ES2272558T3 - Inhibidores del proteasoma para el tratamiento de infecciones causadas por virus de la hepatitis. - Google Patents

Inhibidores del proteasoma para el tratamiento de infecciones causadas por virus de la hepatitis. Download PDF

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Abstract

Uso de inhibidores del proteasoma para la preparación de un agente para inhibir la liberación, maduración y replicación de un virus de la hepatitis.

Description

Inhibidores del proteasoma para el tratamiento de infecciones causadas por virus de la hepatitis.
La invención se refiere a agentes para el tratamiento de infecciones causadas por virus de la hepatitis. Son objeto de la invención agentes que como principio activo contienen inhibidores del proteasoma para inhibir la liberación, la maduración, la capacidad infecciosa y, por lo tanto, la replicación de los virus de la hepatitis.
Estos agentes también se pueden usar para el tratamiento, la terapia y la inhibición de una hepatitis vírica. Se demuestra que las aplicaciones de estos agentes producen la liberación de virus de la hepatitis no infecciosos por parte de las células infectadas. Por lo tanto, estos agentes pueden limitar la propagación de una infección aguda causada por virus de la hepatitis. Además, los agentes son menos tóxicos para hepatocitos no proliferativos que para células no parenquimatosas del hígado y células de carcinoma de hígado. Por lo tanto, estos agentes son adecuados para la destrucción preferente de células de carcinoma de hígado en pacientes y animales infectados con HBV (virus de la hepatitis B, véase el índice de abreviaturas que sigue a los ejemplos) y HCV (virus de la hepatitis C). En el caso de los agentes se trata de diferentes clases de sustancias que tienen en común que inhiben el sistema de ubiquitina/proteasoma. En particular, estos agentes se caracterizan porque estas sustancias, los inhibidores del proteasoma, inhiben la actividad de la proteasa celular principal, es decir, el proteasoma, en las células tratadas. En el ejemplo del virus de la hepatitis de pato, así como en el del virus de la hepatitis B humana, se demuestra que la administración de inhibidores del proteasoma reduce drásticamente la liberación de virus infecciosos de la hepatitis de pato y de la hepatitis B humana por parte de hepatocitos ya infectados (se demuestra en el ejemplo del virus de la hepatitis de pato). Los inhibidores del proteasoma, por lo tanto, pueden suprimir la viremia tanto en el caso de una reinfección como en el caso de infecciones crónicas causadas por virus de la hepatitis, y se puede aumentar la probabilidad de éxito de la eliminación del virus mediante el sistema inmunológico propio y/o mediante agentes conocidos con un efecto similar o diferente. Mediante el uso de estos agentes, los inhibidores del proteasoma, se pueden evitar, reducir o revertir las consecuencias de una infección causada por HBV y HCV, como, por ejemplo, daños hepáticos de diferentes grados de gravedad que pueden llegar hasta hepatitis fulminantes, a menudo mortales, desarrollo de una cirrosis hepática/fibrosis y de un carcinoma de hígado. Los campos de aplicación de estas invenciones son, por lo tanto, la terapia antiviral de infecciones causadas por virus de la hepatitis, en particular para evitar que se establezca y persista una infección aguda y crónica por HBV y HCV.
Características del estado de la técnica conocido 0. Introducción
Desde principios de los años 80, la pandemia del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (Aquired Immunodeficiency Syndrome, SIDA) ha confrontado a millones de personas infectadas por VIH con una enfermedad perniciosa, multisistémica y, al fin y al cabo, incurable hasta la fecha. Hasta este momento no se conoce ninguna estrategia eficaz para la vacunación contra el VIH, ni se pueden aplicar extensamente otros mecanismos de estimulación de la inmunidad natural, que sigue sin entenderse del todo, frente a una infección por VIH. Se usan diversos medicamentos antirretrovirales para el tratamiento de una infección por VIH ya establecida o para la protección contra una manifestación sistémica de una infección por VIH inmediatamente tras la entrada del virus. Éstos constituyen esencialmente sustancias que inhiben las enzimas víricas transcriptasa inversa (RT) y proteasa (PR). Además del problema de la baja tolerabilidad, la limitación principal de estos medicamentos radica en la enorme tasa de mutación del VIH, de hasta 10^{6} veces mayor (en comparación con la replicación del ADN humano). El consiguiente polimorfismo conduce inevitablemente y en un plazo relativamente corto a la aparición de mutantes de VIH que son resistentes a agentes terapéuticos anti-VIH individuales o incluso combinados, en especial a la terapia HAART (highly active antiretroviral therapy [terapia antirretroviral altamente activa], documento de patente WO 00/33654). El objetivo de la investigación futura del VIH consiste, pues, en identificar puntos de ataque celulares ("dianas") para una terapia antirretroviral. Éstos incluyen factores celulares, enzimas o mecanismos complejos esenciales para la replicación del VIH en la célula huésped que se puedan manipular selectivamente sin alterar considerablemente la vitalidad del organismo completo. Esta reivindicación la cumple la sorprendente observación que se describe en esta invención y que consiste en que los agentes, los inhibidores del proteasoma, inhiben procesos tardíos en la replicación del VIH-1 y VIH-2 y evitan de este modo la liberación y formación de virus descendientes infecciosos.
El documento WO 01/46448 da a conocer un procedimiento para el tratamiento de infecciones víricas causadas, entre otras cosas, por el citomegalovirus humano, el virus herpes simplex o también el virus de la varicella zoster, mediante el uso de Z-Leu-Leu-Z, E64d y otros inhibidores de proteasas. El documento EP-A-0652290 describe el uso de N-acetil-Leu-Leu-NorL y otros inhibidores peptídicos de la aldehído proteasa en el tratamiento de infecciones víricas (por ejemplo, SIDA) mediante la inhibición de serinproteasas similares a la quimotripsina. El documento US 6.083.903 da a conocer el uso de ésteres y ácidos bóricos MG-261 a MG-369 como inhibidores del proteasoma en el tratamiento del SIDA. El documento WO 00/33654 describe el uso del inhibidor del proteasoma ritonavir en la terapia HAART, entre otras, para el tratamiento del SIDA y de enfermedades concomitantes del SIDA. El documento WO 96/32105 da a conocer nuevos inhibidores del proteasoma que derivan estructuralmente de lactacisteína y lactacisteína-\beta-lactona y que se usan en el tratamiento de infecciones causadas por VIH, así como en el diagnóstico. Las publicaciones científicas Schubert y col., J. of Virology, 1998, pág. 2280-2288; Everett y col., EMBO Journal, 1998, pág. 7161-7169; así como Roger D. Everett, Trends in Biochemical Sciences, 1999, pág. 293-295, describen el papel del proteasoma en las infecciones víricas causadas por herpesvirus y en el SIDA. Además, Fujita y col., J. of General Virology, 1997, pág. 619-625, y Fine y col., J. of Neuroimmunology, 1999, pág. 55-64, señalan un posible papel de los inhibidores del proteasoma en el tratamiento de la demencia por VIH, así como su efecto en la descomposición de las células CD4-positivas infectadas por VIH.
La infección con virus de la hepatitis B (afecta a aproximadamente un 5% de la población mundial) y con virus de la hepatitis C (afecta a aproximadamente un 3% de la población mundial) se cuenta, junto con la problemática del VIH/SIDA, entre los grandes problemas de salud a nivel mundial. La consecuencia de las infecciones por HBV o HCV es con frecuencia un estado portador crónico del virus. Entre los síntomas de las infecciones se encuentran hepatitis de diferentes grados de gravedad que llegan hasta el fallo hepático (hepatitis fulminante), un mayor riesgo de desarrollo de una cirrosis hepática y de fibrosis, así como la generación de carcinomas de hígado. Mediante una inmunización profiláctica se pueden evitar reinfecciones con HBV de forma relativamente eficaz, aunque no por completo debido a la existencia de fallos vacunales y variantes que escapan a la inmunización. Hasta ahora no existe ninguna protección por vacunación contra una reinfección por HCV. Pese a los numerosos medicamentos disponibles para el tratamiento de una infección crónica causada por HCV y HBV, que adolecen todos ellos de efectos adversos y constan esencialmente de citocinas (interferón alfa y sus variantes) y análogos de nucleósidos, no es posible hasta ahora tratar satisfactoriamente a la mayoría de los portadores crónicos de HBV y HCV, puesto que los pacientes no responden a los medicamentos o se produce sólo una mejora a corto plazo y el virus en general no se puede eliminar por completo mediante el tratamiento. Tampoco la administración pasiva de anticuerpos neutralizantes específicos de HBV y/o de análogos de nucleósidos u otros medicamentos a pacientes con trasplante de hígado evita, generalmente, la reinfección del hígado trasplantado. La inmunosupresión de pacientes con hepatitis en remisión puede producir la reactivación de virus presentes de forma latente. El problema principal de los análogos de nucleósidos es la elevada tasa de mutación tanto del HBV como del HCV, por lo que durante el tratamiento se desarrollan cepas víricas resistentes a los medicamentos. Para resolver los problemas de los agentes terapéuticos y antivirales disponibles actualmente para las hepatitis B y C, se necesitan nuevas estrategias terapéuticas que, de forma similar a la terapia antirretroviral, influyan sobre factores celulares conservados, esenciales para la proliferación de estos virus en la célula huésped. En esta invención se describen agentes de este tipo. Se trata del sorprendente hallazgo de que los inhibidores del proteasoma también impiden, de forma similar a los efectos novedosos que ejercen sobre los retrovirus, la producción de virus de la hepatitis infecciosos e inducen simultáneamente la muerte de células de tumores hepáticos. Puesto que es posible transportarlos preferentemente al hígado, estos agentes, los inhibidores del proteasoma, son especialmente adecuados para el tratamiento selectivo de enfermedades hepáticas víricas y de carcinomas de hígado (véanse las referencias bibliográficas que siguen a los ejemplos de realización).
1. Función de la ruta de ubiquitina/proteasoma
Los proteasomas son complejos enzimáticos multicatalíticos y de múltiples subunidades que constituyen aproximadamente el 1% de las proteínas celulares totales y están presentes como componente proteolítico principal en el núcleo celular y en el citosol de todas las células eucarióticas. La función principal de los proteasomas es la proteolisis de proteínas, normalmente de proteínas reguladoras, mal plegadas, no funcionales o destinadas a la degradación rápida. Otra función de la degradación proteasómica de una gran cantidad de proteínas celulares o víricas es la generación de ligandos peptídicos para las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I, necesaria para la respuesta inmunológica mediada por células T (para revisión, véase Rock y Goldberg, 1999).
Las dianas para el proteasoma generalmente son marcadas para la degradación proteasómica mediante la asociación de formas oligoméricas de la ubiquitina (Ub). La Ub es una proteína altamente conservada de 76 aminoácidos que se acopla covalentemente a las proteínas diana por medio de un enlace isopeptídico entre el extremo COOH-terminal y el grupo \varepsilon-NH_{2} de las cadenas laterales de lisina, que se encuentran bien en la proteína diana o bien en moléculas de Ub que ya están asociadas con la proteína diana. El resultado de la conjugación de moléculas de Ub es la formación de las denominadas cadenas de poli-Ub. En general, se requieren multímeros de cuatro moléculas de Ub para que sirvan de señal para la degradación por el proteasoma. La ubiquitinación misma es reversible, y las moléculas de Ub se pueden volver a eliminar de la molécula diana mediante un gran número de Ub-hidrolasas. La conexión entre la ubiquitinación de las proteínas diana y la proteolisis proteasómica se denomina generalmente sistema de ubiquitina/proteasoma (UPS) (para revisión, véanse Hershko y Chiechanover, 1998; Baumeister y col., 1998).
El proteasoma 26S es un complejo multienzimático con un tamaño de 2,5 megadalton (MDa) que se compone de aproximadamente 31 subunidades (para revisión, véase Voges y col., 1999). La actividad proteolítica del complejo proteasómico reside en una estructura nuclear, el proteasoma 20S. El proteasoma 20S constituye un complicado complejo multienzimático que está formado por 14 proteínas no idénticas (con un peso molecular comprendido en el intervalo de 21 a 31 kDa) y está dispuesto en dos anillos \alpha y dos \beta en el orden \alpha\beta\beta\alpha (para revisión, véase Voges y col., 1999). La especificidad del proteasoma 20S por el sustrato comprende tres actividades proteolíticas fundamentales: las actividades tripsina, quimotripsina y postglutamil-péptido hidrolasa (PGPH), denominadas también actividades similares a la caspasa, que se localizan en la subunidades \beta X, Y y Z. Las actividades enzimáticas del proteasoma 20S se regulan por asociación con las subunidades reguladoras 19S, formando juntas la partícula proteasómica activa 26S. Las subunidades reguladoras 19S están implicadas en el reconocimiento de proteínas poliubiquitinadas, así como en el despliegue de proteínas diana. La actividad del proteasoma 26S es dependiente de ATP y degrada casi exclusivamente proteínas poliubiquitinadas. Las subunidades \beta catalíticamente activas del proteasoma 20S (X, Y y Z) se pueden reemplazar por subunidades codificadas por el MHC inducibles por interferón \gamma, formando así el denominado "inmunoproteasoma" (Gaczynska y col., 1993).
1.1. Importancia del sistema de ubiquitina/proteasoma en la patogénesis de enfermedades clínicamente relevantes
La estrecha relación entre el UPS (sistema de ubiquitina/proteasoma) y los mecanismos celulares explica la importancia que tiene este sistema en numerosos mecanismos patológicos, de los cuales hasta ahora sólo se conoce una pequeña parte (para revisión, véase Schwartz y Chiechanover, 1999). El UPS desempeña una función central en enfermedades del sistema inmunológico. Por una parte, el complejo proteasómico 26S constituye la proteasa principal en el procesamiento de MHC-I-antígeno y, por otra, la actividad del proteasoma mismo puede ser manipulada por subunidades \beta catalíticas inducibles por interferón \gamma. Muchas enfermedades inflamatorias e inmunológicas están relacionadas con el factor de transcripción NF-\kappaB, que regula diferentes funciones génicas en la respuesta inmunológica. La activación de NF-\kappaB, que es regulada por ubiquitinación y disociación específica de una proteína precursora mediante el proteasoma, conduce a un aumento de la expresión de diferentes citocinas, moléculas de adhesión, proteínas inflamatorias y de respuesta a estrés, así como de inmunorreceptores (para revisión, véanse Chiechanover y col., 2000; Schwartz y Chiechanover, 1999).
1.2. Inhibidores del proteasoma
Se conocen diversas clases de sustancias que actúan como inhibidores del proteasoma. Por una parte son aldehídos peptídicos químicamente modificados, tales como el aldehído tripeptídico N-carbobenzoxil-L-leucinil-L-leucinil-L-leucinal (zLLL), denominado también MG132, y el derivado del ácido bórico MG232, que es 10 veces más eficaz. El zLLL y sus derivados bloquean el proteasoma de forma reversible mediante la formación de una estructura de hemiacetal transitoria con la cadena lateral treonina-hidroxilo catalíticamente activa, situada en la posición 1 de la subunidad \beta del proteasoma 26S (para revisión, véase Coux y col., 1996). De forma similar al zLLL se describió otra clase de péptidos modificados como inhibidores del proteasoma, las peptidil-vinil-sulfonas (Bogyo y col.,
1997).
La lactacistina (LC) (Fenteany y col., 1995) de estreptomicetos y la epoxomicina de actinomicetos (Meng y col., 1999a,b) son sustancias naturales aisladas de microorganismos. La LC es un inhibidor altamente específico y eficaz del proteasoma que inactiva el proteasoma de forma irreversible por transesterificación y alquilación de la cadena lateral de treonina de la subunidad \beta (Fenteany y col., 1995). Por lo tanto, la LC es un inhibidor irreversible del proteasoma que actúa de forma covalente y bloquea principalmente las actividades quimotripsina y tripsina de la partícula proteasómica 26S (Fenteany y col., 1995). La LC no presenta una estructura básica peptídica sino que se compone de un anillo de \gamma-lactama, una cisteína y un grupo hidroxibutilo. La LC misma no inhibe el proteasoma. Más bien se hidroliza el resto N-acetilcisteína en solución acuosa. El resultado es la formación de una clastolactacisteína-\beta-lactona. Esta estructura de lactona es capaz de atravesar membranas celulares. Una vez introducida en la célula, se produce un ataque nucleofílico del anillo de \beta-lactona y a continuación una transesterificación del grupo treonina^{1}-hidroxilo de la subunidad \beta.
Otro inhibidor del proteasoma es la epoxicetona epoxomicina presente en la naturaleza. En cuanto a la especificidad por el proteasoma 26S y la eficacia, la epoxomicina es actualmente el inhibidor más eficaz de todos los inhibidores naturales conocidos del proteasoma (Meng y col., 1999a,b). La epoxomicina se caracteriza asimismo por una toxicidad comparablemente baja en cultivos celulares (Hanada y col, 1992).
Otra clase muy potente de inhibidores sintéticos del proteasoma son los derivados peptídicos del ácido bórico, en especial el compuesto ácido piranocil-fenil-leucinil-bórico con el nombre de "PS-341". El PS-341 es muy estable en condiciones fisiológicas y está biodisponible tras la administración intravenosa (Adams y Stein, 1996; Adams y col., 1998). Los derivados peptídicos del ácido bórico son conocidos en general como inhibidores de diferentes proteasas eucarióticas, como, por ejemplo, la trombina, la elastasa, la dipeptidilproteasa IV (para revisión, véase Adams y Stein, 1996). La especial eficacia del PS-341 como inhibidor del proteasoma reside en el enlace muy estable entre los grupos ácido bórico e hidroxilo de la cadena lateral catalíticamente activa de Thr^{1} en la subunidad \beta activa del proteasoma 20S, con una constante de inhibición (Ki) de 0,6 nM (Adams y Stein, 1996). Aparte del proteasoma, no se conoce actualmente ninguna proteasa celular que se vea afectada por el PS-341.
Como inhibidores del proteasoma se describieron otros derivados peptídicos del ácido bórico similares a PS-341, como, por ejemplo, el ácido benzoil-fenilalanin-leucin-bórico (Gardner y col., 2000). Asimismo se describió un inhibidor muy potente del proteasoma con el nombre de "PS-273" (morfolin-CONH-(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}), que tiene una estructura básica similar al PS-341 pero presenta una estructura de morfolina en el extremo N-terminal, de modo que es más hidrófobo y, por lo tanto, probablemente pueda atravesar las membranas con mayor facilidad que el PS-341 (Adams y col., 1999).
Aplicación clínica de los inhibidores del proteasoma
El complejo proteasómico ejerce funciones celulares esenciales y es imprescindible para la vitalidad celular. Por lo tanto, la inhibición permanente de la actividad del proteasoma puede producir alteraciones en la regulación del ciclo celular, de la transcripción, de toda la proteolisis celular y del procesamiento de MHC-I-antígeno (para revisión, véase Hershko y Chiechanover, 1998). La inhibición total de la actividad del proteasoma conduce generalmente a la detención del ciclo celular y la muerte celular. La inhibición permanente de todas las actividades enzimáticas del proteasoma es incompatible con la vida de una célula y, por lo tanto, de todo el organismo.
Sin embargo, se ha observado que novedosos inhibidores del proteasoma que actúan de forma reversible inhiben selectivamente actividades proteolíticas individuales del proteasoma 26S sin afectar a otras proteasas celulares. La citotoxicidad de estos inhibidores es, por tanto, bastante más baja que la de los inhibidores del proteasoma que actúan de forma relativamente inespecífica, como, por ejemplo, el aldehído peptídico zLLL. Este hecho permite tanto la aplicación in vivo de estos novedosos inhibidores del proteasoma (Meng y col., 1999a) como el establecimiento de líneas celulares permanentes que toleran concentraciones relativamente altas de inhibidores del proteasoma (Glas y col., 1998; Geier y col., 1999).
Se ha demostrado en varias ocasiones la reivindicación de que determinados inhibidores del proteasoma pueden ser tolerables in vivo en un determinado régimen de dosificación. Por ejemplo, se describió la selección de líneas celulares de timo de ratón que toleran la presencia constante de 10 \muM del inhibidor del proteasoma z-leucinil-leucinil-leucin-vinilsulfona (NLVS) y que poseen un crecimiento celular y metabolismo celular normales con, al mismo tiempo, una presentación de MHC-I-antígeno limitada (Glas y col., 1998). Se obtuvieron unos resultados similares con el muy potente inhibidor del proteasoma LC, que fue tolerado en cultivo celular hasta 6 \muM (Geier y col., 1999).
La epoxomicina, un péptido modificado con epoxi-\beta-aminocetona, se aisló de actinomicetos como una clase completamente nueva de inhibidores del proteasoma (Hanada y col., 1992). La epoxomicina posee un fuerte efecto citotóxico en diferentes líneas celulares tumorales cultivadas in vitro y mostró in vivo una actividad inhibidora de los tumores modelo de melanoma y leucemia en el modelo de ratón (Hanada y col., 1992).
La importancia de los inhibidores del proteasoma como nuevo principio terapéutico ha crecido en los últimos años, especialmente en el tratamiento del cáncer y de enfermedades inflamatorias (para revisión, véanse Murray y Norbury, 2000; Rivett y Gardner, 2000-Categoría XXX = referencias bibliográficas según la fecha de prioridad). Hasta ahora todavía no se ha autorizado el uso de inhibidores del proteasoma para una extensa aplicación clínica en el hombre. Sin embargo, en la bibliografía especializada aumenta el número de informes que señalan que, últimamente, la industria farmacéutica trabaja intensamente en el desarrollo de nuevos medicamentos basados en inhibidores del proteasoma tolerables in vivo. Son de mencionar algunos ejemplos de ello: La empresa "Millenium Pharmaceuticals, Inc." (Cambridge, MA 02139, EE.UU.), tras la adquisición de la empresa "ProScript, Inc.", trabaja en el desarrollo de inhibidores del proteasoma para tratamientos antiinflamatorios, inmunomoduladores y antineoplásicos, en particular en los derivados dipeptídicos de ácido bórico. Los compuestos PS-341 (Gardner y col., 2000 Categoría XXX), PS-519 y PS-273 (Adams y col., 1998, 1999) desempeñan aquí un papel especial.
En el modelo de rata, la administración de PS-341 por vía oral presenta un efecto antiinflamatorio sobre la poliartritis inducida por estreptococos y la hepatitis (Palombella y col., 1998). En el modelo de ratón, el PS-341 muestra un efecto antineoplásico sobre el carcinoma de pulmón y presenta, además, un efecto aditivo en combinación con agentes citostáticos (Teicher y col., 1999). Ensayos in vitro demuestran una muy buena eficacia frente a células de tumores sólidos de ovario y próstata humanos (Frankel y col., 2000). Los estudios clínicos de fase I con PS-341 demuestran una buena biodisponibilidad y un buen comportamiento farmacocinético (Lightcap y col., 2000 Categoría XXX).
El PS-341 es actualmente el único inhibidor del proteasoma clínicamente probado. A este respecto se han concluido ya los estudios clínicos de fase I y de fase II en pacientes con diferentes enfermedades cancerosas, como, por ejemplo, malignidades hematológicas como tumores sólidos. Las informaciones al respecto fueron presentadas por Millennium Pharmaceuticals Inc. en diversos comunicados de prensa:
- Se informó, por ejemplo, de los resultados de estudios clínicos de fase II realizados en pacientes con mieloma múltiple (comunicado de prensa de Millennium Pharmaceuticals, Inc. del 01.03.01: "Millennium Initiates Phase II Clinical Trials of LDP-341 in Multiple Myeloma", publicado en la página web http:biz.yahoo.com/prnews/010301/neth003.
html, Categoría XXX).
- En la 42ª reunión de la Sociedad Hematológica Americana en diciembre de 2000, San Francisco, CA, EE.UU., se presentaron los primeros estudios preclínicos sobre el efecto de los inhibidores del proteasoma PS-341 como nuevo tratamiento contra el cáncer en pacientes con mieloma (comunicado de prensa de Millennium Pharmaceuticals, Inc. del 04.12.00: Millennium's LDP(PS)-341 inhibits growth and induces death of cancer cells, appears to overcome chemotherapy resistance; publicado en la página web http:biz.yahoo.com/prnews/010301/neth003.html, 
\hbox{Categoría
XXX).}
- En la reunión de la Sociedad Americana de Oncología Clínica en mayo de 2000, se presentaron datos de estudios clínicos de fase I con PS-341 en pacientes con tumores malignos avanzados (incluidos melanoma, carcinoma de riñón, carcinoma de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de cuello del útero, tumores endometriales y de vesícula). No se observó ninguna toxicidad que limitara la dosis en el tratamiento con PS-341. Se pudieron observar efectos terapéuticos en diversos pacientes con tumores gracias al sorprendente efecto de PS-341 en lo que al efecto antineoplásico y la inducción de apoptosis se refiere (comunicado de prensa de Millennium Pharmaceuticals, Inc. del 23.05.00: "Millennium presents clinical trial data on LDP-341 for advanced malignancies", publicado en la página web http://www.mlnm.com.releases.pr052300_{-}I.shtml).
- En "CancerNet" online se publicaron informaciones adicionales sobre el protocolo clínico de estudios de fase I en pacientes con tumores avanzados (tumores sólidos y linfoma) que ya no respondían a la quimioterapia convencional ("Phase I study of PS-341 in patients with advanced solid tumors or lymphomas", publicado el 11.09.00 en la página web http://cancernet.nci.nih.gov/, Categoría XXX).
- Se informó de los resultados de estudios clínicos de fase I con PS-341 en pacientes con leucemia aguda, síndrome mielodisplásico y leucemia mieloide crónica, especialmente del efecto sinérgico de PS-341 con agentes quimioterapéuticos convencionales (comunicado de prensa de Millennium Pharmaceuticals, Inc. del 09.11.00: "Phase I study of PS-341 in acute leukemias, myelodysplastic syndromes and chronic myeloid leukemia in blast phase", publicado en Leukemia Insights Newsletter online en la página web httw//www3ananderson.org/leukemia/insight/letter52.htlm).
En un modelo de ratón se pudo demostrar que el inhibidor del proteasoma PS-519 (un derivado de \beta-lactona), desarrollado por la empresa Millennium Pharmaceuticals, Inc., tiene un fuerte efecto antiinflamatorio sobre ambas reacciones inflamatorias, la retardada y la hipersensible. A bajas dosis, el PS-519 también es eficaz en combinación con esteroides. Por este motivo se propuso el PS-519 como nuevo medicamento para el tratamiento del asma (Elliott y col., 1999). Otra aplicación del PS-519 resulta del modelo del infarto: La reacción inflamatoria producida tras lesiones cerebrales se redujo drásticamente mediante PS-519. Por lo tanto, el PS-519 también parece ser un agente farmacéutico interesante para el tratamiento del ataque de apoplejía (Phillips y col., 2000, Categoría XXX).
Puesto que los inhibidores del proteasoma afectan a una ruta esencial del metabolismo celular, se requiere un estricto régimen de dosificación para suprimir los efectos secundarios tóxicos. En el marco del desarrollo de inhibidores del proteasoma tolerables in vivo se ensayaron diferentes derivados peptídicos del ácido bórico que mostraron un efecto antitumoral tanto en el cultivo celular como en el modelo animal (Adams y Stein, 1996; Adams y col., 1998, 1999, 2000). El PS-341 posee in vitro una actividad citotóxica selectiva en un amplio espectro de líneas celulares tumorales humanas (Adams y col., 1999). Esta actividad está relacionada con el acúmulo de p21 y la detención del ciclo celular en la fase G2-M, seguida de apoptosis (Adams y col., 1999). La inyección directa de PS-341 provocó necrosis en un 70% de los tumores estudiados en el modelo de ratón. Tras la administración de PS-341 por vía intravenosa, la sustancia se distribuyó en todos los órganos y tejidos y presentaba una actividad antineoplásica en modelos de xenoinjertos humanos (Adams y col., 1999).
Hasta la fecha no se ha informado del uso de inhibidores del proteasoma de ninguna clase de sustancias con el fin de bloquear infecciones víricas.
2. Biología de los virus de la hepatitis 2.1. Virus humanos y animales de la hepatitis B
Además del HBV humano se conocen numerosos virus animales relacionados que forman juntos la familia de los denominados hepadnavirus (para revisión, véase Schäfer y col., 1998). Estos virus tienen en común la síntesis de un ARN pregenómico a partir de una forma circular superenrollada del genoma (ADNccc) en el núcleo celular, el empaquetamiento de un ARN pregenómico en nucelocápsidas en el plasma celular y la transcripción del ARN pregenómico dentro de la cápsida en una forma de ADN circular, parcialmente de hebra doble (ADNcc), con la ayuda de la transcriptasa inversa con actividad ADN-polimerasa codificada por el virus durante la maduración y exclusión del virus. Debido a las numerosas similitudes con el HBV, los hepadnavirus animales se usan muy a menudo como modelos animales para investigar la biología, la patogénesis y la evaluación de las sustancias antivirales para el tratamiento de la hepatitis B humana (para revisión, véase Schäfer y col., 1998). Por este motivo, en la descripción de la presente invención se usó, en particular, el modelo animal del virus de la hepatitis B de pato para los estudios con los inhibidores del proteasoma.
2.1.1. Partículas víricas y componentes de los hepadnavirus
En el suero de pacientes y animales virémicos se encuentran en general, además del virión infeccioso (aproximadamente 42 nm de diámetro), entre 1.000 y 10.000 partículas no infecciosas, más bien subvíricas, con una forma esférica o filamentosa. Las partículas víricas se componen de una envuelta lipídica en la que están incorporadas las proteínas superficiales codificadas por el genoma del HBV (HBs o S, PreS1 o S grande, PreS2 o S medio). La nucleocápsida se compone de la proteína de la nucleocápsida y contiene el genoma vírico, que es parcialmente de hebra doble, así como proteínas celulares. Éstas incluyen, entre otras, cinasas celulares.
2.1.2. Los procesos infecciosos tempranos de los hepadnavirus
Una vez unidas las partículas víricas a moléculas superficiales de los hepatocitos y de otras células de origen hepático y no hepático, el virus es transportado al interior de las células mediante mecanismos poco comprendidos, y el genoma del virus, al núcleo celular. Cualquiera de los procesos de las etapas tempranas de la infección en los que está implicada la interacción con los componentes celulares podría estar alterado en las células tratadas con proteasoma y explicar así la capacidad infecciosa nula o reducida de los viriones que, sorprendentemente, se observó en la presente invención. Durante o después de la penetración del genoma vírico en el núcleo celular, éste se convierte en un genoma de ADN superenrollado, completamente de hebra doble (ADNccc). A partir del ADNccc se sintetizan todos los ARNs víricos y ARNs subgenómicos. El ARN supragenómico es redundante en el extremo y además del ARN pregenómico se sintetizan ARNs subgenómicos, a partir de los cuales se traducen las proteínas estructurales y no estruc-
turales.
2.1.3. Las etapas tardías de la replicación de los hepadnavirus
La fosforilación y desfosforilación de la proteína nuclear desempeñan un papel importante en el ensamblaje de la nucleocápsida, en la síntesis de ADN, en la asociación de las proteínas de la nucleocápsida con la membrana nuclear y su transporte al núcleo celular, así como en la descomposición de la nucleocápsida, necesaria para transportar el genoma al núcleo celular. Modificaciones en la fosforilación de la nucleocápsida pueden interferir en la capacidad infecciosa de los hepadnavirus y en el proceso infeccioso. Cuando la síntesis de ADN ha alcanzado un determinado estado de madurez, se realiza la envoltura del virus. Una parte de las nucleocápsidas migra hacia la membrana nuclear y se encarga así de aumentar lo necesario el número de copias del ADNccc.
2.1.4. El problema de la heterogeneidad de los hepadnavirus
Debido al paso de la transcripción inversa del genoma de HBV a ADN y la falta de una función correctora de errores de la transcriptasa inversa, con frecuencia se generan durante la multiplicación del HBV mutaciones similares a las que se conocen para el VIH y otros virus de ARN, incluido el HCV (para revisión, véase Günther y col., 1998). Por este motivo, los pacientes siempre están infectados por una población muy heterogénea de HBV y HCV. La heterogeneidad influye en la patogénesis, la resistencia del virus, la respuesta al tratamiento con interferones (IFN) y sustancias antivirales (análogos de nucleósidos y otras), así como en el reconocimiento de las células infectadas por parte del sistema inmunológico. Estos hallazgos demuestran que, a pesar de disponer de una vacuna y de anticuerpos que se pueden administrar de forma profiláctica, son necesarias y convenientes nuevas estrategias antivirales para evitar una reinfección por HBV y, sobre todo, para tratar una infección crónica.
2.2. Posibilidades de tratamiento para la protección inmunológica frente a una infección causada por HBV
Una de las escasas posibilidades de tratamiento de una infección crónica causada por HBV consiste en el tratamiento con interferones (IFN). Éste está reconocido y autorizado, pero sólo es parcialmente eficaz. En el caso de coinfecciones con VIH y HCV, que se dan con cierta frecuencia, la tasa de éxito del tratamiento con IFN es aún más baja que en el caso de una sola infección por HBV o HCV. Casi nunca se eliminan todos los reservorios de HBV y HCV, aún cuando el tratamiento con IFN ha tenido éxito clínico, y se puede producir una reactivación de la infección (Rehermann y col., 1996). El inconveniente fundamental del tratamiento anti-HBV basado en la administración de IFN reside en que a menudo está asociado a efectos secundarios adversos (para revisión, véase Trautwein y Manns, 2001).
Los análogos de nucleósidos usados para el HBV inhiben la transcripción del ARN pregenómico a ADN realizada por la polimerasa codificada por el virus. Un gran inconveniente de los análogos de nucleósidos (por ejemplo, lamivudina, famciclovir, adevofir y entecavir) reside en que casi siempre se produce una selección de cepas de HBV resistentes a los medicamentos. Además, los análogos de nucleósidos conllevan el riesgo de que pueden causar mutaciones cromosómicas y, por lo tanto, cáncer. Los nuevos medicamentos mencionados en el marco de la invención presentada en esta memoria no muestran este riesgo ni los efectos adversos.
2.3. Biología y tratamiento de las infecciones por HCV
También la infección con el virus de la hepatitis C (HCV) constituye uno de los grandes problemas de salud a nivel mundial. Aproximadamente 170 millones de personas (es decir, aproximadamente un 3% de la población mundial) están infectados con este virus. Algunos países presentan una prevalencia del HCV en más del 10% de la población. Al contrario que para el HBV, actualmente no existen vacunas eficaces para el HCV. En aproximadamente un 80% de los casos, la infección por HCV se desarrolla de forma crónica con hepatitis de diferentes grados de gravedad. Al igual que en el caso del HBV, también la infección crónica por HCV conlleva un muy alto riesgo de generación de cirrosis hepática y carcinoma de hígado. Las probabilidades de curación son casi nulas para ambas enfermedades, salvo en el caso de un trasplante de hígado realizado con éxito. El HCV pertenece a los flavivirus y codifica aproximadamente 10 productos génicos. La infección se diagnostica generalmente mediante la determinación de anticuerpos anti-HCV específicos y de antígenos y ARN víricos. Como en el caso del HBV, la patogénesis se caracteriza por diferentes grados de hepatitis que llegan hasta el fallo hepático, la generación de una cirrosis hepática/fibrosis y de un carcinoma de hígado, así como por enfermedades concomitantes. También la terapia, al igual que en el caso del HBV, se basa predominantemente en el tratamiento con interferón alfa y sus derivados, así como con análogos de nucleósidos y otras sustancias cuyo modo de acción se desconoce (para revisión, véase Trautwein y Manns, 2001). Desde 1999 está autorizado para el tratamiento del HCV crónico el análogo de guanosina ribavirina en combinación con interferones. El modo de acción de este medicamento, sin embargo, no está del todo elucidado. Con la administración de ribavirina no cabe esperar la eliminación completa del HCV. Además, la ribavirina presenta con frecuencia una serie de efectos adversos (para revisión, véase Trautwein y Manns, 2001). Para todos los medicamentos actualmente autorizados para HBV y HCV, así como para HDV (virus de la hepatitis D), se cumple que existen numerosos pacientes que no responden y a
los que, en principio, únicamente pueden ayudar nuevos medicamentos, como los que se describen en esta invención.
2.4. Relación entre el UPS y el ciclo de replicación de los hepadnavirus
Para una de las proteínas reguladoras del HBV, la proteína HBx, se demostró que interactúa con una subunidad del complejo proteasómico 26S y que esta interacción es esencial para la función de HBx (Hu y col., 1999). Asimismo se informó que la presentación de determinantes antigénicos de HBV y HCV en forma de complejos MHC-I-péptido también se puede efectuar de forma eficaz en presencia de inhibidores del proteasoma (López y col, 2000). Por lo tanto, el reconocimiento de las células hepáticas infectadas por HBV por parte de las células T_{CD8+} citotóxicas y, con ello, la inmunidad celular natural frente a una infección no se verían alterados por el tratamiento con inhibidores del proteasoma, como se propone en la presente descripción de la invención.
2.4.1. Función del UPS en la replicación del HCV
La expresión de proteínas de HCV no influye, como en el caso del HBV, en la actividad del UPS (Moradpour y col., 2001). Estos resultados permiten suponer que la presentación de antígenos mediante el MHC de clase I y el procesamiento de los antígenos víricos del HCV no están alterados y que, por lo tanto, para establecer una infección por HCV persistente, se requieren otros mecanismos para eludir el sistema inmunológico. Una fracción de la propia proteína nuclear de HCV es degradada por el UPS, y se observó una forma monoubiquitinada de la proteína nuclear (Suzuki y col., 2001).
2.4.2. Función del UPS en la replicación de HCC
Hasta ahora no se ha comprobado si los inhibidores del proteasoma influyen sobre la proliferación o el estado de transformación de carcinomas hepatocelulares (HCC). Únicamente se sabe que en la mayoría de los HCCs está sobreexpresada una subunidad del proteasoma (Higashitsuji y col., 2000).
Según el estado de la técnica, se puede decir que hasta la fecha no se ha informado del efecto antiviral, observado sorprendentemente, de los inhibidores del proteasoma sobre procesos tardíos de la replicación de retrovirus, como, por ejemplo, el procesamiento de Gag, el ensamblaje y la gemación de viriones de HTV-1 o VIH-2, así como sobre la producción de virus descendientes infecciosos y/o sobre todo el ciclo de replicación del virus. Tampoco existen informes sobre el uso de inhibidores del proteasoma para el tratamiento de infecciones causadas por VIH u otros retrovirus. Asimismo cabe destacar que en ninguno de los estudios publicados hasta ahora en la bibliografía especializada o de patentes ni en otros trabajos publicados hasta la fecha se ensayó ni informó que los inhibidores del proteasoma influyen en la liberación y la capacidad infecciosa de los virus de la hepatitis, como se presenta en la descripción de la presente invención. Concretamente, no se halló ningún efecto antiviral de los inhibidores del proteasoma sobre los procesos del ciclo de replicación del HBV. Tampoco se informó que los inhibidores del proteasoma destruyen con preferencia las células del carcinoma de hígado causado por infecciones de tipo hepatitis y que, por lo tanto, son adecuados para el tratamiento de carcinomas de hígado. Los efectos de los inhibidores del proteasoma presentados en la presente invención sobre procesos tempranos y tardíos de la replicación del HBV, así como sobre el desarrollo de cirrosis hepática secundaria y carcinomas de hígado, constituyen así principios completamente nuevos del tratamiento antiviral de infecciones por HBV. Hasta ahora no se ha informado del uso de inhibidores del proteasoma en la terapia antiviral de infecciones de tipo hepatitis, especialmente para evitar que se establezca o persista una infección aguda y crónica causada por HBV y HCV.
Se han publicado los siguientes documentos de patente, que no afectan directamente a la presente invención: Una invención que describe agentes para interferir en las infecciones por HBV basándose en la interacción de la proteína X de HBV con las subunidades del proteasoma (documento US 5872206); un procedimiento para la determinación de la actividad del proteasoma en muestras biológicas (documento 00/23614); el uso de inhibidores del proteasoma como agentes para el tratamiento de cáncer, inflamaciones y enfermedades autoinmunes (documento WO 99/22729); el uso de inhibidores del UPS como agentes para el tratamiento de inflamaciones y enfermedades autoinmunes (documento 99/15183).
Esencia de la invención
La invención se basa en el objetivo de proporcionar agentes que se puedan usar para el tratamiento, la terapia y la inhibición de una hepatitis vírica.
El objetivo se alcanzó mediante el uso de al menos un inhibidor del proteasoma. De acuerdo con la invención, se han desarrollado agentes para el tratamiento de infecciones víricas que como componentes activos contienen inhibidores del proteasoma en preparaciones farmacéuticas. La invención se refiere a infecciones víricas, en particular a las causadas por aquellos virus que son liberados en la superficie celular en el marco del ciclo de replicación. De acuerdo con una forma de realización preferida de la invención, se usan como inhibidores del proteasoma sustancias que inhiben, regulan o alteran de otro modo las actividades de la ruta de ubiquitina/proteasoma.
También es posible usar como inhibidores del proteasoma sustancias que alteran especialmente las actividades enzimáticas del complejo proteasómico 26S completo y de la estructura proteasómica catalíticamente activa 20S libre, no ensamblada con las subunidades reguladoras. Estos inhibidores pueden inhibir una, varias o las tres actividades proteolíticas principales del proteasoma (las actividades tripsina, quimotripsina y postglutamil-péptido hidrolasa) dentro del complejo proteasómico 26S o 20S.
Una variante de la invención consiste en usar como inhibidores del proteasoma sustancias que son absorbidas por las células de organismos eucarióticos superiores y que, una vez absorbidas por las células, interactúan con la subunidad catalítica beta del proteasoma 26S, bloqueando así de forma reversible o irreversible todas o algunas de las actividades proteolíticas del complejo proteasómico.
Como otra forma de la invención se usan agentes que inhiben las actividades de las enzimas conjugadoras de ubiquitina e hidrolizantes de ubiquitina. Entre ellos se encuentran también factores celulares que interactúan con ubiquitina, tanto con mono- como con poliubiquitina. La poliubiquitinación sirve, en general, como señal de reconocimiento para la proteolisis mediante el proteasoma 26S, y la alteración de la ruta de ubiquitina puede regular igualmente la actividad del proteasoma.
De acuerdo con la invención, también se usan como inhibidores del proteasoma sustancias que se administran in vivo en diferentes formas por vía oral, intravenosa, intramuscular, subcutánea o en forma encapsulada con o sin modificaciones que proporcionan especificidad celular o por cualquier otra vía, presentan, debido a un determinado régimen de administración y de dosificación, una baja citotoxicidad y/o una elevada especificidad por determinadas células u órganos, tienen efectos adversos insignificantes o ninguno, presentan una semivida metabólica relativamente larga y una tasa de aclaramiento relativamente baja en el organismo.
Como inhibidores del proteasoma se usan asimismo sustancias que se aíslan en forma natural de microorganismos u otras fuentes naturales, se obtienen a partir de sustancias naturales por modificación química o se preparan de forma totalmente sintética o se sintetizan in vivo mediante procedimientos de terapia génica o se preparan in vitro mediante procedimientos de ingeniería genética o en microorganismos. Entre ellas se encuentran:
a) Inhibidores del proteasoma presentes en la naturaleza:
- epoxomicina y eponemicina,
- aclacinomicina A (denominada también aclarrubicina),
- lactacistina y sus variantes químicamente modificadas, en especial la variante que atraviesa la membrana celular "clastolactacisteína \beta-lactona",
b) preparados sintéticamente:
- aldehídos peptídicos modificados, como, por ejemplo, N-carbobenzoxi-L-leucinil-L-leucinil-L-leucinal (denominado también MG132 o zLLL), su derivado de ácido bórico MG232; N-carbobenzoxi-Leu-Leu-Nva-H (denominado MG115); N-acetil-L-leucinil-L-leucinil-L-norleucinal (denominado LLnL); N-carbobenzoxi-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-H (denominado también PSI);
- péptidos que llevan \alpha,\beta-epoxicetonas en el extremo C-terminal (denominadas también epoxomicina o eponemicina), vinilsulfonas (por ejemplo, carbobenzoxi-L-leucinil-L-leucinil-L-leucin-vinilsulfona o 4-hidroxi-5-yodo-3-nitrofenilacetil-L-leucinil-L-leucinil-L-leucin-vinilsulfona, denominada también NLVS), restos glioxal o ácido bórico (por ejemplo, piracil-CONH(CHPhe)CONH(CH-isobutil)B(OH)_{2}, denominado también "PS-341" o benzoil(Bz)-Phe-boroLeu, fenacetil-Leu-Leu-boroLeu, Cbz-Phe-boroLeu); ésteres de pinacol, por ejemplo éster benciloxicarbonílico (Cbz) de Leu-Leu-boroLeu-pinacol;
y
- como compuestos especialmente adecuados se usan péptidos y derivados de péptidos que llevan estructuras epoxicetona en el extremo C-terminal, entre las cuales se cuentan, por ejemplo, la epoxomicina (fórmula molecular: C_{28}H_{86}N_{4}O_{7}) y la eponemicina (fórmula molecular: C_{20}H_{36}N_{2}O_{5});
- derivados químicamente modificados basados en las sustancias presentes en la naturaleza, en particular un derivado de \beta-lactona con el nombre de PS-519 (1R-[1S,4R,5S]-1-(1-hidroxi-2-metilpropil)-4-propil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptano-3,7-diona, fórmula molecular: C_{12}H_{19}NO_{4}) que deriva del inhibidor natural del proteasoma lactacistina;
- determinados derivados dipeptidílicos del ácido bórico, en particular compuestos que derivan del derivado ácido piranocil-fenil-leucinil-bórico con el nombre de "PS-341" (ácido N-pirazincarbonil-L-fenilalanin-L-leucin-bórico, fórmula molecular: C_{19}H_{25}BN_{4}O_{4}). Entre ellos se cuentan asimismo los compuestos "PS-273" (morfolin-CONH-(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}) y su enantiómero PS-293, el compuesto PS-296 (8-quinolilsulfonil-CONH-(CH-naftil)-CONH(CH-isobutil)-B(OH)_{2}); el compuesto PS-303 (NH_{2}(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}); el compuesto PS-321 (morfolin-CONH-(CH-naftil)-CONH-(CH-fenilalanin)-H(OH)_{2}); el compuesto PS-334 (CH_{3}-NH-(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}); el compuesto PS-325 (2-quinol-CONH-(CH-homo-fenilalanin)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}); el compuesto PS-352 (fenilalanin-CH_{2}-CH_{2}-CONH-(CH-fenilalanin)-CONH-(CH-isobutil)1-B(OH)_{2}); el compuesto PS-383 (piridil-CONH-(CHpF-fenilalanin)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}). Todos estos compuestos se han descrito ya, entre otras cosas en Adams y col. (1999).
Además de la epoxomicina y la eponemicina, han resultado ser compuestos especialmente adecuados los inhibidores del proteasoma PS-519, PS-341 y PS-273 (desarrollados por la empresa Millennium Pharmaceuticals Inc., Cambridge, MA 02139, EE.UU.). Estos inhibidores del proteasoma son muy potentes y muy específicos del proteasoma y no bloquean otras proteasas celulares, por lo que casi no presentan efectos adversos. Los inhibidores del proteasoma PS-341 y PS-519 se ensayaron además tanto en modelos animales para estudios preclínicos como en el ser humano (pacientes con cáncer) para estudios clínicos.
Con los inhibidores del proteasoma se proporcionan de acuerdo con la invención agentes que, sorprendentemente,
- bloquean la liberación de virus de la hepatitis infecciosos, en especial de HBV y HCV, por parte de células infectadas;
- limitan la propagación de una infección aguda causada por virus de la hepatitis;
- provocan con preferencia la destrucción de células de carcinoma de hígado;
- suprimen la viremia tanto en el caso de una reinfección como en el de infecciones crónicas causadas por virus de la hepatitis y aumentan la probabilidad de que se produzca una eliminación del virus por medio del propio sistema inmunológico y/o mediante agentes conocidos con un efecto similar o diferente.
El bloqueo de la replicación del virus en cultivos celulares se puede explicar mecanísticamente como resultado de las novedosas actividades descritas en el marco de la invención para los inhibidores del proteasoma, de las siguiente manera:
- en presencia de los inhibidores del proteasoma se liberan menos viriones,
- los pocos viriones liberados presentan poca o ninguna capacidad infecciosa.
De este modo se limita la reinfección de células en cultivo, por lo que la propagación de la infección está reducida o se suprime por completo.
La esencia de la invención consiste en el uso de agentes conocidos para un nuevo propósito y en una combinación de elementos conocidos, los inhibidores del proteasoma, con una nueva acción, su uso para influir en hepadnavirus, que, mediante su nueva acción total, proporcionan ventajas y el éxito pretendido, que reside en que ahora se dispone de agentes para inhibir la liberación y maduración de los hepadnavirus, así como de agentes para el tratamiento, terapia e inhibición de una hepatitis vírica.
Sorprendentemente se ha observado que los inhibidores del proteasoma inhiben procesos tardíos en el ciclo de replicación de hepadnavirus de forma similar al efecto que producen sobre retrovirus. Específicamente, se observó que el uso de acuerdo con la invención de inhibidores del proteasoma es adecuado para suprimir en gran parte o por completo la producción de viriones infecciosos por parte de las células infectadas de forma crónica con HBV. Después de tratar células productoras de HBV con inhibidores del proteasoma se produce tanto una inhibición de la liberación de viriones como un prácticamente completo
\bullet En comparación con zLLL, el inhibidor epoxomicina, muy específico del proteasoma, presenta un efecto mucho más potente sobre la actividad del proteasoma. Esto se refleja en la observación hecha de acuerdo con la invención de que 100 nM de epoxomicina produce un bloqueo completo de la replicación del VIH-1 y 10 nM de epoxomicina, un bloqueo casi completo (Fig. 4, panel 4. Experimento en A3.01).
El bloqueo de la replicación del virus en cultivos celulares se puede explicar mecanísticamente como resultado de las novedosas actividades descritas en el marco de la invención para los inhibidores del proteasoma, de las siguiente manera:
- en presencia de los inhibidores del proteasoma se liberan menos viriones,
- los pocos viriones liberados presentan poca o ninguna capacidad infecciosa.
De este modo se limita la reinfección de células en cultivo, por lo que la propagación de la infección está reducida o se suprime por completo.
La esencia de la invención reside en el uso de agentes conocidos para un nuevo propósito y en una combinación de elementos conocidos, los inhibidores del proteasoma, con una nueva acción, su uso para influir en retrovirus y hepadnavirus, que, mediante su nueva acción total, proporcionan ventajas y el éxito pretendido, que reside en que ahora se dispone de agentes para inhibir la liberación y maduración de los retrovirus, así como de agentes para el tratamiento, terapia e inhibición de una hepatitis vírica.
La invención se dirige también al uso de inhibidores del proteasoma para la preparación de agentes para inhibir la liberación, maduración y replicación de retrovirus. Incluye su uso para la preparación de medicamentos para el tratamiento y la profilaxis del SIDA y de fenómenos patológicos relacionados con una infección por VIH, como, por ejemplo, la demencia inducida por VIH, los trastornos del metabolismo de lípidos inducidos por VIH, en especial el síndrome HLS (HIV-associated lipodystrophy syndrome, síndrome de lipodistrofia asociada a VIH), así como trastornos de las funciones renales inducidos por VIH, en especial el síndrome HIVAN (HIV-associated nephropathy, nefropatía asociada a VIH).
En otro aspecto, el segundo punto esencial de la invención, se ha observado sorprendentemente que los inhibidores del proteasoma inhiben procesos tardíos en el ciclo de replicación de hepadnavirus de forma similar al efecto que producen sobre retrovirus. Específicamente, se observó que el uso de acuerdo con la invención de inhibidores del proteasoma es adecuado para suprimir en gran parte o por completo la producción de viriones infecciosos por parte de las células infectadas de forma crónica con HBV. Después de tratar células productoras de HBV con inhibidores del proteasoma se produce tanto una inhibición de la liberación de viriones como una reducción prácticamente completa de la capacidad infecciosa de los viriones liberados. Como consecuencia de estas nuevas actividades, los inhibidores del proteasoma pueden impedir la replicación del virus, la reinfección de hepatocitos y, por lo tanto, la propagación de la infección por HBV in vivo en el tejido hepático de un paciente infectado por HBV.
Asimismo se observó que el tratamiento de células de hepatocarcinoma con infección crónica por HBV con inhibidores del proteasoma induce preferentemente la muerte (principalmente por inducción de apoptosis) de estas células cancerosas, mientras que los hepatocitos primarios sanos y los demás hepatocitos no proliferativos son mucho más resistentes al tratamiento con inhibidores del proteasoma. Los carcinomas de hígado prácticamente no se pueden tratar con medicamentos, y sin trasplante de hígado o hepatectomía generalmente causan la muerte. Los inhibidores del proteasoma adquieren de este modo un potencial terapéutico adicional para el tratamiento de infecciones causadas por virus de la hepatitis: Mediante el tratamiento con inhibidores del proteasoma no sólo se puede suprimir o evitar la propagación de la infección (bloqueando la producción de viriones infecciosos), sino también la generación de carcinomas hepatocelulares relacionada con la infección o curar un carcinoma hepatocelular ya establecido. Esta reivindicación se basa en el hecho de que el tratamiento con inhibidores del proteasoma puede producir una eliminación específica de las células de carcinoma de hígado in vivo de forma similar al efecto antineoplásico ya conocido que presentan los inhibidores del proteasoma sobre un gran número de tumores. El efecto antineoplásico de los inhibidores del proteasoma no se ha demostrado hasta ahora para el carcinoma hepatocelular y, por lo tanto, constituye un novedoso principio terapéutico. Los inhibidores del proteasoma se pueden usar, por lo tanto, para el tratamiento/combate/prevención de la cirrosis hepática inducida por HBV y, en especial, de carcinomas hepatocelulares
primarios.
Los inhibidores del proteasoma también se pueden usar, aprovechando el novedoso efecto antiviral, para el tratamiento de las infecciones sintomáticas y asintomáticas causadas por los siguientes virus de la hepatitis: Virus de la hepatitis A (HAV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la hepatitis delta (HDV), virus de la hepatitis E (HEV), virus de la hepatitis F (HFV), virus de la hepatitis G (HGV). El tratamiento de las hepatitis B y C con inhibidores del proteasoma es especialmente importante debido a su gran propagación, la patogenicidad especialmente elevada y la asociación de la infección crónica con el desarrollo de un carcinoma de hígado.
Los inhibidores del proteasoma también se pueden usar en combinación con otros medicamentos para la hepatitis y demás esquemas terapéuticos, por ejemplo interferón alfa/beta/gamma y sus variantes (por ejemplo, interferones pegilados), interleucinas, análogos de nucleósidos (lamivudina, cidovir, ribavirina y otros), esteroides, sustitución de plasma, timosina alfa 1, vacunas, vacunación pasiva y activa, vacunación terapéutica y profiláctica, glicirricina, trasplante de células troncales, trasplantes de órganos, terapia nutricional, inmunosupresores, ciclosporinas y sus derivados, amanditina y derivados, interleucinas y otras citocinas, inhibidores de proteasas no selectivos del proteasoma, azatoprina, hemodiálisis, así como la terapia antirretroviral altamente activa (highly active antiretroviral therapy, "HAART") en caso de coinfección de HBV con virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Puesto que los inhibidores del proteasoma también tienen un efecto antiviral sobre VIH, el tratamiento de coinfecciones de HBV/VIH, especialmente en combinación con una terapia HAART, constituye una aplicación esencial de la invención.
De acuerdo con la invención, también es posible con los inhibidores del proteasoma evitar el desencadenamiento de la enfermedad y reducir la propagación de la infección en el organismo de personas asintomáticas infectadas por HBV.
Un uso adicional de los inhibidores del proteasoma consiste en evitar que se establezca una infección sistémica por virus de la hepatitis tras el contacto con un virus infeccioso (por ejemplo, en el caso de heridas producidas por el pinchazo con una aguja manchada de sangre o productos sanguíneos contaminados con virus).
Otro uso de los inhibidores del proteasoma consiste en prevenir la infección por virus de la hepatitis en personas con un alto riesgo de contraer una reinfección, por ejemplo en médicos, el personal de riesgo en edificios con un gran número de visitantes, drogadictos, personas que viajan a regiones altamente endémicas para los virus de la hepatitis, en el tratamiento de enfermos y para familiares de portadores crónicos del virus.
Otro uso más de los inhibidores del proteasoma consiste en evitar la reinfección con HBV en trasplantes de hígado y de otros órganos, así como en terapias celulares que se realizan administrando los agentes antes, durante y algún tiempo después del trasplante. La administración de estos agentes está indicada tanto en la situación de alto riesgo del trasplante de órganos exentos de virus a portadores crónicos del virus, que siempre presentan virus residuales que pueden infectar los órganos nuevos, como en la transferencia de órganos de donantes que presentan virus a pacientes exentos de virus.
La solución principal del objetivo se muestra en el ejemplo del DHBV. Se demuestra que tras añadir diferentes clases de sustancias inhibidoras del proteasoma se inhibe la producción de partículas víricas infecciosas por parte de las células ya infectadas.
Los inhibidores del proteasoma bloquean la liberación de partículas víricas infecciosas por parte de células infectadas de forma crónica con DHBV
De acuerdo con la invención, este fenómeno se muestra en el ejemplo de la no infectabilidad de hepatocitos primarios (pato, marmota, tupaia y hombre), de células del conducto biliar, de cultivos mixtos de hepatocitos y no hepatocitos, de células del sistema hematopoyético, así como de células de hepatoma establecido, con virus de la hepatitis B, C y D procedentes de células tratadas con inhibidores del proteasoma. Esto se demuestra asimismo in vivo mediante ensayos de infección análogos en modelos animales (modelo de ratón uPA/RAG2 repoblado con hepatocitos humanos, de marmota y de tupaia; con patos, marmotas y tupaias). El modo de proceder consiste en recoger partículas víricas de HBV, HCV, HDV y combinaciones de ellas de medios de células productoras tratadas durante diferentes tiempos con diferentes dosis de inhibidores del proteasoma y en ensayar la capacidad infecciosa de las partículas víricas por infección de células exentas de virus de la hepatitis. Para ello, las células antes mencionadas se incuban con las partículas víricas y a continuación se comprueba la infección o la ausencia de infección por análisis de los componentes intra- y extracelulares de los virus descendientes. El estado de la síntesis de novo de antígenos víricos, tales como, por ejemplo, proteínas superficiales y la proteína de la nucleocápsida, se ensaya concretamente mediante inmunotransferencia, ELISA y marcado metabólico. Asimismo se analizan los ácidos nucleicos del virus (ARN por transferencias Northern, ADN por transferencias Southern, así como por análisis de PCR y RT-PCR). Los antígenos víricos se detectan además en el microscopio por tinción inmunofluorescente indirecta con la ayuda de anticuerpos específicos para el virus.
En el ejemplo de los hepatocitos de pato infectados de forma crónica con DHBV se muestra de acuerdo con la invención que la vitalidad de los hepatocitos primarios básicamente no está alterada después del tratamiento con inhibidores del proteasoma y que, del mismo modo, la síntesis de proteínas básicamente no está bloqueada en estas células primarias. Sin embargo, en el marco de la descripción de la invención se observa que los viriones liberados en efecto no son infecciosos y, por lo tanto, no pueden provocar una reinfección en los hepatocitos primarios. El resultado de la invención demuestra, por lo tanto, que la inhibición de la ruta del proteasoma mediante inhibidores del proteasoma bloquea la producción de viriones de DHB infecciosos sin alterar significativamente la síntesis de proteínas en los hepatocitos.
La solución principal se muestra en el ejemplo de los hepatocitos primarios de pato infectados con preparaciones de DHBV.
Los hepatocitos primarios de pato infectados de forma crónica con DHBV, obtenidos por tratamiento con colagenasa a partir del hígado de embriones de pato (incubación de huevos de pato disponibles en el mercado) que con frecuencia ya están infectados con DHBV, se tratan con diferentes clases de inhibidores del proteasoma, incluidos aquellos inhibidores del proteasoma que ya se encuentran en la fase de estudio clínico para el tratamiento de pacientes con cáncer (por ejemplo, los inhibidores del proteasoma PS-341, PS-273, PS-519). Después del tratamiento con inhibidores del proteasoma se observa en el marco de la invención que los hepatocitos tratados han perdido en gran parte o por completo su capacidad de producir partículas víricas infecciosas. Gracias a estas novedosas actividades de los inhibidores del proteasoma, se puede partir de la base de que la administración de inhibidores del proteasoma tolerables in vivo suprime la propagación de la infección por hepadnavirus en el organismo infectado. En el marco de la invención también se puede partir de la base de que, con la novedosa estrategia antiviral, se puede eliminar por completo el reservorio de virus en el caso de una infección por hepadnavirus y lograr así una curación parcial o total de la hepatitis vírica. Esta reivindicación se basa, en particular, en el hecho de que con este novedoso tratamiento se puede evitar la propagación de la infección y, por lo tanto, la reinfección de hepatocitos. Aun cuando la síntesis intracelular de proteínas y ácidos nucleicos víricos en células ya infectadas no disminuye cuantitativamente de forma detectable, el tratamiento puede conducir a la eliminación completa del virus puesto que las células infectadas por virus de la hepatitis generalmente sólo poseen una vida limitada. La regeneración de los hepatocitos es especialmente alta en los pacientes con hepatitis. Por este motivo, el tratamiento con inhibidores del proteasoma debería evitar que se puedan reinfectar los hepatocitos, en principio exentos de virus, generados con mayor frecuencia en estos pacientes.
De acuerdo con la invención, se demuestra que el efecto inhibidor ejercido por los inhibidores del proteasoma sobre la proliferación vírica de hepadnavirus comprende los siguientes mecanismos:
1) Bloqueo/reducción de la liberación de nuevos viriones;
2) bloqueo/reducción de la capacidad infecciosa de los viriones liberados,
3) bloqueo/reducción de la propagación de la infección en cultivos de hepatocitos primarios;
4) bloqueo/reducción de la propagación de la infección en el hígado in vivo.
Para alcanzar el objetivo, se realizaron en el marco de la invención diferentes estudios proteoquímicos, moleculares-virológicos e inmunohistológicos en células infectadas con HBV. De acuerdo con la invención, el defecto en la capacidad infecciosa de los hepadnavirus causado por los inhibidores del proteasoma se muestra mediante procedimientos bioquímicos. Para ello se realizaron estudios de inmunotransferencia de Western con proteínas de DHBV.
En el marco de la descripción de la invención también se determina, por medición de inmunofluorescencia, el bloqueo de la reinfección de hepatocitos primarios con virus aislados de células tratadas con inhibidores del proteasoma. Las informaciones obtenidas permiten demostrar el efecto inhibidor que ejercen los inhibidores del proteasoma sobre la infección de hepatocitos primarios en cultivo. Con la ayuda de estos procedimientos se muestra que después del tratamiento de células infectadas con inhibidores del proteasoma, la célula en efecto ya no es capaz de liberar partículas víricas infecciosas. Estos estudios de infección in vitro muestran que diferentes clases de sustancias inhibidoras del proteasoma provocan el mismo efecto: el bloqueo de la producción de hepadnavirus infecciosos.
De acuerdo con la invención se muestra asimismo, mediante estudios de valoración hasta el punto final en hepatocitos primarios, la reducción de la capacidad infecciosa de los viriones de la hepatitis B inmaduros liberados a causa de los inhibidores del proteasoma. Se demuestra que una sola incubación con inhibidores del proteasoma durante 48 horas (aproximadamente el tiempo que dura un ciclo de replicación del HBV) conduce al bloqueo total de la capacidad infecciosa, pues con los procedimientos usados en efecto no se pudo observar ningún título de virus en los sobrenadantes del cultivo celular de células tratadas con inhibidores del proteasoma.
En el ejemplo del DHBV se demuestra de acuerdo con la invención que bajo el tratamiento con inhibidores del proteasoma está alterada la modificación bioquímica de la proteína de la nucleocápsida. Sorprendentemente se observó que las proteínas nucleares que se expresan bajo el tratamiento con inhibidores del proteasoma muestran una alteración del peso molecular. Esta nueva observación permite deducir que existe una alteración en la fosforilación de la proteína de la nucleocápsida. Como resultado de esta observación se puede decir, por lo tanto, que la alteración en la modificación de la proteína de la nucleocápsida constituye la base mecanística para la capacidad infecciosa reducida de los DHBV secretados por las células tratadas con inhibidores del proteasoma.
En el marco de la invención se muestra por primera vez que, sorprendentemente, tras la inactivación del UPS mediante el tratamiento de hepatocitos primarios infectados de forma crónica con DHBV, se bloquea la liberación de partículas infecciosas de DHBV. La capacidad infecciosa específica de los viriones liberados está drásticamente reducida. Con los procedimientos habituales para la determinación de la capacidad infecciosa no se puede detectar ningún título específico de partículas víricas producidas de nuevo en los sobrenadantes del cultivo celular, por lo que se aplicó un ensayo de infección individual (véase a este respecto el ejemplo de realización 7). Para ello, de acuerdo con la invención se infectan hepatocitos primarios de pato obtenidos de hígados de embriones de pato y cultivados in vitro con sobrenadantes de cultivos celulares con contenido en DHBV. Estos sobrenadantes de cultivos celulares con contenido en DHBV se obtuvieron de hepatocitos primarios de pato infectados de forma crónica con DHBV y tratados durante dos días con 10 \muM de inhibidores del proteasoma. Un cultivo paralelo no recibió inhibidores. El tratamiento de los cultivos productores de virus se inició en el momento de máxima producción de virus (aproximadamente un 90% de los hepatocitos de un cultivo primario de hepatocitos se encuentra en la fase de infección aguda). La cantidad de viriones de DHB liberados se determina mediante el análisis del ADN extraído de las partículas víricas por hibridación puntual de ADN, así como mediante el análisis de la proteína nuclear vírica por inmunotransferencia de Western. Se observó una reducción de 5 a 10 veces en la cantidad de viriones de DHB liberados.
La capacidad infecciosa específica de los viriones de DHB recién producidos se determina por valoración en cultivos permisivos de hepatocitos primarios de pato. La determinación del número de células infectadas se lleva a cabo por inmunotinción nuclear y de preS. Cuando como inóculo se usan diferentes diluciones de los sobrenadantes del cultivo celular, se observa que en las células que se incubaron con sobrenadantes de cultivo celular procedentes de cultivos tratados con inhibidores del proteasoma no se puede detectar ni un solo suceso de infección. En ninguno de los cultivos usados para la valoración se pudo detectar por inmunofluorescencia para las proteínas nucleares y preS de DHBV ni una célula reinfectada. Con este resultado se reivindica de acuerdo con la invención una nueva actividad de los inhibidores del proteasoma (véase a este respecto el ejemplo de realización 8).
Esta nueva actividad de los inhibidores del proteasoma no se puede atribuir a alteraciones del metabolismo celular meramente inespecíficas debidas a la inactivación del UPS, por los siguientes motivos: Esta falta total de viriones de DHB infecciosos no se debe a una inhibición general de la síntesis de proteínas y de la expresión de DHBV en la célula productora, puesto que, por una parte, no se observaron efectos tóxicos en hepatocitos primarios de pato durante el tratamiento de 2 días con inhibidores del proteasoma y, por otra, el análisis de la expresión de proteínas intracelulares de DHBV mediante la técnica de inmunotransferencia de Western no mostró ningún efecto significativo de la inhibición del proteasoma sobre la expresión de la proteína nuclear de DHBV (véase el ejemplo de realización 8).
La eficacia de los inhibidores del proteasoma en cuanto al bloqueo de la ruta del proteasoma en los hepatocitos tratados se determinó por análisis de inmunotransferencia de Western usando anticuerpos que reconocen proteínas poliubiquitinadas. Está claro que todos los inhibidores del proteasoma ensayados producen una notable acumulación de proteínas poliubiquitinadas. Por lo tanto, se puede decir que estos inhibidores presentan una eficacia absoluta en hepatocitos primarios.
En otra forma de realización de la invención se muestra que el tratamiento de líneas celulares de hepatoma humano infectadas de forma crónica con HBV con inhibidores del proteasoma provoca la liberación de proteínas específicas de HBV, especialmente de los antígenos HBs y HBe (véase a este respecto el ejemplo de realización 10). Se observó una clara inhibición de la secreción de proteínas de HBV, que era equivalente al efecto que tienen los inhibidores del proteasoma sobre DHBV.
En otra forma de la invención se muestra que, debido al nuevo efecto que presentan sobre la liberación e capacidad infecciosa de los virus de la hepatitis, los inhibidores del proteasoma impiden la propagación de la infección por HBV en hepatocitos cultivados. De acuerdo con la invención se demuestra que se evita por completo una infección secundaria, es decir, la transmisión de una infección ya establecida a células vecinas. Este efecto inhibidor sobre la infección secundaria se demostró en hepatocitos primarios de pato que después de la infección primaria se trataron durante varios días con inhibidores del proteasoma. Como consecuencia de los nuevos efectos de los inhibidores del proteasoma, se detectó en las células infectadas de forma primaria y tratadas tanto una menor expresión de los antígenos víricos como también, debido al bloqueo de la infección secundaria, un menor número de células reinfectadas (véase a este respecto el ejemplo de realización 8).
De acuerdo con la invención, este efecto inhibidor que ejercen los inhibidores del proteasoma sobre la infección secundaria con DHBV es comparable al efecto farmacológico del fármaco suramina, del que se sabe que bloquea selectivamente la infección secundaria con HBV sin interferir en la infección primaria ya establecida. A diferencia de los inhibidores del proteasoma usados, la suramina, en cambio, es una sustancia muy tóxica que no se puede usar in vivo para el tratamiento de infecciones de tipo hepatitis. Además, al contrario que en el caso de la suramina, la inhibición de la actividad del proteasoma reduce de forma aditiva la expresión de los genes de HBV y produce de acuerdo con la invención la superposición de dos efectos antivirales de los inhibidores del proteasoma, es decir, la inhibición tanto de la infección primaria como secundaria.
Los inhibidores del proteasoma inducen la muerte celular de células de carcinoma de hígado mientras que los hepatocitos primarios son relativamente resistentes a los inhibidores del proteasoma
En otro aspecto de la invención se muestra que los inhibidores del proteasoma inducen la muerte celular de células de carcinoma de hígado. De acuerdo con la invención, se demuestra en el ejemplo de hepatocitos de pato en cultivo que los hepatocitos primarios son relativamente resistentes a los inhibidores del proteasoma hasta una concentración de aproximadamente 10 \muM, mientras que las células de carcinoma de hígado ya son destruidas a concentraciones 100 veces menores de los inhibidores del proteasoma.
La inducción de la muerte celular (causada por procesos apoptóticos, necróticos u otros) de células de carcinoma de hígado productoras de HBV después del tratamiento con inhibidores del proteasoma se demuestra de acuerdo con la invención en el ejemplo de líneas celulares de carcinoma de hígado humano (por ejemplo, HepG.2.2.15). Este nuevo mecanismo se demuestra por tinción de exclusión de azul de tripano (las células vivas no se tiñen, las células muertas absorben el colorante), detección por inmunofluorescencia de la exposición de anexina V en la superficie, detección de la fragmentación de ADN, detección por inmunotransferencia y detección por tinción fluorescente de caspasas procesadas y activadas y detección enzimática de la actividad de la caspasa. En otra forma de realización de la invención se ensaya en una línea celular de hepatoma de pollo (LMH) y en hepatocitos primarios de pato (infectados con DHBV y no infectados) y de pollo (no infectados con DHBV) la toxicidad selectiva de los inhibidores del proteasoma para células de hepatoma en comparación con hepatocitos no transformados.
La destrucción preferida de células de carcinoma de hígado se debe, de acuerdo con la invención, al efecto antineoplásico de los inhibidores del proteasoma. Por ejemplo, el inhibidor del proteasoma conocido PS-341 posee una actividad citotóxica selectiva frente a un amplio espectro de células tumorales humanas, una actividad que está relacionada con la acumulación de p21 y la detención del ciclo celular en la fase G2-M, seguida de apoptosis. La expresión, modificación y actividad de la proteína supresora de tumores p53 también se ven afectadas por el efecto de los inhibidores del proteasoma. De acuerdo con la invención se puede lograr, mediante estos y otros mecanismos, la eliminación selectiva de células de carcinoma de hígado, que, a consecuencia de una infección por HBV y una infección por HCV o de una coinfección correspondiente con ambos virus o una coinfección de HDV/HBV, se generan con una frecuencia de más de 100 veces mayor que en células no infectadas.
En otra forma de realización de la invención se observa por primera vez que los inhibidores del proteasoma causan relativamente pocos efectos tóxicos en hepatocitos primarios pero provocan la destrucción preferida de células de carcinoma de hígado. De acuerdo con la invención se demuestra a este respecto que los hepatocitos primarios toleran un tratamiento de varios días con unas concentraciones de hasta 10 \muM de los inhibidores del proteasoma. Por el contrario, las células de carcinoma de hígado humano mueren ya a concentraciones 1.000 veces menores de los inhibidores del proteasoma (véase a este respecto el ejemplo de realización 9). La diferente toxicidad de los inhibidores del proteasoma sobre hepatocitos primarios y sobre células de hepatoblastoma humano se analizaron en estudios de limitación de dosis con inhibidores del proteasoma. La vitalidad de las células se comprobó en el microscopio óptico. Se trataron durante varios días cultivos paralelos con concentraciones crecientes de inhibidores del proteasoma (10 \muM, 3 \muM, 1 \muM, 10 nM y 1 nM). Adicionalmente se determinó la funcionalidad de los hepatocitos mediante tinción vital con fluorescencia. En esta ocasión se observó de acuerdo con la invención que los hepatocitos primarios de pato pueden tolerar unas concentraciones relativamente altas, de hasta aproximadamente 10 \muM, de inhibidores del proteasoma, mientras que las células de carcinoma de hígado proliferativas son mucho más sensibles al efecto tóxico de los inhibidores del proteasoma.
Uso de inhibidores del proteasoma en el tratamiento de infecciones causadas por virus de la hepatitis
El principio presentado en la descripción de la invención de usar los inhibidores del proteasoma para bloquear una infección por hepadnavirus es novedoso en cuanto a que se usa una clase de sustancias ya conocida (los inhibidores del proteasoma) para una nueva actividad que se puede resumir en los siguientes términos terapéuticos:
- el bloqueo de la producción de hepadnavirus infecciosos y, por lo tanto, la inhibición de la propagación de la infección in vivo en el tejido hepático de una persona infectada;
- la inducción de la muerte de células de carcinoma de hígado generadas como consecuencia directa o indirecta de una infección por hepadnavirus.
Al mismo tiempo, el uso de inhibidores del proteasoma también es novedoso en cuanto al principio de acción. Hasta ahora no se conocen sustancias/principios/procedimientos que actúen sobre procesos tardíos de la replicación de hepadnavirus, especialmente sobre la liberación de viriones infecciosos. Asimismo es nuevo que el uso de inhibidores del proteasoma conduce al bloqueo de la replicación de los virus de la hepatitis. Este mecanismo de inhibición está conservado en todas las células huésped del virus, los hepatocitos. En comparación con los procedimientos antivirales actuales para el tratamiento de infecciones de tipo hepatitis, que se dirigen directamente a componentes esenciales del virus, la probabilidad de que se generen mecanismos de resistencia durante la administración de los inhibidores del proteasoma en el tratamiento de infecciones por hepadnavirus es de un orden de magnitud menor. La originalidad de este principio de acción de los inhibidores del proteasoma también se manifiesta en el hecho de que los inhibidores del proteasoma poseen un amplio espectro de actividad frente a diversos virus de la hepatitis (HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, HGV). En el marco de la invención se observó el efecto inhibidor con la misma intensidad en diferentes virus de la hepatitis tanto primarios como clonados.
Asimismo es novedoso el principio de acción de los inhibidores del proteasoma por medio del cual éstos evitan la producción de partículas víricas infecciosas por parte de las células ya infectadas con hepadnavirus. De este modo se reduce considerablemente la cantidad de viriones infecciosos (carga de virus) y, con ello, la propagación de la infección in vivo.
La suma de estos mecanismos novedosos permite constatar que, en el caso de una administración in vivo de los inhibidores del proteasoma, la liberación reducida de partículas víricas poco o nada infecciosas, junto con la muerte celular de células de carcinoma productoras de virus, reduce, como efecto neto, la cantidad de viriones infecciosos en un organismo infectado con hepadnavirus. De este modo se reduce el número total de células productoras infectadas en el tejido hepático. Esto hace atractiva la administración de los inhibidores del proteasoma, solos o en combinación con agentes terapéuticos ya usados en la terapia antiviral de hepadnavirus.
En el marco de la invención se observa por primera vez que los inhibidores del proteasoma inhiben el mantenimiento y la persistencia de una infección ya establecida al mismo tiempo que bloquean por completo la infección secundaria de hepatocitos y, por tanto, la propagación in vivo de la infección por virus de la hepatitis. De acuerdo con la presente invención, los inhibidores del proteasoma son sustancias adecuadas para bloquear la propagación in vivo de una infección por HBV.
La ventaja esencial de la invención consiste en que el tratamiento con inhibidores del proteasoma puede desencadenar dos efectos esenciales para el combate de las infecciones víricas de tipo hepatitis: Por una parte, se inhibe la producción de partículas víricas infecciosas y, con ello, la propagación de la infección en el organismo. Por otra parte, se impide la generación, el crecimiento y la metastatización de tumores hepatocelulares, que aparecen muy a menudo como consecuencia de una infección por virus de la hepatitis tras una fase de latencia. Además, los inhibidores del proteasoma destruyen los carcinomas de hígado ya existentes pero no las células hepáticas normales que proliferan poco o nada.
Por lo tanto, con este novedoso procedimiento terapéutico se pueden obtener múltiples efectos terapéuticos usando los inhibidores del proteasoma en infecciones causadas por hepadnavirus. Además de bloquear la capacidad infecciosa de los virus liberados y evitar la aparición de carcinomas hepatocelulares, otra ventaja de este procedimiento terapéutico reside en que con esta estrategia se atacan factores celulares que son esenciales para la replicación de los hepadnavirus pero que presentan una estabilidad genética mucho mayor que los factores víricos. Gracias a esta estabilidad genética de la estructura diana no se ha de temer con esta novedosa estrategia antiviral la aparición de fenómenos de resistencia, como los que se conocen para muchos de los inhibidores conocidos hasta ahora para una infección por HBV. Esto es válido especialmente para los mutantes de la polimerasa de los virus de la hepatitis B y C, que prácticamente siempre aparecen al cabo de un tiempo relativamente corto durante el tratamiento con análogos de nucleósidos. Esto también es válido para las variantes que escapan al sistema inmunológico, como las que aparecen por vacunación pasiva y activa, así como de forma natural. Lo mismo es válido para las cepas de HBV y HCV resistentes a interferón. La reivindicación de la invención se basa en este novedoso efecto de los inhibidores del proteasoma, en que con el tratamiento con inhibidores del proteasoma no sólo se puede evitar la propagación de una infección por HBV sino que también se pueden tratar carcinomas hepatocelulares causados por HBV.
La invención se explica con más detalle mediante ejemplos de realización.
Ejemplos de realización Ejemplo 1 La inhibición de la actividad del proteasoma no influye significativamente en la expresión de genes víricos intracelulares pero bloquea drásticamente la liberación de partículas víricas por parte de hepatocitos infectados de forma crónica con DHBV
Se obtuvieron hepatocitos primarios de pato y otras células no parenquimatosas del hígado a partir de embriones de pato por tratamiento con colagenasa siguiendo básicamente un procedimiento ya descrito (Köck y col., 1993). En un criadero (Wichmann, Alemania) se compraron huevos de pato pequinés fecundados. La incubación de los huevos se llevó a cabo en un incubador automático durante al menos 21 días a 37ºC y una humedad del 50%. Tras abrir el huevo y extraer el embrión, éste se sacrificó y se le extrajo la sangre. A continuación se extirpó el hígado bajo exclusión de la vesícula biliar, se trituró mecánicamente, se suspendió en 3 ml de medio E de Williams (GIBCOBRL, Paisley, Escocia) con un 0,5% de colagenasa (Sigma, Deisenhofen, Alemania) y se digirió durante 1 h a 37ºC. Las células se lavaron dos veces con medio E de Williams nativo, y las células vitales y disociadas se separaron de los agregados celulares y restos celulares grandes por centrifugación a través de 10% de Percoll (Sigma, Deisenhofen, Alemania). En paralelo se analizó la presencia de una infección natural congénita por DHBV en los sueros sanguíneos extraídos por análisis de hibridación puntual de proteínas con suero anti-PreS (Sunjach y col., 1999). Los hepatocitos de animales positivos para DHBV se combinaron y se usaron en este experimento. Las células se resuspendieron en medio E de Williams (GIBCOBRL, Paisley, Escocia) suplementado con L-glutamina 2 mM (GIBCOBRL, Paisley, Escocia), 100 unidades/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina (Biochrom, Berlín, Alemania), HEPES (ácido N-[2-hidroxietil]piperazin-N'-[2-etanosulfónico]) 15 mM (pH 7,2) (todos de GIBCOBRL, Paisley, Escocia), hidrocortisona 10^{-5} M, insulina 10^{-9} M y 1,5% de DMSO (todos de Sigma, Deisenhofen, Alemania), se sembraron en placas de microvaloración de 12 pocillos (Greiner, Solingen, Alemania) a una densidad de aproximadamente 8 x 10^{5} por pocillo y se cultivaron a 37ºC. Aproximadamente 4 h después del sembrado en placas se cambió el medio, y 24 h más tarde se realizó otro cambio de medio. De aquí en adelante, el medio se cambió cada 2 a 3 días, salvo que se indique otra cosa. Una semana después del sembrado de la mezcla de hepatocitos primarios y otras células hepáticas se volvió a cambiar el medio de cultivo, y las células se incubaron con un medio nuevo que contenía ahora diferentes concentraciones de IP (10 \muM, 3 \muM, 1 \muM, 10 nM y 1 nM) o ningún inhibidor. El IP se disolvió en PBS tal y como se ha descrito (Adamas y Stein, 1996; Adams y col., 1996) y se añadió al medio una alícuota de la solución madre concentrada 1.000 veces. Durante la fase de tratamiento se comprobó la morfología de las células cada 12 h (horas) en el microscopio óptico. Sólo a una concentración de 10 \muM de IP se observaron las primeras alteraciones morfológicas que indicaban toxicidad. Éstas aparecieron después de aproximadamente 48 h de tratamiento y comprendían una vacuolización de gránulos finos, la pérdida de corpúsculos macrovacuolares, así como el aplanamiento de los hepatocitos, mientras que en las células no parenquimatosas era el redondeamiento, el encogimiento y el desprendimiento del fondo de la placa de cultivo celular lo que marcaba el cuadro. A concentraciones inferiores a 10 \muM de IP no se observaron en los hepatocitos, ni siquiera después de un tiempo de tratamiento de 48 h, alteraciones morfológicas significativas que pudieran deberse a alteraciones del metabolismo celular condicionadas por el IP.
Por el contrario, el tratamiento continuo con IP 1 \muM durante 72 h no era compatible con la vitalidad de las células no parenquimatosas. La imagen de contraste de fases (Figura 1) muestra una región relativamente grande correspondiente a un antiguo conglomerado de células no parenquimatosas, en la que después del tratamiento con IP 1 \muM ya casi no existen células adherentes. Los hepatocitos, en cambio, conservan su morfología normal (Figura 1, flecha ancha). La tinción con Höchst (Figura 1) confirma que las demás células no parenquimatosas están redondeadas y picnóticas (flechas).
Después de tratar los hepatocitos infectados de forma crónica por DHBV durante 48 h con diferentes dosis de IP (10 \muM, 3 \muM, 1 \muM, 10 nM y 1 nM) o sin inhibidor, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos celulares y se centrifugaron (4.000 rpm durante 5 min). La cantidad de partículas víricas liberadas se determinó mediante una hibridación puntual específica para el antígeno PreS (Figura 2) y una inmunotransferencia (Figura 3) (Bruns y col., 1998). Para el análisis de hibridación puntual se aplicaron mediante un aparato (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) puntualmente alícuotas de 300 \mul sobre una membrana de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania), se secaron al aire y a continuación se lavaron con PBS (tampón fosfato). Para el análisis de inmunotransferencia de Western se desnaturalizaron 5 \mul de sobrenadante hirviéndolos durante 5 min tras añadir tampón de muestra para SDS-PAGE. A continuación, las muestras se separaron en SDS-PAGE al 12,5% y se electrotransfirieron a nitrocelulosa mediante la técnica de trasferencia semiseca (Biorad, Munich, Alemania).
Tras bloquearlas con leche desnatada al 5% se llevó a cabo la incubación de las membranas con un antisuero específico para PreS (anti-PreS Kpn de conejo; Fernholz y col., 1993). Las proteínas marcadas se visualizaron con el procedimiento de quimioluminiscencia intensificada (ECL) (Pierce, Rockford, EE.UU.). Las Figuras 2 y 3 muestran que el tratamiento de cultivos de hepatocitos infectados por DHBV con inhibidores del proteasoma conduce a una drástica disminución dosis-dependiente de la proteína PreS en el medio. Incluso a una concentración relativamente baja de IP (0,01 \muM) se observó una inhibición de casi 10 veces en la liberación de partículas subvíricas (Figura 3). Puesto que la proteína PreS es un componente estructural de todas las partículas víricas (partículas subvíricas vacías y viriones infecciosos que contienen ADN), la cantidad de proteína PreS en la hibridación puntual y la inmunotransferencia de Western refleja directamente la cantidad de partículas víricas con envuelta que son secretadas al medio durante el periodo de tratamiento.
El efecto de los inhibidores del proteasoma sobre la cantidad de partículas víricas que contienen el genoma y que son liberadas al medio se analizó mediante hibridación puntual de ADN (Sunjach y col., 1999). Después de tratar los hepatocitos infectados de forma crónica por DHBV durante 48 h con diferentes dosis de IP (10 \muM, 3 \muM, 1 \muM y 10 nM) o sin inhibidor, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos celulares y se centrifugaron (4.000 rpm durante 5 min). Después de la aplicación puntual de las muestras (200 \mul en cada caso) sobre una membrana de nitrocelulosa, ésta se desnaturalizó 2 veces durante 1,5 min sobre papel Whatman 3MM (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) con un tampón alcalino (NaOH 0,5 M y NaCl 1,5 M) y a continuación se renaturalizó 4 veces durante 1 min sobre papel Whatman 3MMM con un tampón neutro (Tris-HCl 0,5 M, pH 7,4 y NaCl 3 M). Tras el secado al aire y la reticulación de la membrana, se llevó a cabo su hibridación con genoma de DHBV clonado y marcado con ^{32}P como sonda. Las señales se visualizaron por autorradiografía según un protocolo convencional (Sunjach y col., 1999). La Figura 4 muestra que el IP reduce al menos aproximadamente 4 veces la cantidad de partículas víricas completas liberadas. Por lo tanto, el resultado de la determinación del ADN está correlacionado con la cantidad de antígeno PreS secretado, que se ha reducido de modo similar (Figuras 2 y 3).
Para estudiar la influencia que ejerce el tratamiento con inhibidores del proteasoma sobre la expresión intracelular de DHBV, las células tratadas en paralelo y las no tratadas se lisaron con 200 \mul de tampón (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 1%, desoxicolato sódico 1%) complementado con un cóctel de inhibidores del proteasoma (Complete, Roche, Mannheim). Los lisados se separaron de la fracción celular insoluble por centrifugación (14.000 rpm, 10 min, 4ºC), y se desnaturalizaron 20 \mul de cada lisado total aclarado hirviéndolos durante 5 min tras añadir tampón de Laemmli. A continuación, las muestras se separaron en SDS-PAGE al 12,5% y se transfirieron a nitrocelulosa mediante la técnica de transferencia semiseca (Biorad, Munich, Alemania). Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% (Biorad, Munich, Alemania) y, tras lavarlas con TBS (tampón Tris), se incubaron con anticuerpos contra PreS (Fernholz y col., 1993) o contra la proteína nuclear (Breiner y col., 2001) (Figuras 5 y 6). Las proteínas víricas marcadas se visualizaron a continuación mediante quimioluminiscencia intensificada (Pierce, Rockford, EE.UU.).
Las Figuras 5 y 6 muestran que bajo el tratamiento con inhibidores del proteasoma no se produce ninguna alteración significativa en las cantidades de las proteínas PreS (Figura 5) y nuclear (Figura 6) en estado estacionario. Únicamente a la concentración máxima de IP (10 \muM) se observa una ligera disminución en las proteínas víricas. Cabe señalar que, por ejemplo, 10 nM de IP no presenta ningún efecto sobre la expresión intracelular de proteínas víricas pero todavía tiene un claro efecto sobre la liberación.
La suma de estos resultados permite constatar que el tratamiento de hepatocitos primarios de pato infectados de forma crónica con una concentración de IP de hasta 10 \muM durante un periodo de tratamiento de 48 h influye sólo ligeramente o nada en la expresión intracelular de los antígenos nuclear y PreS, mientras que la liberación de partículas víricas está drásticamente reducida. Asimismo se puede concluir que la vitalidad y la síntesis de proteínas de los hepatocitos primarios de pato básicamente no se ven afectadas.
Para demostrar la eficacia del tratamiento de los hepatocitos primarios de pato con inhibidores del proteasoma en cuanto al bloqueo del UPS, se suspendieron 20 \mul de cada lisado celular en tampón de muestra para SDS-PAGE, se hirvieron durante 5 min y se separaron en SDS-PAGE al 6%. Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa, se incubaron con anticuerpos policlonales anti-ubiquitina de conejo (Sigma, Deisenhofen, Alemania) y se visualizaron mediante una reacción de ECL siguiente. En la Figura 7 se muestra que a partir de una concentración de IP de 1 \muM se produce una clara acumulación de proteínas poliubiquitinadas respecto a las bandas de bajo peso molecular. Se sabe que el tratamiento prolongado con inhibidores del proteasoma conduce a una alteración tanto en la síntesis como en el patrón de proteínas. Ésta se reconoce claramente por el perfil alterado de las proteínas de bajo peso molecular en las células tratadas con IP y, por lo tanto, constituye otra prueba más de la eficacia de los IP en el bloqueo eficaz de la actividad proteasómica en hepatocitos primarios.
Ejemplo 2 Los inhibidores del proteasoma bloquean la producción/liberación de virus infecciosos por parte de hepatocitos primarios infectados de forma crónica por DHBV
En los experimentos precedentes (ejemplo 1) se observó que la inhibición de la actividad proteasómica celular limita considerablemente la liberación de las proteínas de DHBV sin influir significativamente en la expresión intracelular de las proteínas víricas. Por lo tanto, quedaba por aclarar si el tratamiento con inhibidores del proteasoma sólo reduce aproximadamente 4 veces la secreción de partículas víricas o si también presenta un efecto negativo sobre el grado de capacidad infecciosa de los virus descendientes. Por consiguiente, se estudió la existencia y la cantidad de viriones infecciosos presentes en los sobrenadantes de hepatocitos primarios de pato infectados de forma crónica por DHBV y tratados con inhibidores del proteasoma en comparación con células no tratadas. Para ello, se trataron hepatocitos primarios de pato de unos 7 días de edad, infectados de forma crónica por DHBV, cuya preparación está descrita en el ejemplo 1, durante 48 h con IP 10 \muM. A continuación se recogieron los sobrenadantes de los cultivos celulares como se describió en el ejemplo 1 y se usaron para la reinfección de hepatocitos primarios. Se prepararon hepatocitos primarios de pato negativos para DHBV como se describió en el ejemplo 1 y se sembraron en placas de microvaloración de 12 pocillos a una densidad de aproximadamente 8 x 10^{5}/pocillo. Una semana después del sembrado en placas, las células se infectaron por adición de 1 ml de sobrenadantes exentos de células, procedentes de cultivos celulares positivos para DHBV tratados o no tratados con IP. Como control se infectó un cultivo paralelo con 20 \mul de suero positivo para DHBV/pocillo (equivale a una multiplicidad de infección (MOI) de 20). Tras una incubación de 16 h a 37ºC se eliminó el inóculo de virus, las células se lavaron con PBS y a continuación se siguieron cultivando en medio nuevo. El establecimiento de una infección productiva se determinó después de 2,5 días por inmunofluorescencia indirecta y SDS-PAGE para las proteínas víricas nuclear y PreS. Para la tinción inmunofluorescente, las células se lavaron con PBS y a continuación se fijaron durante 10 min a temperatura ambiente con 1 ml de una mezcla 1:1 helada de metanol y acetona. Las células fijadas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con el primer anticuerpo, anti-PreS de conejo (Breiner y col., 2001), en una dilución de 1:800 en PBS. Después del lavado con PBS se llevó a cabo una incubación de 30 minutos con el anticuerpo secundario acoplado a Alexa 488 (anti-conejo de cabra, Molecular Probes, Leiden, Países Bajos). Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst (4 \mug/ml) (Sigma, Deisenhofen, Alemania). Las fluorescencias se analizaron con un microscopio invertido de epifluorescencia (Axiovert S100, Carl Zeiss, Göttingen, Alemania) y se procesaron mediante el sistema de procesamiento de imágenes Openlab (Improvision, Coverty, RU). Las imágenes de inmunofluorescencia muestran que en los cultivos celulares que se infectaron con DHBV procedentes de sobrenadantes de cultivos celulares de células tratadas con IP no se pudo detectar ninguna célula que expresara PreS (Figura 8, PreS), mientras que aproximadamente 1 a 5% de los hepatocitos de los cultivos que se incubaron con sobrenadantes de células no tratadas eran claramente positivas para PreS y, por lo tanto, estaban infectadas (Figura 9, PreS). Para determinar el número de células presentes en el portaobjetos se tiñeron sus núcleos celulares con Hoechst, y esta imagen se superpuso a las imágenes de fluorescencia (para las células tratadas, véase la Figura 8, y para las células no tratadas, véase la Figura 9, combinación Hoechst y PreS).
Para los análisis de inmunotransferencia de Western, las células procedentes de cultivos paralelos se lisaron directamente con 200 \mul de tampón de Laemmli y se hirvieron durante 5 min. Se separaron 20 \mul de cada lisado celular en SDS-PAGE al 12,5% y se transfirieron a nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con anticuerpos contra la proteína PreS (Fernholz y col., 1993) o nuclear (Breiner y col., 2001) y las proteínas se visualizaron por ECL. Las transferencias muestran señales claramente visibles para las proteínas PreS (Figura 10, carril 3) y nuclear (Figura 11, carril 3) en los extractos de células que se infectaron con DHBV procedente de células no tratadas, pero, en cambio, prácticamente ningún indicio de la expresión de proteínas de DHBV en células que se incubaron con sobrenadantes de cultivos celulares de células tratadas con IP (Figura 10, carril 4, y Figura 11, carril 4, respectivamente).
Ejemplo 3 Los inhibidores del proteasoma bloquean tanto la fase temprana de una infección aguda por DHBV como la infección secundaria posterior y, por lo tanto, su propagación en el cultivo celular
En los ejemplos de realización precedentes se mostró que los inhibidores del proteasoma no sólo inhiben la secreción de nuevas partículas víricas y subvíricas por parte de hepatocitos infectados de forma crónica con HDBV, sino que también bloquean prácticamente por completo la capacidad infecciosa de los pocos viriones de DHB liberados. Por lo tanto, se puede suponer que los inhibidores del proteasoma pueden evitar la transmisión de una infección ya establecida (por virus descendientes liberados por parte de hepatocitos ya infectados) a células no infectadas, la denominada infección secundaria. Este efecto se estudió en el siguiente experimento: Se prepararon hepatocitos primarios procedentes de animales negativos para DHBV siguiendo exactamente la metodología descrita en el ejemplo 1, el medio se cambió de nuevo 4 días después de sembrar las células en placas de microvaloración de 12 pocillos (aproximadamente 8 x 10^{5} células/pocillo) y las células se infectaron con una MOI de 20. Después de una incubación de 16 h, las células se lavaron con PBS y a continuación se siguieron cultivando en medio nuevo durante otros 3 días. En este periodo de tiempo sólo se produce el establecimiento de la infección primaria. Después se volvió a cambiar el medio, se añadió a cultivos paralelos 1 \muM de los inhibidores del proteasoma eponemicina o epoxomicina y los cultivos se incubaron durante otros 3 días. Como consecuencia del efecto antes descrito de los inhibidores del proteasoma, las células infectadas de forma primaria y tratadas deberían mostrar, en comparación con las células no tratadas, tanto una menor expresión de los antígenos víricos como también (a causa del bloqueo de la infección secundaria) un número claramente menor de células infectadas. Para comprobarlo, los cultivos celulares se fijaron y se determinó el número de células positivas para la proteína nuclear y su tasa de expresión a nivel individual mediante inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos contra la proteína nuclear. En efecto, los inhibidores del proteasoma usados inhiben la persistencia de una infección productiva ya establecida (como se aprecia claramente en la Figura 16 (proteína nuclear, IP, eponemicina y epoxomicina), como se puede deducir del número mucho menor de células positivas para la proteína nuclear en comparación con los cultivos no tratados (Figura 12, no tratados). Como comparación se muestran las imágenes de contraste de fases (Figura 12, CF), así como la tinción con Hoechst (Figura 12, Hoechst) de los mismos recortes de imagen.
Para averiguar si los inhibidores del proteasoma inhiben la liberación del denominado antígeno e, que es necesario para el establecimiento de una infección crónica (Chen y col., 1992), se determinó la cantidad de antígeno e en el medio mediante inmunotransferencia y se correlacionó con el antígeno PreS, también ensayado. Para ello, las proteínas presentes en una alícuota de los medios de cultivo celular (20 \mul) se separaron en SDS-PAGE al 12,5%, se transfirieron a nitrocelulosa y se detectaron las proteínas antigénicas e y PreS mediante ECL con anticuerpos de conejo contra la proteína nuclear (presenta reacción cruzada con el antígeno e, Breiner y col., 2001) o PreS. Como se aprecia en las Figuras 13 y 14, el tratamiento con inhibidores del proteasoma produce una reducción significativa de la cantidad de antígenos e y PreS en el medio. La tinción de los geles con azul de Coomassie dio como resultado que los inhibidores del proteasoma sólo inhiben específicamente la secreción de las proteínas víricas ensayadas pero no la de determinadas proteínas celulares.
Resumiendo, estos resultados demuestran que el tratamiento con inhibidores del proteasoma produce una drástica reducción de la liberación de los antígenos e y PreS.
Para demostrar que el menor número de células positivas para DHBV en las células tratadas con inhibidores del proteasoma se debe realmente al bloqueo de la infección secundaria, las células se trataron tres días después de la infección con 100 \mug/ml de suramina (Sigma, Deisenhofen, Alemania) durante tres días. Se sabe que la suramina, una sustancia muy tóxica in vivo, bloquea la infección secundaria sin interferir en la infección primaria por DHBV ya establecida (Pugh y Simmons, 1994). Por otra parte, los hepatocitos tratados previamente con suramina son resistentes a una infección por DHBV. Por consiguiente, en las células tratadas con suramina (Figura 15, suramina 3 d post-infección) se observa tres días después de la infección primaria una tinción de la proteína nuclear en las células de intensidad similar a la de los cultivos no tratados (Figura 15, no tratado), pero el número de células que expresan la proteína nuclear es mucho menor. Como era de esperar, el tratamiento previo de las células con suramina bloquea por completo el establecimiento de la infección primaria (Figura 15, suramina 2 h pre-infección). Como comparación se muestran igualmente las correspondientes imágenes de contraste de fases (Figura 15, CF) y tinciones con Höchst (Figura 15, Höchst) de los mismos recortes de imagen. En resumen, estos experimentos demuestran que los inhibidores del proteasoma pueden evitar, de forma similar a la suramina, la propagación de la infección por DHBV bloqueando la infección secundaria. Además de ello y al contrario que en el caso de la suramina, la inhibición de la actividad proteasómica reduce de forma aditiva la expresión de genes víricos en hepatocitos infectados de forma primaria. Los efectos de los inhibidores del proteasoma sobre la infección tanto primaria como secundaria están estrechamente correlacionados con el potencial de las diferentes clases de sustancias usadas.
En conjunto, estos experimentos demuestran que los inhibidores del proteasoma inhiben tanto el establecimiento como la persistencia de una infección primaria. Además evitan la propagación de la infección primaria por DHBV bloqueando los virus descendientes. Por lo tanto, los inhibidores del proteasoma son sustancias adecuadas para bloquear la propagación de una infección por HBV in vivo.
Ejemplo 4 Los inhibidores del proteasoma inducen hipofosforilación de la proteína nuclear en hepatocitos primarios infectados de forma crónica con DHBV
En los ejemplos de realización precedentes se demostró que los inhibidores del proteasoma no sólo inhiben la secreción de nuevas partículas víricas y subvíricas por parte de los hepatocitos, sino que también bloquean prácticamente por completo la capacidad infecciosa de los pocos viriones de DHB liberados. Una razón para la capacidad infecciosa masivamente reducida del DHBV podría residir en las modificaciones postraduccionales de los componentes estructurales del virus mediadas por los inhibidores del proteasoma. Por ejemplo, una alteración en el grado de fosforilación de la proteína nuclear conduciría a un defecto en la desestabilización de los núcleos entrantes en la fase temprana de la infección.
Para estudiar la influencia que ejerce el tratamiento con inhibidores del proteasoma sobre el patrón de fosforilación intracelular de la proteína nuclear, se trataron hepatocitos primarios de pato de unos 7 días de edad, infectados de forma crónica por DHBV, durante 48 h con concentraciones crecientes de IP (10 \muM, 3 \muM, 1 \muM y 10 nM). Finalmente se lisaron las células (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 1%, desoxicolato sódico 1%, complementado con un cóctel de inhibidores del proteasoma (Complete, Roche, Mannheim)). Los lisados celulares se separaron de la fracción insoluble por centrifugación (14.000 rpm, 10 min, 4ºC), y se desnaturalizaron 20 \mul de cada fracción aclarada añadiendo tampón de Laemmli e hirviéndolos durante 5 min. A continuación, los lisados se separaron en SDS-PAGE al 12,5% y se electrotransfirieron a nitrocelulosa mediante la técnica de transferencia semiseca (Biorad, Munich, Alemania). Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% y, tras lavarlas con TBS, se incubaron con anticuerpos contra la proteína nuclear (Breiner y col., 2001) (Figura 16). Las proteínas víricas marcadas se visualizaron a continuación por quimioluminiscencia. La Figura 20 muestra que en todas las muestras tratadas, la relación entre la proteína nuclear hiperfosforilada y la proteína nuclear menos o no fosforilada está desplazada hacia esta última. Cabe destacar que, por ejemplo, 4 nM de IP no presenta ningún efecto sobre la expresión intracelular de proteínas víricas (Figura 5, carril 6; Figura 6, carril 6) pero tiene todavía un claro efecto sobre el grado de fosforilación de la proteína nuclear (Figura 16, carril 6). Como resultado de este estudio se puede decir, por lo tanto, que los inhibidores del proteasoma conducen a una alteración en la modificación de la proteína de la nucleocápsida y que esto seguramente es la base mecanística para la capacidad infecciosa reducida de los virus de DHB secretados por las células tratadas con inhibidores del proteasoma.
Ejemplo 5 Los hepatocitos primarios de pato son relativamente resistentes a los efectos tóxicos de los inhibidores del proteasoma
Puesto que el UPS está implicado en numerosos mecanismos celulares, la inhibición completa de la actividad proteasómica a largo plazo no es compatible con la vitalidad de una célula. Sin embargo, los diferentes tipos celulares muestran diferentes sensibilidades frente al efecto tóxico de los inhibidores del proteasoma. Resulta llamativo que las células activadas y/o que se dividen rápidamente poseen, generalmente, una mayor sensibilidad frente a los inhibidores del proteasoma que los cultivos en reposo y/o no activados. En esto se basa el efecto antineoplásico de los inhibidores del proteasoma. Para determinar la toxicidad de los inhibidores del proteasoma en hepatocitos primarios de pato en comparación con células de hepatoblastoma transformadas humanas (véase el ejemplo 6), se realizaron estudios de limitación de dosis con los inhibidores del proteasoma. Para ello, se obtuvieron hepatocitos primarios de embriones de pato como se describió en el ejemplo 1, se sembraron en placas de microvaloración de 12 pocillos a una densidad de aproximadamente 8 x 10^{5}/pocillo y se cultivaron durante 7 días. La vitalidad de las células se comprobó por microscopía óptica. Se trataron cultivos paralelos durante 48 h con dosis crecientes de IP (10 \muM, 3 \muM, 1 \muM, 10 nM y 1 nM). La morfología y la vitalidad de las células se analizaron aproximadamente cada 12 h por microscopía óptica. Adicionalmente se determinó su funcionalidad por tinción vital fluorescente con diacetato de fluoresceína (FDA) (Sigma, Deisenhofen, Alemania) (Yagi y col., 2001). El FDA es absorbido de forma activa y con preferencia por hepatocitos, y en ellos se convierte en fluoresceína mediante una lipasa que se expresa exclusivamente en hepatocitos y tiñe el citoplasma con fluorescencia, señal de que los hepatocitos son funcionales y vitales. En este experimento, los hepatocitos primarios de pato tratados y no tratados se incubaron durante 5 min a 37ºC con medio E de Williams que contenía FDA (5 \mug/ml). A continuación, las células se lavaron con PBS, se valoró la vitalidad de los hepatocitos mediante un microscopio invertido de epifluorescencia y se procesó adicionalmente con el sistema de procesamiento de imágenes Openlab. La Figura 17 muestra que ninguno de los cultivos tratados con hasta 1 \muM de IP mostraba una alteración morfológica ni indicios de una vitalidad limitada, es decir, que no se distinguían de los hepatocitos no tratados (Figura 18). En el tratamiento con 3 \muM y 10 \muM de IP se observaron claras alteraciones morfológicas, como, por ejemplo, células redondeadas y formación de vacuolas intracelulares, en las células distintas de los hepatocitos, que siempre coexisten en los cultivos de hepatocitos primarios. La vitalidad de los hepatocitos, en cambio, no estaba alterada según la valoración visual y la intensidad de la fluorescencia. Sólo a partir de una concentración de IP de 10 \muM aparecieron las primeras señales de un efecto tóxico en hepatocitos (Figura 17). Se observaron resultados similares con diferentes IP, como, por ejemplo, lactacistina y epoxomicina.
En resumen se puede decir que los hepatocitos primarios de pato pueden tolerar concentraciones del inhibidor del proteasoma relativamente altas, de hasta aproximadamente 10 \muM, mientras que las células de carcinoma de hígado proliferativas (véase el ejemplo 6) y otras células proliferativas en el cultivo de hepatocitos son mucho más sensibles al efecto tóxico de los inhibidores del proteasoma (Figuras 1, 17, 19, 20 y 21).
Ejemplo 6 Efecto de los inhibidores del proteasoma sobre el crecimiento celular y la vitalidad de las células de hepatoma humano HepG2
La línea celular de hepatoma humano HepG2 se cultivó a 37ºC en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (GIBCOBRL, Paisley, Escocia) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Biochrom, Berlín, Alemania), L-glutamina 2 mM (GIBCOBRL, Paisley, Escocia), 100 unidades/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina (Biochrom, Berlín, Alemania). Tras un pase con tripsina al 0,25% y EDTA 1 mM (GIBCOBRL, Paisley, Escocia), las células se sembraron en placas de microvaloración de 12 pocillos a una densidad de 0,5 x 10^{6}/pocillo. 24 h después se cambió el medio, y las células se trataron durante 48 h con IP, eponemicina y epoxomicina a concentraciones de 10 \muM, 3 \muM y 1 \muM, así como de 100 nM, 10 nM y 1 nM, y a continuación se ensayó su vitalidad por tinción con azul de tripano y se evaluaron morfológicamente por microscopía óptica. Ninguno de los inhibidores del proteasoma usados resultó tóxico ni antiproliferativo hasta una concentración de 10 nM (Figuras 19, 20 y 21). En el caso de IP (Figura 19) y epoxomicina (Figura 21) aparecieron fenómenos tóxicos a partir de una concentración de 100 nM, mientras que la eponemicina (Figura 20) todavía era bien tolerada. A 1 \muM y más, todas las sustancias ensayadas resultaron altamente tóxicas (Figuras 19, 20 y 21). Se observaron efectos tales como redondeamiento y desprendimiento de las células, degeneración y apoptosis.
En resumen, se puede decir que las células proliferativas de carcinoma de hígado son mucho más sensibles al efecto tóxico de los inhibidores del proteasoma, mientras que los hepatocitos primarios de pato pueden tolerar concentraciones relativamente altas, de hasta aproximadamente 10 \muM, de los inhibidores del proteasoma (Figuras 17, 19, 20 y 21).
Ejemplo 7 Efecto de los inhibidores del proteasoma sobre la secreción de antígenos específicos de HBV en líneas celulares de hepatoma humano
Se obtuvieron hepatocitos primarios humanos de hígados humanos como se describió anteriormente (Dandri y col., 2001) y se infectaron con HBV humanos que se recogieron del medio de células HepG2.2.15 que producen el virus de la hepatitis B humano infeccioso (Sells y col., 1987). Se trataron cultivos paralelos de células HepG2 durante dos días con IP o no se trataron. Antes del tratamiento, las células HepG2 se transfectaron con genomas de HBV competentes para replicarse según se describió anteriormente (Kalinina y col., 2001). Al contrario que en el caso de los numerosos hepatocitos primarios positivos para la proteína nuclear de HBV (analizados por tinción inmunofluorescente directa con anticuerpos contra la proteína nuclear), que permiten concluir que la infección de los hepatocitos primarios humanos con virus procedentes de células no tratadas se ha realizado con éxito, no se detectaron hepatocitos primarios humanos positivos para la proteína nuclear tras la infección con virus descendientes procedentes de células HepG2 tratadas con inhibidores del proteasoma. Por lo tanto, como resultado de este experimento se puede constatar que el tratamiento con inhibidores del proteasoma también bloquea la liberación y la capacidad infecciosa de los HBV de forma similar al efecto que produce en DHBV.
En general, los procesos tardíos del ciclo de replicación comprenden la síntesis nueva de proteínas estructurales víricas en la célula infectada, el plegado y la modificación correctos, así como el transporte de las proteínas estructurales al lugar del ensamblaje del virus, seguido de la liberación de virus en la membrana celular y el procesamiento proteolítico de las poliproteínas Gag mediante la proteasa vírica en la partícula vírica que va madurando. En los ejemplos de los virus de la inmunodeficiencia humana y de los virus de la hepatitis B se demostró que los diferentes inhibidores del proteasoma 26S reducen tanto la liberación de partículas víricas como la capacidad infecciosa de las partículas víricas liberadas. Los análisis bioquímicos muestran que los inhibidores del proteasoma bloquean específicamente la maduración y el procesamiento proteolítico de las proteínas Gag y, en el caso de los virus de la hepatitis B, alteran también la modificación postraduccional de la nucleocápsida y reducen la secreción del antígeno e. Los análisis morfológicos muestran que en el caso del VIH-1 se concentran partículas víricas inmaduras en la membrana celular en presencia de inhibidores del proteasoma. Los estudios virológicos muestran que los inhibidores del proteasoma impiden la propagación de una infección por VIH-1 así como de una infección por HBV en el cultivo celular. Los estudios mecanísticos muestran además que los inhibidores del proteasoma no presentan un efecto directo sobre la proteasa vírica del VIH-1, sino que
influyen en mecanismos celulares que son necesarios para la maduración y liberación eficaces de las partículas víricas.
El uso de inhibidores del proteasoma constituye un novedoso procedimiento para la intervención en los ciclos de replicación víricos. Puesto que la diana de este procedimiento la constituyen mecanismos celulares conservados, es decir, la actividad enzimática del complejo proteasómico mismo, no son de esperar mecanismos de resistencia mediados por mutaciones del virus durante la administración in vivo de los inhibidores del proteasoma.
La invención se refiere además al uso en la investigación básica, por ejemplo en el análisis del ensamblaje, la liberación y la maduración de retrovirus, en especial de procesos tardíos del ciclo de replicación del VIH; asimismo a
- la investigación básica y la investigación aplicada,
- la comprensión del ensamblaje de retrovirus,
- la comprensión del modo de acción de las proteasas víricas,
- la comprensión del procesamiento de Gag de retrovirus,
- la comprensión de los mecanismos celulares implicados en el proceso tardío del ensamblaje de retrovirus, en especial de los factores del sistema de ubiquitina/proteasoma, los factores de unión a ubiquitina,
- los factores que se unen a las proteínas Gag ubiquitinadas de retrovirus,
- los factores que se unen a los dominios L (de ensamblaje tardío) monounbiquitinados de proteínas Gag retrovirales,
- los factores celulares que controlan, regulan, alteran y/o inhiben la monoubiquitinación de los dominios L de retrovirus,
- los factores celulares que revierten por desubiquitinación la monoubiquitinación de los dominios L de las proteínas Gag de retrovirus,
- los factores celulares que controlan, regulan, alteran y/o inhiben los procesos tardíos del ensamblaje del virus, especialmente el desprendimiento de partículas víricas de la membrana celular en función de la monoubiquitinación de los dominios L de las proteínas Gag de retrovirus, así como
- la comprensión en el desarrollo de sustancias adicionales que puedan controlar, regular, alterar y/o inhibir el procesamiento de Gag de retrovirus, así como el ensamblaje y la liberación de retrovirus, influyendo en la interacción de las proteínas Gag con el sistema de ubiquitina/proteasoma.
Otros campos de aplicación de la presente invención son:
- la prevención y el tratamiento/terapia de enfermedades causadas por infecciones con retrovirus, en especial la terapia y la prevención antirretroviral en el caso de infecciones por lentivirus que causan inmunodeficiencia, sobre todo la inmunodeficiencia adquirida en animales y seres humanos, tales como el tratamiento de individuos infectados con VIH, tanto de pacientes asintomáticos como de pacientes con SIDA, la prevención de una infección por VIH y evitar una infección por VIH inmediatamente después del contacto con virus IH;
- el desarrollo de nuevos agentes farmacéuticos basados, en especial, en sustancias que inhiben el proteasoma 26S, tales como los inhibidores del proteasoma que se pueden administrar in vivo y presentan una baja toxicidad al mismo tiempo que suprimen la replicación de retrovirus en el organismo y evitan la propagación de la infección;
- la aplicación de vectores retrovirales para el uso en procedimientos de transferencia de genes en la terapia génica, en especial la aplicación de inhibidores del proteasoma para evitar la generación y la propagación de retrovirus recombinantes y/o competentes para replicarse no deseados tras la transferencia de genes;
- la virología, biología celular, terapia génica, farmacología, química de sustancias naturales, química de péptidos, investigación molecular del VIH e investigación aplicada del SIDA.
Leyendas de las figuras
Figura 1
Las células no parenquimatosas de un cultivo de hepatocitos primarios son más sensibles a los efectos tóxicos de los inhibidores del proteasoma
Se muestra un cultivo de hepatocitos primarios tratado durante 72 h con IP 1 \muM. A continuación, las células se fijaron y los núcleos se tiñeron con Hoechst (azul). A modo de comparación se presenta la correspondiente imagen de contraste de fases. La imagen de contraste de fases superior muestra un antiguo islote de células distintas de hepatocitos, mientras que la inferior refleja los núcleos teñidos del mismo recorte de imagen. Las flechas pequeñas señalan las células no parenquimatosas apoptóticas, mientras que la flecha ancha señala una pequeña colonia de hepatocitos intactos.
Figura 2
Los inhibidores del proteasoma inhiben de forma dependiente de la concentración la liberación de partículas víricas con contenido en PreS en hepatocitos primarios de pato infectados de forma crónica con DHBV-Detección de PreS por hibridación puntual
Un cultivo de hepatocitos primarios de pato de 7 días de edad, infectado de forma crónica con DHBV, se trató durante 48 h con concentraciones crecientes de IP (1 nM, 1 \muM y 10 \muM) o no se trató. Se aplicaron puntualmente 200 \mul de los sobrenadantes correspondientes. La cantidad de partículas víricas liberadas se determinó mediante una hibridación puntual específica del antígeno PreS.
Figura 3
Los inhibidores del proteasoma inhiben de forma dependiente de la concentración la liberación de partículas víricas con contenido en PreS en hepatocitos primarios de pato infectados de forma crónica con DHBV-Detección de PreS por inmunotransferencia de Western
Un cultivo de hepatocitos primarios de pato de 7 días de edad, infectado de forma crónica con DHBV, se trató durante 48 h con concentraciones crecientes de IP (1 nM, 10 nM, 1 \muM, 3 \muM y 10 \muM) o no se trató. Se separaron 5 \mul de los sobrenadantes correspondientes en SDS-PAGE al 12,5%. La visualización de las bandas correspondientes a la proteína PreS (p36 y p28) se efectuó por inmunotransferencia de Western.
Figura 4
Los inhibidores del proteasoma inhiben de forma dependiente de la concentración la liberación de partículas víricas con contenido en ADN en hepatocitos primarios de pato (HPP) infectados de forma crónica con DHBV-Detección de ADN por hibridación puntual
Un cultivo de hepatocitos primarios de pato de 7 días de edad, infectado de forma crónica con DHBV, se trató durante 48 h con concentraciones crecientes de IP (10 nM, 1 \muM, 3 \muM y 10 \muM) o no se trató, se recogió el sobrenadante y se aclaró por centrifugación. Después, el sobrenadante se aplicó puntualmente en nitrocelulosa, y la membrana se hibridó con una sonda de ADN de DHBV marcada con ^{32}P y se autorradiografió. Los puntos de HPP no infectados están marcados con -, los puntos de hepatocitos infectados con +. La normalización de la hibridación puntual de ADN se llevó a cabo aplicando concentraciones conocidas de ADN de DHBV clonado (patrón de ADN de
DHBV).
Figura 5
Los inhibidores del proteasoma no ejercen una influencia digna de mención sobre la expresión intracelular del gen de PreS
Cultivos de hepatocitos primarios de pato (HPP) de 7 días de edad, infectados de forma crónica con DHBV, se trataron durante 48 h con dosis crecientes de IP. Los lisados celulares se separaron en SDS-PAGE al 12,5% y se hibridaron con el fin de detectar el antígeno PreS. En los carriles 1 y 2 se aplicaron hepatocitos no tratados, no infectados (-HPP) o infectados de forma crónica con DHBV (+HPP), respectivamente. Los carriles 3 a 7 corresponden a las aplicaciones de células tratadas con diferentes dosis de IP. p36 y p28 corresponden a la proteína PreS de longitud completa y a un producto de degradación de la misma, respectivamente.
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Figura 6
Los inhibidores del proteasoma no ejercen una influencia digna de mención sobre la expresión de la proteína nuclear
Cultivos de hepatocitos primarios de pato (HPP) de 7 días de edad, infectados de forma crónica con DHBV, se trataron durante 48 h con dosis crecientes de IP. Los lisados celulares se separaron en SDS-PAGE al 12,5% y la proteína nuclear (flecha) se visualizó por quimioluminiscencia indirecta. En los carriles 1 y 2 se aplicaron hepatocitos no tratados, negativos para DHBV (-HPP) o infectados de forma crónica con DHBV (+HPP), respectivamente. Los carriles 3 a 7 corresponden a aplicaciones de células tratadas con diferentes dosis de IP.
Figura 7
Acumulación de proteínas poliubiquitinadas en hepatocitos primarios de pato tratados con inhibidores del proteaso-ma
Se trataron hepatocitos primarios de pato de una semana de edad, infectados de forma crónica con DHBV, durante 48 h con concentraciones crecientes de IP (carriles 2 a 6). Como control se cultivaron células infectadas por DHBV (+HPP, carril 1) y células exentas de virus sin IP (-HPP, carril 7). A continuación se separaron los lisados celulares en SDS-PAGE al 6% y se detectaron las proteínas mono- y poliubiquitinadas mediante anti-ubiquitina de conejo. A la derecha se indica la posición correspondiente de las bandas de los marcadores de proteínas en kDa. Poliubi. indica las proteínas poliubiquitinadas de alto peso molecular.
Figura 8
Los sobrenadantes de los cultivos de hepatocitos primarios de pato (HPP) infectados de forma crónica con DHBV y tratados con inhibidores del proteasoma no contienen virus descendientes infecciosos
Se trataron hepatocitos primarios de pato de 7 días de edad, infectados de forma crónica con DHBV, durante 48 h con IP 10 \muM y a continuación se usó el sobrenadante del cultivo celular recogido para la reinfección de cultivos de HPP negativos para DHBV. 60 h después de la infección, las células se lavaron y se fijaron. A continuación se llevó a cabo la tinción de las células para PreS (verde). La visualización de los núcleos celulares se efectuó por tinción con Hoechst (azul). Las regiones superior e inferior de la figura corresponden a un aumento menor y mayor, respectivamente, del mismo recorte de imagen.
Figura 9
Los virus descendientes procedentes de hepatocitos primarios de pato infectados de forma crónica con DHBV son infecciosos
Se recogieron los sobrenadantes de un cultivo de hepatocitos primarios de pato de 7 días de edad, infectado de forma crónica, y se usaron para la reinfección de hepatocitos primarios de pato negativos para DHBV. 60 h después de la infección se fijaron las células. Finalmente se llevó a cabo la tinción de las células para PreS (verde). La visualización de los núcleos celulares se efectuó por tinción con Hoechst (azul). La región inferior de la figura es un aumento mayor del mismo recorte de imagen mostrado en la parte superior.
Figura 10
Los sobrenadantes de los hepatocitos infectados con DHBV y tratados con inhibidores del proteasoma no contienen virus descendientes infecciosos-Detección de PreS por inmunotransferencia de Western
Se trataron hepatocitos primarios de pato (HPP) de 7 días de edad, infectados de forma crónica con DHBV, durante 48 h con IP 10 \muM, y a continuación se recogió el sobrenadante, se aclaró por centrifugación y se usó para la reinfección de HPP. 60 h después de la infección, las células se lisaron y se separaron en SDS-PAGE al 12,5%. La visualización de las bandas correspondientes a la proteína PreS se llevó a cabo por inmunotransferencia de Western. En los carriles 1 y 2 se aplicaron HPP negativos para DHBV o infectados de forma crónica con DHBV, respectivamente. Los carriles 3 y 4 corresponden a los HPP infectados con sobrenadantes procedentes de cultivos no tratados o tratados con IP, respectivamente. En el carril 5 se aplicaron HPP infectados con una MOI de 20.
Figura 11
Los sobrenadantes de los hepatocitos infectados con DHBV y tratados con inhibidores del proteasoma no contienen virus descendientes infecciosos-Detección de la proteína nuclear por inmunotransferencia de Western
Se trataron hepatocitos primarios de pato (HPP) de 7 días de edad, infectados de forma crónica con DHBV, durante 48 h con IP 10 \muM, y a continuación se recogió el sobrenadante, se aclaró por centrifugación y se usó para la reinfección de cultivos de HPP. 60 h después de la infección, las células se lisaron y el lisado se separó en SDS-PAGE al 12,5%. La visualización de la proteína nuclear se llevó a cabo por inmunotransferencia de Western. En los carriles 1 y 2 se aplicaron HPP negativos para DHBV o infectados de forma crónica con DHBV, respectivamente. Los carriles 3 y 4 corresponden a los HPP infectados con sobrenadantes procedentes de cultivos no tratados o tratados con IP, respectivamente. En el carril 5 se aplicaron HPP infectados con una MOI de 20.
Figura 12
Inhibición de las infecciones primaria y secundaria mediante el tratamiento de hepatocitos primarios de pato (HPP) infectados por DHBV con inhibidores del proteasoma
Se infectaron cultivos de HPP de cuatro días de edad con una MOI de 20 durante 16 h. A continuación, las células se lavaron y se cultivaron en medio nuevo durante otros tres días. El 3^{er} día después de la infección, las células se cultivaron sin inhibidores del proteasoma (no tratadas) o se trataron durante otros 3 días con eponemicina, epoxomicina o IP 1 \muM. El día 6 de la infección, las células se lavaron y se fijaron. A continuación se llevó a cabo la tinción de las células para la proteína nuclear (verde). Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst (azul). También se aprecian las imágenes de contraste de fases de los recortes de imagen correspondientes.
Figura 13
Los inhibidores del proteasoma inhiben la liberación del antígeno e en hepatocitos primarios de pato infectados con DHBV
Se infectaron cultivos de hepatocitos primarios de pato (HPP) de cuatro días de edad con una MOI de 20 durante 16 h. A continuación, las células se lavaron y se cultivaron en medio nuevo durante otros tres días. El 3^{er} día después de la infección, las células se trataron durante otros tres días con 1 \muM de IP (carril 3), epoxomicina (carril 4), eponemicina (carril 5). El día 6 después de la infección se recogió el sobrenadante y se aclaró por centrifugación. Se separó una alícuota de los sobrenadantes en SDS-PAGE al 12,5%. La visualización de las bandas correspondientes a la proteína antigénica e (flechas) se llevó a cabo por quimioluminiscencia indirecta. En los carriles 1 y 2 se aplicaron HPP no tratados, negativos o infectados de forma crónica con DHBV, respectivamente, y en los carriles 3, 4 y 5, HPP infectados con DHBV y tratados con IP, epoxomicina y eponemicina.
Figura 14
Los inhibidores del proteasoma inhiben la liberación del antígeno PreS en hepatocitos primarios de pato infectados con DHBV
Se infectaron cultivos de hepatocitos de cuatro días de edad con una MOI de 20 durante 16 h. A continuación, las células se lavaron y se cultivaron durante otros tres días en medio nuevo. El día 3 después de la infección, las células se trataron durante otros tres días con 1 \muM de IP (carril 3), epoxomicina (carril 4) y eponemicina (carril 5). El día 6 después de la infección se recogió el sobrenadante y se separó en SDS-PAGE al 12,5%. La visualización de las bandas correspondientes a la proteína PreS (p36 y p28) se efectuó por inmunotransferencia de Western. En los carriles 1 y 2 se aplicaron HPP no tratados, negativos o infectados de forma crónica con DHBV, respectivamente; los HPP infectados con DHBV se aplicaron en el carril 3 (IP), el carril 4 (epoxomicina) y el carril 5 (eponemicina).
Figura 15
La suramina inhibe tanto la infección primaria como la secundaria causada por DHBV en hepatocitos primarios de pato
HPP de cuatro días de edad se trataron 2 h antes de la infección con 100 \mug/ml de suramina (preinfección con suramina) o permanecieron en un principio sin tratar (sin suramina y suramina 3 d post-infección). A continuación se infectaron todas las células con una MOI de 20. Tras una incubación de 16 h, los cultivos se lavaron y se siguieron cultivando en medio nuevo. El día 3 después de la infección se volvió a cambiar el medio y las células "sin suramina" y "preinfección con suramina" se trataron durante otros tres días sin suramina y las células "suramina 3 d post-infección", con 100 \mug/ml de suramina. El día 6 de la infección, las células se lavaron y se fijaron. A continuación se llevó a cabo la tinción de las células para la proteína nuclear (P. nuclear). Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst (Hoechst). Asimismo se muestran las imágenes de contraste de fases de los recortes de imagen correspondientes (contraste de fases).
Figura 16
Los inhibidores del proteasoma inducen la hipofosforilación de la proteína nuclear intracelular en hepatocitos primarios infectados de forma crónica con DHBV
Se trataron cultivos de hepatocitos primarios de pato de 7 días de edad, infectados de forma crónica con DHBV, durante 48 h con dosis crecientes de IP y a continuación se lisaron. Los lisados se separaron en SDS-PAGE al 12,5%, y la proteína nuclear se visualizó mediante quimioluminiscencia indirecta. En los carriles 1 y 2 se aplicaron HPP no tratados, negativos o infectados de forma crónica con DHBV, respectivamente. Los carriles 3 a 6 corresponden a las células tratadas con IP. "P. nuclearPP" corresponde a la proteína nuclear hiperfosforilada y "P. nuclearP", a la proteína nuclear hipofosforilada.
Figura 17
El tratamiento de hepatocitos primarios de pato con inhibidores del proteasoma no limita su vitalidad ni funcionalidad
Se trataron cultivos celulares primarios de 7 días de edad, procedentes de hígados de pato infectados de forma crónica con DHBV, durante 48 h con concentraciones crecientes de IP (10 \muM, 3 \muM y 1 \muM). Al final de este periodo de tratamiento, las células se incubaron durante 5 min a 37ºC con medio E de Williams que contenía FDA (5 \mug/ml). A continuación, las células se lavaron con PBS y el éxito de la conversión del FDA en fluoresceína en los hepatocitos se valoró con un microscopio de epifluorescencia. Se asumió que las células teñidas de verde en el citoplasma eran vitales y funcionales. Se muestran las imágenes correspondientes de fluorescencia (fluoresceína) y de contraste de fases (contraste de fases) indicando la dosis de IP usada. Las flechas blancas con punta señalan, a modo de ejemplo, nidos de células no parenquimatosas, que en comparación con los hepatocitos sólo muestran una absorción y conversión de FDA reducidas o nulas.
Figura 18
La absorción y conversión del marcador de vitalidad diacetato de fluoresceína en fluoresceína se realiza con preferencia en hepatocitos
Se incubaron cultivos celulares primarios de una semana de edad, procedentes de hígados de pato infectados de forma crónica con DHBV, durante 5 min a 37ºC con medio E de Williams que contenía FDA (5 \mug/ml). A continuación, las células se lavaron con PBS y se valoró el éxito de la conversión del FDA en fluoresceína en los hepatocitos con un microscopio de epifluorescencia. Se asumió que las células teñidas de verde en el citoplasma eran vitales y funcionales (fluoresceína). Asimismo se muestra la imagen de contraste de fases correspondiente al mismo recorte de imagen (contraste de fases). Las flechas blancas con punta señalan, a modo de ejemplo, nidos de células no parenquimatosas, que en comparación con los hepatocitos sólo muestran una absorción y conversión de FDA reducidas o nulas.
Figura 19
El tratamiento de células de hepatoma (HepG2) con inhibidores del proteasoma limita su vitalidad y funcionalidad
Se trataron células HepG2 durante 48 h con concentraciones crecientes (10 \muM, 3 \muM, 1 \muM, 100 nM, 10 nM y 1 nM) de IP (sección A). Al final de este periodo de tratamiento, las células se tiñeron con azul de tripano y se examinaron en un microscopio de luz transmitida. Se asumió que las células teñidas de azul oscuro no eran vitales. La concentración correspondiente del IP se indica en las correspondientes imágenes de contraste de fases.
Figura 20
El tratamiento de células de hepatoma (HepG2) con eponemicina limita su vitalidad y funcionalidad
Se trataron células HepG2 durante 48 h con concentraciones crecientes (10 \muM, 3 \muM, 1 \muM, 100 nM, 10 nM y 1 nM) de eponemicina (sección A). Al final de este periodo de tratamiento, las células se tiñeron con azul de tripano y se examinaron en un microscopio de luz transmitida. Se asumió que las células teñidas de azul oscuro no eran vitales. La concentración correspondiente de la eponemicina se indica en las correspondientes imágenes de contraste de fases.
Figura 21
El tratamiento de células de hepatoma humano (HepG2) con epoxomicina limita su vitalidad y funcionalidad
Se trataron células HepG2 durante 48 h con concentraciones crecientes (10 \muM, 3 \muM, 1 \muM, 100 nM, 10 nM y 1 nM) de epoxomicina (sección A). Al final de este periodo de tratamiento, las células se tiñeron con azul de tripano y se examinaron en un microscopio de luz transmitida. Se asumió que las células teñidas de azul oscuro no eran vitales. La concentración correspondiente de la epoxomicina se indica en las correspondientes imágenes de contraste de fases.
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Lista de abreviaturas
A3.01
línea celular T CD4^{+} humana
SIDA
Síndrome de inmunodeficiencia adquirida
Anexina-V
receptor celular anexina-cinco
ATP
5'-trifosfato de adenosina
BIV
virus de la inmunodeficiencia bovina
BLV
virus de la leucemia bovina
CA
cápsida (antígeno p24^{CA} de HIV-1)
ADNccc
genoma de ADN superenrollado totalmente de hebra doble
RTFC
regulador transmembranal de la fibrosis quística
d
día
DHB(V)
(virus de la) hepatitis B de pato
DHBV
virus de la hepatitis B de pato
DMEM
medio de Eagle modificado por Dulbecco
DMSO
dimetilsulfóxido
ADN
desoxyribonucleic acid (DNA) (ácido desoxirribonucleico)
ECL
quimioluminiscencia intensificada
EDTA
ácido etilendiaminotetraacético
EIAV
virus de la anemia infecciosa equina
ELISA
ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas
Env
envuelta
RE
retículo endoplasmático
FDA
diacetato de fluoresceína
FIV
virus de la leucemia felina
Gag
antígeno específico de grupos, proteína nuclear de retrovirus
h
hora(s)
hr
hora(s)
HAART
terapia HAART (terapia antirretroviral altamente activa, highly active antiretroviral therapy)
HAV
virus de la hepatitis A
HBe
antígeno E del virus de la hepatitis B
HBs
proteína superficial del HBV
HBV
virus de la hepatitis B
HCC
carcinoma hepatocelular
HCV
virus de la hepatitis C
HDV
virus de la hepatitis delta
HEPES
ácido N-[2-hidroxietil]piperazin-N'-[2-etano-sulfónico]
HEV
virus de la hepatitis E
HFV
virus de la hepatitis F
HGV
virus de la hepatitis G
VIH
virus de la inmunodeficiencia humana
HIVAN
síndrome de la nefropatía asociada a VIH
VIH-1_{NL4-3}
virus de la inmunodeficiencia humana, clon infecciosos NL4-3
HLS
síndrome de la lipodistrofia asociada a VIH
HPV
papilomavirus humano
HTLV
virus de la leucemia de células T humana
IFN
interferón
IL
interleucina
kb
kilobases
I\kappaB
factor inhibidor I\kappaB
kDa
kilodalton (medida del peso molecular)
Ki
constante inhibidora
LC
lactacistina
domino L
late assembly domain, dominio de ensamblaje tardío en proteínas Gag retrovirales
LLnL
leucinil-leucinil-nor-leucinal
MA
matriz (proteína p17^{MA} de VIH-1)
MDa
megadalton
MG132
N-carbobenzoxil-L-leucinil-L-leucinil-L-leucinal
MG232
derivado de MG132 con ácido bórico
MHC
complejo mayor de histocompatibilidad
Mo-MuLV
virus de la leucemia murina
MOI
multiplicidad de infección
nanoM
nano Molar (nM)
células MT-4
línea celular T CD4^{+} humana, transformada con HTLVI
NC
nucleocápsida
NF-\kappaB
factor de transcripción
NLVS
4-hidroxi-5-yodo-3-nitrofenilacetil-L-leucinil-L-leucinil-L-leucinvinilsulfona, denominada también NLVS
nM
nanomolar
ADNca
forma circular abierta del ADN
p27^{CA}
cápsida (antígeno p27^{CA} de VIH-2)
PBS
tampón fosfato, phosphate buffered saline
PCR
polymerase chain reaction-reacción en cadena de la polimerasa
PEH
hepatocitos de pato/hepatocitos de pato pequinés
PGPH
postglutamil-péptido hidrolasa
IP
inhibidor del proteasoma
Pol
polimerasa (retrovirus)
proteína P
proteína polimerasa del virus de la hepatitis B
PR
proteasa
Pr55
proteína Gag precursora de VIH-1
Pr58
proteína Gag precursora de VIH-2
PreS
proteína grande de la envuelta del virus de la hepatitis B
PS
ProScript
PS-273
morfolin-CONH-(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}
PS-293
enantiómero de PS273
PS-296
8-quinolil-sulfonil-CONH-(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}
PS-303
NH_{2}(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}
PS-325
2-quinol-CONH-(CH-homo-fenilalanin)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}
PS-334
CH_{3}-NH(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}
PS-341
ácido N-pirazincarbonil-L-fenilalanin-L-leucin-bórico, fórmula molecular: C_{19}H_{25}BN_{4}O_{4}
PS-383
piridil-CONH-(CHpF-fenilalanin)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}
PS-519
1R-[1S,4R,5S]-1-(1-hidroxi-2-metilpropil)-4-propil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptano-3,7-diona, fórmula molecular: C_{12}H_{19}NO_{4}
PSI
N-carbobenzoxi-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-H
ARN
ácido ribonucleico (ribonucleic acid, RNA)
RSV
virus del sarcoma de Rouse
RT
transcriptasa inversa
SDS
dodecilsulfato sódico (sodium dodecylsulfate)
SDS-PAGE
electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
SIV
virus de la inmunodeficiencia de simios
TBS
tampón Tris
TNF
factor de necrosis tumoral
Thr
treonina
Tris
tampón Tris - Tris-(hidroximetil)-aminometano
Ub
ubiquitina
UPS
sistema de Ub/proteasoma
Vpu
proteína U de virus
WB
inmunotransferencia de Western
XXX
categoría XXX = referencias bibliográficas según la fecha de prioridad
zLLL
N-carbobenzoxil-L-leucinil-L-leucinil-L-leucinal

Claims (25)

1. Uso de inhibidores del proteasoma para la preparación de un agente para inhibir la liberación, maduración y replicación de un virus de la hepatitis.
2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque el agente contiene como componente activo al menos un inhibidor del proteasoma que se aísla a partir de fuentes naturales o de microorganismos o que se prepara por síntesis o que se compone de compuestos con estructuras de epoxicetona o lactona o de derivados de aldehído peptídico, glioxal, ácido bórico o ésteres de pinacol.
3. Uso según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el agente se usa contra virus que se liberan de la superficie celular en el marco del ciclo de replicación.
4. Uso según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el agente contiene como componente activo en la preparación farmacéutica uno o varios inhibidores del proteasoma que inhiben, regulan o influyen de otro modo las actividades de la ruta de ubiquitina/proteasoma.
5. Uso según la reivindicación 4, caracterizado porque se usan uno o varios inhibidores del proteasoma como sustancias que influyen especialmente las actividades enzimáticas del complejo proteasómico 26S completo y de la estructura proteasómica 20S libre catalíticamente activa, no ensamblada con subunidades reguladoras.
6. Uso según las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque como agentes se usan sustancias que son absorbidas por organismos eucarióticos superiores como inhibidores del proteasoma y que, una vez absorbidas por la célula, interactúan con las subunidades catalíticas del proteasoma bloqueando de forma reversible o irreversible todas o algunas de las actividades proteolíticas del proteasoma (las actividades tripsina, quimotripsina y postglutamil-péptido hidrolasa) dentro del complejo proteasómico 26S o también 20S.
7. Uso según una de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque las preparaciones farmacéuticas también contienen, además de los inhibidores del proteasoma, otros agentes que influyen, regulan o inhiben el sistema de ubiquitina celular.
8. Uso según la reivindicación 7, caracterizado porque se influyen, regulan o inhiben las actividades
a)
de las enzimas conjugadoras de ubiquitina y/o
b)
de las enzimas hidrolizantes de ubiquitina y/o
c)
de factores celulares que interactúan con ubiquitina.
9. Uso según la reivindicación 8, caracterizado porque se influyen, regulan o inhiben las actividades de los factores celulares que interactúan con ubiquitina en forma de monoubiquitina o poliubiquitina.
10. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque como inhibidores del proteasoma se usan sustancias que se administran in vivo en diferentes formas por vía oral, intravenosa, intramuscular, subcutánea o en forma encapsulada con o sin modificaciones que proporcionan especificidad celular, presentan, debido a la aplicación de un determinado régimen de administración y/o de dosificación, una baja citotoxicidad, tienen efectos adversos insignificantes o ninguno, presentan una semivida metabólica relativamente larga y una tasa de aclaramiento relativamente baja en el organismo.
11. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque como inhibidores del proteasoma se usan sustancias que
a)
se aíslan en forma natural de microorganismos u otras fuentes naturales; o
b)
derivan de sustancias naturales por modificación química; o
c)
se preparan por vía totalmente sintética; o
d)
se sintetizan in vivo mediante procedimientos de terapia génica; o
e)
se preparan in vitro mediante procedimientos de ingeniería genética o
f)
en microorganismos.
12. Uso según la reivindicación 11, caracterizado porque como inhibidores del proteasoma se usan sustancias que pertenecen a las siguientes clases de sustancias:
a)
Inhibidores del proteasoma presentes en la naturaleza:
-
derivados peptídicos que contienen estructuras de epoxicetona en el extremo C-terminal; o
-
derivados de \beta-lactona; o
-
aclacinomicina A (denominada también aclarrubicina); o
-
lactacistina y sus variantes químicamente modificadas, tales como la variante que atraviesa la membrana celular "clastolactacisteína \beta-lactona",
b)
inhibidores del proteasoma preparados sintéticamente:
aldehídos peptídicos modificados, tales como N-carbobenzoxi-L-leucinil-L-leucinil-L-leucinal (denominado también MG132 o zLLL), su derivado de ácido bórico MG232; N-carbobenzoxi-Leu-Leu-Nva-H (denominado MG115); N-acetil-L-leucinil-L-leucinil-L-norleucinal (denominado LLnL); N-carbobenzoxi-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-H (denominado también PSI);
c)
péptidos que llevan \alpha,\beta-epoxicetonas en el extremo C-terminal, asimismo vinilsulfonas tales como carbobenzoxi-L-leucinil-L-leucinil-L-leucin-vinil-sulfona o 4-hidroxi-5-yodo-3-nitrofenilacetil-L-leucinil-L-leucinil-L-leucin-vinilsulfona (NLVS);
d)
restos glioxal o ácido bórico, tales como pirazil-CONH(CHPhe)CONH(CH-isobutil)B(OH)_{2}, así como derivados dipeptidílicos de ácido bórico, o
e)
ésteres de pinacol, tales como el éster benciloxicarbonílico(Cbz) de Leu-Leu-boroLeu-pinacol.
13. Uso según las reivindicaciones 11 y 12, caracterizado porque como inhibidores del proteasoma especialmente adecuados se usan las epoxicetonas epoxomicina (fórmula molecular: C_{28}H_{86}N_{4}O_{7}) y/o eponemicina (fórmula molecular: C_{20}H_{36}N_{2}O_{5}).
14. Uso según las reivindicaciones 11 y 12, caracterizado porque como inhibidores del proteasoma de la serie PS especialmente adecuados se usan los compuestos
a)
PS-519, 1R-[1S,4R,5S]-1-(1-hidroxi-2-metilpropil)-4-propil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptano-3,7-diona, fórmula molecular: C_{12}H_{19}NO_{4}, en forma de derivado de \beta-lactona y de lactacistina y/o
b)
PS-314, ácido N-pirazincarbonil-L-fenilalanin-L-leucin-bórico, fórmula molecular: C_{19}H_{25}BN_{4}O_{4}, en forma de derivado peptidílico de ácido bórico y/o
c)
PS-273 (morfolin-CONH-(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}) y su enantiómero PS-293 y/o
d)
el compuesto PS-296 (8-quinolilsulfonil-CONH-(CH-naftil)-CONH(CH-isobutil)-B(OH)_{2}) y/o
e)
PS-303 (NH_{2}(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}) y/o
f)
PS-321 (morfolin-CONH-(CH-naftil)-CONH-(CH-fenilalanin)-H(OH)_{2}) y/o
g)
PS-334 (CH_{3}-NH-(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}) y/o
h)
el compuesto PS-325 (2-quinol-CONH-(CH-homo-fenilalanin)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}) y/o
i)
PS-352 (fenilalanin-CH_{2}-CH_{2}-CONH-(CH-fenilalanin)-CONH-(CH-isobutil)1-B(OH)_{2}) y/o
j)
PS-383 (piridil-CONH-(CHpF-fenilalanin)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)_{2}).
15. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque los inhibidores del proteasoma
a)
bloquean en gran parte o por completo la producción de viriones infecciosos por parte de las células infectadas con el virus de la hepatitis y/o
b)
producen la inhibición de la liberación de viriones, así como también una reducción prácticamente completa de la capacidad infecciosa de los viriones liberados, y/o
c)
suprimen la proliferación del virus y, por lo tanto, la reinfección de hepatocitos y la propagación in vivo de una infección de tipo hepatitis en el tejido hepático de un individuo infectado.
\newpage
16. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la proliferación de los hepadnavirus es inhibida por los inhibidores del proteasoma mediante los mecanismos
a)
bloqueo/reducción de la liberación de nuevos viriones
b)
bloqueo/reducción de la capacidad infecciosa de los viriones liberados
c)
bloqueo/reducción de la propagación de la infección en cultivos de hepatocitos primarios
d)
bloqueo/reducción de la propagación de la infección in vivo en el tejido hepático de un individuo infectado.
17. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 14, en el que
a)
se induce la muerte de las células de carcinoma de hígado; y/o
b)
se suprime y/o evita la generación de carcinomas hepatocelulares; y/o
c)
se tratan pacientes con carcinomas hepatocelulares establecidos.
18. Uso según la reivindicación 17, en el que se tratan/combaten/evitan
a)
cirrosis de hígado inducidas por HBV y/o
b)
carcinomas hepatocelulares inducidos por HBV y/o
c)
carcinomas de hígado inducidos por HCV y/o
d)
carcinomas de hígado inducidos por medicamentos y/o
e)
carcinomas de hígado condicionados genéticamente y/o
f)
carcinomas de hígado condicionados por el medio ambiente.
19. Uso según las reivindicaciones 17 y 18, en el que se eliminan selectivamente las células de carcinoma de hígado que se generan como consecuencia de una
a)
infección causada por HBV y/o
b)
infección causada por HCV o
c)
coinfección correspondiente con ambos virus o
d)
coinfección con HDV/HBV.
20. Uso según las reivindicaciones 17 a 19, en el que se evita la generación, el crecimiento y/o la metastatización de tumores hepatocelulares y se destruyen con preferencia las células de carcinoma de hígado en pacientes y animales infectados con HBV y HCV.
21. Uso según una de las reivindicaciones 11 a 14, en el que
a)
se modulan la expresión, modificación y actividad de la proteína supresora de tumores p53; y/o
b)
se reduce el número de células infectadas y productoras de virus de la hepatitis en el tejido hepatocelular; y/o
c)
se inhibe tanto el mantenimiento y la persistencia de una infección ya establecida causada por virus de la hepatitis como la infección secundaria y, con ello, la propagación de una infección, que incluye el bloqueo de la propagación de una infección causada por virus de la hepatitis in vivo.
22. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque los inhibidores del proteasoma alteran la fosforilación de proteínas de la nucleocápsida específicas del virus de la hepatitis y porque reducen o bloquean la liberación e capacidad infecciosa de los virus de la hepatitis B y C.
23. Uso de los inhibidores del proteasoma según una de las reivindicaciones 1 a 14 en combinación para la preparación de un agente
a)
para el tratamiento y el combate de hepatitis
b)
con agentes terapéuticos ya usados en la terapia antiviral de los hepadnavirus.
24. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 14, en el que se tratan infecciones causadas por virus de la hepatitis para evitar
a)
una reinfección con HBV en trasplantes de hígado o de otros órganos; o
b)
una reinfección con HBV en terapias celulares mediante la administración de los agentes antes, durante y después del trasplante; o
c)
una reinfección con HBV en el trasplante de órganos exentos de virus a portadores crónicos del virus, que siempre presentan virus residuales que pueden infectar órganos nuevos, así como en la transferencia de órganos de donantes que presentan virus a pacientes exentos de virus; o
d)
el establecimiento de una infección sistémica con virus de la hepatitis inmediatamente después del contacto con un virus infeccioso.
25. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 14, en el que tratan infecciones causadas por virus de la hepatitis
a)
para prevenir una infección con virus de la hepatitis en personas con un alto riesgo de sufrir una reinfección, tales como médicos, el personal de riesgo en edificios con un gran número de visitantes, drogadictos, personas que viajan a regiones altamente endémicas para los virus de la hepatitis, en el tratamiento de enfermos o para familiares de portadores crónicos del virus; o
b)
para reducir o eliminar una hepatitis mediante mecanismos mediados por el sistema inmunológico.
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