ES2273046T3

ES2273046T3 - Pirrolopirazoles de quinolinilo.

Info

Publication number: ES2273046T3
Application number: ES03768531T
Authority: ES
Inventors: Douglas Wade Beight; Jason Scott Sawyer; Jonathan Michael Yingling
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2002-11-22
Filing date: 2003-11-10
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2023-11-10
Also published as: PT1565471E; HRP20050436B1; NO331403B1; US20060040983A1; UA80571C2; CR7830A; EA200500859A1; PL227840B1; EA008387B1; IL168190A; EP1565471A1; ZA200503121B; DE60308893T2; CY1106283T1; NO20053045L; CA2501322A1; AU2003291643B2; WO2004048382A1; US20080027102A1; KR20050083945A

Abstract

Un compuesto según la fórmula II (Ver fórmula) y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Description

Pirrolopirazoles de quinolinilo.

La invención se refiere a nuevos compuestos de quinolinil-pirazol y su uso como agentes farmacéuticos, en particular su uso como inhibidores de la transducción de señal del TGF-beta.

Antecedentes de la invención

Los polipéptidos del factor transformante de crecimiento beta (TGF-beta) influyen sobre el crecimiento, la diferenciación y la expresión génica en muchos tipos de células. El primer polipéptido de esta familia caracterizado, TGF-\beta1, posee do subunidades de 112 aminoácidos idénticas que están covalentemente unidas. El TGF-\beta1 es una proteína altamente conservada que se distingue en humanos y ratones por una única diferencia de un aminoácido. Existen otros dos miembros de la familia génica del TGF-\beta que se expresan en mamíferos. El TGF-\beta2 presenta una homología del 71% con el TGF-\beta1 (de Martin y col. (1987) EMBO j. 6: 3673-3677), mientras que el TGF-\beta3 presenta una homología del 80% con el TGF-\beta1 (Derynck y col. (1988) EMBO J 7: 3737-3743). Las características estructurales del TGF-\beta1 determinadas por resonancia magnética nuclear (Archer y col. (1993) Biochemistry 32: 1164-1171) concuerdan con la estructura cristalina del TGF-\beta2 (Daopin, y col. (1992) Science 257: 369-374; Schlunegger y Grutter (1992) Nature 358: 430-434).

Existen al menos tres receptores extracelulares de TGF-\beta diferentes, los tipo I, II y III, que están implicados en las funciones biológicas de los factores TGF-\beta1, TGF-\beta2 y TGF-\beta3 (para revisiones, véase Derynck (1994) TIBS 19: 548-553 y Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol. 6: 597-641). Los receptores de tipo I y de tipo II son serina/treonina cinasas transmembranales, que en presencia de TGF-\beta forman un complejo heteromérico señalizador (Wrana, y col. (1992) Cell 71: 1003-1014).

El mecanismo de activación del complejo heteromérico señalizador en la superficie celular se ha aclarado (Wrana, y col. (1994) Nature 370: 341-347). En primer lugar, el TGF-\beta se une al receptor de tipo II que es una serina/treonina quinasa transmembranal constitutivamente activa. Posteriormente, el receptor de tipo I se introduce en el complejo, se fosforila en el dominio GS y se activa para fosforilar en dirección 3’ los componentes de la señalización (p. ej., las proteínas SMAD) para iniciar la cascada de señalización intracelular. Se ha mostrado que un receptor de tipo I constitutivamente activo (mutante T204D) transluce de forma eficaz las respuestas del TGF-\beta, por tanto evita el requerimiento del TGF-\beta y del receptor de tipo II (Wieser y col., (1995) EMBO J 14: 2199-2208). Aunque no se ha descubierto ninguna función de señalización para el receptor de tipo III, incrementa la afinidad del TGF-\beta2 por el receptor de tipo II, convirtiéndolo en esencialmente equipolente con el TGF-\beta1 y el TGF-\beta3 (López-Casillas y col. (1993) Cell 73: 1435-1444).

Las células endoteliales vasculares carecen del receptor de tipo III. En su lugar, las células endoteliales expresan una proteína estructuralmente relacionada denominada endoglina (Cheifetz, y col. (1992) J. Biol. Chem. 267: 19027-19030), que sólo se une al TGF-\beta1 y al TGF-\beta3 con afinidad elevada. Por tanto, la potencia relativa de los TGF-\beta refleja el tipo de receptores que se expresan en una célula y un sistema orgánico. Además de la regulación de los componentes en la ruta de señalización multifactorial, la distribución de la síntesis de los polipéptidos de TGF-\beta también afecta a la función fisiológica. La distribución del TGF-\beta2 y el TGF-\beta3 es más limitada (Derynck y col. (1988) EMBO J 7: 3737-3743) que la del TGF-\beta1, por ejemplo el TGF-\beta3 está limitado a los tejidos de origen mesenquimatoso, mientras que el TGF-\beta1 está presente en los tejidos tanto de origen mesenquimatoso como epitelial.

El TGF-\beta1 es una citocina multifuncional crucial para la reparación tisular. Los gránulos de las plaquetas liberan concentraciones elevadas de TGF-\beta1 en el sitio de la lesión (Assoian y Sport (1986) J. Cell Biol. 102: 1217-1223). El TGF-\beta1 inicia una serie de acontecimientos que estimulan la cicatrización, incluida la quimiotaxis de células tales como leucocitos, monocitos y fibroblastos, y la regulación de los factores de crecimiento y las citocinas implicadas en la angiogénesis, la división celular asociada con la reparación tisular y las respuestas inflamatorias. El TGF-\beta1 también estimula la síntesis de componentes de la matriz extracelular (Roberts, y col. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4167-4171; Sport y col. (1983) Science 219: 1329-1330; Massague (1987) Cell 49: 437-438) y, más importante, para entender la fisiopatología del TGF-\beta1, el TGF-\beta1 autorregula su propia síntesis (Kim y col. (1989) J. Biol. Chem. 264: 7041-7045).

Los compuestos descritos en el presente documento también pueden exhibir otra actividad cinasa, tal como inhibición de cinasa p38 y/o inhibición de cinasa KDR (VEGFR2). En la técnica se conocen los ensayos para determinar dicha actividad cinasa y un experto en la materia sería capaz de analizar los compuestos descritos para detectar tal actividad.

\newpage

Sumario de la invención

La invención descrita también se refiere al compuesto seleccionado de Fórmula II:

1

Fórmula II

2-(6-metil-piridin-2-il)-3-[6-amido-quinolin-4-il)-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol

y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

El compuesto anterior se describe genéricamente y se reivindica en la solicitud de patente PCT PCT/US02/11884, presentada el 13 de mayo de 2002, que reivindica prioridad sobre la solicitud de patente de EE.UU. U.S.S.N 60/293, 464, presentada el 24 de mayo de 2001. y que se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia. El compuesto anterior se ha seleccionado por tener un perfil de toxicología sorprendentemente superior al de los compuestos específicamente descritos en la solicitud mencionada antes.

Descripción detallada de la invención

El término "cantidad eficaz", como se usa en "una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I", por ejemplo, se refiere a una cantidad de un compuesto de la presente invención que es capaz de inhibir el TGF-beta.

El término \muM se refiere a micromolar.

Los términos químicos generales usados en la presente memoria descriptiva se usan en todos los esquemas y ejemplos de síntesis:

DMF se refiere a dimetilformamida

THF se refiere a tetrahidrofurano

Ms se refiere a mesilo, que es metilsulfonilo

THP se refiere a tetrahidropirano.

Los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva se pueden preparar de acuerdo con los siguientes ejemplos y esquemas. Los ejemplos no deben entenderse de ningún modo como limitantes de ninguna forma del modo en que se pueden hacer los compuestos.

El esquema siguiente ilustra la preparación del compuesto de Fórmula I.

\newpage

Esquema I

2

Fórmula I

\vskip1.000000\baselineskip

El esquema siguiente ilustra la preparación del compuesto de Fórmula II.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Esquema pasa a página siguiente)

\newpage

Esquema II

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

Los ejemplos siguientes ilustran la preparación de los compuestos de esta invención como se muestra de forma esquemática en los Esquemas I y II.

Ejemplo 1 Preparación de 7-(2-morfolin-4-il-etoxi)-4-(2-piridin-2-il-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol-3-il)-quinolina A. Preparación de 4-(2-piridin-2-il-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol-3-il)-7-[2-(tetrahidropiran-2-iloxi)etoxi]quinolina

Calentar 4-(2-piridin-2-il-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol-3-il)-quinolin-7-ol (376 mg, 1,146 mmol), carbonato de cesio (826 mg, 2,54 mmol) y 2-(2-bromoetoxi)tetrahidro-2H-pirano (380 \mul, 2,52 mmol) en DMF (5 ml) a 120ºC durante 4 horas. Inactivar la reacción con cloruro de sodio saturado y después extraer con cloroformo. Secar la capa orgánica sobre sulfato de sodio y concentrar al vacío. Purificar la mezcla de reacción en columna de gel de sílice eluyendo con diclorometano a metanol al 10% en diclorometano para dar el compuesto intermedio deseado del subtítulo en forma deas un aceite de color amarillo (424 mg, 81%). EM ES^{+} m/e 457,0 (M + 1).

B. Preparación de 2-[4-(2-piridin-2-il-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol-3-il)-quinolin-7-iloxi]-etanol

Calentar una solución de 4-(2-piridin-2-il-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol-3-il)-7-[2-tetrahidropiran-2-iloxi)etoxi]quinolina (421 mg, 0,92 mmol) en ácido acético:tetrahidrofurano:agua (4:2:1) (20 ml). Eliminar el disolvente al vacío y recuperar el residuo con cloroformo:isopropilo (3:1). Lavar la capa orgánica con bicarbonato sódico saturado y secar sobre sulfato sódico. Concentrar al vacío. El residuo será lo bastante puro para la siguiente etapa en el esquema (425 mg, 100%). EM ES^{+} m/e 373,1 (M + 1).

C. Preparación de éster 2-[4-(2-piridin-2-il-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol-3-il)-quinolin-7-iloxi]-etílico de ácido metanosulfónico

Agitar una solución de 2-[4-(2-piridin-2-il-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol-3-il)-quinolin-7-iloxi]-etanol (293 mg, 0,78 mmol) y cloruro de metano sulfonilo (68 \mul, 0,81 ml) en piridina seca (5 ml) durante 2 horas). Eliminar la piridina al vacío y recuperar el residuo con cloroformo. Lavar la capa orgánica con bicarbonato sódico saturado y secar sobre sulfato sódico, para dar el compuesto intermedio deseado del subtítulo en forma de espuma blanca (425 mg, 100%). EM ES^{+} m/e 451,1 (M + 1).

D. Preparación de 7-(2-morfolin-4-il-etoxi)-4-(2-piridin-2-il-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol-3-il)-quinolina

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

Calentar el éster 2-[4-(2-piridin-2-il-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol-3-il)-quinolin-7-iloxi]-etílico de ácido metanosulfónico (87 mg, 0,19 mmol) con morfolina (1 ml) a 50ºC durante 4 horas. Eliminar la morfolina al vacío y extraer después el producto con alcohol isopropílico:cloroformo (1:3). Lavar la capa orgánica con cloruro sódico y secar sobre sulfato sódico. Concentrar al vacío para dar el producto del título deseado en forma de un sólido de color amarillo claro (83 mg, 100%). EM ES^{+} m/e 442,0 (M + 1).

Ejemplo 2 Preparación de 2-(6-metil-piridin-2-il)-3-[6-amido-quinolin-4-il)-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol A. Preparación de 6-bromo-4-metil-quinolina

Agitar una solución de 4-bromo-fenilamina (1 eq.) en 1,4-dioxano y enfriar hasta aproximadamente 12ºC. Lentamente añadir ácido sulfúrico (2 eq.) y calentar a reflujo. Añadir metilvinil cetona (1,5 eq.) gota a gota en la solución en reflujo. Calentar la solución durante 1 hora una vez que la adición se ha completado. Evaporar la solución de la reacción hasta sequedad y disolver en cloruro de metileno. Ajustar la solución a pH 8 con carbonato de sodio 1M y extraer tres veces con agua. Someter el residuo a cromatografía en SiO_{2} (70/30 hexano/acetato de etilo) para obtener el compuesto intermedio deseado del subtítulo. EM ES^{+} m/e 158,2 (M + 1).

B. Preparación de éster metílico de ácido 6-metil-piridina-2-carboxílico

Suspender ácido -metil-piridina-2-carboxílico (10 g, 72,9 mmol) en cloruro de metileno (200 ml). Enfriar hasta 0ºC. Añadir metanol (10 ml), 4-dimetilaminopiridina (11,6 g, 94,8 mmol) y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) (18,2 G, 94,8 mmol). Agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 6 horas, lavar con agua y salmuera y secar sobre sulfato sódico. Filtrar la mezcla y concentrar al vacío. Someter el residuo a cromatografía en SiO_{2} (50% de acetato de etilo/hexanos) para obtener el compuesto intermedio deseado del subtítulo, 9,66 g (92%) en forma de un líquido incoloro.

RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,93-7,88 (m, 1H), 7,75-7,7 (m, 1H), 7,35-7,3 (m, 1H), 4,00 (s, 3H), 2,60 (s, 3H).

C. Preparación de 2-(6-bromo-quinolin-4-il)-1-6-(6-metil-piridin-2-il)-etanona

Disolver 6-bromo-4-metil-quinolina (38,5 g, 153 mmol) en 600 ml de THF seco. Enfriar hasta -70ºC y tratar con la adición gota a gota de hexametildisilizano potásico 0,5 M (KN(SiMe_{3})_{2} (400 ml, 200 mmol) en 2 horas manteniendo la temperatura por debajo de -65ºC. Agitar la solución resultante a -70ºC durante 1 hora y añadir una solución de éster metílico de ácido 6-metilpiridina-2-carboxílico (27,2, 180 mmol) en 100 ml de THF gota a gota durante 15 minutos. Durante la adición, la mezcla pasará de rojo oscuro a verde guisante y formará un precipitado. Agitar la mezcla a -70ºC durante 2 horas, después dejar calentar a temperatura ambiente con agitación durante 5 horas. Enfriar la mezcla, después inactivar con HCl 12N hasta pH= 1. Elevar el pH a 9 con carbonato potásico sólido. Decantar la solución de los sólidos y extraer dos veces con 200 ml de acetato de etilo. Combinar los extractos orgánicos, lavar con agua y secar sobre carbonato potásico. Agitar los sólidos en 200 ml de agua y 200 ml de acetato de etilo, tratar después con carbonato potásico adicional. Separar la porción orgánica y secar con los extracto de acetato de etilo anteriores. Concentrar la solución al vacío hasta obtener un aceite oscuro. Pasar el aceite a través de un tapón de sílice de 300 ml con cloruro de metileno, después acetato de etilo. Combinar las fracciones adecuadas y concentrar al vacío para dar un aceite de color ámbar. Aclarar el aceite por los lados del matraz con cloruro de metileno, después diluir con hexano agitando el matraz para dar 38,5 g (73,8%) del compuesto intermedio deseado del subtítulo en forma de un sólido amarillo.

EM ES+= 341 (M + 1).

D. Preparación de 1-[2-(6-bromo-quinolin-4-il)-1-(6-metil-piridin-2-il)-etilidenamino]-pirrolidin-2-ona

Agitar una mezcla de 2-(6-bromo-quinolin-4-il)-1-(6-metil-piridin-2-il)-etanona (38,5 g, 113 mmol) y clorhidrato de 1-aminopirrolidinona (20 g, 147 mmol) en 115 ml de piridina a temperatura ambiente durante 10 horas. Añadir aproximadamente 50 g de filtros inactivados de 4 A. Continuar agitando 13 horas más y añadir 10-15 g de sílice y filtrar la mezcla a través de un tapón de sílice de 50 g. Eluir el tapón de sílice con 3 l de acetato de etilo. Combinar los filtrados y concentrar al vacío. Recolectar el precipitado de hidrazona mediante filtración y secar mediante succión para obtener 33,3 g (69,7%) del compuesto intermedio deseado del subtítulo en forma de un sólido
blancuzco.

EM ES+= 423 (M + 1).

E. Preparación de 6-bromo-4-[-2-(6-metil-piridin-2-il)-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol-3-il]-quinolina

A una mezcla de carbonato de cesio (1,2 eq.) y 1-[2-(6-bromo-quinolin-4il)-1-(6-metil-piridin-2-il)-etilidenamino]-pirrolidin-2-ona (33,3 g, 78,8 mmol) añadir 300 ml de N,N-dimetilformamida seca. Agitar la mezcla 20 horas a 100ºC. LA mezcla puede volverse oscura durante la reacción. Eliminar la N,N-dimetilformamida al vacío. Repartir el residuo entre agua y cloruro de metileno. Extraer la porción acuosa con cloruro de metileno adicional. Filtrar las soluciones orgánicas a través de un tapón de sílice de 300 ml, eluyendo con 1,5 l de cloruro de metileno, 1,5 l de acetato de etilo y 1,5 l de acetona. Combinar las fracciones adecuadas y concentrar al vacío. Recoger el precipitado resultante mediante filtración para dar 22,7 g (71,2%) del compuesto intermedio deseado del subtítulo en forma de un sólido de color blancuzco.

EM ES+= 405 (M + 1).

F. Preparación de éster metílico de ácido 4-[-2-(6-metil-piridin-2-il)-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol-3-il]-quinolina-6-carboxílico

Añadir 6-bromo-4-[-2-(6-metil-piridin-2-il)-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol-3-il]-quinolina (22,7 g, 45 mmol) a una mezcla de acetato de sodio (19 g, 230 mmol) y el catalizador paladio [1,1’-bis(difenilfosfino)ferrocen]dicloropaladio (II), en complejo con diclorometano (1:1) (850 mg, 1,04 mmol) en 130 ml de metanol. Colocar la mezcla de una atmósfera de monóxido de carbono de 344,735 KPa y agitar mientras se caliente hasta 90ºC durante 1 hora y con carga constante de monóxido de carbono adicional. Dejar enfriar la mezcla durante 8 horas, recargar de nuevo con monóxido de carbono y calentar hasta 90ºC. La presión se puede elevar hasta aproximadamente 517,102 KPa. La reacción se completa en aproximadamente una hora cuando la presión es estable y el tlc (1:1 de tiluelo/acetona) no muestra restos de bromuro. Se reparte la mezcla entre cloruro de metileno (600 ml) y agua (1 l). Extraer la porción acuosa con una porción adicional de cloruro de metileno (400 ml). Filtrar la solución orgánica a través de un tapón de sílice de 300 ml y lavar con 500 ml de cloruro de metileno, 1200 ml de acetato de etilo y 1500 ml de acetona. Desechar la porción de acetona. Combinar las fracciones adecuadas y concentrar para dar 18,8 g (87,4%) de compuesto intermedio deseado del subtítulo en forma de un polvo de color rosa.

EM ES+= 385 (M + 1).

G. Preparación de 2-(6-metil-piridin-2-il)-3-[6-amido-quinolin-4-il)-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol

\vskip1.000000\baselineskip

5

Calentar una mezcla de éster metílico de ácido 4-[-2-(6-metil-piridin-2-il)-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol-3-il]-quinolina-6-carboxílico en 60 ml de amoniaco 7N en metanol hasta 90ºC en un vaso a presión de acero inoxidable durante 66 horas. La presión se elevará hasta aproximadamente 551,576 KPa. Mantener la presión durante la reacción. Enfriar el vaso y concentrar la mezcla marrón al vacío. Purificar el sólido residual en dos cartuchos Redi-Pak de 12 g acoplados en serie eluyendo con acetona. Combinar las fracciones adecuadas y concentrar al vacío. Suspender el sólido resultante casi blanco en cloruro de metileno, diluir con hexano y filtrar. El sólido de color blancuzco recogido da 1,104 g (63,8%) del producto deseado del título.

EM ES+= 370 (M + 1).

Los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva se analizaron mediante los siguientes protocolos para detectar la inhibición de TGF-\beta, como se describe a continuación en la descripción del protocolo.

Reacciones de purificación del receptor I del TGF-\beta y cinasa in vitro

Para los receptores de tipo I del TGF-\beta (RIT204d):

El dominio cinasa citoplasmático 6X-HIS marcado de cada receptor se expresó y purificó en lisados de células de insectos Sf9 y se describen brevemente a continuación:

Tras 48-72 horas de infección los sedimentos celulares se lisaron en tampón de lisis (TL: Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, NaF 50 mM, NP40 al 0,5% con \beta-mercaptoetanol 20 mM recién añadido, imidazol 10 mM, PMSF 1 mM, 1X Inhibidor de proteasa completo sin EDTA (Boehringer Mannheim).

Los lisados celulares se clarificaron mediante centrifugación y se filtraron a 0,45 \mum antes de la purificación mediante cromatografía de afinidad con Ni/NTA (Qiagen).

Protocolo de la cromatografía

Equilibrar con 10 CV de TL, cargar la muestra, lavar con 10 CV de tampón RIPA (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, NP40 al 1%, EDTA 1 mM, desoxicolato sódico al 0,25%, \beta-mercaptoetanol 20 mM recién añadido, PMSF 1 mM), lavar con 10CV de TL, lavar con 10CV de 1X KB (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 4 mM, NaF 1 mM, \beta-mercaptoetanol 20 mM ), eluir con un gradiente lineal de 1X KB con imidazol 200 mM.

Ambas enzimas fueron de una pureza de aproximadamente un 90% y presentaban actividad de autofosforilación.

Reacciones: enzima 170-200 nM en 1X KB, series de dilución del compuesto en 1X KB/DMSO al 16% (concentración final de 20 \muM a 1 nM con DMSO a una concentración final del 4%), las reacciones comenzaron mediante la adición de una mezcla de ATP (ATP 4 \muM/concentraciones finales \muCi^{33}P-\gamma-ATP) en 1X KB.

Las reacciones se incubaron a 30ºC durante 1 hora. Las reacciones se detuvieron y cuantificaron usando precipitación estándar con TCA/BSA en placas con filtro de fibra de vidrio Millipore FB y mediante recuento en centelleo líquido en un MicroBeta JET.

Los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva inhiben el dominio cinasa del receptor de TGF-\beta de tipo I (RIT204D) con valores de CI50 < 20 \muM, mientras que exhiben menos toxicidad in vivo que los compuestos de estructura relacionada, como se describe en la solicitud de patente PCT PCT/US02/11884 que se ha identificado anteriormente.

Entre los trastornos "caracterizados por una mayor actividad del TGF-\beta " se incluyen aquellos en los que la síntesis de TGF-\beta está estimulada de forma que hay TGF-\beta a niveles mayores o en los que la proteína TGF-\beta latente está indeseablemente activada o se ha convertido en proteína TGF-\beta activa o en los que se ha producido una regulación por incremento de los receptores de TGF-\beta o en los que la proteína TGF-\beta muestra una mayor unión a células o a la matriz extracelular en la localización de la enfermedad. Por tanto, en cualquiera de los casos "mayor actividad" se refiere a cual-
quier trastorno en el que la actividad biológica del TGF-\beta esté indeseablemente elevada, con independencia de la causa.

Numerosas enfermedades se han asociado con la sobreproducción de TGF-\beta1. Los inhibidores de la ruta de señalización intracelular del TGF-\beta son tratamientos útiles para las enfermedades fibroproliferativas. Específicamente, las enfermedades fibroproliferativas incluyen trastornos renales asociados con una falta de regulación de la actividad del TGF-\beta y fibrosis excesiva, incluidas glomerulonefritis (GN), tales como GN proliferativa mesangial, GN inmunitaria y GN creciente. Otros trastornos renales incluyen nefropatía diabética, fibrosis intersticial renal, fibrosis renal en pacientes de trasplante que reciben ciclosporina, y nefropatía asociada con el VIH. Entre las enfermedades vasculares del colágeno se incluyen esclerosis sistémica progresiva, polimiositis, esclerodermia, dermatomiositis, fascitis eosinofílica, morfea o aquéllas asociadas con la aparición del síndrome de Raynaud. Entre las fibrosis pulmonares resultantes de un exceso de actividad del TGF-\beta se incluyen el síndrome de dificultad respiratoria del adulto, la fibrosis pulmonar idiomática y la fibrosis pulmonar intersticial a menudo asociada con trastornos autoinmunitarios, tales como lupus eritematoso sistémico y esclerodermia, contacto químico o alergias. Otra enfermedad autoinmunitaria asociada con características fibroproliferativas es la artritis reumatoide.

Entre las enfermedades oculares asociadas con un trastorno fibroproliferativo se incluyen la cirugía de reinserción de la retina que acompaña a la vitreoretinopatía proliferativa, la extracción de cataratas con implantación intraocular del cristalino y la cirugía de drenaje posglaucoma, se asocian con la sobreproducción de TGF-\beta1.

Las enfermedades fibróticas asociadas con la sobreproducción de TGF-\beta se pueden dividir en trastornos crónicos tales como fibrosis renal, pulmonar y hepática, y trastornos más agudos como la cicatrización dérmica y la reestenosis (Chamberlain, J. Cardiovascular Drug Reviews, 19(4):329-344). La síntesis y secreción de TGF-\beta1 por células tumorales también puede conducir a supresión inmunológica como la que se observa en pacientes con tumores cerebrales o mamarios agresivos (Arteaga y col. (1993) J. Clin. Invest. 92: 2569-2576). El TGF-\beta1 altera de forma drástica la evolución de la infección por Leishmania en ratones. (Barral-Netto y col. (1992) Science 257: 545-547). El TGF-\beta1 exacerbó la enfermedad, mientras que los anticuerpos frente al TGF-\beta1 detuvieron la progresión de la enfermedad en ratones genéticamente susceptibles. Los ratones genéticamente resistentes se convirtieron en susceptibles a la infección por Leishmania tras la administración de TGF-\beta1.

Los profundos efectos del TGF-\beta1 sobre el depósito de la matriz extracelular se han revisado (Rocco y Ziyadeh (1991) en Contemporary Issues in Nephrology v. 23, Hormones, autocoids and the kidney. Ed. Jay Stein, Churchill Livingston, Nueva York pág. 391-410; Roberts y col., (1988) Rec. Prog. Hormone Res. 44: 157-197) e incluyen la estimulación de la síntesis y la inhibición de la degradación de los componentes de la matriz extracelular Dado que la estructura y las propiedades de filtración del glomérulo están en gran medida determinadas por la composición de la matriz extracelular del mesangio y la membrana glomerular, no es sorprendente que el TGF-\beta1 posea profundos efectos sobre el riñón. La acumulación de matriz mesangial en la glomerulonefritis proliferativa (Border y col., (1990) Kidney Int. 37: 689-695) y la nefropatía diabética (Mauer y col. (1984) J. Clin. Invest. 74: 1143-1155) son características patológicas claras y dominantes de las enfermedades. Los niveles de TGF-\beta1 están elevados en la glomeruloesclerosis diabética humana (neuropatía avanzada) (Yamamoto y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1814-1818). El TGF-\beta1 es un mediador importante en la génesis de fibrosis renal en una serie de modelos animales (Phan y col., (1990) Kidney Int. 37: 426; Okuda y col. (1990) J. Clin. Invest. 86: 453). La supresión de glomerulonefritis inducida experimentalmente en ratas se ha demostrado mediante antisuero contra el TGF-\beta1 (Border y col. (1990) Nature 346: 371) y mediante una proteína de la matriz extracelular, decorina, que se puede unir al TGF-\beta1 (Border y col. (1992) Nature 360: 361-363).

Demasiado TGF-\beta1 conduce a la formación de tejido cicatricial dérmico. Se ha mostrado que anticuerpos neutralizantes del TGF-\beta1 inyectados en los márgenes de heridas en cicatrización en ratas inhiben la cicatrización sin interferir con la velocidad de curación de la herida o la resistencia a la fractura de la herida (Shah y col. (1992) Lancet 339: 213-214). Al mismo tiempo se redujo la angiogénesis, se redujo el número de macrófagos y monocitos en la herida y se redujo la cantidad de deposición de fibras de colágeno desorganizadas en el tejido cicatricial.

El TGF-\beta1 puede ser un factor en el engrosamiento progresivo de la pared arterial, que es el resultado de la proliferación de células de músculo liso y la deposición de matriz extracelular en la arteria tras una angioplastia con globo. El diámetro de la arteria reestenosada puede reducirse en un 90% a causa de este engrosamiento y, dado que la reducción del diámetro se debe a la matriz extracelular en vez de a los cuerpos de las células de músculo liso, puede ser posible abrir estos vasos hasta un 50% simplemente reduciendo la extensa deposición de matriz extracelular. En arterias de cerdo no lesionadas sometidas a transfección in vivo con un gen del TFG-\beta1, la expresión del gen de TFG-\beta1 se asoció con síntesis de matriz extracelular e hiperplasia (Nabel y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10759-10763). La hiperplasia inducida por TFG-\beta1 no fue tan extensa como la inducida con PDGF-BB, pero la matriz extracelular fue más extensa con los transfectantes con TFG-\beta1. En este modelo de cerdos de transferencia de genes ninguna deposición de matriz extracelular se asoció con hiperplasia inducida por FGF-1 (una forma secretada de FGF) (Nabel (1993) Nature 362: 844-846).

Existen varios tipos de cáncer en los que el TFG-\beta1 producido por el tumor puede ser perjudicial. Las células de cáncer de próstata en ratas MATLyLy (Steiner y Barrack (1992) Mol. Endocrinol 6: 15-25) y células de cáncer de mama humano MCF-7 (Arteaga y col., (1993) Cell Growth and Differ. 4: 193-201) se convirtieron en más tumorigénicas y metastásicas tras la transfección con un vector que expresa el TFG-\beta1 de ratón. El TFG-\beta1 se ha asociado con angiogénesis, metástasis y mal pronóstico en cáncer de próstata humano y gástrico en estado avanzado (Wikstrom, P., y col. (1998) Prostate 37: 19-29; Saito, H. y col. (1999) Cancer 86: 1455-1462). En el cáncer de mama, el mal pronóstico se asocia con niveles elevados de TFG-\beta (Dickson y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 837-841; Kasid y col. (1987) Cancer Res. 47: 5733-5738; Daly y col. (1990) J. Cell Biochem. 43: 199-211; Barrett-Lee, y col. (1990) Br. J Cancer 61: 612-617; King y col. (1989) J. Steroid Biochem. 34: 133-138; Welch y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 7678-7682; Walter y col. (1992) Eur. J. Cancer 238: 641-644) e inducción de TFG-\beta1 por tratamiento con tamoxifeno (Butta y col. (1992) Cancer Res. 52: 4261-4264) se ha asociado con fallo del tratamiento con tamoxifeno para el cáncer de mama (Thompson y col. (1991) Br. J. Cancer 63: 609-614). Los anticuerpos anti TFG-\beta1 inhiben el crecimiento de células de cáncer de mama humano MDA-231 en ratones atímicos (Arteaga y col. (1993) J. Clin. Invest. 92: 2569-2576), un tratamiento que se correlaciona con un incremento en la actividad de las células asesinas naturales en el bazo. Las células CHO sometidas a transfección con TFG-\beta1 latente también mostraron una menor actividad NK y un incremento del crecimiento tumoral en ratones desnudos (Wallick y col. (1990) J. Exp. Med. 172: 1777-1784). Por tanto, el TFG-\beta secretado por los tumores mamarios puede causar una inmunosupresión endocrina. Se ha mostrado que concentraciones de TFG-\beta1 elevadas en plasma indican pero pronóstico para los pacientes de cáncer de mama avanzado (Anscher y col. (1993) N. Engl. J. Med. 328: 1592-1598). Los pacientes con niveles circulantes de TFG-\beta elevados antes de quimioterapia a dosis elevadas y trasplante antólogo de médula ósea se encuentran en riesgo alto de enfermedad venooclusiva hepática (15-50% de todos los pacientes con una tasa de mortalidad de hasta un 50%) y neumonitis intersticial idiomática (40-50% de todos los pacientes). LA implicación de estos hallazgos es 1) que los niveles elevados en plasma de TFG-\beta1 se pueden usar para identificar pacientes en riesgo y 2) que la reducción de TFG-\beta1 podría disminuir la morbididad y la mortalidad de estos tratamientos habituales para los pacientes de cáncer de mama.

Muchas células malignas secretan factor transformante de crecimiento-\beta (TFG-\beta), un potente inmunosupresor, lo que sugiere que la producción de TFG-\beta puede representar un mecanismo de escape del tumor significativo de la inmunovigilancia del huésped. El establecimiento de una subpoblación leucocitaria con alteración en la señalización del TFG-\beta en el huésped portador del tumor ofrece un posible medio para inmunoterapia d el cáncer. Un modelo animal transgénico con alteración de la señalización del TFG-\beta es capaz de erradicar un tumor linfoma que sobreexpresa TFG-\beta normalmente letal, EL4 (Gorelik y Flavell, (2001) Nature Medicine 7(10): 111-1122). La regulación por disminución de la secreción de TFG-\beta en las células tumorales tiene como resultado el restablecimiento de la inmunogenicidad en el huésped, mientras que la insensibilidad de las células T al TFG-\beta tiene como resultado una diferenciación acelerada y autoinmunidad, elementos de los cuales se pueden requerir con el fin de combatir los tumores de expresión de autoantígenos en un huésped tolerizado. Los efectos de la inmunosupresión de TFG-\beta también han sido implicados en una subpoblación de pacientes con VIH con una respuesta inmunitaria menor a la predicha según los recuentos de células T CD4/CD8 (Garba y col. J. Immunology (2002) 168: 2247-2254). Un anticuerpo neutralizante del TFG-\beta fue capaz de invertir el efecto en cultivo, lo que indica que los inhibidores de la señalización del TFG-\beta pueden tener utilidad en la inversión de la supresión inmunitaria presente en esta subpoblación de pacientes
con VIH.

Durante las primeras etapas de la carcinogénesis, el TFG-\beta puede actuar como un potente supresor tumoral y puede mediar en las acciones de algunos agentes de quimioprevención. Sin embargo, en algún punto durante el desarrollo y la progresión de neoplasias malignas, las células tumorales parecen escapar de la inhibición del crecimiento dependiente de TFG-\beta en paralelo con la aparición de TFG-\beta bioactivo en el microambiente. Los papeles dobles de supresión tumoral/estimulación tumoral del TFG-\beta se han aclarado con más claridad en un sistema transgénico de sobreexpresión de TFG-\beta en queratinocitos. Mientras que los transgénicos eran más resistentes a la formación de lesiones cutáneas benignas, el índice de conversión metastásica en los transgénicos aumentó de forma drástica (Cui y col. (1996) Cell 86(4): 531-42). La producción de TFG-\beta1 por las células malignas en tumores primarios parece aumentar con el avance de las etapas de la progresión del tumor. Los estudios en muchos de los principales cánceres epiteliales sugieren que la mayor producción de TFG-\beta por los cánceres humanos se produce como un acontecimiento relativamente tardío durante la progresión del tumor. Además este TFG-\beta asociado con el tumor proporciona a las células tumorales una ventaja selectiva y estimula la progresión del tumor. Los efectos del TFG-\beta sobre las interacciones célula/célula y célula/estroma tienen como resultado una mayor propensión a la invasión y metástasis. El TFG-\beta asociado con el tumor puede permitir que las células tumorales escapen de la vigilancia del sistema inmunitario, ya que es un potente inhibidor de la expansión clonal de los linfocitos activados. También se ha mostrado que el TFG-\beta inhibe la producción de angiostatina. Las modalidades terapéuticas del cáncer, como la radioterapia y la quimioterapia, inducen la producción de TFG-\beta activado en el tumor, seleccionando de este modo el sobrecrecimiento de células malignas resistentes a los efectos inhibidores del crecimiento del TFG-\beta. Por tanto, estos tratamientos anticancerosos incrementan el riesgo y detienen el desarrollo de tumores con mayor crecimiento y capacidad de invasión. En esta situación, los agentes dirigidos a la transducción de la señal mediada por TFG-\beta podrían ser una estrategia terapéutica muy eficaz. Se ha mostrado que la resistencia de las células tumorales al TFG-\beta anula muchos de los efectos citotóxicos de la radioterapia y la quimioterapia, y la activación dependiente del tratamiento del TFG-\beta en el estroma puede incluso ser perjudicial ya que puede convertir al microambiente en más conductor de la progresión tumoral y contribuir al daño tisular y producir fibrosis. Es probable que el desarrollo de inhibidores de la transducción de la señal del TFG-\beta beneficie el tratamiento del cáncer en progreso solo y en combinación con otros tratamientos.

Los compuestos son útiles para el tratamiento de cáncer y otros estados de enfermedad influidos por el TFG-\beta mediante la inhibición del TFG-\beta en un paciente que lo necesite, mediante la administración de dicho(s) compuesto(s) a dicho paciente. El TFG-\beta también sería útil contra enfermedades de aterosclerosis (T. A. McCaffrey: TFG-\betas y TFG-\beta receptors in Atherosclerosis: Cytokine and Growth Factor Review 2000, 11, 103-114) and Alzheimer's (Masliah, E.; Ho, G.; Wyss-Coray, T.: Functional Role of TFG-\beta in Alzheimer's Disease Microvascular Injury: Lessons from Transgenic Mice: Neurochemistry Internacional 2001, 39, 393-400).

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones de la presente invención son cantidades terapéuticamente eficaces de antagonistas de TFG-\beta, como se ha indicado anteriormente. La composición puede formularse con excipientes, diluyentes o transportadores habituales, y comprimirse en comprimidos, o elixires o soluciones formuladas para administración orla conveniente o administrados mediante vías intravenosas intramusculares. Los compuestos se pueden administrar por vía transdérmica y pueden formularse en formas farmacéuticas de liberación sostenida y similares.

Los antagonistas de TFG-\beta se formulan en formulaciones que pueden administrarse por las vías oral y rectal, tópicamente, parenteralmente, por ejemplo mediante inyección y mediante infusión intraarterial continua o discontinua, en forma de, por ejemplo, comprimidos, pastillas, comprimidos sublinguales, sellos, obleas, elixires, geles suspensiones, aerosoles, ungüentos, por ejemplo que contengan de 1 a 10% en peso del compuesto activo en una base adecuada, cápsulas de gelatina blandas y duras, supositorios, soluciones inyectables y suspensiones en medios fisiológicamente aceptables, y polvos en envase estéril adsorbidos en un material de soporte para preparar soluciones inyectables. De forma ventajosa para este propósito, las composiciones pueden proporcionarse en forma de unidad de dosificación, preferentemente cada unidad de dosificación contiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg (de aproximadamente 5 a 50 mg en el caso de la administración parenteral o por inhalación, o de aproximadamente 25 a 500 mg en el caso de la administración oral o rectal) de los compuestos. Las dosificaciones de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 300 mg/kg al día, preferentemente de 0,5 a 20 mg/kg de ingrediente activo se pueden administrar aunque, por supuesto, se entenderá fácilmente que la cantidad del compuesto a administrar en realidad será determinado por un médico, a la luz de todas las circunstancias relevantes , incluida la afección a tratar, la elección del compuesto que se va administrar y la elección de la vía de administración y, por tanto, el intervalo de dosificación preferido indicado antes no está destinado a limitar el alcance de la presente invención de ningún modo.

Las formulaciones útiles para su administración por separado de los antagonistas de TFG-\beta consistirá normalmente en al menos un compuesto seleccionado de los compuestos que se especifican en la presente memoria descriptiva mezclados con un vehículo, o diluidos por un vehículo, o incluidos o encapsulados por un transportador que se puede ingerir en forma de una cápsula, un sello, una oblea, papel u otro encase, o mediante un envase desechable como una ampolla. Un vehículo o diluyente puede ser un material sólido, semisólido o líquido que sirve como vehículo, excipiente o medio apara la sustancia terapéutica activa. Algunos ejemplos de los diluyentes o vehículos que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención son lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, propilenglicol, parafina líquida, parafina blanda blanca, caolín, dióxido de silicio ahumado, celulosa microcristalina, silicato de calcio, sílice, polivinilpirrolidona, alcohol cetoestearílico, almidón, almidones modificados, goma arábiga, fosfato cálcico, manteca de cacao, ésteres etoxilados, aceite de teobroma, aceite de cacahuete, alginatos, goma tragacanto, gelatina, jarabe, metilcelulosa, monolaurato de sorbitán polioxietileno, lactato de etilo, hidroxibenzoato de metilo y propilo, trioleato de sorbitán, sesquioleato de sorbitán y alcohol oleílico, y propelentes tales como tricloromonofluorometano, dicloromonofluorometano y diclorotetrafluoroetano. En el caso de los comprimidos, se puede incorporar un lubricante para evitar que los ingredientes en polvo se peguen o se fijen en los colorantes o en el perforador de la máquina de formación de comprimidos. Para tal fin se puede emplear, por ejemplo, estearatos de aluminio, magnesio o calcio, talco o aceite mineral.

Las formas farmacéuticas preferidas de la presente invención son cápsulas, comprimidos, supositorios, soluciones inyectables, cremas y ungüentos. Especialmente preferidas son las formulaciones para inhalación, tales como un aerosol. para inyección y para ingestión oral.

Claims

1. Un compuesto según la fórmula II

6

Fórmula II

\vskip1.000000\baselineskip

y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

2. El compuesto que es 2-(6-metil-piridin-2-il)-3-[6-amido-quinolin-4-il)-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-b]pirazol y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

3. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 1 o la sal farmacéuticamente aceptables del mismo junto con un diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. Un compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para usar en un procedimiento de tratamiento en el cuerpo humano o animal.

5. Uso de un compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.