ES2273376T3 - Formulaciones de vacunas recombinantes frente a papilomas. - Google Patents
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A UNAS COMBINACIONES DE VACUNAS QUE COMPRENDEN PROTEINAS PRECOCES (E) Y TARDIAS (L) RECOMBINADAS DEL PAPILOMAVIRUS, ASI COMO MANANO OXIDADO. ESTA INVENCION SE REFIERE A UNOS PROCEDIMIENTOS DE FABRICACION Y DE USO DE DICHAS FORMULACIONES.
Description
Formulaciones de vacunas recombinantes frente a
papilomavirus.
Se proporcionan formulaciones vacunales que
comprenden proteínas recombinantes tempranas (T) y tardías (T) de
papilomavirus y manano oxidado así como procedimientos para fabricar
y usar las formulaciones.
La presente invención identifica una nueva
tecnología que puede ser útil para provocar respuestas inmunitarias
humorales y mediadas por células frente a un antígeno proteico
candidato para el desarrollo de vacunas.
El hidróxido de aluminio normalmente provoca
potentes respuestas de anticuerpos frente al antígeno candidato y
pocas, si algunas, respuestas inmunitarias mediadas por células.
Apostolopoulos y col. demostraron la inducción
de fuertes respuestas inmunitarias mediadas por células al antígeno
mucina 1 (MUC 1) en ratones cuando los animales fueron inmunizados
con el antígeno MUC1 conjugado con manano oxidado
(oxo-manano). Estos estudios se describen en las
siguientes referencias: i) Production of
anti-peptide specific antibody in mice following
immunization hit peptides conjugated to mannan. Okawa. Y, Howard. C.
R. y Steward. M. W. 1992, J immunol. Methods 149:
127-131. Department of clinical sciences, London
School of Higiene and Tropical Medicine, London, RU; ii)
Apostolopoulos, V., Pietersz. G. A., Loveland, B. E., Sandrin, M.
S., y McKenzie, I. F. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:
10128-10132. The Austin Research Institute, Studly
Road, Heidelberg 3084, Victoria, Australia; y iii) Apostolopoulos,
V., Loveland, B. E., Pietersz G. A. y McKenzie. I. F. 1995, J
Immunol. 155: 5089-5094. The Austin Research
Institute, Studly Road, Heidelberg 3084, Victoria, Australia. Sin
embargo, la utilidad de oxo-manano como adyuvante o
inmunomodulador en el desarrollo de vacunas frente a agentes
infecciosos no se ha evaluado.
Es probable que los antígenos conjugados con
manano oxidado o reducido provoquen fuertes respuestas inmunitarias
mediadas por células y humorales frente al antígeno candidato. Se ha
usado alumbre como adyuvante que provoca buenas respuestas
inmunitarias humorales y pocas, si algunas, respuestas inmunitarias
mediadas por células.
Sería útil desarrollar vacunas contra
papilomavirus humano que puedan requerir un adyuvante capaz de
provocar respuestas tanto humorales como mediadas por células frente
a antígenos de papilomavirus. En este informe, los autores describen
la utilidad del oxo-manano a la hora de provocar
respuestas inmunitarias protectoras frente a agentes infecciosos en
un modelo de papilomavirus de conejo de cola de algodón.
Los virus del papiloma humano (HPV) son virus
sin cubierta, de ADN bicatenario, de los que se han identificado más
de 75 tipos. La infección con HPV puede tener como resultado el
desarrollo de condilomas genitales y neoplasia cervical, y puede
asociarse con hasta un 90% de los carcinomas cervicales. Los virus
del papiloma son especies específicas en relación con la infección
productora y la infección por HPV en animales no produce la
enfermedad. Esto necesita que se realicen las pruebas preliminares
de vacunas candidatas en modelos de papilomavirus en animales. El
papilomavirus del conejo de cola de algodón (CRPV) fue el primer
papilomavirus identificado y también el primer virus de ADN asociado
con el cáncer. L1 es el principal componente de la cápside del virus
y la expresión de L1 en baculovirus o levaduras tiene como resultado
la formación de partículas similares a virus (VLP). La inmunización
de animales con VLP con la principal proteína de la cápside (L1)
tiene como resultado la generación de anticuerpos neutralizantes que
reconocen epítopos conformacionales formados cuando las proteínas de
la cápside viral se ensamblan en VLP o viriones. Aunque la
vacunación con VLP solo es eficaz contra la provocación mediante
CRPV infeccioso, no tiene efectos en la contención de la infección
preexistente.
En este estudio, los autores evaluaron la
utilidad del manano oxidado como transportador para el desarrollo de
la vacuna e inmunoterapia. Los autores han conjugado manano oxidado
con antígenos de proteínas tempranas del CRPV (proteínas E)
expresados en E. coli y evaluaron su eficacia en la
contención de la infección preexistente.
Las infecciones por papilomavirus se producen en
una variedad de animales, incluidos seres humanos, ovejas, perros,
gatos, conejos, monos, serpientes y vacas. Los papilomavirus
infectan células epiteliales, en general inducen tumores
epiteliales o fibroepiteliales benignos en el punto de la infección.
Los papilomavirus son agentes infecciosos específicos de especie; un
papilomavirus humano no puede infectar a un animal no humano.
Los papilomavirus pueden clasificarse en grupos
distintos según el huésped que infectan. Los papilomavirus humanos
(HPV) se clasifican además en más de 70 tipos según la homología de
la secuencia de ADN (para una revisión, véase Papillomaviruses and
Human Cancer, H. Pfister (ed.), CRC Press, Inc., 1990). Los tipos de
papilomavirus parecen ser inmunógenos específicos de tipo en cuanto
a que una inmunidad neutralizante frente a la infección con un tipo
de papilomavirus no confiere inmunidad contra otro tipo de
papilomavirus.
En seres humanos, diferentes tipos de HPV causan
distintas enfermedades. Los tipos de HPV 1, 2, 3, 4, 7, 10 y
26-29 producen verrugas benignas en individuos tanto
normales como inmunocomprometidos. Los tipos de HPV 5, 8, 9, 12, 14,
15, 17, 19-25, 36 y 46-50 causan
lesiones planas en individuos inmunocomprometidos. Los tipo de HPV
6, 11, 34, 39, 41-44 y 51-55
producen condilomas no malignos de la mucosa genital o respiratoria.
Los tipos de HPV 16 y 18 producen displasia epitelial de la mucosa
genital y están asociados con la mayoría de los carcinomas
invasivos e in situ del cuello uterino, la vagina, la vulva y
el canal anal. HPV6 y HPV11 son los agentes acusantes de más del 90%
de todos los condilomas (verrugas genitales) y papilomas laríngeos.
El subtipo más abundante del tipo HPV6 es el HPV6a.
Los estudios inmunológicos en animales han
mostrado que la producción de anticuerpos neutralizantes frente a
los antígenos de papilomavirus previene la infección con los virus
homólogos. El desarrollo de vacunas eficaces frente a papilomavirus
se ha retrasado por dificultades asociadas con el cultivo de
papilomavirus in vitro. El desarrollo de una vacuna eficaz
frente a HPV se ha retrasado particularmente por la ausencia de un
modelo animal adecuado.
La neutralización de papilomavirus por
anticuerpos parece ser específica de tipo y depende de los epítopos
conformacionales de la superficie del virus.
Los papilomavirus son virus pequeños
(50-60 nm), si cubierta, icosahédricos y de ADN, que
codifican hasta ocho genes tempranos y dos tardíos. Los marcos de
lectura abiertos (ORF) de los genomas de los virus se denominan E1 a
E7 y L1 y L2, donde "E" indica temprano y "L" indica
tardío. L1 y L'' codifican las proteínas de la cápside de los virus.
Los genes tempranos E están asociados con funciones tales como la
replicación viral y la transformación celular.
La proteína L1 es la principal proteína de la
cápside y posee un peso molecular de 55-60 kDa. La
proteína L2 es una proteína minoritaria de la cápside que posee un
peso molecular previsto de 55-60 kDa y un peso
molecular aparente de 75-100 kDa determinado
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Los datos
inmunológicos sugieren que la mayoría, pero no toda la proteína L'',
es interna de la proteína L1. Las proteínas L2 están altamente
conservadas entre los diferentes papilomavirus, en especial los 10
aminoácidos básicos en el C terminal. El ORF de L1 está altamente
conservado entre diferentes papilomavirus.
Los genes L1 y L2 se han usado para generar
vacunas para la prevención de infecciones por papilomavirus en
animales. Zhou y col. (1991; 1992) clonaron los genes L1 y L2 del
HPV tipo 16 en un vector de virus vacunal e infectaron células de
mamífero CV-1 con el vector recombinante para
producir partículas similares a virus (VLP). Se han generado L1 y
L'' de papilomavirus bovino recombinantes derivados de bacterias. Se
produjo una reacción cruzada a niveles bajos entre sueros
neutralizantes frente a las proteínas bacterianas recombinantes y
virus nativos, posiblemente debido a diferencias en las
conformaciones de las proteínas nativas y derivadas de
bacterias.
Se han usado baculovirus recombinantes que
expresan ORF de L1 de HPV6, L1 de HPV11, L1 de HPV 16, L1 de HPV18,
L1 de HPV31 o L2 de HPV16 para infectar células SF9 de insecto y
producir proteínas L1 y L2. Los análisis de transferencia Western
mostraron que las proteínas L1 y L2 derivadas de baculovirus
reaccionaron con anticuerpos frente a HPV16. La L1 derivada de
baculovirus forma VLP.
Carter y col., (1991) demostraron la producción
de proteínas L1 de HPV16 y L2 de HPV16 por cepas recombinantes de
Saccharomyces cerevisiae. Carter y col. también demostraron
la producción de proteínas L1 y L2 de HPV6b. La proteína L1 de HPV6b
no era la proteína L1 de HPV6b de longitud completa. Las proteínas
recombinantes se produjeron como productos intracelulares así como
secretados. Las proteínas L1 y L2 recombinantes fueron de pesos
moleculares similares a las proteínas nativas. Cuando las proteínas
se expresaron intracelularmente, se encontró que la mayoría de la
proteína era insoluble cuando las células se lisaron en ausencia de
reactivos desnaturalizantes. Aunque esta inso-
lubilidad puede facilitar la purificación de la proteína, puede dificultar el análisis de los epítopos nativos de la proteína.
lubilidad puede facilitar la purificación de la proteína, puede dificultar el análisis de los epítopos nativos de la proteína.
El documento
EP-A-0659768 (The Austin Research
Institute) describe un conjugado entre un antígeno y un polímero de
hidratos de carbono, específicamente manano oxidado y MUC1. El
conjugado específico indujo una respuesta mediada por célula, pero
exhibió poca inmunidad humoral.
Se mostró que las proteínas recombinantes
secretadas por levaduras contenían hidratos de carbono derivados de
levaduras. La presencia de estos oligosacáridos unidos a N puede
enmascarar los epítopos nativos. Además, las proteínas recombinantes
secretadas pueden contener otras modificaciones, tales como
retención de la secuencia líder secretora.
Sería útil desarrollar procedimientos para
producir grandes cantidades de proteínas de papilomavirus de
cualquier especie y tipo mediante cultivo de levaduras
recombinantes. También sería útil producir grandes cantidades de
proteínas de papilomavirus que posean propiedades que confieren
inmunidad de las proteínas nativas, tal como la conformación de la
proteína nativa.
La presente invención está dirigida a proteínas
de papilomavirus recombinantes que poseen las propiedades de
conferir inmunidad de las proteínas de papilomavirus nativas así
como procedimientos para su producción y uso. La presente invención
está dirigida a la producción de una vacuna profiláctica y
terapéutica para la infección por papilomavirus. Las proteínas
tardías recombinantes de la presente invención son capaces de formar
partículas similares a virus. Estas VLP son inmunogénicas e impiden
la formación de verrugas en un modelo animal. Además, las proteínas
E recombinantes se producen en E. coli y estas proteínas se
presentan de forma que provocan una respuesta inmunitaria medicada
por células. La presente invención usar el papilomavirus de conejo
de cola de algodón (CRPV) y el HPV tipo 6 (subtipo 6a) como sistemas
modelo.
Se proporcionan formulaciones vacunales que
comprenden proteínas recombinantes y tardías (E) ADDUCTED con manano
oxidado y proteínas tardías (L) de papilomavirus y manano oxidado
así como procedimientos para fabricar y usar las formulaciones.
Las figuras muestran que la infección por CRPV
tuvo como resultado el desarrollo de verrugas en todos los puntos de
la provocación en animales control. El desarrollo de papilomas se
inhibió en > 90% en 3/3 animales del grupo de 4 animales
inmunizados con VLP en combinación con proteínas E conjugadas con
manano oxidado. Por el contrario, sólo 3/5 animales del grupo 2,
inmunizados con mezcla de VLP + proteína E en RIBI y 2/4 animales
del grupo 2 inmunizados con mezcla de VLP +
oxo-manano-proteína E en RIBI
mostraron una inhibición >90% del desarrollo de papilomas. Los
resultados sugieren que la inmunización de conejos con un cóctel de
proteína E conjugada con manano oxidado en combinación con VLP con
L1/L2 causa una inhibición significativa del desarrollo de verrugas
de células infectadas por CRPV.
Figura 1. La inmunización de conejos con un
cóctel de proteína E en combinación con VLP con L1/L2 inhibe el
desarrollo de papilomas inducidos por CRPV.
Figura 2. La comparación de la formulación en
CRPV indujo desarrollo de papiloma.
La presente invención proporciona el uso de una
mezcla que comprende L1 o L2 de papilomavirus recombinantes o
partículas similares a virus de L1 y L2 y proteínas E recombinantes
de papilomavirus, donde las proteínas están conjugadas a manano
oxidado, en la fabricación de un medicamento capaz de provocar
respuestas humorales y mediadas por células frente a antígenos de
papilomavirus en un animal y, de este modo, prevenir la infección de
dicho animal por papilomavirus.
También se proporciona una composición
inmunogénica que comprende L1 o L2 de papilomavirus recombinantes y
partículas similares a virus de L1 y L2 y proteínas E recombinantes
de papilomavirus donde las proteínas están conjugadas a manano
oxidado, en la fabricación de un medicamento capaz de provocar
respuestas humorales y mediadas por células frente a antígenos de
papilomavirus en un animal.
Además se proporciona una vacuna que comprende
L1 o L2 de papilomavirus recombinantes y partículas similares a
virus de L1 y L2 y proteínas E recombinantes de papilomavirus donde
las proteínas están conjugadas a manano oxidado, en la fabricación
de un medicamento capaz de provocar respuestas humorales y mediadas
por células frente a antígenos de papilomavirus en un animal.
La presente invención identifica una nueva
tecnología que puede ser útil para provocar respuestas inmunitarias
humorales y mediadas por células frente a un antígeno proteico
candidato para el desarrollo de vacunas.
El hidróxido de aluminio normalmente provoca
potentes respuestas de anticuerpos frente al antígeno candidato y
pocas, si algunas, respuestas inmunitarias mediadas por células.
Apostolopoulos y col. demostraron la inducción
de fuertes respuestas inmunitarias mediadas por células al antígeno
mucina 1 (MUC 1) en ratones cuando los animales fueron inmunizados
con el antígeno MUC1 conjugado con manano oxidado
(oxo-manano). Sin embargo, la utilidad de
oxo-manano como adyuvante o inmunomodulador en el
desarrollo de vacunas frente a agentes infecciosos no se ha
evaluado.
Es probable que los antígenos conjugados con
manano oxidado o reducido provoquen fuertes respuestas inmunitarias
mediadas por células y humorales frente al antígeno candidato. Se ha
usado alumbre como adyuvante que provoca buenas respuestas
inmunitarias humorales y pocas, si algunas, respuestas inmunitarias
mediadas por células.
Una vacuna contra papilomavirus humano que pueda
requerir un adyuvante capaz de provocar respuestas tanto humorales
como mediadas por células frente a antígenos de papilomavirus. En
este informe, los autores describen la utilidad del
oxo-manano a la hora de provocar respuestas
inmunitarias protectoras frente a agentes infecciosos en un modelo
de papilomavirus de conejo de cola de algodón
En este estudio, los autores evaluaron la
utilidad del manano oxidado como transportador para el desarrollo de
la vacuna e inmunoterapia, los autores han conjugado manano oxidado
con antígenos de proteínas tempranas del CRPV (proteínas E)
expresados en E. coli y evaluaron su eficacia en la
contención de la infección preexistente.
Se proporcionan métodos, composiciones y
procedimientos para la prevención, caracterización, detección y
tratamiento de la infección por papilomavirus (PV). Los
procedimientos se basan en la producción de proteínas L1
recombinantes o L2 recombinantes o L1 y L2 recombinantes en
levaduras. Las proteínas recombinantes son capaces se simular los
epítopos neutralizantes conformaciones de PV nativo. Las proteínas
recombinantes L1 o L1 y L2 también pueden ser capaces de formar
partículas similares a virus (VLP). Las composiciones de la
invención incluyen, entre otras, moléculas de ADN recombinante que
codifican las proteínas L1 o L2 o L1 y L2, las proteínas
recombinantes bien solas o en combinación con otras proteínas
recombinantes, VLP compuestas por al menos una proteína
recombinante, fragmentos de las proteínas recombinantes,
composiciones farmacéuticas que comprenden la proteínas
recombinantes, composiciones vacunales que comprenden las proteínas
recombinantes, anticuerpos frente a las proteínas recombinantes o
VLP, composiciones inmunogénicas que comprenden al menos una
proteína recombinante y kit diagnósticos que comprenden las
moléculas de ADN recombinante o las proteínas recombinantes. Los
procedimientos de la presente invención incluyen, entre otros, el
procedimiento de producir una proteína recombinante que comprende la
transformación de una células huésped de levadura adecuada con una
molécula de ADN recombinante, cultivando la levadura transformada en
condiciones que permitan la expresión del ADN que codifica la
proteína recombinante, y purificando la proteína recombinante. Los
procedimientos de la presente invención también incluyen la
administración de la proteína recombinante, las composiciones de
proteínas recombinantes o VLP a un animal, incluidos, entre otros,
los seres humanos. Las células huésped adecuadas se incluyen, entre
otras, cepas de levaduras de los géneros Saccharomyces, Pichia,
Kluyvermyces, Schizosaccharomyces y Hansenula.
Los estudios inmunológicos en animales han
mostrado que la producción de anticuerpos neutralizantes frente a
proteínas de la cápside de papilomavirus previene la infección con
los virus homólogos. El desarrollo de vacunas eficaces frente a
papilomavirus se ha retrasado por dificultades asociadas con el
cultivo de papilomavirus in vitro. El desarrollo de una
vacuna eficaz frente a HPV se ha retrasado particularmente por la
ausencia de un modelo animal adecuado.
La neutralización de papilomavirus por
anticuerpos parece ser específica de tipo y depende de los epítopos
conformacionales de la superficie del virus.
Se pueden formular composiciones
farmacéuticamente útiles que comprenden las proteínas o VLP de
acuerdo con procedimientos conocidos, tales como la mezcla de un
transportador farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de tales
transportadores y procedimientos de formulación se pueden encontrara
en Remington's Pharmaceutical Sciences. Para formar una composición
farmacéuticamente aceptable adecuada para administración eficaz,
tales composiciones contendrán una cantidad eficaz de la proteína o
VLP. Tales composiciones pueden contener proteínas o VLP derivadas
de más de un tipo de HPV.
Composiciones terapéuticas o diagnósticas de la
invención se administran a un individuo en cantidades suficientes
para tratar o diagnosticar infecciones de PV. La cantidad eficaz
puede variar de acuerdo con una variedad de factores tales como el
estado del individuo, el peso, el sexo y la edad. Entre otros
factores se incluyen el modo de administración. En general, las
composiciones se administrarán en dosis que varían de
aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 250 \mug.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
proporcionar al individuo mediante una variedad de vías tales como
subcutánea, tópica, oral, mucosa e intramuscular.
Las vacunas de la invención comprenden proteínas
recombinantes o VLP que contienen los determinantes antigénicos
necesarios para inducir la formación de anticuerpos neutralizantes
en el huésped. Tales vacunas también son lo bastante seguras como
para administrase sin peligro de infección clínica; no producen
efectos secundarios; se pueden administrar por una vía eficaz; son
estables; y son compatibles con los transportadores de la
vacuna.
Las vacunas pueden administrarse por una
variedad de vías, tales como oralmente, parenteralmente,
subcutáneamente, mucosalmente o intramuscularmente. La dosis
administrada puede variar con el estado, el sexo, el peso y la edad
del individuo; la vía de administración y el tipo PV de la vacuna.
La vacuna puede usarse en formas de dosificación tales como
cápsulas, suspensiones, elixires o soluciones líquidas. La vacuna se
puede formular con un transportador inmunológicamente aceptable.
Las vacunas se administran en cantidades
terapéuticamente eficaces, es decir, en cantidades suficientes como
para generar una respuesta inmunológicamente protectora. La cantidad
terapéuticamente eficaz puede variar de acuerdo con el tipo de PV.
La vacuna se puede administrar en dosis únicas o múltiples.
El uso de la presente invención hace posible la
formulación de vacunas subvirales para prevenir la infección por PV.
Usando los procedimientos, se pueden fabricar vacunas de PV
monovalentes o multivalentes. Por ejemplo, una vacuna monovalente
frente al HPV de tipo 16 se puede fabricar mediante la formulación
de la proteína recombinante L1 del HPV 16 y la proteína L2 o las
proteínas L1 y L2. Como alternativa, se puede formular una vacuna
multivalente frente a HPV mezclando las proteínas L1 o L2 o L1 y L2
o VLP de diferentes tipos de HPV.
Las proteínas recombinantes y VLP de la presente
invención se pueden usar en la formulación de composiciones
inmunogénicas. Tales composiciones, cuando se introducen en un
huésped adecuado, son capaces de inducir una respuesta inmunológica
en el huésped.
Las proteínas recombinantes y VLP pueden usarse
para generar anticuerpos. El término "anticuerpo" Como se usa
en la presente memoria descriptiva incluye anticuerpos policlonales
y monoclonales, así como fragmentos de los mismos, tales como
fragmentos Fv, Fab y F(ab)2 que son capaces de unirse
al antígeno o hapteno.
Las proteínas recombinantes, VLP y anticuerpos
de la presente invención se pueden usar para determinar el serotipo
de la infección por HPV y la selección de HPV. Las proteínas
recombinantes, VLP y anticuerpos se prestan a la formulación de kit
adecuados para la detección y serotipaje de HPV. Tal kit
comprendería un transportador adecuado para mantener en estrecho
aislamiento al menos un envase. El transportador además comprendería
reactivos tales como proteína de HPV recombinante o VLP o
anticuerpos anti-HPV adecuados para detectar una
variedad de tipos de HPV. El transportador también puede contener
medios para la detección tales como antígeno marcado o sustratos
enzimáticos o similares.
Las proteínas recombinantes y VLP de la presente
invención también son útiles como marcadores de peso molecular y de
tamaño molecular.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
definir más la invención sin, no obstante, limitar la invención a
los casos concretos de estos ejemplos.
Para amplificar los genes de longitud completa
de CRPV E1, E2, E4, E5, E6 y E7 se usaron cebadores de PCR basados
en la secuencia publicada del CRPV (Yaniv, M. y col. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82, 1580-1584, 1985). Para aumentar
la expresión de la proteína E4 de CRPV, los primeros 4 codines de
aminoácidos de la proteína E1 del CRPV se fusionaron con la porción
amino terminal de E4 usando PCR (E1^4). Los marcos de lectura
abiertos de los genes E6 y E7 se fusionaron en el extremo carboxi de
E6 con el amino terminal de E7 usando PCR. Todos los productos
amplificados por PCR se subclonaron en el vector pQE30 (Quiagen,
Inc., San Diego, CA) y se secuenciaron. La expresión de la proteína
deseada se llevó a cabo mediante crecimiento en cultivos de 1 litro
de E. coli SG-1300 expresando las proteínas E
deseadas durante ocho horas a 37ºC en medio LB y después se indujo
durante la noche a 30ºC usando IPTG 1 mM. A continuación, las
células se recogieron mediante centrifugación durante 15 minutos a
5000 rpm, se lavaron con 500 ml de PBS y las proteínas E se
purificaron usando las instrucciones del fabricante (Qiagen,
Inc.).
La pasta de cultivo de E. coli (de 1
litro de medio) se solubilizó en 100 ml de tampón de extracción
(Clorhidrato de guanidina 6,0, imidazol 2 mM y 2
\beta-mercaptoetanol 0,35 mM, fosfato sódico 0,1M
a pH 7,4) a temperatura ambiente durante 30 minutos. La fracción
soluble se aisló mediante centrifugación a 18000 x g durante 30
minutos u se mezcló con 8,0 ml de resina de Ni concentrada
equilibrada con el tampón de extracción. La pasta de resina se rotó
durante 2 horas a temperatura ambiente o 16 horas a 4ºC. Las
proteínas no unidas se eliminaron mediante centrifugación a 200 x g.
La resina se lavó con volúmenes de 4,0 del tampón de extracción y
del tampón A (urea 8,0M, fosfato sódico 0,1M pH 7,4). A temperatura
ambiente. LA resina se resuspendió en tampón A a pH 6,3 y se
transfirió a una columna y se lavó secuencialmente con 4 volúmenes
de tampón B (urea 8,0M, imidazol 10 mM, fosfato sódico 0,1M, pH
6,3), tampón C (urea 8,0 M, imidazol 200 mM, fosfato sódico 0,1 M,
pH 6,3), tampón D (urea 8,0 M, imidazol 500 mM, fosfato sódico, pH
5,7) y, por último, con tampón E (urea 8,0 M, imidazol 1,0 mM,
fosfato sódico 0,1 M, pH 5,7). La proteína purificada eluyeron en
tampón C, D y F. La proteína se cuantificó con ensayos proteicos de
Bradford o BCA y se analizó mediante SDS-PAGE y
transferencia Western. Las proteínas purificadas se dializaron
extensamente con agua desionizada para eliminar la urea antes de la
conjugación u otras formulaciones (Qiagen Inc. Manual).
Para amplificar el gen de longitud completa de
CRPV L1 y el gen de CRPV L2 que tenían los 37 primeros codones (111
pb) delecionados se usaron cebadores de PCR basados en la secuencia
publicada del CRPV (Yaniv, M. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,
1580-1584, 1985). Estos genes se subclonaron en el
vector de 2 casetes pAcUW51 (PharMingen Inc., San Diego, CA) para la
coexpresión en el sistema de expresión de baculovirus o en un vector
de 2 casetes pLS110 (Hofman, K, J y col. J. Virol 209:
506-518, 1995) para expresión en levaduras. El
vector pAcUW51 que contiene los genes que codifican las proteínas L1
y L2 de CRPV1 se transfeccionó en las células SF9 usando el kit de
expresión de PharMingen Baculogold. Los sobrenadantes de esta
transfección se usaron para infectar grandes cultivos (1 litro) de
células SF9 que se cultivaron durante 5 días, las células se
recogieron y las VLP con L1/L2 se purificaron.
El vector Pls110 que contiene los genes que
codifican las proteínas L1 y L2 de CRPV se transformó en levaduras
usando el protocolo de transformación con esferoplastos estándar. Se
identificaron los clones positivos y se cultivaron cultivos a gran
escala. Se cultivaron cultivos de 200 ml de levaduras que expresan
VLP con L1/L2 durante 2 días a 30ºC. A continuación, este cultivo de
200 ml se usó para inocular 1 litro de medio de inducción (2% de
extracto de levadura. 1% de peptona de soja, 1,6% de glucosa, 4% de
galactosa) que se cultivó a 30ºC durante 5 días. Las células se
recolectaron mediante centrifugación y las VLP con L1/L2 se
purificaron.
Las proteínas E de CRPV de E. coli se
purificaron mediante cromatografía de afinidad en columna de Ni y se
sometieron a diálisis extensa contra agua desionizada. Las proteínas
E de CRPV se mezclaron (E1, E2, E6^7 150 \mug de cada uno; 100
\mug de E1^4 y 50 \mug de E5 por dosis) y se liofilizaron. Se
disolvieron 14 mg de manano (purificado de Saccharomyces SIGMA
Chemical Co.) en 1,0 ml de tampón fosfato 0,1M a pH 6,0, se
mezclaron con 20 \mul de peryodato de sodio 0,1M y se incubaron
durante 1h a 4ºC. Se añadió etanodiol (20 \mul) y se incubó
durante otros 30 minutos a 4ºC y la mezcla se pasó a través de una
columna PD-10 equilibrada en tampón bicarbonato a pH
8,0 (Apostolopoulos. V. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:
10128-10132, 1995). El manano oxidado que eluyó en
volumen de vacío se mezcló con mezcla de proteínas E liofilizadas y
se incubó a temperatura ambiente durante la noche y se usó.
Las proteínas E de CRPV de E. coli se
purificaron mediante cromatografía de afinidad en columna de Ni y se
sometieron a diálisis extensa contra agua desionizada. Las proteínas
E de CRPV se mezclaron (E1, E2, E6^7 150 \mug de cada uno; 100
\mug de E1^4 y 50 \mug de E5 por dosis) y se liofilizaron. Se
disolvieron 14 mg de manano (purificado de Saccharomyces SIGMA
Chemical Co.) en 1,0 ml de tampón fosfato 0,1M a pH 6,0, se
mezclaron con 20 \mul de peryodato de sodio 0,1M y se incubaron
durante 1h a 4ºC. Se añadió etanodiol (20 \mul) y se incubó
durante otros 30 minutos a 4ºC y la mezcla se pasó a través de una
columna PD-10 equilibrada en tampón bicarbonato
(0,02M, a pH 8,0). El manano oxidado que eluyó en volumen de vacío
se mezcló con mezcla de proteínas E liofilizadas y se incubó a
temperatura ambiente durante la noche.
Cinco ratones fueron inmunizados con 25 \mug
de VLP con L1/L2 derivados de levaduras con 150 \mug de cada uno
de E1, E2, E1^4, E6^7 y 50 \mug de E5, proteínas E de CRPV en RIBI
(grupo 1). Cuatro conejos fueron inmunizados con la misma mezcla en
RIBI, con la excepción de que las proteínas E se conjugaron con el
polisacárido oxidado manano
(oxo-manano-proteína E, grupo 2).
Cada uno de tres conejos recibió RIBI únicamente (grupo 3) o VLP con
L1/L2 + oxo-manano-proteína E sin
RIBI (grupo 4). Cada conejo recibió 0,3 ml cada uno por vía
intramuscular en sus patas traseras, 0,5 ml cada por vía
intradérmica en 6 puntos y 0,1 ml por vía subcutánea en el cuello,
de la formulación deseada. Los conejos e infectaron con el
papilomavirus 4 de conejo de cola de algodón (CRPV) después de la
primera inmunización y se inyecto refuerzo con la misma cantidad de
antígeno en la misma formulación el día 21 y el día 42. El tamaño de
los papilomas se determinó el día 35 y el día 47 después de la
infección.
LA infección con CRPV tuvo como resultado el
desarrollo de verrugas en todos los sitios expuestos en los animales
control. El desarrollo de papilomas se inhibió en > 90% en 3/3
animales del grupo 4 inmunizados con la mezcla proteica de
VLP+oxo-manano-proteína E sin RIBI.
Por el contrario, sólo 3/5 animales del grupo 1, inmunizados con
mezcla de VLP + proteína E en RIBI y 2/4 animales del grupo 2
inmunizados con mezcla de VLP +
oxo-manano-proteína E en RIBI
mostraron una inhibición >90% del desarrollo de papilomas. La
inhibición del desarrollo de papilomas en los 2 animales restantes
del grupo 1 fue del 80% y en el grupo 2 varió de
10-50%. Los resultados sugieren que la inmunización
de conejos con un cóctel de proteína E conjugada en combinación con
VLP con L1/L2 en RIBI causa una inhibición significativa
(80-90%) del desarrollo de verrugas. Es interesante
el hecho de que también se observó una inhibición similar del
desarrollo de verrugas en animales inmunizados con la formulación
que sólo contenía el cóctel de VLP y proteína E conjugada con manano
oxidado (Figura 1).
Claims (3)
1. Uso de una mezcla que
comprende partículas similares a virus con L1 o L2 o L1 y L2 de
papilomavirus recombinantes y proteínas E recombinantes de
papilomavirus, donde las proteínas están conjugadas con manano
oxidado, en la fabricación de un medicamento capaz de provocar
respuestas tanto humorales como mediadas por células frente a los
antígenos de papilomavirus en un animal y, de este modo, prevenir la
infección de dicho animal por papilomavirus.
2. Una composición inmunogénica
que comprende partículas similares a virus con L1 o L2 o L1 y L2 de
papilomavirus recombinantes y proteínas E recombinantes de
papilomavirus, donde las proteínas están conjugadas con manano
oxidado, capaz de provocar respuestas tanto humorales como mediadas
por células frente a los antígenos de papilomavirus en un
animal.
3. Una vacuna que comprende
partículas similares a virus con L1 o L2 o L1 y L2 de papilomavirus
recombinantes y proteínas E recombinantes de papilomavirus, donde
las proteínas están conjugadas con manano oxidado, capaz de provocar
respuestas tanto humorales como mediadas por células frente a los
antígenos de papilomavirus en un animal.
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