ES2273505T3 - Inhibidores de la actividad proteasomal para estimular el crecimiento del cabello. - Google Patents

Inhibidores de la actividad proteasomal para estimular el crecimiento del cabello. Download PDF

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Abstract

Un método cosmético para tratar un sujeto mamífero de un estado que se beneficia por la estimulación del crecimiento del cabello, cuyo método comprende administrar a dicho sujeto mamífero una cantidad eficaz para estimular el crecimiento del cabello de un compuesto que inhibe la actividad proteasomal o que inhibe la producción de estas proteínas, en el que dicho compuesto es una estatina, un aldehído peptidílico o una epoxicetona peptidílica, o está seleccionado entre el grupo que consiste en pentoxifilina, gliotoxina, SN50, Bay 11-7082, capsaicina, PDTC, PPM-18. lactacistina y MG262.

Description

Inhibidores de la actividad proteasomal para estimular el crecimiento del cabello.
Campo técnico
La invención se refiere a composiciones y métodos para usar para aumentar la densidad y el crecimiento del cabello. Más específicamente, la invención se refiere al uso de inhibidores de la actividad proteasomal para este fin.
Técnica fundamental
Los inhibidores de la actividad proteasomal y en alguna medida los inhibidores de la actividad del NF-\kappaB. tienen dos efectos fisiológicos importantes. El primero de ellos, es que son capaces de mejorar la formación del hueso y, por tanto, son útiles para tratar diversas afecciones óseas. En segundo lugar, estimulan la producción de los folículos pilosos y por consiguiente son útiles para estimular el crecimiento del cabello, incluyendo la densidad del pelo, en sujetos en que este hecho es deseable.
Efecto sobre el hueso
El hueso está sometido a rotura y resíntesis constantes en un proceso complejo que ocurre con mediación de los osteoblastos, que producen nuevo hueso, y los osteoclastos que destruyen el hueso. Las actividades de estas células están reguladas por un gran número de citoquinas y de factores de crecimiento, muchos de los cuales han sido identificados recientemente y clonados.
Existe un cúmulo de condiciones que se caracterizan por la necesidad de mejorar la formación ósea o inhibir la resorción ósea, Quizás lo más evidente es el caso de fracturas de huesos, en que sería deseable estimular el crecimiento del hueso y acelerar y completar la reparación del hueso. También serían útiles los agentes que mejoraran la formación del hueso en procedimientos de reconstrucción facial. Otras condiciones de déficit óseo incluyen los defectos segmentarios de los huesos, la enfermedad periodontal, la enfermedad metastática del hueso, la enfermedad osteolítica de los huesos y los estados en que la reparación del tejido conjuntivo podría ser beneficiosa, tal como la curación o la regeneración de defectos o daños de los cartílagos. Asimismo es de gran importancia el estado crónico de la osteoporosis, incluyendo la osteoporosis relacionada con la edad y la osteoporosis asociada al estado hormonal posterior a la menopausia. Otros estados que se caracterizan por la necesidad de crecimiento óseo incluyen el hiperparatiroidismo primario y secundario, la osteoporis desascostumbrada, la osteoporosis relacionada con la diabetes y la osteoporosis relacionada con los glucocorticoides.
No existen en la actualidad enfoques farmacéuticos satisfactorios para el tratamiento de cualquiera de estos estados. Las fracturas de los huesos son tratadas, todavía, exclusivamente empleando moldes, lañas, dispositivos de anclaje y otros medios estrictamente mecánicos. Además, el deterioro óseo asociado con la osteoporosis posterior a la menopausia ha sido tratada con estrógenos o bisfosfonatos, que pueden tener inconvenientes para algunas personas. Aun cuando han sido intentados varios enfoques, como se discute más adelante, permanece la necesidad de adiciones al repertorio de agentes que puedan ser utilizados para tratar estas condiciones.
El tratamiento del hueso u otros trastornos del esqueleto, tales como los asociados con los cartílagos, puede conseguirse o bien mejorando la formación del hueso o inhibiendo la resorción ósea, o ambos hechos. Se han sugerido varios enfoques relacionados con la formación del hueso.
El tejido óseo es una fuente excelente de factores que poseen la capacidad de estimular las células del hueso. Así, extractos de tejido óseo bovino obtenidos de mataderos contienen no solo proteínas estructurales que son responsables del mantenimiento de la integridad estructural del hueso, sino también factores de crecimiento del hueso biológicamente activos que pueden estimular la proliferación de las células óseas. Entre estos últimos factores están el factor \beta de crecimiento transformante, los factores de crecimiento de unión a heparina (por ejemplo, el factor de crecimiento de fibroblastos ácido y básico), los factores de crecimiento semejantes a la insulina (por ejemplo el factor I de crecimiento semejante a la insulina y el factor II de crecimiento semejante a la insulinaa) y una familia de proteínas recientemente descritas denominada proteínas morfogénicas del hueso (BMPs). Todos estos factores de crecimiento tienen efectos sobre otros tipos de células, así como también sobre las células óseas.
Las BMPs son factores nuevos de la superfamilia extendida del factor \beta de crecimiento transformante. La BMP2 y la BMP4 recombinantes pueden inducir la nueva formación de hueso cuando son inyectadas localmente en los tejidos subcutáneos de ratas (Wozney J. Molec. Reprod. Dev. (1992) 32: 160-67). Estos factores son expresados por los osteoblastos normales a medida que se diferencian y se ha puesto de manifiesto que estimulan la diferenciación de los osteoblastos y la formación de nódulos óseos in vitro así como la formación del hueso in vivo (Harris S. et al., J. Bone Miner Res. (1994) 9:855-63). Esta última propiedad sugiere utilidad potencial como agentes terapéuticos en enfermedades que dan por resultado pérdida ósea.
Las células que son responsables de la formación del hueso son los osteoblastos. A medida que los osteoblastos se diferencian partiendo de precursores hacia las células maduras que forman el hueso, expresan y secretan diversas enzimas y proteínas estructurales de la matriz ósea, incluyendo colágeno de tipo 1, osteocalcina, osteopontina y fosfatasa alcalina. También sintetizan diversos péptidos reguladores del crecimiento que están almacenados en la matriz ósea, y que son responsable, presumiblemente, de la formación normal del hueso. Estos péptidos reguladores del crecimiento incluyen las BMPs (Harris S. et al., (1994) (referencia citada).En estudios de cultivos primarios de osteoblastos fetales de calvarios de la rata, las BMPs 1, 2, 3, 4 y 6 son expresadas por células cultivadas antes de la formación de nódulos óseos mineralizados (Harris S. et al., (1994) (referencia citada). A semejanza de la fosfatasa alcalina, la osteocalcina y la osteopontina, las BMPs son expresadas por osteoblastos cultivados a medida que estos proliferan y se diferencian.
Aun cuando las BMPs son estimuladores potentes de la formación del hueso in vitro e in vivo, son desventajosos para su uso como agentes terapéuticos para mejorar la curación del hueso. Han sido identificados en muchos tejidos receptores para las proteínas morfogénicas óseas y las propias BMPs son expresadas en una gran variedad de tejidos en esquemas específicos temporales y espaciales. Este hecho sugiere que las BPMs pueden tener efectos sobre muchos tejidos además del hueso, limitando potencialmente su utilidad como agentes terapéuticos cuando se administran sistémicamente. Además, dado que son péptidos, podrían tener que ser administradas por inyección. Estas desventajas imponen limitaciones importantes al desarrollo de las BMPs como agentes terapéuticos.
Los fluoruros, sugeridos también para este fin, poseen un modo de acción que puede estar relacionado con la fosforiliación de tirosina de receptores de factores de crecimiento sobre los osteoblastos, como han descrito, por ejemplo, Burgener et al., J. Bone Min. Res. (1995) 10:164-171, pero la administración de fluoruros va asociada con un aumento de la fragilidad ósea, debido, presumiblemente, a efectos sobre la mineralización del hueso.
Han sido descritas moléculas pequeñas que son capaces de estimular la formación ósea, en las solicitudes de patentes PCT del documento WO98/17267 publicado el 30 de Abril de 1998, el documento WO97/15308 publicado el 1 de Mayo de 1997 y el documento WO97/48694 publicado el 24 de Diciembre de 1997. Estos agentes comprenden, en general, dos sistemas aromáticos separados espacialmente por un engarce. Además la solicitud de patente PCT del documento WO98/25460 publicada el 18 de Junio de 1998, describe el uso de la clase de compuestos que se conoce como estatinas, para mejorar la formación ósea. La solicitud de patente de EE.UU. Ser. No. 09/096.631 presentada el 12 de Junio de 1998 se refiere a compuestos para estimular el crecimiento óseo que, en general, son inhibidores del camino de los isoprenoides. El contenido de esta solicitud de patente así como también el de las solicitudes de patentes PCT antes citadas, se incorporan en esta memoria por referencia.
Aparecen otros agentes que actúan evitando la resorción ósea. Así, la patente de EE.UU. No. 5.280.040 describe compuestos que se indica que son útiles para el tratamiento de la osteoporosis. Estos compuestos consiguen, putativamente, este resultado evitando la resorción ósea.
Wang, G. J. et al., J. Formos. Med. Assoc. (1995) 94:589-592, indican que ciertos agentes utilizados para reducir los niveles de lípidos, ejemplificados por lovastatina y benzafibrato, eran capaces de inhibir la resorción ósea resultante de la administración de esteroides en el conejo. No había efecto sobre la formación del hueso mediante estos dos compuestos en ausencia de tratamiento con esteroides. Se dice que el mecanismo de la inhibición de la resorción ósea observado en presencia de esteroides (y el mecanismo del efecto de los esteroides sobre el hueso per se) es desconocido.
Un resumen de un artículo titulado "Lovastatin Prevents Steroid-Induced Adipogenesis and Osteoporosis" de Cui, Q. et al., aparecido en los Informes de la 18ª Reunión Anual de la ASBMR (Septiembre de 1996), J. Bone Mineral Res. (1996) 11(S1);S510, que indica que la lovastatina hacía disminuir las vesículas de triglicéridos que se habían acumulado, cuando células osteoprogenitoras clonadas a partir de estromas de la médula ósea del pollo, habían sido tratadas en cultivo con dexametasona. Se indicaba que la lovastatina hacía disminuir la expresión de ciertos mRNAs y permitían que las células mantuvieran el fenotipo osteogénico después del tratamiento con dexametasona, y que los pollos que habían sufrido pérdida ósea en la cabeza del fémur como resultado del tratamiento con dexametasona, habían mejorado mediante el tratamiento con lovastatina.
Estos datos son, sin embargo, contrarios a informes de que la dexametasona y otros inductores, tales como las BMPs, inducen la diferenciación osteoblástica y estimulan el mRNA de la osteocalcina (Bellows, C.G., et al., Develop. Biol. (1990) 140:132-38; Rickard, D.J. et al., Develop. Biol. (1994) 161:218-28). Además, Ducy, P. et al., Nature (1996) 382:448-52 han indicado recientemente que ratones deficientes en osteocalcina manifiestan un fenotipo marcado por formación ósea incrementada y huesos de calidad funcional mejorada, sin deterioro de la resorción ósea. Ducy et al., exponen que su resultados obtenidos sugieren que los antagonistas de la osteocalcina pueden tener uso terapéutico en asociación con terapia de reemplazo de estrógenos (para la prevención o el tratamiento de la osteoporosis).
Se ha manifestado también que la lovastatina inhibe la activación del NF-\kappaB inducida por lipopolisacáridos en células mesangiales humanas. Guijaro, C. et al., Nephrol. Dial Transplant (1996) 11:6:990-996.
Y su efecto sobre el crecimiento del cabello
Los trastornos del crecimiento del cabello humano incluyen calvicie masculina, alopecia areata, alopecia inducida por quimioterapia del cáncer y adelgazamiento del cabello asociado con el envejecimiento. Estos estados son mal comprendidos, pero, no obstante, son comunes y aflictivos dado que el cabello es un factor importante en la comunicación social y sexual humana.
La regulación del folículo piloso y el crecimiento del cabello no están, todavía, bien comprendidos, pero representan procesos dinámicos que llevan consigo proliferación, diferenciación e interacciones celulares durante la morfogénesis tisular. Se opina que los folículos pilosos se forman solo en las etapas precoces del desarrollo y no son sustituidos
Hardy, M.H. et al., Trans. Genet. (1992) 8:55-61, describen evidencia de que las proteínas morfogénicas óseas (BPMs), miembros de la superfamilia del TGF\beta, son expresadas de diferente modo en los folículos pilosos durante el desarrollo. Harris, S.E. et al., J. Bone Miner. Res. (1994) 9:855-863, describen los efectos del TGF\beta sobre la expresión de la BMP-2 y otras sustancias existentes en las células óseas. La expresión de BMP-2 en folículos maduros tiene lugar también durante la maduración y después del período de proliferación celular (Harsy et al., (1992, referencia citada). Sin embargo, como ha sido hecho notar por Blessing, M. et al., Genes and Develop. (1992) 7:204-215, el papel funcional preciso de la BMP-2 en la maduración del folículo piloso permanece sin esclarecer.
Enfoques para tratar la calvicie abundan en la bibliografía de patentes de los Estados Unidos. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 5.767.152 (derivados del ácido cianocarboxílico, la patente de EE.UU. No. 5.824.643 (factores de crecimiento de queratinocitos) y la patente de EE.UU. No. 5.910.497 (inhibidores de isoenzima 1 de 16-pirazinil-sustitutivo-4-aza-5-alfa androstano-reductasa). Existen muchos otros.
Gat, U. et al., Cell (1998) 95:605-614, han demostrado que la \beta-catenina ocasiona el que células epiteliales adultas creen folículos pilosos, un resultado sorprendente a la luz de la conocida incapacidad de que las células maduras lo hagan así. Es sabido que la \beta-catenina desempeña un papel importante en la adhesión celular y en la transfección de la señal del factor de crecimiento. También es sabido que después de la ubiquitinación, la \beta-catenina es degrada por los proteasomas. Orford, K. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272:24735-24738. Ha sido indicado también al menos un gen asociado con el crecimiento del cabello (o su carencia). Ahmed, W. et al., Science (1998) 279-720-724.
Dos agentes corrientemente utilizados para el tratamiento de la pérdida del cabello son el fármaco antihipertensivo Minoxidil y el inhibidor de la 5\alpha-reductasa Finasterida. Ninguno de los dos es totalmente satisfactorio. Ambos muestran poseer una modesta eficacia y son inconvenientes para administrar. Un compuesto específico, activo por vía tópica y fácil de administrar, con una mejor eficacia que estos agentes, podría representar un gran avance.
Proteasomas y NF-\kappaB
La presente invención describe ensayos convenientes para compuestos que pueden ser útiles para estimular el crecimiento del cabello. Los ensayos llevan consigo la inhibición de la actividad de proteasas proteasomales, preferiblemente proteasas proteasomales. Los compuestos que inhiben esta actividad son, en general, útiles para tratar trastornos del crecimiento del cabello. Los compuestos que inhiben la producción de estas proteasas también son útiles en la invención. Su aptitud para hacer esto puede confirmarse, además, mediante ensayos adicionales.
El proteasoma es una colección no compartimentalizada de proteasas no afines que forman una arquitectura común, en la que subunidades proteolíticas están auto-ensambladas formando complejos de forma de tonel (para una revisión, véase la publicación de Baumeister et al., Cell (1998) 92:367-380. El proteasoma contiene un conjunto de diferentes actividades proteolíticas en el interior de células eucarióticas. Los compuestos que inhiben la actividad proteasomal reducen también la actividad del NF-\kappaB al limitar su capacidad para ser translocado al núcleo (Barnes, P.J. et al., New England J. Med. (1997) 336:1066-1071.
Descripción de la invención
La presente invención se añade al repertorio de agentes que estimulan el crecimiento del cabello proporcionando fármacos que podrían inhibir proteínas y enzimas fundamentales implicadas en la actividad proteasomal y que estimulan, por tanto, el crecimiento del cabello. Según la presente invención, los presentes inventores han descubierto que la inhibición de las funciones de las proteínas proteasomales en células óseas lleva a la formación y estimulación del folículo piloso. Así, la evaluación de un compuesto candidato por su aptitud para inhibir las proteínas proteasomales, proporciona medios útiles para identificar agentes anabólicos de crecimiento del cabello.
La presente memoria descriptiva proporciona, por consiguiente, métodos de identificación de compuestos que estimulan el crecimiento del cabello mediante evaluación de su capacidad para inhibir la actividad proteasomal. También son útiles en los métodos de la invención, compuestos que inhiben la producción in situ de las enzimas contenidas en el proteasoma. Una vez identificado un compuesto que se ha descubierto que inhibe estas actividades, éste puede ser utilizado en un aspecto adicional de la invención - un método de estimulación del crecimiento del cabello por puesta en contacto de células adecuadas con el compuesto identificado. El contacto celular puede incluir administración in vivo y los compuestos de la invención son útiles, por tanto, para tratar la calvicie, las alopecias y afecciones semejantes. Estos métodos se realizan, conforme a la presente invención, con compuestos identificados como inhibidores de la actividad de proteasomas o inhibidores de la producción de las enzimas de proteasomas.
En un primer aspecto, la invención se refiere a un método cosmético para tratar un sujeto mamífero de un estado que se beneficia por la estimulación del crecimiento del cabello, cuyo método comprende administrar a dicho sujeto mamífero una cantidad eficaz para estimular el crecimiento del cabello, de un compuesto que inhibe la actividad proteasomal o que inhibe la producción de estas proteínas, en el que dicho compuesto es una estatina, un aldehído peptidílico o una epoxicetona peptidílica, o está seleccionado entre el grupo que consiste en pentoxifilina, gliotoxina, SN50, Bay 11-7082, capsaicina, PDTC, PPM-18, lactacistina y MG262.
En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de un compuesto que inhibe la actividad proteasomal o que inhibe la producción de estas proteínas, para la fabricación de un medicamento para estimular el crecimiento del cabello en un sujeto mamífero, en el que dicho compuesto es una estatina, un aldehído peptidílico o una epoxicetona peptidílica, o está seleccionado entre el grupo que consiste en pentoxifilina, gliotoxina, SN50, Bay 11-7082, capsaicina, PDTC, PPM-18, lactacistina y MG262.
Descripción breve de los dibujos
La Figura 1 muestra un diagrama del camino de los isoprenoides.
Modos de llevar a cabo la invención
Según la presente invención se proporcionan métodos de tratamiento de trastornos del crecimiento del cabello. Los trastornos de crecimiento del cabello pueden ser el resultado de un defecto en la capacidad de los folículos pilosos existentes para extruir el cabello, o pueden ser el resultado de una deficiencia en el número de folículos pilosos per se. La "estimulación del crecimiento del cabello" alude al aumento del volumen del cabello en una zona particular de un sujeto tanto si éste es el resultado de una velocidad aumentada de crecimiento en longitud y/o grosor a partir del mismo número de folículos pilosos, como del crecimiento procedente de un número aumentado de folículos pilosos, o ambos casos. El número de folículos pilosos puede ser aumentado por activación, además, de los folículos pilosos existentes o por estimulación del aspecto o proliferación de los folículos pilosos en una región particular de la piel.
Tal como se emplea en esta memoria, el término "sujeto" incluye tanto seres humanos como otras especies animales tales como, por ejemplo, canina, felina, bovina, porcina, de roedores y semejantes. Se comprenderá por los expertos en la materia, que el sujeto es uno apropiado para la deseabilidad de estimular el crecimiento del cabello. Así pues, en general, por ejemplo, la estimulación del crecimiento del cabello será limitada en la mayoría de los casos a animales que puedan poner de manifiesto, aproximadamente, tal crecimiento.
Las condiciones que podrían beneficiarse por "tratar" o por el "tratamiento" para estimular el crecimiento del cabello incluyen la calvicie masculina, la alopecia ocasionada por quimioterapia, el adelgazamiento del cabello resultante del envejecimiento, los trastornos genéticos que dan por resultado deficiencia de cobertura del cabello, y, en animales, procurando protección adicional contra temperaturas frías. Por consiguiente, mientras que el uso en seres humanos puede ser principalmente de beneficio cosmético, el uso en animales puede ser asimismo terapéutico.
Las composiciones de la invención pueden ser administrada sistémica o localmente. Para el uso sistémico, los compuestos de esta invención se formulan para administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intranasal o transdérmica), o enteral (por ejemplo, oral o rectal), según métodos convencionales. La administración intravenosa puede efectuarse mediante una serie de inyecciones o mediante infusión continua durante un período prolongado. La administración por inyección u otras vías de administración separadas discretamente, puede llevarse a cabo a intervalos que varían desde semanalmente hasta una a tres veces al día. Alternativamente, los compuestos descritos en esta memoria pueden ser administrados de un modo cíclico (administración del compuesto descrito, seguida de no administración, seguida de administración del compuesto descrito, y semejante). El tratamiento se continúa hasta conseguir el resultado deseado. En general, las formulaciones farmacéuticas incluyen un compuesto de la presente invención en combinación con un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico, tal como solución salina, solución salina tamponada, solución acuosa de dextrosa al 5%, solución salina tamponada con borato conteniendo indicios de metales, o semejante. Las formulaciones pueden incluir, además, uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes de tamponamiento, albúmina para prevenir la pérdida de proteínas sobre las superficies de los viales, lubricantes, cargas, estabilizantes, etc. Métodos de formulación son bien conocidos en la técnica y están descritos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, última edición, Mack Publishing Co., Easton PA, que se incorpora en esta memoria por referencia.
Las composiciones farmacéuticas para usar dentro de la presente invención pueden tener la forma de soluciones o suspensiones líquidas estériles, apirógenas, cápsulas recubiertas, supositorios, polvos liofilizados, parches transdérmicos u otras formas farmacéuticas conocidas en la técnica. La administración local puede hacerse por inyección en el sitio de daño o defecto, o por inserción o fijación de un excipiente sólido en el sitio, o mediante aplicación tópica directa de un líquido viscoso, o semejante. Para administración local, el vehículo de distribución es, preferiblemente, un vehículo que pueda ser absorbido por el sujeto sin efectos adversos.
En formulaciones adicionales, pueden usarse preparaciones convencionales tales como las que se describen a continuación.
Las suspensiones acuosas pueden contener el ingrediente activo en mezcla con excipientes farmacológicamente aceptables, que comprenden agentes de suspensión, tales como metilcelulosa, y agentes humectantes, tales como lecitina, lisolecitina o alcoholes grasos de cadena larga. Dichas suspensiones acuosas pueden contener, asimismo, agentes conservantes colorantes, aromatizantes, edulcorantes y semejantes, conforme a los patrones industriales.
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Las preparaciones para aplicación tópica y local comprenden pulverizaciones en aerosol, lociones, geles y pomadas en vehículos apropiados desde el punto de vista farmacéutico que pueden comprender alcoholes alifáticos inferiores, polialcoholes tales como glicerina, polietilenglicol, ésteres de ácidos grasos, aceites y grasas, y siliconas. Las preparaciones pueden comprender, además, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o tocoferol, y agentes conservantes, tales como ésteres del ácido p-hidroxibenzoico.
Las preparaciones parenterales comprenden particularmente productos estériles o esterilizados. Las composiciones inyectables pueden ser provistas conteniendo el compuesto activo y cualquiera de los vehículos de preparaciones inyectables conocidos. Estos pueden contener sales para regular la presión osmótica.
También se contemplan usos veterinarios de los compuestos descritos, según se ha expuesto anteriormente. Tales usos incluirían el tratamiento de defectos asociados con el pelo o la piel de animales domésticos, caballos de granjas y caballos pura sangre.
Como se ha expuesto anteriormente, los compuestos de la presente invención pueden ser utilizados también para estimular el crecimiento del cabello o bien aumentando su velocidad de formación partiendo de folículos ya existentes, estimulando los folículos inactivos, efectuando la producción de folículos pilosos adicionales o alguna combinación de los anteriores, o mediante cualquier otro mecanismo que pueda o no pueda ser comprendido en la actualidad.
Dentro de la presente invención, una "cantidad eficaz" de una composición para usar en la estimulación del crecimiento del cabello, es aquella cantidad que proporciona el efecto deseado en términos de longitud o densidad del cabello. Tales cantidades eficaces serán determinadas utilizando técnicas de optimización rutinarias y dependen de la condición particular que haya de ser tratada, el estado del paciente, la vía de administración, la formulación, y el criterio de quien realiza el estudio y otros factores evidentes para los expertos en la técnica. La dosis requerida de los compuestos de la invención es manifestada como diferencia entre sujetos tratados con éxito y testigos, con respecto a la estimulación del crecimiento del cabello y, en general, puede determinarse mediante observación directa.
La dosis de los compuestos de la invención puede variar según la extensión y la rigurosidad de la necesidad del tratamiento, la actividad del compuesto administrado, el estado general de salud del sujeto y otras consideraciones bien conocidas de los expertos en la materia. En general, pueden ser administrados a un ser humano típico sobre una base diaria, en forma de administración oral, de aproximadamente 0,1 mg/kg-1000 mg/kg, y más preferiblemente, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 200 mg/kg. La dosis parenteral será, apropiadamente, 20-100% de la dosis oral.
Si bien la administración tópica es preferible, en general, para estimular el crecimiento del cabello, dado que, en general, solamente se desean obtener efectos locales, en algunos casos también puede ser preferible un tratamiento sistémico.
Ensayos de compuestos útiles en la invención
Ensayos para determinar la aptitud de un compuesto para inhibir la actividad proteasomal y de inhibidores de la actividad de NF-\kappaB, son conocidos en la técnica. Se describen seguidamente dos ensayos típicos, pero no limitantes.
Evaluación de la actividad proteasomal
La actividad proteasomal se mide por el aumento de complejos proteínicos citoplásmicos ubiquitinilados, determinada por transferencia Western usando un anticuerpo anti-ubiquitina.
Se cultivan células MG-63 en confluencia, en medio alfa MEM y suero fetal de ternera (FCS) al 10%. Las células se tratan luego durante 24 horas con compuestos específicos. Después de los tratamientos indicados, las células son raspadas con un raspador desechable, lavadas dos veces con solución salina fosfatada (NaCl 137 mM, d-glucosa 10 mM, KCl 4 mM, Na_{2}HPO_{4} 0,5 mM, KH_{2}PO_{4} 0,1 mM), centrifugadas y el glóbulo resultante suspendido en el tampón de muestra que contiene SDS al 2%, pH 6,75. Las muestras se calientan y se calcula la concentración de proteína total por medio del kit de ensayo de proteínas micro de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL/EE.UU.) Las muestras se diluyen hasta obtener una concentración final de proteína de 2 mg/ml, se suplementa con 2-mercaptoetanol al 10% y azul de bromofenol al 1%, y se analiza mediante SDS-PAGE 4-15%. Los geles que resultan son sometidos a transferencia Western con anticuerpo policlonal de conejo anti-ubiquitina (diluido 1:100, Sigma, St. Louis, MO/ EE.UU.) Las muestras son visualizadas con peroxidasa de rábano picante copulada a anticuerpos de IgG anti-conejo (Amersham Corp, Arlington Heights, IL/ EE.UU. usando kits de detección de ECL (Amersham Corp.).
Ensayos de actividad de NF-\kappaB
Se tratan células con diferentes concentraciones de los compuestos y extractos nucleares preparados. En breve, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato y se vuelven a suspender en tampón de lisis (Nonidet P-40 0,6%, NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,9, EDTA 1 mM, DTT 0,5 mM y un "cocktail" de inhibidores de proteasas (Complete (TM), Boehringer Mannheim). Después de incubación sobre hielo durante 15 minutos, los núcleos son recogidos por centrifugación. El glóbulo se vuelve a suspender en tampón de extracción nuclear (Hepes 10 mM, pH 7,9, NaCl 420 mM, EDTA 0,1 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, DTT 0,5 mM, inhibidores de proteasas (Complete (TM), Boehringer, Mannheim), glicerina 25%), y se incuba a 4ºC durante 30 minutos. Se recoge el sobrenadante y se somete a diálisis en una solución tampón que contiene Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 5 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, y glicerina, 20%. Después de la diálisis el extracto nuclear se centrifuga para separar las proteínas precipitadas y partes alícuotas de almacenan a -70ºC. Se mide la concentración de proteínas en los extractos nucleares mediante el método de Bradford empleando un kit de ensayo de fijación de colorante (Bio-Rad).
La sonda para ensayos de desviación de la movilidad electroforética es un oligonucleótido de doble cadena marcado con ^{32}P que contiene la secuencia de consenso específica para NF-\kappaB (Promega). Los extractos nucleares (5 \mug) se someten a pre-incubación en 20 \mul de mezclas de reacción que contienen Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, DTT 2,5 mM, EDTA 0,5 mM, MgCl_{2} 1 mM, glicerina 4% y 5 \mug de poly(dI-dC). Al cabo de 10 minutos a temperatura ambiente se añaden 10-20 frmol de sonda y se incuba otros 20 minutos. Se separan los complejos de DNA-proteína de los oligonucleótidos libres sobre un gel de poliacrilamida al 5%/0,5X TBE (Tris-HCl 45 mM, ácido bórico 45 mM, EDTA 1 mM). Después de electroforesis, los geles se secan y se someten a autorradiografía.
Ensayos de inhibición de la producción
Compuestos que inhiben la producción de las enzimas que poseen actividad proteasomal o de NF-\kappaB, pueden ser evaluados midiendo el nivel de producción de esas proteínas en presencia y ausencia de compuestos candidatos. Los niveles de producción pueden ser medidos con facilidad en sistemas in vitro usando, por ejemplo, inmunoensayos para determinar el nivel de proteína producido. Los niveles de tales proteínas pueden ser determinados también utilizando, por ejemplo, marcado de metionina y separación por tamaños de las proteínas en las células sometidas a evaluación. Con objeto de realizar un nivel conveniente de producción de proteínas para la medida, es ventajosos utilizar sistemas de expresión recombinantes para las enzimas relevantes o el NF-\kappaB de interés de modo que se obtengan cantidades sustanciales.
Los enfoques típicos para inhibir la producción de NF-\kappaB o enzimas proteasomales incluyen el uso de tecnología antisentido o formación de tríplices con formas de doble cadena de secuencias de nucleótidos importantes en la expresión de los genes. Además, diversas moléculas pequeñas pueden inhibir también esta producción
Ensayos - Crecimiento del pelo: Ensayo in vivo de los efectos de compuestos sobre la proliferación de folículos pilosos y el crecimiento del pelo
El ensayo antes descrito para evaluar el efecto de compuestos sobre el crecimiento óseo de la bóveda craneal (calvario) puede ser utilizado también para determinar la aptitud de compuestos para estimular el crecimiento del pelo. El compuesto en ensayo o vehículo testigo apropiado se aplica a la parte superior e inferior del dorso de ratones blancos Swiss ICR machos o bien mediante administración tópica o mediante inyección subcutánea. El vehículo se selecciona según sea apropiado para el compuesto que ha de ser ensayado y según la vía de administración. Opcionalmente, el pelo de la zona de ensayo puede ser separado antes de la administración Después de un intervalo adecuado, típicamente 7 días, los ratones son anestesiados y se toma una biopsia de la zona de tratamiento dorsal usando un punzón dérmico de 6 mm. Las muestras son fijadas en formalina tamponada al 10% y embebidas en parafina, seccionadas y teñidas para observar los folículos pilosos. Además, puede utilizarse fotografía para observar y registrar el crecimiento del pelo; típicamente, tal crecimiento se observa al cabo de 14-18 días. Después de un intervalo adecuado, típicamente 21 días, los animales pueden ser eutenizados y el pelo puede ser examinado para efectuar el análisis de las fibras y el del tejido procedente de la zona de tratamiento para efectuar la cuantificación de los folículos pilosos.
Naturaleza de los compuestos útiles en la invención
Los compuestos útiles en los métodos y usos de la invención, son inhibidores de la actividad proteasomal y preferiblemente también, inhibidores del factor NF-\kappaB de la transcripción. Inhibidores conocidos de estas actividades pueden ser encontrados en la bibliografía o pueden ensayarse compuestos para estas actividades empleando ensayos conocidos en la técnica. Además, pueden evaluarse inhibidores que hacen disminuir el nivel de expresión efectiva de la secuencia de nucleótidos que codifica las enzimas, que poseen actividad proteasomal y utilizarse en los métodos de la invención.
Los compuestos así identificados incluyen compuestos que inhiben el camino de los isoprenoides, tales como las estatinas. Una descripción de estos compuestos puede encontrarse en los documentos WO 98/25460 y U.S. Ser No. 09/096.631.
Por conveniencia el camino de los isoprenoides al que se alude, está expuesto en esta memoria en la Figura 2. Una clase de compuestos que son inhibidores, son las estatinas que tienen la fórmula
1 
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en la que X en cada una de las fórmulas (1) y (2) representa un engarce alquileno, alquenileno o alquinilino de 2-6C, sustituido o sin sustituir;
Y representa uno o más anillos carbocíclicos o heterocíclicos en que, cuando Y comprende dos o más anillos, dichos anillos pueden estar fusionados; y
R^{1} representa un catión, H o un grupo alquilo de 1-6C sustituido o sin sustituir; y
las líneas de puntos representan enlaces \pi opcionales.
Estos compuestos pueden ser empleados en el método de la invención en cuanto se refiere a la estimulación del crecimiento del cabello.
Los compuestos que se sabe que son inhibidores de proteasomas o de NF-\kappaB incluyen:
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2 
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Véanse, por ejemplo, Vinitsky, A. et al., J. Biol. Chem. (1994 269:29860-29866; Figueiredo-Pereira, M.E. et al., J. Neurochem (1994) 63:1578-1581; Wojcik, C. et al., Eur. J. Cell Biol. (1996) 71:311-318
Se sabe que la lactacistina, que figura en la lista anterior, es un inhibidor irreversible de la actividad de proteasomas. Se une a la subunidad catalítica \beta y es un inhibidor específico del proteasoma 20S. También inhibe irreversiblemente el NF-\kappaB.
El SN50 es la NLS (secuencia nuclear de localización) de p50 más la región hidrófoba de K-FGF. Inhibe la translocación del complejo activo de NF-\kappaB hacia el núcleo.
Ciertas epoxicetonas peptidílicas tales como la EST son inhibidores irreversibles de los proteasomas. La MG-132 muestra actividad contra la actividad quimotríptica de la proteína 20S sin afectar a su actividad de ATPasa o isopeptidasa e inhibe reversiblemente la actividad del NF-\kappaB. Las MG-115 y MG-341 manifiestan actividades similares a la de la MG-132. Otros diversos inhibidores de NF-\kappaB son menos activos en el ensayo de ABA. Estos incluyen capsaicina, curcumina y resiniferatoxina. Otros compuestos que se sabe que inhiben el NF-\kappaB son la gliotoxina y el PDTC (ácido 1-pirrolidina-carbotiótico). Otros diversos compuestos tales como el BAY-11-7082 y el BAY-11-7085 así como la caliculina-A inhiben la fosforilación del NF-\kappaB. El inhibidor de calpaína inhibe la calpaína 1 y el proteasoma; otros compuestos tales como la olomoucina y la roscovitina inhiben cdk2 y/o cdk5.
Un compuesto adicional que se ha indicado que es un inhibidor de proteasomas es la pentoxifilina (PTX. (Combaret L. et al., Mol. Biol. Rep. (1999) 26:95-101. Este compuesto es activo en el ensayo del calvario, in vitro, anteriormente descrito.
Como se ha expuesto antes, en realizaciones preferidas de los métodos de la invención, los compuestos identificados inhiben el camino de los isoprenoides, típicamente como muestra la Figura 1. En otras realizaciones preferidas están descritos compuestos en las solicitudes de patente PCT WO98/17267, WO97/15308 y WO97/48694 citadas. El uso de estos compuestos en el método de estimulación del crecimiento del cabello, según la invención, está incluido.
Los ejemplos que siguen están destinados a ilustrar pero no a limitar la invención.
Ejemplo 1 Cribado de alto rendimiento
Miles de compuestos han sido analizados en el sistema de ensayo expuesto en el documento U.S. Ser. No. 08/458.434, presentado el 2 de Junio de 1995,. Compuestos representativos de la invención dieron respuestas positivas, mientras que la mayoría de compuestos (sin relacionar) son inactivos. En este cribado, el testigo positivo estándar era el compuesto 59-0008 (denominado también "OS8", que tiene la fórmula:
3
Con más detalle, se emplearon las células 2T3-BMP-2-LUC, una línea celular de osteoblastos transformada de modo estable, descrita por Ghosh-Choudhury et a en Endocrinology (1996) 137:331-39, anteriormente referenciada, Las células fueron cultivadas empleando un medio \alpha-MEM, FCS al 10% con penicilina/estreptomicina al 1% y glutamina al 1% ("medio de cultivo en placa") y fueron divididas 1:5 una vez por semana. Para el ensayo, las células fueron resuspendidas en un medio de cultivo en placa que contenía FCS al 4%, distribuidas en placas de microtitulación en una concentración de 5 x 10^{3} células (en 50 \mul)/pocillo), e incubadas durante 24 horas a 37ºC en CO_{2} al 5%. Para iniciar el ensayo, se añadió a cada pocillo 50 \mul del compuesto a ensayar o el testigo, en el seno de DMSO, en una concentración 2X, con lo que el volumen final fue 100 \mul. La concentración sérica final fue 2% de FCS y la concentración final de DMSO fue 1%. Se usó como testigo positivo el compuesto 59-0008 (10 \muM).
Las células tratadas fueron incubadas durante 24 horas a 37ºC y CO_{2} al 5%. Después se separó el medio y las células fueron lavadas tres veces con PBS. Después de retirar el PBS en exceso, se añadió a cada pocillo 25 \mul de reactivo de lisis de cultivo celular 1X (Promega nº E153A) y se incubó durante diez minutos por lo menos. Opcionalmente, las placas/muestras pudieron ser congeladas en este punto. A cada pocillo se añadió 50 \mul de sustrato de luciferasa (Promega nº E152A; 10 ml de tampón de ensayo de luciferasa Promega por 7 mg de sustrato de ensayo de luciferasa Promega). Se midió la luminiscencia en un medidor de luminosidad de 96 pocillos automatizado y se expresó el resultado o bien como picogramos de actividad de luciferasa por pocillo o como picogramos de actividad de luciferasa por microgramo de proteína.
En este ensayo, el compuesto 59-0008 (3-fenilazo-1H-4,1,2-benzotiadiazina) pone de manifiesto un esquema de reactividad que es máximo en una concentración de aproximadamente 3-10 \muM. De conformidad con ello, otros compuestos ensayados pueden ser evaluados en varias concentraciones, y compararse los resultados con los resultados obtenidos para el compuesto 59-0008 a 10 \muM (cuyo valor sería normalizado a 100). Alternativamente, la reactividad de un compuesto a ensayar puede ser comparada directamente con la de un testigo negativo que no contiene compuesto.
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El compuesto testigo 59-0328, que es la simvastatina, da una respuesta buena. Los inhibidores de proteasomas conocidos MG-132 y MG-115 muestran también alta actividad; el MG-132 es eficaz a concentraciones más bajas, También se han obtenido respuestas positivas usando lactacistina. Sin embargo, la gliotoxina, la olomoucina, la roscovitina, el SN50, el PDTC y la capsaicina no dan respuestas prometedoras.
Ejemplo 2 Formación de hueso in vitro
Compuestos seleccionados y testigos apropiados fueron ensayados in vitro (ex vivo) para determinar la actividad de formación de hueso (anteriormente descrita en "Techniques for Neonatal Mouse Calvaria Assay" (in vitro). Evaluaciones histomorfométricas de calvario ex vivo fueron llevadas a cabo usando un programa OsteoMetrics de medida de la morfometría ósea, siguiendo las indicaciones del fabricante. Las medidas fueron realizadas usando o bien un objetivo de 10 ó 20 aumentos con una cuadrícula del ocular de recuento puntual estándar.
Se determinó la formación de hueso nuevo (usando un objetivo 10X) midiendo la zona de hueso nuevo que se había formado en un campo, en 3 secciones representativas de cada hueso (4 huesos por grupo). Cada medida se llevó a cabo en una distancia de ½ campo desde el extremo de la sutura. Se midió la superficie del hueso total y la del hueso antiguo. Los resultados obtenidos fueron expresados como superficie del hueso nuevo en \mum^{2}.
Los resultados del Ejemplo 1 estaban correlacionados algo imperfectamente con los resultados de este ensayo. El compuesto testigo, la simvastatina, mostró formación de hueso nuevo en este ensayo como lo hicieron los compuestos MG-132 y la lactacistina. El MG-115 mostró asimismo resultados positivos aun cuando menos espectaculares que los de la simvastatina. Sin embargo, la gliotoxina, que aparecía como negativa en el ensayo ABA del Ejemplo 1, demostró capacidad para estimular el crecimiento del hueso. Los restantes compuestos, olomoucina, roscovitina, SN50, PDTC y capsaicina se mostraron negativos en esta ensayo.
Los números de osteoblastos se determinan por recuento puntual. El número de células de osteoblastos que revisten la superficie del hueso por ambas caras del hueso, se cuentan en un campo usando un objeto de 20X. Los resultados obtenidos se expresan como número de osteoblastos/mm de superficie del hueso.
La actividad de fosfatasa alcalina se mide en los medios acondicionados de los cultivos de órganos murinos, usando el método descrito por Majeska, R.J. et al., en Exp. Cell Res. (1978) 111:465-465. Los medios acondicionados se incuban a 37ºC durante 20 minutos con sustrato de fosfatasa 104 (Sigma) y la reacción se detiene con 2 ml de NaOH 0,1 M. L actividad de fosfatasa alcalina se calcula midiendo el sustrato escindido, en una densidad óptica de 410 nm, en un espectrofotómetro Beckman de doble haz desde la DO410 y corregida por la concentración de proteína.
En este ensayo fueron analizados los compuestos PSI y MG-132, así como los compuestos testigo/factores bFGF y BMP-2 y un testigo de vehículo, o y las bóvedas craneales fueron analizadas histomorfométricamente, según se ha descrito antes. Se midieron el aumento de superficie ósea en función de la concentración, el aumento de osteoblastos y el aumento de actividad de la fosfatasa alcalina para el PSI.
Los resultados obtenidos indican que el PSI es tan bueno o mejor, que el BMP-2 y el bFGF (dos agentes "patrón oro" para el crecimiento del hueso; véase Wozney, J. Molec. Reprod. Dev. (1992) 32:160-67) documento WO 95/24211) para inducir la formación del hueso.
Un experimento adicional, pentoxifilina (PTX) fue llevado a cabo en el ensayo que sigue. Este compuesto puso de manifiesto la aptitud de mejorar la formación de hueso nuevo en concentraciones tan bajas como 0,1 \mum. En una concentración de 10 \mum, la PTX mostró aumentar la formación de hueso nuevo respecto al testigo en más de 100%; a 100 \muM, el aumento fue, aproximadamente, tres(3) veces el del testigo.
Ejemplo 3 Resultados obtenidos de crecimiento oseo del calvario in vivo
Los compuestos PSI y MG-132 fueron ensayados in vivo según el procedimiento operatorio descrito anteriormente (véase "In vivo Assay of Effects of Compounds on Murine Calvarial Bone Growth", referencia bibliográfica anterior). Como testigo, la simvastatina proporcionó un aumento de 1,5 veces en el número de osteoblastos.
En un experimento, testigo de vehículo, bFGF y dosis variables de PSI fueron ensayados en el ensayo in vivo de crecimiento óseo del calvario. Los resultados se exponen como medida de la superficie ósea total, % de aumento de superficie con respecto a la del testigo de vehículo, y % de aumento de la anchura del nuevo hueso como se indica seguidamente:
4
Además de esto, un examen histológico indicó confirmación del crecimiento del hueso tanto cuando se usó 5 mg/kg/día de PSI como cuando se usó 1 mg/kg/día.
Ejemplo 4 Resumen de efectos sobre la formación del hueso
La tabla que figura seguidamente resume los resultados obtenidos con los compuestos analizados en los diversos ensayos expuestos anteriormente. Se aprecia que los compuestos que son inhibidores de proteasomas también mejoran la formación del hueso. En los compuestos ensayados de esta tabla, no obstante, los compuestos que se sabe que son inhibidores solamente del NF-\kappaB pero que fallan en inhibir la actividad proteasomal, no aumentan la actividad de luciferasa (indicativa de actividad promotora de BMP-2) en el ensayo de alto rendimiento, ni mejoran la formación del hueso en el ensayo del calvario in vitro en tan gran extensión como los inhibidores de proteasomas.
Los compuestos útiles de la invención incluyen:
5
6
Ejemplo 5 Efecto del PSI y otros inhibidores de proteasomas sobre la producción de folículos pilosos
El ensayo de crecimiento óseo del calvario, in vivo, del Ejemplo 3, fue modificado para observar el número de folículos pilosos en ratones tratados. En las observaciones iniciales se inyectó PSI (5 mg/kg/día), tres veces al día, durante 5 días, sobre el calvario de ratones ICR Swiss, según se ha descrito anteriormente. Dieciséis días después los ratones fueron sacrificados. La histología de los calvarios reveló un aumento sorprendentemente grande del número de folículos pilosos en los ratones tratados con PSI frente a los ratones testigo. Además del PSI, el MG132 (10 mg/kg), el MG115 (10 mg/kg) y la lactacistina, administrados del mismo modo, estimularon también un aumento del número de folículos pilosos.
Ejemplo 6 Estimulación del crecimiento del pelo
Ratones ICR Swiss fueron tratados primeramente para retirar el pelo de la región del pericráneo y de la zona dorsal del modo siguiente. Se licuó parafina por calentamiento a 55ºC y la parafina licuada se aplicó luego a cepillo al pericráneo y/o el dorso (bajo anestesia). Se dejó solidificar la cera y luego se retiró. El día siguiente a la retirada del pelo se inyectó PSI (1 mg/kg/día) por vía subcutánea, tres veces al día, durante cinco días, en la región del pericráneo y la zona dorsal. El día 7 se realizó una biopsia por punción dérmica; el examen histológico reveló un gran aumento del número de folículos pilosos en los ratones a los que se había administrado PSI frente a los ratones testigo. El día 18 pudo observarse que los ratones tratados tenían una velocidad de crecimiento del pelo mayor que el de los ratones del grupo testigo.
Los ratones fueron sacrificados el día 21 y se llevó a cabo un examen histológico sobre la dermis del pericráneo y de la zona dorsal. En los ratones tratados, folículos pilosos maduros en número mucho mayor que en los testigos habían emigrado hacia la región inferior de la dermis. Con un examen más estricto se observó que los ratones que habían recibido solamente vehículo tenían folículos pilosos inactivos. Cuando se trató con PSI tales folículos fueron estimulados diferenciándose en folículos pilosos maduros y emigrando hacia la región inferior de la dermis.
Ejemplo 7 Administración tópica
Se preparó PSI en forma de formulación tópica siendo el vehículo 50% de propilenglicol, 30% de etanol, 20% de agua desionizada y una concentración de PSI de 0,1%. La solución se aplicó 3 veces al día durante 5 días. Los ratones del grupo tratado fueron observados en comparación con testigos tratados de modo semejante solamente con vehículo. Los resultados el día 16 pusieron de manifiesto estimulación del crecimiento del pelo con relación a los
testigos.
Además de estimular el crecimiento del pelo, el PSI era capaz de engrosar tanto el pelo como el eje del pelo. El PSI aumenta el recuento de pelos cuando la superficie del folículo es mayor de 0,01 mm^{2}. Al repetir el protocolo anterior empleando una solución de PSI al 0,5% en grupos que contenían 5 ratones cada uno, el número de pelos por 0,8 mm^{2} era 60 en los ratones tratados, frente a 10, aproximadamente, en el grupo testigo. El porcentaje de superficie de folículos en una región de 0,8 mm^{2} aproximadamente, era de alrededor del 30% por término medio en el grupo tratado en comparación con el 15% por término medio en el grupo testigo.
Ejemplo 8 Requisitos de dosis
Con objeto de determinar la dosis mínima eficaz de PSI cuando se utiliza tópicamente, se preparó una curva de dósis-respuesta para el PSI. Todos los experimentos fueron llevados a cabo según las regulaciones actuales de buenas prácticas de laboratorio (21CFR58). Los ratones fueron divididos en 7 grupos con 10 ratones cada uno, uno de cuyos grupos era testigo tratado solamente con vehículo y los grupos 1-6 con una serie de concentraciones crecientes de PSI en un vehículo que comprendía 50% de propilenglicol, 30% de etanol y 20% de agua desionizada. Las concentraciones fueron 0,006%, 0,012%, 0,025%, 0,05%, 0,11% y 0,5%.
Los ratones fueron anestesiados (50 \mul de "Mouse Cocktail" que contenía 3 ml de ketamina, 2 ml de rompum de animales pequeños, 5 ml de NaCl), identificados mediante un código por taladro de la oreja, pesados y retirado el pelo del lado dorsal por tratamiento con parafina, como se ha descrito en el Ejemplo 6. Después del tratamiento con la parafina, los animales fueron fotografiados. Al día siguiente (día 1), 100 \mul de PSI a las concentraciones anteriores fueron aplicados a pincel sobre la zona de la que se había retirado el pelo. Una aplicación similar de solución de PSI fue efectuada diariamente durante un período adicional de 4 días.
El día 7 los ratones fueron anestesiados y se realizó una biopsia de la zona dorsal de tratamiento usando un punzón dérmico de 6 mm; las muestras fueron fijadas en formalina tamponada al 10% y embebidas en parafina. Se cortaron secciones usando un microtomo estándar.
Los ratones fueron examinados diariamente para determinar señales de crecimiento del pelo y el crecimiento del pelo fue registrado por fotografía. El día 21 los animales fueron eutanizados (75 mg de fenobarbital por kg de peso, inyección IP), se tomaron muestras de 2 cm del pelo para análisis de la fibra por observación óptica y la zona dorsal restante del tratamiento fue fijada en formalina tamponada al 10% para realizar un análisis histológico posterior. El análisis incluyó la cuantificación del grosor del pelo y la cuantificación de los folículos pilosos maduros. Los resultados fueron expresados como la media = +/- el error estándar de la media. Los resultados obtenidos fueron analizados mediante medidas repetidas de análisis de la varianza seguido de los valores P después del ensayo, de Tukey-Kramer, de <0,05 considerados significantes.
\newpage
Los resultados indican que la dosis mínima eficaz de PSI es 0,5% aplicada 1 vez al día durante 4 días; experimentos adicionales pusieron de manifiesto que también era eficaz una dosis de 0,1% de PSI aplicada tópicamente 3 veces al día, durante 5 días.
Una observación groso modo de los ratones que habían recibido una dosis eficaz indicó una velocidad aumentada de crecimiento del pelo, un engrosamiento del diámetro del pelo, un aumento en el diámetro de la vaina y una diferenciación de los folículos pilosos inactivos hacia formas más maduras.

Claims (16)

1. Un método cosmético para tratar un sujeto mamífero de un estado que se beneficia por la estimulación del crecimiento del cabello, cuyo método comprende administrar a dicho sujeto mamífero una cantidad eficaz para estimular el crecimiento del cabello de un compuesto que inhibe la actividad proteasomal o que inhibe la producción de estas proteínas, en el que dicho compuesto es una estatina, un aldehído peptidílico o una epoxicetona peptidílica, o está seleccionado entre el grupo que consiste en pentoxifilina, gliotoxina, SN50, Bay 11-7082, capsaicina, PDTC, PPM-18. lactacistina y MG262.
2. El método según la reivindicación 1, en el que dicho compuesto es una estatina o es PSI.
3. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho sujeto es un ser humano.
4. El método según la reivindicación 1, en el que dicho estado que ha de ser tratado, es la calvicie masculina, la alopecia causada por quimioterapia, el adelgazamiento del pelo debido al envejecimiento, o un trastorno genético.
5. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho sujeto es un mamífero no humano.
6. El método según la reivindicación 5, en el que dicho crecimiento del cabello proporciona protección adicional frente a las temperaturas frías.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho crecimiento del cabello está caracterizado por una velocidad aumentada de crecimiento de longitud y/o de grosor del cabello, o por la aparición de proliferación de nuevos folículos pilosos.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho compuesto se administra conjuntamente en una película o matriz biodegradable, con un agente que favorece el crecimiento o infiltración tisular.
9. El método según la reivindicación 8, en el que dicho agente es un factor de crecimiento epidérmico, un factor de crecimiento de fibroblastos, un factor de crecimiento derivado de plaquetas, un factor de crecimiento transformante, una hormona paratiroidea, un inhibidor/factor de leucemia, o un factor de crecimiento semejante a la insulina.
10. El uso de un compuesto que inhibe la actividad proteasomal o que inhibe la producción de estas proteínas, para la fabricación de un medicamento para estimular el crecimiento del cabello de un sujeto mamífero en el que dicho compuesto es una estatina, un aldehído peptidílico o una epoxicetona peptidílica, o está seleccionado entre el grupo que consiste en pentoxifilina, gliotoxina, SN50, Bay 11-7082, capsaicina, PDTC, PPM-18, lactacistina y MG262.
11. El uso según la reivindicación 10, en el que dicho compuesto es una estatina o es PSI.
12. El uso según la reivindicación 10 ú 11, en el que el medicamento es para el tratamiento de la calvicie masculina, la alopecia causada por quimioterapia, el adelgazamiento del cabello debido al envejecimiento o un trastorno genético.
13. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que dicho crecimiento se caracteriza por una velocidad aumentada de crecimiento de longitud y/o grosor del cabello, o por la aparición de proliferación de nuevos folículos pilosos.
14. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que dicho compuesto se administra conjuntamente, en una película o matriz biodegradable, con un agente que favorece el crecimiento o infiltración tisular.
15. El uso según la reivindicación 14, en el que dicho agente es un factor de crecimiento epidérmico, un factor de crecimiento de fibroblastos, un factor de crecimiento derivado de plaquetas, un factor de crecimiento transformante, una hormona paratiroidea, un inhibidor/factor de leucemia o un factor de crecimiento semejante a la insulina.
16. Un método para identificar un compuesto que estimula el crecimiento del cabello, cuyo método comprende:
someter un compuesto candidato a un ensayo para evaluar su capacidad para inhibir la actividad proteasomal, con lo que se identifica un compuesto que inhibe la actividad proteasomal como un compuesto que estimula el crecimiento del cabello; o
someter un compuesto candidato a un ensayo para evaluar su capacidad para inhibir la producción de enzimas con actividad proteasomal, con lo que se identifica un compuesto que inhibe la producción de enzimas con actividad proteasomal como un compuesto que estimula el crecimiento del cabello.
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