo que se une al polipéptido NIP45V1 puede entonces lograrse, por ejemplo, mediante el recuento directo de la radioemisión, mediante recuento de centelleo o determinando la conversión de un sustrato apropiado en un producto detectable.

Alternativamente, la unión de un compuesto de ensayo a un polipéptido NIP45V1 puede determinarse sin marcar ninguno de los elementos que interactúan. Por ejemplo, puede usarse un microfisiómetro para detectar la unión de un compuesto de ensayo al polipéptido NIP45V1. Un microfisiómetro (por ejemplo, el Cytosensor^{TM}) es un instrumento analítico que mide la tasa a la cual una célula acidifica su entorno usando un sensor potenciométrico direccionable por la luz (LAPS). Los cambios en esta tasa de acidificación pueden usarse como indicador de la interacción entre un compuesto de ensayo y un polipéptido NI 45 V (McConnell y col., Science 257, 1906-1912, 1992).

También puede conseguirse determinar la capacidad de un compuesto para unirse a un polipéptido NIP45V1 usando una tecnología como el análisis de interacción biomolecular a tiempo real (BIA) (Sjolander y Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338-2345, 1991, y Szabo y col., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705, 1995). El BIA es una tecnología para estudiar las interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los elementos que interactúan (por ejemplo, BIAcore^{TM}). Los cambios en el fenómeno óptico de la resonancia del plasmón superficial (SPR) pueden usarse como una indicación de las reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

Aún en otro espectro de la invención, puede usarse un polipéptido NIP45V1 como "proteína cebo" en un ensayo de doble híbrido o triple híbrido (véase la patente de EE.UU. Nº 5.283.317; Zervos y col., Cell 72, 223-232, 1993; Madura y col., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054, 1993; Bartel y col., Biotechniques 14, 920-924, 1993; Iwabuchi y col., Oncogene 8, 1693-1696, 1993 y Brent, documento W094/10300), para identificar otras proteínas que se unen o interaccionan con el polipéptido NIP45V y modula su actividad.

El sistema de doble híbrido se basa en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción que están compuestos de dominios de unión a ADN y de activación divisibles. Brevemente, el ensayo utiliza dos construcciones de ADN diferentes. Por ejemplo, en una construcción, el polinucleótido que codifica un polipéptido NIP45V1 puede fusionarse con un polinucleótido que codifica el dominio de unión al ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En la otra construcción, una secuencia de ADN que codifica una proteína no identificada ("presa" o "muestra") puede fusionarse con un polinucleótido que codifica el dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas "cebo" y "presa" son capaces de interaccionar in vivo para formar un complejo dependiente de proteína, los dominios de unión a ADN y de activación del factor de transcripción se colocan muy próximos. Esta proximidad permite la transcripción de un gen indicador (por ejemplo, LacZ), que se une de forma operativa a un sitio de regulación de la transcripción sensible al factor de transcripción. Puede detectarse la expresión del gen indicador y pueden aislarse las colonias de células que contiene el factor de transcripción funcional y usarse para obtener la secuencia de ADN que codifica la proteína que interacciona con el polipéptido NIP45V1.

Puede ser deseable inmovilizar el polipéptido NIP45V1 (o el polinucleótido) o el compuesto de ensayo para facilitar la separación de las formas unidas y no unidas de uno de los elementos que interactúan, o de ambos, así como adecuar la automatización del ensayo. De este modo, el polipéptido (o polinucleótido) NIP45V1 o el compuesto de ensayo puede estar unido a un soporte sólido. Los soportes sólidos adecuados incluyen, pero sin limitaciones, láminas de vidrio o plástico, placas de cultivo tisular, pocillos de microvaloración, tubos, chips de silicona, o partículas tales como perlas (que incluyen, pero sin limitaciones, perlas de látex, poliestireno o de vidrio). Puede usarse cualquier procedimiento conocido en la técnica para unir el polipéptido (o polinucleótido) NIP45V1 o el compuesto de ensayo a un soporte sólido, que incluyen el uso de uniones covalentes o no covalentes, absorción pasiva o pares de restos de unión unidos respectivamente al polipéptido (o polinucleótido) o compuesto de ensayo y al soporte sólido. Los compuestos de ensayo se unen preferiblemente al soporte sólido en una matriz, de modo que puede seguirse la localización de compuestos de ensayos individuales. La unión de un compuesto de ensayo a un polipéptido (o polinucleótido) NIP45V1 puede conseguirse en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Ejemplos de estos recipientes incluyen placas de microvaloración, tubos de ensayo y tubos de microcentrí-
fuga.

En una realización, el polipéptido NIP45V1 es una proteína de fusión que comprende un dominio que permite que el polipéptido NIP45V1 se una al soporte sólido. Por ejemplo, las proteínas de fusión con glutatión-S-transferasa pueden adsorberse a perlas de glutatión-sefarosa (Sigma Chemical, St Louis, Mo.) o a placas de microvaloración derivatizadas con glutatión que, a continuación, se mezclan con el compuesto de ensayo o con el compuesto de ensayo y el polipéptido NIP45V1 no adsorbido; a continuación, la mezcla se incuba en condiciones que promueven la formación del complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas de sal y pH). Tras la incubación, las perlas o los pocillos de las placas de microvaloración se lavan para retirar cualquier componente no unido. La unión de los elementos que interactúan puede determinarse directa o indirectamente, como se describe anteriormente. Alternativamente, los complejos pueden disociarse del soporte sólido antes de que se determine la unión.

También pueden usarse otras técnicas para inmovilizar de proteínas o polinucleótidos en un soporte sólido en los ensayos de selección de la invención. Por ejemplo, puede inmovilizarse un polipéptido (o un polinucleótido) NIP45V1 o un compuesto de ensayo utilizando la conjugación de biotina estreptavidina. Pueden preparase polipéptidos (o polinucleótidos) NIP45V1 o compuestos de ensayo biotinilados con biotina-NHS (N-hidroxisuccinimida) usando técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, III.) e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertos con estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, pueden derivatizarse a los pocillos de la placa anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido o polinucleótido NIP45V1, o a un compuesto de ensayo, pero que no interfiere con un sitio de unión deseado, tal como el centro activo del polipéptido NIP45V1. La diana o proteína no unida puede quedar atrapada en los pocillos mediante la conjugación con anticuerpo.

Los procedimientos para detectar estos complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GST, incluyen la inmunodetección de los complejos usando anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido NIP45V1 o al compuesto de ensayo, ensayos ligados a enzimas que dependen de la detección de la actividad del polipéptido NIP45V1 y electroforesis en gel en presencia de SDS en condiciones no reductoras.

La selección de los compuestos de ensayo que se unen a un polipéptido o polinucleótido NI45V también puede realizarse sobre una célula intacta. Puede usarse cualquier célula que comprenda un polipéptido o polinucleótido NIP45V en un sistema de ensayo basado en células. Un polinucleótido de NIP45V puede aparecer de forma natural en la célula o puede introducirse usando técnicas tales como las descritas anteriormente. La unión del compuesto de ensayo a un polipéptido o polinucleótido NIP45V se determina como se describe anteriormente.

Ensayos funcionales

Puede analizarse la capacidad de los compuestos de ensayo para aumentar o disminuir un efecto biológico de un polipéptido NIP45V1. Estos efectos biológicos pueden determinarse usando los ensayos funcionales descritos a continuación en los ejemplos específicos. Los ensayos funcionales pueden realizarse después de poner en contacto un polipéptido NIP45V1, una preparación de membrana celular o una célula intacta con un compuesto de ensayo. Un compuesto de ensayo que disminuye una actividad funcional de un NIP45V1 en al menos aproximadamente el 10, preferiblemente aproximadamente el 50, más preferiblemente aproximadamente el 75, 90 ó 100%, se identifica como un posible agente para disminuir la actividad de NIP45V1. Un compuesto de ensayo que aumenta una actividad de un NIP45V1 en al menos aproximadamente el 10, preferiblemente aproximadamente el 50, más preferiblemente aproximadamente el 75, 90 ó 100%, se identifica como un posible agente para aumentar la actividad de NIP45V1.

Un procedimiento de selección como este implica el uso de células de linfoma de origen B que se transfectan para expresar un polipéptido NIP45V1. Por ejemplo, este ensayo puede emplearse para seleccionar un compuesto que inhiba la activación del polipéptido exponiendo las células transfectadas del linfoma de origen B, que comprenden el polipéptido tanto con las proteínas como con los sustratos que interaccionan de forma endógena, a un compuesto de ensayo que se va a seleccionar. La inhibición de la actividad del polipéptido indica que un compuesto de ensayo es un posible antagonista del polipéptido, es decir, inhibe la función de la proteína. La selección puede emplearse para identificar un compuesto de ensayo que activa la proteína exponiendo estas células a compuestos para seleccionar, y determinar si cada compuesto de ensayo activa la proteína.

Otras técnicas de selección incluyen el uso de células que expresan un polipéptido NIP45V1 humano (por ejemplo, células T transfectadas) en un sistema que mide las cantidades de proteínas secretadas generadas por la activación del polipéptido. Por ejemplo, pueden añadirse compuestos de ensayo a las células que expresan un polipéptido NIP45V1 y puede medirse la expresión de un gen indicador con secuencias promotoras específicas para determinar si el compuesto de ensayo activa o inhibe la proteína.

Los detalles de los ensayos funcionales, tales como los descritos anteriormente, se proporcionan a continuación en los ejemplos específicos.

Expresión del gen de NIP45V

En otra realización, se identifican los compuestos de ensayo que aumentan o disminuyen la expresión del gen de NIP45V1. Un polinucleótido de NIP45V1 se pone en contacto con un compuesto de ensayo y se determina la expresión de un ARN o producto polipeptídico de los polinucleótidos de NIP45V1. El nivel de expresión del ARNm o del polipéptido apropiado en presencia del compuesto de ensayo se compara con el nivel de expresión del ARNm o del polipéptido en ausencia del compuesto de ensayo. A continuación, puede identificarse un compuesto de ensayo como un modulador de la expresión en base a esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión del ARNm o del polipéptido es mayor en presencia del compuesto de ensayo que en su ausencia, el compuesto de ensayo se identifica como un estimulador o potenciador de la expresión del ARNm o del polipéptido. Alternativamente, cuando la expresión del ARNm o del polipéptido es menor en presencia del compuesto de ensayo que en su ausencia, el compuesto de ensayo se identifica como un inhibidor de la expresión del ARNm o del polipéptido.

El nivel de expresión del ARNm o del polipéptido NIP45V1 en las células puede determinarse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica para la detección de ARNm o polipéptido. Pueden usarse tanto procedimientos cualitativos como cuantitativos. La presencia de productos polipeptídicos de un polinucleótido NIP45V1 puede determinarse, por ejemplo, usando diversa técnicas conocidas en la materia, incluyendo procedimientos inmunoquímicos tales como radioinmunoensayos, inmunotransferencia e inmunohistoquímica. Alternativamente, la síntesis del polipéptido puede determinarse in vivo, en un cultivo celular o en un sistema de translación in vitro mediante la detección de la incorporación de aminoácidos marcados en el polipéptido NIP45V1.

Esta selección puede realizarse en un sistema de ensayo libre de células o en una célula intacta. Cualquier célula que exprese un polinucleótido de NIP45V1 puede usarse en un sistema de ensayo basado en células El polinucleótido de NIP45V1 puede aparecer de forma natural en la célula o puede introducirse usando técnicas tales como las descritas anteriormente. Puede usarse un cultivo primario o una línea celular establecida, tal como CHO o las células embrionarias de riñón humano 293.

Composiciones farmacéuticas

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que pueden administrarse a un paciente para lograr un efecto terapéutico. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender, por ejemplo, un polipéptido NIP45V1, un polinucleótido de NIP45V1, anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido NIP45V1 o miméticos, potenciadores e inhibidores, o inhibidores de una actividad del polipéptido NIP45V1. Las composiciones puede administrarse solas o en combinación con al menos algún otro agente, tales como compuestos estabilizadores, que pude administrarse en cualquier vehículo farmacéutico biocompatible estéril, incluyendo, pero sin limitaciones, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. Las composiciones pueden administrarse al paciente solas o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas.

Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprende excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en las preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por cualquiera de las numerosas vías, incluyendo, pero sin limitaciones, vía oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, parenteral, tópica, sublingual o rectal. Las composiciones farmacéuticas para administración por vía oral pueden formularse usando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica a dosis adecuadas para la administración oral. Estos vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, mezclas poco espesas, suspensiones, y similares, para su ingestión por el paciente.

Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse a través de la combinación de compuestos activos con un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y procesar la mezcla de gránulos, después de añadir los compuestos auxiliares adecuados, si se desea, para obtener los núcleos de comprimidos o grageas. Los excipientes adecuados son cargas de hidratos de carbono o proteínas, tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa, tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, o carboximetilcelulosa sódica; gomas que incluyen la arábiga o la de tragacanto y proteínas, tales como gelatina y colágeno. Si se desea, pueden añadirse agentes de desintegración o solubilizantes, tales como polivinilpirrolidona entrecruzada, agar, ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato sódico.

Los núcleos de grageas pueden usarse junto con recubrimientos adecuados, tales como soluciones concentradas de azúcar, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilénglicol y/o dióxido de titanio, laca en solución y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Pueden añadirse a los comprimidos o grageas recubiertas soluciones colorantes o pigmentos para la identificación del producto o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, es decir, la dosificación.

Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un recubrimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener mezclas de ingredientes activos con una carga o aglutinantes, tales como lactosa y almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o resuspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, líquidos o polietilénglicoles líquidos con o sin estabilizantes.

Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina fisiológicamente tamponada. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Adicionalmente, las suspensiones de compuestos activos pueden prepararse como suspensiones oleosas apropiadas para inyección. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen ácidos grasos, tales como aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. También pueden usarse polímeros amino policatiónicos no lipídicos. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas. Para la administración tópica o por vía nasal, se usan en la formulación agentes penetrantes apropiados para la barrera en particular que se quiere penetrar. Generalmente, estos penetrantes son conocidos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse de una forma que es conocida en la técnica, por ejemplo, por medio de procedimientos convencionales de mezclado, disolución, granulación, preparación de grageas, homogeneización, de formación de emulsiones, encapsulación, inmovilización o liofilización. La composición farmacéutica puede proporcionarse como una sal o puede formarse con muchos ácidos, que incluyen, pero sin limitaciones, ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles que las correspondientes formas de base libre en disolventes acuosos o en otros protónicos. En otros casos, la preparación preferida puede ser un polvo liofilizado que puede contener cualquiera o todos los siguientes compuestos: histidina 1-50 mM, sacarosa al 0,1%-2% y manitol al 2-7%, en un intervalo de pH de 4,5 a 5,5, que se combinan con el tampón antes de su uso.

Detalles adicionales de las técnicas para formulación y administración pueden encontrarse en la última edición de REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Maack Publishing Co., Easton, Pa.). Después de que se hayan preparado las composiciones farmacéuticas, pueden colocarse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de una dolencia indicada. Esta etiqueta incluiría cantidad, frecuencia y procedimiento de administración.

Indicaciones y procedimientos terapéuticos

La variante de NIP45 de la presente invención es responsable de muchas funciones biológicas, incluyendo muchas patologías. Por consiguiente, es deseable encontrar compuestos y fármacos que, por un lado, estimulen la variante de NIP45 y que por el otro, puedan inhibir la función la variante de NIP45. Los compuestos que pueden modular la función o la expresión de la variante de NIP45 son útiles para tratar diversas enfermedades alérgicas, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias y enfermedades infecciosas que incluyen asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, urticaria, conjuntivitis, conjuntivitis primaveral, reumatismo articular crónico, lupus eritematoso sistémico, miastenia gravis, psoriasis, colitis diabrótica, síndrome de la respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), timitis linfofolicular, sepsis, polimiositis, dermatomiositis, poliateritis nodosa, enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD), síndrome de Sjoegren, gota y similares.

Esta invención además se refiere al uso de nuevos agentes identificados por los ensayos de selección descritos anteriormente. Por consiguiente, está dentro del alcance de esta invención usar un compuesto de ensayo, identificado como se describe en este documento, en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, puede usarse en un modelo animal un agente identificado como se describe en este documento (por ejemplo, un agente modulador, una molécula de ácido nucleico complementaria, un anticuerpo específico, una ribozima o una molécula que se une al polipéptido NIP45V1) para determinar la eficacia, toxicidad o efectos secundarios del tratamiento con este agente. Alternativamente, un agente identificado como se describe en este documento puede usarse en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de tal agente. Además, esta invención se refiere a los usos de nuevos agentes identificados por los ensayos de selección descritos anteriormente para los tratamientos descritos en este documento.

Un reactivo que afecte a la actividad de la variante de NIP45, puede administrarse a una célula humana, in vitro o in vivo, para reducir la actividad similar a NIP45V1. Preferiblemente, el reactivo se une a un producto de expresión de gen de una variante de NIP45 humana. Si el producto de expresión es una proteína el reactivo, preferiblemente, es un anticuerpo. Para el tratamiento de células humanas ex vivo, puede añadirse un anticuerpo a una preparación de células troncales que se han extraído del organismo. A continuación, las células pueden reimplantarse en el mismo organismo humano o en otro, con o sin propagación clonal, como se conoce en la técnica.

En una realización, el reactivo se administra usando un liposoma. Preferiblemente, el liposoma es estable en el animal al que se le ha administrado durante al menos aproximadamente 30 minutos, más preferiblemente durante al menos aproximadamente 1 hora e, incluso más preferiblemente, durante al menos aproximadamente 24 horas. Un liposoma comprende una composición lipídica que es capaz de dirigirse a un reactivo, especialmente un polinucleótido, a un sitio particular de un animal, tal como un humano. Preferiblemente, la composición lipídica del liposoma es capaz de dirigirlo hacia un órgano específico de un animal, tal como el pulmón, hígado, corazón, cerebro, ganglio linfático y piel.

Un liposoma útil en la presente invención comprende una composición lipídica que es capaz de fusionarse con la membrana plasmática de la célula diana para administrar su contenido a la célula. Preferiblemente, la eficacia de transfección de un liposoma es de aproximadamente 0,5 \mug de ADN por cada 16 nmoles de liposoma administrados a aproximadamente 10^{6} células, más preferiblemente aproximadamente 1,0 \mug de ADN por cada 16 nmoles de liposoma administrados a aproximadamente 10^{6} células e incluso más preferiblemente, aproximadamente 2,0 \mug de ADN por cada 16 nmoles de liposoma administrados a aproximadamente 10^{6} células. Preferiblemente, un liposoma tiene un diámetro de entre aproximadamente 100 y 500 nm, más preferiblemente entre aproximadamente 150 y 450 nm, e incluso más preferiblemente de entre aproximadamente 200 y 400 nm.

Los liposomas adecuados para su uso en la presente invención incluyen aquellos liposomas usados de forma convencional en, por ejemplo, procedimientos de administración de genes, conocidos por los expertos en la materia. Los liposomas más preferidos incluyen liposomas que tiene una composición lipídica policatiónica y/o liposomas con un esqueleto de colesterol conjugado con polietilénglicol. Opcionalmente, un liposoma comprende un compuesto capaz de dirigir el liposoma a una célula tumoral, tal como un ligando de una células tumoral expuesto en la superficie externa de liposoma.

La formación del complejo de un liposoma con un reactivo, tal como un oligonucleótido complementario o una ribozima puede lograrse usando procedimientos que son habituales en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.705.151). Preferiblemente, de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 10 \mug de polinucleótido se combinan con aproximadamente 8 nmoles de liposomas, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 \mug a aproximadamente 5 \mug de polinucleótidos se combinan con aproximadamente 8 nmoles de liposomas e, incluso más preferiblemente, aproximadamente 1,0 \mug de polinucleótidos se combinan con aproximadamente 8 nmoles de liposomas.

En otra realización, pueden administrarse anticuerpos a tejidos específicos in vivo, usando la administración dirigida mediada por proteína. Las técnicas de administración de ADN mediadas por proteínas se describen, por ejemplo, en Findeis y col. Trends in Biotechnol. 11, 202-05 (1993); Chiou y col., GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J. A. Wolff, editores) (1994); Wu y Wu, J. Biol. Chem. 263, 621-24 (1988); Wu y col., J. Biol. Chem. 269, 542-46 (1994); Zenke y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 3655-59 (1990); Wu y col., J. Biol. Chem. 266, 338-42 (1991).

Determinación de una dosis terapéuticamente eficaz

La determinación de una dosis terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la materia. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de un ingrediente activo que aumenta o disminuye la actividad de NIP45V1 en relación con la actividad de NIP45V que tiene lugar en ausencia de la dosis terapéuticamente eficaz.

Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente en ensayos en cultivos celulares o en modelos animales, normalmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también se usa para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración apropiados. A continuación, esta información puede usarse para determina dosis y vías de administración útiles en humanos.

La eficacia terapéutica y toxicidad, por ejemplo, la DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y la DL_{50} (la dosis letal para el 50% de la población), pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o en animales de experimentación. El índice terapéutico es la proporción entre las dosis de efectos tóxicos y terapéuticos, y puede expresarse como el cociente de DL_{50}/DE_{50}.

Se prefieren las composiciones farmacéuticas que muestran índices terapéuticos grandes. Los datos obtenidos de los ensayos en cultivos celulares y en estudios animales se usan para formular un intervalo de dosis para su uso en humanos. Preferiblemente, la dosificación contenida en estas composiciones está dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyan la DE_{50} sin toxicidad o con la mínima. La dosificación varía dentro de este intervalo, dependiendo de la forma de dosificación empleada, de la sensibilidad del paciente y de la vía de administración.

El médico determinará la dosis exacta, a la vista de factores relacionados con el sujeto que requiere el tratamiento. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del ingrediente activo o para mantener los efectos deseados. Los factores que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el género del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, las combinaciones de fármacos, las reacciones de sensibilidad y la tolerancia/respuesta a la terapia. Pueden administrarse composiciones farmacéuticas de acción prolongada cada 3 ó 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la semivida y velocidad de aclaramiento de la formulación en particular.

Las cantidades de dosis normales pueden variar de 0,1 a 100.000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, dependiendo de la vía de administración. Las directrices para dosificaciones y procedimientos de administración en particular de se proporcionan en la literatura y generalmente están disponibles para los especialistas en esta técnica. Los expertos en la materia emplearán diferentes formulaciones para los nucleótidos que para las proteínas o sus inhibidores. De forma similar, la administración de polinucleótidos o polipéptidos será específica de células, dolencias, localizaciones, etc. en particular.

Si el reactivo es un anticuerpo de cadena sencilla, pueden construirse polinucleótidos que codifiquen el anticuerpo e introducirlos en una célula ex vivo o in vivo usando técnicas bien establecidos que incluyen, pero sin limitaciones, transferencia de ADN mediada por transferrina policatiónica, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, fusión celular mediada por liposomas, transporte intracelular de perlas de látex recubiertas de ADN, fusión de protoplastos, infección vírica, electroporación, "pistola de genes" y una transfección mediada por DEAE fosfato cálcico.

Las dosis in vivo eficaces de un anticuerpo están en el intervalo de aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 50 \mug/kg, de aproximadamente 50 \mug a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 100 \mug a aproximadamente 500 \mug/kg de peso corporal del paciente, y de aproximadamente 200 a aproximadamente 250 \mug/kg de peso corporal del paciente. Para la administración de polinucleótidos que codifican anticuerpos de cadena sencilla, las dosis in vivo eficaces están en el intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 ng, 500 ng a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 2 mg, de aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 500 \mug y de aproximadamente 20 \mug a aproximadamente 100 \mug de ADN.

Si el producto de expresión es un ARNm, el reactivo preferiblemente es un oligonucleótido complementario o una ribozima. Pueden introducirse polinucleótidos que expresan oligonucleótidos complementarios o ribozimas dentro de las células mediante diversos procedimientos, como se describe anteriormente.

Preferiblemente, un reactivo reduce la expresión de un gen de NIP45V1 o la actividad de un polipéptido NIP45V1 en al menos aproximadamente el 10, preferiblemente aproximadamente el 50, más preferiblemente aproximadamente el 70, 90 ó 100% en relación con la ausencia del reactivo. La eficacia del mecanismo elegido para disminuir el nivel de expresión de un gen de NIP45V1 o la actividad de un polipéptido NIP45V1 puede evaluarse usando procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como hibridación de sondas de nucleótidos con el ARNm específico de NIP45V1, RT-PCR cuantitativa, detección inmunológica de un polipéptido NIP45V1 o medida de la actividad de NIP45V1.

En cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, cualquiera de las composiciones farmacéuticas de la invención, pueden administrarse con otros agentes terapéuticos apropiados. Un experto en la materia pude hacer una selección de los agentes apropiados para su uso en terapia de combinación, según principios farmacéuticos convencionales. Las combinación de agentes terapéuticos puede actuar de forma sinérgica para llevar a cabo el tratamiento o la prevención de los diversos trastornos descritos anteriormente. Usando esta estrategia, puede ser posible conseguir la eficacia terapéutica con dosis más bajas de cada agente, reduciendo de ese modo la posibilidad de efectos secundarios adversos.

Cualquiera de los procedimientos terapéuticos descritos anteriormente puede aplicarse a cualquier sujeto que necesite ésta terapia, incluyendo, por ejemplo, mamíferos, tales como perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos, y más preferiblemente, seres humanos.

Procedimientos diagnósticos

La variante de NIP45 también puede usarse en ensayos diagnósticos para detectar enfermedades y anomalías o la susceptibilidad a enfermedades y anomalías relacionadas con la presencia de mutaciones en las secuencias del ácido nucleico que codifica una variante de NIP45. Estas enfermedades, a modo de ejemplo, están relacionadas con diversas enfermedades alérgicas, enfermedades autoinmunes y enfermedades infecciosas, que incluyen asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, urticaria, conjuntivitis, conjuntivitis primaveral, reumatismo arterial crónico, lupus eritematoso sistémico, miastenia gravis, psoriasis, colitis diabrótica, síndrome de la respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), timitis linfofolicular, sepsis, polimiositis, dermatomiositis, poliateritis nodosa, enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD), síndrome de Sjoegren, gota y similares.

Pueden determinarse las diferencias entre la secuencia del ADNc o genómico que codifica una variante de NIP45 en individuos afectados por una enfermedad y en individuos normales. Si se observa una mutación en algunos o en todos los individuos afectados pero no en los individuos normales, entonces, probablemente la mutación es un agente causal de la enfermedad.

Las diferencias de secuencia entre un gen de referencia y un gen que tiene mutaciones pueden ponerse de manifiesto mediante el procedimiento de secuenciación directa de ADN. Además, pueden emplearse segmentos de ADN clonados como sondas para detectar segmentos de ADN específicos. La sensibilidad de este procedimiento se potencia en gran medida cuando se combina con PCR. Por ejemplo, puede usarse un cebador de secuenciación con un producto de PCR de doble hebra o una molécula molde de hebra sencilla generada mediante una PCR modificada. La determinación de secuencia se lleva a cabo mediante procedimientos convencionales usando nucleótidos marcados radiactivamente y mediante procedimientos de secuenciación automática usando etiquetas fluorescentes.

Las pruebas genéticas basadas en diferencias de secuencia de ADN pueden llevarse a cabo mediante la detección de la alteración de la movilidad electroforética de fragmentos de ADN en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Las deleciones e inserciones de pequeñas secuencias pueden visualizarse, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de alta resolución. Los fragmentos de ADN de secuencias diferentes pueden distinguirse en geles en gradiente de formamida en condiciones desnaturalizantes, en los que las movilidades de los diferentes fragmentos de ADN se retardan en el gel a posiciones diferentes según sus temperaturas de fusión específica o de fusión parcial (véase, por ejemplo, Myers y col., Science 230, 1242, 1985). Los cambios de secuencia en localizaciones específicas también pueden ponerse de manifiesto mediante ensayos de protección de nucleasas, tal como de protección para la ARNasa y S1 o el procedimiento de escisión química (por ejemplo, Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4397-4401, 1985). De este modo, puede realizarse la detección de una secuencia de ADN específica mediante procedimientos tales como hibridación, protección de ARNasa, escisión química, secuenciación directa de ADN o el uso de enzimas de restricción y transferencia de ADN genómico. Además de los procedimientos directos, tales como electroforesis en gel y secuenciación de ADN, las mutaciones también pueden detectarse mediante análisis in situ.

También pueden detectarse niveles alterados de una variante de NIP45 en diversos tejidos. Los ensayos usados para detectar niveles de los polipéptidos de la proteína en una muestra del organismo, tal como sangre o biopsia de tejido, derivado de un hospedador, son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis por inmunotransferencia y ensayos de ELISA. Generalmente, la descripción anterior describe la presente invención. Puede obtenerse un entendimiento más completo en referencia a los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan sólo con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1

La secuencia del ARNm de NIP45 murina (número de acceso de GenBank U76759) se usó para buscar homólogos de secuencia del subgrupo de las EST en el banco de datos de ADN de Japón (DDBJ), usando el programa BLAST 2.0 (Centro Nacional de Información Biotecnológica). Se encontraron cinco secuencias que tenían más del 75% de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia del ARNm de la NIP45 murina y se seleccionaron como fragmentos potenciales de la secuencia del ARNm de la NIP45 humana. Las cinco secuencias tenían los números de accesos de GenBank AI954626, AA919081, AA063239, AA351060 y AA352196. Para reunir más información sobre la posible secuencia del ARNm de la NIP45 humana, se usaron las mismas cinco secuencias para buscar secuencias homólogas en la DDBJ. Como resultado de la segunda búsqueda, se identificó una EST adicional con número de acceso GenBank T56384. A continuación, se realizó una tercera búsqueda con la EST T56384 y se identificó una EST adicional, con número de acceso de GenBank W31117.

Los clones que contenían cuatro de las EST se obtuvieron de Genoma Systems (St. Louis, MO, EE.UU.) para una evaluación de secuencia adicional. Las inserciones completas de los clones EST AA919081, AA063239, T56384 y W31117 se secuenciaron en un secuenciador de ADN ABI Prism 377 (PE Biosystems) según el protocolo de secuenciación convencional del fabricante, usando cebadores complementarios a las regiones promotoras T3 y T7 que flanquean las inserción de cada vector. Después de que se obtuvieron las secuencias completas, se alinearon las secuencias de las siete EST usando el programa Sequencher (GeneCodes Corporation, Ann. Arbor, MI, EE.UU.), formando una secuencia contigua de ADN. Se consideró que la secuencia consenso de este cóntigo representa la secuencia del ARNm de la NIP45 humana. Las secuencias de nucleótidos de la NIP45 humana se muestran en la ID SEC Nº 6. La fase de lectura abierta del homólogo humano nativo de NIP45 está compuesta de 1.260 nucleótidos (ID SEC Nº 7).

Ejemplo 2 Identificación de las variantes de empalme alternativo de NIP45

Para probar la expresión de NIP45 en diversos tipos de tejidos, se llevó a cabo una amplificación por PCR de una región de 368 pares de bases del ADNc de la NIP45 humana, usando los cebadores oligonucleotídicos NIP-11 (cccgactcttcccactcaaaatcc, que corresponden a las posiciones 797-820 de la secuencia mostrada en la ID SEC Nº 6) y NIP12 (cagtcccatggcctcctcatagtg, que corresponden a las posiciones 1.141-1.164 de la secuencia mostrada en la ID SEC Nº 6) y el Panel de ADNc de Tejido Múltiple del Sistema Inmune Humano (Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA, EE.UU.) como molde. La amplificación se realizó con la ADN polimerasa AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer) con las siguientes condiciones de los ciclos de PCR: desnaturalización del ADN molde durante 9 minutos a 96ºC seguido por ciclos de entre 96ºC durante 15 segundos y 66ºC durante 30 segundos repetidos 55 veces. Como se muestra en la Figura 13, la amplificación por PCR del ADNc de NIP45 derivado de médula ósea, hígado fetal y leucocitos de sangre periférica proporcionaba el producto de 368 pares de bases esperado, mientras que la amplificación por PCR del ADNc de NIP45 derivado de ganglio linfático y de timo daba un producto mucho más corto y la amplificación por PCR del ADNc de NIP45 derivado de bazo daba tanto el producto de 368 pares de base como el producto
más corto.

La secuenciación directa del producto de PCR más corto se llevó a cabo en un secuenciador de ADN ABI Prism 377 (PE Biosystems), como se describe en el Ejemplo 1, excepto por que se usan los cebadores NIP-11 y NIP-12. La longitud más corta del producto era debida a la ausencia de un fragmento de 255 pares de bases en comparación con la secuencia del ADN de NIP45. El alineamiento del producto de PCR más corto con la secuencia del ADN de NIP45 y con un fragmento de la secuencia genómica derivada del gen de NIP45 indicaba que los límites de las 255 pb de la secuencia delecionada se correspondían exactamente con los límites de dos exones contenidos en el fragmento de la secuencia genómica. Esta variante de empalme se denominó NIP45V1. Las secuencias de nucleótidos del ADNc preparado a partir de los ARNm de la NIP45V1 humana se muestran en la ID SEC Nº 1.

La posterior amplificación por PCR de la región codificante completa de NIP45 usando ADNc del bazo a partir del panel anterior como molde y los cebadores oligonucleotídicos NIP-L4 (aaagtgtgccatggcggagcctgt, que corresponden a las posiciones 3-26 de la secuencia mostrada en la ID SEC Nº 6) y NIP-R4 (gggtgtcagccccagacctcaat, que corresponden a las posiciones 1.255-1.277 de la ID SEC Nº 6) producía varios productos de amplificación de diferente tamaño. Los productos de amplificación se clonaron en el vector de clonación pCRII-TOPO (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE.UU.) y se secuenciaron en un secuenciador de ADN ABI Prism 377 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). El análisis de las secuencias obtenidas puso de manifiesto tres variantes de empalme alternativo adicionales, denominadas NIP45V2, NIP45V3 y NIP45V4, respectivamente.

Propiedades de la secuencia de nucleótidos del ADNc de NIP45V1 (ID SEC Nº 1 y 2)

1. Deleción de 255 pares de bases correspondientes a las bases 847 a 1.101 de la secuencia codificante de la transcripción de NIP45 completa.

2. Cuando la región delecionada se compara con una secuencia genómica parcial del gen de NIP45 (clon RPCI-11-449D23, secuencia genómica de sondeo, número de acceso AQ584348) corresponde exactamente con dos exones, lo que indica que la deleción se debe a un suceso de empalme alternativo.

Propiedades de la secuencia de aminoácidos de NIP45V1 (ID SEC Nº 8)

1. La traducción conceptual daba una proteína de 334 aminoácidos de longitud, 85 restos de aminoácidos más corta que la proteína NIP45 de longitud completa de 419 aminoácidos.

2. Los restos de aminoácidos perdidos en la traducción conceptual de NIP45V1 corresponden a los restos de los aminoácidos 283 a 367 de la proteína NIP45 de longitud completa.

Propiedades de las regiones eliminadas en el empalme

Las secuencias de la proteína NIP45 tienen una homología significativa con las proteínas similares a ubiquitina, UBL1 y SMT3H2, también conocidas con sentrina y sentrina 2. Este dominio de NIP45 homólogo a la sentrina se extiende del resto aminoacídico 342 al 418 y contiene 44 de los 77 restos (56%) que son similares a los de la secuencia de SMT3H2, entre los cuales 28 de los 77 restos (36%) son idénticos a los de la secuencia de SMT3H2, según se identifica mediante el programa de búsqueda de similitud de secuencia BLAST (Centro Nacional para la Información Biotecnológica). NIP45 también tiene una región de homología con la ubiquitina desde los restos amino 274 al 334, que muestran el 84,7% de alineamiento frente a una matriz de valoración de posiciones específicas de homólogos de ubiquitina en la Base de Datos de Dominios Conservados del Centro Nacional para la Información Biotecnológica. El dominio homólogo a sentrina se ha delecionado parcialmente en NIP45V1. El dominio homólogo a ubiquitina está delecionado el 85% en NIP45V1.

Distribución en tejidos de NIP45V1

Se ha descubierto que la variante de empalme de NIP45, NIP45V1, sólo se expresa en timo, bazo y ganglio linfático, mientras que se ha encontrado que NIP45 se expresa en todos los tejidos relacionados con el sistema inmune analizados hasta la fecha, incluyendo médula ósea, hígado fetal, ganglio linfático, leucocitos de sangre periférica, bazo, timo y amígdala.

Ejemplo 3 Caracterización funcional

Las funciones de las variantes de NIP45 se evaluaron por su capacidad para interaccionar específicamente con NF-ATp en células de mamífero. Cada una de las inserciones del ADNc de NIP45 V (V1-V4) obtenidos en el Ejemplo 2 se subclonaron en un vector de expresión de mamíferos que fusionaba la región codificante con un epítopo etiqueta de un péptido de la hemaglutinina (HA) del virus influenza, vector pCEP4-HA (Herrscher, R.F. y col. (1995) Genes Dev. 9: 3067-3082), para crear el vector de expresión.

A continuación, el vector se transfectaba conjuntamente con un plásmido de expresión de NF-ATp en células HepG2 que expresaban bajos niveles de NF-ATp. Como control, las células HepG2 también se transfectaron conjuntamente con HIP45-HA junto con el vector de expresión sin la inserción de NF-ATp o con el vector de expresión de NF-ATp junto con una fusión fuera de fase de NIP45 con un epítopo etiqueta. Se prepararon lisados de las células transfectadas y se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-NF-ATp. A continuación, se realizaron análisis de inmunotransferencia del material inmunoprecipitado usando anticuerpos anti-NF-ATp o anti-HA y se observaba que NF-AR y la variante NIP45 se asociaban físicamente in vivo en las células de mamífero.

Ejemplo 4 Expresión tisular del ARNm de NIP45V2-V4

Se realizó un análisis del ARN de diferentes tejidos humanos mediante una reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) cuantitativa, para investigar la expresión tisular del ARNm de NIP45V2-4. Se usaron como molde 100 \mug de ARN total de diversos tejidos (Panel I-V de ARN total humano, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, EE.UU.) para sintetizar la primera hebra del ADNc usando el sistema SUPERSCRIPT^{TM} First-Strand Syntheswas para RT-PCR (Life Technologies, Rockville, MD, EE.UU.). A continuación, para analizar la presencia de la transcripción del ARNm de NIP45V, se usaron 10 ng de la primera hebra de ADNc como molde en una reacción en cadena de la polimerasa. La reacción en cadena de la polimerasa se realizó en un LightCycler (Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, IN, EE.UU.), en presencia del colorante fluorescente de unión a ADN, SYBR Green I, que se une al surco menor de la doble hélice de ADN, producido sólo cuando en la reacción se sintetiza eficazmente ADN de doble hebra y tras la unión emite luz que puede medirse cuantitativamente mediante el aparato LightCycler. La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo usando cebadores oligonucleotídicos diseñados para abarcar la unión de las regiones delecionadas que flanquean los exones empalmados y se toman las medidas de la intensidad de luz emitida después de cada ciclo de la reacción cuando la reacción alcanza una temperatura de 86ºC. Las intensidades de luz emitida se convierten en número de copias del gen transcrito por nanogramo de ADNc molde mediante la comparación con patrones de concentración conocida incluidos simultáneamente en la reacción.

Para corregir las diferencias en los niveles de transcripción de ARNm por células en los diversos tipos de tejido, se realizó un procedimiento de normalización usando niveles de expresión calculados en los diversos tejidos de cinco genes constitutivos diferentes: gliceraldehído-3-fosfato (G3PHD), hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HPRT), actina beta, porfobilonógeno desaminasa (PBGD) y beta-2-microglobulina. Excepto por el uso de un conjunto ligeramente diferente de genes constitutivos, los procedimientos de normalización son esencialmente los mismos que los descritos en el RNA Master Blot User Manual, Apéndice C (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, EE.UU.).

Ejemplo 5 Actividad funcional de las variantes de NIP45 en la regulación de la expresión génica

Para analizar el papel funcional de las variantes de NIP45 en la transcripción dirigida por NF-AT, se expresó cada una de las NIP45 V a altos niveles en células HepG2. Las células HepG2 expresan bajos niveles de NF-AT endógena y se ha demostrado que la expresión ectópica de las proteínas miembros de la familia de NF-AT activa en trans la transcripción dirigida por NF-AT en esta línea celular en ausencia de estimulación exógena (Hoey, T. y col. (1995) Immunity 2: 461-472). Las células HepG2 se transfectan con un gen indicador 3X NF-AT-CAT (Venkataraman, L. y col. (1994) Immunity 1: 189-196) y los plásmidos control o de expresión para las variantes de NIP45 y los miembros de la familia NF-AT (NF-ATp, NF-ATc, NF-AT3, NF-AT4). Este gen indicador contiene tres copias en tándem del sitio de unión a NF-AT derivado del gen IL-2. Alternativamente, las células HepG2 se transfectaron con una construcción indicadora IL-4-CAT (que se extiende hasta las -732 pb del promotor de la IL-4 y que contienen un promotor nativo dependiente de NF-AT) y vectores de expresión o controles para las variantes de NIP45, NF-ATp y c-maf. Las células HepG2 se transfectaron por el procedimiento de DEAE-dextrano, como se describe en Hoey, T. y col. (1995) anterior y se realizaron ensayos de CAT según metodologías convencionales.

Ejemplo 6 Producción de IL-4 endógena

La expresión de IL-4 endógena en células que normalmente no producen IL-4 se examinó para ver si la combinación de cualquiera de las variantes de NIP45, NF-ATp y c-Maf es suficiente para inducir la expresión. Las células de linfoma B, M12 se cotransfectaron de forma transitoria con plásmidos de expresión para NF-ATp y c-Maf junto con NIP45 o el vector control pCI. Las células M12 se transfectaron de forma transitoria mediante electroporación como se ha descrito previamente (Ho., I. C. y col. (1996) Cell 85: 973-983). Los niveles de IL-4 en los sobrenadantes recogidos 72 horas después se midieron en un ELISA para IL-4 disponible en el mercado (Pharmingen), realizado según las instrucciones del fabricante, excepto con la modificación descrita (Ho, I. C. y col. (1996), anterior).

Ejemplo 7 Identificación de un compuesto de ensayo que se une a una variante de NIP45

El polipéptido NIP45 V1 purificado que comprende una proteína glutatión-S-transferasa y absorbido a pocillos derivatizados con glutatión de placas de microvaloración de 96 pocillo, se pone en contacto con compuestos de ensayo de una biblioteca de moléculas pequeñas a pH 7,0 en una solución tamponadora fisiológica. Los polipéptidos NIP45 V1 comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostrados en la ID SEC Nº 8. Los compuestos de ensayo comprenden una etiqueta fluorescente. Las muestras se incubaron de 5 minutos a una hora. Las muestras control se incubaron en ausencia de un compuesto de ensayo.

La solución tamponadora que contiene los compuestos se elimina de los pocillos mediante lavado. La unión de un compuesto a un polipéptido NIP45V1 se detecta midiendo la fluorescencia de los contenidos de los pocillos. Un compuesto que aumenta la fluorescencia en un pocillo en al menos el 15%, en relación con la fluorescencia de un pocillo en el cual no se ha incubado ningún compuesto de ensayo, se identifica como un compuesto que se une a un polipéptido NIP45V1.

Ejemplo 8 Identificación de un compuesto de ensayo que modula (aumenta o disminuye) la expresión del gen de NIP45V1

Se administra un compuesto de ensayo a un cultivo de células de ganglio linfático humano y se incuba a 37ºC durante 10 a 45 minutos. Se proporciona como control negativo un cultivo del mismo tipo de células incubadas durante el mismo tiempo sin el compuesto.

Se aísla el ARN de dos cultivos como se describe en Chirgwin y col., Biochem. 18, 5294-99, 1979). Las transferencias del ARN total se preparan usando de 20 a 30 \mug de ARN total y se hibridaron con una sonda específica de NIP45V1 marcada con ^{32}P a 65ºC en Express-hyb (CLONTECH). La sonda comprende al menos 11 nucleótidos contiguos seleccionados de la secuencia complementaria de la SED ID Nº 1 ó 2. Un compuesto de ensayo que modula la señal específica de NIP45V1 respecto a la señal obtenida en ausencia del compuesto de ensayo se identifica como un modulador de la expresión del gen de NIP45V1.

Ejemplo 9

La selección de un compuesto que modula la interacción entre la variante de NIP45 y NF-AT puede realizarse con el uso de sistemas de doble híbrido de levaduras.

Ejemplo 10

Tratamiento de enfermedades relacionadas con el sistema inmune modulando la función de una variante de NIP45 humana.

Se administra a un paciente un polinucleótido que expresa una variante de la NIP45 humana o un compuesto que modula la función de la variante de NIP45. Se reduce en el paciente la gravedad de la inflamación.

<110> Bayer AG

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<120> REGULACION DE UNA VARIANTE DE LA PROTEÍNA NIP45 QUE INTERACCIONA CON NF-AT

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<130> Países extranjeros RCK-2

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<140>

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<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<150> Documento US 60/199.356

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 25-04-2000

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<160> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2.232

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

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<210> 2

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<211> 1.005

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

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<222> (1) .. (1.005)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NIP45V1-ORF

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1.115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (1.115)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NIP45V2-ORF

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 913

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (913)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NIP45V31-ORF

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (272)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NIP45V4-ORF

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2.576

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (2.576)

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<223> ADNc de NIP45

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<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<310> Documento WO 99/21993

\vskip0.400000\baselineskip

<311> 21-10-1998

\vskip0.400000\baselineskip

<312> 06-05-1999

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1.260

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (1.260)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NIP45-ORF

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 334

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> PÉPTIDO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (334)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NIP45V1

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 286

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> PÉPTIDO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (286)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NIP45V2

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 303

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> PÉPTIDO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (303)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NIP45V3

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> PÉPTIDO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (55)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NIP45V4

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 419

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> PÉPTIDO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (419)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NIP45

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgactctt cccactcaaa atcc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagtcccatg gcctcctcat agtg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaagtgtgcc atggcggagc ctgt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggtgtcagc cccagacctc aat

\hfill

23

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Claims (15)

1. Un polinucleótido seleccionado entre el grupo constituido por:

i) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 8 que carece de los restos de aminoácidos 283 a 367 respecto a la proteína NIP45 de longitud completa, que son capaces de interaccionar con NFATp para potenciar la transcripción del gen de la IL-4;

ii) polinucleótidos que comprenden la secuencia de la ID SEC Nº 2 que carece de la parte de la secuencia que codifica los restos de aminoácidos 283 a 367 respecto a la proteína NIP45 de longitud completa, en el que las proteínas codificadas son capaces de interaccionar con NFATp para potenciar la transcripción del gen de la IL-4.

2. Un vector de expresión que contiene cualquier polinucleótido de la reivindicación 1.

3. Una célula hospedadora que contiene el vector de expresión de la reivindicación 2.

4. Un polipéptido sustancialmente purificado, codificado por un polinucleótido de la reivindicación 1.

5. Un procedimiento para producir un polipéptido según la reivindicación 4, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas:

a. cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 3 en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido según la reivindicación 4; y

b. recuperar el polipéptido según la reivindicación 4 del cultivo de la célula hospedadora.

6. Un procedimiento para detectar un polinucleótido según la reivindicación 1 en una muestra biológica tomada de un organismo humano o animal que comprende las siguientes etapas:

a. hibridar cualquier polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 con un material de ácido nucleico de una muestra biológica tomada de un organismo humano o animal, para formar de este modo un complejo de hibridación; y

b. detectar dicho complejo de hibridación.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que antes de la hibridación, se amplifica el material del ácido nucleico de la muestra biológica.

8. Un procedimiento para la detección de un polipéptido de la reivindicación 4 que comprende las etapas de:

a. poner en contacto una muestra biológica tomada de un organismo humano o animal con un anticuerpo que interacciona específicamente con el polipéptido y

b. detectar la interacción.

9. Un kit de diagnóstico para llevar a cabo el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

10. Un procedimiento para seleccionar agentes que disminuyen la actividad de un polipéptido de la reivindicación 4, que comprende las etapas de:

a. poner en contacto un compuesto de ensayo con cualquier polipéptido codificado por cualquier polinucleótido de la reivindicación 1 o con cualquier polinucleótido según la reivindicación 1;

b. detectar la unión del compuesto de ensayo con el polipéptido codificado por cualquiera de los polinucleótidos de la reivindicación 1 o con el polinucleótido de la reivindicación 1, en el que un compuesto de ensayo que se une al polipéptido o al polinucleótido se identifica como un posible agente terapéutico para disminuir la actividad de un polipéptido variante de empalme de NIP45, según la reivindicación 4.

11. Un procedimiento de selección de agentes que regulan la actividad de un polipéptido de la reivindicación 4, que comprende las etapas de:

a. poner en contacto un compuesto de ensayo con un polipéptido codificado por cualquiera de los polinucleótidos de la reivindicación 1 ó 2; y

b. detectar una actividad del polipéptido, en el que un compuesto de ensayo que aumenta la actividad se identifica como un posible agente terapéutico para aumentar la actividad del polipéptido y en el que un compuesto de ensayo que disminuye la actividad del polipéptido se identifica como un posible agente terapéutico para disminuir la actividad del polipéptido.

12. Una composición farmacéutica que comprende el vector de expresión de la reivindicación 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Uso del vector de expresión de la reivindicación 2 en la preparación de un medicamento para modular la actividad de un polipéptido variante de empalme de NIP45 que carece de los restos de aminoácidos 283 a 367 respecto a la proteína NIP45 de longitud completa en una enfermedad.

14. Uso de la reivindicación 13 en el que la enfermedad es una enfermedad autoinmune, alérgica, infecciosa o inflamatoria crónica.

15. Uso de la reivindicación 14 en el que la enfermedad es asma.