ES2273420T3 - Electrodos para la medicion de analitos en pequeños volumenes de muestras. - Google Patents

Abstract

Dispositivo concebido para el análisis electroquímico de un analito en una muestra de líquido, comprende: un sustrato no conductor (1), una capa conductora, depositada sobre el sustrato, en dos partes (2a,2b) que definen un espacio no conductor (8) entre dichas partes, un reactivo (5) específico para el analito y que cubre la capa conductora por un lado del espacio, un electrodo de referencia (3) sobre la capa conductora del otro lado del espacio, una capa de espaciamiento (4) depositada por encima de la capa conductora, una malla monofilamento (6) revestida por un tensioactivo o un agente caotrópico, estando la malla colocada por encima del reactivo, del electrodo de referencia y de la capa de espaciamiento, y una segunda capa no conductora (7), adherida a la capa de malla, pero no coextensiva con ella, con lo que se proporciona un área de aplicación de muestra (9) sobre la malla.

Description

Electrodos para la medición de analitos en pequeños volúmenes de muestras.

Campo técnico

La presente invención se refiere a dispositivos de electrodo los cuales son capaces de aceptar pequeños volúmenes de muestras y a su utilización en un procedimiento de prueba para la detección y la cuantificación de especies de prueba presentes en pequeños volúmenes de muestras.

Antecedentes de la invención

Se han descrito diversos dispositivos capaces de aceptar pequeños volúmenes de un material de muestra y que permiten analizar los analitos presentes en la muestra, tanto mediante procesos de análisis ópticos como eléctricos. En particular, la utilización y la construcción de cámaras de muestra, que pueden ser rellenadas por la acción de la capilaridad, han sido descritas tanto en patentes como en la literatura científica. Véanse por ejemplo los documentos EP-A-0170375 y US-A-5141868.

Los dispositivos conocidos de ese tipo pueden comprender electrodos depositados en un substrato no conductor, recubierto con un sistema reactivo específico para el analito de interés, y alojado, dentro de una cavidad cuyas dimensiones son lo suficientemente pequeñas como para permitir la introducción de una muestra por la acción de la capilaridad. La muestra es retenida en la proximidad de los electrodos y los electrodos están configurados de tal forma que facilitan la medición de las propiedades eléctricas específicas de la muestra.

Los dispositivos de ese tipo adolecen de numerosos inconvenientes, en particular la necesidad de controlar las dimensiones de la cavidad con límites muy estrechamente definidos. Exceder estas tolerancias de fabricación no dejará que la muestra entre en la cavidad por la acción de la capilaridad.

Adicionalmente, cuando se introducen en la cavidad fluidos viscosos de muestra, tales como sangre, la cámara se llenará de forma relativamente lenta con la muestra, retrasando de ese modo el tiempo necesario para completar el análisis. Las variaciones en la viscosidad de la muestra y por lo tanto las características de la tensión superficial de la muestra resultan en variaciones en el tiempo de llenado, lo cual no sólo compromete el tiempo total del análisis sino que, más importante aún, conduce a imprecisiones en el resultado analítico, puesto que el tiempo durante el cual se expone la muestra al reactivo del analito específico está sujeto a variaciones.

El documento WO-A-9730344 da a conocer un dispositivo de electrodo el cual incluye una malla de poliéster adaptada para guiar la muestra al electrodo de referencia. Este dispositivo requiere que el reactivo incluya un relleno provisto de zonas superficiales tanto hidrofóbicas como hidrofílicas, a fin de evitar problemas asociados con las variaciones en la manipulación de muestras y que sea independiente del hematocrito de la muestra, para la prueba de glucosa.

El documento US-A-5 628 890 da a conocer un dispositivo para utilizarlo en el análisis electroquímico de un analito en una muestra líquida y comprende:

Un substrato no conductor;

Una capa conductora, depositada sobre el substrato, en dos partes definiendo un espacio no conductor entre ellos;

Un reactivo específico del analito recubierto sobre la capa conductora en un lado del espacio;

Una capa separadora depositada sobre la capa conductora;

Una malla de monofilamento recubierta con un agente tensoactivo, estando depositada la malla sobre el reactivo, el electrodo de referencia y la capa separadora; y

Una segunda capa no conductora adherida a la capa de malla, pero no coextensiva con la misma, proporcionando de ese modo un área de aplicación de la muestra.

Según la invención

Según la presente invención, un dispositivo, el cual es capaz de realizar la medición electroquímica de los niveles de los analitos presentes en un pequeño volumen de una muestra fluida, comprende una capa conductora recubierta con un reactivo específico del analito y depositado en un substrato no conductor, una capa separadora depositada sobre el substrato no conductor mediante impresión de capa gruesa, un material de malla de monofilamento recubierto con un agente tensoactivo y un reactivo caotrópico, estando superpuesta la malla sobre la capa separadora y un segundo substrato no conductor adherido a la capa de la malla. El dispositivo, por lo tanto, es de construcción de múltiples capas y comprende dos superficies separadas por una capa separadora impresa y que forma una cavidad o área la cual está abierta en un extremo para la introducción de la muestra. Esta cavidad o área está llena con un material de malla que se extiende más allá del segundo substrato y forma un área de aplicación de la muestra en un borde de la
malla.

Un dispositivo según la presente invención puede ser fabricado y utilizado mediante las etapas siguientes:

(a)

depositar una capa conductora de carbono y grafito, en un aglutinante de polímero, sobre un primer substrato no conductor;

(b)

depositar una segunda capa conductora que consiste en plata/cloruro de plata para que funcione como un electrodo de referencia/contador adyacente, pero no continuo, con la primera capa conductora;

(c)

recubrir la superficie de la primera capa conductora con un reactivo o mezclas de reactivos los cuales reaccionan específicamente con un analito o con analitos en un material de muestra;

(d)

formar una capa separadora mediante capa gruesa sobre la parte superior del primer substrato no conductor a fin de dejar una parte expuesta de cada una de las capas conductoras primera y segunda;

(e)

colocar un material de malla recubierta sobre la parte superior de la capa separadora y fijar permanente la misma a la capa separadora;

(f)

colocar un segundo substrato no conductor sobre la parte superior del material de la malla y fijar permanente el mismo de modo que se deje expuesta un área extendida de la malla;

(g)

aplicar una muestra al área extendida de la malla a fin de llenar o inundar el área de detección del dispositivo, humedeciendo la malla con la muestra; y

(h)

cuantificar el analito en la muestra mediante la reacción con el reactivo en la primera capa conductora.

El dispositivo de electrodo permite la aplicación de un pequeño volumen de muestra (típicamente inferior a 2 \muL) a la extensión de la malla. Esto es seguido por la inundación el área de detección del dispositivo con la muestra, llevándola a entrar en contacto íntimo con los electrodos de medición. La cavidad también se puede llenar tanto colocando una gota del líquido de la muestra sobre la parte superior de la malla expuesta en el borde de la cavidad como haciendo entrar en contacto el borde de la cavidad con la muestra.

Descripción de la invención

Los dibujos adjuntos se proporcionan únicamente a título ilustrativo. En los dibujos:

La figura 1A es una vista lateral esquemática de un dispositivo sensor que constituye una forma de realización de la presente invención; y

La figura 1B es una vista en planta de parte de la forma de realización representada en la figura 1A.

Con más detalle, los dibujos muestran una lámina no conductora 1 y, depositado sobre la misma, un electrodo conductor en dos piezas 2a y 2b. La pieza 2a transporta un electrodo de referencia/contador 3 y la pieza 2b transporta una capa de reactivo 5. Las piezas 2a y 2b también transportan una capa separadora 4 (ésta y otros componentes descritos más adelante no se representan en la figura 1B, la cual se proporciona meramente para representar la configuración eléctrica). Un material de malla 6 se deposita sobre el electrodo 3, el separador 4 y la capa de reactivo 5. Está provista una cinta 7 sobre el material de malla 6.

Un área de detección del dispositivo 8 está definida entre las partes respectivas de la capa conductora y por lo tanto entre el reactivo y el electrodo de referencia. El material de malla no es coextensivo con la cinta 7, definiendo de ese modo un área de aplicación de la muestra 9. Al utilizarlo, la muestra aplicada al área 9 es transportada por la malla 6, de forma que inunda las áreas 3, 5 y 8. Ahora se podrá determinar electroquímicamente la presencia de un analito en la muestra.

Descripción de la invención

El material de malla está interpuesto entre la capa separadora (en el primer substrato) y el segundo substrato y sirve para reducir la tensión superficial y la viscosidad de la muestra, en virtud del agente humectante recubierto sobre su superficie. La aplicación de la muestra en la parte extendida de la malla, resulta en la disolución del material de recubrimiento de la malla en la muestra, reduciendo la tensión superficial de la muestra y permitiendo que la muestra fluya dentro de la cavidad del dispositivo. La muestra no entrará en la cavidad del dispositivo en ausencia de un reactivo humectante recubierto sobre la malla. Alternativamente, en muestras complejas, tal como por ejemplo sangre, en donde la medición de un analito específico se ve afectada negativamente por la presencia de células enteras, por ejemplo empobreciendo la superficie del electrodo, la malla puede estar recubierta con un agente que lisa las células en contacto; esto tiene la ventaja añadida de reducir la viscosidad de la muestra al mismo tiempo que elimina la interferencia de la célula completa.

El sistema puede estar depositado como un electrodo único, un micro electrodo o como una matriz de electrodos. El electrodo se puede utilizar conjuntamente con electrodos de referencia/contadores depositados en el mismo substrato.

El material del substrato no conductor puede ser una lámina de, por ejemplo, poliéster, policarbonato, cloruro de polivinilo, polipropileno de alta densidad o polipropileno de baja densidad. En una forma de realización preferida, un material de la lámina de poliéster se estabiliza por calor antes de la aplicación de las capas conductoras, para conferir estabilidad dimensional al material de poliéster antes del procesado.

La capa conductora preferentemente contiene grafito, carbono y un aglutinante de polímero. Por ejemplo, el componente de grafito tiene un tamaño promedio de las partículas de hasta 20 \mum, por ejemplo de 1 a 20 \mum, un área superficial típica de hasta 50 m^{2}/g, por ejemplo de 1 a 50 m^{2}/g. Es inherentemente conductor, puede ser derivado de cualquier fuente natural o sintéticamente producida. El componente de carbono preferentemente tiene un tamaño promedio de las partículas inferior a 1 \mum, por ejemplo de 5 a 70 nm, y un área superficial típica inferior a 150 m^{2}/g. Al igual que el componente de grafito, también es inherentemente conductor.

El aglutinante de polímero tanto puede ser termoestable como termoplástico. Puede derivar de cualquiera de las diversas familias de polímeros, incluyendo cloruro de vinilo, acetato de vinilo, alcohol de vinilo (y copolímeros de cloruro de vinilo, acetato y alcohol), hidrocarbonos, celulosas de etilo y metilo, epoxis, poliésteres, alcídicos y polímeros conteniendo grupos funcionales reactivos tales como grupos carboxilo, hidróxilos, amina, tiol, éster, epóxido y amida, los cuales permiten la reticulación del polímero.

El material de electrodo conductor se puede depositar en el substrato no conductor mediante un proceso de impresión convencional, por ejemplo impresión de capa gruesa (también conocido como impresión con retícula), litografía, impresión tipográfica, deposición por vapor, recubrimiento por rociado, impresión por chorro de tinta, impresión por láser, recubrimiento por rodillo o deposición al vacío. A continuación de la deposición del material conductor del electrodo, el aglutinante de polímero se puede estabilizar o curar mediante una serie de procesos convencionales, incluyendo el secado por aire forzado, el secado por aire forzado a elevadas temperaturas, irradiación de infrarrojos, irradiación de ultravioletas, irradiación por haz de iones o irradiación de rayos gamma. Todos estos procesos dan como resultado diversos grados de reticulación de las moléculas individuales del aglutinante de polímero. La utilización de radiación ultravioleta requiere la inclusión de un reactivo fotosensible en el material conductor del electrodo, para iniciar la reacción de reticulación del polímero.

El reactivo colocado en la parte superior de la primera capa conductora está caracterizado porque contiene todos los componentes en un estado sólido necesario para la medición de la concentración del analito en una muestra. Tales componentes incluyen enzimas, cofactores de enzimas, coenzimas, cosubstratos, anticuerpos o bien otros asociados, DNA o RNA, asociados de oxidación reducción, tampones, ionóforos y sales.

El reactivo también puede sostener matrices, aglutinantes y estabilizadores para los otros componentes. Por ejemplo, matrices adecuadas incluyen partículas de grafito, carbono, sílice, vidrio, látex o cloruro de polivinilo. Aglutinantes adecuados incluyen alcohol de polivinilo, acetato de polivinilo, pirrolidina de polivinilo, proteínas, celulosa y acetato de celulosa. Estabilizadores adecuados incluyen alcoholes, ésteres, proteínas, hidrolisatos de proteínas y carbohidratos tanto simples como complejos.

El reactivo puede comprender una serie de capas individualmente aplicadas, cada una de ellas conteniendo componentes específicos. Su composición es de tal tipo que sufre por lo menos una disolución parcial cuando entra en contacto con la muestra de
fluido.

El reactivo se puede depositar en la primera capa conductora mediante un proceso de deposición convencional, por ejemplo impresión de capa gruesa (también conocida como impresión con retícula), litografía, impresión tipográfica, deposición por vapor, recubrimiento por rociado, impresión por chorro de tinta, impresión por láser, recubrimiento por rodillo o deposición al vacío. También se pueden utilizar combinaciones de estos procesos de deposición para construir una capa múltiple. A continuación de la deposición del reactivo (o después de la deposición de cada capa individual), la capa se puede estabilizar o curar mediante una serie de procesos convencionales incluidos aquellos descritos antes, a fin de conseguir la reticulación de las moléculas individuales del aglutinante de polímero.

La capa separadora se puede depositar sobre el primer substrato no conductor mediante deposición de capa gruesa convencional y se puede estabilizar o curar mediante una serie de procesos convencionales, incluidos aquellos descritos antes, a fin de reticular las moléculas individuales del aglutinante de polímero. El grosor de la capa separadora se puede controlar mediante una serie de parámetros, incluyendo las condiciones de impresión (presión, velocidad, tensión de la retícula y grosor de la emulsión) y las propiedades de la tinta, tales como el contenido en sólidos y la viscosidad.

La capa de malla preferentemente es un material tejido de monofilamento sintético. Puede estar fabricado a partir de poliéster o de nylon. La malla está recubierta con un material tensoactivo, un detergente o un agente de humectación o lisante. Ejemplos incluyen fluortensoactivos, tensoactivos no iónicos, tensoactivos iónicos, tensoactivos zwitteriónicos, colato de saponina y sodio.

Los electrodos de la invención tienen diversas características deseables. Por ejemplo, los dispositivos requieren un volumen pequeño, típicamente inferior a 2 \muL, de la muestra tal como por ejemplo sangre completa, plasma, suero, fluido intersticial, sudor o saliva. Cuando la muestra llena la cavidad de la muestra, una película muy delgada de la muestra se esparce a través de la superficie del reactivo depositado, haciendo máximo el contacto con el reactivo y permitiendo que el reactivo sea disuelto rápidamente en la muestra. Esto permite lograr rápidamente en el estado estable.

En una forma de realización preferida del dispositivo, la cavidad está colocada en el extremo del borde del dispositivo. Este dispositivo puede ser llenado rápidamente con la muestra mediante el contacto del borde de la tira de la prueba con la muestra. En otra forma de realización preferida, la cavidad puede estar colocada a entre 0 y 2 mm del borde del dispositivo, exponiendo de ese modo un área de la tira de la prueba la cual puede arañar a lo largo de una superficie (como por ejemplo un área pinchada de la piel), a fin de recoger la muestra.

Los electrodos de la invención se pueden utilizar para el análisis de analitos/especies los cuales se pueden oxidar o reducir directamente por la extracción o la adición de electrones en el electrodo; analitos/especies los cuales se pueden convertir rápidamente, mediante una enzima o una serie de enzimas, en un producto el cual se puede oxidar o reducir directamente por la extracción o la adición de electrones en el electrodo; analitos/especies los cuales se pueden convertir en un producto mediante una enzima, con la concomitante oxidación o reducción de un cofactor de enzima en donde el cofactor se puede oxidar o reducir directamente entonces mediante la adición o extracción de electrones; y analitos/especies los cuales se pueden convertir en un producto mediante una enzima la cual está en contacto íntimo con la superficie del electrodo, de tal forma que la enzima es capaz de pasar o de recibir electrones directamente del electrodo. El dispositivo novedoso es particularmente adecuado para utilizarlo como un sensor de glucosa. En este caso, el reactivo preferentemente es glucosa deshidrogenasa; esto puede proporcionar una lectura de la glucosa que es sustancialmente independiente del hematocrito de la muestra.

El siguiente ejemplo ilustra la invención.

Ejemplo

Un material de tinta conductora se imprime sobre un material de lámina de poliéster no conductor
(125 \mum de grueso) mediante un proceso de impresión con retícula. El material de tinta conductora consiste en una mezcla de partículas de grafito (el tamaño promedio de la partícula de 1 \mum, con un área superficial de 15 m^{2}/g), partículas de carbono conductor (el tamaño promedio de la partícula de 40 nm, con un área superficial de 100 m^{2}/g), y un aglutinante copolímero de cloruro de polivinilo/acetato de vinilo en un disolvente orgánico. Después de la deposición de la tinta conductora, los disolventes se extraen en un horno de aire forzado, mientras la aplicación de una temperatura elevada inicia la reticulación química del aglutinante de polímero por la amina bifuncional.

Un electrodo de plata/cloruro de plata, de referencia/contador impreso con retícula está colocado adyacente a la capa de carbono conductor en el soporte de poliéster. Una capa separadora es entonces impresa con retícula de tal forma que deja expuestos parte del electrodo de carbono conductor y todo el electrodo de referencia/contador.

Se prepara una mezcla de reactivo de múltiples capas, específico para la medición de glucosa. Comprende 2,6-diclorofenolindofenol, azul Nilo, azul mendola o cualquier otro medio adecuado para el cofactor de enzima NADH, depositado sobre la capa expuesta de carbono conductor/grafito a partir de una solución de agua mediante pipeta y se seca para dejar una película de mediador recubierta sobre la capa de carbono conductor/grafito. Se deposita una segunda capa mediante impresión por capa gruesa que consiste en una mezcla de grafito, NAD^{+}, sales de tampón, tensoactivos, estabilizadores y modificadores reológicos. Esto entonces se seca. Se deposita una tercera capa mediante pipeta, que consiste en una solución acuosa de glucosa deshidrogenasa (NAD-dependiente), sales de tampón y estabilizadores. Esto entonces se seca.

Un material de malla de monofilamento recubierto con tensoactivo se coloca en la parte superior de la capa separadora y se fija mediante deposición por capa gruesa de una segunda capa separadora. Una segunda capa no conductora, que comprende material de cinta de poliéster de 75 \mum de grueso recubierto en un lado con un adhesivo sensible a la presión, se coloca en la parte superior de la malla de monofilamento de tal modo que deja expuesta un área extendida de la malla. El área expuesta actúa como la zona de aplicación de la muestra.

Cuando se aplica una diferencia de potencial adecuada entre los electrodos de carbono conductor y de referencia de cloruro de plata, el dispositivo de electrodo puede ser utilizado para la medición de la glucosa en una muestra de sangre, utilizando técnicas electroquímicas normales tales como la cronoamperometría. La glucosa se convierte en gluconolactona con la concomitante conversión de NAD* en NADH por la acción de la deshidrogenasa de glucosa NAD*-dependiente, y el NADH se reoxida en NAD* mediante el compuesto mediador. El compuesto mediador a su vez se reoxida en la superficie del electrodo y la corriente producida es proporcionar a la concentración de glucosa en la muestra.

Claims (8)

1. Dispositivo para su utilización en el análisis electroquímico de un analito en una muestra de líquido, el cual comprende:

un substrato no conductor (1);

una capa conductora, depositado sobre el substrato, en dos piezas (2a, 2b), que definen un espacio no conductor entre ellas;

un reactivo específico del analito (5) recubierto sobre la capa conductora, en un lado del espacio;

un electrodo de referencia (3) sobre la capa conductora, en el otro lado del espacio;

una capa separadora (4) depositada sobre la capa conductora;

una malla de monofilamento (6) recubierta con un tensoactivo o un agente caotrópico, estando depositada la malla (6) sobre el reactivo (5), el electrodo de referencia (3) y la capa separadora (4); y

una segunda capa no conductora (7) adherida a la capa de malla (6) pero no coextensiva con ella, proporcionando de ese modo un área de aplicación de la muestra (9) en un borde de la malla (6).

2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el reactivo está libre de relleno presentando unas zonas superficiales tanto hidrofóbicas como hidrofílicas.

3. Dispositivo según la reivindicación 1 ó 2, en el que el analito es glucosa y el reactivo es deshidrogenasa de glucosa.

4. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la malla está tratada con un tensoactivo.

5. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la malla está adicionalmente recubierta con un agente lítico de célula.

6. Dispositivo según cualquiera que las reivindicaciones anteriores en el que la capa conductora comprende partículas de grafito, partículas de carbono y un aglutinante de polímero.

7. Dispositivo según la reivindicación 6, en el que las partículas de grafito tienen un tamaño promedio de 1 a 20 \mum y un área superficial de 1 a 50 m^{2}/g y las partículas de carbono tienen un tamaño promedio de 5 a 70 nm y un área superficial inferior a 150 m^{2}/g.

8. Procedimiento para el análisis electroquímico de un analito en una muestra de líquido, el cual comprende la aplicación de la muestra al área de aplicación en un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y la cuantificación del analito por la reacción con el reactivo.