ES2287285T3 - Regulacion de la proteina del tipo proteina quinasa humana. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para seleccionar agentes útiles en el tratamiento de la diabetes que disminuyan la actividad de una proteína tipo proteína quinasa, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un compuesto de ensayo con una proteína tipo proteína quinasa que comprende una secuencia polipeptídica definida por la SEC ID Nº 9; y (b) detectar una actividad de la proteína tipo proteína quinasa del polipéptido, en el que un compuesto de ensayo que disminuye la actividad de la proteína tipo proteína quinasa del polipéptido se identifica como un agente terapéutico potencial para disminuir la actividad de la proteína tipo proteína quinasa. 89
Description
Regulación de la proteína del tipo proteína
quinasa humana.
La invención se refiere al uso de una proteína
tipo proteína quinasa humana en la selección de fármacos útiles en
el tratamiento de la diabetes.
Las proteína quinasas desempeñan papeles
críticos en la regulación de cambios bioquímicos y morfológicos
asociados con el crecimiento y la división celular. D'Urso y col.,
Science 250, 786-91, 1990; Birchmeier y col.,
Bioessays 15,185-89, 1993); Patente de
Estados Unidos 6.200.770. Sirven como receptores del factor de
crecimiento y transductores de señales y se han implicado en la
transformación y malignidad celular. Hunter y col., Cell 70,
375-87, 1992; Posada y col., Mol. Biol. Cell
3, 583-92, 1992; Hunter y col., Cell 79,
573-82, 1994. Por ejemplo, las proteína quinasas han
demostrado participar en la transmisión de señales desde receptores
del factor de crecimiento (Sturgill y col., Nature 344,
715-18, 1988; Gomez y col., Nature 353,
170-73, 1991), el control de la entrada de las
células en mitosis (Nurse y col., Nature 344,
503-08, 1990; Maller, Curr. Opin. Cell Biol.
3, 269-75, 1991), y la regulación de los haces
de actina (Husain-Chishti y col., Nature
334, 718-21, 1988).
Las proteína quinasas pueden dividirse en dos
grupos principales en base a la similitud de secuencia de
aminoácidos o la especificidad por restos de serina/treonina o
tirosina. Una pequeña cantidad de quinasas con especificidad doble
son estructuralmente similares al grupo específico para
serina/treonina. En la amplia clasificación, las quinasas pueden
subdividirse adicionalmente en familias cuyos miembros comparten un
elevado grado de identidad de secuencia de aminoácidos del dominio
catalítico y también tienen propiedades bioquímicas similares. La
mayoría de los miembros de la familia de las proteína quinasas
también comparten características estructurales fuera del dominio
quinasa que reflejan sus funciones celulares particulares. Éstas
incluyen dominios reguladores que controlan la actividad quinasa o
la interacción con otras proteínas. Hanks y col., Science
241, 42-52, 1988).
Existe una necesidad en la técnica de
identificar proteínas tipo proteína quinasa, que puedan regularse
para proporcionar efectos terapéuticos.
Se describen reactivos y procedimientos para
regular una proteína tipo proteína quinasa humana.
Una realización de la invención es un
procedimiento para seleccionar agentes útiles en el tratamiento de
la diabetes. Se pone en contacto un compuesto de ensayo con un
polipéptido de proteína tipo proteína quinasa que comprende una
secuencia de aminoácidos definida por la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID Nº 9.
Se detecta la unión entre el compuesto de ensayo
y el polipéptido de proteína tipo proteína quinasa. Se selecciona
un agente que funciona disminuyendo la actividad de proteína tipo
proteína quinasa como un agente que es potencialmente útil en el
tratamiento de la diabetes.
Otra realización de la invención es un
procedimiento para seleccionar agentes que sean útiles para el
tratamiento de la diabetes. Se pone en contacto un compuesto de
ensayo con un polipéptido de proteína tipo proteína quinasa que
comprende una secuencia de aminoácidos definida por la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID
Nº 9.
Nº 9.
Se detecta una actividad de proteína tipo
proteína quinasa del polipéptido. De este modo se identifica un
compuesto de ensayo que disminuye la actividad de proteína tipo
proteína quinasa del polipéptido con relación a la actividad de
proteína tipo proteína quinasa en ausencia del compuesto de ensayo
como un agente potencial para el tratamiento de la diabetes.
Se describe una proteína tipo proteína quinasa
humana que puede usarse para identificar compuestos de ensayo que
pueden actuar, por ejemplo, como inhibidores en el sitio activo de
la enzima.
La Fig. 1 muestra la secuencia de ADN que
codifica un polipéptido de proteína tipo proteína quinasa (SEC
ID
Nº 1).
Nº 1).
La Fig. 2 muestra la secuencia de aminoácidos
deducida de la secuencia de ADN de la Fig. 1 (SEC ID Nº 2).
La Fig. 3 muestra la secuencia de aminoácidos de
la proteína identificada por swiss|P80192|M3K9_HUMAN (SEC ID Nº
3).
La Fig. 4 muestra la secuencia de ADN que
codifica un polipéptido de proteína tipo proteína quinasa (SEC
ID
Nº 4).
Nº 4).
La Fig. 5 muestra la secuencia de ADN que
codifica un polipéptido de proteína tipo proteína quinasa (SEC
ID
Nº 5).
Nº 5).
La Fig. 6 muestra la secuencia de ADN que
codifica un polipéptido de proteína tipo proteína quinasa (SEC
ID
Nº 6).
Nº 6).
La Fig. 7 muestra la secuencia de ADN que
codifica un polipéptido de proteína tipo proteína quinasa (SEC
ID
Nº 7).
Nº 7).
La Fig. 8 muestra la secuencia de ADN que
codifica un polipéptido de proteína tipo proteína quinasa (SEC
ID
Nº 8).
Nº 8).
La Fig. 9 muestra la secuencia de aminoácidos
deducida de la secuencia de ADN de la Fig. 8 (SEC ID Nº 9).
La Fig. 10 muestra la secuencia de ADN que
codifica un polipéptido de proteína tipo proteína quinasa (SEC
ID
Nº 10).
Nº 10).
La Fig. 11 muestra la alineación en BLASTP de
423 (SEC ID Nº 2) frente a swiss|P80192|M3K9_HUMAN (SEC ID Nº
3).
La Fig. 12 muestra la alineación en HMMPFAM de
423 (SEC ID Nº 2) frente a pfam|hmm|pkinase.
La Fig. 13 muestra la expresión relativa del
ARNm de la proteína tipo proteína quinasa humana en células y
tejidos cancerosos.
La Fig. 14 muestra la expresión relativa del
ARNm de la proteína tipo proteína quinasa en tejido relevante para
la obesidad y la diabetes.
La Fig. 15 muestra el número de copias del ARNm
de la proteína tipo proteína quinasa en tejido relevante para la
obesidad y la diabetes.
La Fig.16 muestra el perfil de expresión
relativa del ARNm de la proteína de tipo proteína quinasa en
diversos tejidos humanos (mapa corporal).
La invención se refiere al uso de una proteína
tipo proteína quinasa humana que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 9. Se muestra una secuencia
codificante para la proteína tipo proteína quinasa humana en las
SEC ID Nº 1, 8 y 10. Esta secuencia se localiza en el cromosoma 15.
Los EST relacionados (SEC ID Nº 4-7) se expresan en
células B de linfoma y centros germinales.
La proteína tipo proteína quinasa humana es un
31% idéntica en 287 aminoácidos a swiss|P80192|M3K9_HUMAN (SEC
ID Nº 3) (Fig. 1). Los resultados de la búsqueda de homología en
Pfam apoyan la identificación de esta proteína como una proteína
quinasa eucariota. Su probable función como una proteína tirosina
quinasa de clase III también está apoyada por los resultados de una
búsqueda en la base de datos BLOCKS. Los patrones consenso están
subrayados en la Fig. 1; el resto Asp del sitio activo y el resto
Lys de unión a ATP están marcados en negrita.
La proteína tipo proteína quinasa humana también
puede usarse para seleccionar inhibidores de la proteína tipo
proteína quinasa humana.
Los polipéptidos tipo proteína quinasa humana de
acuerdo con la invención comprenden al menos 6, 10, 15, 20, 25, 50,
75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, o 286 aminoácidos
contiguos seleccionados ente la secuencia de aminoácidos mostrada
en la SEC ID Nº 2 o una variante biológicamente activa de la misma,
como se define a continuación. Los polipéptidos tipo proteína
quinasa humana de acuerdo con la invención comprenden al menos 6,
10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300,
325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625,
650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950,
975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1225,
1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375 ó 1394 aminoácidos contiguos
seleccionados entre la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID
Nº 9 o una variante biológicamente activa de la misma, como se
define a continuación. Un polipéptido tipo proteína quinasa de la
invención, por lo tanto, puede ser una parte de una proteína tipo
proteína quinasa, una proteína tipo proteína quinasa de longitud
completa, o una proteína de fusión que comprende todo o parte de una
proteína tipo proteína quinasa.
Las variantes del polipéptido tipo proteína
quinasa humana que son biológicamente activas, por ejemplo, retienen
la actividad enzimática, también son polipéptidos tipo proteína
quinasa humana. Preferiblemente, las variantes del polipéptido tipo
proteína quinasa humana de origen natural o no natural tienen
secuencias de aminoácidos que son al menos aproximadamente un 32,
35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, ó 70, preferiblemente aproximadamente
un 75, 80, 85, 90, 96, 96, 98, o 99% idénticas a la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 2 y 9 o un fragmento de la
misma. El porcentaje de identidad entre una variante del polipéptido
tipo proteína quinasa humana putativo y una secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº 2 o 9 se determina por procedimientos
convencionales. Véase, por ejemplo, Altschul y col., Bull. Math.
Bio. 48:603 (1986), y Henikoff & Henikoff, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89:10915 (1992). En resumen, se alinean dos
secuencias de aminoácidos para optimizar los valores de alineación
usando una penalización por abertura de hueco de 10, una
penalización por extensión de hueco de 1, y la matriz de valores
"BLOSUM62" de Henikoff & Henikoff, 1992.
Los especialistas en la técnica aprecian que hay
muchos algoritmos establecidos para alinear dos secuencias de
aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA" de
Pearson & Lipman es un procedimiento de alineación de proteínas
adecuado para examinar el nivel de identidad compartido por una
secuencia de aminoácidos descrita en este documento y la secuencia
de aminoácidos de una variante putativa. El algoritmo FASTA se
describe por Pearson & Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
85:2444(1988), y por Pearson, Meth. Enzymol.
183:63 (1990). En resumen, FASTA caracteriza primero la
similitud de secuencia identificando regiones compartidas por la
secuencia cuestión (por ejemplo, la SEC ID Nº 2 ó 9) y una secuencia
de ensayo que tiene la mayor densidad de identidades (si la
variable ktup es 1) o pares de identidades (si ktup=2), sin
considerar sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos
conservativas. Las diez regiones con la mayor densidad de
identidades después se vuelven a valorar comparando la similitud de
todos los aminoácidos emparejados usando una matriz de sustitución
de aminoácidos, y se "adaptan" los extremos de las regiones
para que incluyan solamente los restos que contribuyen al valor
mayor. Si hay varias regiones con valores mayores que el valor de
"corte" (calculado por una fórmula predeterminada basada en la
longitud de secuencia del valor ktup), entonces se examinan las
regiones adaptadas iniciales para determinar si las regiones pueden
unirse para formar una alineación aproximada con huecos.
Finalmente, las regiones con la valoración más alta de las dos
secuencias de aminoácidos se alinean usando una modificación del
algoritmo de
Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman
& Wunsch, J. Mol. Biol.48: 444 (1970); Sellers, SIAM
J. Appl. Math. 26:787 (1974)), que permite inserciones y
deleciones de aminoácidos. Los parámetros preferidos para el
análisis FASTA son: ktup=1, penalización por abertura de hueco=10,
penalización por extensión de hueco=1, y matriz de
sustitución=BLOSUM62. Estos parámetros pueden introducirse en un
programa FASTA modificando el archivo de la matriz de valores
("SMATRIX"), como se explica en el Apéndice 2 de Pearson,
Meth. Enzymol. 183:63 (1990).
También puede usarse FASTA para determinar la
identidad de secuencia de moléculas de ácido nucleico usando una
proporción que se ha descrito anteriormente. Para comparaciones de
secuencia de nucleótidos, el valor ktup puede variar de uno a seis,
preferiblemente de tres a seis, más preferiblemente tres, con otros
parámetros establecidos como defecto.
Variaciones en el porcentaje de identidad pueden
deberse, por ejemplo, a sustituciones, inserciones o deleciones de
aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos se definen como un
reemplazo de un aminoácido por otro. Son de naturaleza conservativa
cuando el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales y/o
químicas similares. Ejemplos de reemplazos conservativos son
sustitución de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato
con un glutamato, o una treonina con una serina.
Las inserciones o deleciones de aminoácidos son
cambios a o en una secuencia de aminoácidos. Típicamente están en
el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. Puede encontrarse
una guía para determinar qué restos aminoacídicos pueden
sustituirse, insertarse, o delecionarse sin eliminar la actividad
biológica o inmunológica de un polipéptido tipo proteína quinasa
humana usando programas informáticos bien conocidos en la técnica,
tales como el software DNASTAR.
La invención adicionalmente abarca polipéptidos
tipo proteína quinasa que se modifican de forma diferente durante o
después de la traducción, por ejemplo, por glicosilación,
acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos
protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a una
molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Cualquiera de
las numerosas modificaciones químicas puede realizarse por técnicas
conocidas incluyendo, aunque sin limitación, escisión química
específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina,
papaína, proteasa V8, NaBH_{4}, acetilación, formilación,
oxidación, reducción, síntesis metabólica en presencia de
tunicamicina, etc.
Modificaciones
post-traduccionales adicionales abarcadas por la
invención incluyen, por ejemplo, cadenas de carbohidrato unidas a N
o unidas a O, procesamiento de los extremos
N-terminal o C-terminal, unión de
restos químicos a la estructura de aminoácidos, modificaciones
químicas de cadenas de carbohidrato unidas a N o unidas a O, y
adición o deleción de un resto de metionina
N-terminal como resultado de la expresión en células
huésped procariotas. Los polipéptidos tipo proteína quinasa humana
también pueden modificarse con un marcador detectable, tal como un
marcador enzimático, fluorescente, isotópico o de afinidad para
permitir la detección y aislamiento de la
proteína.
proteína.
La invención también proporciona derivados
modificados químicamente de los polipéptidos tipo proteína quinasa
que pueden proporcionar ventajas adicionales tales como solubilidad,
estabilidad y tiempo en circulación aumentados del polipéptido, o
inmunogenicidad disminuida (véase la Patente de Estados Unidos Nº
4.179.337). Los restos químicos para la derivatización pueden
seleccionarse entre polímeros solubles en agua tales como
polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol,
carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), y
similares. Los polipéptidos pueden modificarse en posiciones
aleatorias o predeterminadas en la molécula y pueden incluir uno,
dos, tres, o más restos químicos unidos.
Si un cambio de aminoácido o una modificación
del polipéptido provoca un polipéptido tipo proteína quinasa
biológicamente activo puede determinarse fácilmente ensayando la
actividad enzimática, como se describe por ejemplo, en la Patente
de Estados Unidos 6.194.186.
Las proteínas de fusión son útiles para generar
anticuerpos contra las secuencias de aminoácidos del polipéptido
tipo proteína quinasa y para su uso en diversos sistemas de ensayo.
Por ejemplo, pueden usarse proteínas de fusión para identificar
proteínas que interaccionen con partes de un polipéptido tipo
proteína quinasa. Puede usarse cromatografía de afinidad de
proteínas o ensayos basados en bibliotecas para las interacciones
proteína-proteína, tales como los sistemas de doble
híbrido de levaduras o presentación de fagos, para este propósito.
Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica y también
pueden usarse como filtros de fármacos.
Una proteína de fusión de polipéptido tipo
proteína quinasa comprende dos segmentos polipeptídicos fusionados
juntos mediante un enlace peptídico. El primer segmento
polipeptídico comprende al menos 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100,
125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, ó 286 aminoácidos contiguos de la
SEC ID Nº 2 o de una variante biológicamente activa, tal como las
descritas anteriormente. El primer segmento polipeptídico comprende
al menos 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225,
250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550,
575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875,
900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175,
1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375 ó 1394 aminoácidos
contiguos de la SEC ID Nº 2 o de una variante biológicamente activa,
tal como las descritas anteriormente. El primer segmento
polipeptídico también puede comprender la proteína tipo proteína
quinasa de longitud completa.
El segundo segmento polipeptídico puede ser una
proteína de longitud completa o un fragmento de la proteína. Las
proteínas habitualmente usadas en la construcción de proteínas de
fusión incluyen \beta-galactosidasa,
\beta-glucuronidasa, proteína fluorescente verde
(GFP), proteínas autofluorescentes, incluyendo la proteína azul
fluorescente (BFP),
glutatión-S-transferasa (GST),
luciferasa, peroxidasa de rábano rusticano (HRP), y cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT). Además, se usan marcas de epítopes en las
construcciones de proteínas de fusión, incluyendo marcas de
histidina (His), marcas FLAG, marcas de hemaglutinina de influenza
(HA), marcas Myc, marcas VSV-G, y marcas de
tiorredoxina (Trx). Otras construcciones de fusión pueden incluir
proteína de unión a maltosa (MBP), marca S, fusiones del dominio de
unión a ADN (DBD) de Lex, fusiones del dominio de unión a ADN de
GAL4, y fusiones de la proteína BP16 del virus del herpes simple
(HSV). También puede diseñarse una proteína de fusión para que
contenga un sitio de escisión localizado entre la secuencia
codificante del polipéptido tipo proteína quinasa y la secuencia
proteica heteróloga, de modo que pueda escindirse el polipéptido
tipo proteína quinasa y se pueda purificar del resto heterólogo.
Una proteína de fusión puede sintetizarse
químicamente, como se sabe en la técnica. Preferiblemente, se
produce una proteína de fusión por unión covalente de dos segmentos
polipeptídicos o por procedimientos convenciones en la técnica de
biología molecular. Pueden usarse procedimientos de ADN recombinante
para preparar proteínas de fusión, por ejemplo, preparando una
construcción de ADN que comprenda secuencias codificantes
seleccionadas entre las SEC ID Nº 1, 8 y 10 en fase de lectura
apropiada con los nucleótidos que codifican el segundo segmento
polipeptídico y expresando la construcción de ADN en una célula
huésped, como se sabe en la técnica. Están disponibles muchos kits
para la construcción de proteínas de fusión de compañías tales como
Promega Corporation (Madison, Wl), Stratagene (La Jolla, CA),
CLONTECH (Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,
CA), MBL International Corporation (MIC; Watertown, MA), y Quantum
Biotechnologies (Montreal, Canadá;
1-888-DNA-KITS).
Pueden obtenerse homólogos de especie del
polipéptido tipo proteína quinasa humana usando polinucleótidos del
polipéptido tipo proteína quinasa (descritos a continuación) para
preparar sondas adecuadas o cebadores para explorar bibliotecas de
expresión de ADNc de otras especies, tales como ratones, monos, o
levaduras, identificar ADNc que codifiquen homólogos del
polipéptido tipo proteína quinasa, y expresando los ADNc como se
sabe en la técnica.
Un polinucleótido tipo proteína quinasa puede
ser mono o bicatenario y comprende una secuencia codificante o el
complemento de una secuencia codificante para un polipéptido tipo
proteína quinasa. Se muestra una secuencia codificante para una
proteína tipo proteína quinasa humana en las SEC ID Nº 1, 8 y
10.
Secuencias de nucleótidos degeneradas que
codifican polipéptidos tipo proteína quinasa humana, así como
secuencias de nucleótidos homólogas que son al menos
aproximadamente un 50, 55, 60, 65, 70, preferiblemente
aproximadamente un 75, 90, 96, 98, o 99% idénticas a la secuencia
de nucleótidos mostrada en las SEC ID Nº 1, 8 y 10 o su complemento
también son polinucleótidos tipo proteína quinasa. El porcentaje de
identidad de secuencia entre las secuencias de dos polinucleótidos
se determina usando programas informáticos tales como ALIGN que
emplea el algoritmo FASTA, usando una búsqueda de huecos afinada
con una penalización por abertura de hueco de -12 y una
penalización por extensión de hueco de -2. Moléculas de ADN
complementarias (ADNc), homólogos de especie, y variantes de
polinucleótidos tipo proteína quinasa que codifican polipéptidos
tipo proteína quinasa biológicamente activos también son
polinucleótidos tipo proteína quinasa. Fragmentos polinucleotídicos
que comprenden al menos 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, ó 25 nucleótidos
contiguos de las SEC ID Nº 1, 8 y 10 o su complemento también son
polinucleótidos tipo proteína quinasa. Estos fragmentos pueden
usarse, por ejemplo, como sondas de hibridación o como
oligonucleótidos antisentido.
Las variantes y homólogos de los polinucleótidos
tipo proteína quinasa descritos anteriormente también son
polinucleótidos tipo proteína quinasa. Típicamente, pueden
identificarse secuencias del polinucleótido tipo proteína quinasa
por hibridación de polinucleótidos candidatos con polinucleótidos
tipo proteína quinasa conocidos en condiciones rigurosas, como se
sabe en la técnica. Por ejemplo, usando las siguientes condiciones
de lavado - 2X SSC (NaCl 0,3 M, citrato sódico 0,03 M, pH 7,0), SDS
al 0,1%, temperatura ambiente dos veces, 30 minutos cada una;
después 2X SSC, SDS al 0,1%, 50ºC una vez, 30 minutos; después 2X
SSC, temperatura ambiente dos veces, 10 minutos cada una - pueden
identificase secuencias homólogas que contienen como mucho
aproximadamente un 25-30% de desapareamiento de
pares de bases. Más preferiblemente, las cadenas de ácidos nucleicos
homólogos contienen un 15-25% de desapareamiento de
pares de bases, incluso más preferiblemente un 5-15%
de desapareamiento de pares de bases.
Los homólogos de especie de los polinucleótidos
tipo proteína quinasa descritos en este documento también pueden
identificarse preparando sondas o cebadores adecuados y explorando
bibliotecas de expresión de ADNc de otras especies, tales como
ratones, monos, o levaduras. Pueden identificarse variantes humanas
de polinucleótidos tipo proteína quinasa, por ejemplo, explorando
bibliotecas de expresión de ADNc humanas. Es bien sabido que la
T_{m} de un ADN bicatenario disminuye en 1-1,5ºC
con cada disminución del 1% en la homología (Bonner y col., J.
Mol. Biol. 81, 123 (1973)). Por lo tanto, pueden identificarse
variantes de polinucleótidos tipo proteína quinasa humana o
polinucleótidos tipo proteína quinasa de otras especias hibridando
una polinucleótido tipo proteína quinasa homólogo putativo con un
polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de las SEC ID
Nº 1, 8 y 10 o el complemento de las mismas para formar un híbrido
de ensayo. La temperatura de fusión del híbrido de ensayo se
compara con la temperatura de fusión de un híbrido que comprende
polinucleótidos que tienen secuencias de nucleótidos perfectamente
complementarias, y se calcula la cantidad o porcentaje de
desapareamiento de pares de bases en el híbrido de ensayo.
Secuencias de nucleótidos que hibridan con
polinucleótidos tipo proteína quinasa o sus complementos después de
condiciones de hibridación y/o lavado rigurosas también son
polinucleótidos tipo proteína quinasa. Las condiciones de lavado
rigurosas son bien conocidas y entendidas en la técnica y se
describen, por ejemplo, en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A
LABORATORY MANUAL, 2ª ed., 1989, en las páginas
9.50-9.51.
Típicamente, para condiciones de hibridación
rigurosas debe elegirse una combinación de temperatura y
concentración salina que sea aproximadamente
12-20ºC por debajo de la T_{m} calculada del
híbrido en estudio. Puede calcularse la T_{m} de un híbrido entre
un polinucleótido tipo proteína quinasa que tiene una secuencia de
nucleótidos mostrada en las SEC ID Nº 1, 8 y 10 o el complemento de
las mismas y una secuencia polinucleotídica que es al menos
aproximadamente un 50, preferiblemente aproximadamente un 75, 90,
96, o 98% idéntica a una de esas secuencias de nucleótidos, por
ejemplo, usando la ecuación de Bolton y McCarthy, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 48, 1390 (1962):
T_{m} =
81,5^{o}C - 16,6(log_{10}[Na^{+}]) + 0,41(%G + C) - 0,63(% \
formamida) -
600/l),
en la que l = la longitud del
híbrido en pares de
bases.
Las condiciones de lavado rigurosas incluyen,
por ejemplo, 4X SSC a 65ºC, o formamida al 50%, 4X SSC a 42ºC, o
0,5X SSC, 0,1% SDS a 65ºC. Las condiciones de lavado altamente
rigurosas incluyen, por ejemplo, 0,2X SSC a 65ºC.
Puede aislarse un polinucleótido tipo proteína
quinasa libre de otros componentes celulares tales como componentes
de membrana, proteínas, y lípidos. Los polinucleótidos pueden
fabricarse por un célula o aislarse usando técnicas de purificación
de ácido nucleico convencionales, o sintetizarse usando una técnica
de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), o usando un sintetizador automático. Los procedimientos para
aislar polinucleótidos son rutinarios y conocidos en la técnica.
Puede usarse cualquiera de dichas técnicas para obtener un
polinucleótido para obtener polinucleótidos tipo proteína quinasa
aislados. Por ejemplo, pueden usarse enzimas de restricción y
sondas para aislar fragmentos polinucleotídicos, que comprenden las
secuencias de nucleótidos de la proteína tipo proteína quinasa. Los
polinucleótidos aislados están en preparaciones que están libres o
al menos un 70, 80, ó 90% libres de otras moléculas.
Las moléculas de ADNc tipo proteína quinasa
humana pueden prepararse con técnicas de biología molecular
convencionales, usando ARNm tipo proteína quinasa como molde. Las
moléculas de ADNc tipo proteína quinasa humana después pueden
replicarse usando técnicas de biología molecular conocidas en la
técnica y descritas en manuales tales como Sambrook y col. (1989).
Puede usarse una técnica de amplificación, tal como PCR, para
obtener copias adicionales de polinucleótidos de la invención,
usando ADN genómico humano o ADNc como molde.
Como alternativa, pueden usarse técnicas de
química sintética para sintetizar polinucleótidos tipo proteína
quinasa. La degeneración del código genético permite alternar
secuencias de nucleótidos a sintetizar que codificarán un
polipéptido tipo proteína quinasa que tiene, por ejemplo, una
secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID Nº 2 y 9 o una
variante biológicamente activa de las mismas.
La secuencia parcial descrita en este documento
puede usarse para identificar el gen de longitud completa
correspondiente del que se obtiene. Puede trasladarse la mella o
marcarse en el extremo con ^{32}P la secuencia parcial usando
polinucleótido quinasa usando procedimientos de marcaje conocidos
para los especialistas en la técnica (BASIC
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis y col., eds., Elsevier Press, N.Y., 1986). Puede explorarse directamente una biblioteca lambda preparada a partir de tejido humano con las secuencias marcadas de interés o la biblioteca puede convertirse en masa a pBluescript (Stratagene Cloning Systems La Jolla, Calif. 92037) para facilitar la exploración de colonias bacterianas (véase Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989, pág. 1.20).
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis y col., eds., Elsevier Press, N.Y., 1986). Puede explorarse directamente una biblioteca lambda preparada a partir de tejido humano con las secuencias marcadas de interés o la biblioteca puede convertirse en masa a pBluescript (Stratagene Cloning Systems La Jolla, Calif. 92037) para facilitar la exploración de colonias bacterianas (véase Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989, pág. 1.20).
Ambos procedimientos son bien conocidos en la
técnica. En resumen, se desnaturalizan filtros con colonias
bacterianas que contienen la biblioteca en pBluescript o céspedes
bacterianos que contienen placas lambda, y se fija el ADN a los
filtros. Los filtros se hibridan con la sonda marcada usando
condiciones de hibridación descritas por Davis y col., 1986. Las
secuencias parciales, clonadas en lambda o pBluescript, pueden
usarse como controles positivos para evaluar la unión de fondo y
ajustar las rigurosidades de hibridación y lavado necesarias para
la identificación precisa de clones. Los autorradiogramas
resultantes se comparan con placas duplicadas de colonias o placas;
cada mancha expuesta corresponde a una colonia o placa positiva. Las
colonias o placas se seleccionan, se expanden y se aísla el ADN de
las colonias para análisis adicional y secuenciación.
Se analizan los clones de ADNc positivos para
determinar la cantidad de secuencia adicional que contienen usando
PCR con un cebador de la secuencia parcial y el otro cebador del
vector. Se analizan los clones con un producto de PCR insertado en
el vector más grande que la secuencia parcial original por digestión
con enzimas de restricción y secuenciación de ADN para determinar
si contienen un inserto del mismo tamaño o similar que el tamaño
del ARNm determinado a partir del Análisis de Transferencia de
Northern.
Una vez se ha identificado uno o más clones de
ADNc solapantes, puede determinarse la secuencia completa de los
clones, por ejemplo después de digestión con exonucleasa III
(McCombie y col., Methods 3, 33-40, 1991).
Se genera una serie de clones de deleción, cada uno de los cuales se
secuencia. Las secuencias solapantes resultantes se ensamblan en
una única secuencia contigua de elevada redundancia (habitualmente
tres a cinco secuencias solapantes en cada posición de nucleótido),
produciendo una secuencia final elevadamente precisa.
Pueden usarse diversos procedimientos basados en
PCR para prolongar las secuencias de ácido nucleico descritas en
este documento para detectar secuencias cadena arriba tales como
promotores y elementos reguladores. Por ejemplo, la PCR de sitios
de restricción usa cebadores universales para recuperar la secuencia
desconocida adyacente a un locus conocido (Sarkar, PCR Methods
Applic. 2, 318-322, 1993). Primero se
amplifica el ADN genómico en presencia de un cebador para una
secuencia de engarce y un cebador específico para la región
conocida. Las secuencias amplificadas después se someten a una
segunda ronda de PCR con el mismo cebador de engarce y otro cebador
específico interno al primero. Los productos de cada ronda de PCR se
transcriben con una ARN polimerasa adecuada y se secuencian usando
transcriptasa inversa.
También puede usarse PCR inversa para amplificar
o prolongar secuencias usando cebadores divergentes basados en un
región conocida (Triglia y col., Nucleic Acids Res. 16, 8186,
1988). Pueden diseñarse cebadores usando un software disponible en
el mercado, tal como el software OLIGO 4.06 Primer Analysis
(National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), para que sea de
22-30 nucleótidos de longitud, para que tenga un
contenido en GC del 50% o más, y para que hibride con la secuencia
diana a temperaturas de aproximadamente 68-72ºC. El
procedimiento usa varias enzimas de restricción para generar un
fragmento adecuado en la región conocida de un gen. El fragmento
después se circulariza por ligamiento intramolecular y se usa como
molde de PCR.
Otro procedimiento que puede usarse es PCR de
captura, que implica la amplificación por PCR de fragmentos de ADN
adyacentes a una secuencia conocida en ADN humano y de un cromosoma
artificial de levaduras (Lagerstrom y col., PCR Methods Applic.
1, 111-119, 1991). En este procedimiento,
también pueden usarse múltiples digestiones con enzimas de
restricción y ligamientos para colocar una secuencia bicatenaria
modificada genéticamente en un fragmento desconocido de la molécula
de ADN antes de realizar la PCR.
Otro procedimiento que puede usarse para
recuperar secuencias desconocidas es el de Parker y col., Nucleic
Acids Res. 19, 3055-3060, 1991). Además, puede
usarse PCR, cebadores anidados, y bibliotecas PROMOTERFINDER
(CLONTECH, Palo Alto, Calif.) para recorrer el ADN genómico
(CLONTECH, Palo Alto, Calif.). Este procedimiento evita la
necesidad de explorar bibliotecas y es útil para encontrar uniones
intrón/exón.
Cuando se exploran ADNc de longitud completa, es
preferible usar bibliotecas que se han seleccionado por tamaño para
que incluyan ADNc más grandes. Se prefieren bibliotecas cebadas
aleatoriamente, porque contendrán más secuencias que contienen las
regiones 5' de los genes. El uso de una biblioteca cebada
aleatoriamente puede ser especialmente preferible para situaciones
en las que una biblioteca oligo d(T) no produce ADNc de
longitud completa. Las bibliotecas genómicas pueden ser útiles para
la prolongación de una secuencia en regiones reguladoras no
transcritas 5'.
Pueden usarse sistemas de electroforesis capilar
disponibles en el mercado para analizar el tamaño o confirmar la
secuencia de nucleótidos de los productos de PCR o secuenciación.
Por ejemplo, la secuenciación capilar puede emplear polímeros
fluidos para la separación electroforética, cuatro colorantes
fluorescentes diferentes (uno para cada nucleótido) que se activan
por láser, y detección de las longitudes de onda emitidas por un
dispositivo de cámara acoplada a la carga. La salida/intensidad de
luz puede convertirse en una señal eléctrica usando un software
apropiado (por ejemplo, GENOTYPER y Sequence NAVIGATOR, Perkin
Elmer), y el procedimiento completo desde la carga de las muestras
hasta el análisis informático y la presentación de los datos
electrónicos puede controlarse por ordenador. La electroforesis
capilar es especialmente preferible para la secuenciación de
pequeños trozos de ADN que pueden estar presentes en cantidades
limitadas en una muestra particular.
Pueden obtenerse polipéptidos tipo proteína
quinasa humana, por ejemplo, por purificación a partir de células
humanas u otras células, por expresión de polinucleótidos tipo
proteína quinasa, o por síntesis química directa.
Los polipéptidos tipo proteína quinasa humana
pueden purificarse a partir de cualquier célula que exprese el
polipéptido, incluyendo células huésped que se han transfectado con
construcciones de expresión de proteína tipo proteína quinasa. Se
separa un polipéptido tipo proteína quinasa purificado de otros
compuestos que normalmente están asociados con el polipéptido tipo
proteína quinasa en la célula, tales como ciertas proteínas,
carbohidratos, o lípidos, usando procedimientos bien conocidos en
la técnica. Dichos procedimientos incluyen, aunque sin limitación,
cromatografía por exclusión de tamaño, fraccionamiento en sulfato
amónico, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de
afinidad, y electroforesis en gel preparativa. Una preparación de
polipéptidos tipo proteína quinasa purificados es al menos un 80%
pura; preferiblemente, las preparaciones son un 90%, 95%, ó 99%
puras. La pureza de las preparaciones puede evaluarse por cualquier
medio conocido en la técnica, tal como electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida.
Para expresar una polinucleótido tipo proteína
quinasa, puede insertarse el polinucleótido en un vector de
expresión que contiene los elementos necesarios para la
transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada.
Pueden usarse procedimientos que son bien conocidos para los
especialistas en la técnica para construir vectores de expresión
que contienen secuencias que codifican polipéptidos tipo proteína
quinasa y elementos de control de la transcripción y la traducción
apropiados. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN
recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación
genética in vivo. Dichas técnicas se describen, por ejemplo,
en Sambrook y col. (1989) y en Ausubel y col., CURRENT PROTOCOLS IN
MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y.,
1989.
Puede utilizarse una diversidad de sistemas de
vector de expresión/huésped para que contengan y expresen secuencias
que codifican un polipéptido tipo proteína quinasa. Estos incluyen,
aunque sin limitación, microorganismos, tales como bacterias
transformadas con vectores de expresión de ADN bacteriófagos
recombinantes, plasmídicos, o cósmidos; levaduras transformadas con
vectores de expresión de levaduras, sistemas de células de insecto
infectados con vectores de expresión virales (por ejemplo,
baculovirus), sistemas de células vegetales transformados con
vectores de expresión virales (por ejemplo, virus del mosaico de la
coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores
de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322), o
sistemas de células animales.
Los elementos de control o secuencias
reguladoras son aquellas regiones no traducidas del vector -
potenciadores, promotores, regiones no traducidas 5' y 3' - que
interaccionan con proteínas celulares del huésped para realizar la
transcripción y traducción. Dichos elementos pueden variar en su
fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y huésped
utilizados, puede usarse cualquiera de varios elementos de
transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores
constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas
bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como el
promotor lacZ híbrido del fagómido BLUESCRIPT (Stratagene LaJolla,
Calif.) o el plásmido pSPORT1 (Life Technologies) y similares. Puede
usarse el promotor de la polihedrina de baculovirus en células de
insecto. Pueden clonarse promotores o potenciadores derivados de los
genomas de células vegetales (por ejemplo, genes de choque térmico,
RUBISCO, y de almacenamiento) o de virus de plantas (por ejemplo,
promotores o secuencias líder virales) en el vector. En sistemas de
células de mamífero, se prefieren promotores de genes de mamífero o
de virus de mamíferos. Si es necesario generar una línea celular
que contenga múltiples copias de una secuencia de nucleótidos que
codifique un polipéptido tipo proteína quinasa, pueden usarse
vectores basados en SV40 o EBV con un marcador de selección
apropiado.
En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse
varios vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para el
polipéptido tipo proteína quinasa. Por ejemplo, cuando se necesita
una gran cantidad de un polipéptido tipo proteína quinasa para la
inducción de anticuerpos, pueden usarse vectores que dirigen la
expresión de elevado nivel de proteínas de fusión que se purifican
fácilmente. Dichos vectores incluyen, aunque sin limitación,
vectores de clonación y expresión de E. coli multifuncionales
tales como BLUESCRIPT (Stratagene). En un vector BLUESCRIPT, puede
ligarse una secuencia que codifica el polipéptido tipo proteína
quinasa en el vector en fase con secuencias para el resto Met
amino-terminal y los posteriores 7 retos de la
\beta-galactosidasa de modo que se produzca una
proteína híbrida. También pueden usarse vectores pIN (Van Heeke
& Schuster, J. Biol. Chem. 264,
5503-5509, 1989) o vectores pGEX (Promega, Madison,
Wis.) para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión
con glutatión S-transferasa (GST). En general,
dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse
fácilmente de células lisadas por adsorción a perlas de
glutatión-agarosa seguido de elución en presencia
de glutatión libre. Pueden diseñarse proteínas preparadas en dichos
sistemas para que incluyan sitios de escisión con heparina,
trombina, o proteasa de factor Xa de modo que pueda liberarse el
polipéptido de interés clonado del resto GST en un futuro.
En la levadura Saccharomyces cerevisiae,
pueden usarse varios vectores que contienen promotores constitutivos
o inducibles tales como el factor alfa, alcohol oxidasa, y PGH.
Para revisiones, véase Ausubel y col. (1989) y Grant y col.,
Methods Enzymol. 153, 516-544, 1987.
Si se usan vectores de expresión en plantas, la
expresión de secuencias que codifican polipéptidos tipo proteína
quinasa puede dirigirse por cualquiera de varios promotores. Por
ejemplo, pueden usarse promotores virales tales como los promotores
35S y 19S de CaMV solos o en combinación con la secuencia líder
omega de TMV (Takamatsu, EMBOJ. 6,307-311,
1987). Como alternativa, pueden usarse promotores de plantas tales
como los promotores de la subunidad pequeña de la RUBISCO o de
choque térmico (Coruzzi y col., EMBOJ. 3,
1671-1680, 1984; Broglie y col., Science
224, 838-843, 1984; Winter y col., Results
Probl. Cell Differ. 17, 85-105, 1991). Estas
construcciones pueden introducirse en células vegetales por
transformación directa de ADN o por transfección mediada por
patógenos. Dichas técnicas se describen en varias revisiones
generalmente disponibles (por ejemplo, Hobbs o Murray, en MCGRAW
HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, Nueva York,
N.Y., pág. 191-196, 1992).
También puede usarse un sistema de insectos para
expresar un polipéptido tipo proteína quinasa. Por ejemplo, en uno
de dichos sistemas se usa el virus de la polihedrosis nuclear de
Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar
genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en
larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican
polipéptidos tipo proteína quinasa pueden clonarse en una región no
esencial del virus, tal como el gen de la polihedrina, y colocarse
bajo el control del promotor de la polihedrina. La inserción
satisfactoria de polipéptidos tipo proteína quinasa volverá al gen
de la polihedrina inactivo y producirá virus recombinante que
carece de la proteína de envuelta. Los virus recombinantes después
pueden usarse para infectar células de S. frugiperda o
larvas de Trichoplusia en las que pueden expresarse
polipéptidos tipo proteína quinasa (Engelhard y col., Proc. Nat.
Acad. Sci. 91, 3224-3227, 1994).
Pueden usarse varios sistemas de expresión
basados en virus para expresar polipéptidos tipo proteína quinasa
en células de mamífero. Por ejemplo, si se usa un adenovirus como
vector de expresión, pueden ligarse secuencias que codifican
polipéptidos tipo proteína quinasa en un complejo de
transcripción/traducción de adenovirus que comprende el promotor
tardío y la secuencia líder tripartita. Puede usarse la inserción en
una región E1 o E3 no esencial en el genoma viral para obtener un
virus viable que sea capaz de expresar un polipéptido tipo proteína
quinasa en células huésped infectadas (Logan & Shenk, Proc.
Natl. Acad. Sci. 81, 3655-3659, 1984). Si se
desea, pueden usarse potenciadores de la transcripción, tales como
el potenciador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para aumentar
la expresión en células huésped de mamífero.
También pueden usarse cromosomas artificiales
humanos (HAC) para suministrar fragmentos más grandes de ADN que
puedan contenerse y expresarse en un plásmido. Los HAC de 6M a 10M
se construyen y suministran a las células por procedimientos de
suministro convencionales (por ejemplo, liposomas, polímeros amino
policatiónicos, o vesículas).
También pueden usarse señales de inicio
específicas para conseguir una traducción más eficaz de las
secuencias que codifican polipéptidos tipo proteína quinasa. Dichas
señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. En
casos en los que se insertan secuencias que codifican un polipéptido
tipo proteína quinasa, su codón de inicio, y secuencias cadena
arriba en el vector de expresión apropiado, pueden no necesitarse
señales de control de la transcripción o traducción adicionales. Sin
embargo, en casos en los que se inserta solamente la secuencia
codificante, o un fragmento de la misma, deben proporcionarse
señales de control de la traducción exógenas (incluyendo el codón
de inicio ATG). El codón de inicio debe estar en la fase de lectura
correcta para asegurar la traducción del inserto completo. Los
elementos de traducción y codones de inicio exógenos pueden ser de
diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de
la expresión puede potenciarse por la inclusión de potenciadores
que son apropiados para el sistema celular particular que se usa
(véase Scharf y col., Results Probl. Cell Differ. 20,
125-162, 1994).
Una célula huésped puede elegirse por su
capacidad de modular la expresión de las secuencias insertadas o de
procesar el polipéptido tipo proteína quinasa expresado del modo
deseado. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, aunque sin
limitación, acetilación, carboxilación, glicosilación,
fosforilación, lipidación, y acilación. Puede usarse también el
procesamiento post-traduccional que escinde una
forma "prepro" del polipéptido para facilitar la inserción,
plegamiento y/o función correctos. Están disponibles diferentes
células huésped que tienen la maquinaria celular específica y los
mecanismos característicos para las actividades
post-traduccionales (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK,
HEK293, y WI38), en la American Type Culture Collection (ATCC; 10801
University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) y
pueden elegirse para asegurar la correcta modificación y
procesamiento de la proteína
extraña.
extraña.
Se prefiere la expresión estable para la
producción a largo plazo, de elevado rendimiento de proteínas
recombinantes. Por ejemplo, pueden transformarse líneas celulares
que expresen de forma estable polipéptidos tipo proteína quinasa
usando vectores de expresión que puedan contener orígenes de
replicación virales y/o elementos de expresión endógenos y un gen
marcador de selección en el mismo vector o en uno diferente. Después
de la introducción del vector, puede permitirse que las células
crezcan durante 1 - 2 días en un medio enriquecido antes de que se
cambien a un medio selectivo. El propósito del marcador de selección
es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el
crecimiento y recuperación de las células que expresan de forma
satisfactoria las secuencias de la proteína tipo proteína quinasa
introducidas. Pueden proliferarse los clones resistentes de células
transformadas de forma estable usando técnicas de cultivo tisular
apropiadas para el tipo celular. Véase, por ejemplo, ANIMAL CELL
CULTURE, R.I. Freshney, ed., 1986.
Puede usarse cualquiera de varios sistemas de
selección para recuperar líneas celulares transformadas.
Estos incluyen, aunque sin limitación, los genes
de la timidina quinasa (Wigler y col., Cell 11,
223-32, 1977) y de la adenina
fosforribosiltransferasa (Lowy y col., Cell 22,
817-23, 1980) del virus del herpes simple que
pueden emplearse en células tk^{-} o aprt^{-},
respectivamente. Además, puede usarse resistencia a
antimetabolitos, antibióticos, o herbicidas como base para la
selección. Por ejemplo, dhfr confiere resistencia a
metotrexato (Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 77,
3567-70, 1980), npt confiere resistencia a
los aminoglicósidos, neomicina y G-418
(Colbere-Garapin y col., J. Mol. Biol. 150,
1-14,1981), y als y pat confieren
resistencia a clorsulfurona y fosfinotricina acetiltransferasa,
respectivamente (Murray, 1992, supra). Se han descrito genes
de selección adicionales. Por ejemplo, trpB permite que las
células utilicen indol en lugar de triptófano, o hisD, que
permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina
(Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85,
8047-51, 1988). Pueden usarse marcadores visibles
tales como antocianinas, \beta-glucuronidasa y su
sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, para
identificar transformantes y para cuantificar la cantidad de
expresión transitoria o estable de proteína que se puede atribuir a
un sistema de vector específico (Rhodes y col., Methods Mol.
Biol. 55, 121-131, 1995).
Aunque la presencia de la expresión del gen
marcador sugiere que el polinucleótido tipo proteína quinasa también
está presente, puede necesitar confirmarse su presencia y
expresión. Por ejemplo, si se inserta una secuencia que codifica un
polipéptido tipo proteína quinasa en una secuencia del gen marcador,
las células transformadas que contienen secuencias que codifican un
polipéptido tipo proteína quinasa pueden identificarse por la
ausencia de la función del gen marcador. Como alternativa, puede
colocarse un gen marcador en tándem con una secuencia que codifica
un polipéptido tipo proteína quinasa bajo el control de un único
promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción
o selección habitualmente indica la expresión del polinucleótido
tipo proteína quinasa.
Como alternativa, las células huésped que
contienen un polinucleótido tipo proteína quinasa y que expresan un
polipéptido tipo proteína quinasa pueden identificarse por una
diversidad de procedimientos conocidos para los especialistas en la
técnica. Estos procedimientos incluyen, aunque sin limitación,
hibridaciones ADN-ADN o ADN-ARN y
técnicas de bioensayo de proteínas o inmunoensayo que incluyen
tecnologías basadas en membrana, solución, o chip para la detección
y/o cuantificación de ácido nucleico o proteína. Por ejemplo, la
presencia de una secuencia polinucleotídica que codifica un
polipéptido tipo proteína quinasa puede detectarse por hibridación
ADN-ADN o ADN-ARN o amplificación
usando sondas o fragmentos o fragmentos de polinucleótidos que
codifican un polipéptido tipo proteína quinasa. Los ensayos basados
en la amplificación de ácido nucleico implican el uso de
oligonucleótidos seleccionados entre secuencias que codifican un
polipéptido tipo proteína quinasa para detectar transformantes que
contienen un polinucleótido tipo proteína quinasa.
Se conoce en la técnica una diversidad de
protocolos para detectar y medir la expresión de un polipéptido
tipo proteína quinasa, usando anticuerpos policlonales o
monoclonales específicos para el polipéptido. Los ejemplos incluyen
ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo
(RIA), y clasificación de células activadas por fluorescencia
(FACS). Puede usarse un inmunoensayo de dos sitios, basado en
anticuerpos monoclonales usando anticuerpos monoclonales reactivos
para dos epítopes no interferentes en un polipéptido tipo proteína
quinasa, o puede emplearse un ensayo de unión competitivo. Estos y
otros ensayos se describen en Hampton y col., SEROLOGICAL METHODS:
A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, Minn., 1990) y Maddox y
col., J. Exp. Med. 158, 1211-1216, 1983).
Los especialistas en la técnica conocen una
amplia diversidad de marcadores y técnicas de conjugación y pueden
usarse en diversos ensayos de ácido nucleico y aminoácidos. Los
medios para producir sondas de hibridación marcadas o de PCR para
detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos que codifican
polipéptidos tipo proteína quinasa incluyen oligomarcaje, traslado
de mella, marcaje en el extremo, o amplificación por PCR usando un
nucleótido marcado. Como alternativa, pueden clonarse secuencias que
codifican un polipéptido tipo proteína quinasa en un vector para la
producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores son conocidos en la
técnica, están disponibles en el mercado, y pueden usarse para
sintetizar sondas de ARN in vitro por la adición de
nucleótidos marcados y una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3,
o SP6. Estos procedimientos pueden realizarse usando una diversidad
de kits disponibles en el mercado (Amersham Pharmacia Biotech,
Promega, y US Biochemical). Las moléculas informadoras o marcadores
adecuados que pueden usarse para facilitar la detección incluyen
radionúclidos, enzimas, y agentes fluorescentes,
quimioluminescentes, o cromogénicos, así como sustratos,
cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares.
Las células huésped transformadas con secuencias
de nucleótidos que codifican un polipéptido tipo proteína quinasa
pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión y
recuperación de la proteína de cultivo celular. El polipéptido
producido por una célula transformada puede secretarse o estar
contenida de forma intracelular dependiendo de la secuencia y/o el
vector usado. Como entenderán los especialistas en la técnica,
pueden diseñarse vectores de expresión que contienen polinucleótidos
que codifican polipéptidos tipo proteína quinasa para que contengan
secuencias señal que dirigen la secreción de polipéptidos tipo
proteína quinasa solubles a través de una membrana celular
procariota o eucariota o que dirige la inserción en la membrana de
un polipéptido tipo proteína quinasa unido a membrana.
Como se ha analizado anteriormente, pueden
usarse otras construcciones para unir una secuencia que codifica un
polipéptido tipo proteína quinasa a una secuencia de nucleótidos que
codifica un dominio polipeptídico que facilitará la purificación de
proteínas solubles. Dichos dominios que facilitan la purificación
incluyen, aunque sin limitación, péptidos quelantes de metales
tales como módulos de histidina-triptófano que
permiten la purificación en metales inmovilizados, dominios de
proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina
inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación
por extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). La
inclusión de secuencias engarce escindibles tales como las
específicas para Factor Xa o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego,
CA) entre el dominio de purificación y el polipéptido tipo proteína
quinasa también pueden usarse para facilitar la purificación. Uno de
dichos vectores de expresión proporciona la expresión de una
proteína de fusión que contiene un polipéptido tipo proteína quinasa
y 6 restos de histidina que predice un sitio de escisión de
tiorredoxina o uno de enteroquinasa. Los restos de histidina
facilitan la purificación por IMAC (cromatografía de afinidad por
iones metálicos inmovilizados, como se describe en Porath y col.,
Prot. Exp. Purif. 3, 263-281, 1992), mientras
que el sitio de escisión de enteroquinasa proporciona un medio para
purificar el polipéptido tipo proteína quinasa de la proteína de
fusión. Los vectores que contienen proteínas de fusión se describen
en Kroll y col., DNA Cell Biol. 12, 441-453,
1993.
Pueden sintetizarse secuencias que codifican un
polipéptido tipo proteína quinasa, por completo o en parte, usando
procedimientos químicos bien conocidos en la técnica (véase
Caruthers y col., Nucl. Acids Res. Symp. Ser.
215-223,1980; Horn y col. Nucl. Acids Res. Symp.
Ser. 225-232, 1980). Como alternativa, puede
producirse un propio polipéptido tipo proteína quinasa usando
procedimientos químicos para sintetizar su secuencia de
aminoácidos, tal como por síntesis directa de péptidos usando
técnicas en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85,
2149-2154, 1963; Roberge y col., Science 269,
202-204, 1995). La síntesis de proteínas puede
realizarse usando técnicas manuales o por automatización. La
síntesis automática puede conseguirse, por ejemplo, usando el
Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer).
Opcionalmente, pueden sintetizarse por separado fragmentos de
polipéptidos tipo proteína quinasa y combinarse usando
procedimientos químicos para producir una molécula de longitud
completa.
El péptido recién sintetizado puede purificarse
sustancialmente por cromatografía líquida de alta resolución
preparativa (por ejemplo, Creighton, PROTEINS: STRUCTURES AND
MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co., Nueva York, N.Y., 1983).
La composición de un polipéptido tipo proteína quinasa sintético
puede confirmarse por análisis de aminoácidos o secuenciación (por
ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman; véase Creighton,
supra). Además, puede alterarse cualquier parte de la
secuencia de aminoácidos del polipéptido tipo proteína quinasa
durante la síntesis directa y/o combinarse usando procedimientos
químicos con secuencias de otras proteínas para producir produce un
polipéptido variante o una proteína de fusión.
Como entenderán los especialistas en la técnica,
puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que
codifican el polipéptido tipo proteína quinasa que tiene codones de
origen no natural. Por ejemplo, pueden seleccionarse codones
preferidos por un huésped procariota o eucariota particular para
aumentar el índice de expresión de proteínas o para producir un
transcrito de ARN que tenga propiedades deseables, tales como
semi-vida que sea más larga que la del transcrito
generado a partir de la secuencia de origen natural.
Las secuencias de nucleótidos descritas en este
documento pueden modificarse genéticamente usando procedimientos
generalmente conocidos en la técnica para alterar las secuencias
codificantes del polipéptido tipo proteína quinasa por una
diversidad de razones, incluyendo aunque sin limitación,
alteraciones que modifican la clonación, procesamiento, y/o
expresión del polipéptido o producto de ARNm. Puede usarse arrastre
de ADN por fragmentación aleatoria y reensamblaje por PCR de los
fragmentos génicos y pueden usarse oligonucleótidos sintéticos para
modificar genéticamente las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo,
puede usarse mutagénesis dirigida al sitio para insertar nuevos
sitios de restricción, alterar los patrones de glicosilación,
cambiar la preferencia de codones, producir variantes de corte y
empalme, introducir mutaciones, etc.
Puede generarse cualquier tipo de anticuerpo
conocido en la técnica para que se una específicamente a un epítope
de un polipéptido tipo proteína quinasa. "Anticuerpo" como se
usa en este documento incluye moléculas de inmunoglobulina
intactas, así como fragmentos de las mismas, tales como Fab,
F(ab')_{2}, y Fv, que son capaces de unirse a un epítope
de un polipéptido tipo proteína quinasa. Típicamente, se necesitan
al menos 6, 8, 10, ó 12 aminoácidos contiguos para formar un
epítope. Sin embargo, epítopes que implican aminoácidos no contiguos
pueden requerir más, por ejemplo, al menos 15, 25, ó 50
aminoácidos.
Un anticuerpo que se une específicamente a un
epítope de un polipéptido tipo proteína quinasa puede usarse
terapéuticamente, así como en ensayos inmunoquímicos, tales como
transferencia de Western, ELISA, radioinmunoensayos, ensayos
inmunohistoquímicos, inmunoprecipitaciones, u otros ensayos
inmunoquímicos conocidos en la técnica. Pueden usarse diversos
inmunoensayos para identificar anticuerpos que tienen la
especificidad deseada. Se conocen bien en la técnica numerosos
protocolos para ensayos de unión competitivos o
inmunorradiométricos. Dichos inmunoensayos típicamente implican la
medición de una formación de complejo entre un inmunógeno y un
anticuerpo que se une específicamente al inmunógeno.
Típicamente, un anticuerpo que se une
específicamente a un polipéptido tipo proteína quinasa proporciona
una señal de detección al menos 5, 10, ó 20 veces mayor que una
señal de detección proporcionada con otras proteínas cuando se usan
en un ensayo inmunohistoquímico. Preferiblemente, anticuerpos que se
unen específicamente a polipéptidos tipo proteína quinasa no
detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y pueden
inmunoprecipitar un polipéptido tipo proteína quinasa de la
solución.
Pueden usarse polipéptidos tipo proteína quinasa
humana para inmunizar a un mamífero, tal como un ratón, rata,
conejo, cobaya, mono, o ser humano, para producir anticuerpos
policlonales. Si se desea, puede conjugarse un polipéptido tipo
proteína quinasa a una proteína vehículo, tal como albúmina sérica
bovina, tiroglobulina, y hemocianina de lapa californiana.
Dependiendo de la especie del huésped, pueden usarse diversos
adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Dichos
adyuvantes incluyen, aunque sin limitación, adyuvante de Freund,
geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio), y sustancias
tensioactivas (por ejemplo, lisolecitina, polioles pluronic,
polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa
californiana, y dinitrofenol). Entre los adyuvantes usados en seres
humanos, son especialmente útiles BCG (bacilos de
Calmette-Guerin) y Corynebacterium
parvum.
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales que
se unen específicamente a un polipéptido tipo proteína quinasa
usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas
de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Estas
técnicas incluyen, aunque sin limitación, la técnica de hibridoma,
la técnica de hibridoma de células B humanas, y la técnica de
hibridoma de EBV (Kohler y col., Nature 256,
495-497, 1985; Kozbor y col., J. Immunol.
Methods 81, 31-42, 1985; Cote y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. 80, 2026-2030, 1983; Cole y
col., Mol. Cell Biol. 62, 109-120, 1984).
Además, pueden usarse técnicas desarrolladas
para la producción de "anticuerpos quiméricos", el corte y
empalme de genes de anticuerpo de ratón con genes de anticuerpo
humano para obtener una molécula con especificidad de antígeno y
actividad biológica apropiadas (Morrison y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. 81, 6851 -6855,1984; Neuberger y col., Nature
312, 604-608,1984; Takeda y col., Nature
314, 452-454, 1985). Los anticuerpos
monoclonales y otros anticuerpos también pueden "humanizarse"
para evitar que un paciente monte una respuesta inmune contra el
anticuerpo cuando se usa terapéuticamente. Dichos anticuerpos pueden
ser suficientemente similares en secuencia a anticuerpos humanos a
usar directamente en terapia o pueden requerir la alteración de
unos pocos restos clave. Las diferencias de secuencia entre
anticuerpos de roedores y secuencias humanas pueden minimizarse
reemplazando restos que difieren de los de las secuencias humanas
por mutagénesis dirigida al sitio de restos individuales o
injertando las regiones determinantes de complementariedad
completas. Como alternativa, pueden producirse anticuerpos
humanizados usando procedimientos recombinantes, como se describe
en el documento GB2188638B. Los anticuerpos que se unen
específicamente a un polipéptido tipo proteína quinasa pueden
contener sitios de unión a antígeno que están parcial o
completamente humanizados, como se describe en el documento U.S.
5.565.332.
Como alternativa, pueden adaptarse técnicas
descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla
usando procedimientos conocidos en la técnica para producir
anticuerpos de cadena sencilla que se unen específicamente a
polipéptidos tipo proteína quinasa. Pueden generarse anticuerpos con
especificidad relacionada, pero de distinta composición idiotípica,
por arrastre de cadena de bibliotecas de inmunoglobulina
combinatorias aleatorias (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88,
11120-23, 1991).
También pueden construirse anticuerpos de cadena
sencilla usando un procedimiento de amplificación de ADN, tal como
PCR, usando ADNc de hibridoma como molde (Thirion y col., 1996,
Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11). Los
anticuerpos de cadena sencilla pueden ser mono- o biespecíficos, y
pueden ser bivalentes o tetravalentes. Se muestra la construcción
de anticuerpos de cadena sencilla tetravalentes, biespecíficos, por
ejemplo, en Coloma & Morrison, 1997, Nat. Biotechnol.
15, 159-63. Se muestra la construcción de
anticuerpos de cadena sencilla bivalentes, biespecíficos en
Mallender & Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269,
199-206.
Puede construirse una secuencia de nucleótidos
que codifique un anticuerpo de cadena sencilla usando síntesis de
nucleótidos manual o automatizada, clonarse en una construcción de
expresión usando procedimientos de ADN recombinante convenciones, e
introducirse en una célula para expresar la secuencia codificante,
como se describe a continuación. Como alternativa, pueden
producirse anticuerpos de cadena sencilla directamente usando, por
ejemplo, tecnología de fagos filamentosos (Verhaar y col., 1995,
Int. J. Cancer 61, 497-501; Nicholls y col.,
1993, J. Immunol. Meth. 165, 81-91).
También pueden producirse anticuerpos que se
unen específicamente a polipéptidos tipo proteína quinasa induciendo
la producción in vivo en la población de linfocitos o
explorando bibliotecas de inmunoglobulina o paneles de reactivos de
unión elevadamente específica como se describe en la bibliografía
(Orlandi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 86,
3833-3837, 1989; Winter y col., Nature 349,
293-299, 1991).
Pueden construirse otros tipos de anticuerpos y
usarse terapéuticamente en procedimientos de la invención. Por
ejemplo, pueden construirse anticuerpos quiméricos como se describe
en el documento WO 93/03151. También pueden prepararse proteínas de
unión que se obtienen de inmunoglobulinas y que son multivalentes y
multiespecíficas, tales como los "diacuerpos" descritos en el
documento WO 94/13804.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención
pueden purificarse por procedimientos bien conocidos en la técnica.
Por ejemplo, los anticuerpos pueden purificarse por afinidad por
paso en una columna a la que se ha unido un polipéptido tipo
proteína quinasa. Los anticuerpos unidos después pueden eluirse de
la columna usando un tampón con una elevada concentración
salina.
Los oligonucleótidos antisentido son secuencias
de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de ADN o ARN
específica. Una vez introducidos en una célula, los nucleótidos
complementarios se combinan con secuencias naturales producidas por
la célula para formar complejos y bloquear la transcripción o
traducción. Preferiblemente, un oligonucleótido antisentido es de
al menos 11 nucleótidos de longitud, pero puede ser de al menos 12,
15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ó 50 o más nucleótidos de longitud.
También pueden usarse secuencias más largas. Las moléculas de
oligonucleótido antisentido pueden proporcionarse en una
construcción de ADN e introducirse en una célula como se ha
descrito anteriormente para disminuir el nivel de productos génicos
tipo proteína quinasa en la célula.
Los oligonucleótidos antisentido pueden ser
desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, o una combinación de
ambos. Los oligonucleótidos pueden sintetizarse de forma manual o
por un sintetizador automático, uniendo covalentemente el extremo
5' de un nucleótido con el extremo 3' del otro nucleótido con
enlaces entre los nucleótidos no fosfodiéster tales como
alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos,
alquilfosfonotioatos, alquilfosfonatos, fosforamidatos, ésteres de
fosfato, carbamatos, acetamidato, ésteres de carboximetilo,
carbonatos, y triésteres de fosfato. Véase Brown, Meth. Mol.
Biol. 20, 1-8, 1994; Sonveaux, Meth. Mol.
Biol. 26, 1-72, 1994; Uhlmann y col., Chem.
Rev. 90, 543-583, 1990.
Pueden obtenerse modificaciones de la expresión
del gen tipo proteína quinasa diseñando oligonucleótidos antisentido
que formarán dúplex con las regiones de control, 5', o reguladoras
del gen tipo proteína quinasa. Se prefieren oligonucleótidos
derivados del sitio de inicio de la transcripción, por ejemplo,
entre las posiciones -10 y +10 del sitio de inicio. De forma
similar, puede conseguirse la inhibición usando metodología de
apareamiento de bases de "triple hélice". El apareamiento de
triple hélice es útil porque causa la inhibición de la capacidad de
la doble hélice de abrirse suficientemente para la unión de las
polimerasas, factores de transcripción, o chaperonas. Se han
descrito en la bibliografía avances terapéuticos usando ADN triple
(por ejemplo, Gee y col., en Huber & Carr, MOLECULAR AND
IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.,
1994). También puede diseñarse un oligonucleótido antisentido
también para bloquear la traducción de ARNm evitando que el
transcrito se una a los ribosomas.
No se requiere la complementariedad precisa para
la formación satisfactoria de complejos entre un oligonucleótido
antisentido y la secuencia complementaria de un polinucleótido tipo
proteína quinasa. Los oligonucleótidos antisentido que comprenden,
por ejemplo, 2, 3, 4 ó 5 o más tramos de nucleótidos contiguos que
son complementarios de forma precisa a un polinucleótido tipo
proteína quinasa, cada uno separado por un tramo de nucleótidos
contiguos que no son complementarios a nucleótidos de proteína tipo
proteína quinasa adyacentes, pueden proporcionar suficiente
especificidad de diana para ARNm tipo proteína quinasa.
Preferiblemente, cada tramo de nucleótidos contiguos complementario
es al menos de 4, 5, 6, 7, u 8 o más nucleótidos de longitud. Las
secuencias intercaladas no complementarias son preferiblemente de
1, 2, 3 ó 4 nucleótidos de longitud. Los especialistas en la técnica
pueden usar fácilmente el punto de fusión calculado de un par
antisentido-con sentido para determinar el grado de
desapareamiento que se tolerará entre un oligonucleótido antisentido
particular y una secuencia de polinucleótido tipo proteína quinasa
particular.
Los oligonucleótidos antisentido pueden
modificarse sin afectar a su capacidad de hibridar con un
polinucleótido tipo proteína quinasa. Estas modificaciones pueden
ser internas o en uno o ambos extremos de la molécula antisentido.
Por ejemplo, los enlaces fosfato entre nucleósidos pueden
modificarse añadiendo restos de colesterilo o diamina con
cantidades variables de restos de carbono entre los grupos amino y
la ribosa terminal. Las bases y/o azúcares modificados, tales como
arabinosa en lugar de ribosa, o un oligonucleótido 3',
5'-sustituido en el que el grupo hidroxilo 3' o el
grupo fosfato 5' están sustituidos, también pueden emplearse en un
oligonucleótido antisentido modificado. Estos oligonucleótidos
modificados pueden prepararse por procedimientos bien conocidos en
la técnica. Véase, por ejemplo, Agrawal y col., Trends
Biotechnol. 10, 152-158, 1992; Uhlmann y col.,
Chem. Rev. 90, 543-584, 1990; Uhlmann y col.,
Tetrahedron. Lett. 215, 3539-3542, 1987.
Las ribozimas son moléculas ARN con actividad
catalítica. Véase, por ejemplo, Cech, Science 236,
1532-1539; 1987; Cech, Ann. Rev. Biochem.
59, 543-568; 1990, Cech, Curr. Opin. Struct.
Biol. 2, 605-609; 1992, Couture &
Stinchcomb, Trends Genet. 12, 510-515, 1996.
Pueden usarse ribozimas para inhibir la función génica escindiendo
una secuencia de ARN, como se sabe en la técnica (por ejemplo,
Haseloff y col., Patente de Estados Unidos 5.641.673). El mecanismo
de la acción de las ribozimas implica la hibridación específica de
secuencia de la molécula ribozima con un ARN diana complementario,
seguido de escisión endonucleolítica. Los ejemplos incluyen
moléculas de ribozima con un motivo de cabeza de martillo
modificadas genéticamente que pueden catalizar específica y
eficazmente la escisión endonucleolítica de secuencias de
nucleótidos específicas.
La secuencia codificante de un polinucleótido
tipo proteína quinasa puede usarse para generar ribozimas que se
unirán específicamente a ARNm transcrito a partir del polinucleótido
tipo proteína quinasa. Se han desarrollado y descrito en la técnica
procedimientos para diseñar y construir ribozimas que puedan
escindir otras moléculas de ARN en trans de un modo elevadamente
específico de secuencia (véase Haseloff y col. Nature 334,
585-591, 1988). Por ejemplo, la actividad de
escisión de las ribozimas puede dirigirse a ARN específicos
modificando genéticamente una región de "hibridación" concreta
en la ribozima. La región de hibridación contiene una secuencia
complementaria al ARN diana y por tanto hibrida específicamente con
la diana (véase, por ejemplo, Gerlach y col., documento EP
321.201).
Los sitios de escisión por ribozima específicos
en un ARN diana de proteína tipo proteína quinasa pueden
identificarse explorando la molécula diana para sitios de escisión
por ribozima que incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU, y
GUC. Una vez identificados, pueden evaluarse cortas secuencias de
ARN entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del
ARN diana que contiene el sitio de escisión para características
estructurales secundarias que pueden volver a la diana inoperable.
Lo adecuado de las dianas del ARN candidato de proteína tipo
proteína quinasa también puede evaluarse ensayando la accesibilidad
para la hibridación con oligonucleótidos complementarios usando
ensayos de protección de ribonucleasa. Pueden usarse secuencias
complementarias más largas para aumentar la afinidad de la
secuencia de hibridación por la diana. Las regiones de hibridación
y escisión de la ribozima pueden estar integralmente relacionadas de
modo que después de la hibridación con el ARN diana a través de las
regiones complementarias, la región catalítica de la ribozima pueda
escindir la diana.
Las ribozimas pueden introducirse en células
como parte de una construcción de ADN. Pueden usarse procedimientos
mecánicos, tales como microinyección, transfección mediada por
liposomas, electroporación, o precipitación con fosfato cálcico,
para introducir una construcción de ADN que contiene ribozima en
células en las que se desea disminuir la expresión de proteína tipo
proteína quinasa. Como alternativa, si se desea que las células
retengan de forma estable la construcción de ADN, puede
suministrarse la construcción en un plásmido y mantenerse como un
elemento separado o integrarse en el genoma de las células, como se
sabe en la técnica. Una construcción de ADN que codifica ribozima
puede incluir elementos reguladores de la transcripción, tales como
un elemento promotor, un potenciador o un elemento UAS, y una señal
de terminación de la transcripción, para controlar la transcripción
de las ribozimas en las células.
Como se muestra en Haseloff y col., Patente de
Estados Unidos 5.641.673, pueden modificarse genéticamente las
ribozimas de modo que la expresión de la ribozima suceda en
respuesta a factores que inducen la expresión de un gen diana. Las
ribozimas también pueden modificarse genéticamente para proporcionar
un nivel adicional de regulación, de modo que suceda la destrucción
del ARNm solamente cuando se inducen tanto una ribozima como un gen
diana en las células.
En este documento se describen procedimientos
para la identificación de genes cuyos productos interaccionan con
proteína tipo proteína quinasa humana.
Además, dichos genes pueden representar genes
que se regulan de forma diferencial en respuesta a manipulaciones
relevantes para el progreso o tratamiento de dichas enfermedades.
Además, dichos genes pueden tener una expresión modulada, aumentada
o disminuida temporalmente en diferentes fases de desarrollo del
tejido u organismo. Un gen expresado de forma diferencial también
puede tener su expresión modulada en condiciones de control frente
a experimentales. Además, el gen o producto génico tipo proteína
quinasa humana puede ensayarse en sí mismo para la expresión
diferencial.
El grado al que difiere la expresión en un
estado normal frente a un de enfermedad solamente tiene que ser
suficientemente grande para que se visualice por técnicas de
caracterización convencionales tales como técnicas de presentación
diferencial. Otra de dichas técnicas de caracterización convenciones
por la que pueden visualizarse las diferencias de expresión
incluye, aunque sin limitación, RT (transcriptasa inversa)
cuantitativa, PCR, y análisis de Northern.
Para identificar genes expresados de forma
diferencial, se aísla el ARN total o, preferiblemente, el ARNm de
tejidos de interés. Por ejemplo, se obtienen muestras de ARN de
tejidos de sujetos experimentales y de tejidos correspondientes de
sujetos de control. Puede usarse cualquier técnica de aislamiento de
ARN que no seleccione frente al aislamiento de ARNm para la
purificación de dichas muestras de ARN. Véase, por ejemplo, Ausubel
y col., ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley
& Sons, Inc. Nueva York, 1987-1993. Pueden
procesarse fácilmente grandes cantidades de muestras tisulares
usando técnicas bien conocidas para los especialistas en la
técnica, tales como, por ejemplo, el procedimiento de aislamiento de
ARN en una única etapa de Chomczynski, Patente de Estados Unidos
4.843.155.
Los transcritos en las muestras de ARN recogidas
que representan el ARN producido por genes expresados de forma
diferencial se identifican por procedimientos bien conocidos para
los especialistas en la técnica. Incluyen, por ejemplo, exploración
diferencial (Tedder y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85,
208-12, 1988), hibridación de sustracción (Hedrick
y col., Nature 308, 149-53; Lee y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2825,1984), y,
preferiblemente, presentación diferencial (Liang & Pardee,
Science 257, 967-71, 1992; Patente de
Estados Unidos 5.262.311).
La información de expresión diferencial puede
por sí misma sugerir procedimientos relevantes para el tratamiento
de trastornos que implican la proteína tipo proteína quinasa humana.
Por ejemplo, el tratamiento puede incluir una modulación de la
expresión de los genes expresados de forma diferencial y/o el gen
que codifica la proteína tipo proteína quinasa humana. La
información de expresión diferencial puede indicar que la expresión
o actividad del gen o producto génico expresado de forma
diferencial o el gen o producto génico tipo proteína quinasa humana
está regulada positivamente o regulada negativamente.
La invención proporciona ensayos para
seleccionar compuestos de ensayo que se unen a o modulan la
actividad de un polipéptido tipo proteína quinasa o un
polinucleótido tipo proteína quinasa. Un compuesto de ensayo
preferiblemente se une a un polipéptido o polinucleótido tipo
proteína quinasa. Más preferiblemente, un compuesto de ensayo
disminuye o aumenta la actividad enzimática en al menos
aproximadamente el 10, preferiblemente aproximadamente el 50, más
preferiblemente aproximadamente el 75, 90, ó 100% con relación a la
ausencia del compuesto de ensayo.
Los compuestos de ensayo pueden ser agentes
farmacológicos ya conocidos en la técnica o pueden ser compuestos
previamente desconocidos que tienen alguna actividad farmacológica.
Los compuestos pueden existir de forma natural o diseñarse en el
laboratorio. Pueden aislarse de microorganismos, animales, o
plantas, y pueden producirse de forma recombinante, o sintetizarse
por procedimientos químicos conocidos en la técnica. Si se desea,
los compuestos de ensayo pueden obtenerse usando cualquiera de los
numerosos procedimientos de bibliotecas combinatorias conocidos en
la técnica, incluyendo aunque sin limitación, bibliotecas
biológicas, bibliotecas en fase sólida o fase de solución paralelas
espacialmente dirigible, procedimientos de bibliotecas sintéticas
que requieren la deconvolución, el procedimiento de biblioteca de
"una-perla un-compuesto", y
procedimientos de biblioteca sintética usando selección por
cromatografía de afinidad. El enfoque de biblioteca biológica se
limita a bibliotecas de polipéptidos, mientras que los otros cuatro
enfoques son aplicables a bibliotecas de compuestos polipeptídicos,
oligoméricos no peptídicos, o pequeñas moléculas. Véase Lam,
Anticancer Drug Des. 12, 145, 1997.
Los procedimientos para la síntesis de
bibliotecas moleculares son bien conocidos en la técnica (véase, por
ejemplo, DeWitt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90,
6909, 1993; Erb y col. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91,
11422, 1994; Zuckermann y col., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994;
Cho y col., Science 261, 1303, 1993; Carell y col.,
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell y col.,
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop y col., J.
Med. Chem. 37, 1233, 1994). Las bibliotecas de compuestos pueden
presentarse en solución (véase, por ejemplo, Houghten,
BioTechniques 13, 412-421, 1992), o en perlas
(Lam, Nature 354, 82-84, 1991), virutas
(Fodor, Nature 364, 555-556, 1993), bacterias
o esporas (Ladner, Patente de Estados Unidos 5.223.409), plásmidos
(Cull y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89,
1865-1869, 1992), o fagos (Scott & Smith,
Science 249, 386-390, 1990; Devlin,
Science 249, 404-406, 1990); Cwirla y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378-6382, 1990;
Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310,1991; y
Ladner, Patente de Estados Unidos 5.223.409).
Los compuestos de ensayo pueden seleccionarse
para la capacidad de unirse a polipéptidos o polinucleótidos tipo
proteína quinasa o para afectar a la actividad de proteína tipo
proteína quinasa o la expresión del gen tipo proteína quinasa
usando selección de alto rendimiento. Usando la selección de alto
rendimiento, pueden ensayarse muchos compuestos determinados en
paralelo de modo que puedan seleccionarse rápidamente grandes
cantidades de compuestos de ensayo. Las técnicas más ampliamente
establecidas utilizan placas de microtitulación de 96 pocillos. Los
pocillos de las placas de microtitulación típicamente requieren
volúmenes de ensayo que varían de 50 a 500 \mul. Además de las
placas, están disponibles en el mercado muchos instrumentos,
materiales, dispositivos de pipeteo, robots, limpia placas, y
lectores de placa para equipar el formato de 96 pocillos.
Como alternativa, pueden usarse "ensayos de
formato libre" o ensayos que no tienen barreras físicas entre
muestras. Por ejemplo, se describe un ensayo que usa células
pigmentadas (melanocitos) en un ensayo homogéneo simple para
bibliotecas peptídicas combinatorias, por Jayawickreme y col.,
Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 19, 1614-18
(1994). Las células se siembran en agarosa en placas petri, después
se colocan perlas que llevan los compuestos combinatorios en la
superficie de la agarosa. Los compuestos combinatorios se liberan
parcialmente de las perlas. Los compuestos activos pueden
visualizarse como áreas de pigmentación oscura porque, como los
compuestos se difunden localmente en la matriz del gel, los
compuestos activos causan que las células cambien de color.
Otro ejemplo de un ensayo de formato libre se
describe por Chelsky, "Strategies for Screening Combinatorial
Libraries: Novel and Traditional Approaches", presentado en la
First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening
in Philadelphia, Pa. (7-10 Nov., 1995). Chelsky
colocó un ensayo enzimático homogéneo simple para anhidrasa
carbónica en el interior de un gel de agarosa de modo que la enzima
en el gel causara un cambio de color en todo el gel. Después se
colocaron las perlas que llevan los compuestos combinatorios
mediante un fotoengarce en el interior del gel y los compuestos se
liberaron parcialmente por luz UV. Los compuestos que inhibían la
enzima se observaron como zonas locales de inhibición que tienen
menos cambio de color.
Se describe otro ejemplo más por Salmon y col.,
Molecular Diversity 2, 57-63 (1996). En este
ejemplo, se exploraron bibliotecas combinatorias para compuestos
que tenían efectos citotóxicos en células cancerosas que crecían en
agar.
Otro procedimiento de selección de alto
rendimiento se describe en Beutel y col., Patente de Estados Unidos
5.976.813. En este procedimiento, se colocan muestras de ensayo en
una matriz porosa. Después se colocan uno o más componentes de
ensayo en, en la parte superior de, o en la parte inferior de una
matriz tal como un gel, una lámina de plástico, un filtro, u otra
forma de soporte sólido fácilmente manipulada. Cuando se introducen
las muestras en la matriz porosa difunden de forma suficientemente
lenta, de modo que los ensayos pueden realizarse sin que las
muestras de ensayo se procesen juntas.
Para ensayos de unión, el compuesto de ensayo es
preferiblemente una molécula pequeña que se une a y ocupa, por
ejemplo, el sitio activo del polipéptido tipo proteína quinasa, de
modo que se evita la actividad biológica normal. Los ejemplos de
dichas moléculas pequeñas incluyen, aunque sin limitación, pequeños
péptidos o moléculas tipo péptido.
En ensayos de unión, el compuesto de ensayo o el
polipéptido tipo proteína quinasa puede comprende un marcador
detectable, tal como un marcador fluorescente, radioisotópico,
quimioluminescente, o enzimático, tal como peroxidasa de rábano
rusticano, fosfatasa alcalina, o luciferasa. La detección de un
compuesto de ensayo que está unido al polipéptido tipo proteína
quinasa entonces puede conseguirse, por ejemplo, por recuento
directo de radio-emisión, por recuento de
centelleo, o determinado la conversión de un sustrato apropiado en
un producto detectable.
Como alternativa, la unión de un compuesto de
ensayo a un polipéptido tipo proteína quinasa puede determinarse
sin marcar ninguno de los compuestos de interacción. Por ejemplo,
puede usarse un microfisiómetro para detectar la unión de un
compuesto de ensayo con un polipéptido tipo proteína quinasa. Un
microfisiómetro (por ejemplo, Cytosensor^{TM}) es un instrumento
analítico que mide la velocidad a la que una célula acidifica su
entorno usando un detector potenciométrico dirigible por luz
(LAPS). Pueden usarse cambios en esta velocidad de acidificación
como un indicador de la interacción entre un compuesto de ensayo y
un polipéptido tipo proteína quinasa (McConnell y col., Science
257, 1906-1912, 1992).
La determinación de la capacidad de un compuesto
de ensayo de unirse a un polipéptido tipo proteína quinasa también
puede conseguirse usando una tecnología tal como Análisis de
Interacción Bimolecular (BIA) a tiempo real (Sjolander &
Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338-2345, 1991,
y Szabo y col., Curr. Opin. Struct. Biol. 5,
699-705, 1995). BIA es una tecnología para estudiar
las interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno
de los compuestos de interacción (por ejemplo, BIAcore^{TM}). Los
cambios en el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial
(SPR) pueden usarse como una indicación de las reacciones a tiempo
real entre moléculas
biológicas.
biológicas.
En otro aspecto más de la invención, puede
usarse un polipéptido tipo proteína quinasa como una "proteína
cebo" en un ensayo doble híbrido o ensayo triple híbrido (véase,
por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5.283.317; Zervos y col,
Cell 72, 223-232, 1993; Madura y col., J.
Biol. Chem. 268, 12046-12054, 1993; Bartel y
col., BioTechniques 14, 920-924, 1993;
Iwabuchi y col., Oncogene 8, 1693-1696, 1993;
y Brent, documento WO 94/10300), para identificar otras proteínas
que se unen a o interaccionan con el polipéptido tipo proteína
quinasa y modulan su actividad.
El sistema doble híbrido se basa en la
naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción,
que constan de dominios de unión a ADN y de activación separables.
En resumen, el ensayo utiliza dos construcciones de ADN diferentes.
Por ejemplo, en una construcción puede fusionarse un polinucleótido
que codifica un polipéptido tipo proteína quinasa con un
polinucleótido que codifica el dominio de unión a ADN de un factor
de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En
la otra construcción puede fusionarse una secuencia de ADN que
codifica una proteína no identificada ("presa" o
"muestra") con un polinucleótido que codifica el dominio de
activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas
"cebo" y "presa" son capaces de interaccionar in
vivo para formar un complejo dependiente de proteína, los
dominios de unión a ADN y de activación del factor de transcripción
se ponen en cercana proximidad. Esta proximidad permite la
transcripción de un gen informador (por ejemplo, LacZ), que está
unido de forma operativa a un sitio regulador de la transcripción
sensible al factor de transcripción. La expresión del gen
informador puede detectarse, y pueden aislarse las colonias
celulares que contienen el factor de transcripción funcional y
pueden usarse para obtener la secuencia de ADN que codifica la
proteína que interacciona con el polipéptido tipo proteína
quinasa.
Puede ser deseable inmovilizar el polipéptido
tipo proteína quinasa (o polinucleótido) o el compuesto de ensayo
para facilitar la separación de las formas unidas de las no unidas
de uno o ambos compuestos de interacción, así como para acomodar la
automatización del ensayo. Por tanto, el polipéptido tipo proteína
quinasa (o polinucleótido) o el compuesto de ensayo puede unirse a
un soporte sólido. Los soportes sólidos adecuados incluyen, aunque
sin limitación, portaobjetos de vidrio o plástico, placas de cultivo
tisular, pocillos de microtitulación, tubos, chips de silicio, o
partículas tales como perlas (incluyendo, aunque sin limitación,
perlas de látex, poliestireno, o vidrio). Puede usarse cualquier
procedimiento conocido en la técnica para unir el polipéptido
enzimático (o polinucleótido) o compuesto de ensayo a un soporte
sólido, incluyendo el uso de enlaces covalentes y no covalentes,
absorción pasiva, o pares de restos de unión unidos respectivamente
al polipéptido (o polinucleótido) o compuesto de ensayo y el
soporte sólido. Los compuestos de ensayo se unen preferiblemente al
soporte sólido en una serie, de modo que pueda rastrearse la
localización de compuestos de ensayo individuales. La unión de un
compuesto de ensayo a un polipéptido tipo proteína quinasa (o
polinucleótido) puede conseguirse en cualquier recipiente adecuado
para que contenga los reactivos. Los ejemplos de dichos recipientes
incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de
microcentrífuga.
En una realización, el polipéptido tipo proteína
quinasa es una proteína de fusión que comprende un dominio que
permite que el polipéptido tipo proteína quinasa se una a un soporte
sólido. Por ejemplo, pueden adsorberse proteínas de fusión de
glutatión-S-transferasa en perlas de
glutatión sepharose (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) o placas de
microtitulación derivatizadas con glutatión, que después se combinan
con el compuesto de ensayo o el compuesto de ensayo y el
polipéptido tipo proteína quinasa no adsorbido; después se incuba la
mezcla en condiciones que conducen a la formación del complejo (por
ejemplo, en condiciones fisiológicas para concentración salina y
pH). Después de la incubación, se lavan las perlas o los pocillos de
la placa de microtitulación para retirar cualquier componente no
unido. La unión de los compuestos de interacción puede determinarse
directa o indirectamente, como se ha descrito anteriormente. Como
alternativa, los complejos pueden disociarse del soporte sólido
antes de que se determine la unión.
También pueden usarse otras técnicas para la
inmovilización de proteínas o polinucleótidos en un soporte sólido
en los ensayos de selección de la invención. Por ejemplo, puede
inmovilizarse un polipéptido tipo proteína quinasa (o
polinucleótido) o un compuesto de ensayo utilizando conjugación de
biotina y estreptavidina. Pueden prepararse polipéptidos tipo
proteína quinasa (o polinucleótidos) o compuestos de ensayo
biotinilados a partir de biotina-NHS
(N-hidroxisuccinimida) usando técnicas bien conocidas en la
técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals,
Rockford, III.) e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96
pocillos revestidos de estreptavidina (Pierce Chemical). Como
alternativa, pueden derivatizarse anticuerpos que se unen
específicamente a un polipéptido tipo proteína quinasa,
polinucleótido, o un compuesto de ensayo, pero que do no interfiere
con un sitio de unión deseado, tal como el sitio activo del
polipéptido tipo proteína quinasa, en los pocillos de la placa. La
diana o proteína no unida puede atraparse en los pocillos por
conjugación de anticuerpo.
Los procedimientos para detectar dichos
complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos
inmovilizados por GST, incluyen inmunodetección de complejos usando
anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido tipo
proteína quinasa o compuesto de ensayo, ensayos ligados a enzimas
que dependen de la detección de una actividad del polipéptido tipo
proteína quinasa, y electroforesis en gel SDS en condiciones no
reductoras.
La selección de compuestos de ensayo que se unan
a un polipéptido tipo proteína quinasa o polinucleótido también
puede realizarse en una célula intacta. Puede usarse cualquier
célula que comprenda un polipéptido tipo proteína quinasa o
polinucleótido en un sistema de ensayo basado en células. Un
polinucleótido tipo proteína quinasa puede estar de forma natural
en la célula o puede introducirse usando técnicas tales como las
descritas anteriormente. La unión del compuesto de ensayo a un
polipéptido tipo proteína quinasa o polinucleótido se determina como
se ha descrito anteriormente.
Los compuestos de ensayo pueden ensayarse para
la capacidad de aumentar o disminuir la actividad proteína quinasa
de un polipéptido tipo proteína quinasa humana. La actividad
proteína quinasa puede medirse, por ejemplo, como se describe en la
Patente de Estados Unidos 6.194.186.
Los ensayos enzimáticos pueden realizarse
después de poner en contacto un polipéptido tipo proteína quinasa
purificado, una preparación de membrana celular, o una célula
intacta con un compuesto de ensayo. Un compuesto de ensayo que
disminuya una actividad proteína quinasa de un polipéptido tipo
proteína quinasa en al menos aproximadamente un 10, preferiblemente
aproximadamente un 50, más preferiblemente aproximadamente un 75,
90, ó 100% se identifica como un agente terapéutico potencial para
disminuir la actividad de la proteína tipo proteína quinasa. Un
compuesto de ensayo que aumente una actividad proteína quinasa de un
polipéptido tipo proteína quinasa humana en al menos
aproximadamente un 10, preferiblemente aproximadamente un 50, más
preferiblemente aproximadamente un 75, 90, ó 100% se identifica
como un agente terapéutico potencial para aumentar la actividad de
una proteína tipo proteína quinasa humana.
Se identifican compuestos de ensayo que aumentan
o disminuyen la expresión de un gen tipo proteína quinasa. Se pone
en contacto un polinucleótido tipo proteína quinasa con un compuesto
de ensayo, y se determina la expresión de un ARN o producto
polipeptídico del polinucleótido tipo proteína quinasa. El nivel de
expresión del ARNm o polipéptido apropiado en presencia del
compuesto de ensayo se compara con el nivel de expresión del ARNm o
polipéptido en ausencia del compuesto de ensayo. Después puede
identificarse el compuesto de ensayo como un modulador de la
expresión en base a esta comparación. Por ejemplo, cuando la
expresión del ARNm o polipéptido es mayor en presencia del
compuesto de ensayo que en su ausencia, el compuesto de ensayo se
identifica como estimulador o potenciador de la expresión del ARNm
o polipéptido. Como alternativa, cuando la expresión del ARNm o
polipéptido es menor en presencia del compuesto de ensayo que en su
ausencia, el compuesto de ensayo se identifica como un inhibidor de
la expresión del ARNm o polipéptido.
El nivel de expresión del ARNm o polipéptido
tipo proteína quinasa en las células puede determinarse por
procedimientos bien conocidos en la técnica para detectar ARNm o
polipéptidos. Pueden usarse procedimientos cualitativos o
cuantitativos. Puede determinarse la presencia de productos
polipeptídicos de un polinucleótido tipo proteína quinasa, por
ejemplo, usando una diversidad de técnicas conocidas en la técnica,
incluyendo procedimientos inmunoquímicos tales como
radioinmunoensayo, transferencia de Western, e inmunohistoquímica.
Como alternativa, puede determinarse la síntesis de polipéptido
in vivo, en un cultivo celular, o en un sistema de traducción
in vitro detectando la incorporación de aminoácidos marcados
en un polipéptido tipo proteína quinasa.
Dicha exploración puede realizarse en un sistema
de ensayo libre de células o en una célula intacta. Puede usarse
cualquier célula que exprese un polinucleótido tipo proteína quinasa
en un sistema de ensayo basado en células. El polinucleótido tipo
proteína quinasa puede estar de forma natural en la célula o puede
introducirse usando técnicas tales como las descritas
anteriormente. Puede usarse un cultivo primario o una línea celular
establecida, tal como células CHO o de riñón embrionario humano
293.
La proteína tipo proteína quinasa humana puede
regularse para tratar la diabetes.
La diabetes mellitus es un trastorno metabólico
común caracterizado por una elevación anormal de la glucosa en
sangre, alteraciones en los lípidos y anormalidades (complicaciones)
en el sistema cardiovascular, ojos, riñones y sistema nervioso. La
diabetes está dividida en dos enfermedades diferentes: diabetes de
tipo 1 (aparición juvenil), provocada por una pérdida de las
células que fabrican y secretan insulina, y diabetes de tipo 2
(aparición en adultos), que está causada por un defecto en la
secreción de insulina y un defecto en la acción de la insulina.
La diabetes de tipo 1 se inicia por una reacción
autoinmune que ataca a las células secretoras de insulina (células
beta) en los islotes pancreáticos. Los agentes que evitan que suceda
esta reacción o que detienen la reacción antes de se haya
conseguido la destrucción de las células beta son terapias
potenciales para esta enfermedad. Otros agentes que inducen la
proliferación y regeneración de las células beta también son
terapias potenciales.
La diabetes de tipo II es la más común de las
dos afecciones diabéticas (6% de la población). El defecto en la
secreción de insulina es una causa importante de la afección
diabética y está provocada por una incapacidad de las células beta
de detectar y responder apropiadamente a elevaciones en los niveles
de glucosa en sangre con liberación de insulina. Las terapias que
aumentan la response por las células beta a la glucosa ofrecerían
un nuevo tratamiento importante para esta enfermedad.
El defecto en la acción de la insulina en
sujetos diabéticos de Tipo II es otra diana para la intervención
terapéutica. Los agentes que aumentan la actividad del receptor de
insulina en el músculo, hígado, y grasas causará una disminución en
el nivel de glucosa en sangre y una normalización de los lípidos en
plasma. La actividad del receptor puede aumentarse por agentes que
estimulan directamente el receptor o que aumentan las señales
intracelulares desde el receptor. Otras terapias pueden activar
directamente el proceso final celular, es decir, el transporte de
glucosa o diversos sistemas enzimáticos, para generar un efecto tipo
insulina y por lo tanto para producir un resultado beneficioso.
Como los sujetos con sobrepeso tienen mayor susceptibilidad a
diabetes de Tipo II, cualquier agente que reduzca el peso corporal
es una posible terapia.
La diabetes tanto de Tipo I como de Tipo II
puede tratarse con agentes que imitan la acción de la insulina o
que tratan las complicaciones diabéticas reduciendo los niveles de
glucosa en sangre. Asimismo, los agentes que reducen el crecimiento
de nuevos vasos sanguíneos pueden usarse para tratar las
complicaciones oculares que se desarrollan en ambas
enfermedades.
Ejemplo
1
El polinucleótido de la SEC ID Nº 1 se inserta
en el vector de expresión pCEV4 y se introduce por transfección el
vector de expresión pCEV4-polipéptido proteico tipo
proteína quinasa obtenido en células 293 de riñón embrionario
humano. A partir de estas células se obtienen extractos y se ensaya
la actividad de la proteína tipo proteína quinasa midiendo la
incorporación de 32Pi en histona H1 de timo de ternero de
[gamma-32P]ATP. Los extractos celulares se
incuban en una mezcla de reacción que contiene Tris HCl 20 mM a pH
7,5, MgCl_{2} 10 mM, ATP 20 \muM, 15-50 kBq de
[gamma-32P]ATP, y 200 \mug/ml de histona
H1. La incubación se realiza durante 5 min a 30ºC, y las proteínas
fosforiladas se separan por SDS/PAGE y se visualizan y cuantifican
midiendo la intensidad de la luminiscencia fotoestimulada (PSL)
usando un Bio-Imaging Analyzer. Se muestra que el
polipéptido de la SEC ID Nº 2 tiene una actividad de la proteína
tipo proteína quinasa.
Ejemplo
2
El vector de expresión de Pichia pastoris
pPICZB (Invitrogen, San Diego, CA) se usa para producir granes
cantidades de polipéptidos recombinantes tipo proteína quinasa
humana en levaduras. La secuencia de ADN que codifica la proteína
tipo proteína quinasa se obtiene de las SEC ID Nº 1, 8 y 10. Antes
de la inserción en el vector pPICZB, se modifica la secuencia de
ADN por procedimientos bien conocidos de tal modo que contenga en
su extremo 5' un codón de inicio y en su 3' un sitio de escisión por
enteroquinasa, una marca informadora His6 y un codón de
terminación. Además, en ambos extremos se añaden secuencias de
reconocimiento para endonucleasas de restricción y después de la
digestión del sitio de clonación múltiple de pPICZ B con las enzimas
de restricción correspondientes, la secuencia modificada de ADN se
liga en pPICZB. Este vector de expresión está diseñado para la
expresión inducible en Pichia pastoris, dirigida por un
promotor de levaduras. El vector pPICZ/md-His6
resultante se usa para transformar la levadura.
La levadura se cultiva en condiciones habituales
en matraces de agitación de 5 litros y la proteína producida de
forma recombinante se aísla del cultivo por cromatografía de
afinidad (Resina Ni-NTA) en presencia de urea 8 M.
El polipéptido unido se eluye con tampón, pH 3,5, y se neutraliza.
La separación del polipéptido de la marca informadora His6 se
consigue por proteolisis específica de sitio usando enteroquinasa
(Invitrogen, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Se obtiene polipéptido tipo proteína quinasa humana
purificado.
Ejemplo
3
Los polipéptidos tipo proteína quinasa
purificados que comprenden una proteína
glutatión-S-transferasa y se
absorben en pocillos derivatizados con glutatión de placas de 96
pocillos se ponen en contacto con compuestos de ensayo de una
biblioteca de pequeñas moléculas a pH 7,0 en una solución de tampón
fisiológico. Los polipéptidos tipo proteína quinasa humana
comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID Nº 2 y
9. Los compuestos de ensayo comprenden una marca fluorescente. Las
muestras se incuban durante 5 minutos a una hora. Las muestras de
control se incuban en ausencia de un compuesto de ensayo.
La solución de tampón que contiene los
compuestos de ensayo se lava de los pocillos. La unión de un
compuesto de ensayo a un polipéptido tipo proteína quinasa se
detecta por medidas de fluorescencia de los contenidos de los
pocillos. Un compuesto de ensayo que aumenta la fluorescencia en un
pocillo en al menos un 15% con relación a la fluorescencia de un
pocillo en el que no se ha incubado un compuesto de ensayo se
identifica como un compuesto que se une a un polipéptido tipo
proteína quinasa.
Ejemplo
4
Se administra un compuesto de ensayo a un
cultivo de células humanas transfectadas con una construcción de
expresión de proteína tipo proteína quinasa y se incuba a 37ºC
durante 10 a 45 minutos. Se incuba un cultivo del mismo tipo de
células que no se han transfectado durante el mismo tiempo sin el
compuesto de ensayo para proporcionar un control negativo.
Se aísla el ARN de los dos cultivos como se
describe en Chirgwin y col., Biochem. 18,
5294-99, 1979. Se preparan transferencias de
Northern usando de 20 a 30 \mug de ARN total y se hibridan con una
sonda específica de proteína tipo proteína quinasa marcada con
^{32}P a 65ºC en Express-hyb (CLONTECH). La sonda
comprende al menos 11 nucleótidos contiguos seleccionados entre el
complemento de las SEC ID Nº 1, 8 y 10. Un compuesto de ensayo que
disminuye la señal específica de proteína tipo proteína quinasa con
relación a la señal obtenida en ausencia del compuesto de ensayo se
identifica como un inhibidor de la expresión del gen tipo proteína
quinasa.
Ejemplo
5
Se administra un compuesto de ensayo a un
cultivo de células humanas transfectadas con una construcción de
expresión de proteína tipo proteína quinasa y se incuba a 37ºC
durante 10 a 45 minutos. Se incuba un cultivo del mismo tipo de
células que no se han transfectado durante el mismo tiempo sin el
compuesto de ensayo para proporcionar un control negativo. Se mide
la actividad de la proteína tipo proteína quinasa usando el
procedimiento de la Patente de Estados Unidos 6.194.186.
Un compuesto de ensayo que disminuye la
actividad de la proteína tipo proteína quinasa de la proteína tipo
proteína quinasa con relación a la actividad de la proteína tipo
proteína quinasa en ausencia del compuesto de ensayo se identifica
como un inhibidor de la actividad de la proteína tipo proteína
quinasa.
Ejemplo
6
El patrón de expresión cualitativo de la
proteína tipo proteína quinasa en diversos tejidos se determina por
Reacción en Cadena de la Polimerasa de Transcripción Inversa
(RT-PCR).
Para demostrar que la proteína tipo proteína
quinasa está implicada en el cáncer, se determina la expresión en
los siguientes tejidos: glándula suprarrenal, médula ósea, cerebro,
cerebelo, colon, cerebro fetal, hígado fetal, corazón, riñón,
hígado, pulmón, glándula mamaria, páncreas, placenta, próstata,
glándula salivar, músculo esquelético, intestino delgado, médula
espinal, bazo, estómago, testículo, timo, tiroides, tráquea, útero,
y linfocitos de sangre periférica. También se determina la expresión
en las siguientes líneas celulares cancerosas:
DU-145 (próstata), NCl-H125
(pulmón), HT-29 (colon), COLO-205
(colon), A-549 (pulmón), NCl-H460
(pulmón), HT-116 (colon), DLD-1
(colon), MDA-MD-231 (mama), LS174T
(colon), ZF-75 (mama),
MDA-MN-435 (mama),
HT-1080, MCF-7 (mama), y U87. Se
ensayan los pares coincidentes de tejido maligno y normal del mismo
paciente.
Para demostrar que la proteína tipo proteína
quinasa está implicada en trastornos del SNC, se exploran los
siguientes tejidos: cerebro fetal y adulto, músculo, corazón,
pulmón, riñón, hígado, timo, testículo, colon, placenta, tráquea,
páncreas, riñón, mucosa gástrica, colon, hígado, cerebelo, piel,
corteza (de Alzheimer y normal), hipotálamo, corteza, amígdala,
cerebelo, hipocampo, coroides, plexo, tálamo, y médula espinal.
Para demostrar que la proteína tipo proteína
quinasa está implicada en la patología de COPD, el panel de
expresión inicial consta de muestras de ARN de tejidos
respiratorios y células inflamatorias relevantes para COPD: pulmón
(adulto y fetal), tráquea, células de tipo II alveolares recién
aisladas, células epiteliales bronquiales humanas cultivadas,
células epiteliales de las vías respiratorias inferiores cultivadas,
células de músculo liso bronquial cultivadas, células H441
cultivadas (tipo Clara), neutrófilos y monocitos recién aislados, y
monocitos cultivados (tipo macrófago). También se realiza un
perfilado del mapa corporal, usando paneles de ARN total adquiridos
de Clontech. Los tejidos son glándula suprarrenal, médula ósea,
cerebro, colon, corazón, riñón, hígado, pulmón, glándula mamaria,
páncreas, próstata, glándula salivar, músculo esquelético, intestino
delgado, bazo, estómago, testículo, timo, tráquea, tiroides, y
útero.
Para demostrar que la proteína tipo proteína
quinasa está implicada en la patología de obesidad, se determina la
expresión en los siguientes tejidos: tejido adiposo subcutáneo,
tejido adiposo mesentérico, glándula suprarrenal, médula ósea,
cerebro (cerebelo, médula espinal, corteza cerebral, caudado,
médula, sustancia negra, y putámen), colon, cerebro fetal, corazón,
riñón, hígado, pulmón, glándula mamaria, páncreas, placenta,
próstata, glándula salivar, músculo esquelético, intestino delgado,
bazo, estómago, testículo, timo, tiroides, tráquea, y útero.
También se ensayan las líneas celulares de neuroblastoma
SK-Nr-Be (2), Hr,
Sk-N-As, HTB-10,
IMR-32, SNSY-5Y, T3,
SK-N-D2, D283, DAOY,
CHP-2, U87MG, BE(2)C, T986, KANTS,
M059K, CHP234, C6 (rata), SK-N-F1,
SK-PU-DW, PFSK-1,
BE(2)M17, y MCIXC para la expresión de proteína tipo
proteína quinasa. Como etapa final, se compara la expresión de
proteína tipo proteína quinasa en células obtenidas de individuos
normales con la expresión de células obtenidas de individuos
obesos.
Para demostrar que la proteína tipo proteína
quinasa está implicada en la patología de la diabetes, se exploró
el siguiente panel corporal completo para mostrar la expresión
predominante o relativamente alta: tejido adiposo subcutáneo y
mesentérico, glándula suprarrenal, médula ósea, cerebro, colon,
cerebro fetal, corazón, hipotálamo, riñón, hígado, pulmón, glándula
mamaria, páncreas, placenta, próstata, glándula salivar, músculo
esquelético, intestino delgado, bazo, estómago, testículo, timo,
tiroides, tráquea, y útero. También se ensayaron células de los
islotes pancreáticos y una biblioteca de células de islotes. Como
etapa final, se compara la expresión de la proteína tipo proteína
quinasa en células obtenidas de individuos normales con la expresión
de células obtenidas de individuos diabéticos.
Perfilado de expresión cuantitativa. El
perfilado de expresión cuantitativa se realiza en forma de análisis
por PCR cuantitativa llamado "análisis cinético" por primera
vez descrito en Higuchi y col., BioTechnology 10,
413-17, 1992, e Higuchi y col., BioTechnology
11, 1026-30, 1993. El principio es que en
cualquier ciclo dado en la fase exponencial de PCR, la cantidad de
producto es proporcional a la cantidad inicial de copias del
molde.
Si la amplificación se realiza en presencia de
un oligonucleótido fluorescente inactivado de forma interna (sonda
TaqMan) complementario a la secuencia diana, la sonda se escinde por
la actividad endonucleasa 5'-3' de la ADN
polimerasa Taq y se libera un colorante fluorescente en el medio
(Holland y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88,
7276-80, 1991). Como la emisión de fluorescencia
aumentará en proporción directa a la cantidad del producto
amplificado específico, la fase de crecimiento exponencial del
producto de PCR puede detectarse y usarse para determinar la
concentración de molde inicial (Heid y col, Genome Res. 6,
986-94, 1996, y Gibson y col, Genoma Res. 6,
995-1001, 1996).
Puede realizarse la amplificación de un control
endógeno para normalizar la cantidad de ARN de muestra añadido a
una reacción. En este tipo de experimento, el control de elección es
el ARN ribosómico 18S. Como están disponibles colorantes
informadores con diferentes espectros de emisión, la diana y el
control endógeno pueden cuantificarse independientemente en el
mismo tubo si se usan sondas marcadas con diferentes colorantes.
Todas las medidas de "PCR a tiempo real" de
fluorescencia se hacen en el ABI Prism 7700.
Extracción de ARN y preparación de ADNc.
Se usa el ARN total de los tejidos enumerados anteriormente para la
cuantificación de la expresión. Se extrajeron los ARN marcados "de
la autopsia" de tejidos de autopsia con el reactivo TRIzol (Life
Technologies, MD) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Se trataron cincuenta \mug de cada ARN con
ADNasa I durante 1 hora a 37ºC en la siguiente mezcla de reacción:
0,2 U/\mul ADNasa I libre de ARNasa (Roche Diagnostics, Alemania);
0,4 U/\mul de inhibidor de ARNasa (PE Applied Biosystems, CA);
Tris-HCl 10 mM pH 7,9; MgCl_{2} 10 mM; NaCl 50 mM;
y DTT 1 mM.
Después de incubación, se extrae el ARN una vez
con 1 volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (24:24:1) y
una vez con cloroformo, y se precipitó con 1/10 volumen de NaAcetato
3 M, pH 5,2, y 2 volúmenes de etanol.
Se tratan con ADNasa cincuenta \mug de cada
ARN de los tejidos de autopsia con los kits libres de ADN adquiridos
de Ambion (Ambion, TX). Después de resuspensión y cuantificación
espectrofotométrica, cada muestra se transcribe de forma inversa
con los Reactivos de Transcripción Inversa TaqMan (PE Applied
Biosystems, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La
concentración final de ARN en la mezcla de reacción es 200
ng/\mul. La transcripción inversa se realiza con 2,5 \muM de
cebadores hexaméricos aleatorios.
Análisis cuantitativo TaqMan. Se diseñan
cebadores y sondas específicos de acuerdo con las recomendaciones
de PE Applied Biosystems; la sonda puede marcarse en el extremo 5'
con FAM (6-carboxi-fluoresceína) y
en el extremo 3' con TAMRA
(6-carboxi-tetrametil-rodamina).
Los experimentos de cuantificación se realizan en 10 ng de ARN
transcrito de forma inversa de cada muestra. Cada determinación se
hace por triplicado.
El contenido de ADNc total se normaliza con la
cuantificación simultánea (PCR múltiple) del ARN ribosómico 18S
usando el Kit de Control de Reactivos de Ensayo TaqMan
Pre-Desarrollados (PDAR) (PE Applied Biosystems,
CA).
La mezcla de reacción de ensayo es la siguiente:
Mezcla Maestra Universal de PCR TaqMan 1X final (a partir de
solución madre 2X) (PE Applied Biosystems, CA); control PDAR 1X -
ARN 18S (a partir de solución madre 20X); cebador directo 300 nM;
cebador inverso 900 nM; sonda 200 nM; ADNc 10 ng; y agua hasta 25
\mul.
Cada una de las siguientes etapas se realizó una
vez: pre PCR, 2 minutos a 50ºC, y 10 minutos a 95ºC. Las siguientes
etapas se realizaron 40 veces: desnaturalización, 15 segundos a
95ºC, hibridación/extensión, 1 minuto a 60ºC.
El experimento se realiza en un Detector de
Secuencia ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, CA). Al final de
la realización, se procesan los datos de fluorescencia adquiridos
durante la PCR como se describe en el manual del usuario de ABI
Prism 7700 para conseguir una mejor sustracción del fondo así como
linealidad de la señal con la cantidad de diana de partida.
Ejemplo
7
La línea celular usada para el ensayo es la
línea celular de cáncer de colon humano HCT116. Las células se
cultivan en RPMI-1640 con suero de ternera fetal al
10-15% a una concentración de 10.000 células por
mililitro en un volumen de 0,5 ml y se mantienen a 37ºC en una
atmósfera de aire al 95%/CO_{2} al 5%.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se sintetizan oligorribonucleótidos de
fosforotioato en un sintetizador de ADN Applied Biosystems Modelo
380B usando química de fosforoamidita. Se usa una secuencia de 24
bases complementaria a los nucleótidos en la posición 1 a 24 de las
SEC ID Nº 1, 8 y 10 como oligonucleótido de ensayo. Como control, se
usa otra secuencia (aleatoria): 5'-TCA ACT GAC TAG
ATG TAC ATG GAC-3'. Después del ensamblaje y
desprotección, los oligonucleótidos se precipitan con etanol dos
veces, se secan, y se suspenden en solución salina tamponada con
fosfato a la concentración deseada. La pureza de los
oligonucleótidos se ensaya por electroforesis en gel capilar y HPLC
de intercambio iónico. Los oligonucleótidos purificados se añaden al
medio de cultivo a una concentración de 10 \muM una vez al día
durante siete días.
La adición del oligonucleótido de ensayo durante
siete días provoca una expresión significativamente reducida de la
proteína tipo proteína quinasa determinada por transferencia de
Western. Este efecto no se observa con el oligonucleótido de
control. Después de 3 a 7 días, se cuenta la cantidad de células en
los cultivos usando un contador de células automático. La cantidad
de células en cultivos tratados con el oligonucleótido de ensayo
(expresada como el 100%) se compara con la cantidad de células en
cultivos tratados con el oligonucleótido de control. La cantidad de
células en cultivos tratados con el oligonucleótido de ensayo no es
más del 30% del control, que indica que la inhibición de la
proteína tipo proteína quinasa humana tiene un efecto
anti-proliferativo en células cancerosas.
Ejemplo
8
Este ensayo no tumoral mide la capacidad de un
compuesto de reducir el nivel endógeno de una hormona en circulación
o el nivel de hormona producida en respuesta a un estímulo
biológico. Se administra a roedores el compuesto de ensayo (p.o.,
i.p., i.v., i.m., o s.c.). En un momento predeterminado después de
la del compuesto de ensayo, se recoge plasma sanguíneo. El plasma
se ensaya para los niveles de la hormona de interés. Si los niveles
en circulación normales de la hormona son demasiado bajos y/o
variables para proporcionar resultados coherentes, el nivel de la
hormona puede elevarse por un pre-tratamiento con un
estímulo biológico (es decir, pueden inyectarse LHRH i.m. en
ratones a una dosificación de 30 ng/ratón para inducir una explosión
de síntesis de testosterona). El ritmo de recogida de plasma se
ajustaría para coincidir con el pico de la respuesta hormonal
inducida. Los efectos del compuesto se comparan con un grupo de
control tratado con vehículo. Se realiza un ensayo F para
determinar si la varianza es igual o diferente, seguido de un ensayo
t de Student. La significancia es el valor p \leq 0,05 en
comparación con el grupo de control tratado con vehículo.
Se preparan fibras huecas con la línea o líneas
celulares deseadas y se implantan de forma intraperitoneal y/o
subcutánea en roedores. Los compuestos se administran p.o., i.p.,
i.v., i.m., o s.c. Las fibras se recogen de acuerdo con el
protocolo de ensayo de lectura específico, estos pueden incluir
ensayos para la expresión génica (ADNb, PCR, o Taqman), o una
actividad bioquímica específica (es decir, niveles de AMPc). Los
resultados se analizan por en ensayo t de Student o ensayo de Suma
de Rango, después se compara la varianza entre grupos por un ensayo
F, con significancia a p \leq 0,05 en comparación con el grupo de
control tratado con vehículo.
Éste es otro ensayo no tumoral que mide la
capacidad de un compuesto de reducir la masa de un tejido
dependiente de hormonas (es decir, vesículas seminales en machos y
úteros en hembras). Se administra a roedores el compuesto de ensayo
(p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c.) de acuerdo con un programa
predeterminado y durante un periodo predeterminado (es decir, 1
semana). En la finalización del estudio, se pesan los animales, se
escinde el órgano diana, se expresa cualquier fluido, y se registra
el peso del órgano. También se recoge plasma sanguíneo. El plasma
puede ensayarse para los niveles de una hormona de interés o para
niveles de agente de ensayo. Los pesos de los órganos pueden
comprarse directamente o pueden normalizarse para el peso corporal
del animal. Los efectos del compuesto se comparan con un grupo de
control tratado con vehículo. Se realiza un ensayo F para
determinar so la varianza es igual o diferente seguido de un ensayo
t de Student. La significancia es el valor p \leq 0,05 en
comparación con el grupo de control tratado con vehículo.
Se preparan fibras huecas con la línea o líneas
celulares deseadas y se implantan de forma intraperitoneal y/o
subcutánea en roedores. Los compuestos se administran p.o., i.p.,
i.v., i.m., o s.c. Las fibras se recogen de acuerdo con el
protocolo de ensayo de lectura específico. La proliferación
celulares se determina midiendo un marcador de cantidad de células
(es decir, MTT o LDH). La cantidad de células y el cambio en la
cantidad de células a partir del inóculo de partida se analizan por
ensayo t de Student o ensayo de Suma de Rango, después se compara
la varianza entre grupos por un ensayo F, con significancia a p
\leq 0,05 en comparación con el grupo de control tratado con
vehículo.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se implantan gránulos de Hydron con o sin
factores de crecimiento o células en un microbolsillo creado
quirúrgicamente en la córnea del roedor. La administración del
compuesto puede ser sistémica o local (compuesto mezclado con
factores de crecimiento en el gránulo de Hydron). Las córneas se
recogen a los 7 días después del implante inmediatamente después de
infusión intracardiaca de carbono coloidal y se fijan en formalina
al 10%. La lectura es valoración cualitativa y/o análisis de
imágenes. Los valores cualitativos se comparan por ensayo de Suma
de Rango. Los datos de análisis de imágenes se evalúan midiendo el
área de neovascularización (en píxeles) y se comparan las medias de
grupo por ensayo t de Student (bilateral). La significancia es p
\leq 0,05 en comparación con el grupo de factor de crecimiento o
solamente células.
Se inyecta Matrigel, que contiene células o
factores de crecimiento, de forma subcutánea. Los compuestos se
administran p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. Se recogen tapones de
Matrigel en uno o más momentos puntuales predeterminados y se
preparan para la lectura. La lectura es un ensayo basado en ELISA
para la concentración de hemoglobina y/o examen histoquímico (es
decir, recuento de vasos, tinción especial para marcadores de
superficie endotelial: CD31, factor-8). Las
lecturas se analizan por ensayo t de Student, después se compara la
varianza entre grupos por un ensayo F, con significancia
determinada a p \leq 0,05 en comparación con el grupo de control
tratado con vehículo.
Se implantan células tumorales o fragmentos de
forma subcutánea en el Día 0. El vehículo y/o los compuestos se
administran p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. de acuerdo con un
programa predeterminado comenzando en un momento, habitualmente en
el Día 1, antes de la capacidad para medir la carga tumoral. Se
registran los pesos corporales y las medidas de tumor
2-3 veces a la semana. Se calcula el peso corporal y
tumoral neto medio para cada día de recogida de datos. La eficacia
anti-tumoral puede determinarse inicialmente
comprando el tamaño de los tumores tratados (T) y de control (C) en
un día dado por un ensayo t de Student, después se compara la
varianza entre grupos por un ensayo F, con significancia
determinada a p \leq 0,05. El experimento también puede
continuarse pasado el final de la dosificación en cuyo caso las
medidas del tumor continuarían registrándose par controlar el
retardo del crecimiento tumoral. Los retardos del crecimiento
tumoral se expresan como la diferencia en el tiempo medio para que
los grupos tratados y de control obtengan un tamaño predeterminado
dividido por el tiempo medio para que el grupo de control obtenga
ese tamaño. Los retardos de crecimiento se comparan generando
curvas de Kaplan-Meier a partir de los tiempos para
que los tumores individuales obtengan el tamaño de evaluación. La
significancia es p \leq 0,05.
Se inyectan células tumorales de forma
intraperitoneal o de forma intracraneal en el Día 0. Los compuestos
se administran p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. de acuerdo con un
programa predeterminado comenzando en el Día 1. Se registran
observaciones de morbilidad y/o mortalidad dos veces al día. Se
miden y registran los pesos corporales dos veces a la semana. Los
datos de morbilidad/mortalidad se expresan en términos del tiempo
medio de supervivencia y la cantidad de supervivientes a largo
plazo se indica por separado. Se usan los tiempos de supervivencia
para generar curvas de Kaplan-Meier. La
significancia es p \leq 0,05 por un ensayo de rango logarítmico
en comparación con el grupo de control en el experimento.
Se implantan células tumorales o fragmentos de
forma subcutánea y se hacen crecer al tamaño deseado para que
comience el tratamiento. Una vez en el intervalo de tamaño
predeterminado, se aleatorizan los ratones en grupos de
tratamiento. Los compuestos se administran p.o., i.p., i.v., i.m., o
s.c. de acuerdo con un programa predeterminado. Se miden y
registran los pesos tumorales y corporales 2-3 veces
a la semana. Se hacen gráficos de los pesos tumorales medios de
todos los grupos en los días después de la inoculación para
comparación. Se realiza un ensayo F para determinar si la varianza
es igual o diferente seguido de un ensayo t de Student para comparar
los tamaños tumorales en los grupos tratados y de control al final
del tratamiento. La significancia es p \leq 0,05 en comparación
con el grupo de control. Las medidas tumorales se pueden registrar
después de que se haya detenido la dosificación para controlar el
retardo de crecimiento tumoral. Los retardos de crecimiento tumoral
se expresan como la diferencia en el tiempo medio para que los
grupos tratados y de control obtengan un tamaño predeterminado
dividido por el tiempo medio para que el grupo de control obtenga
ese tamaño. Los retardos en el crecimiento se comparan generando
curvas de Kaplan-Meier a partir de los tiempos para
que los tumores individuales obtengan el tamaño de evaluación. La
significancia es el valor p \leq 0,05 en comparación con el grupo
de control tratado con vehículo.
Se implantan células tumorales o fragmentos, de
origen de adenocarcinoma mamario, directamente en una almohadilla
de grasa mamaria quirúrgicamente expuesta y reflejada en roedores.
La almohadilla de grasa se coloca de nuevo en su posición original
y se cierra el sitio quirúrgico. También pueden administrarse
hormonas a los roedores para apoyar el crecimiento de los tumores.
Los compuestos se administran p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. de
acuerdo con un programa predeterminado. Se miden y registran los
pesos tumorales y corporales 2-3 veces a la semana.
Se hacen gráficos de los pesos tumorales medios de todos los grupos
en los días después de la inoculación para comparación. Se realiza
un ensayo F para determinar si la varianza es igual o diferente
seguido de un ensayo t de Student para comparar tamaños tumorales
en los grupos tratados y de control al final de tratamiento. La
significancia es p \leq 0,05 en comparación con el grupo de
control.
Las medidas tumorales pueden registrarse después
de que se haya detenido la dosificación para controlar el retardo
del crecimiento tumoral. Los retardos del crecimiento tumoral se
expresan como la diferencia en el tiempo medio para que los grupos
tratados y de control obtengan un tamaño predeterminado dividido por
el tiempo medio para que el grupo de control obtenga ese tamaño.
Los retardos en el crecimiento se comparan generando curvas de
Kaplan-Meier a partir de los tiempos para que los
tumores individuales obtengan el tamaño de evaluación. La
significancia es el valor p \leq 0,05 en comparación con el grupo
de control tratado con vehículo. Además, este modelo proporciona
una oportunidad de aumentar el índice de metástasis espontánea de
este tipo de tumor. La metástasis puede evaluarse al terminar el
estudio contando la cantidad de focos visibles por órgano diana, o
midiendo el peso del órgano diana. Las medias de estos criterios de
valoración se comparan por ensayo t de Student después de realizar
un ensayo F, con significancia determinada a p \leq 0,05 en
comparación con el grupo de control en el experimento.
Se implantan células tumorales o fragmentos, de
origen de adenocarcinoma prostático, directamente en un lóbulo
quirúrgicamente expuesto de la próstata en roedores. La próstata se
externaliza a través de una incisión abdominal de modo que pueda
implantarse el tumor específicamente en el lóbulo dorsal verificando
que el implante no entra en las vesículas seminales. La próstata
inoculada satisfactoriamente se reemplaza en el abdomen y se
cierran las incisiones a través del abdomen y la piel. También
pueden administrarse hormonas a los roedores para apoyar el
crecimiento de los tumores. Los compuestos se administran p.o.,
i.p., i.v., i.m., o s.c. de acuerdo con un programa predeterminado.
Se miden y registran los pesos corporales 2-3 veces
a la semana. En un momento predeterminado, se termina el
experimento y se disecciona al animal. Se mide el tamaño del tumor
primario en tres dimensiones usando un calibre o un micrómetro
ocular unido a un endoscopio de disección. Se realiza un ensayo F
para determinar si la varianza es igual o diferente seguido de un
ensayo t de Student para comparar tamaños tumorales en los grupos
tratados y de control al final del tratamiento. La significancia es
p \leq 0,05 en comparación con el grupo de control. Este modelo
proporciona una oportunidad de aumentar el índice de metástasis
espontánea de este tipo de tumor. La metástasis puede evaluarse al
terminar el estudio contando la cantidad de focos visibles por
órgano diana (es decir, los pulmones), o midiendo el peso del órgano
diana (es decir, los ganglios linfáticos regionales). Las medias de
estos criterios de valoración se comparan por ensayo t de Student
después de realizar un ensayo F, con significancia determinada a p
\leq 0,05 en comparación con el grupo de control en el
experimento.
Pueden implantarse células tumorales de origen
pulmonar de forma intrabronquial haciendo una incisión a través de
la piel y exponiendo la tráquea. Se perfora la tráquea con el
extremo biselado de una aguja de calibre 25 y se inoculan las
células tumorales en el bronquio principal usando una aguja de
calibre 27 de extremo plano con un recodo de 90º. Los compuestos se
administran p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. de acuerdo con un
programa predeterminado. Se miden y registran los pesos corporales
2-3 veces a la semana. En un momento predeterminado,
se termina el experimento y se disecciona al animal. Se mide el
tamaño del tumor primario en tres dimensiones usando un calibre o
un micrómetro ocular unido a un endoscopio de disección. Se realiza
un ensayo F para determinar si la varianza es igual o diferente
seguido de un ensayo t de Student para comparar tamaños tumorales en
los grupos tratados y de control al final del tratamiento. La
significancia es p \leq 0,05 en comparación con el grupo de
control. Este modelo proporciona una oportunidad de aumentar el
índice de metástasis espontánea de este tipo de tumor. La
metástasis puede evaluarse al terminar el estudio contando la
cantidad de focos visibles por órgano diana (es decir, el pulmón
contralateral), o midiendo el peso del órgano diana. Las medias de
estos criterios de valoración se comparan por ensayo t de Student
después de realizar un ensayo F, con significancia determinada a p
\leq 0,05 en comparación con el grupo de control en el
experimento.
Pueden implantarse células tumorales de origen
gastrointestinal de forma intracecal haciendo una incisión
abdominal a través de la piel y externalizando el intestino. Las
células tumorales se inoculan en la pared del ciego sin penetrar en
la luz del intestino usando una aguja de calibre 27 ó 30. Los
compuestos se administran p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. de acuerdo
con un programa predeterminado. Se miden y registran los pesos
corporales 2-3 veces a la semana. En un momento
predeterminado, se termina el experimento y se disecciona al animal.
Se mide el tamaño del tumor primario en tres dimensiones usando un
calibre o un micrómetro ocular unido a un endoscopio de disección.
Se realiza un ensayo F para determinar si la varianza es igual o
diferente seguido de un ensayo t de Student para comparar tamaños
tumorales en los grupos tratados y de control al final de
tratamiento. La significancia es p \leq 0,05 en comparación con el
grupo de control. Este modelo proporciona una oportunidad de
aumentar el índice de metástasis espontánea de este tipo de tumor.
La metástasis puede evaluarse al terminar el estudio contando la
cantidad de focos visibles por órgano diana (es decir, el hígado),
o midiendo el peso del órgano diana. Las medias de estos criterios
de valoración se comparan por ensayo t de Student después de
realizar un ensayo F, con significancia determinada a p \leq 0,05
en comparación con el grupo de control en el experimento.
Se inoculan s.c. células tumorales y se permite
que los tumores crezcan a un intervalo predeterminado para estudios
de metástasis espontánea en el pulmón o el hígado. Después se
escinden estos tumores primarios. Los compuestos se administran
p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. de acuerdo con un programa
predeterminado que puede incluir el periodo preparatorio de la
escisión del tumor primario para evaluar terapias dirigidas a
inhibir las fases tempranas de la metástasis tumoral. Se registran
diariamente las observaciones de morbilidad y/o mortalidad. Se
miden y registran los pesos corporales dos veces a la semana. Los
criterios de valoración potenciales incluyen tiempo de
supervivencia, cantidades de focos visibles por órgano diana, o peso
del órgano diana. Cuando se usa el tiempo de supervivencia como
criterio de valoración no se determinan los otros valores. Se usan
los datos de supervivencia para generar curvas de
Kaplan-Meier. La significancia es p \leq 0,05 por
un ensayo de rango logarítmico en comparación con el grupo de
control en el experimento. La cantidad media de focos tumorales
visibles, determinada bajo un microscopio de disección, y los pesos
medios del órgano diana se comparan por ensayo t de Student después
de realizar un ensayo F, con significancia determinada a p \leq
0,05 en comparación con el grupo de control en el experimento para
estos dos criterios de valoración.
Se inyectan células tumorales en la vena de la
cola, vena portal, o el ventrículo izquierdo del corazón en
estudios de metástasis experimental (forzada) de pulmón, hígado, y
hueso, respectivamente. Los compuestos se administran p.o., i.p.,
i.v., i.m., o s.c. de acuerdo con un programa predeterminado. Se
registran diariamente las observaciones de morbilidad y/o
mortalidad. Se miden y registran los pesos corporales dos veces a la
semana. Los criterios de valoración potenciales incluyen tiempo de
supervivencia, cantidades de focos visibles por órgano diana, o
peso del órgano diana. Cuando se usa el tiempo de supervivencia como
criterio de valoración no se determinan los otros valores. Se usan
los datos de supervivencia para generar curvas de
Kaplan-Meier. La significancia es p \leq 0,05 por
un ensayo de rango logarítmico en comparación con el grupo de
control en el experimento. La cantidad media de focos tumorales
visibles, determinada bajo un microscopio de disección, y los pesos
medios del órgano diana se comparan por ensayo t de Student después
de realizar un ensayo F, con significancia a p \leq 0,05 en
comparación con el grupo de control tratado con vehículo en el
experimento para los dos criterios de valoración.
Ejemplo
9
El dolor agudo se mide en una placa caliente
principalmente en ratas. Se usan dos variantes del ensayo de placa
caliente: En la variante clásica los animales se ponen en una
superficie caliente (52 a 56ºC) y se mide el tiempo de lantencia
hasta que los animales muestran un comportamiento de autodefensa,
tal como caminar o lamerse la pata. La otra variante es una placa
caliente de temperatura creciente en la que se ponen los animales
experimentales en una superficie de temperatura neutra.
Posteriormente esta superficie se calienta lentamente pero
constantemente hasta que los animales comienzan a lamerse las patas
traseras. La temperatura que se alcanza cuando comienzan a lamerse
las patas traseras es una medida del umbral de dolor.
Los compuestos se ensayan frente a un grupo de
control tratado con vehículo. La aplicación de sustancia se realiza
en diferentes momentos puntuales por diferentes vías de aplicación
(i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.c., intradérmica, transdérmica)
antes del ensayo de dolor.
El dolor persistente se mide con el ensayo de
formalina o capsaicina, principalmente en ratas. Se inyecta una
solución de formalina del 1 al 5% o 10 a 100 \mug de capsaicina en
una pata trasera del animal experimental. Después de la aplicación
de formalina o capsaicina los animales muestran reacciones de
autodefensa como estremecerse, lamerse y morderse la pata afectada.
La cantidad de reacciones de autodefensa en un tramo de tiempo de
hasta 90 minutos es una medida de la intensidad de dolor.
Los compuestos se ensayan frente a un grupo de
control tratado con vehículo. La aplicación de sustancia se realiza
en diferentes momentos puntuales por diferentes vías de aplicación
(i.v., i.p., p.o., i.t, i.c.v., s.c, intradérmica, transdérmica)
antes de la administración de formalina o capsaicina.
El dolor neuropático se induce por diferentes
variantes de lesión unilateral del nervio ciático en ratas. La
operación se realiza con anestesia. La primera variante de lesión
del nervio ciático se produce colocando ligaduras poco
constrictivas alrededor del nervio ciático común. La segunda
variante es el ligamiento apretado de aproximadamente la mitad del
diámetro del nervio ciático común. En la siguiente variante, se usa
un grupo de modelos en el que se hacen ligamientos apretados o
transecciones de los nervios espinales L5 y L6, o solamente el
nervio espinal L5. La cuarta variante implica una axotomía de dos de
las tres ramificaciones terminales del nervio ciático (nervios
tibial y peroneal común) dejando el nervio sural restante intacto
mientras que la última variante comprende la axotomía de solamente
la ramificación tibial dejando los nervios sural y común sin
lesionar. Los animales de control se tratan con una operación
simulada.
Después de la operación, los animales con el
nervio lesionado desarrollan alodinia mecánica crónica, alodinia al
frío, así como hiperalgesia térmica. La alodinia mecánica se mide
mediante un transductor de presión (Anestesiómetro electrónico de
von Frey, IITC Inc.-Life Science Instruments, Woodland Hills, SA,
USA; Sistema electrónico de von Frey, Somedic Sales AB, Horby,
Suecia). La hiperalgesia térmica se mide mediante una fuente de
calor radiante (Ensayo Plantar, Ugo Basile, Comerio, Italia), o
mediante una placa fría de 5 a 10ºC en la que se cuentan las
reacciones de autodefensa de la pata trasera afectada como una
medida de la intensidad de dolor. Un ensayo adicional para el dolor
inducido por frío es el recuento de reacciones de autodefensa, o
duración de las respuestas de autodefensa después de la
administración plantar de acetona a la extremidad trasera afectada.
El dolor crónico en general se evalúa registrando los ritmos
circadianos en actividad (Surjo y Arndt, Universität zu Koln,
Cologne, Alemania), y valorando las diferencias en la manera de
andar (patrones de huella de pisada; programa FOOTPRINTS, Klapdor y
col., 1997. A low cost method to analyze footprint patterns. J.
Neurosci. Methods 75, 49-54).
Los compuestos se ensayan frente a grupos de
control de operación simulada y tratados con vehículo. La aplicación
de sustancia se realiza en diferentes momentos puntuales por
diferentes vías de aplicación (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.c,
intradérmica, transdérmica) antes del ensayo de dolor.
El dolor inflamatorio se induce principalmente
en ratas por inyección de 0,75 mg de carragenina o adyuvante
completo de Freund en una pata trasera. Los animales desarrollan un
edema con alodinia mecánica así como hiperalgesia térmica. La
alodinia mecánica se mide mediante un transductor de presión
(Anestesiómetro electrónico de von Frey, IITC Inc.-Life Science
Instruments, Woodland Hills, SA, USA). La hiperalgesia térmica se
mide mediante una fuente de calor radiante (Ensayo Plantar, Ugo
Basile, Comerio, Italia, Estimulador térmico de las patas, G.
Ozaki, University of California, USA). Para la medida del edema se
están usando dos procedimientos. En el primer procedimiento, se
sacrifican los animales y se seccionan y pesan las patas traseras
afectadas. El segundo procedimiento comprende diferencias en el
volumen de la pata midiendo el desplazamiento de agua en un
pletismómetro (Ugo Basile, Comerio, Italia).
Los compuestos se ensayan frente a grupos de
control sin inflamación así como tratados con vehículo. La
aplicación de sustancia se realiza en diferentes momentos puntuales
por diferentes vías de aplicación (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v.,
s.c, intradérmica, transdérmica) antes del ensayo de dolor.
Las ratas tratadas con una única inyección
intraperitoneal de 50 a 80 mg/kg de estreptozotocina desarrollan
una hiperglucemia profunda y alodinia mecánica en 1 a 3 semanas. La
alodinia mecánica se mide mediante un transductor de presión
(Anestesiómetro electrónico de von Frey, IITC Inc.-Life Science
Instruments, Woodland Hills, SA, USA).
Los compuestos se ensayan frente a grupos de
control diabéticos y no diabéticos tratados con vehículo. La
aplicación de sustancia se realiza en diferentes momentos puntuales
por diferentes vías de aplicación (i.v., i.p., p.o., i.t, i.c.v.,
s.c, intradérmica, transdérmica) antes del ensayo de dolor.
La degeneración de las vías dopaminérgicas
nigroestriada y estriadopalidal es el acontecimiento patológico
central en la enfermedad de Parkinson. Este trastorno se ha imitado
experimentalmente en ratas usando inyecciones estereotáxicas
unilaterales únicas/secuenciales de
6-OH-DA en el haz prosencefálico
medio (MFB).
Se usan ratas Wistar macho (Harlan Winkelmann,
Alemania), que pesan 200\pm250 g al inicio del experimento. Las
ratas se mantienen en un entorno de temperatura y humedad
controladas en un ciclo de 12 h luz/oscuridad con acceso libre a
alimento y agua cuando no están en sesiones experimentales. Los
siguientes protocolos in vivo están aprobados por las
autoridades gubernamentales. Se hacen todos los esfuerzos por
minimizar el sufrimiento de los animales, por reducir la cantidad
de animales usados, y por utilizar alternativas a técnicas in
vivo.
Se administra a los animales pargilina en el día
de la cirugía (Sigma, St. Louis, MO, USA; 50 mg/kg i.p.) para
inhibir el metabolismo de 6-OHDA por la monoamina
oxidasa y desmetilimipramina HCl (Sigma; 25 mg/kg i.p.) para evitar
la captación de 6-OHDA por terminales
noradrenérgicos. Treinta minutos después se anestesia a las ratas
con pentobarbital sódico (50 mg/kg) y se colocan en un tramo
estereotáxico. Para lesionar la vía DA nigroestriada se inyectan 4
\mul de ácido ascórbico al 0,01%-solución salina que contiene 8
\mug de 6-OHDA HBr (Sigma) en el haz
prosencefálico medial izquierdo a un índice de 1 \mul/min (2,4 mm
anterior, 1,49 mm lateral, -2,7 mm ventral al Bregma y la
superficie del cráneo). La aguja se deja en el sitio 5 min más para
permitir que suceda la difu-
sión.
sión.
Se evalúa la aquinesia de las extremidades
anteriores tres semanas después de la colocación de la lesión usando
un protocolo de ensayo de pasos modificado. En resumen, los
animales se mantienen por el experimentador con una mano fijando
las extremidades posteriores y elevando ligeramente la parte trasera
por encima de la superficie. Una pata está tocando la mesa, y
después se mueve lentamente de lado (5 s durante 1 m), primero en la
dirección a derechas y después a la inversa. Se cuenta la cantidad
de pasos de ajuste para ambas patas en la dirección inversa y a
derechas de movimiento. La secuencia del ensayo es la pata derecha a
derechas y a la inversa ajustando los pasos, seguido de la pata
izquierda a derechas y a la inversa. El ensayo se repite tres veces
en tres días consecutivos, después de un periodo inicial de
entrenamiento de tres días antes del primer ensayo. Los pasos de
ajuste a derechas revelan diferencias no consistentes entre los
animales lesionados y sanos de control. Por lo tanto el análisis se
restringe a los pasos ajustados en la dirección inversa.
También se miden los ajustes de equilibrio
después de una estimulación postural durante las sesiones de ensayo
de pasos. Las ratas se mantienen en la misma posición descrita en el
ensayo de pasos y, en lugar de moverse de lado, se inclinan por el
experimentador hacia el lateral de la pata que está tocando la mesa.
Esta maniobra provoca una pérdida de equilibrio y se registra la
capacidad de las ratas de volver a conseguir el equilibrio por
movimientos de las extremidades anteriores en una escala que varía
de 0 a 3. Se da un valor 0 para una colocación normal de la
extremidad anterior. Cuando el movimiento de la extremidad anterior
se retarda pero se detecta una recuperación del equilibrio
postural, se da un valor 1. El valor 2 representa una clara reacción
de la extremidad anterior, pero insuficiente, como se evidencia por
la contracción del músculo, pero que carece de éxito para recuperar
el equilibrio, y el valor 3 se da sin reacción de movimiento. El
ensayo se repite tres veces al día para cada lateral durante tres
días consecutivos después de un periodo inicial de entrenamiento de
tres días antes del primer ensayo.
Se usa una versión modificada del ensayo de
escalera para la evaluación del comportamiento de alargamiento de
la pata tres semanas después de la colocación de la lesión primaria
y secundaria. Se usan cajas de ensayo de Plexiglass con una
plataforma central y una escalera móvil en cada lateral. El aparato
está diseñado de tal modo que pueda usarse la pata del mismo
lateral en cada escalera, proporcionado de este modo una medida del
uso independiente de las patas anteriores. Para cada ensayo, se
dejan los animales en las cajas de ensayo durante 15 min. La doble
escalera se carga con 7 x 3 gránulos de pienso (gránulos de pienso
Precision, fórmula: P, dieta de roedores purificada, tamaño de 45
mg; Sandown Scientific) en cada lado. Después de cada ensayo se
cuentan por separado la cantidad de gránulos comidos (gránulos
retirados con éxito) y la cantidad de gránulos cogidos (tocados
pero caídos) para cada pata y el índice de éxito (gránulos
comidos/gránulos cogidos). Después de tres días de privación de
alimento (12 g por animal por día) se ensayan los animales durante
11 días. Se realiza un análisis completo solamente durante los
últimos cinco
días.
días.
La neurotoxina
1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidro-piridina
(MPTP) causa degeneración de las neuronas dopaminérgicas
mesencefálicas (DAérgicas) en roedores, primates no humanos, y seres
humanos y, al hacerlo, reproduce muchos de los síntomas de la
enfermedad de Parkinson. MPTP conduce a una disminución marcada en
los niveles de dopamina y sus metabolitos, y en la cantidad de
terminales dopaminérgicos en el estriado así como grave pérdida de
los cuerpos celulares inmunorreactivos a la tirosina hidroxilasa
(TH) en la sustancia negra, parte compacta.
Para obtener lesiones graves y de larga
duración, y para reducir la mortalidad, los animales reciben
inyecciones únicas de MPTP, y después se ensayan para la gravedad
de la lesión 7-10 días después. Las inyecciones
sucesivas de MPTP se administran en los días 1, 2 y 3. Los animales
reciben una aplicación de 4 mg/kg de clorhidrato de MPTP (Sigma) en
solución salina una vez al día. Todas las inyecciones son
intraperitoneales (i.p.) y la solución madre de MPTP se congela
entre las inyecciones. Los animales se decapitan en el día 11.
Al completarse los experimentos de
comportamiento, se anestesia a todos los animales con 3 ml de
tiopental (1 g/40 ml i.p., Tyrol Pharma). Los ratones se prefunden
de forma transcardiaca con PBS 0,01 M (pH 7,4) durante 2 min,
seguido de paraformaldehído al 4% (Merck) en PBS durante 15 min. Los
cerebros se retiran y se colocan en paraformaldehído al 4% durante
24 h a 4ºC. Para la deshidratación después se transfieren a una
solución de sacarosa al 20% (Merck) en PBS 0,1 M a 4ºC hasta que se
hunden. Los cerebros se congelan en metilbutano a -20ºC durante 2
min y se almacenan a -70ºC. Usando un micrótomo manual (mod.
3800-Frigocut, Leica), se toman secciones de 25
\mum desde el genu del cuerpo calloso (AP 1,7 mm) hasta el
hipocampo (AP 21,8 mm) y desde AP 24,16 hasta AP 26,72. Se cortan
cuarenta y seis secciones y se almacenan en cajas clasificadoras en
tampón Tris 0,25 M (pH 7,4) para inmunohistoquímica.
Se procesa una serie de secciones para
inmunohistoquímica de tirosina hidroxilasa (TH) de flotación libre.
Después de tres aclarados en PBS 0,1 M, se inactiva la actividad
peroxidasa endógena durante 10 min en H_{2}O_{2} al 0,3%\pm
PBS. Después de aclarar en PBS, se preincuban las secciones en suero
bovino normal al 10% (Sigma) durante 5 min como agente de bloqueo y
se transfieren a antisuero de conejo primario
anti-TH de rata (dilución 1:2000).
Después de incubación durante una noche a
temperatura ambiente, se aclaran las secciones para la
inmunorreactividad a TH en PBS (2 x 10 min) y se incuban en
anticuerpo anti-inmunoglobulina G de conejo
biotinilado producido en cabra (dilución 1:200) (Vector) durante 90
min, se aclaran repetidamente y se transfieren a solución Vectastain
ABC (Vector) durante 1 h. El tetraclorhidrato de
3,3'-diaminobencidina (DAB; Sigma) en PBS 0,1 M,
suplementado con H_{2}O_{2} al 0,005%, sirve como cromógeno en
la posterior reacción de visualización. Las secciones se montan en
portaobjetos revestidos de gelatina, se dejan secar durante una
noche, se tiñen con contraste con hematoxilina deshidratada en
concentraciones ascendentes de alcohol y se aclaran en butilacetato.
Se montan los cubreobjetos en entellan.
Se usa una modificación del procedimiento
descrito por Rozas y Labandeira-García (1997), con
un sistema CR-1 Rotamex (Columbus Instruments,
Columbus, OH) que comprende un ordenador personal
IBM-compatible, una tarjeta de adquisición de datos
CIO-24, una unidad de control, y una unidad de
varilla rotatoria de cuatro carriles. La unidad de varilla
rotatoria consta de un eje rotatorio (diámetro 7,3 cm) y
compartimientos individuales para cada ratón. El software del
sistema permite preprogramar los protocolos de sesión con
velocidades de rotación variables (0-80 rpm). Se
usan rayos infrarrojos para detectar cuándo cae un ratón en la
rejilla de la base por debajo de la varilla rotatoria. El sistema
registra la caída como el final del experimento para ese ratón, y
se registra el tiempo total en la varilla rotatoria, así como el
momento de la caída y todos los parámetros establecidos. El sistema
también permite que pase una corriente débil a través de la rejilla
de la base, para ayudar al entrenamiento.
La tarea de reconocimiento de objeto se ha
diseñado para evaluar los efectos de las manipulaciones
experimentales en el rendimiento cognitivo de roedores. Se coloca
una rata en un campo abierto, en el que están presentes dos objetos
idénticos. Las ratas inspeccionan ambos objetos durante el primer
ensayo de la tarea de reconocimiento de un objeto. En un segundo
ensayo, después de un intervalo de retención de por ejemplo 24
horas, uno de los dos objetos usados en el primer ensayo, el objeto
"familiar", y un nuevo objeto se colocan en el campo abierto.
Se registra el tiempo de inspección en cada uno de los objetos. Las
medidas básicas en las tareas OR es el tiempo usado por una rata en
explorar los dos objetos en el segundo ensayo. La buena retención se
refleja por tiempos de exploración mayores en el objeto nuevo que
en el "familiar".
La administración de un potenciador de la
cognición putativo antes del primer ensayo permite predominantemente
la evaluación de los efectos en la adquisición, y finalmente en los
procesos de consolidación. La administración del compuesto de
ensayo después del primer ensayo permite evaluar los efectos en los
procesos de consolidación, mientras que la administración antes del
segundo ensayo permite medir los efectos en los procesos de
recuperación.
La tarea de evitación pasiva evalúa el
rendimiento de la memoria en ratas y ratones. El aparato de
evitación inhibidora consta de una caja con dos compartimientos con
un compartimiento iluminado y un compartimiento oscuro. Los dos
compartimientos están separados por una puerta de guillotina que
puede accionarse por el experimentador. Un umbral de 2 cm separa
los dos compartimientos cuando se levanta la puerta de guillotina.
Cuando la puerta está abierta, la iluminación en el compartimiento
oscuro es de aproximadamente 2 lux. La intensidad de la luz es de
aproximadamente 500 lux en el centro del suelo del compartimiento
iluminado.
Se dan dos sesiones de habituación, una sesión
de choque, y una sesión de retención, separadas por intervalos
entre las sesiones de 24 horas. En las sesiones de habituación y la
sesión de retención se deja que la rata explore el aparato durante
300 segundos. La rata se coloca en el compartimiento iluminado,
mirando hacia la pared opuesta a la puerta de guillotina. Después
de un periodo de acomodación de 15 segundos se abre la puerta de
guillotina de modo que puedan visitarse libremente todas las partes
del aparato. Las ratas normalmente evitan las áreas brillantemente
encendidas y entrarán en el compartimiento oscuro en unos pocos
segundos.
En la sesión de choque se baja la puerta de
guillotina entre los compartimientos en cuanto la rata ha entrado
en el compartimiento oscuro con sus cuatro patas, y se administra un
calambre a las patas de 1 mA de subida durante 2 segundos. Se
retira la rata del aparato y se pone de nuevo en su jaula. El
procedimiento durante la sesión de retención es idéntico al de las
sesiones de habituación.
La latencia de cruce, que es la primera latencia
hasta entrar en el compartimiento oscuro (en segundos) durante la
sesión de retención es un índice del rendimiento de la memoria del
animal; cuanto más larga sea la latencia hasta entrar en el
compartimiento oscuro, mejor es la retención. Se da un compuesto de
ensayo media hora antes de la sesión de choque, junto con 1
mg*kg^{-1} de escopolamina. La escopolamina altera el rendimiento
de la memoria durante la sesión de retención 24 horas después. Si
el compuesto de ensayo aumenta la latencia de entrada en
comparación con los controles tratados con escopolamina,
probablemente tenga potencial de potenciación de la cognición.
La tarea de escape de agua de Morris mide la
orientación espacial que se aprende en roedores. Es un sistema de
ensayo que se ha usado ampliamente para investigar los efectos de un
compuesto terapéutico putativo en las funciones cognitivas de ratas
y ratones. El rendimiento de un animal se evalúa en un tanque de
agua circular con una plataforma de escape que está sumergida
aproximadamente 1 cm por debajo de la superficie del agua. La
plataforma de escape no está visible para un animal que nada en el
tanque de agua. Se proporcionan abundantes indicaciones de
laberinto adicionales por los muebles de la habitación, incluyendo
escritorios, equipo informático, un segundo tanque de agua, la
presencia del experimentador, y por una radio en un estante que
suena suavemente.
Los animales reciben cuatro ensayos durante
cinco sesiones diarias de adquisición. Un ensayo se inicia colocando
un animal en la piscina, mirando hacia la pared del tanque. Se usa
cada una de las cuatro posiciones de partida en los cuadrantes
norte, este, sur, y oeste una vez en una serie de cuatro ensayos; su
orden es aleatorio. La plataforma de escape siempre está en la
misma posición. Un ensayo se termina en cuanto el animal ha trepado
a la plataforma de escape o cuando han pasado 90 segundos, el
acontecimiento que suceda primero. Se permite que el animal
permanezca en la plataforma durante 30 segundos. Después se coge de
la plataforma y se inicia el siguiente ensayo. Si un animal no
encuentra la plataforma en 90 segundos, lo pone en la plataforma el
experimentador y se permite que permanezca allí durante 30
segundos. Después del cuarto ensayo de la quinta sesión diaria, se
da un ensayo adicional como un ensayo de sonda: se retira la
plataforma, y se mide el tiempo que usa el animal en los cuatro
cuadrantes durante 30 ó 60 segundos. En el ensayo de sonda, todos
los animales comienzan desde la misma posición de partida, opuesta
al cuadrante donde se había colocado la plataforma de escape durante
la adquisición.
Se toman cuatro medidas diferentes para evaluar
el rendimiento de un animal durante el entrenamiento de adquisición:
latencia de escape, distancia recorrida, distancia hasta la
plataforma, y velocidad de nado. Se evalúan las siguientes medidas
para el ensayo de sonda: tiempo (s) en los cuadrantes y distancia
recorrida (cm) en los cuatro cuadrantes. El ensayo de sonda
proporciona información adicional sobre cómo de bien aprende un
animal la posición de la plataforma de escape. Si un animal usa más
tiempo y nada una mayor distancia en el cuadrante donde se había
colocado la plataforma durante las sesiones de adquisición que en
cualquier otro cuadrante, se concluye que se había aprendido bien
la posición de la plataforma.
Para evaluar los efectos de los compuestos
potenciadores de la cognición putativos, se usan ratas o ratones
con lesiones cerebrales específicas que alteran las funciones
cognitivas, o animales tratados con compuestos tales como
escopolamina o MK-801, que impiden el aprendizaje
normal, o animales ancianos que sufren déficit cognitivos.
La tarea de alternancia espontánea en un
laberinto en T (TeMCAT) evalúa el rendimiento de la memoria espacial
en ratones. El brazo de partida y los dos brazos objetivo del
laberinto en T están provistos con puertas de guillotina que pueden
accionarse manualmente por el experimentador. Se pone un ratón en el
brazo de partida al inicio del entrenamiento. La puerta de
guillotina está cerrada. En el primer ensayo, el "ensayo
forzado", el brazo objetivo izquierdo o derecho se bloquean
bajando la puerta de guillotina. Después de que se haya liberado el
ratón desde el brazo de partida, sorteará el laberinto, finalmente
entrará en el brazo objetivo abierto, y volverá a la posición de
partida, donde se confinará durante 5 segundos, bajando la puerta de
guillotina. Después, el animal puede elegir libremente entre el
brazo objetivo izquierdo y derecho (todas las puertas de guillotina
abiertas) durante los 14 ensayos de "elección libre". En cuanto
el ratón ha entrado en un brazo objetivo, se cierra el otro. El
ratón finalmente vuelve al brazo de partida y es libre de visitar
cualquiera de los brazos objetivo que quiera después de haber
estado confinado en el brazo de partida durante 5 segundos. Después
de completarse 14 ensayos de elección libre en una sesión, se retira
al animal del laberinto. Durante el entrenamiento, nunca se maneja
al animal.
Se calcula el porcentaje de alternancia de los
14 ensayos. Se analiza este porcentaje y el tiempo total necesario
para completar el primer ensayo forzado y los posteriores 14 ensayos
de elección libre (en s). Habitualmente se inducen déficit
cognitivos por una inyección de escopolamina, 30 min antes del
inicio de la sesión de entrenamiento. La escopolamina redujo el
porcentaje de alternancia al nivel de probabilidad, o por debajo. Un
potenciador de la cognición, que se administra siempre antes de la
sesión de entrenamiento, antagonizará al menos parcialmente la
reducción en el índice de alternancia espontánea inducida por
escopolamina.
Ejemplo
10
El ARN total usado para el análisis cuantitativo
Taqman se adquirió (Clontech, CA) o se extrajo de los tejidos
usando reactivo TRIzol (Life Technologies, MD) de acuerdo con un
protocolo modificado del vendedor que utiliza el protocolo Rneasy
(Qiagen, CA).
Se trataron cien \mug de cada ARN con ADNasa I
usando ADNasa libre de ARNasa (Qiagen, CA) para su uso con columnas
RNeasy o QiaAmp.
Después de elución y cuantificación con
Ribogreen (Molecular Probes Inc., OR), se transcribió de forma
inversa cada muestra usando el Sistema de Síntesis de la Primera
Cadena GibcoBRL Superscript II para RT-PCR de
acuerdo con el protocolo del vendedor (Life Technologies, MD). La
concentración final de ARN en la mezcla de reacción era 50
ng/\mul. La transcripción inversa se realizó con 50 ng de
hexámeros aleatorios.
Se diseñaron cebadores y sonda específicos de
acuerdo con las recomendaciones del programa Primer Express de PE
Applied Biosystems y se enumeran a continuación:
cebador directo:
\hskip0.3cm5'-(CTGTGACCTGAAGTCGGACAAC)-3'
cebador inverso:
\hskip0.3cm5'-(GGAATGACTGCCTCGAAATCC)-3'
sonda: SYBR Green
Se realizaron experimentos de cuantificación en
25 ng de ARN transcrito de forma inversa a partir de cada muestra.
Se midió el ARN ribosómico 18S como un control usando los Reactivos
de Ensayo TaqMan Pre-Desarrollados (PDAR) (PE
Applied Biosystems, CA). La mezcla de reacción de ensayo fue la
siguiente:
\hskip1.8cm
El experimento se realizó en un Detector de
Secuencia ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, CA). Al final de
la realización, se procesaron los datos de fluorescencia adquiridos
durante la PCR como se describe en el manual del usuario de ABI
Prism 7700. Se calculó la cantidad de cambios usando el
procedimiento delta-delta CT con normalización a
los valores de 18S. Se calculó la expresión relativa normalizando a
18s (D Ct), después haciendo del tejido de expresión mayor 100 y
todo lo demás con relación a ello. La conversión de la cantidad de
copias se realizó sin normalización usando la fórmula
Cn=10(Ct-40,007)/-3,623.
Los resultados se muestran en las Figuras 13,
14, 15 y 16.
La expresión de proteína tipo proteína quinasa
en tejido adiposo y músculo esquelético podía regularse para
aumentar la sensibilidad a insulina.
1. Protein kinases 6. The eukaryotic protein
kinase superfamily: kinase (catalytic) domain structure and
classification. FASEB J 1995 May;
9(8):576-96.
2. Protein kinase catalytic domain sequence
database: identification of conserved features of primary structure
and classification of family members. Methods Enzymol
1991; 200:38-62.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Bayer AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> REGULACIÓN DE PROTEÍNA TIPO PROTEÍNA
QUINASA HUMANA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> LIO312 Países Extranjeros
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/276.055
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
16-03-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/324.053
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
24-09-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/326.458
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
03-10-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/337.124
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
10-12-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 858
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 286
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 473
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 454
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1066
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 471
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (452) . . (452)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=a, c, g o t
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5475
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4216
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtgacctg aagtcggaca ac
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaatgactg cctcgaaatc c
\hfill21
Claims (1)
1. Un procedimiento para seleccionar agentes
útiles en el tratamiento de la diabetes que disminuyan la actividad
de una proteína tipo proteína quinasa, que comprende las etapas
de:
(a) poner en contacto un compuesto de ensayo con
una proteína tipo proteína quinasa que comprende una secuencia
polipeptídica definida por la SEC ID Nº 9; y
(b) detectar una actividad de la proteína tipo
proteína quinasa del polipéptido,
en el que un compuesto de ensayo
que disminuye la actividad de la proteína tipo proteína quinasa del
polipéptido se identifica como un agente terapéutico potencial para
disminuir la actividad de la proteína tipo proteína
quinasa.
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