BRPI0708073A2 - fármacos para tratamento de infecções com vìrus da influenza - Google Patents

Abstract

FáRMACOS PARA TRATAMENTO DE INFECçõES COM VìRUS DA INFLUENZA. A presente invenção refere-se a fármacos para a profilaxia e/ou tratamento de infecções virais, em particular de infecções com vírus da influenza que liberam infectantes gripais. O objeto da invenção são fármacos que contêm, como ingredientes ativos, inibidores do sistema ubiquitina protease, em particular inibidores do proteossomo. A presente invenção também se refere tanto à administração sistêmica, quanto tópica, de preferência por via aérea, de inibidores do proteossomo. O ingrediente ativo de um inibidor de proteossomo usado de acordo com a invenção pode ser usado com pelo menos uma substância ativa antiviral adicional para a profilaxia e/ou terapia de infecções pelo vírus da influenza.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FÁRMACOSPARA TRATAMENTO DE INFECÇÕES COM VÍRUS DA INFLUENZA".

Descrição

A presente invenção refere-se a fármacos para a profilaxia e/outratamento de infecções virais, em particular infecção com vírus da influenzacausador da influenza. O objeto da invenção são fármacos que contêm, co-mo ingredientes ativos, inibidores do sistema ubiquitina protease, em particu-lar inibidores do proteossomo. A presente invenção também se refere tanto àadministração sistêmica, quanto tópica, de preferência por via aérea, de ini-bidores do proteossomo. O ingrediente ativo de um inibidor de proteossomointroduzido de acordo com a invenção pode ser introduzido com pelo menosuma substância antiviral eficaz adicional para profilaxia e/ou terapia de infec-ções pelo vírus da influenza.

1. Características do Estado da Técnica

1.1. A infecção por vírus da influenza em animais e seres humanos

Infecções com vírus da influenza, o patógeno da influenza, re-presentam uma importante ameaça à saúde de seres humanos e animais enão apenas são responsáveis por uma multiplicidade de fatalidades a cadaano, mas também são um imenso custo macroeconômico, devido à incapa-cidade de trabalhar causada pela doença. Além das epidemias que surgemtodo ano, a influenza, além disso, tem uma dimensão ainda mais ameaçado-ra, como nos surtos mundiais passados, chamados de pandemias, que vol-tam recorrentemente e são responsáveis por destruir muitos milhões de vi-das. A emergência de vírus da gripe aviária altamente patogênicos do subti-po H5N1 nos últimos anos ilustra diretamente o perigo de uma nova pande-mia no futuro próximo, contra a qual não há até agora nenhuma vacina efi-caz.

Os vírus da influenza pertencem à família dos ortomixovírus e possuem umgenoma segmentado de orientação em sentido negativo, que codifica ummínimo de 11 proteínas virais (Lamb e Krug, em Fields, Virology, Filadélfia:Lippincott-Raven Publishers, 1353-1395, 1996). Os vírus da influenza estãoclassificados nos tipos A1BeC com base em características moleculares eserológicas das nucleoproteínas (NP) e das proteínas de matriz (M). Os ví-rus do tipo A possuem o maior potencial patogênica para seres humanos ealgumas espécies de animais (Webster et al., Microbiol. Rev., 56, 152-79,1992).

Uma partícula do vírus da influenza A consiste em 9 proteínasestruturais e um revestimento lipídico que vem da célula hospedeira. Ossegmentos de RNA viral 1 a 3 codificam componentes do complexo RNApolimerase dependente de RNA (RDRP), PB1, PB2 e PA1 que, relacionadosao complexo de ribonucleoproteína que catalisa a transcrição e amplificaçãopor esses componentes do genoma viral. Hemaglutinina (HA) e neuramini-dase (NA) são glicoproteínas de superfície viral que são formadas pelossegmentos 4 e 6 do vRNA. Atualmente, são conhecidos 16 subtipos diferen-tes de HA e 9 diferentes de NA, que são classificados em diferentes catego-rias com base em seus vírus de influenza A.

Vírus com os tipos de HA H1, H2 e HA e tipos NA N1 e N2 po-dem ser epidêmicos em seres humanos (Lamb e Krug, em Fields, Virology,Filadélfia: Lippincott-Raven Publishers, 1353-1395, 1996). O segmento 5codifica a nucleoproteína (NP), os principais componentes do complexo deribonucleoproteína. Cada um dos dois menores segmentos de vRNA codificaduas proteínas. O segmento 7 do vRNA codifica a proteína de matriz M1 e aproteína M2. A proteína M1 se asociada ao interior da membrana dupla lipí-dica e reveste a cobertura viral de dentro para fora, M2 é um terceiro com-ponente transmembrana que funciona como um canal de íons dependentedo pH. A seqüência do segmento 8 tem informações para a proteína de ex-portação de núcleo NS/NEP e para a proteína não estrutural única, NS1.Recentemente, foi identificada uma décima-primeira proteína do vírus dainfluenza A (Chen et al., fonte depois das modalidades exemplificativas). É aproteína PB1-F2, que é formada por um quadro de leitura aberto do segmen-to de gene de PB1 deslocado por um nucleotídeo.

PB1-F2 é uma proteína mitocontrial que está em uma posiçãopara reforçar a indução da morte celular controlada, a apoptose.

A dificuldade para enfrentar vírus RNA é a mutabilidade dos ví-rus causada por uma elevada taxa de erro das polimerases virais, o que tor-na muito difícil tanto a fabricação de vacinas adequadas, quanto o desenvol-vimento de substâncias antivirais.

Verificou-se que o uso de substâncias antivirais que ataquemdiretamente as funções do vírus leva muito rapidamente à seleção de varian-tes resistentes devido a mutações. Um exemplo disso é um agente antiinflu-enza amantadina e seus derivados, que se dirigem contra uma proteínatransmembrana do vírus e já levam ao acúmulo de variantes resistentes comum pequeno número de passagens.

As novas terapias para infecções por influenza, que bloqueiam aproteína de superfície viral da influenza neuraminidase e são vendidas naAlemanha sob os nomes comerciais RELANZA e TAMIFLU da Glaxo Well-come e Roche já produziram variantes resistentes em pacientes (Gubarevaet al., J. Infect. Dis. 178, 1257-1262, 1998). Resistências a TAMIFLU surgi-ram até contra os vírus de gripe aviária H5N1 atualmente encontrados emseres humanos (Qui et al., Nature 437, 1108, 2005). As esperanças que fo-ram colocadas nessas terapias não podem ser atendidas por essa razão.

Devido a seus genomas muito pequenos e, portanto, à limitadacapacidade de codificação de funções necessárias para replicação, todos osvírus são, em grande medida, dependentes de funções de suas células hos-pedeiras. Exercendo influência sobre essas funções celulares, quando ne-cessárias para replicação viral, é possível afetar negativamente a replicaçãode vírus na célula infectada (Ludwig et al., Trends Mol. Med. 9, 46-51, 2003).Aqui, o vírus não tem oportunidade de substituir a função celular ausente poradaptação. Um escape por mutação devida à pressão de seleção não épossível aqui. Isso poderia ser demonstrado pelo exemplo do vírus da influ-enza A, não apenas com inibidores relativamente inespecíficos contra quina-ses e metil transferases celulares (Scholtissek e Muller, Arch. Virol. 119,111-118, 1991), mas também com inibidores de quinase que ataquem seleti-vãmente uma via de sinal requerida pelo vírus (Ludwig et al., FEBS Lett.561, 37-43, 2004).1.2. Função do Sistema Ubiauitina/proteossomo (UPS)

Proteossomos representam os principais componentes proteolí-ticos em células e no citossol de todas as células eucarióticas. São comple-xos de enzimas multicatalíticas que compõem aproximamente 1% das prote-ínas celulares totais. Os proteossomos exercem um papel vital em váriasfunções do metabolismo celular. A principal função é a proteólise de proteí-nas mal dobradas e não funcionais. Uma função adicional é possuída peladecomposição proteossômíca de proteínas celulares ou virais para a respos-ta imune exercida por células T mediante a geração de Iigantes peptídicospara as moléculas de histocompatibilidade maior classe I (para uma revisão,vide Rock e Goldberg1 1999). Os alvos do proteossomo são, como regra,marcados pela fixação das formas oligoméricas de ubiquitina (Ub) para adecomposição. Ub é uma proteína altamente conservada, de 76 aminoáci-dos de comprimento, que é covalentemente ligada a protéinas-alvo. A pró-pria ubiquitilação é reversível, e moléculas de Ub podem ser novamente re-movidas por uma multiplicidade de Ub hidrolases da molécula-alvo. A cone-xão entre a ubiquitilação de protéinas-alvo e a proteólise proteossômíca égeralmente chamada de sistema de ubiquitina/proteossomo (UPS) (parauma revisão, vide Rock e Goldberg, 1999; Hershko e Ciechanover, 1998).

O proteossomo 26S é um grande complexo de múltiplas enzi-mas de 2,5 MDa, que consiste em aproximadamente 31 subunidades. A ati-vidade proteolítica do complexo de proteossomo é implementada por umagrande estrutura de núcleo cilíndrica de 700 kDa, que consiste em quatroanéis um sobre o outro, o proteossomo 20S. O proteossomo 20S forma umintrincado complexo de múltiplas enzimas, que consiste em 14 proteínas nãoidênticas, um complexo que está arranjado em dois anéis α e dois β, emuma seqüência αβα. A especificidade de substrato do proteossomo 20Scompreende três atividades essenciais: tripsina, quimiotripsina e de hidrólisede peptídio pós-glutamila (PGPH) ou mesmo atividades do tipo casepase,que estão localizadas nas subunidades β Ζ, Y e Ζ. O proteossomo 20S de-grada in vitro proteínas desnaturantes, independentemente de sua poliubi-quitilação. Por outro lado, as atividades enzimáticas in vivo dos proteosso-mos 20S são reguladas pela fixação das subunidades reguladoras 19S, queformam juntas a partículas de proteossomo 26S ativo. As subunidades regu-ladoras 19S estão envolvidas na identificação de proteínas poliubiquitiladas,assim como no desdobramento de protéinas-alvo. A atividade do proteos-somo 26S é dependente de ATP e degrada quase que exclusivamente ape-nas proteínas poliubiquitiladas (para uma revisão, vide Hershko e Ciechano-ver, 1998).

1.3. Inibidores de Proteossomo

Várias classes de fármacos são conhecidas como inibidores deproteossomo. Em uma, há aldeídos peptídicos quimicamente modificados,como o aldeído tripeptídico N-carbobenzoxil-L-leucinil-L-leucinil-L-leucinil(zLLL; também chamado de MG132), assim como o derivado de ácido bóricoeficaz MG232. Da mesma forma que o zLLL, uma classe adicional de peptí-dios modificados, as peptídio vinil sulfonas, foi descrita como inibidores deproteossomo (para uma revisão, vide Elliott e Ross, 2001). Substâncias deocorrência natural são a Iactacistina (LC) (Fenteany et al., 1995), que é re-cuperada estreptomicetos, assim como a epoxomicina, que é recuperada deactinomicetos (Meng et al., 1999a, b). A LC é um inibidor de proteossomoaltamente específico e irreversivelmente eficaz, que bloqueia principalmenteas atividades do tipo quimiotripsina e tripsina da partícula de proteossomo26S (Fenteany et al., 1995). A LC não tem nenhuma estrutura básica peptí-dica, mas, ao invés, consiste em um anel γ-lactama, uma cisteína e um gru-po hidróxi-butila. A própria LC não inibe o proteossomo. Ao invés, um resí-duo N-acetil cisteína é hidrolisado em uma solução aquosa. O resultado é aformação de uma clastolactacisteína β-lactona, que é capaz de penetrar emmembranas celulares. Depois da aceitação na célula, a β-lactona forma umanel, e há a subseqüente transesterificação do grupo treonina-1-hidroxila dasubunidade β (Fenteany et al., 1995).

Com relação à especificidade e à eficácia, a epoxomicina é atéagora o mais eficaz de todos os inibidores naturais de proteossomo (Meng etal., 1999a, b). Uma classe adicional e muito potente de inibidores sintéticosde proteossomo são os derivados de ácido bórico-peptídio, em particular ocomposto piranosil-fenil-leucinil-ácido bórico com o nome "PS-341". O PS-341 é muito estável sob condições fisiológicas e biologicamente disponívelapós aplicação intravenosa (Adams e Stein, 1996; Adams et al., 1999, US1.448.012TW01).

1.4. Aplicação Clínica de Inibidores do Proteossomo

O bloqueio da atividade do proteossomo como principal proteasecelular pode levar a alterações na regulação do ciclo celular, na transcrição,na proteólise celular total, assim como no processamento do antígeno MHC-1 (para uma revisão, vide Ciechanover et al., 2000). Como resultado, umainibição duradoura de todas as atividades enzimáticas do proteossomo nãopode ser combinada com a vida de uma célula e, conseqüentemente, doorganismo inteiro. Particularmente, inibidores de proteossomo de ação re-versível podem, entretanto, inibir atividades proteolíticas individuais do pro-teossomo 26S seletivamente, sem influenciar, dessa forma, outras proteasescelulares. Os primeiros estudos clínicos com inibidores de proteossomo (A-dams et al., 1999) deixam claro o fato de que essa classe de substânciastem um enorme potencial como substância farmacêutica com uma variadabase para uso (para uma revisão, vide Elliott e Ross, 2001). O significado deinibidores de proteossomo como um novo princípio terapêutico foi cada vezmais notado nos últimos anos, em particular no tratamento de câncer e do-enças inflamatórias (para uma revisão, vide Elliott e Ross, 2001). Os inibido-res de proteossomo desenvolvidos pela companhia "Millennium Inc." (Cam-bridge, MA, EUA) para terapias antiinflamatórias, imunomoduladoras e anti-neoplásicas, em particular derivados de ácido bórico de dipeptídios e, dessaforma, em particular o composto PS-341 (Adams et al., 1999).

A aplicação de inibidores de proteossomo com o objetivo de blo-quear infecções virais já foi descrita. Em particular, foi demonstrado por S-chubert et al. (2000 a, b) que inibidores de proteossomo bloqueiam a monta-gem, liberação e maturação proteolítica de HIV-1 e HIV-2. Esse efeito sebaseia em um bloqueio específico do processamento proteolítico da gag-poliproteína pela protease de HIV, sem que os inibidores de proteossomoinfluenciem a atividade enzimática da própria protease viral. Conexões adi-cionais com a UP foram relatadas para a germinação do vírus do sarcomade Rous1 RSV (Patnaik et al., 2000); vírus da imunodeficiência símia, SIV(Strack et al., 2000) e vírus Ebola (Harty et al., 2000). No último caso (Hartyet al., 2000), demonstrou-se que a ubiquitina Iigase celular interage com aproteína de matriz do Ebola.

1.5. Inibidores de Proteossomo na Literatura de Patentes

Inibidores de proteossomo e seu uso médico são assunto deinúmeras patentes e pedidos de patente. Na patente norte-americana n-5.780.454 A (Adams et al.), foram descritos compostos de ácidos e ésteresbóricos, sua síntese e uso como inibidores de proteossomo. A inibição de NFkapa B em uma célula é dada como o mecanismo da inibição de proteosso-mo.

O pedido de patente internacional WO 98/10779 tem como seuobjeto o uso de inibidores de proteossomo para o tratamento de infecçõesparasitárias.

No texto do WO 99/15183, inibidores de proteossomo foram u-sados para o tratamento de doenças auto-imunes. Isso também tem a vercom o papel do UPS na ativação mediada por NFkB do promotor LTR deHIV-1 e a ver com processos de transcrição no núcleo celular, que não são,entretanto, essenciais para uma replicação de HIV. Não se demonstra queinibidores de proteossomo possam bloquear a replicação de HIV. A via deNFkB certamente não é adequada para isso.

Usos médicos adicionais são o tratamento de doenças fibróticas(US 2005/222043 A), a prevenção da rejeição de transplantes e de um cho-que séptico (EP 0967976 A), o tratamento de constrições de vasos sangüí-neos (WO 02/060341 A) ou o tratamento de uma insuficiência do endotélio(WO 2004/012732 A).

O uso de inibidores de proteossomo em uma indicação cardioló-gica também é mencionado (DE 10040742 A).

A aplicação de inibidores de proteossomo para o tratamento deinfecções virais é o assunto do pedido de patente EP 1430903 A1 = US2004/0106539A1. Descreve-se o uso de inibidores de proteossomo comoum meio de bloquear a liberação, maturação e replicação de retrovírus. U-sando o exemplo do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), demonstra-seque inibidores de proteossomo bloqueiam tanto o processamento de proteí-nas gag, quanto a liberação de partículas virais, assim como a infectividadedas partículas virais liberadas e, com isso, a replicação viral. Áreas de usosão a terapia retroviral e a prevenção de infecções com lentivírus causado-res de imunodeficiência em animais e seres humanos, em particular demên-cia induzida por AIDS ou HIV, incluindo em combinação com outros medi-camentos anti-retrovirais.

No pedido de patente EP 1326632 A1, apresentam-se meiospara o tratamento, terapia e bloqueio de infecções pelo vírus da hepatite edoenças hepatopatogênicas. O fármaco usado para bloquear a liberação,maturação e replicação de vírus da hepatite em preparações farmacêuticascontém, como ingredientes ativos, classes de substâncias que têm em co-mum o fato de que inibem o proteossomo 26S em células. Isso incluí acimade tudo inibidores de proteossomo que influenciam as atividades da via daubiquitina/proteossomo, em particular as atividades enzimáticas dos comple-xos de proteossomo 26S e 20S. O uso da invenção se encontra na terapiaantiviral de infecções de hepatite, particularmente na prevenção do estabe-lecimento, assim como a manutenção de uma infecção aguda e crônica porHBV e HCV e carcinomas de fígados associados a ela.

Os inibidores de proteossomo também são usados para o trata-mento, terapia e bloqueio de infecções por vírus flaviviridae (WO2003/084551 A1). Os fármacos usados para bloquear a liberação, matura-ção e replicação de flaviviridae em preparações farmacêuticas contêm, comoseus ingredientes ativos, classes de substâncias que têm em comum o fatode que inibem o proteossomo 26S em células.

Inibidores de proteossomo também são sugeridos para o trata-mento de infecções virais, em particular infecções com vírus corona quecausam SARS (síndrome respiratória aguda grave).

A importância da via da ubiquitina-proteossomo para a replica-ção de vírus da influenza, ou mesmo o uso de inibidores de proteossomopara a profilaxia e/ou tratamento de infecções por vírus da influenza, ainda

não foi mostrada.

No pedido de patente alemã DE 103 00 222 A1, descreve-se ouso de ingredientes ativos para o bloqueio das replicações de IAV, que ini-bem exclusivamente componentes da via do sinal NFkB. Juntamente comuma multiplicidade de inibidores de NFkB de ação relativamente específica,também se mencionam inibidores de proteossomo como possíveis ingredi-entes ativos nessa descrição de invenção, sem mostrar detalhes suficientesde nenhum tipo de dados experimentais para isso. Ao contrário, especulou-se apenas que os inibidores de proteossomo também influenciam a via detransmissão do sinal de NFkB. A desvantagem decisiva da invenção descritaem DE 103 00 222 A1 é o fato de que investigações referentes ao efeito deinibidores de proteossomo sobre a ativação de NFkB em combinação com oefeito antiviral em vírus da influenza foram até agora negativos. Assim, nãose pôde mostrar que seja possível produzir composições farmaceuticamenteeficazes que contenham pelo menos um inibidor de proteossomo e/ou pelomenos um inibidor da UPA e que sejam adequados para o tratamento deuma infecção por IAV. Um efeito antiviral de inibidores de proteossomo rela-tivo a vírus da influenza não pôde ser mostrado na invenção descrita no DE103 00 222 A1. Ao contrário, os resultados contidos na presente descriçãode invenção demonstrarão que a eficácia de inibidores de proteossomo so-bre a ativação de NFKB requer uma dose tão elevada de inibidores de pro-teossomo, que não é obtida in vivo por aplicações padronizadas e, além dis-so, não seria justificável em termos médicos, por causa da toxicidade dosefeitos colaterais conhecidos de inibidores de proteossomo já usados clini-camente nesse grau de concentração. Como resultado, o DE 103 00 222 A1não ensina que inibidores de proteossomo sejam adequados para a produ-ção de composições farmacêuticas antivirais contra vírus da influenza.

A descrição internacional WO 00/33654 A1 descreve o uso deum inibidor de protease de HIV-1, Ritonavir, como um inibidor de proteosso-mo. Esse inibidor de protease tem um efeito inespecífico sobre o proteosso-mo na concentração de aproximadamente 10 microgramas, isto é, 10.000vezes menor que a concentração eficaz de um inibidor de proteossomo es-pecífico. Além disso, essa concentração extremamente alta não é fisiologi-camente obtenível. Além do mais, surge a conclusão lógica de que esse blo-queio permanente do UPS por Ritonavir quando administrado a pessoas in-fectadas com HIV na terapia anti-retroviral de alta dose (HAART) tem de le-var a efeitos colaterais extremamente tóxicos, devido à desconexão perma-nente do proteossomo 26S. Até agora, isso não foi descrito para todos ospacientes tratados com Ritonavir. Da mesma forma, na exposição WO00/33654 A1, faltam dados experimentais para essa hipótese apenas teóricae também demonstravelmente falsa que possam fundamentar esse efeito.Evidentemente, o Ritonavir, como um inibidor de protease de HIV, bloqueia aatividade do HIV, mas não faz isso pelo efeito inespecífico sobre o proteos-somo, mas, ao invés, porque bloqueia a protease de HIV exclusiva e seleti-vamente nas concentrações terapeuticamente aplicáveis. O Ritonavir blo-queia o proteossomo 26S apenas nas altas concentrações não obtidas tera-peuticamente, e apenas o Ritonavir pode fazer isso, e nenhum dos outrosinibidores de protease de HIV até agora conhecidos. Finalmente, esse efeitobizarro do Ritonavir foi representado no UPS in vitro. Vírus da influenza tam-bém são mencionados no WO 00/33654 A1 de maneira apenas teórica; en-tretanto, essa menção é feita exclusivamente com relação à melhora do es-tado imune, em particular com referência à atividade de células T CD4+. Umefeito antiviral direto sobre vírus da influenza não é mencionado. Além disso,esse documento não ensina que inibidores de proteossomo possam ser u-sados como fármacos antivirais para a produção de composições farmaceu-ticamente eficazes para o tratamento de vírus da influenza.

O assunto do pedido de patente WO 03/064453 A2 são os cha-mados inibidores de Tróia, que consistem em inibidores de proteossomo epeptídios de Tróia. Esses também devem poder ser usados no tratamentode vírus da influenza. Entretanto, nessa exposição também há falta de pro-vas experimentais de que um efeito antiviral contra vírus da influenza sejarealmente obtido por meio desses inibidores de Tróia. Além disso, não sepode estabelecer por esse texto que uma possível eficácia desses inibidoresde Tróia seja atribuível a inibidores específicos do proteossomo 26S. Tem dese considerar, ao invés, que uma eficácia específica só possa ser consegui-da pelo fato de o inibidor de proteossomo ser colocado na célula-alvo pormeio do componente de Tróia, em que também há falta de provas concretasdisso.

O texto WO 03/064453 A2, portanto, não ensina o uso de inibi-dores de proteossomo para o tratamento de vírus da influenza.

Inibidores da ubiquitina-ligase são o assunto do WO2004/007141 A2. Descrevem-se nela componentes antivirais, fármacos anti-câncer e compostos que possam ser usados para o tratamento de disfun-ções neurológicas. Os vírus da influenza não são mencionados. Além disso,nem o presente texto nem outras publicações dão qualquer indicação de queubiquitina Iigases interrompam a replicação de vírus da influenza.

Em resumo, pode-se estabelecer que, em todos os usos até a-gora de inibidores do proteossomo, seu efeito sobre vírus da influenza e,conseqüentemente, seus usos terapêuticos para o tratamento de infecçõespor vírus da influenza não foram descritos. O efeito de inibidores de proteos-somo para o tratamento de uma infecção por vírus da influenza também nãofoi discutido. Além disso, ainda não foi testado se inibidores de proteossomobloqueiam a montagem e a liberação de vírus da influenza. Da mesma for-ma, até agora não foi relatado nenhum tipo de conexão entre infecções porvírus da influenza e o UPS. Portanto, o uso de inibidores tanto de ubiquitinaligases, quanto de ubiquitina hidrolases celulares também é completamentenovo.

2. Natureza da Invenção

A tarefa subjacente da invenção é tornar disponíveis fármacosque sejam adequados para o tratamento de infecções por vírus da influenza,dessa forma, substâncias que tenham um efeito antiviral sobre a infecçãopor vírus da influenza em animais e seres humanos. A tarefa é resolvida, deacordo com as características das reivindicações da patente, pela introduçãode inibidores de UPS. Tanto inibidores de proteossomo, quanto inibidores deubiquitina ligases ou ubiquitina hidrolases encontram uso aqui.De acordo com a invenção, foram desenvolvidos fármacos comum efeito antiviral que contêm, como ingredientes ativos, tanto inibidores deproteossomo, quanto inibidores de ubiquitina ligases ou ubiquitina hidrolasesem preparações farmacêuticas. Os novos fármacos de acordo com a inven-ção são adequados para a profilaxia e/ou terapia de infecções por vírus dainfluenza, em particular o vírus da influenza A.

A natureza da invenção também surge das reivindicações dapatente.

Além disso/os fármacos de acordo com a invenção podem serusados para a profilaxia e/ou tratamento, terapia e bloqueio de uma infecçãopor ortomixovírus. Demonstra-se que os usos desse fármaco levam ao blo-queio da disseminação da infecção e, portanto, do desenvolvimento da do-ença in vivo no modelo animal. Esses fármacos podem, portanto, prevenir oestabelecimento de uma infecção por vírus da influenza em animais e sereshumanos ou, ao invés, curar uma infecção que já tenha se estabelecido.

A tarefa foi resolvida com o auxílio de preparações farmacêuti-cas que são adequadas para bloquear a liberação, maturação e replicaçãode vírus da influenza, em particular de IAV.

Essas preparações se caracterizam pelo fato de conterem pelomenos um inibidor de proteossomo como um componente eficaz. Além dis-so, esses medicamentos podem conter outros componentes do UPS. Isso serefere a ubiquitina ligases e/ou ubiquitina hidrolases, isto é, enzimas que re-gulam a ubiquitilação de proteínas. Essa tarefa é, portanto, resolvida poruma combinação de inibidores de proteossomo, por um lado, e por ubiquitinaligases e/ou ubiquitina hidrolases, por outro lado. Em uma modalidade prefe-rida da invenção, também se introduzem inibidores de proteossomo puros,que se distinguem por uma alta permeabilidade de membrana, assim comoalta especificidade pelo proteossomo 26S da célula hospdeira.

De acordo com uma modalidade vantajosa da invenção, os efei-tos antivirais podem ser particularmente conseguidos em células infectadaspor IAV. Esses se referem em primeiro lugar à indução da apoptose nas cé-lulas infectadas pelo vírus da influenza e, com isso, a morte preferida dascélulas infectadas no organismo. Ao mesmo tempo, com a inibição da mon-tagem e maturação de vírus da influenza, a liberação e a produção de partí-culas virais infecciosas é interrompida. No total desse efeito, pode-se ocasi-onar um efeito terapêutico por bloqueio da replicação viral e remoção de cé-lulas produtoras de vírus do organismo.

Em uma modalidade adicional da invenção, podem-se usar inibi-dores de proteossomo clássicos para combater infecções com vírus da influ-enza. Para isso, deve-se, acima de tudo, usar inibidores que interajam ex-clusivamente com o grupo hidroxil-treonina cataliticamente ativo da subuni-dade beta do proteossomo 26S e, conseqüentemente, apenas bloquear es-pecificamente o proteossomo. Um constituinte substancial adicional e efeitosurpreendente desse desenvolvimento é a observação de que o bloqueio doUPS induz, de preferência, a morte (apoptose) de células infectadas pelovírus da influenza.

As tarefas da invenção foram resolvidas pela introdução de pelomenos um inibidor de proteossomo e/ou pelo menos um inibidor de ubiquiti-na Iigases ou ubiquitina hidrolases. De acordo com a invenção, foram de-senvolvidos fármacos para o tratamento de infecções virais que, em prepa-rações farmacêuticas, contêm inibidores do UPS como um ingrediente ativopara o bloqueio de vírus da influenza. De acordo com uma modalidade pre-ferida da invenção, foram aplicadas substâncias como inibidores de proteos-somo que bloqueiam, regulam ou de outra forma influenciam as atividadesdo UPS.

Também é possível que se introduzam substâncias como inibi-dores de proteossomo que influenciem particularmente as atividades enzi-máticas do complexo de proteossomo 26S completo e a estrutura de prote-ossomo cataliticamente ativo 20S livre não montado com subunidades regu-ladoras. Esses inibidores podem bloquear uma ou várias ou todas as trêsatividades proteolíticas primárias do proteossomo (atividades tripsina, quimi-tripsina e de hidrólise de peptídio pós-glutamil) dentro do complexo de prote-ossomo 26S ou mesmo 20S.

Uma variante da invenção consiste na introdução, como inibido-res de proteossomo, de substâncias que sejam captadas por células euca-rióticas superiores e interajam, após aceitação pela célula, com a subunida-de beta catalítica do proteossomo 26S e, dessa forma, bloqueiem todas oualgumas das atividades proteolíticas dos complexos de proteossomo, demaneira irreversível ou reversível.

Em uma variante adicional da invenção, introduzem-se substân-cias como inibidores específicos de proteossomo que, após aceitação pelacélula, bloqueiem seletivamente atividades enzimáticas individuais do prote-ossomo 26S e, além disso, também bloqueiem seletivamente formas demontagem particulares do proteossomo como, por exemplo, o imunoprote-ossomo. O imunoproteossomo é formado pela remontagem como uma formaparticular do proteossomo 26S, em particular após estímulo por tratamentocom interferon. O imunoproteossomo também pode se formar como umareação a uma infecção por IAV. Conseqüentemente, a inibição específica doimunoproteossomo é uma modalidade particular do efeito antiviral de inibido-res de proteossomo em infecções por IAV. De acordo com a invenção, porcausa disso, também se introduzem substâncias que inibam seletivamente oimunoproteossomo.

Como outra forma da invenção, usam-se fármacos que bloquei-am as atividades das enzimas de conjugação com ubiquitina e/ou hidrólisede ubiquitina. Também pertencem a ela fatores celulares que interajam comubiquitina tanto como monoubiquitina, quanto como poliubiquitina. A poliubi-quitinilação em geral conta como um sinal de identificação para a proteólisepelo proteossomo 26S, e a influência da via de ubiquitinilação também poderegular a atividade do proteossomo.

De acordo com a invenção, também se introduzem substânciascomo inibidores de protessomo que sejam administradas em várias formasin vivo por via oral na forma de cápsula, com ou sem alterações portadorasde especificidade para células, intravenosa, intramuscular, subcutânea oupor inalação em forma de aerossol, ou que, de outra forma, tenham umabaixa citotoxicidade e/ou alta seletividade por células e órgãos particularesdevido ao uso de uma aplicação e regime de dose particulares, não tenhamefeitos colaterais, ou apenas insignificantes, e tenham uma meia-vida meta-bólica relativamente alta e uma taxa de depuração relativamente baixa noorganismo.

A diferença decisiva da presente invenção, em comparação coma solução descrita, é que se poderia demonstrar, de acordo com a invenção,que o efeito específico de inibidores de proteossomo sobre a replicação deIAV não contém a via de transferência de sinal de NFkB, mas, ao invés, refe-re-se a uma via celular completamente diferente, isto é, a via do ubiquitinaproteossomo (UPS) na liberação de vírus descendentes infecciosos em umainfecção com IAV. O efeito antiviral de inibidores de proteossomo em umainfecção por IAV também poderia ser demonstrado pela primeira vez expe-rimentalmente e in vivo. Como resultado, poderia ser provado na presenteinvenção que inibidores de proteossomo não influenciam a via de transfe-rência de sinal de NFkB. Os presentes resultados (vide modalidade exempli-ficativa) mostram claramente que, em uma concentração antiviral de inibido-res de proteossomo eficazes in vivo, a via de NFkB claramente não é afeta-da.

Além disso, introduzem-se substâncias como inibidores de pro-teossomo que, em sua forma natural, são isoladas de microorganismos ououtras fontes naturais, surgem de substâncias naturais por modificaçõesquímicas ou são fabricadas de maneira totalmente sintética, ou sintetizadaspor métodos terapêuticos genéticos in vivo ou são fabricadas por métodosde engenharia genética in vitro ou em microorganismos. Elas incluem:

a) inibidores de proteossomo de ocorrência natural:

- epoxomicina e eponemicina;

- alcacinomicina A (também chamada de aclarrubicina);

- lactacistina e suas variantes quimicamente modificadas, em particular avariante de penetração em membrana celular "clastolactacisteína β-lactona";

b) fabricadas de maneira sintética:

- aldeídos peptídicos modificados como, por exemplo, N-carbobenzóxi-L-leucinil-L-leucinil-L-leucinal (também chamado de MG132 ou zLLL), seu de-rivado de ácido bórico MG232; N-carbobenzóxi-Leu-Leu-Nva-H (chamado deMG115); N-acetil-L-leuzinil-L-leuzinil-L-norleuzinal (chamado de LLnL); N-Carbobenzoxi-IIe-GIu(OBut)-AIa-Leu-H (também chamado de PSI);

- peptídios portadores dos resíduos C terminais epoxicetona (também cha-mado de epoxomicina ou eponemicina), vinil-sulfona (por exemplo, carbo-benzóxi-L-leucinil-L-leucinil-L-leucin-vinil-sulfona ou 4-hidróxi-5-iodo-3-nitrofenilacetil-L-leucinil-L-leucinil-L-leucin-vinil-sulfona, também chamado deNLVS), glioxal ou ácido bórico (por exemplo, pirazil-CONH(CHPhe)CONH(CHisobutiI)B(OH)2), também chamado de "PS-431" ou benzoil(Bz)-Phe-boroLeu, fenacetil-Leu-Leu-boroLeu, Cbz-Phe-boroLeu; pinacol-éster, porexemplo, benziloxicarbonil(Cbz)-Leu-Leu-boroLeu-pinacol-éster; e

- foram introduzidos como compostos particularmente adequados peptídios ederivados peptídicos portando estruturas epoxicetona C terminais; essesincluem, por exemplo, epoxomicina (fórmula molecular: C28H86N4O7) e epo-nemicina (fórmula molecular: C20HseN2O5); derivados de dipeptidil ácido bóri-co particulares, em particular o composto PS-296 (8-quinolil-sulfonil-CONH-(CH-naftil)-CONH(-CH-isobutil)-B(OH)2); o composto PS-303 (NH2(CH-naftil)-CONH-(CH-IsobutiI)-B(OH)2); o composto PS-321 (morfolin-CONH-(CH-naftil)-CONH-(CH-fenilalanina)-B(OH)2); o composto PS-334 (CH3-NH-(CH-naftil-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)2); o composto PS-325 (2-quinol-CONH-(CH-homofenilalanina)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)2); o composto PS-352(fenilalanina-CH2-CH2-CONH-(CH-fenilalanina)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)2);o composto PS-383 (piridil-CONH-(CHpF-fenilalanina)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)2). Os compostos já descritos em Adams et al. (1999) também estãoincluídos aqui. Juntamente com epoxomicina e eponemicina, derivados depeptidil ácido bórico também se mostraram compostos particularmente ade-quados. Esses inibidores de proteossomo são muito potentes, muito especí-ficos para o proteossomo, não bloqueiam nenhuma outra protease celular e,portanto, quase não têm efeitos colaterais.

De acordo com a invenção, apresentam-se fármacos com osinibidores de proteossomo que, surpreendentemente:

- afetam de maneira adversa a produção de vírus descendentesinfecciosos por bloqueio da replicação de vírus da influenza e, dessa forma,previnem a disseminação de uma infecção por vírus da influenza no orga-nismo;

- bloqueiam a liberação de vírus da influenza infecciosos pelascélulas infectadas;

- limitam a disseminação de uma infecção aguda pelo vírus dainfluenza;

- suprimem a viremia tanto em uma nova infecção, quanto noretorno de infecções RE com vírus da influenza, e aumentam o sucesso daeliminação de vírus pelo próprio sistema imune e/ou por fármacos conheci-dos com um efeito similar ou diferente.

As características da invenção surgem dos elementos das rei-vindicações e da descrição, em que tanto características individuais, quantovárias na forma de combinações de modalidades vantajosas representamaquila para que se pede proteção com este relatório descritivo. A invençãotambém se encontra em um uso combinado de elementos conhecidos e no-vos: inibidores de proteossomo e Ub ligases, por um lado, e Ub hidrolases,por outro lado.

De acordo com a invenção, inibidores de proteossomo encon-tram uso:

- no tratamento de infecções de gripe e doenças relacionadasem seres humanos e animais, que sejam causadas por vírus da influenza evírus RNA de filamento negativo relacionados;

- como um fármaco para influenciar, bloquear ou regular a via daubiquitina/proteossomo;

- como um fármaco para influenciar as atividades enzimáticas docomplexo de proteossomo 26S completo e a estrutura de proteossomo cata-liticamente ativa 20S livre, não montada com subunidades reguladoras, epara o bloqueio seletivo do imunoproteossomo.

Os inibidores de UPS introduzidos de acordo com a invençãotêm um uso adicional:

- para a prevenção de um surto de doença e para a redução dosurto de infecção no organismo de pessoas já infectadas;- para a profilaxia do estabelecimento de uma infecção sistêmicapor influenza diretamente após contato com amostras biológicas infecciosas,pessoas infectadas ou suas proximidades.

Os inibidores de UPS introduzidos de acordo com a invençãopodem ser administrados tanto por via sistêmica, quanto tópica, de preferên-cia por via aérea. O ingrediente ativo de um inibidor de proteossomo introdu-zido de acordo com a invenção pode ser introduzido com pelo menos umasubstância eficaz como antiviral adicional, para a profilaxia e/ou terapia deinfecções por influenza.

A invenção será descrita em maiores detalhes com base emmodalidades exemplificativas, sem se limitar a esses exemplos.Modalidades Exemplificativas

Exemplo 1: O inibidor de proteossomo não mostra efeitos colaterais tóxicosapós tratamento por aerossol de camundongos

Para investigar se um inibidor de proteossomo é tóxico para ca-mundongos após aplicação como um aerossol, 6 camundongos foram trata-dos 3 vezes por dia, durante 5 dias, com 500 nM de inibidor de proteossomo.Para isso, 2 mL de inibidor de proteossomo (500 nM) foram nebulizados como auxílio de um nebulizador (PARI®). A duração do tratamento foi de 10 mi-nutos em cada caso. O tratamento foi realizado às 9 h, 12 h e 15 h. No teste,houve 6 camundongos que foram tratados com o solvente (DMS0/H20). Pa-ra medir a temperatura corporal e a atividade corporal, minissensores foramimplantados nos camundongos. As gaiolas nas quais ficavam os camundon-gos estavam sobre placas receptoras. Esses receptores alimentavam os si-nais para um computador, que avaliava os dados com o auxílio de um soft-ware especial.

Após implantação do sensor, o estado de saúde dos camundon-gos foi observado durante 5 dias, após os quais ocorreu o tratamento cominibidores de proteossomo durante mais 5 dias. Durante o tratamento, ne-nhuma diferença de temperatura corporal (figura 1A) e atividade corporal(figura 1B) poderia ser estabelecida entre camundongos que foram tratadoscom o inibidor de proteossomo e o solvente. Os gráficos mostram os valoresde investigação no 5Q dia de tratamento como um exemplo. As investigaçõesmostram que camundongos que foram tratados com o inibidor de proteos-somo em uma concentração de 500 nM e um período de tratamento de 5dias não mostraram efeitos tóxicos significativos. Assim, o inibidor de prote-ossomo na concentração indicada é adequado para investigações de ativi-dade antiviral contra vírus da influenza no modelo de camundongo.Exemplo 2: Inibidores de proteossomo bloqueiam eficientemente a replica-ção de vírus da influenza de maneira dependente da concentração e nãosão significativamente tóxicos para a célula hospedeira em concentraçõeseficazes como antiviral no período de observação.

Para investigar se inibidores do proteossomo têm um efeito ne-gativo sobre a replicação de vírus da influenza, células de carcinoma epitelialpulmonar humano A549 (figura 2A, B) ou células de carcinoma epitelial renalde cão Madine Darby Canine Kidney (MDCKII) (figura 2C) foram pré-incubadas com os inibidores de proteossomo nas concentrações dadas du-rante uma hora e, então, infectadas com a cepa de vírus da gripe aviáriaA/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (multiplicidade da infecção (MOI) = 0,01). Comocomparação, havia células infectadas não tratadas ou, ao invés, células tra-tadas com o solvente dimetilsulfóxido (DMSO). As substâncias introduzidasforam PS341 (10 nM e 100 nM), PS273 (10 nM e 100 nM), lactacisteína (1μΜ e 10 μΜ), assim como epoxomicina (10 nM, 100 nM e 1 μΜ). 8 e 24 h(figura 2A) ou 8, 24 e 36 h (figura 2B, C) após o início da infecção, os sobre-nadantes de meio contendo vírus foram coletados, e o título de vírus foi de-terminado em ensaios em placa com células MDCKII.

O resultado mostrou que todos os inibidores do proteossomoinibem a replicação do vírus da influenza agressivo A/FPV/Bratislava/79 efi-cientemente e de maneira dependente da concentração. Para responder àquuestão de se o efeito antiviral é posto em ação indiretamente por um efeitotóxico celular dos inibidores de proteossomo, células MDCKII (contagem ce-lular: 2 χ 106) foram tratadas com concentrações eficazes como antiviral dosinibidores de proteossomo antivirais mais eficazes PS341, lactacisteína eepoxomicina. Como controle, usou-se a substância indutora de apoptosealtamente citotóxica estaurosporina (0,3 μΜ). Após 16 e 24 h, tanto as ade-rentes, quanto as mortas já removidas foram coletadas, cultivadas em PBS etratadas com 50 μβ/mL de iodeto de propídio (PI). O PI se intercala na fita deDNA de células agonizantes. A análise foi realizada por meio de citometriade fluxo (FACScan Becton Dickinson). Na figura 3 (A, B e C), a porcentagemde células mortas em comparação com o controle não tratado é representa-da em cada caso.

Observa-se que os inibidores de proteossomo em concentraçõeseficazes como antiviral no período de observação de 24 h não têm efeitotóxico significativo. A idéia de que o efeito antiviral dos inibidores de proteos-somo mostrados na figura 1 se baseia em efeitos tóxicos sobre as célulaspode, portanto, ser descartada.

Exemplo 3: Inibidores de proteossomo têm um efeito antiviral contra vírus dainfluenza em um mecanismo independente de NFKB

Para investigar se o efeito antiviral dos inibidores de proteosso-mo pode ser rastreado de volta ao bloqueio da via de sinal de NFkB, a ativa-ção induzida por TNFa de NFkB foi analisada com base na decomposiçãoda proteína inibidora ΙκΒα (inibidor de κΒ) no Western-Blot na presença eausência dos inibidores de proteossomo. Para isso, células A549 (2 χ 106)ou HEK293 (4 χ 106) foram pré-incubadas durante 1 h com os inibidores deproteossomo em várias concentrações. Depois disso, as células foram trata-das durante 15 min com 20 ng/mL de TNFa, para induzir a decomposição deΙκΒα. As células foram subseqüentemente cultivadas com IxPBS e lisadas.As concentrações de proteínas foram determinadas por meio do Ensaio deProteínas Bradford (Biorad) e alinhadas entre si. As proteínas foram separa-das por meio de eletroforese em gel SDS e transferidas para uma membranade nitrocelulose. A decomposição de ΙκΒα ficou visível por meio de um anti-soro específico para ΙκΒα (Santa Cruz Biotechnologies) e um reagente se-cundário acoplado à peroxidase de rábano (Amersham) com o auxílio deuma reação de luminescência eletroquímica (ECL, Amersham).

Surpreendentemente, as concentrações eficazes como antiviralde cada um dos inibidores de proteossomo não estavam em posição de ini-bir eficazmente a decomposição induzida por TNFa de ΙκΒα e, dessa forma,bloquear a ativação de NFkB. Assim, por exemplo, PS341 (100 nM) não es-tava em posição de prevenir a degradação de ΙκΒα em células A549 ouHEk293 (figura 4B e D). Da mesma forma, a mesma concentração de PS341em células A549 infectadas levou a uma redução do título de vírus (mais de2 níveis logarítmicos após 8 h, vide figura 2A). De maneira similar, Iactaciste-ína (1 μΜ) levou a uma redução do título de vírus (figura 2A), mas não sufi-cientemente eficaz para bloquear a degradação de ΙκΒα (figura 4B e D).

Isso prova de maneira inequívoca que os inibidores de proteos-somo agem de maneira antiviral por um mecanismo diferente do bloqueio deNFKB.

Exemplo 4: Um inibidor farmacológico do proteossomo MG132 interfere coma expressão induzida por vírus da influenza de genes pró-apoptóticos e inibeeficientemente a replicação do vírus da influenza in vitro e in vivo

Para investigar se o inibidor de proteossomo MG132 tem umefeito negativo sobre a replicação de vírus da influenza, a linhagem celularde epitélio de pulmão humano A549 foi infectada com o vírus de influenza Aaviário altamente patogênico A/FPV/Bratislava/79 (multiplicidade de infecção= 1) na presença ou ausência de várias concentrações dos inibidores de pro-teossomo MG132 (1, 5, 10 μΜ). No caso da presença do inibidor, as célulasforam pré-incubadas com a substância 30 minutos antes da infecção. 24 hapós a infecção, os sobrenadantes celulares foram investigados quanto aoteor de vírus descendentes infecciosos em ensaios em placa. Como resulta-do, na presença de MG132, mostrou-se uma redução dependente de con-centração de até 10 vezes do título de vírus (figura 5).

Para investigar se a redução do título de vírus é acompanhadapor uma expressão reduzida dos Iigantes pró-apoptóticos TRAIL eFasL/CD95L, a linhagem celular de epitélio pulmonar A549 foi infectada con-forme descrito com o vírus da influenza aviária A/FPV/Bratislava/79 (multipli-cidade de infecção = 1) na presença ou ausência de várias concentraçõesdos inibidores de proteossomo MG132 (10 μΜ). Cerca de 24 h após a infec-ção, as células foram fixadas com formaldeído a 4% e incubadas com anti-corpos específicos contra TRAIL e FasL7CD95L. Após a conexão dos anti-corpos com um corante fluorescente, as células foram submetidas a umaanálise de citometria de fluxo (FACS) para medir a expressão dos fatorespró-apoptóticos. Como resultado, os perfis de FACS mostram uma expres-são induzida por vírus claramente reduzida de FasL e TRAIL na presença deMG132 (figura 6).

Para testar a atividade antiviral de MG132 em um modelo deinfecção in vivo no camundongo, camundongos C57B1/6 (10 semanas deidade, criação própria da BFAV Tübingen) foram infectados por via intranasalcom 104 unidades infecciosas do vírus da influenza A aviária altamente pa-togênio e adaptado para camundongo A/FPV/Bratislava/79 e deixados semtratamento (n = 14) ou, ao invés, tratados em uma gaiola de isolamento 5vezes ao dia com um aerossol nebulizado de 1 mM de MG132 (n = 8) duran-te 5 dias. O tratamento ocorreu uma vez ao dia, começando 1 h antes dainfecção no dia 1. Determinou-se a taxa de sobrevivência dos camundongos.

Como resultado, no total, mostrou-se uma taxa de sobrevivênciasignificativamente aumentada dos camundongos infectados e tratados comMG132 em comparação com controles não tratados (figura 7).

Exemplo 5: Materiais e Métodos

Tratamento de camundongos com inibidores de proteossomo: otratamento de camundongos foi realizado em um sistema de inalação. Paraisso, 6 camundongos foram tratados em tubos de inalação. Esses 6 tubosficaram em conexão com um cilindro central com um volume total de 8,1 χ10'4 m3. Um nebulizador PARI® (Nebulizador de Aerossol; Art. nõ 73-1963)foi conectado ao cilindro central. Inibidores de proteossomo ou solventesforam nebulizados com 150 KPa (1,5 bar) durante 10 min (aproximadamente2 mL) na câmara. Camundongos BALB/c foram tratados 3 vezes ao dia às 9h, 12 h e 3 h durante 5 dias. O estado de saúde geral dos camundongos foiverificado duas vezes ao dia, e os animais foram pesados uma vez ao dia.

Monitorização dos camundongos: a monitorização da temperatu-ra corporal e da atividade corporal dos camundongos foi realizada com oSistema de Software e Hardware Vital View® (Mini Mitter, EUA). Esse siste-ma permite a geração de parâmetros fisiológicos do camundongo. O hard-ware é composto por um sistema transmissor (E-mitter)/receptor. O E-mittercoleta dados da temperatura corporal e da atividade corporal dos animais.Esses dados são registrados a cada 5 minutos e enviados para um compu-tador. Aí, a análises dos dados é realizada com o auxílio do software VitalView.

Para a implantação do E-mitter, os camundongos são anestesi-ados por injeção intraperitoenal de 150 μΙ_ de cetamina Rompun. A barrigados camundongos é barbeada, e se faz um corte de aproximadamente 1,5cm de comprimento ao longo da Linea abla para abrir o abdômen. Depoisdisso, o E-mitter é posicionado, e a abertura é fechada com grampos paraferidas (autoclip 9 mm; Becton & Dickinson, Alemanha). Os animais são de-volvidos a suas gaiolas, e a implantação bem-sucedida é verificada com oauxílio do software Vital View.

Infecção viral das células: as células são cultivadas, e se adicio-na a solução de vírus diluída em PBS de infecção (PBS com 1% de penicili-na/estreptomicina, 1% de Ca2VMg2+, 0,6% de albumina bovina a 35%). Ascélulas foram incubadas com o vírus nas quantidades dadas durante 30 mina 37°C no incubador e subseqüentemente cultivadas de novo, para removeras partículas de vírus que não se ligaram às células.

Depois dessa fase de adsorção, as células foram cobertas commeio de infecção (MEM com 1% de penicilina/estreptomicina e 1% deCa2+/Mg2+). As células foram mantidas no incubador a 37°C até a colheitadas células ou determinação dos vírus descendentes restantes.

Ensaio em placa para determinação de vírus descentes infeccio-sos: para determinar o número de partículas infecciosas em uma solução devírus, realizaram-se ensaios em placa com células MDCK II. A infecção dascélulas foi realizada com uma seqüências de soluções de vírus diluídas por500 μΐ Iogaritmicamente em PBS de infecção. A incubação foi realizada noincubador durante 30 min a 37°C, após o que a solução de vírus foi removi-da, e as células foram cobertas com uma mistura de meio e ágar (27 mL deddH20, 5 mL de 10 χ MEM, 0,5 mL de penicilina/estreptomicina, 1,4 mL debicarbonato de sódio, 0,5 mL de DEAE-dextrano a 1%, 0,3 mL de albuminabovina, 15 mL de ágar oxóide a 3%, 500 μΙ_ de Ca2+/Mg2+). As células forammantidas à temperatura ambiente até a sedimentação da mistura de mei-o/ágar e, depois disso, incubadas durante 2 a 3 dias a 37°C no incubador,até que houvesse um acúmulo de placas visíveis de células lisadas.

As placas foram tingidas com 1 mL de uma solução de vermelhoPBD neutra durante mais 1 - 2 horas no incubador, até que as placas ficas-sem visíveis.

Coloração das células com iodeto de propídio: a substância io-deto de propídio pode penetrar na membrana celular de células agonizantese se intercalar no DNA do núcleo celular. O número de células agonizantes emortas pode ser determinado de acordo com sua fluorescência no citômetrode fluxo. Células MDCK (2 χ 106) foram tratadas com as concentrações da-das de inibidores de proteossomo. As células MDCK foram tratadas com asubstância Iiberadora de apoptose estaurosporina (0,3 μΜ) como um testede toxicidade. Após 16 ou 24 h, as células aderentes, assim como as célulasdeixadas foram coletadas e tingidas com 50 μg/mL de iodeto de propídio. Aanálise foi realizada com o auxílio de citometria de fluxo (BD FACScan).

Eletroforese em gel SDS e Western-Blot: as células a serem Ii-sadas foram primeiro cultivadas com PBS e subseqüentemente colocadasnas cavidades de uma placa de 6 cavidades com 200 μί do tampão de IiseRIPA (25 mM de Tris, pH 8, 137 mM de NaCI, 10% de glicerina, 0,1% deSDS, 0,5% de desoxicolato de sódio DOC, 1% de NP40, 2 mM de EDTA, pH8, adicionados frescos: Pefablock 1:1000, Aprotinina 1:1000, Leupeptina1:1000, vanadato de sódio 1:1000, benzamidina 1:200). As células foramlisadas com oscilação a 4°C durante 30 min e subseqüentemente a 14.000rotações por minuto durante 10 min a 4°C na centrífuga de mesa, para sepa-rar as proteínas dos detritos celulares.

A concentração de proteína nos Iisados foi determinada com oauxílio da solução corante de proteínas Biorad (Biorad) e ajustada aos mes-mos volumes de proteínas. Depois disso, as amostras foram substituídascom 5 χ tampão de amostra (10% de SDS, 50% de glicerina, 25% de β-mercaptoetanol, 0,01% de azul bromofenol, 312 mM de Tris). O β-mercaptoetanol no tampão de amostra também se encarrega da desnatura-ção de proteínas por redução das ligações dissulfeto. As proteínas negati-vamente carregadas, portanto, se deslocam pelo campo elétrico na direçãodo eletrodo positivo, em que proteínas maiores no gel são deixadas maisfortemente para trás. O gel de eletroforese consiste em um gel de combina-ção a 5% (0,49 mL de gel de rotiforese 30, 3,25 mL de tampão de acondicio-namento (0,14 M de Tris, pH 6,8, 0,11% de Temed, 0,11% de SDS), 45 μΙ_de persulfato de amônio a 10%), no qual as proteínas são concentradas, eem um gel de divisão a 10% (3,375 mL de gel de rotiforese 30, 2,5 mL detampão de operação (1,5 M de Tris, pH 9, 0,4% de Temed, 0,4% de SDS),4,025 mL de agua bidestilada, 200 μL de peroxodissulfato de amônio a10%), no qual as proteínas são separadas de acordo com seu peso molecu-lar.

O gel é vertido em duas placas de vidro mantidas em um estadode escoamento e mantidas a uma distância por um espaçador, em que o gelé vertido primeiro. Este foi coberto com isopropanol para despolimerização esubseqüentemente deixado crescer com água bidestilada. O gel de combi-nação é vertido sobre o gel de divisão e colocado livre de bolhas em umacâmara de amostra. Depois da despolimerização, a câmara de amostra éretirada, e o gel é colocado emuma câmara de eletroforese, que foi enchidacom 1 χ SDS-PAGE-Tampão (5 mM de Tris, 50 mM de glicerina, 0,02% deSDS). As proteínas desnaturadas e um marcador são colocados nas bolsas.O gel é operado a um fluxo constante de 25 - 40 mA.

Depois disso, as proteínas são transferidas por meio de umcampo elétrico do gel para uma membrana de nitrocelulose. Proteínas queestejam imobilizadas na membrana de nitrocelulose podem ser detectadaspor um anticorpo específico. Este é identificado por um segundo anticorpoconectado à enzima, com o qual a proteína pode se tornar visível por umareação quimioluminescente. Ao fazer isso, o substrato luminoso é oxidadopor uma peroxidase de rábano ligada ao anticorpo secundário, mediante oqual muda para um estado excitado e emite luz, que pode se tornar visívelem um filme de raio X.

O gel SDS com as proteínas de divisão é recolhido pelo apare-lho de escoamento e deitado sobre dois papéis Whatman encharcado comtampão de transferência (3,9 mM de glicina, 4,8 mM de Tris, 0,0037% deSDS, 10% de metanol). A membrana de nitrocelulose foi deitada livre de bo-lhas sobre o antes antes de ocorrer a excitação em uma câmara de transfe-rência molhada (BioRad) cheia de tampão de transferência. As proteínas sãotransferidas sob uma corrente elétrica constante de 400 nA para a membra-na de nitrocelulose em 50 min. Nesta, as proteínas se movem do catodo pa-raoanodo.

De acordo com o procedimento de transferência, sítios de liga-ção não específica são bloqueados com leite em pó a 5% em 1 χ TBST (50μΜ de Tris, 0,9% de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,6) durante pelo menos45 min, por oscilação à temperatura ambiente, para evitar uma ligação nãoespecífica do anticorpo à membrana. A membrana é subseqüentemente in-cubada com os anticorpos primários (aqui anti ΙκΒα, diluição de 1:1000, San-ta Cruz Biotechnologies) durante uma noite a 4°C, enquanto se sacode. Amembrana é lavada três vezes, durante 10 min cada vez, com 1 χ TBST,para não remover resíduos não ligados do anticorpo. Depois disso, a mem-brana é enxaguada durante 1 - 2 horas no anticorpo secundário à temperatu-ra ambiente.

Depois de outras três lavagens com 1 χ TBST, a membrana élevada a uma condição de quimioluminescência aumentada (ECL = quimio-luminescência intensificada) pela adição de um substrato de quimiolumines-cência (250 mM de luminol, 90 mM de ácido p-cumárico, 1 M de Tris/HCI, pH8,5, 35% de H2O2), uma condição em que o substrato luminol contido nela ésubstituído pela peroxidase de rábado ligada ao anticorpo secundário. Amembrana é incubada durante 1 min com o substrato, então, seca e, então,depositada sobre um cassete de filme de raio X, onde a quimioluminescên-cia aumentada é tornada visível sobre um filme de raio X.

Análise de citometria de fluxo: TRAIL e FasL Expression foramtestados com o auxílio de um corante fluorescente intracelular com anticor-pos ligados. Células A549 foram infectadas com o vírus cepaA/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (MOI = 5) durante 8 horas, na presença de 2 μΜde monensina, para evitar a secreção de proteína. Como resultado, as célu-las foram fixadas com paraformaldeído a 4% a 4°C durante 20 min e, então,lavadas com tampão de permeabilidade (0,1% de saponina/1% deFBS/PBS). Então, ocorreu a incubação com os anticorpos primários contraTRAIL, FasL ou um isótopo de teste (anticorpos da Becton Dickinson). A se-guir, as células foram tingidas com IgG de cabra anticamundongo conjugadaBiotina-Sp (Dianova) e estreptavidina-Cy-cromo (Becton Dickinson). A fluo-rescência foi medida no canal FL3 de um citômetro de fluxo FACScaIibur(Becton Dickinson).

Infecção e tratamento de camundongos: camundongos C57B1/6de 10 semanas de idade (criação própria, FLI, Tübingen) foram introduzidospara infecção e tratamento. O tratamento com aproximadamente 2 mL deuma diluição a ImM de MG132 (Sigma) foi realizado uma vez ao dia pormeio de administração de aerossol em uma gaiola de inalação, começandouma hora antes da infecção intranasal com 5 χ 103 a 104 unidades infeccio-sas formadoras de placas (ufp) do vírus cepa A/FPV/Bratislava/79 (H7N7). Anebulização da solução de MG132 foi realizada por meio de um Sistema Mi-nivent para camundongos (Hugo Sachs Electronics - Harvard Apparatus)combinado com um nebulizador (Hugo Sachs Electronics - Harvard Appara-tus).

Legenda das Figuras

Figura 1: Tratamento por aerossol de camundongos Balb/c com inibidor deproteossomo

Progresso da temperatura (A) e da atividade (B) de camundon-gos que foram tratados 3 vezes ao dia com o inibidor de proteossomo (ver-melho) ou com o solvente (preto). Os gráficos mostram o valor médio damedição de 6 animais. No total, foram anotadas 288 medições (a cada 5 mi-nutos).

Figura 2: Inibidores de proteossomo bloqueiam eficientemente a replicaçãodo vírus da influenzaCélulas A549 (2 χ 106) (A, Β) ou células MDCK (4 χ 106) (C) fo-ram pré-incubadas durante 1 h com as concentrações indicadas dos inibido-res de proteossomo particulares. Depois da pré-incubação, as células foraminfectadas com o vírus da influenza aviária A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (mul-tiplicidade da infecção, MOI = 0,01). Após 8, 24 ou 36 h, os meios restantesforam coletados, e os títulos de vírus foram determinados com o auxílio doensaio em placa com células MDCK.

Figura 3: Concentrações de ação antiviral dos inibidores de proteossomonão são tóxicas para células MDCK no período de tempo observado até 24 h(A, B, C) Células MDCK (2 χ 106) foram tratadas com as concen-trações indicadas dos inibidores de proteossomo. Como teste de toxicidade,as células MDCK foram tratadas com a substância Iiberadora de apoptoseestaurosporina (0,3 μΜ) (linhas grossas pretas no diagrama). Após 16 ou 24h, as células aderentes, assim como as células do restente são coletadas etingidas com 50 μg/mL de iodeto de propídio. A análise foi realizada com oauxílio de citometria de fluxo (BD FACScan). A figura mostra a porcentagemde células vivas em comparação com o teste não tratado.

Figura 4: Inibidores de proteossomo não estão em posição de evitar a de-gradação de IkBoc induzida por TNFa nas concentrações de ação antiviralCélulas A549 (2 χ 106) (A, B) ou células MDCK (4 χ 106) (C, D)foram pré-incubadas durante 1 h com as concentrações indicadas dos inibi-dores de proteossomo. Depois da pré-incubação, as células foram estimula-das durante 15 min com 20 ng/mL de TNFa recombinante e lisadas. O Iisadofoi separado com o auxílio da eletroforese em gel SDS e transferido parauma membrana de nitrocelulose. A degradação de ΙκΒα foi detectada com oauxílio de um soro de coelho específico para ΙκΒα (Santa Cruz Biotechnolo-gies).

Figura 5: MG132 bloqueia a replicação de vírus da influenza. Células A549foram infectadas com FPV (MOI = 1) na presença de MG132 (10 μΜ). 24 hp.i., os restantes foram coletados, e os títulos de vírus descendentes deter-minados por meio de ensaio em placa.

Figura 6: MG132 bloqueia a indução induzida por vírus de TRAIL e FasL.Α549 com FPV (MOI = 1) infecta e incubada com MG132 (10 μΜ). 24 h p.i.,as células foram fixadas com paraformaldeído a 4%, e tingidas com anti-TRAIL e anti-CD95L.

Figura 7: Efeito antiviral de MG132 em camundongos infectados. Camun-dongos C57B1/6 foram infectados com FPV (104 ufp, intranasal), foram tra-tados com MG132 (n = 8) (linha cheia) por inalação na gaiola ou não recebe-ram tratamento (n = 14) (linha tracejada). Para o tratamento em gaiola, osanimais foram tratados com um aerossol de 2 mL de MG132 a 1 mM (Sig-ma) durante 5 dias. O tratamento foi realizado diariamente e começou umahora antes da infecção inicial para 5. Para o teste, o peso dos animais foideterminado diariamente. São mostradas as curvas de sobrevivência doscamundongos infectados com FPV e tratados com MG132 e não tratados.

Lista de Abreviações

<table>table see original document page 30</column></row><table>zLLL tripeptidaldeído N-carbobenzoxil-L-leucinil-L-leucinil-L-leucinalBibliografia

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Claims (25)

1. Fármacos para o tratamento de infecções com ortomixovirida-e, caracterizados pelo fato de que contêm pelo menos um inibidor de prote-ossomo e/ou pelo menos um inibidor da via da ubiquitina proteossomo(UPS) como ingredientes ativos em preparações farmacêuticas.

2. Fármacos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadospelo fato de que contêm inibidores do proteossomo e/ou de ubiquitina Iiga-ses e/ou ubiquitina hidrolases como inibidores do UPS.

3. Fármacos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteriza-dos pelo fato de que possuem alta especificidade pelo proteossomo 26S deuma célula hospedeira.

4. Fármacos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteriza-dos pelo fato de que interagem exclusivamente com o grupo hidroxila-treonina cataliticamente ativo da subunidade beta do proteossomo 26S ebloqueiam especificamente apenas o proteossomo.

5. Fármacos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteriza-dos pelo fato de que, após aceitação pela célula, bloqueiam seletivamenteatividades enzimáticas individuais do proteossomo 26S e, além disso, blo-queiam seletivamente formas de montagem específicas do proteossomo, depreferência o imunoproteossomo.

6. Fármacos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteriza-dos pelo fato de que bloqueiam as atividades das enzimas de conjugação deubiquitina e/ou de hidrólise de ubiquitina.

7. Uso do fármaco como definido em qualquer uma das reivindi-cações de 1 a 6 para a produção de fármacos antivirais e/ou preparaçõesfarmacêuticas com um efeito antiviral, caracterizado pelo fato de que levama uma:a) indução da apoptose em células infectadas por influenza e,dessa forma, à morte preferida de células infectadas no organismo; eb) a interrupção da liberação e produção de partículas virais in-fecciosas por inibição da montagem e maturação de vírus da influenza.

8. Uso dos fármacos como definidos em qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 6 para o tratamento de infecções com vírus da influenza.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, para:-9.1. tratar de infecções virais;-9.2. influenciar, impedir, regular ou bloquear a via da ubiquiti-na/proteossomo na célula-alvo;-9.3. prevenir o surto de infecções virais no organismo;-9.4. impedir a liberação, matuação e replicação de vírus da influ-enza;-9.5. induzir a apoptose de células infectadas pelo vírus da influ-enza.

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a-9, caracterizado pelo fato de que a liberação, matuação e replicação de vírusda influenza é impedida.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a-9, para combater/tratar gripe e doenças relacionadas, particularmente surtospandêmicos e endêmicos de influenza em animais e seres humanos.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, em combinação comoutros medicamentos antivirais já conhecidos como, por exemplo, ripavarina,interleucinas, análogos de nucleosídeos, inibidores de protease, bloqueado-res de quinase viral, fusão de membrana e bloqueadores da entrada de ví-rus, particularmente bloqueadores do componente do vírus da influenza co-mo, por exemplo, a neuraminidases ou a proteína IAV de canal de íons M2.

13. Uso, de acordo com as reivindicações 11 e 12, para prevenirum surto de doença e para reduzir a dissminação de infecção em organis-mos de seres humanos e animais agudamente infectados com vírus de in-fluenza.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13,para bloquear a via da ubiquitina/proteossomo em células-alvo particulares,em que as células-alvo são células hospedeiras atacadas por vírus da influ-enza.

15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a-14, para influenciar células-alvo em seus mecanismos celulares: divisão ce-lular, ciclo celular, diferenciação celular, morte celular (apoptose), ativaçãocelular, transdução de sinal ou processamento de antígeno, particularmenteativação de NF-KB.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 7, para produzir fárma-cos que impeçam a liberação, maturação e replicação de vírus da influenza,caracterizado pelo fato de que contém pelo menos um inibidor de proteos-somo e/ou pelo menos um inibidor de ubiquitina Iigases e/ou ubiquitina hidro-Iases como ingredientes ativos em uma preparação farmacêutica.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, para tratar infecçõesgripais, caracterizado pelo fato de que as substâncias são introduzidas comoinibidores do proteossomo que são absorvidos como inibidores do proteos-somo de células de eucariotos superiores e, após absorção pela célula, en-tram em interação com as subunidades catalíticas do proteossomo e, dessaforma, bloqueiam de maneira irreversível ou reversível todas ou algumas dasatividades proteolíticas do proteossomo - as atividades tripsina, quimiotripsi-na e de hidrólise de peptídio pós-glutamila - dentro do complexo de proteos-somo 26S ou também 20S.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizadopelo fato de que as preparações farmacêuticas contêm outros fármacos jun-tamente com inibidores do proteossomo, fármacos que influenciam, regulamou impedem o sistema de ubiquitina celular, como as atividades:-18.1. das enzimas de conjugação de ubiquitina; e/ou-18.2. das enzimas de hidrólise de ubiquitina;-18.3. de fatores celulares que interajam com ubiquitina;-18.4. de fatores celulares que interajam com ubiquitina, como:-18.4.1. monoubiquitina; ou como-18.4.2. poliubiquitina.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 16 ou 18, caracterizadopelo fato de que as substâncias são postas em uso como inibidores do pro-teossomo que são administrados in vivo por via oral em forma de cápsula,com ou sem alterações portadoras de especificidade para células, intraveno-sa, intramuscular, subcutânea ou por inalação em forma de aerossol, ouque, de outra forma, por causa do uso de uma apliação e/ou regime de doseparticulares, não dêem origem a efeitos colaterais, ou apenas insignificantes,e tenham uma meia-vida metabólica relativamente alta e uma taxa de depu-ração relativamente baixa no organismo.

20. Uso, de acordo com as reivindicações 16 a 19, caracterizadopelo fato de que substâncias que:a) sejam isoladas em forma natural de microorganismos ou ou-tras fontes naturais; oub) surjam por modificação química de substâncias naturais;c) sejam produzidas de maneira totalmente sintética;d) sejam sintetizadas por métodos terapêuticos genéticos in vivo;e) sejam produzidas por métodos de engenharia genética in vi-tro; ouf) em microorganismos;são introduzidas como substâncias inibidoras do proteossomo.

21. Uso, de acordo com as reivindicações 16 a 20, caracterizadopelo fato de que substâncias que pertencem às seguintes classes de subs-tâncias:a) inibidores de proteossomo de ocorrência natural:- derivados peptídicos que contenham estruturas epoxicetona Cterminais;- derivados de β-lactona;- aclacinomicina A (também chamada de aclarrubicina);- lactacistina e suas variantes quimicamente modificadas, comoas variantes de penetração em membrana celular "clastolactocisteína β-lactona";b) inibidores de proteossomo produzidos sinteticamente:- aldeídos peptídicos modificados, como N-carbobenzóxi-L-leucinil-L-leucinil-L-leucinal (também chamado de MG132 ou zLLL), seu de-rivado de ácido bórico MG232; N-carbobenzóxi-Leu-Leu-Nva-H (chamado deMG115); N-acetil-L-leuzinil-L-leuzinil-L-norleuzinal (chamado de LLnL); N-carbobenzóxi-lle-Glu(OBut)-Ala-carbobenzóxi-lle-Glu(OBut)-Ala-Leu-H (tam-bém chamado de PSI);c) peptídios portadores de uma estrutura α,β-epoxicetona C terminal, tam-bém vinil sulfonas como:c1) carbobenzóxi-L-leucinil-L-leucinil-L-leucin-vinil-sulfona; ouc2) 4-hidróxi-5-iodo-3-nitrofenilacetil-L-leucinil-L-leucinil-L-leucin-vinil-sulfona(NLVS);d) resíduos de glioxal ou ácido bórico, como:d1) pirazil-CONH(CHPhe)CONH(CHisobutil)B(OH)2); assim como:d2) derivados de dipeptidil-ácido bórico; oue) pinacol-éster, como benzi!oxicarbonil(Cbz)-Leu-Leu-boroLeu-pinacol-éster;são introduzidos como substâncias inibidoras de proteossomo.

22. Uso, de acordo com as reivindicações 16 a 21, caracterizadopelo fato de que as epoxicetonas:-22.1. epoxomicina (epoxomicina fórmula molecular: C28H86N4O7);e/ou-22.2. eponemicina (eponemicina fórmula molecular:C20H36N2O5);são introduzidas como inibidores de proteossomo particularmente adequa-dos.

23. Uso, de acordo com as reivindicações 11 a 17, caracterizadopelo fato de que os compostos:-23.1. PS-519, como o derivado β-lactona, assim como lactacisti-na do composto 1R-[1S, 4R, 5S]]-1-(1-hidróxi-2-metilpropil)-4-propil-6-oxa-2-azabiciclo [3.2.0] heptano-3,7-diona - fórmula molecular Ci2HioNO4;-23.2. PS-303 (NH2(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)2); e/ou-23.3. PS-321 (morfolina-CONH-(CH-naftil)-CONH-(CH-fenilalanina)-B(OH)2); e/ou-23.4. PS-334 (CH3-NH-(CH-naftil-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)2);e/ou-23.5. o composto PS-325 (2-quinol-CONH-(CH-homo-fenilalanina)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)2); e/ou-23.6. PS-352 (fenilalanina-CH2-CH2-CONH-(CH-fenilalanina)-CONH-(CH-ISobutiI)-B(OH)2); e/ou-23.7. PS-383 (piridil-CONH-(CHpF-fenilalanina)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)2);são introduzidos como inibidores de proteossomo particularmente adequa-dos da série PS.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 16, como um fármacopara influenciar as atividades enzimáticas do complexo de proteossomo 26Scompleto e a estrutura de proteossomo cataliticamente ativo 20S não mon-tada com subunidades reguladoras.

25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a-24, para uma administração sistêmica e tópica, de preferência por via aérea,de inibidores de UPS.