ES2273404T3

ES2273404T3 - Metodos para cultivar celulas y propagar virus.

Info

Publication number: ES2273404T3
Application number: ES98903539T
Authority: ES
Inventors: Russell G. G. Condon; Nancy V. Connelly; Andreas Frei; Edward Glowacki; Vijay Yabannavar; Serge Batondolo
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-01-28
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2018-01-28
Also published as: EP1731598A1; EP0981601B1; CA2278808C; ATE338814T1; JP2008067720A; CA2278808A1; DK0981601T3; DE69835813D1; JP2001509675A; WO1998033886A1; IL181695A0; EP0981601A1; DE69835813T2; IL131014A0; AU6028898A

Abstract

La invención se refiere a procedimientos para cultivar células, y en particular a procedimientos para la propagación de virus, y más particularmente a procedimientos para propagar virus recombinantes para terapia génica.

Description

Métodos para cultivar células y propagar virus.

Antecedentes del invento

Muchas líneas celulares establecidas están disponibles para una variedad de propósitos en biotecnología. Algunas líneas celulares pueden ser cultivadas como suspensiones unicelulares, pero otras líneas celulares no crecen bien sin ningún soporte. El crecimiento de una línea celular que requiere un soporte está frecuentemente limitado por el área de la superficie disponible para que las células crezcan sobre ella, puesto que muchas líneas celulares formarán sólo una capa monocelular sobre la superficie. Además, algunas líneas celulares pueden tender a crecer en grupos o en agregados en ausencia de un soporte, lo cual es un resultado indeseable cuando se necesitan como suspensiones unicelulares, pero más especialmente cuando las células han de ser infectadas con un virus o transformadas con un vector recombinante, puesto que el virus o vector puede no tener acceso a las células dentro de grupo o agregado. Así, pueden haber graves problemas a la hora de llevar el cultivo de una línea celular a mayor escala, en particular para proporcionar un área superficial suficiente para que las células puedan crecer sobre ella y/o evitar el agrupamiento de las células.

La tecnología de microvehículos ha sido usada para cultivar células en cultivo. Por ejemplo, Forestell y otros. (Biotech. Bioeng. 40: 1039-1044 (1992)) describió subcultivos en serie extendidos de fibroblastos diploides humanos sobre microvehículos usando un medio de suplemento que redujo la necesidad por el suero de las células en cultivo. Además, Ohlson y otros, (Cytotechnology 14: 67-80 (1994)) describió la transferencia bola a bola de células de ovario de hámster chino usando microvehículos de gelatina macroporosa. Finalmente, Hu y otros (Biotech. Bioeng. 27:1666-1476 (1985)) describió la propagación seriada de células de mamífero sobre microvehículos usando una técnica de tripsinización con selección de pH. En Develop. Biol. Standar, vol 55, 1984, 67-75 se describe la separación de las células de microvehículos vía el uso de una rejilla de nylon.

Sin embargo, en vista de los problemas observados anteriormente, hay una necesidad para mejoras en los métodos de cultivo de líneas celulares, en métodos de producir virus para usos clínicos, y en métodos para aumentar a mayor escala la producción de virus para la comercialización a mayor escala; especialmente virus recombinantes para terapia génica. El invento inmediato alcanza estas necesidades y más.

El invento se refiere a un método para la separación de células de los microvehículos sobre los que han sido cultivadas pero de las cuales se han soltado, que comprende introducir una suspensión acuosa de células y microvehículos a través de una entrada en un dispositivo de separación, el dispositivo comprende

(a): una entrada;

(b): una columna;

(c): una salida para la recolección de las células y la disolución acuosa; y

(d): una pantalla de rejilla;

en la que los microvehículos son retenidos en suspensión mediante un flujo ascendente en el dispositivo de separación y son retenidos en el dispositivo de separación mediante una pantalla de rejilla, y en la que las células y disolución acuosa son recogidas a través de la salida.

El invento más específicamente se refiere a un método para separar células de microvehículos sobre las que las células han sido cultivadas usando un sistema que comprende;

(a) un bioreactor en el que las células fueron cultivadas sobre los microvehículos;

(b) una vía de flujo desdel bioreactor a un dispositivo de separación;

(c) un dispositivo de separación que comprende

(i): una entrada;

(ii): una columna;

(iii): una salida para la recolección de células y la disolución acuosa; y

(iv): una pantalla de rejilla;

en la que los microvehículos son retenidos en suspensión mediante el flujo ascendente en el dispositivo de separación y son retenidos en el dispositivo de separación mediante una pantalla de rejilla, y las células y disolución acuosa son recogidas a través de la salida; y

(d) una bomba, en la que la bomba dirige el flujo de la disolución acuosa desdel bioreactor a la salida.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una vista lateral de un sistema según el presente invento usado para separar medios que contienen células libres y virus de los microvehículos.

La Figura 2 es una vista explotada de un dispositivo de separación según el presente invento usado para separar medio que contiene células libres y virus de los microvehículos.

Descripción detallada del invento

El invento inmediato trata del cultivo a gran escala de células para la propagación de virus, especialmente virus recombinantes para terapia génica, producción de vacunas, y así sucesivamente. En particular, el invento inmediato trata tres aspectos del cultivo a gran escala; el uso de transferencia bola a bola de células adherentes hasta aumentar secuencialmente el número de células en cultivo, incluyendo el uso de tripsina para disociar células de microvehículos en bioreactores, el uso de la separación de lecho fluido de células a partir de las bolas durante el cultivo, y el uso de microfiltración para romper las células a modo de liberar las partículas virales.

El término "virus" como se usa aquí incluye no sólo virus presentes de manera natural sino también virus recombinantes, virus atenuados, cepas de vacuna, y así sucesivamente. Los virus recombinantes incluyen pero no se limitan a vectores virales que comprenden un gen heterólogo. En algunas realizaciones, una(s) función(es) ayudante(s) para la replicación de los virus es(son) proporcionada(s) por las células hospedantes, un virus ayudante, o un plásmido ayudante. Los vectores representativos incluyen pero no se limitan a los que infectan células de mamífero, especialmente células humanas, y pueden ser derivados a partir de virus tales como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpes virus, y virus avipox. Los vectores adenovirales son preferidos. Los vectores adenovirales tipo 2 y tipo 5 son más preferidos, siendo los vectores adenovirales tipo 5 especialmente preferidos. ADN 53 es un adenovirus recombinante de tipo 5 que codifica la proteína supresora de tumores p53 silvestre humana y está descrita, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional PCT WO 95/11984 publicada.

Como se usa aquí, el término "concluyente" indica que las células han formado una capa monocelular coherente sobre la superficie (por ejemplo del microvehículo), de modo que virtualmente toda la superficie disponible es usada. Por ejemplo, "concluyente" ha sido definido (R.I. Freshney, Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Techniques, Wiley-Liss, Inc. Nueva York, NY, 1994, p. 363) como la situación en la que "todas las células están en contacto alrededor de su periferia con otras células y no queda al descubierto ningún sustrato disponible". Para propósitos del presente invento, el término "sustancialmente concluyente" indica que las células están en contacto general sobre la superficie, aunque pueden quedar insterticios, de tal modo que algo más de alrededor del 70%, preferiblemente alrededor de alrededor del 90%, de la superficie disponible es usada. Aquí, "superficie disponible" significa área superficial suficiente para acomodar una célula. Así, pequeños insterticios entre células adyacentes que no pueden acomodar una célula adicional no constituyen "superficie disponible".

Las etapas de cultivo en los métodos del presente invento pueden ser llevadas a cabo en un bioreactor o fermentador conocido en la técnica de alrededor de 1 a 5000 L equipados con entradas apropiadas para introducir las células y microvehículos, oxígeno estéril, diversos medios de cultivo, etc.; salidas para eliminar células, microvehículos y medio, y medios para agitar el medio de cultivo en el bioreactor, preferiblemente un filtro de centrífuga (que también funciona como una salida para el medio). Medios ejemplares están descritos en la técnica; véase, por ejemplo, Freshney, Culture of animal Cells- A Manual of Basic Techniques, Wiley-Liss, Inc. Nueva York, NY, 1994, pp 82-100. El bioreactor también tendrá medios para controlar la temperatura y preferiblemente medios para supervisar y controlar electrónicamente las funciones del bioreactor.

Microvehículos ejemplares sobre los que las células son dejadas crecer son conocidos en la técnica y están preferiblemente adaptados para el propósito de cultivo celular. Se hace una referencia general al libro Microcarrier Cell Culture -Principles & Methods, publicado por Pharmacia. Sin embardo, debería observarse que algunas líneas celulares usadas en el presente invento pueden no adherirse firmemente a las superficie de los microvehículos; está dentro de la capacidad de una persona con experiencia común en la técnica el determinar una combinación adecuada de líneas celulares, virus (en los casos en que sea aplicable), microvehículo y condiciones de cultivo. El microvehículo tiene preferiblemente un tamaño de partícula en el intervalo de alrededor de 100 a 250 micrones, más preferiblemente en el intervalo de alrededor de 130 a 220 micrones, y debería estar compuesto de un material no tóxico. La media del tamaño de muestra cae preferiblemente en estos intervalos, tales que estos intervalos de tamaño son preferiblemente los de al menos el 90% de la muestra de microvehículos. En una realización preferida, el microvehículo consiste en microbolas sustancialmente esféricas con un tamaño de partícula medio de alrededor de 150 a 200 micrones, preferiblemente 170 a 180 micrones. La superficie de microvehículo puede ser tratada para modificar la adhesión celular, en particular para potencial la adhesión celular aunque permitiendo la proliferación y expansión; así los microvehículos pueden ser recubiertos, por ejemplo, con colágeno. Preferiblemente, los microvehículos son ligeramente más densos que el medio de cultivo, de modo que una agitación suave los mantendrá en suspensión, mientras que medios simples tales como sedimentación o centrifugación permiten su separación. Una densidad de 1,03 a 1,045 g/ml cuando los microvehículos son equilibrados con una disolución estándar tales como 0,9% NaCl (o con el medio de cultivo) es adecuada. Los presentes inventores han encontrado que los microvehículos Cytodex-3 de Pharmacia en general reunirán estos requerimientos, aunque los requerimientos particulares que se ajustan a ciertas líneas celulares o virus pueden requerir la selección de un microvehículo Cytodex en particular.

Las células pueden ser aquellas de una línea celular hospedante adecuada que es capaz de replicar por sí misma y en particular permitir la replicación del virus de interés. Una línea celular particularmente preferida es la línea celular 293 de riñón embrionario humano (ATCC número de catálogo CRL 1573). Estás células no se adhieren firmemente a todos los microvehículos, y son preferiblemente usadas con los microvehículos Cytodex-3 de pharmacia, que estan recubiertos de colágeno par una mejor adhesión celular. Los microvehículos Cytodex-3 tienen un tamaño de partícula de alrededor de 175 micrones con un 90% de la muestra que tiene una talla de alrededor de 140 a 210 micrones; la densidad de tales microvehículos cuando están equilibrados con NaCl 0,9% es 1,04 g/ml. Las células son preferiblemente cultivadas sobre tal microvehículo en una primera etapa, y después liberadas del mismo y transferidas a microvehículos adicionales para una etapa de producción.

La agitación puede ser efectuada convenientemente no sólo mediante un pala en el fondo del bioreactor sino también mediante un filtro de centrifugación rotante, que se extiende preferiblemente hacia abajo desde la parte alta del bioreactor en el volumen del medio. Las células y microvehículos pueden ser mantenidas en suspensión en el cultivo mediante rotación del filtro de centrifugación; el filtro de centrifugación puede también estar equipado con finos orificios que permiten la retirada de medio sin pérdida de células. El medio puede ser eliminado y remplazados simultáneamente o alternativamente; frecuentemente es conveniente eliminar una fracción sustancial (por ejemplo, hasta alrededor del 50%) del medio y después rellenarlo con el medio de remplazo adecuado mientras que se sigue eliminando medio, por ejemplo, a través del filtro de centrifugación.

Típicamente, las células son llevadas a mayor escala desde un vial de banco de células de trabajo a través de diversos tamaño de frascos T, y, preferiblemente, finalmente a reactores. Un frasco preferido es el frasco de cultivo tisular CELL FACTORY^{TM} (CF; NUNC), un frasco grande diseñado especialmente que tiene convenientemente varios compartimentos internos proporcionando un área superficial grande a la que las células pueden adherirse o unirse y sobre la que pueden crecer. Tras el cultivo hasta una confluencia sustancial, las células pueden ser liberadas mediante tripsinización y aisladas. La tripsinización es efectuada durante un corto período de tiempo (preferiblemente menos de 5 minutos, más preferiblemente alrededor de 3 minutos), y la tripsina es entonces neutralizada mediante la adición rápida de suero en medio de crecimiento. Si se desea, las células pueden ser centrifugadas y el medio que contiene tripsina eliminado antes de que se añada el suero. La suspensión celular resultante es entonces típicamente alimentada en un bioreactor de producción de semillas (típicamente 20- 30 L de volúmen) para un cultivo adicional, y en algunas realizaciones, a un bioreactor de mayor producción (típicamente 150-180 L de volumen).

La relación de volumen del segundo bioreactor (más largo) a un bioreactor de semillas depende del grado en el que la línea celular es propagada en el primer bioreactor, pero es típicamente desde 5:1 a 10:1, por ejemplo, en el intervalo de (6-8):1.

Las células son liberadas de los microvehículos mediante un procedimiento de tripsinización realizado en vasos de cultivo, preferiblemente un bioreactor, mientras que los microvehículos son suspendidos. El filtro de centrifugación es utilizado para realizar intercambio de medio para reducir los niveles de suero y de calcio en el medio, lo que aumenta la eficacia de la tripsinización mientras que mantiene constante el volumen en el bioreactor. Etapas de asentamiento son evitadas, lo que podría causar daños a las células en los microvehículos. La suspensión célula/microvehículo resultante pueden entonces ser transferidas a un bioreactor de producción que es previamente cargado con medio de cultivo y microvehículos.

Después de la transferencia de la suspensión célula/microvehículo a partir del bioreactor de semilla, el bioreactor de producción (por ejemplo, alrededor de 200 L) es operado, por ejemplo, a alrededor de 37ºC y alrededor de pH 7,3. Una perfusión de medio fresco durante la propagación celular puede entonces ser realizada para mantener la concentración de lactato por debajo de alrededor de 1,0 g/L. Las células son típicamente dejadas crecer sobre los microvehículos durante alrededor de 4 a 7 días hasta que más del 50% de los microvehículos son completamente concluyentes. Preferiblemente, un proceso de infección por virus es entonces iniciado. Un vial de 40 a 50 ml de inóculo viral, que contiene típicamente aproximadamente 1,0 x 10^{13} partículas virales totales es usado para infectar el bioreactor de producción. El virus es dejado que se replique en el bioreactor de producción durante alrededor de 3 a 5 días hasta alrededor del tiempo de valoración viral máxima. Típicamente más del 90% de células se habrá soltado de los microvehículos debido a los efectos citopáticos del virus. El rendimiento final de adenovirus recombinante del bioreactor de producción es típicamente alrededor de 8,5 x 10^{9} partículas virales/ml. Esto da un rendimiento total de partículas virales de 1,4 x 10^{15} a partir de cada lote de 160 L.

En otras realizaciones del invento, el bioreactor de producción es inoculado con células recogidas mediante tripsinización y después usadas directamente para inocular el bioreactor de producción. Típicamente 8 a 12 frascos de cultivo tisular CELL FACTORY^{TM} son utilizados para lograr una densidad de siembra de inóculo en bioreactor global de 0,6 a 1 x 10^{5} células/ml. El rendimiento viral típico en este método oscila desde alrededor de 1,7 hasta 2,6 x 10^{10} partículas virales/ml. Por lo tanto, este método particular proporciona un número de partículas virales total de alrededor de 3 hasta 4 x 10^{15} a partir de cada lote de 160 L.

En algunas realizaciones del invento, un proceso de tipo lecho fluido es usado para recoger las células del bioreactor. Típicamente, el bioreactor es recolectado después de que el 90% de las células se suelten de los microvehículos. Sin estar limitado a una teoría cualquiera, el efecto citopático de propagación viral en las células hospedantes parece ser responsable para la liberación celular. En otras realizaciones, células no infectadas pueden ser liberadas de los microvehículos mediante el método de tripsinización del invento presente. Después de que el bioreactor es recolectado, el cultivo contiene células, microvehículos y medio. El virus está presente en las células y el medio. Por lo tanto, todo este material es recogido preferiblemente para su procesado. La gravedad (densidad) específica de los microvehículos es similar a la de las células. Preferiblemente, los microvehículos son mantenidos suspendidos libremente mientras que se separan las células de las bolas, como etapas de procesamiento usando sedimentación causa que las células sedimenten con los microvehículos, lo cual resulta en pérdidas en la recuperación.

Una realización preferida de un dispositivo de separación es proporcionando en las Figuras 1 y 2. En algunas realizaciones del invento, el dispositivo de separación es proporcionado como parte de un sistema. Un sistema ejemplar es descrito en la Figura 2. El sistema comprende así un bioreactor 100 en el cual las células son cultivadas sobre microvehículos; una ruta de flujo 102 desdel bioreactor hasta el dispositivo de separación 104; el dispositivo de separación comprende una columna 106; una salida 108 para la recolección de células y la disolución acuosas; y una pantalla de rejilla 110. Los microvehículos son retenidos en una suspensión mediante un flujo ascendente en el dispositivo de separación y son retenidos en el dispositivo de separación mediante la pantalla de rejilla, y las células y disolución acuosa son recogidas a través de la salida. También proporcionada en el sistema está una bomba 112, en la que la bomba dirige el flujo de la disolución acuosa desdel bioreactor hasta la salida. En algunas realizaciones, un microfiltro 114 y un ultrafiltro 116 pueden ser proporcionados como componentes del sistema.

En la realización mostrada en la Figura 1, el dispositivo de separación comprende típicamente una columna 106, tal como una columna de cromatografía, teniendo una entrada 114 a través de la cual una suspensión acuosa de células y microvehículos desde un bioreactor 100 es introducido en el dispositivo de separación 104; y al menos una salida 108 para la recolección de células y la disolución acuosa; y una pantalla de rejilla 110. Los microvehículos son retenidos en suspensión en la columna mediante un flujo ascendente en el dispositivo de separación y son retenidos en el dispositivo de separación mediante una pantalla de rejilla, y en la que las células y la disolución acuosa son recolectadas a través de la salida. El caudal en el dispositivo de separación es alrededor de 1 a alrededor de 3 cm/min. Típicamente, un flujo ascendente a través de la columna es generada bombeando una disolución acuosa, tal como la suspensión celular o un tampón, a través de la entrada, en la que la entrada está situada en el fondo del dispositivo y la salida está situada en la parte alta del dispositivo.

La Figura 2 es una vista esquemática expandida de un dispositivo de separación 200, que describe en más detalles un ensamblaje de salida 210, un ensamblaje de pantalla de rejilla 212, una entrada 214, y una columna 216 que tiene una sección superior 218 y una sección inferior 220. La sección inferior comprende típicamente alrededor de 20 hasta 50%, más preferiblemente alrededor de 30%, del volumen de la columna y contiene la entrada. La sección inferior es preferiblemente cónica, con un ángulo preferido de alrededor de 15 hasta alrededor de 45 grados.

Así, el caldo de fermentación desdel bioreactor es bombeado en la base de la columna. El caudal es regulado para proporcionar un flujo ascendente suficiente para mantener las células y partículas virales suspendidas en el medio mientras que se permite la retención de los microvehículos dentro del dispositivo de separación. Preferiblemente, el caudal es aproximadamente 1-2 cm/min puesto que las células tienen una gravedad específica similar a la de los microvehículos. El caldo aclarado que contiene células y virus pasa a través de la pantalla de rejilla en el extremo superior de la columna de tipo lecho fluido y es recolectado por microfiltración.

Para un dispositivo de 200 L de escala, la sección inferior de la columna es preferiblemente cónica. El cono permite una reducción gradual de la velocidad lineal del caldo de fermentación que entra en el cono. La velocidad de fluido de la línea de entrada es reducida para lograr un flujo lineal reducido en una distribución uniforme a través del área transversal en el extremo superior del cono. Las paredes del cono están en un ángulo que permite a las bolas que se sedimenten sobre las paredes para moverse hacia abajo hacia la entrada. De esta manera estas bolas están resuspendidas para evitar el atrapamiento de las células entre las bolas sedimentadas. El ángulo de las paredes cónicas es preferiblemente alrededor de 30 grados. Ángulos inferiores a 15 grados proporcionan un cono excepcional-mente largo y ángulos más grandes de aproximadamente 45 grados puede que no dispersen la entrada de alimentación de modo eficaz. La sección superior de la columna funciona como una zona en la que las bolas se sedimentan a una velocidad mayor que el caudal lineal del medio de fermentación. Esta sección de la columna es cilíndrica en forma. Dentro de esta zona se forma un límite tal que los microvehículos se acumulan en la región inferior de la columna. Un ensamblaje de placa de extremo 222 (Figura 2) de la columna funciona como un punto de recolección para el medio de fermentación aclarado que contiene células y virus. Esto consiste en una placa de extremo 224 adaptada con un ensamblaje de pantalla de rejilla. Esta pantalla, preferiblemente alrededor de 50 a 120 de rejilla, más preferiblemente alrededor de una rejilla de 100, funciona como un segundo punto para la eliminación de los microvehículos.

La realización descrita anteriormente es la realización preferida usada en los ejemplos aquí. Las dimensiones de la columna y la pantalla de rejilla puede ser variada basada en el volumen de la disolución a ser procesada, la concentración de las bolas, el microvehículo particular usado y la formulación del medio (por ejemplo, gravedad específica del medio). Una columna preferida consiste en un fondo cónico fabricado a medida de acero inoxidable para ser unido a dos tubos de sección KS 370 de Pharmacia ajustados con un ensamblaje de extremo KS 370 al cual la pantalla del vendedor fue remplazada con una rejilla de acero inoxidable (ss) (preferiblemente alrededor de rejilla 50 a 120, más preferiblemente alrededor de rejilla 100).

Después de que las células son recogidas, son lisadas preferiblemente para liberar partículas virales adicionales. Se puede usar homogenización o congelación/descongelación para liberar las partículas virales. En una realización preferida del invento, la microfiltración es usada para lisar simultáneamente células que contienen virus y clarificar el caldo de restos celulares que de otro modo podrían interferir con la purificación viral. Por ejemplo, la microfiltración puede ser realizada usando un sistema Prostak (Millipore) con una membrana hidrofílica o hidrofóbida de 0,65 micrones, y a una velocidad de fricción de 7000 l/segundo. La velocidad de fricción es generada mediante el flujo de retenido (la parte que no atraviesa la membrana) a través de canales de flujo tangencial de la membrana. Por lo tanto el flujo transversal es usado no sólo para impedir que la membrana se ensucie sino también para crear suficiente fricción para lisar las células. El tamaño de poro del filtro debería ser suficiente para permitir el paso del virus mientras que se retiene los restos celulares. Así, típicamente el intervalo de tamaños de poro es alrededor de 0,2-0,65 micrones. El intervalo de velocidades de ruptura es típicamente alrededor de 2000 hasta 10.000 l/s, más preferiblemente alrededor de 7000 l/s.

Típicamente, la endonucleasa BENZONASE^{TM} (American Internation Chemical, Inc.) es añadida al caldo aclarado para digerir los ácidos nucleicos celulares, ya que las partículas virales pueden acomplejarse con ácidos nucleicos celulares. En una realización preferida, se usa ultrafiltración con un sistema Pellicon (Millipore) con un peso molecular de corte nominal de 1 millón, usando una membrana de celulosa regenerada Pellicon-1 para concentrar el virus. La etapa de ultrafiltración logra dos funciones; el virus es concentrado para purificación y se realiza una diafiltración para cambiar el tampón de modo que la suspensión viral pueda ser directamente aplicada a una columna DEAE. El eluído a partir del microfiltro contiene el virus liberado y es preferiblemente concentrado por ejemplo mediante ultrafiltración.

Entre cada etapa de cultivo, las células pueden ser liberadas y levantadas del microvehículo mediante tripsinización, por ejemplo, mediante tratamiento con tripsina. En el presente invento es preferible eliminar el suero usado en el cultivo, puesto que las proteínas séricas inhiben la tripsina; la eliminación del suero permite por lo tanto que se use una cantidad mas pequeña de tripsina. Esto es ventajoso puesto que la adición de una mayor cantidad puede causar elevadas concentraciones localizadas de tripsina que pueden dañar las células. Con respecto a la siguiente etapa, los iones de Ca^{++} son eliminados puesto que la eliminación de estos iones de las células tiende a soltar las células y permite que se use menos tripsina. Así, la liberación y despegue de las células, especialmente de la línea celular de riñón embrionario humano 293, puede incluir convenientemente las siguientes etapas:

i): lavar rápidamente las células para eliminar el suero y otros materiales solubles;

ii): eliminar Ca^{++} de las células lavadas añadiendo un agente quelante

iii): eliminar rápidamente el agente quelante;

iv): añadir rápidamente tripsina;

v): tripsinizar las células durante un corto período de tiempo (preferiblemente oscilando desde alrededor de 3 minutos hasta alrededor de 15 minutos); y

vi): neutralizar rápidamente la tripsina añadiendo proteína.

En la etapa (I) anterior, la fase "lavar rápidamente" significa a un volumen de bioreactor constante prefundir un cambio de volumen del medio a una velocidad de alrededor de 1-3 litros por minutos, más preferiblemente alrededor de 2 litros por minutos. En la etapa (iii) anterior, la frase "eliminar rápidamente el agente quelante" significa que a un volumen de bioreactor constante se perfunde un cambio de un volumen y medio de medio a una velocidad de alrededor de 1-3 litros por minutos, más preferiblemente alrededor de 2 litros por minutos. En la etapa (iv) anterior, la frase "añadir tripsina rápidamente" significa añadir el volumen apropiado de disolución de tripsina (típicamente una disolución al 2,5%) a una velocidad de alrededor de 1-3 litros por minutos, más preferiblemente alrededor de 2 litros por minutos. En la etapa (vi) anterior la frase "neutralizar rápidamente la tripsina añadiendo suero" significa añadir el volumen adecuado de suero a una velocidad de alrededor de 1-3 litros por minutos, más preferiblemente alrededor de 2 litros por minuto.

Si el suero no se elimina en la etapa (i), entonces la adición de grandes cantidades necesarias de tripsina puede llevar a elevadas concentraciones locales de tripsina, lo que puede de hecho dañar o incluso matar las células más que sólo soltarlas. La eliminación de suero en la Etapa (i) y de Ca^{++} en la Etapa (ii) reduce la cantidad de tripsina necesaria en las Etapas (iv) y (v). De hecho, para evitar dañar o incluso matar las células, el tratamiento con el agente quelante y con la tripsina debería ser preferiblemente mantenido corto (es decir, lo suficiente para soltar las células de los microvehículos pero preferiblemente no mucho más tiempo). Ejemplos de agente quelantes preferidos incluye EDTA (ácido etilendiamino tetraacético) y EGTA (ácido etilén-bis (oxietilén-nitrilo) tetraacético.

El suero es eliminado mediante un proceso de intercambio de medio; por ejemplo, el medio puede ser extraído mediante bombeo a través de un filtro de centrifugación. Medio de lavado libre de suero es añadido para remplazar lo que fue extraído por bombeo y la mezcla es agitada. Alternativamente, la adición de medio de lavado libre de medio puede ser contínuo con la eliminación de medio a través del filtro de centrifugación. El proceso es repetido hasta que la concentración sérica ha sido reducida a un nivel los suficientemente bajo, por ejemplo, menos de alrededor de 1,0 a 0,2%, preferiblemente alrededor de 0,2%. El agente quelante, preferiblemente EDTA, es añadido en medio quelante libre de suero, la mezcla es agitada de nuevo, y el agente quelante es bombeado. Alternativamente, la adición del agente quelante en medio libre de suero puede ser continuo con la eliminación del medio a través del filtro de centrifugación.

La tripsina es preferiblemente usada en la etapa (v) para proporcionar una concentración en el bioreactor de desde alrededor de 0,05% hasta 0,1%, y se permite que actúe sobre las células desde alrededor de 5 a 10 minutos, por ejemplo, preferiblemente una concentración de tripsina de alrededor de 0,065% durante alrededor de 8 minutos. La proteína, típicamente en la forma de suero de ternera bovino, es preferiblemente añadida al bioreactor a una concentración final de alrededor de 10 a 20% para inhibir la tripsina.

Así, la adición de suero en la etapa (iv) no sólo prepara las células para un cultivo adicional sino que también neutraliza la tripsina residual. La secuencia entera de las etapas (i)-(vi) puede tener lugar in situ en el bioreactor; en algunas realizaciones la suspensión de microvehículos y células puede ser transferida a un bioreactor más grande, en el que microvehículos adicionales son añadidos para la siguiente etapa de cultivo. Las células se permite que se unan a los microvehículos y entonces se cultivan adicionalmente. Una vez que se han vuelto sustancialmente confluentes (por ejemplo, 3-4 días de cultivo a alrededor de 37ºC), se pueden poner a través de la siguiente etapa, que puede ser por ejemplo la recogida, soltando las células para una cambio de etapa adicional, o inoculación con virus. Si las células han sido cultivadas simplemente para su recogida, entonces pueden ser recogidas en esta etapa, por ejemplo, mediante repetición de las etapas (i) hasta (vi) anteriores. Si se necesitar para una fase adicional, entonces las etapas (i)- (vi) anteriores pueden ser repetidas. Si han sido cultivadas para la propagación de un virus, el virus puede ser ahora inoculado en el medio.

Los ejemplos aquí sirven para ilustrar el presente invento. Los vectores seleccionados y los hospedadores y otros materiales, la concentración de reactivos, las temperaturas, y los valores de otras variables ejemplifican la aplicación del presente invento.

Ejemplos experimentales I. Revisión general A. Preparación del inóculo celular

Cada lote de fermentación viral comienza desde una línea celular propagada desde un vial de células 293 del Banco de Células Manufacturers Working Cell Bank (MWCB). Los bioreactores son inoculados con células 293 (número de catálogo CRL 1573 de la ATCC) mantenido mediante propagación en frascos en T y CELL FACTORY^{TM} usando medio de crecimiento (Medio 1), como se ilustra en la Tabla 1 a continuación. Cada transferencia representa un pase. Típicamente, un número de pases de 4 a 30 son empleados durante la inoculación de un bioreactor de
semilla.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Composición del medio

1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{1}   \begin{minipage}[t]{145mm}DMEM en polvo (disponible de
American Biorganics, n ^{o}  de catálogo D2807): usado
preferiblemente para proporcionar 4,5 g/l de glucosa y 0,584 g/L de 
L-glutamina; sin bicarbonato sódico y sin
HEPES.\end{minipage} \cr   ^{2} 
 \begin{minipage}[t]{145mm}DMEM en polvo libre de Ca ^{++} 
(disponible de American Biorganics, n ^{o}  de catálogo D2807403):
preferiblemente usado para proporcionar 4,5 g/l de glucosa y 0,584
g/L de L-glutamina; sin bicarbonato sódico, sin
cloruro cálcico y sin HEPES.\end{minipage} \cr   ^{3}  suero de
ternera bovino: disponible de Hyclone, n ^{o}  de catálogo 2151.\cr 
 ^{4}  Disolución patrón de EDTA: 186,1 g/L de EDTA y lentejas de 20
g/l de NaOH.\cr   ^{5}  Disolución patrón de glutamina: 29,22
g/L.\cr}

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Para preparar para la transferencia de células de frasco a frasco durante la expansión celular, el medio gastado es vertido y las células en el frasco son entonces lavadas con tampón fosfato salino (PBS). Una disolución de tripsina es añadida a la monocapa celular sobre la superficie del frasco y las células son expuestas hasta que se sueltan de la superficie. La acción de la tripsina es entonces ampliamente neutralizada añadiendo medio de cultivo (Medio 1, Tabla 1) que contiene suero; no es necesaria una neutralización completa, puesto que la tripsina residual tendrá una actividad baja. Las células pueden ser recuperadas mediante centrifugación y ser resuspendidas en medio de crecimiento fresco (Medio 1). La Tabla 2 muestra los volúmenes típicos que son usados.

TABLA 2 Volúmenes típicos usados en la transferencia de células

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B. Preparación del inóculo viral

El inóculo viral puede ser preparado infectando frascos de cultivo tisular CELL FACTORY^{TM} de células maduras. En este procedimiento, células 293 fueron primero propagadas de frascos T a frascos de cultivo tisular CELL FACTORY^{TM}. Cuando los cultivos en frasco de cultivo tisular CELL FACTORY^{TM} están maduros (típicamente 80-90% confluentes) se infectan con un inóculo del banco viral manufacturer's working virus bank (MWVB). Los frascos de cultivo de tejidos CELL FACTORY^{TM} son incubados hasta que las células 293 se sueltan de su superficie soporte. Las células son entonces recogidas mediante centrifugación y rotas mediante múltiples ciclos de congelación-descongelación. Tras una centrifugación subsiguiente, el virus es recuperado en el sobrenadante y almacenado como alícuotas a -20ºC o menos. Este material es el "Inóculo Viral" que es usado para infectar bioreactores. Opcionalmente, el inóculo viral puede también ser derivado de la recogida del bioreactor que es esterilizada mediante filtración (véase "Producción del cultivo de bioreactor" a continuación).

C. Preparación y Operación del bioreactor de semilla

Preferiblemente, un bioreactor de semilla es usado para preparar el inóculo celular 293 para la producción del bioreactor. El bioreactor de semilla es esterilizado por vapor y cargado con un lote de medio de crecimiento esterilizado mediante filtración (Medio 1, Tabla 1, anterior) para el proceso de suspensión libre de células. Para el proceso de microvehículos, sin embargo, bolas microvehículos estériles infladas (Cytodex 3 o equivalente) son preferiblemente añadidas en esta etapa.

El bioreactor de semilla es inoculado con las células 293 recogidas de frascos de cultivo de tejidos CELL
FACTORY^{TM}. Las condiciones de operación son establecidas como se muestran en la Tabla 3. El pH y el oxígeno disuelto (OD) son controlados inyectando CO_{2} y oxígeno, respectivamente. Se puede añadir medio de crecimiento extra al bioreactor mediante perfusión. El crecimiento celular es supervisado mediante examinación microscópica y mediante medida de la producción de lactato y de consumo de glucosa. Típicamente, cuando la densidad celular en el cultivo en suspensión alcanza 1 x 10^{6} células/ml en el bioreactor de semilla, está listo para inocular el bioreactor de producción. Sin embargo, la inoculación requiere unas cuantas etapas adicionales para el proceso de microvehículo. Típicamente, cuando las células sobre los microvehículos son >50% confluentes, el suero y calcio en el medio del bioreactor son lavados usando medio descrito en la Tabla 1. La tripsina es entonces añadida rápidamente, y cuando el desprendimiento celular alcanza el nivel típico, el suero es añadido para inactivar la tripsina. Los contenidos del bioreactor de semilla son ahora transferidos al bioreactor de producción.

Opcionalmente, las células 293 recogidas de múltiples frascos de cultivo tisular CELL FACTORY^{TM} pueden ser usadas directamente como inóculo para un bioreactor de producción. Típicamente, 8-12 cultivos son recogidos y juntados para proporcionar un inóculo.

TABLA 3 Condiciones de operación del bioreactor de semilla

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D. Preparación y Operación del Bioreactor de producción

El proceso de producción viral es ejemplificado en un bioreactor de producción de 200 L usando medio de crecimiento (Medio 1, Tabla 1). En el proceso de cultivo en suspensión, el medio esterilizado mediante filtración es añadido en lotes en el bioreactor. Sin embargo, en el proceso de microvehículos, los microvehículos son esterilizados bien in situ en el bioreactor de producción o bien autoclavados externamente y cargados. Estos microvehículos son entonces acondicionados en el medio de crecimiento (Medio 1) previamente a la inoculación con células 293.

El bioreactor de producción es inoculado con las células 293 del bioreactor de semilla. Las condiciones de operación son establecidas como se muestran en la Tabla 4. El pH y el oxígeno disuelto (OD) son controlados inyectando CO_{2} y oxígeno, respectivamente. Opcionalmente, se puede añadir medio de crecimiento extra al bioreactor mediante perfusión. El crecimiento celular es controlado mediante examen microscópico, y midiendo la producción de lactato y el consumo de glucosa. Las células son dejadas crecer hasta aproximadamente 1 x 10^{6} células/ml. El bioreactor es entonces inoculado con virus. Preferiblemente, se usa una relación de multiplicidad de infección (MOI) expresada como el total de partículas virales por células de 50:1 a 150:1. La valoración viral es típicamente realizada usando el ensayo de Resource-Q HPLC. El virus es dejado que se propague hasta que la viabilidad celular cae hasta alrededor del 10%.

El tipo de virus y su acción sobre las células hospedantes puede determinar si es necesario soltar las células hospedantes de los microvehículos y/o lisar las células. A alrededor del tiempo de máxima concentración viral (frecuentemente cuando las células comienzan a soltarse del microvehículo y alguna de las cuales pueden lisarse, de modo que el virus comienza a escapar), la incubación puede ser detenida y las células y virus pueden ser recogidos. Ciertamente, en el proceso del microvehículo, el 80-90% de las células, algunas veces incluso más del 90%, pueden desprenderse de los microvehículos. Sin estar limitado a ninguna teoría, el efecto citopático de la propagación viral en las células hospedantes parece ser responsable del desprendimiento celular.

Así, cuando el adenovirus ACN53 es usado con las células 293, las células empiezan a desprenderse de los microvehículos después de 3 ó 4 días del cultivo con el virus.

TABLA 4 Condiciones de operación del bioreactor de producción

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E. Recogida del bioreactor de producción 1. Separación de las células del microvehículo

En la recogida, los contenidos del bioreactor tienen que ser tratados de manera diferente dependiendo de si el proceso usa suspensión libre o un microvehículo. En el proceso del microvehículo, una columna de lecho fluido es preferiblemente usada para separa los microvehículos de las células y los sobrenadantes. Un caudal ascendente es mantenido de modo que retenga los microvehículos mientras las células y los sobrenadantes pasan a través. El lecho fluido es lavado con el medio o con un tampón de lavado para recuperar la mayoría de las células residuales y los virus y los lavados son combinados con las células y el sobrenadante como un eluído. La operación de lecho fluido no es requerida para el proceso de suspensión celular libre.

El eluído que contiene células y virus es procesado adicionalmente de modo que las células son lisadas por una elevada fricción para liberar el virus, y el eluído es después aclarado por medio de una microfiltración de flujo transversal. Típicamente, se usan membranas de 0,65 \mum de Durapore (Millipore) o membranas equivalentes. Hacia el final de la microfiltración, el retenido es lavado con tampón de lavado para recuperar el virus residual en el líquido permeado. Después de la microfiltración, el líquido permeado puede ser opcionalmente tratado con una nucleasa tal como la endonucleasa BENZONASE™.

El líquido permeado de la microfiltración es concentrado por ultrafiltración (con un peso molecular límite de 1 millón típicamente) y un tampón de intercambio es realizado usando el tampón de lavado. El concentrado y retenido diafiltrado que contiene el virus es después pasado a través de un filtro final. El filtrado final es almacenado como "Concentrado Viral" en un congelador a -20°C o inferior.

2. Composición y preparación del medio

La Tabla 1 anterior presenta el medio usado en la preparación del inóculo viral y en el proceso de fermentación. Todos estos medios de cultivo son preparados para disolver primeramente el polvo DMEM seco y otros reactivos en agua purificada. Después de disolver los polvos secos, estos medios son ajustados a un pH de 7,2-7,6 con ácido hidroclórico. Los medios son después esterilizados al pasar a través de un filtro de 0,2 \mum en un recipiente de almacenamiento apropiado. Los medios esterilizados son refrigerados por debajo de 10°C y descartados un mes después de su preparación.

La Tabla 5 presenta diversos tampones usados en el proceso.

TABLA 5 Tampones usados en la fermentación y el cultivo

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La Tabla 6 resume los testigos en proceso durante la fermentación y los procesos de cultivo.

TABLA 6 Testigos en proceso

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II. Transferencia bola a bola del bioreactor de semilla al bioreactor de producción A. Preparación del inóculo celular 293 para el bioreactor de semilla 1. Aumento de escala del vial al frasco T75

Un vial congelado de la línea celular 293 que contiene un total de 2 x 10^{7} células fue descongelado en un baño de agua a 37°C. Las células fueron lavadas con 10 ml del Medio 1. Las células lavadas fueron resuspendidas en un volumen total de 30 ml del Medio 1 y colocadas en un frasco (T75) de cultivo de tejido de 75 cm^{2}. El cultivo fue colocado en un incubador a 37°C con una atmósfera de CO_{2} al 5% y un nivel de humedad de 100%. Esto fue el pase 1 del cultivo.

2. Aumento de escala del cultivo T75 al frasco T500 usando tripsinización

El cultivo T75 alcanzó un nivel de confluencia del 90% en tres días. En este momento el cultivo T75 fue tripsinizado de la siguiente manera. El medio sobrenadante de 30 ml fue eliminado del frasco. Un volumen de 10 ml del CMF-PBS (tampón fosfato salino de Dulbecco sin cloruro cálcico y sin cloruro de magnesio) fue usado para lavar la superficie del cultivo. El sobrenadante CMF-PBS fue eliminado del frasco. Dos ml de la disolución TE (tripsina pura 0,05% con EDTA-4Na 0,53 mM) fueron añadidos al frasco. El frasco fue movido de modo que la disolución cubrió toda la superficie de cultivo. Las células se desprendieron de la superficie del frasco en cinco minutos. Diez ml del Medio 1 fueron añadidos al frasco inmediatamente después de que las células se desprendieron de la superficie. La suspensión celular fue centrifugada a 1000 rpm durante diez minutos a temperatura ambiente con la interrupción. El sobrenadante fue eliminado. Las células fueron resuspendidas en cinco ml del Medio 1. La suspensión celular fue transferida a un frasco estéril con 200 ml del Medio 1. La suspensión celular de 200 ml fue colocada en un frasco de cultivo tisular de 500 cm^{2}. El líquido en la T500 fue dejado equilibrar entre las cámaras antes de colocarlo en una posición horizontal en el incubador. El cultivo fue colocado en un incubador a 37°C con una atmósfera de CO_{2} al 5% y un nivel de humedad de 100%. Esto fue el pase 2 del cultivo.

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3. Aumento de escala y pase del cultivo T500 usando tripsinización

El cultivo T500 alcanzó un nivel de confluencia de 90% en cuatro días. En el cuarto día, el cultivo T500 fue tripsinizado y aumentado de escala de la siguiente manera. El medio sobrenadante fue descartado. La superficie del cultivo fue lavada con 25 ml de CMF-PBS. Un volumen de 25 ml del TE fue añadido al frasco. El frasco fue movido de modo que la disolución TE cubrió las tres capas de la superficie del cultivo. Las células se desprendieron de la superficie del frasco en cinco minutos. Después de que las células se desprendieran, 50 ml del Medio 1 fueron añadidos al frasco. Todas las superficies fueron contactadas con el medio moviendo el frasco. La suspensión celular resultante fue vertida en un frasco de centrifuga cónico de 200 ml. Las células fueron precipitadas por centrifugación a 1000 rpm durante diez minutos a temperatura ambiente con freno. El sobrenadante fue descartado. Las células fueron resuspendidas en 5 a 15 ml del Medio 1. La suspensión celular fue colocada en 800 ml (200 ml por frasco nuevo T500) del Medio 1. La suspensión celular fue mixta. Un volumen de 200 ml de suspensión celular fue añadido a cada una de los frascos T500. El nivel de líquido en cada frasco fue dejado equilibrar entre las cámaras antes de colocarlo en una posición horizontal en el incubador. La relación de división para este pase fue de 1:4. Este fue el pase 3. El cultivo fue pasado de esta manera por los pases 4 hasta el 13. En el pase 14, cuatro cultivos T500 fueron tripsinizados en la manera dada anteriormente. Las suspensiones celulares fueron juntadas y colocadas en un frasco que contenía 1,5 litros del Medio 1. Esta suspensión celular fue añadida a 6000 cm^{2} del frasco de cultivos tisular CELL FACTORY™. El nivel de líquido en el CF fue dejado equilibrar entre las cámaras antes de colocarlo en una posición horizontal en el incubador.

4. Amplificación y pases de cultivos en botella de cultivos tisulares de CELL FACTORY™

El cultivo de CF alcanzó un nivel de confluencia del 80% en tres días. La tripsinización fue realizada de la siguiente manera para el pase 15. Los 1,5 litros del Medio 1 fueron escurridos del cultivo CF. Las superficies del cultivo fueron lavadas con 500 (+/- 100) ml de CMF-PBS. Después del lavado, 250 (+/-50) ml de la disolución TE fueron añadidos al cultivo de CF. El CF fue movido de modo que la disolución TE cubrió cada una de las superficies. Después de que las células se distanciaron de la superficie, 500 ml del Medio 1 fueron añadidos al CF. El CF fue movido de modo que el Medio 1 contactó cada una de las superficies. La suspensión de células resultante fue alicuotada en cuatro, frascos de centrífuga cónicos de 250 ml. Las células fueron precipitadas por centrifugación a 1000 rpm durante diez minutos con el freno activo. El medio sobrenadante fue descartado de cada frasco de centrífuga. En cada frasco de centrífuga, las células fueron resuspendidas en 5 ml del Medio 1. Las suspensiones de células fueron reunidas en un frasco de centrifuga. Los tres frascos de centrifuga restantes fueron lavados con 5-10 ml adicionales del Medio 1, que fue añadido a la suspensión de células juntadas. Esta suspensión de células fue separada igualmente entre los seis frascos que contenían los 1,5 litros del Medio 1. Cada una de las seis suspensiones de células de 1,5 litros fue añadida al CF. Se dejó equilibrar el nivel de líquido de cada CF entre las cámaras antes de que el CF fuera colocado en posición horizontal en el incubador. El cultivo fue pasado de la misma manera para el
pase 16.

Los datos de los pases son proporcionados en la Tabla 7.

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TABLA 7 Datos de pases

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5. Preparación de Inóculo celular de cultivos en frascos de cultivo tisular de CELL FACTORY™ al bioreactor de semilla

Los cultivos de CF alcanzaron un nivel de confluencia del 80% en cinco días. Cuatro de los seis cultivos de CF fueron usados para inocular el bioreactor de semilla como sigue. Los 1,5 litros del Medio 1 fueron escurridos del cultivo de CF. Las superficies del cultivo fueron lavadas con 500 (+/- 100) ml de CMF-PBS. Después del lavado, 250 (+/-50) ml de la disolución TE fueron añadidos al cultivo de CF. El CF fue movido de modo que la disolución TE cubrió cada una de las superficies. Inmediatamente después de que las células se distanciaran de la superficie, 500 ml del Medio 1 fueron añadidos al CF. El CF fue movido de modo que el Medio 1 contactó cada una de las superficies. La suspensión de células resultante fue alicuotada in cuatro, frascos de centrífuga cónicos de 250 ml. Las células fueron precipitadas por centrifugación a 1000 rpm durante diez minutos a temperatura ambiente con el freno puesto. El medio sobrenadante fue descartado de cada frasco de centrifuga. En cada frasco de centrífuga, las células fueron resuspendidas en 5 ml del Medio 1. Las suspensiones de células fueron juntadas en un frasco de centrífuga. Los tres frascos de centrífuga restantes fueron lavados con 5-10 ml adicionales del Medio 1, que fue añadido a la suspensión de células juntadas. Las suspensiones celulares de cada una de las cuatro botellas de centrífuga fueron después juntadas, rindiendo un volumen total de 50-100 ml. Un volumen adicional del Medio 1 fue añadido para dar un volumen total de 1000 ml. Este fue el inóculo celular. La cantidad total de células en el inóculo celular fue de 2,88 x 10^{9} de células totales y 2,84 x 10^{9} de células viables. Los 1000 ml de inóculo celular fueron transferidos a un frasco Erlenmeyer estéril e inoculados en el bioreactor de semilla de 30 litros que contenía un volumen total de 18 litros del Medio 1 con 66 g de microvehículo de Cytodex 3.

B. Bioreactor de semilla 1. Preparación de microvehículos de Cytodex 3 para el bioreactor de semilla de 30 L

Un lote de 66 gramos de microvehículo de Cytodex 3 fue preparado de la siguiente manera. Los 66 gramos del microvehículo de Cytodex 3 fueron colocados en un vaso de cinco litros, frasco Erlenmeyer. Dos litros de CMF-PBS con 0,2 ml de Tween 80 fueron añadidos. Los microvehículos fueron dejados crecer a temperatura ambiente durante cinco horas y treinta minutos. Después de este periodo de crecimiento, el sobrenadante CMF-PBS fue decantado del frasco dejando detrás la suspensión de los 3 microvehículos Cytodex. La suspensión de los 3 microvehículos Cytodex fue lavada con dos litros del CMF-PBS, después resuspendida en CMF-PBS a un volumen total de dos litros. El lote de Cytodex 3 fue autoclavado en el frasco de cinco litros a 121ºC durante tres horas y media en un ciclo de líquidos. El lote de Cytodex 3 esterilizado fue usado al día siguiente para el bioreactor de semilla de 30 L.

El día de la adición del Cytodex 3 al bioreactor de semilla 30 L, fueron realizadas las siguientes acciones. El sobrenadante CMF-PBS fue decantado del frasco de cinco litros. La suspensión del microvehículo fue lavada con dos litros del Medio 1. Después del lavado, el Medio 1 fue añadido al frasco a un volumen final de dos litros.

2. Preparación del bioreactor de semilla 30 L

El bioreactor de semilla de 30 L que contenía un filtro de centrífuga fue limpiado y desinfectado al vapor. El bioreactor fue esterilizado durante cincuenta minutos a 121ºC. Un día antes de la inoculación de la células 293, el bioreactor de semilla de 30 L fue rellenado con 18 litros del Medio 1. Los dos litros que contenían 66 gramos del microvehículo del Cytodex 3 con la disolución del Medio 1 fueron añadidos al bioreactor de 30 L. Las condiciones de operación del bioreactor de semilla de 30 L son presentadas en la Tabla 8.

TABLA 8 Condiciones de operación del bioreactor de semilla 30 L

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3. Cultivo de las células 293 en el bioreactor de semilla de 30 L

Las células 293 fueron propagadas en el microvehículo del Cytodex 3 durante 5 días. Las condiciones de operación reales en el bioreactor de semilla de 30 L durante este periodo de tiempo son presentadas en la Tabla 9.

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TABLA 9 Condiciones de operación en el bioreactor de semilla 30 L

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En el quinto día del cultivo, el 54% de la población de microvehículos contenía más de 50 células/microvehículo, el 38% contenía de 1-25 células, el 8% no contenía células, y el 8% fueron en agregados de dos microvehículos como se determinó por examen de una muestra bajo el microscopio a un aumento de 100X. Los resultados son proporcionados en la Tabla 10.

TABLA 10

Resultados del examen microscópico al quinto día del cultivo de las células 293 sobre microvehículos cytodex 3 en el bioreactor de 30 L

Bioreactor

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B. Procedimiento de transferencia bola a bola 1. Preparación de los microvehículos del Cytodex 3 para el bioreactor de producción

Un lote de 420 gramos de los microvehículos Cytodex 3 fue preparado de la siguiente manera. Los 420 gramos de los microvehículos Cytodex 3 fueron colocados en el contenedor de cincuenta litros. Un volumen de 21,5 litros de CMF-PBS con 2,0 ml de Tween 80 fue añadido. Los microvehículos fueron dejados crecer a temperatura ambiente durante 17 horas. Después del periodo de crecimiento, el sobrenadante CMF-PBS fue retirado del contenedor dejando detrás la suspensión del microvehículo Cytodex 3. La suspensión del microvehículo Cytodex 3 fue lavada con 25 litros de CMF-PBS, después resuspendida en CMF-PBS a un volumen total de 20 litros.

El bioreactor de 200 L que contenía un filtro de centrífuga fue limpiado y desinfectado al vapor. La suspensión del microvehículo Cytodex 3 de 20 litros fue transferida al bioreactor. Cinco litros del CMF-PBS fueron usados para lavar el contenedor de 50 litros y transferidos al bioreactor. El bioreactor fue esterilizado durante 50 minutos a 123°C. El bioreactor fue mantenido a 4°C durante toda la noche. Al día siguiente, 120 litros del Medio 1 fueron añadidos al bioreactor 200 L. La disolución del microvehículo fue agitada a 90 rpm durante 10 minutos en el bioreactor. El volumen fue reducido a 55 litros al retirar líquido a través del filtro de centrífuga. El Medio 1 fue añadido al bioreactor para dar un volumen de 125 litros. Las condiciones de operación del bioreactor se establecieron según la Tabla 11.

TABLA 11 Condiciones de operación del bioreactor

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El bioreactor de producción 200 L estuvo listo para recibir el inóculo del bioreactor de semilla.

2. Tripsinización del cultivo del bioreactor de semilla

En el quinto día del cultivo de las células 293 en los microvehículos Cytodex 3, se realizó el procedimiento de transferencia bola a bola. Los niveles de suero y calcio del medio en el cultivo fueron reducidos mediante perfusión de 22 litros del Medio 2 a una velocidad de 2 litros por minuto, usando el filtro de centrífuga con un volumen constante del bioreactor de 20 litros. La perfusión fue continuada con 22 litros del Medio 3 a una velocidad de perfusión de 2 litros por minuto con un volumen constante del bioreactor de 20 litros. Esto redujo además los niveles de suero y calcio. El Medio 3 contenía etilenodiamino-tetraacetato disódico dihidratado (EDTA) con quelatos de cationes divalentes tales como magnesio y calcio. Una tercera ronda de perfusión fue realizada usando 33 litros del Medio 2, el cual fue diseñado para reducir además los niveles de suero y calcio y para reducir la concentración de EDTA en el medio. En este punto, el medio fue retirado a través del filtro de centrífuga para recudir el volumen del cultivo total a 15,5 litros. Un volumen de 480 ml de una disolución de tripsina 2,5% fue añadido al bioreactor en un minuto. Mediante observación microscópica, ocho minutos después de la adición de la disolución de tripsina, el 90% de las células se habían separado de los microvehículos. En este punto, cuatro litros de suero fueron añadidos al bioreactor en dos minutos y medio para impedir la acción de la tripsina y para proteger las células de la fricción durante el procedimiento de transferencia al bioreactor de producción. Las células tripsinizadas y los microvehículos fueron transferidos al bioreactor de producción por presión. La transferencia fue lograda en ocho minutos. Inmediatamente después de la transferencia, cinco litros del Medio 1 fueron añadidos al bioreactor de producción mediante presión. Las condiciones de operación del bioreactor de semilla durante el procedimiento de transferencia bola a bola son proporcionadas en la tabla 12.

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TABLA 12 Condiciones de operación del bioreactor de semilla durante el procedimiento de transferencia bola a bola

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C. Cultivo de las células 293 en el bioreactor de producción de 200 L antes de la infección

Las células 293 fueron propagadas en los microvehículos Cytodex 3 durante seis días. Las condiciones de operación reales en el bioreactor de producción de 200 L durante este periodo de tiempo son presentadas en la Tabla 13.

TABLA 13 Condiciones de operación en el bioreactor de producción de 200 L

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Un volumen total de 115 litros del Medio 1 fue perfundido de los días 4 a 6. Las velocidades fueron como sigue; 24 litros fueron perfundidos en una hora en el cuarto día, 40 litros fueron perfundidos en una hora en el quinto día, y 50 litros fueron perfundidos en una hora en el sexto día. La velocidad de ingesta de oxígeno medida como la disminución del nivel de oxígeno disuelto (porcentaje de saturación de aire, DO %) por minuto (DO % disminución/min) alcanzaron 1,65%/min en el día seis. Los resultados del examen microscópico al sexto día del cultivo de las células 293 en los microvehículos Cytodex 3 en el bioreactor de 200 L son proporcionados en la Tabla 14.

TABLA 14 Resultados del examen microscópico en el sexto día del cultivo de las células 293 en los microvehículos en el bioreactor de 200 L

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D. Infección de las células 293 en el bioreactor de producción de 200 L

El cultivo del bioreactor fue inoculado con el virus el día 6. El inóculo viral había sido almacenado congelado a -80°C. Un volumen de 45 ml del inóculo viral, 2-2, fue descongelado en un baño de agua a 20-25°C. La cantidad total de virus añadida al tanque fue de 1,1 x 10^{13} de partículas virales como medidas por el ensayo Resource-Q HPLC. El inóculo viral fue mezclado y colocado en un frasco con un litro del Medio 4 (293-1-R07 Dulbecco's modified Eagle's médium con L-glutamina y bicarbonato sódico (3,7 g/l)). La disolución viral fue filtrada a través de una cápsula de cultivo Maxi Gelman en un frasco de adición de cinco litros. La suspensión viral fue añadida al bioreactor de producción de 200 L con conexiones estériles hechas por medio de tubos welter. Las condiciones de operación del bioreactor de producción después de la infección son proporcionadas en la tabla 15.

TABLA 15 Condiciones de operación del bioreactor de producción después de la infección

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Tres días después de la infección, el 89% de los microvehículos no se habían unido a las células y la velocidad de ingesta de oxígeno medida era de 0,53%/min. La concentración total de células infectadas presente en el caldo de cultivo de cultivo del sobrenadante fue de 1,0 x 10^{6} células/ml. El volumen total en el bioreactor fue de 162 litros. El bioreactor fue recogido en este momento.

E. Operaciones de recuperación

Un volumen de 400 litros del tampón de recuperación recogido fue preparado y filtrado a través de un filtro Pall Ultipor N66 (tamaño del poro 0,2 micras) y alicuotado en vasos estériles de la siguiente manera. Se prepararon tres alícuotas de 210 litros, 130 litros y 50 litros. El volumen de 210 litros fue usado para lavar el bioreactor y para la operación de columna de lecho fluido. La alícuota de 130 litros fue usada durante la microfiltración. La alícuota de 50 litros fue utilizada durante el proceso de ultrafiltración.

F. Separación de las células de los microvehículos usando la columna de lecho fluido

El lecho fluido fue desinfectado usando una disolución cáustica (hidróxido sódico 0,1 N). Un adaptador en T fue conectado para el puerto de recogida del bioreactor. En un lado del adaptador T, se conectaron una manguera sanitizadora (15,9 mm id) y una válvula a la columna de lecho fluido. Una bomba peristáltica fue colocada en esta línea (Watson Marlon Model 604S). El segundo lado del adaptador T fue conectado a una manguera sanitizadora (15,9 mm id) y a una válvula que conducía al tanque del tampón. La salida de la columna de lecho fluido, a través de la cual pasó el caldo de cultivo que contenía las células y los virus, fue conectada a un tanque usado como vaso con recirculación para microfiltración.

El caldo de cultivo del bioreactor fue pasado a través de la columna del lecho fluido a un caudal diana de 2-3 litros por minuto. El caudal fue controlado con la bomba peristáltica. La agitación fue mantenida en el bioreactor. Cuando el volumen del bioreactor fue menor de 100 litros el filtro de centrífuga fue cerrado. Cuando el volumen del bioreactor fue menor de 30 litros, el agitador fue parado. Después de que los contenidos del bioreactor fueron procesados a través de la columna de lecho fluido, el bioreactor fue lavado con 90 litros del tampón de recuperación del cultivo. Este material de lavado fue procesado a través de la columna de lecho fluido. Al final del proceso, los microvehículos permanecieron en la columna de lecho fluido y fueron descartados. Los datos son proporcionados en la
Tabla 16.

TABLA 16 Datos de una operación de columna de lecho fluido

22

G. Microfiltración del microvehículo-caldo de cultivo aclarado- que lisa las células infectadas y tratamiento con endonucleasa BENZONASE™

El material de inicio para el proceso de microfiltración fue el caldo de cultivo de la columna de lecho fluido que fue aclarado de los microvehículos y que contenía células y virus. Durante la etapa de microfiltración, las células fueron lisadas debido a la velocidad de corte usada, el caldo de cultivo fue aclarado de restos celulares mayores de 0,65 micrones y los ácidos nucleicos residuales de las células lisadas fueron digeridos por una preparación enzimática de endonucleasa BENZONASE™ (por ejemplo, 0,5 unidades de millón por lote de 200 L).

La unidad de microfiltración fue un sistema Prostak (Millipore). Contenía un Durapore, tamaño de poro 0,65 micrones, hidrofílico, membrana (número de catalogo SK2P446EO) con un área superficial de 5,02 metros cuadrados (54 pies cuadrados). Las líneas de alimentación y retenidos de la unidad del filtro Prostak fueron conectadas al vaso con recirculación para microfiltración que contenía el microvehículo-caldo de cultivo aclarado de la columna de lecho fluido. Una línea usada para recoger el tampón de recuperación del cultivo, en el vaso con recirculación para microfiltración fue conectada. La línea de líquido permeado de la unidad de Prostak fue conectada al vaso con recirculación para ultrafiltración. La temperatura del caldo de cultivo fue mantenida en el intervalo de entre 25-35°C. Cuando el caldo de cultivo que se alimentaba en la unidad Prostak fue reducido a un volumen de 10 a 30 litros en el vaso con recirculación para microfiltración, 50 litros del tampón de recuperación del cultivo fueron añadidos al vaso y la microfiltración continuó. Esta etapa fue repetida una vez. La microfiltración continuó hasta que el volumen en el vaso con recirculación para microfiltración fue reducido de 10 a 30 litros. En este momento, 0,5 unidades de millón de la endonucleasa BENZONASE™ fueron añadidas al caldo de cultivo aclarado en el vaso con recirculación para microfiltración. Los contenidos del vaso fueron mezclados bien y el caldo de cultivo fue mantenido durante dos horas antes de que comenzara la ultrafiltración. Los datos son proporcionados en la
Tabla 17.

TABLA 17 Datos de una operación de microfiltracion

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H. La ultrafiltración del caldo de cultivo para concentrar el virus con la diafiltración para realizar el cambio de tampón

El material de inicio para el proceso de ultrafiltración en el vaso con recirculación para microfiltración fue el caldo de cultivo aclarado tratado con la endonucleasa BENZONASE™, del permeado de la microfiltración. La unidad de ultrafiltración fue un sistema Pellicon (Millipore). Contenía un peso molecular nominal límite de 1 millón, una membrana de celulosa regenerada Pellicon II (número de catalogo P2C01MC05) con una superficie de 3,72 metros cuadrados (40 pies cuadrados). Las líneas de alimentación y de retenido de la unidad de Pellicon fueron conectadas al vaso con recirculación para microfiltración. La línea de líquido permeado de ultrafiltración fue conectada al vaso de residuos. Un vaso que contenía el tampón de recuperación del cultivo (base Tris 50 mM, cloruro sódico 150 mM, hexahidrato de cloruro de magnesio 2 mM, y sacarosa 2%) fue conectado al vaso con recirculación para ultrafiltración. Cuando el volumen retenido para ultrafiltración alcanzó de 5 a 10 litros, se hizo una adición de 15 litros del tampón de recuperación del cultivo y la ultrafiltración fue continuada. Esta etapa fue repetida una vez. La ultrafiltración fue continuada hasta que el volumen retenido fue menor de 5 a 10 litros. El retenido de la ultrafiltración contenía el virus concentrado. El retenido fue recogido de la unidad de Pellicon. Un chorro de 3 a 6 litros del tampón de recuperación del cultivo fue usado para recoger todo el material de la unidad Pellicon. Este material a chorro fue añadido al caldo de cultivo retenido del ultrafiltro. Esto fue filtrado a través de un filtro de tamaño de poro de 0,45 micrones Millipore, Durapore, (número de catálogo CVHL71PP3) a una bolsa estéril. El material en la bolsa estéril fue almacenado congelado a -80°C. Los datos son proporcionados en la Tabla 18.

TABLA 18 Datos de una operación de ultrafiltración

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I. Comentarios generales

Todos los cultivos de células 293 en los frascos de cultivo tisular T75, T500 y CELL FACTORY™ fueron cultivados en Medio 1 en un incubador a 37°C, a una humedad del 100% y a una atmósfera de CO_{2} del 5%. Todas las operaciones al descubierto fueron realizadas asépticamente bajo una campana de bioseguridad (flujo laminar). Las cargas del medio y adiciones fueron realizadas a través de un filtro en línea, PALL Ultipor N66, de tamaño de poro 0,2 micrones instalado en el puerto de alimentación del bioreactor que fue esterilizado al vapor durante 30 minutos a 121°C. Todas las demás adiciones a los bioreactores fueron realizadas cada una usando un frasco Erlenmeyer estéril con un tubo PHARMED™ que fue asépticamente conectado entre el bioreactor y el frasco de adición por medio de un tubo welter. Todos los tampones usados en el proceso de recuperación fueron filtrados a través de un filtro en línea, PALL Ultipor N66, de tamaño de poro 0,2 micrones (SLK7002NFP) instalado en un puerto del vaso receptor. Nótese que para las operaciones de microfiltración se pueden usar bien una membrana hidrofílica o bien una membrana hidrofóbica.

Claims

1. Un método para la separación de las células de los microvehículos en los que habían sido cultivadas pero de los que se han separado, que comprendía la introducción de una suspensión acuosa de células y microvehículos a través de una entrada en un dispositivo de separación, dispositivo que comprende:

(a) una entrada

(b) una columna;

(c) una salida para la recogida de las células y la disolución acuosa; y

(d) una pantalla de rejilla;

en la que los microvehículos son retenidos en la suspensión mediante un flujo ascendente en el dispositivo de separación y son retenidos en el dispositivo de separación por una pantalla de rejilla, y en el que las células y la disolución acuosa son recogidas a través de la salida.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la entrada está situada al final del dispositivo; en el que la columna tiene una sección superior cilíndrica y una sección inferior cónica, en el que las paredes del cono están a un ángulo que permite a las bolas que se fijan en las paredes moverse hacia abajo hacia la entrada; en el que la salida está situada en lo alto del dispositivo; y en el que la pantalla de rejilla está colocada en el extremo superior de la columna.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el flujo ascendente es generado mediante bombeo de la disolución acuosa a través de la entrada, en el que la entrada está situada al final del dispositivo y la salida está situada en lo alto del dispositivo.

4. El método de la reivindicación 2, en el que el flujo hacia arriba es generado mediante bombeo de la disolución acuosa a través de la entrada.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la columna comprende una sección superior y una sección inferior, la sección inferior comprende alrededor del 20 al 50% del volumen de la columna y contiene la entrada.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la sección inferior es cónica.

7. El método de las reivindicaciones 2 ó 6, en el que el ángulo de la sección inferior es alrededor de 15 a 45 grados.

8. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el caudal en el dispositivo de separación es alrededor de 1 a 3 cm/min.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células y el medio acuoso recogidos son sometidos a microfiltración.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la microfiltración comprende una velocidad de fricción de alrededor de 2.000 - 10.000 l/seg.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la suspensión acuosa de las células y los microvehículos comprenden además un virus propagado en las células.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células son células 293.

13. El método de las reivindicaciones 11 ó 12, en el que el virus es un adenovirus.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones de la 11 a la 13, en el que el virus es un virus recombinante.

15. El método de la reivindicación 14, para producir un virus recombinante para terapia génica.

16. El método de la reivindicación 15, en el que el método comprende además una etapa de liberación de virus de las células cultivadas.