ES2273435T3

ES2273435T3 - Regulacion de la secrecion de las proteinas.

Info

Publication number: ES2273435T3
Application number: ES98941592T
Authority: ES
Inventors: Albert Tauler; Ian Fraser Pryme; John Edward Hesketh
Original assignee: UNI TARGETING RESEARCH AS; UniTargetingResearch AS
Current assignee: UNI TARGETING RESEARCH AS; UniTargetingResearch AS
Priority date: 1997-09-05
Filing date: 1998-09-04
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2018-09-04
Also published as: DE69836336T2; JP4436563B2; DE69836336D1; JP2001515725A; AU8991098A; EP1009834B1; GB9718908D0; DK1009834T3; WO1999013090A1; US6881832B1; EP1009834A1; ATE344327T1

Abstract

Una molécula de ARN codificada por un péptido señal de mamífero unido de manera operacional a una proteína intracelular de mamífero, dicho péptido señal permite que dicha proteína sea sintetizada sobre el retículo endoplasmático de una manera tal que esta pueda ser secretada, la molécula que comprende una región 3'' no-traducida del ARNm para una proteína secretada en su extremo 3''.

Description

Regulación de la secreción de las proteínas.

La presente invención se relaciona con la secreción de las proteínas a partir de células de mamífero.

Las líneas celulares de mamífero cada vez más se están utilizando para producir comercialmente cantidades significantes de proteínas recombinantes en fábricas de células y en animales transgénicos. Hay numerosos ejemplos donde las proteínas secretadas normalmente están siendo producidas de esta manera (Bock et al 1982, Michel et al 1985, Lin et al 1986, Devlin et al 1987, Shak et al 1990), así como un número de vectores comerciales para la secreción de proteínas heterólogas. Sin embargo tales sistemas han sido usados ampliamente para la producción de proteínas secretadas en cambio de las proteínas que normalmente son intracelulares y la secreción de proteínas intracelulares en sistemas de expresión de mamífero es cada vez más una meta importante en la investigación biotecnológica (James y Simpson, 1996). Los presentes inventores solamente son concientes de un papel que describe la secreción exitosa de una proteína intracelular a partir de células de mamífero (Lee et al, 1996). Esta proteína (sialiltransferasa), no obstante, normalmente se sintetiza en el retículo endoplasmático (ER) y la secreción exitosa no depende de una redirección inicial del ARNm.

Es bien establecido que los mARNs específicos se traducen en sitios subcelulares específicos, por ejemplo la membrana y las proteínas secretadas se traducen sobre el retículo endoplasmático rugoso en asociación con polisomas unidos a la membrana (Blobel y Dobberstein, 1975), y los mARNs para las proteínas tales como c-myc (Hesketh et al, 1994, metalotioneína I (Mahon et al 1995), proteínas ribosomales y ciclina A (Hovland et al, 1995) se traducen en asociación con polisomas unidos al citoesqueleto (para las revisiones ver Hesketh 1996, Hovland et al 1996). Actualmente parece que el mecanismo sintético de la proteína está dividido en compartimientos dentro de al menos tres poblaciones de polisomas - libres (FP), polisomas unidos al citoesqueleto (CBP) y unidos a la membrana (MBP). Estas poblaciones diferentes de mARNs se pueden separar utilizando una extracción detergente/sal secuencial (Vedeler et al 1991). Diferentes señales orientan estos mARNs a su sitio para la traducción. En el caso de las membranas y proteínas secretadas ha sido bien establecido que el péptido señal se requiere para dirigir el complejo ribosoma-ARNm al retículo endoplasmático aunque una evidencia reciente ha mostrado que para los mARNs localizados en el citoplasma o asociados con el citoesqueleto existen señales en la región 3' no traducida (Kislauskis et al 1994, Hesketh et al 1994, Wilson et al 1995, Veyrune et al 1996).

De acuerdo con la presente invención se proporciona una molécula de ARN que codifica un péptido señal de mamífero unido de manera operativa a una proteína intracelular de mamífero, dicho péptido señal permite que dicha proteína sea sintetizada sobre el retículo endoplasmático de una manera así que esta pueda ser secretada, la molécula que comprende una región 3' no-traducida a partir del ARNm para una proteína secretada en su extremo 3'.

Sin ser limitado por la teoría, se cree que el péptido señal se proporciona inicialmente y después la traducción del ARNm se detiene o retrasa para permitir que el péptido señal se una a una partícula de reconocimiento señal y conduzca los ribosomas asociados con el ARNm al retículo endoplasmático. La traducción luego inicia otra vez/acelera para permitir que el resto de la proteína sea traducida.

El término "proteína" se utiliza en esta en un amplio sentido para incluir las fracciones que comprenden aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Por consiguiente esto incluye péptidos y polipéptidos.

La presente invención es ampliamente aplicable. En principio la secuencia de cualquier péptido señal de mamífero presente de manera natural que normalmente se asocia con una proteína secretada a partir de células de mamífero pueden ser utilizados para diseñar apropiadas moléculas de ARN codificadas por un péptido señal de mamífero para utilizar en la presente invención.

Las variantes de tales péptidos señal presentes de manera natural que se puedan utilizar para secretar dicha proteína también se pueden utilizar y, para los propósitos de la presente invención, se estiman para estar dentro del alcance del término "péptido señal de mamífero". Se prefieren las variantes que tienen por lo menos 50% de identidad de la secuencia del aminoácido con secuencias del péptido señal de un mamífero presente de manera natural. Más preferiblemente el grado de identidad de la secuencia es por lo menos 75%. Las identidades de la secuencia de al menos 90% o de al menos 95% son más preferidas. Para los propósitos de la presente invención la identidad de la secuencia se puede determinar utilizando el programa "BESTFIT" de Wisconsin Sequence Analysis Package GCG
8.0.

Las secuencias del péptido señal preferidas pueden ser a partir de una hormona del crecimiento, una proteína de leche o de albúmina, tal como albúmina de rata (Database Accession Number J00698), hormona del crecimiento bovina, lactoalbúmina y otras proteínas de la leche.

Una persona de habilidad es capaz de determinar las secuencias señal de muchas proteínas a partir de una base de datos de secuencias o publicaciones disponibles. Aún si estas secuencias no son publicadas, por ejemplo, los estudios de homología de la secuencia se pueden usar para comparar una secuencia de aminoácido candidata con secuencias de aminoácidos de las secuencias señal conocidas.

En la presente invención la posible competición entre una secuencia señal que dirige una proteína al retículo endoplasmático y una secuencia de ARN que dirige un ARN codificado por la proteína a un sitio intracelular con excepción del retículo endoplasmático o a los polisomas libres y/o ligados al citoesqueleto se pueden evitar, o al menos alterar para incrementar la probabilidad de que las proteínas sean dirigidas al retículo endoplasmático.

Esto se logra por el suministro de la molécula de ARN con una región 3' no traducida (UTR) a partir del ARNm para una proteína secretada. Las señales presentes en las regiones 3'UTR de moléculas de ARN dirigidas a sitios subcelulares específicos o a polisomas libres o unidos al citoesqueleto se consideran para controlar la localización de tales mARNs, al menos a algún grado y las mutaciones en tales regiones pueden inactivar las señales. Las señales en las regiones 3' UTR de moléculas de ARN se pueden identificar por deleción o mutación de secuencias dentro de la región 3'UTR de dichas moléculas de ARNm y ensayo de localización de la habilidad mediante el enlace de un gen indicador y la transfección dentro de células de mamífero en cultivo seguido por ensayos de hibridación para detectar la distribución del ARNm.

También dentro del alcance de la presente invención están las moléculas de ADN capaces de ser transcritas para proveer las moléculas del ARN planteadas arriba. Pueden ser proporcionados bajo la forma de un vector (por ejemplo un plásmido, fago o cósmido), aunque esto no es esencial.

También dentro del alcance de la presente invención esta una célula de mamífero que comprende una molécula de ADN o de ARN según lo descrito arriba. La célula de mamífero está presente en el cultivo celular o en un animal no-humano. El término "cultivo celular" se utiliza en esta para entender una o más células que no están presentes en un animal y que pueden ser utilizadas para expresar las proteínas bajo apropiadas condiciones. Generalmente tales células serán mantenidas en un medio de cultivo apropiado bajo condiciones reguladas. El cultivo celular puede ser por ejemplo un cultivo de fibroblastos de mamífero, un cultivo celular de CHO, BHK o mieloma. El animal no-humano puede ser un animal transgénico. (El término "animal transgénico" incluye animales transcarióticos). Este puede secretar las proteínas heterólogas en su leche.

La presente invención también incluye un método que obtiene una proteína de una célula aislada de mamífero que comprende la etapa de la expresión de la proteína utilizando una molécula de ácido nucleico de la presente invención y permite que la célula secrete la proteína. La proteína luego puede ser purificada por técnicas de purificación conocidas.

Deseablemente tales moléculas hibridadas de ácido nucleico son al menos 10 nucleótidos de longitud y preferiblemente son por lo menos 25 o por lo menos 50 nucleótidos de longitud. Ellos se pueden hibridar bajo las condiciones de hibridación rigurosas. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es cuando el intento de hibridación se realiza a una temperatura desde aproximadamente 35°C a aproximadamente 65°C utilizando una solución salina que es aproximadamente 0.9 molar. Sin embargo, la persona de habilidad será capaz de variar tales parámetros tan apropiados con el fin de tomar en cuenta las variables tales como longitud de la sonda, composición base, tipo de iones presentes, etc.

A pesar de que la presente invención ha sido descrita arriba ampliamente con la referencia a los péptidos señal de mamífero presentes de manera natural o a sus variantes, en su amplio alcance todos los péptidos señal capaces del funcionamiento en las células de mamífero pueden ser utilizados. Estos pueden estar presentes de manera natural o no-natural. Preferiblemente (pero no esencialmente) no ocurren de manera natural en organismos procariotas (por ejemplo E. Coli).

La presente invención será ahora descrita a modo de ejemplo únicamente con referencia a las figuras adjuntas, en donde

Figura 1 muestra un diagrama esquemático de las construcciones descritas en los Materiales y Métodos. El vector precursor es el pcDNA3. El cuadro sólido representa la 5'UTR nativa de la beta-globina de conejo. SS es la secuencia señal de albúmina de rata.

Figura 2 muestra una Hibridación Northern del ARN total a partir de polisomas aislados a partir de células transfectadas. Todas las sendas se cargaron con 10 \mug de ARN; el filtro se hibridiza con una sonda de ADNc de beta-globina de conejo y se detectan bandas específicas por autoradiografía a -70°C por 3 días utilizando Hyperfilm-MP. F, polisomas libres; C, polisomas unidos al citoesqueleto; M, polisomas unidos a la membrana.

Figura 3 muestra una cuantificación de la distribución del ARNm de la globina en células transfectadas. Los resultados se expresan en unidades arbitrarias de ARNm por unidad de ARNr 18S obtenidos a partir de imágenes de radioactividad directa utilizando un Canberra Packard Instantimager. Los valores de abundancia se normalizaron tomando la abundancia en polisomas libres como 100 para cada experimento. Los resultados son \pm S.E.M promedio (n=4). Los grupos se compararon utilizando la prueba "t" de Student: la abundancia transcrita en los polisomas unidos a la membrana fue significantemente diferente entre las células GG y SSGG (p=0.01), GM y SSGM (p<0.05) utilizando una prueba de dos colas y entre SSGM y SSGG utilizando una prueba de una cola.

Figura 4 muestra la estabilidad del ARNm de las transcripciones. Las células se cultivaron al 70% de confluencia y la transcripción se inhibió con Actinomicina D. El ARN se extrajo en los puntos de tiempo, después se analizaron por Transcripción Northern. La cuantificación se realizó por imágenes de radioactividad directa utilizando un Canberra Packard Instantimager. Los resultados son \pm S.E.M promedio y se expresan como porcentaje de abundancia inicial. GG y SSGG (n=6).

Figura 5 muestra los perfiles de polisoma de células Ltk transfectadas. El material extraído del detergente/sal soluble se estratificó sobre un gradiente de sacarosa al 15%-40% y se centrifugaron a 200 000 x g por 1 hora. Los perfiles de polisomas se monitorearon midiendo la absorbancia a 260 nm utilizando un flujo celular.

Figura 6 muestra una Hibridación Northern y cuantificación de SSGA.

Figura 6A: Hibridación Northern de células Ltk transfectadas con pcKSSGA. Todas las sendas se cargaron con 20 ug de ARN. El filtro se hibridiza con una sonda de ADNc de beta-globina de conejo.

Figura 6B: Cuantificación de la abundancia del ARNm. Los resultados se expresan en unidades arbitrarias de abundancia del ARNm por unidad de ARNr 18S obtenidas de imágenes de radioactividad directa y se normalizaron tomando la abundancia en polisomas libres a 100 para cada experimento. Los resultados son \pm S.E.M promedio. (n=3).

Ejemplos

La metodología llevada implicó tres etapas: construir una serie de vectores con la albúmina del péptido señal y diferentes secuencias de la región 3' no traducida (3'UTR) unida a la beta-globina de conejo de la región 5' no traducida y codificando la secuencia como un gen indicador; introducir estas construcciones dentro de las células por transfección estable y luego determinar la localización subcelular del ARNm, y su estabilidad y eficacia de la traducción.

Materiales y métodos

Cultivo bacteriano y celular: Los plásmidos se clonaron y propagaron de una manera estándar. Las células CHO K1 se cultivaron en medio Ham's F12 y las células Ltk, una línea de fibroblasto de ratón, se cultivaron en medio mínimo de Eagle modificado por Dulbecco. El medio se suplementó con suero de becerro fetal 10% y se cultivo en una atmósfera al 5% de CO_{2}. Las células se propagaron en platos de Petri de 90mm por fraccionamiento y en platos de Petri de 35 mm por transfección.

Construcción del vector: Todas las construcciones (Figura 1) se derivaron de la \beta-globina de conejo que codifica las secuencias por clonación PCR con los cebadores descritos en la Tabla 1 y todas contenidas en la 5' UTR de la globina nativa. Cada construcción se verificó por secuenciación utilizando un secuenciador ABI 373A y secuenciación por ciclos. La construcción del pcKGG, un plásmido que expresa la beta-globina de conejo con 5' y 3' UTRs nativas ha sido descritos previamente (Mahon et al, 1997). El pcKGM expresa la globina con la 3'UTR de ratón c-myc y se hace como sigue. Una porción de la región que codifica la globina y la 3'UTR c-myc completa se amplificó por PCR utilizando los cebadores KP4 y KP5, KP4 conservando un sitio de BamHI en la región que codifica la globina y KP5 creando un sitio XbaI secuencia abajo de la señal poly-A del c-myc, y el plásmido MP13 como molde (Veyrune et al 1996). Utilizando 1 ng del molde y 20 pmol de cada cebador en MgCl_{2}1.5 mM y 4 Unidades de Polimerasa Taq (PerkinElmer), la reacción se cicló a 94ºC por 1 min, 55ºC por 1 min, y 72ºC por 2 mins. El fragmento y el pcKGG se digirieron con BamHI y KpnI y ligaron utilizando métodos estándar (Sambrook et al 1989).

La fabricación de las construcciones de la secuencia señal requiere la creación de un sitio de restricción apropiado en el codón AUG. Esta se lleva a cabo por PCR utilizando los cebadores KP6 y KP7; KP6 comparándose con la secuencia del pcDNA3 en la posición 731 y KP7 creando un sitio NdeI mientras se conserva el AUG y el marco de lectura. El molde fue pcKGG, la reacción se realiza con las condiciones descritas arriba. El producto de la reacción se purificó, luego 5 \mug se utilizaron en un PCR megainiciador con un cebador KP8 (cubriendo una secuencia en la región que codifica la globina que incluye un sitio de BamHI), 1 \mug de pcKGG como el molde y los ciclos según lo descrito arriba. El fragmento resultante se subclonó en pBluescript en los sitios KpnI y BamHI, creando el pBS-Nde.

La secuencia señal se proporcionó por apareamiento de los oligodeoxinucleótidos sintéticos que corresponden a la secuencia señal de albúmina de rata (SS1 y SS2). El inserto se ligo dentro del sitio NdeI del pBS-Nde, creando el pBS-SS. El fragmento KpnI-BamHI a partir del pBS-SS que cubre la 5' UTR, la secuencia señal de albúmina y la región que codifica la globina en el sitio de BamHI, luego se ligo dentro del pcKGG digerido apropiadamente y el pcKGM para crear el pcKSSGG y pcKSSGM.

La 3' UTR de la albúmina se extrae del gen de albúmina de rata por restricción y después del tratamiento del vector de globina restringido con la polimerasa Vent de la 3'UTR de la albúmina se introdujo mediante unión de extremos romos. El pcKSSGA se construyó según se describe para el pcKSSGG y pcKSSGM.

Transfección: Las transfecciones se realizaron con LipofectAMINE^{TM} (Gibco) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se subcultivaron sobre unos platos de Petri de 35 mm a una densidad de 5 X 10^{5} células/plato y se cultivaron a 70-80% de confluencia. Las células se cubrieron con una capa con 1 \mug del ADN del plásmido y 6-10 \mul de LipofectAMINE en medio libre de suero. Después de 5 horas, el suero se adicionó para una concentración final de 10%. A las 24 horas el medio se reemplazo con medio completo y la selección con G418 200 \mug/ml se inició a las 72 horas. Las células se conservaron en 100 \mug/ml de G418 una vez se transfectaron establemente. Las líneas celulares se denominaron para la construcción transfectada, por ejemplo las células transfectadas con pcKGG se denominaron GG, etc.

Fraccionamiento Celular: Las células Ltk se cultivaron al 70% de confluencia, se cultivaron utilizando una varilla de goma y se fraccionaron por un procedimiento de extracción secuencial con detergente/sal (Vedeler et al, 1991; Hesketh et al 1994). Los polisomas se separan a partir de los monosomas y las partículas de ribonucleoproteína livianas por centrifugación a 32,000 g durante 17 horas a través de un cojín de 15 ml al 40% de sacarosa (Hovland et al, 1995).

Extracción de ARN y Electroforesis de Gel de ARN: El ARN Total se extrajo por el método de ácido/guanidino/fe-
nol/cloroformo de Chomczynski y Sacchi (1987), y las preparaciones se evaluaron por el A260/A280. El ARN luego se separó por electroforesis a través de un formaldehído 2.2 M desnaturalizado, gel de agarosa 1.2% (Sambrook et al 1989) y se transfirió a una membrana de nylon (Genescreen, NEN Dupont, Ltd) por transferencia capilar. El ARN se fijó a la membrana mediante luz UV y se almacenó seco.

Hibridación Northern y Sondas de ADN: Las membranas se pre-hibridizaron a 42ºC por un mínimo de 6 horas con ADN desnaturalizado de esperma de salmón 0.1 mg/ml en 50% de formamida, 10% de sulfato de dextran, 0.2% de albúmina de suero bovina, 0.2% de polivinilpirrolidona, 0.2% de Ficoll, 0.1% de pirofosfato de sodio, 1% de SDS y 50 mM de Tris HCl, pH 7.5. La sonda de betaglobina de ADNc se describe previamente (Veyrune et al 1996). La sonda c-myc fue un ADNc de los 3 exones del gen murina (Hesketh et al, 1994) y fue una donación del Dr. M. Cole (Princeton University, New Jersey USA), la sonda gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa (GAPDH) fue un fragmento PstI-XbaI 0.78 kb a partir del ADNc humano (American Tissue Culture Collection, número de acceso 57090) y la sonda ARNr 18S fue un fragmento BamHI 1.4kb a partir del ADNc obtenido del Dr. R. Fulton, Beatson Institute, Glasgow. 20-30 ng de la sonda se marcaron con 32P dCTP por cebado aleatorio (kit Megaprime of Amersham International UK). La sonda marcada se adicionó a la mezcla de pre-hibridación y se hibridó durante la noche a 42°C. Los filtros se lavaron pronto a temperatura ambiente en 2XSSC para extraer la mezcla de hibridación. Las sondas específicas se lavaron a 65°C como sigue: globina-1X SSC 0.5% SDS 2 X 30 min., c-myc-0.5 X SSC, 1% SDS 2 X 1 hr., GAPDH-1 X SSC, 1% SDS 2 X 1 hr., 18S-0.2X SSC, 1% SDS. Un lavado final breve en 0.1 X SSC retira el SDS. La hibridación específica se detectó y cuantificó en un Canberra Packard Instantimager. Las cantidades de sondas unidas específicamente se corrigieron por enlace no-específico y los datos se expresaron por unidad de ARNr como se mide por hibridación a la sonda de ARNr 18S. Antes de ser re-sondeados los filtros se desmontaron calentándolos a 95°C en 0.1% de SDS por 10 min.

Estabilidad del ARNm: La estabilidad del ARNm se determinó midiendo la abundancia durante un periodo de tiempo de 2-12 h continuando con la inhibición de la transcripción. Las células se cultivaron al 70% de confluencia y la transcripción se inhibió mediante la adición de Actinomicina D (5 \mug/ml). El ARN se extrajo según lo descrito arriba.

Perfiles de polisomas y Eficiencia de la Traducción: Las células se cultivaron al 70% de confluencia, se rasparon dentro del medio utilizando una varilla de goma, luego se forman pellets a 2000 rpm por 5 min. a 4ºC. Las células se lavaron en DEPC PBS, y como antes se forman pellets. Las células se resuspenden en una solución de TEA 10 mM (trietanolamina) pH 7.6, KCl 130 mM, MgCl_{2} 5 mM, CaCl_{2} 0.5 mM, sacarosa 0.25 mM con 0.5% de deoxicolato y 0.5% de Tritón X 100 se incubaron sobre hielo 10 minutos. El núcleo se formó pellet por centrifugación a 3000 rpm por 10 min a 4ºC. Se cargaron 0.3 ml del sobrenadante dentro de un gradiente de 7 ml de sacarosa 15%-40% y se centrifugaron a 200,000 x g durante 1 hora y luego se monitorearon midiendo la absorbancia a 260 nm utilizando un flujo-a través de la célula montada en un espectrofotómetro Zeiss PM 2A y acoplado a un registrador W + W. El flujo de salida del flujo celular se colectó y cada gradiente se divide en tres fracciones - polisomas, monosomas, y remanente (material no traducido). Los polisomas se forman pellets por centrifugación a 32000 x g por 17 horas y el ARN se extrajo a partir del pellet. El ARN monosomal se precipitó con isopropanol y acetato de amonio, luego se extrajo según lo descrito anteriormente.

Resultados

Redirección del ARNm de la globina por la secuencia señal de la albúmina: Inicialmente, se construyeron cuatro plásmidos basados en la 5' UTR de la beta-globina de conejo y la región codificada junto con la 3'UTR nativa o la 3'UTR c-myc y ambas con y sin la secuencia señal de la albúmina. Estas construcciones se introducen dentro de los Ltk-fibroblastos y las líneas celulares transfectadas estables se implantan. La expresión del gen transfectado se evalúo por hibridación Northern para detectar la transcripción de la globinas y se encontró que todos los cuatro genes se expresan. Comprobamos los altos niveles de expresión de la globina al 70% de confluencia (datos no mostrados) y todos los subsiguientes experimentos se realizaron en esta etapa de crecimiento.

El fraccionamiento detergente/sal se realizó para investigar la compartimentación de las transcripciones entre FP, CBP y MBP. Cada línea celular se fraccionó, se formaron pellets de los polisomas, y luego el ARN extraído de los pellets y se analizó por hibridación Northern para la abundancia de la transcripción de la globinas. Según se muestra en la figura 2, en las líneas celulares control (GG) la transcripción de la globina se detectó ampliamente en los polisomas libres. En contraste, en las células que expresan la transcripción de la globina con la secuencia señal de la albúmina (SSGG) esta transcripción se detectó predominantemente en el MBP/ER. El SSGM transcrito también se detectó en una abundancia más alta en la fracción MBP/ER.

El re-sondeo de los filtros con la sonda de ARNr 18S permitió la corrección para la carga del ARN y la cuantificación de los datos de hibridación por la unidad del ARN. La abundancia de la transcripción de la globina en FP, CB y MBP fue respectivamente 2.5 \pm 0.4, 2.9 \pm 1.0 y 2.1 \pm 0.9 (los promedios de al menos cuatro experimentos separados \pm s.e.m., expresados como unidades arbitrarias de c.p.m sonda de globina unida/c.p.m. 18S sonda unida) en las células GG y 0.9 0.2, 1.3 0.2 y 2.5 0.8 en las células SSGG. Dado que la distribución de la transcripción relativa fue mejor que el nivel de expresión completa este fue el parámetro más importante en estos experimentos, estos datos luego se expresaron relativos a la abundancia en la fracción FP; como se muestra en la Figura 3 estos datos confirman que la adición de la secuencia señal de la albúmina redirige el ARNm de la globina al ER (p = 0.01).

En las células GM la abundancia de transcripción de la globinas en FP, CBP y MBP fue respectivamente 2.6 \pm 0.7, 2.8 \pm 0.9 y 1.6 \pm 0.5 (promedios de al menos cuatro experimentos separados \pm s.e.m., expresados como unidades arbitrarias de la c.p.m sonda de globina unida) y en las células SSGM la distribución de la abundancia fue respectivamente 2.5 \pm 1.1, 2.3 \pm 0.8 y 3.0 \pm 1.4. El análisis de estos datos expresados como abundancias relativas a aquellas en FP mostró que las transcripciones GM se presentan ampliamente en CBP, como se encontró previamente en (Hesketh et al., 1994) pero que, en contraste, las transcripciones SSGM se detectaron en CBP y MBP abundancias relativas similares (Figura 3). La abundancia de transcripción de las globinas en MBP fue significantemente mayor en las células SSGM que en las células GM, mostrando otra vez la habilidad de la secuencia señal para redirigir las transcripciones al ER. Sin embargo, el incremento de la abundancia en MBP en la células SSGM comparado con las células GM fue significantemente menor (p<0.05) que el incremento de la abundancia en las células SSGG comparado con las células GG. De esta manera, aunque la secuencia señal redirige la región que codifica la globina y 5'UTR con la 3'UTR del c-myc adherida, la presencia de ambas la 3'UTR del c-myc y la secuencia señal reducida la extiende para que la redirección ocurra. Esto sugiere que hay competición entre una señal de localización ER (péptido señal) y una señal de localización del citoesqueleto (3'UTR del c-myc; Veyrune et al., 1996).

La adición de la secuencia señal no tiene efecto en la estabilidad del ARNm o en la eficiencia de la traducción: Puesto que era teóricamente posible que la manipulación de las señales 5' puedan tener alterada la estabilidad del ARNn de la globina, por lo tanto determinamos la estabilidad de las transcripciones quiméricas. Cada línea celular se cultivó al 70% de confluencia y luego se trato con Actinomicina D para inhibir la transcripción adicional; la abundancia del ARN se midió por transferencia Northern. Como la globina es un mensaje altamente estable (Aviv et al., 1976) las abundancias de las transcripciones GG y SSGG se midieron durante un periodo de 12 h. Según se muestra en la Figura 4, la adición de la secuencia señal de la albúmina no altera significantemente la estabilidad del ARNm de la globina. Del mismo modo, el análisis de las líneas celulares de GM SSGM mostró que la adición de la secuencia señal a la transcripción de las globinas con la 3'UTR del c-myc no desestabilizó el ARNn (datos no mostrados). El re-sondeo de los filtros detectados del ARNn del GAPDH indicó que la transcripción había sido inhibida en las cuatro líneas celulares (datos no mostrados).

Efectos de la secuencia señal en la estabilidad del ARNm: Puesto que era teóricamente posible que la manipulación de las señales 5' y 3' puedían haber alterado la estabilidad del ARNm de la globina, por lo tanto determinamos el efecto de la estabilidad de la secuencia señal adicionada en la estabilidad del ARNm. Las células se cultivaron al 70% de confluencia y luego se trataron con Actinomicina D para inhibir la transcripción adicional; La abundancia del ARN se midió por transferencia Northern. Como la globina es un mensaje altamente estable (Aviv et al, 1976) la abundancia de las transcripciones GG y SSGG se midió durante un periodo de 12 h. Según se muestra en la Figura 4, la adición de la secuencia señal de la albúmina no altera significantemente la estabilidad del ARNm de la globina. El re-sondeo de los filtros para detectar GAPDH ARNm (datos no mostrados) indicó que la transcripción había sido inhibida en ambas líneas celulares.

Eficiencia de la traducción: Con el fin de determinar si la manipulación de las señales dentro del gen extraño ha afectado tanto la traducción en general como la traducción del gen modificado en particular, el mecanismo sintético de la proteína de las cuatro líneas celulares se somete al análisis del perfil del polisoma. Las células se lisaron con sal y detergente, y el material soluble cargado dentro de un gradiente de sacarosa al 15% - 40%. Los perfiles de polisomas se registraron y presentaron en la Figura 5, y las relaciones del polisoma/monosoma en la Tabla 2. Los perfiles de polisomas fueron muy similares para las cuatro líneas con una proporción similar de ribosomas presente en los polisomas activos. Las diferentes alturas pico representan las diferencias en la cantidad total del ARN cargado dentro del gradiente. De esta manera, la transfección con las 4 construcciones no afectó la síntesis de la proteína completa. El análisis de la proporción de la transcripción de las globinas en las fracciones polisoma y monosoma a partir de los gradientes de sacarosa (Tabla 3) muestra que la adición de la secuencia señal no altera significantemente la traducción de las transcripciones.

La influencia de la 3'UTR de la albúmina: Los resultados en la Figura 3 sugirieron que hay competición entre las señales dirigidas 5' y 3' pero nos referimos a que los efectos observados fueron debidos a una cierta forma de interacción entre las secuencias que codifican la globina y la 3'UTR de la c-myc que previenen la secuencia señal que realiza su papel de señalización. Para tratar esta pregunta construimos otro vector con una 3'UTR diferente, a saber la 3'UTR del gen de la albúmina: la región que codifica la globina con la 3'UTR del ARNm de albúmina de rata y la secuencia señal de albúmina de rata (SSGA). El plásmido fue transfectado dentro de las células Ltk y las líneas celulares estables establecidas. Las células SSGA se fraccionaron y se analizaron según lo descrito arriba. Según se muestra en la Figura 6 los resultados muestran que las transcripciones de SSGA que contienen ambas la 3'UTR de la albúmina y la secuencia señal se recuperaron predominantemente en la fracción MBP/retículo endoplasmático. Esto indica que la introducción de una 3'UTR extraña no es suficiente, per se, para prevenir la redirección de la transcripción de la globina al ER. Se construyó un vector adicional (GA) en el cual la secuencia que codifica la globina se unió a la 3'UTR de albúmina de rata pero sin la secuencia señal; desafortunadamente, no fue posible un análisis posterior debido a que no podíamos detectar las células transfectadas que expresan este gen.

Discusión

Los presentes resultados muestran que mediante una tecnología de combinación del ADN recombinante y la transfección es posible producir líneas celulares en las cuales el ARNm de la globina se redirigen al retículo endoplasmático. De esta manera, en los Ltk- fibroblastos, la adición de la secuencia señal de la albúmina de rata a la globina con la 3'UTR de la globina nativa redirige el ARNm a los polisomas unidos a la membrana. Esta es la primera demostración de la redirección de un ARNm a partir de los polisomas libres al ER en una línea celular estable. La redirección parcial del ARNm de la histona al MBP previamente ha sido demostrado en células de mamífero (HeLa) utilizando una secuencia señal E. coli (Zambetti et al 1987). También, Lee y colaboradores (1996) han segregado sialiltransferasa activa a partir de las células COS-7 utilizando un péptido señal IgM pero en este caso la sialiltransferasa nativa se sintetiza en el ER. Considerablemente, en cada uno de estos casos, no obstante, las transfecciones fueron
transitorias.

Actualmente es claro, que además de los mARNs traducidos en polisomas libres, una proporción considerable de mARNs se traducen en polisomas asociados con el citoesqueleto (Hesketh, 1996). El direccionamiento de los mARNs al citoesqueleto se ha mostrado que es debido a las señales en la 3'UTR (Hesketh et al, 1994; Veyrune et al, 1996; Mahon et al, 1997). Según se muestra en la figura 3, si además de un péptido señal, una señal blanco del citoesqueleto está presente en la 3'UTR del transcripción, el desplazamiento de los polisomas unidos a la membrana se disminuye. Esto parece no ser causado por un efecto no-específico de una 3'UTR "extraña" porque la adición de una 3'UTR "extraña" diferente, de esa albúmina, a la globina (SSGA; Figura 6) no reduce la redirección para la secuencia señal. Los datos indican por lo tanto que cuando una transcripción híbrida contienen ambas una secuencia señal y una señal de la localización de la 3' UTR hay una competición entre las señales 5' y 3'. La señal de la localización de la 3'UTR del c-myc parece así interferir con la clasificación del ARNm vía una secuencia señal.

Estos datos tienen implicaciones importantes para la biotecnología. En primer lugar, muestran que es posible crear líneas celulares estables en las cuales un ARNm codificado por una proteína intracelular se redirige al ER. En segundo lugar, muestran que si dicho ARNm contiene una señal de localización de la 3'UTR entonces dicha señal se debe retirar para lograr una redirección eficiente.

Según lo indicado por los presentes resultados con la 3'UTR de la albúmina (Figura 6), lo más apropiado puede ser utilizar un vector que contiene una 3' UTR a partir del ARNm para una proteína secretada, particularmente una forma del mismo gen según la secuencia señal que sea utilizada; de esta manera la región codificada deseada se inserta entre la 5'UTR/secuencia señal y la 3'UTR a partir de un ARNm para una proteína secretada y el problema de la competición de la señal se suprime.

Si dichos genes modificados van a ser utilizados para propósitos comerciales, idealmente la modificación de la señal no debe disminuir la estabilidad del ARNm y la eficiencia de la traducción para ninguna extensión importante. Los datos en la Figuras 4 & 5 muestran que la adición de la secuencia señal a la globina no tuvo ningún efecto sobre la estabilidad del ARNm o la eficiencia de la traducción. De esta manera, el redireccionamiento se puede acompañar por una conservación de la estabilidad del ARNm y de la traducción. Utilizando luciferasa como un gen reportero hemos demostrado que el direccionamiento del ARNm por la secuencia señal de la albúmina se acompaña por la síntesis de una proteína reconocible inmunológicamente en el ER.

En conclusión, los presentes resultados muestran que es posible redirigir un ARNm al ER mientras se conserva la estabilidad y la traducción.

Referencias

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TABLA 1 Oligodeoxinucleótidos Por PCR

100

Tabla 1. Oligos usados en la clonación de varios vectores de expresión descritos en el texto. Las letras en minúscula representan los cambios requeridos para crear los sitios de restricción.

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TABLA 2

	Polisomas	Monosomas

GG	56.5% \pm 3.0	43.5% \pm 3.0
SSGG	53.9% \pm 1.7	46.1% \pm 1.7
GM	51.7% \pm 0.4	48.3% \pm 0.4
SSGM	51.7% \pm 1.1	48.3% \pm 1.1

Tabla 2. Distribución de los ribosomas en Polisomas y Monosomas. Porcentaje de distribución de ribosomas se calculó a partir de las cantidades del material que absorbe a A260 presente en los polisomas y monosomas separados mediante centrifugación en el gradiente de densidad de sacarosa. Los resultados son S.E.M promedio. (n=6 para GG y SSGG, n=9 para GM y SSGM).

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TABLA 3

	Polisomas	Monosomas

GG	32.3%	67.7%
SSGG	42.1%	57.9%
GM	57.8%	42.2%
SSGM	48.5%	51.5%

Tabla 3. Distribución de la transcripción de la globina en polisomas y monosomas. El ARN se extrajo a partir de las fracciones de polisoma y monosomas recuperadas de los gradientes de densidad de sacarosa (se muestran los perfiles en la Figura 5) y se analizó por la abundancia del ARNm de la globina mediante Transferencia de Northern.

Claims

1. Una molécula de ARN codificada por un péptido señal de mamífero unido de manera operacional a una proteína intracelular de mamífero, dicho péptido señal permite que dicha proteína sea sintetizada sobre el retículo endoplasmático de una manera tal que esta pueda ser secretada, la molécula que comprende una región 3' no-traducida del ARNm para una proteína secretada en su extremo 3'.

2. Una molécula de ARN de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha secuencia señal es una secuencia señal seleccionada de una hormona del crecimiento, una proteína de leche o una albúmina.

3. Una molécula de ADN que se pueda transcribir para proveer una molécula de ARN de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la forma de un vector.

5. Una célula de mamífero que comprende una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, cuando está presente en un cultivo celular o en un animal no-humano.

6. Un método de obtención de una proteína a partir de una célula aislada de mamífero, que comprende la expresión de la proteína en la célula utilizando una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y permitiendo a la célula secretar la proteína.