【発明の詳細な説明】
Ｃｅｄ−３及び関連蛋白質のインヒビター背景
細胞死は、動物発生の基本的な面である。多くの細胞が、脊椎動物（Glucksma
nn, Biol. Rev. CambridgePhilos. Soc. 26:59-86 (1951)）及び無脊椎動物（Tr
uman, Ann. Rev.Neurosci. 7:171-188 (1984)）の両者における正常発生の間に
死ぬ。これらの死は、形態形成、変態及び組織ホメオスタシス並びにニューロン
特異性及び性的二型性の発生において機能するようである（Ellis等、Ann. Rev.
Cell Biol. 7:663-698 (1991)に総説あり）。細胞に死を引き起こす機構及びど
の細胞が生きてどの細胞が死ぬべきかを特定する機構の理解は動物発生の理解に
とって必須である。
線虫Caenorhabditis elegansは、自然の即ちプログラムされた細胞死を分析す
るために適当な生物である（Horvitz等、Neurosci. Comments. 1:56-65(1982)）
。９５９個の成虫C. elegans両性個体の体細胞の発生は、更なる１３１個の細胞
の発生とその後の死を伴う（Sulston及びHorvitz, Dev. Viol. 82:110-156(1977
); Sulston等、Dev. Biol. 100:64-119(1982)）。C. elegansにおけるプログラ
ムされた細胞死を受ける細胞の形態学は、光学顕微鏡及び電子顕微鏡の
両方のレベルで記載された（Sulston 及び Horvitz，Dev． Biol． 82:100-156
(1977)： Robertson及びThomson， J． Embryol．Exp．Morph．67:89-100(1982
)）。
C． elegansのプログラムされた細胞死に影響を与える多くの遺伝子が同定さ
れた（Ellis等、 Ann．Rev．CellBiol． 7:663-698 (1991)に総説あり）。これ
らの２つの遺伝子ced-3及びced-4の活性が、殆どすべてのC．elegansのプログラ
ムされた細胞死の開始に必要である（Ellis 及び Horvitz，Cell44:817-829 (19
86)）。ced-3又はced-4の何れかの活性を除去すると、通常は死ぬ細胞が死なず
に生き延び、認識可能な細胞型に分化して機能することさえ可能である（Ellis
及び Horvitz，Cell 44:817-829 (1986)； Avery及びHorvitz， Cell 51:107
1-1078 (1987); White等、 Phil．Trans．R．Soc．Lond． B. 331:263-271 (1
991)）。遺伝的モザイク分析は、ced-3及びced-4遺伝子が死ぬ細胞内で細胞自律
的様式で作用するらしいことを示し、これらの遺伝子の産物が死ぬ細胞内で発現
され且つ何れかが細胞毒性分子であるか又は細胞毒性分子の活性を制御すること
を示唆した（Yuan及びHorvitz，Dev．Biol．138:33-41(1990)）。発明の要約
この発明は、主として次の２つの実験的発見及びそれ
らの関連に基づいている：１）ヒトインターロイキン１βコンバーターゼ（ＩＣ
Ｅ）（プロインターロイキン１βを活性なサイトカインに変換してヒトにおける
炎症応答に関与する）がC．elegans細胞死遺伝子ced-3によりコードされる蛋白
質にかなりの類似性を有すること；及び２） ced-3遺伝子のアミノ末端蛋白質
を含む融合構築物がC．elegansにおける細胞死を阻止し得ること。出願人により
発見されたように、ヒトＩＣＥ及び線虫Ced-3蛋白質は、全体で、２８％のアミ
ノ酸同一性を有する。カルボキシル末端領域（両蛋白質の活性に重要であること
が示された領域）において高度の類似性が見出された。更に、ＩＣＥ活性に重要
な３つの配列（活性システイン及び２つの自己開裂部位を囲む領域）が、ced-3
遺伝子産物において保存されていることが示された。
従って、以前には無関係と考えられた２種の蛋白質（非類似の生理学的役割を
有する）の間に有意の構造的類似性が示された。この発見は幾つかの関係へ導き
、それらの幾つかは下記の通りである：
１）ヒトＩＣＥ遺伝子は、細胞死を引き起こすことにおいてced-3の活性と類似
する活性を有する；
２）Ced-3蛋白質は又、ＩＣＥの基質特異性と類似する基質特異性を有するシス
テインプロテアーゼでもある；
３）ced-3遺伝子における突然変異に対応するＩＣＥにおける突然変異は、不活
性化及び構成的活性化等の類似の効果を生じる；
４）ced-3及びＩＣＥ遺伝子は、構造的に関係する遺伝子ファミリーのメンバー
であり、ここではced-3／ＩＣＥファミリーと呼び、それらの幾つかは細胞死遺
伝子であるらしく、幾つかは基質特異的プロテアーゼをコードし得る；
５）ＩＣＥのインヒビター例えば、ＩＣＥ認識部位又は置換した認識部位を含む
ぺプチドアルデヒド及び牛痘ウイルスCrmA蛋白質は又、細胞死を阻止するために
も有用であり得る；及び
６）ced-3インヒビター例えば、この遺伝子の阻害性蛋白質又はコードされた産
物も又、炎症を阻止するために有用であり得る。
この今まで未知の細胞死蛋白質と炎症応答に関与するプロテアーゼとの関係は
、急性及び慢性の炎症性疾患、ＩＬ−１βが関係する白血病、及び細胞死により
特徴付けられる病気及び状態（例えば、心筋梗塞、卒中、外傷性脳傷害、ウイル
スその他の型の病原体の感染、神経及び筋肉退行性疾患、加齢、脱毛等）の治療
のための新規な薬剤及び方法の開発のための基礎を提供する。更に、細胞死を増
加させ且つ細胞集団（例えば、癌細胞、感染細胞、自己反応性抗体を産生する細
胞及び毛嚢細胞等）の大きさ及び増殖能力を減じるのに有用である薬剤、並びに
病害虫、寄生虫及び組換え生物等の生物を無能力にし又は殺す薬剤を、ced-3、
ＩＣＥ及び他のced-3／ＩＣＥ遺伝子及びそれらの遺伝子の産物を用いて開発す
る
ことが出来る。
この仕事は又、ced-3／ＩＣＥ遺伝子ファミリーの更なるメンバーを同定する
ためのプローブ及び方法をも提供する。ced-3及びＩＣＥに関連する遺伝子は、
種々の生物に存在することが予想される。これらの幾つかは、細胞死遺伝子及び
／又はプロテアーゼであろう。これらの関連遺伝子の配列及びそれらのコードさ
れた産物を、例えばコンピューターに基づく分析を用いて比較してそれらの類似
性を測定することが出来る。例えば、構造比較は、それらの機能的に類似し且つ
重要でありそうな遺伝子又はコードされた産物の領域又は特徴を指示するであろ
う。かかる情報を用いて、ced-3、ＩＣＥの活性又はced-3／ＩＣＥ遺伝子を真似
し又は変え、それ故に上記の種々の医療上の及び農業上の応用において有用であ
り得る薬剤をデザインすることが出来る。
更に、他の哺乳動物蛋白質であるマウスＮＥＤＤ−２蛋白質も又、Ced-3に類
似していることが見出された。興昧深いことに、ＮＥＤＤ−２は、有意にＩＣＥ
に類似していない。それ故、他の潜在的な哺乳動物細胞死遺伝子が同定された。
β−ガラクトシダーゼに融合されたCed-3蛋白質のアミノ末端部分をコードす
る融合構築物がC．elegansにおける細胞死のインヒビターとして作用するという
発見も又ここに記載する。Ced-3への構造類似性のために、ヒトＩＣＥ蛋白質の
対応部分をコードする構築物は又、イ
ンターロイキン１βの開裂におけるＩＣＥの酵素活性を阻害することが予想され
る。従って、Ced-3蛋白質のアミノ末端部分、ＩＣＥ蛋白質又は他のCed-3／ＩＣ
Ｅファミリーのメンバーを含むインヒビター並びにこれらの蛋白質部分を発現す
るＲＮＡ及びＤＮＡ構築物は、種々の病理に関与する細胞死及び／又は炎症を減
じるために潜在的に有用である。Ced-3及びＩＣＥ遺伝子の他の阻害蛋白質を同
定する方法も又記載する。
更に、Ced-3及びＩＣＥ遺伝子の阻害性アミノ末端部分の欠失は、これらの遺
伝子の構成的活性化を生じ得る。それ故、構成的に活性化したこれらの遺伝子又
はそれらのコードする産物のカルボキシル末端部分は、増大した細胞死又は増大
した炎症応答が望ましい応用において重要であり得る。図面の簡単な説明
図１は、第ＩＶ染色体上のCed-3領域の物理地図及び遺伝地図を示している。
図２には、Ｃ４８Ｄ１内にCed-3を位置させる実験をまとめてある。プラスミ
ッドＣ４８Ｄ１及びサブクローンプラスミッドの制限部位を示す。Ced-3活性を
、Ｌ１幼若動物の頭部における細胞の死骸の数として評価した。＋＋、１０を超
える細胞死骸の数。＋、１０未満で２より多い細胞死骸の数。−、２未満の細胞
死骸の数。
図３Ａ〜Ｈは、ced-3のヌクレオチド配列（配列番号
１）及び演繹したアミノ酸配列（配列番号２）を示す。ced-3領域のゲノム配列
をプラスミッドｐＪ１０７から得た。イントロン及び１２のced-3突然変異の位
置を示してある。ありそうな翻訳開始部位を塗りつぶした矢じりにより示す。Ｒ
ＮＡのＳＬ１スプライスアクセプターを箱に入れてある。反復要素を関連配列の
上側の矢で示す。両側の番号は、ヌクレオチド位置を示す。アミノ酸配列下の番
号は、コドン位置を示す。
図４Ａは、ced-3遺伝子のゲノム構造及び突然変異の位置を示す。イントロン
及びエキソンの寸法をｂｐで与える。下向きの矢は、１２のced-3のＥＭＳ誘導
突然変異の位置を示す。右を指している矢は、転写の向きを示す。塗りつぶした
矢じりは、翻訳間始部位を示す。中空の矢じりは、終止コドンを示す。
図４Ｂは、エキソン（番号１〜７）に関する突然変異の位置及びced-3中のコ
ードされたセリンリッチ領域を示す。
図５は、Ced-3蛋白質のKyte−Doolittle疎水性プロットである。
図６Ａ〜Ｂは、Ced-3（配列番号２）及びヒトインターロイキン１βコンバー
ターゼ（ＩＣＥ；配列番号４）のアミノ酸配列の整列を示す。垂直の線は同一の
アミノ酸を示し、単一の又は二重の点は類似するアミノ酸を示す（二重点は単一
点より近い類似性を示す）。Ced-3のセリンリッチ領域及び不活性化突然変異を
示す。ＩＣＥ
の活性部位及び自己開裂部位を示す。ＢＧＡＦＱ及びＰＢＡ構築物によりコード
されたCed-3蛋白質の部分も又示す。
図７は、Ced-3（配列番号２）及びマウスＮＥＤＤ−２（配列番号１３）のア
ミノ酸配列の整列を示す。垂直線及び単一点及び二重点は、図６Ａ〜Ｂにおける
ように類似性の程度を示す。Ced-3の不活性化突然変異を示す。
図８Ａは、３種の線虫（C． briggsae， C． elegans，C． vulgaris）のCed-
3蛋白質並びにマウス（配列番号１４）及びヒトＩＣＥのアミノ末端領域の整列
を示す。コンセンサス配列も又示す。半数より多くの配列において同じ残基を有
するアミノ酸位置に陰をつけてある。完全に保存されたアミノ酸は箱に入れても
ある。
図８Ｂは、３種の線虫のCed-3蛋白質、ヒト及びマウスＩＣＥ、並びにマウス
ＮＥＤＤ−２蛋白質のカルボキシル末端領域の整列を示す。ＮＥＤＤ−２を除い
て、これらの配列は、図８Ａに示した対応する配列と連続している。コンセンサ
ス配列及びアミノ酸の保存をも示す。
図９は、C． elegans（第１行；配列番号２）及び２種の関連線虫種 C． brig
gsae（第２行；配列番号５）及びC． vulgaris（第３行；配列番号６）のCed-3
蛋白質の比較を示す。保存されたアミノ酸を「・」により示す。整列させる目的
で配列に挿入されたギャップを「−」により示す。
図１０は、インターロイキン１βコンバーターゼｃＤＮＡ（配列番号３）であ
る。
図１１Ａは、プログラムされた細胞死を阻止し得る２つの融合構築物の図式表
示である。
図１１Ｂは、融合構築物のlacZ含有部分の図式表示である。発明の詳細な説明
この発明は、ヒトの酵素インターロイキン１βコンバーターゼ（ＩＣＥ）が、
C．elegans細胞死遺伝子ced-3の蛋白質産物に対する有意の構造類似性を有する
という発見に基づいている。ced-3及び他の細胞死遺伝子ced-4の活性は、線虫の
発生中に起きる殆どすべての細胞死に必要であることが示された。ＩＣＥは、生
理学的意義が、免疫及び炎症応答の主要媒介物であるインターロイキン１（ＩＬ
−１）の一形態の成熟における役割に関係すると考えられたシステインプロテア
ーゼである（Fuhlbrigge等、The Year in Immunology， Cruse 及びLewis編、Ka
rger， Basel， 1989. 21-37頁）。２つの離れて関連するＩＬ−１の形態α及び
βがあり、β型が優勢種である。ＩＣＥは、選択的に、プロインターロイキン１
βを活性なサイトカインＩＬ−１βに変換する。活性ＩＬ−１βの産生は、急性
及び慢性の炎症性疾患、敗血症性のショック、並びに傷の治癒及びウイルス感染
への抵抗性を含む他の生理学的過程に関連した（Ｒａｙ等、
Cell 69:597-604 (1992)）。この発見の結果として、炎症性応答及び炎症性疾
患に関与することが知られた酵素が細胞死過程にある役割を有して関連している
。この発見は、線虫のced-3遺伝子と同等の細胞死遺伝子が種々の生物において
機能するという考えと一致する。それらの遺伝子産物の間の構造類似性は、ＩＣ
Ｅ遺伝子がced-3細胞死遺伝子のヒトにおける等価物であることを示唆する。更
に下記に説明するように、Ced-3蛋白質におけるＩＣＥのある種の特徴の保存は
、更に、Ced-3がＩＣＥの基質特異性と類似した基質特異性を有するプロテアー
ゼであることを示唆する。
更に、ced-3及びＩＣＥの、構造的に関連した遺伝子（即ち、コードした産物
又は遺伝子自身が構造的に類似している遺伝子）としての同定は、構造的に関連
した遺伝子のファミリーが存在してこのced-3／ＩＣＥ遺伝子ファミリーの更な
るメンバーを同定するためのプローブを提供する可能性を与える。このファミリ
ー内の遺伝子の比較は、これらの遺伝子又はそれらの遺伝子産物の機能的に重要
な特徴を示し、それ故、細胞死により特徴付けられる状態及び／又は炎症性疾患
を治療するのに有用な薬剤をデザインするための情報を提供することが出来よう
。
この発見は、ced-3、ＩＣＥ及び他のced-3／ＩＣＥ遺伝子、並びにＩＬ−１β
の産生を阻止し且つ急性及び慢性の炎症性疾患の処置（予防及び治療）に有用な
コー
ドされた産物に基づく新規な薬剤、並びに細胞死を減じ且つ細胞死を含む病気及
び状態（例えば、心筋梗塞、卒中、外傷性脳傷害、ウイルスその他の型の病原体
感染、退行性疾患、加齢及び脱毛等）の処置に有用な薬剤を提供する。これらの
薬剤は又、ＩＬ−１βが関連した白血病を治療するためにも有用であり得る。
細胞死を増大させる薬剤又は薬品も又、ced-3、ＩＣＥ、及び関連遺伝子並び
に遺伝子産物に基づいて開発することが出来る。かかる薬剤又は薬品は、望まし
くない細胞集団（例えば、癌細胞、感染細胞、自己反応性抗体を産生する細胞及
び毛嚢細胞等）又は望ましくない生物（例えば、病害虫、寄生虫及び遺伝子工学
的生物等）を殺し又は無力化するのに有用であり得る。ＩＬ−１β産生を増大さ
せ、それ故、炎症及び免疫応答を増大させる薬剤も又提供される。これらの薬剤
は、ウイルス及び他の形態の感染に対する増大した抵抗性を与えるために役立ち
得る。
ced-3遺伝子のアミノ末端部分を含む融合構築物は、他の野生型の蠕虫におい
て発現されるときは完全な遺伝子の活性を阻止し得るという発見も又ここに記載
する。ＩＣＥとCed-3との類似性のために、ＩＣＥ遺伝子の対応アミノ末端部分
も又インターロイキン１βの開裂においてＩＣＥの酵素活性を阻止するであろう
ことはありそうである。それ故、種々の病理に関与する細胞死及び／又は炎症を
減じるのに有用であり得るced-3及びＩＣＥ
遺伝子の新規なインヒビターを提供する。
この仕事は又、Ced-3及びマウスＮＥＤＤ−２蛋白質が構造的に類似している
ことをも示す。従って、細胞死を増大させ又は減少させるための薬剤をＮＥＤＤ
−２遺伝子及びそのコードする産物に基づいて開発することが出来る。
上記の発見及びそれらの関連、並びに、細胞死に関連した病気及び／又はそれ
から生じる炎症に対する新規な薬剤及び治療を、以下に、一層詳細に説明する。
ここで用いる場合、遺伝子の活性は、遺伝子自身の活性及び遺伝子にコードさ
れた産物の活性を含むことを意図する。従って、遺伝子の活性に影響を与える薬
剤及び突然変異は、コードされたＲＮＡ及び蛋白質の発現並びに機能に影響を与
えるものを含む。これらの薬剤は、遺伝子と又は遺伝子によりコードされるＲＮ
Ａ若しくは蛋白質と相互作用し、或は一層間接的に効果を発揮することが出来る
。ced-3遺伝子
C．elegansのced-3遺伝子を、ＤＮＡ制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）をマッピ
ングすること及び染色体歩行によってクローン化した（実施例１；図１）。この
遺伝子は、ced-3突然変異体の表現型の相補性により、クローン化ゲノムＤＮＡ
の７．５ｋｂ断片に位置した（図２）。２．８ｋｂの転写物を更に同定した。こ
のced-3転写物は、胚中に最も豊富に見出されたが、幼虫及び若
い成虫でも検出され、ced-3がプログラムされた細胞死を受ける細胞に限らずに
発現されることを示唆している。
ced-3 ｍＲＮＡに対応する２．５ｋｂのｃＤＮＡを配列決定した。プラスミッ
ドｐＪ１０７にてクローン化したゲノム配列をも決定した（図３；配列番号１）
。ｃＤＮＡ配列との比較は、ced-3遺伝子が、５４〜１１９５ｂｐに及ぶ大きさ
の７つのイントロンを有することを明らかにした（図４Ａ）。４つの最大のイン
トロン並びに開始コドンの５’側配列は、反復要素を含み（図３）、その幾つか
は、以前に、他のC．elegans遺伝子の非コード領域例えば fem-1（Spence等、C
ell 60:981-990(1990)）、lin-12 （J．Yochem、私信）、及びmyoD（Krause等
、Cell 63:907-919 (1990)）として特性決定されている。転写開始部位も又マ
ップし（図３）、ced-3転写物はC．elegansスプライスリーダー、ＳＬＩにトラ
ンス−スプライスされることを見出した。
１２個のＥＭＳ誘導ced-3対立遺伝子も又配列決定した。突然変異の８つはミ
スセンス突然変異であり、３つはナンセンス突然変異であり、１つは推定のスプ
ライシング突然変異である（表１）。このced-3ヌル対立遺伝子の同定は、ced-3
におけるこれらのヌル突然変異について同型接合の線虫の遺伝的分析の結果と共
に、ced-3機能がced-4と同様に生存能力に必須であることを示す。更に、１２の
突然変異の内の１０は、遺伝子のカル
ボキシル末端領域（エキソン６〜８、図４Ｂ）に密集しており、コードされる蛋
白質のこの部分が活性について重要であり得ることを示唆している。
ced-3遺伝子は、５０３アミノ酸の推定の蛋白質をコードする（図３；配列番
号２）。この蛋白質は、非常に親水性であり有意に疎水性の領域（トランスメン
ブレンドメインであろう）は見出され得ない（図５）。Ced-3蛋白質の１領域は
、非常にセリンに富んでいる（図６Ａ〜Ｂ）。C．elegans蛋白質の、２つの関連
する線虫種C．briggsae及びC．vulgarisのCed-3蛋白質との比較は、この領域に
おけるアミノ酸配列の保存を伴わないセリンリッチな特徴の保存を示す（図９；
配列番号５〜６）。これは、このセリンリッチ領域の正確な配列は重要でないが
セリンリッチな特徴が重要であることを示唆している。この仮説は、１２のＥＭ
Ｓ誘導ced-3突然変異の何れもがセリンリッチ領域内にないというced-3突然変異
の分析により支持される（図４Ｂ）。Ced-3内のセリンリッチ領域が、転写因子
における酸小塊（acidblobs）及び核局在性信号における塩基性残基に類似の、
半特異的な蛋白質−蛋白質相互作用の他の例であることはあり得る。これらのす
べての場合に、正確な一次配列は重要でない。
セリンリッチ領域は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼによるセリン残基の蛋白質リン
酸化を通してのCed-3活性の翻訳後調節のための部位として機能し得る。McConke
y等
（J．Immunol． 145:1227-1230 (1990)）は、プロテインキナーゼＣを刺激する
ホルボールエステルが、Ｃａ++イオノホア又は糖質コルチコイドにさらすことに
より誘導される培養胸腺細胞の死をブロックし得ることが示された（Wyllie等、
J．Path． 142:67-77 (1984)）。プロテインキナーゼＣがリン酸化によりある種
の細胞死蛋白質を不活性化し、それ故、細胞死を阻止して細胞増殖を促進するこ
とはあり得る。細胞質ゾルｃＡＭＰレベルを上昇させ得る幾つかの薬品は、胸腺
細胞死を誘導することが示され、プロテインキナーゼＡも又胸腺細胞死の媒介に
おいて役割を演じていることを示唆している。更なる証拠は、異常なリン酸化が
ある種の細胞退行性疾患の病因において役割を演じ得ることを示唆する。例えば
、微小管関連蛋白質Ｔａｕの異常なリン酸化が、アルツハイマー病及びダウン症
候群患者の脳において見出されている（Grundke−Iqbal等、Proc． Natl． Acad
． Sci． USA 83:4913-4917 (1986)； Flament等、Brain Res． 516：15-19 (1
990)）。従って、リン酸化がC．elegansにおけるプログラムされた細胞死の制御
において役割を有することはあり得る。これは、かなり高レベルのced-3及びced
-4転写物（これは、プログラムされた細胞死を調節するには転写調節単独では不
十分であることを示唆する）と一致する。ced-3及びヒトインターロイキン１βコンバーターゼ遺伝子の構造的関係並びに 機能的関連性
Blast プログラム（National Center for Bio- technology Information）
を用いるGenBank、PIR及びSWISS-PROTデータベースの調査は、ヒトインターロイ
キン１βコンバーターゼ（ＩＣＥ）がCed-3蛋白質と２８％アミノ酸同一性を有
することを示した（図６Ａ〜Ｂ）。同等のレベルの全体的類似性がＩＣＥと２つ
の他の線虫種C．briggsae及びC．vulgarisからのCed-3蛋白質との間に見出され
た。
Ced-3及びＩＣＥのカルボキシル末端領域（それぞれアミノ酸２５０〜５０３
及びアミノ酸１６６〜４０４）は、これらの２種の蛋白質のアミノ末端部分（２
２％同一性）より一層保存されている（３３％同一性）ことが見出された。ヒト
とマウスのＩＣＥの比較も又、６２％の全体の同一性に比べてカルボキシル末端
における高度の類似性（８０％同一性）を示した（Cerretti等、Science 256:9
7-100 (1992)）。更に、ＩＣＥｃＤＮＡ配列の欠失分析は、ＩＣＥのアミノ末端
の１１９アミノ酸は酵素活性に必要でないが、カルボキシル末端領域の欠失はプ
ロ−ＩＬ−１βを加工処埋する酵素能力を除去することを示した（Cerretti等、
１９９２ 前出）。殆どのced-3の不活性化突然変異はカルボキシル末端領域に
密集しているという観察（図４Ｂ）は、Ced-3の活性も又（少なくとも部分的に
）この領域に存在することを示唆する。従って、これらの２種の蛋白質のカルボ
キシル末端領域の機能性ドメインとしての同一性及びこれらの領域の
著しい類似性は、Ced-3及びＩＣＥ蛋白質が類似の活性を有すること即ちＩＣＥ
がCed-3に類似の細胞死活性を有し且つCed-3がＩＣＥに類似のプロテアーゼ活性
を有することを示唆する。
Ced-3がプロテアーゼ活性を有する可能性は、更に、ＣＥの活性システインを
囲む領域及び自己開裂部位がCed-3蛋白質において保存されているらしいという
観察により支持される。図６Ａ〜Ｂに示すように、ＩＣＥの活性システインを囲
む５つのアミノ酸（ＱＡＣＲＧ、アミノ酸２８３〜２８７）（Thornberry等、Na
ture 356:768-774 (1992)）は、Ced-3のアミノ酸３５６〜３６０において保存
されている（この５量体ぺプチドは、ＩＣＥとCed-3との間で最も長い保存され
た配列である）。このぺプチドは又C．briggsae及びC．vulgarisのCed-3蛋白質
においても保存されている（図９）。１つのced-3の不活性化突然変異、ｎ２４
３３は、推定の活性システインの近くにグリシンからセリンへの変化を導入する
（図６Ａ〜Ｂ）。ヒトＩＣＥ遺伝子は、活性型酵素により自己蛋白質分解によっ
て２つの主要部位（アミノ酸１０３及び２９７）において開裂される前駆体酵素
をコードしている（Thornberry等、1992 前出）。両方の自己開裂部位のＡｓｐ
−Ｓｅｒ２量体ペプチドは、Ced-3において保存されている（アミノ酸１３１〜
３７１）（図６Ａ〜Ｂ）。これらの機能的に重要な配列の保存は、ＩＣＥ同様、
Ced-3が類似の基質特異性を有する
システインプロテアーゼであることを強く示唆する。それ故、Ced-3は、ＩＬ−
１β前駆体並びに他のＩＣＥの基質を開裂させることが予想される。
ＩＣＥが細胞死遺伝子である可能性は、活性ＩＬ−１βの産生が細胞死過程に
関与するということを示唆する証拠と一致する。第１に、多様な研究が、ＩＬ−
１βが細胞死を阻止し得ることを示唆した（McConkey等、J．Biol． Chem．265:
3009-3011 (1990)；Mangan等、Ｊ．Immun． 146:1541-1546 (1991)； Sakai等
、J． Exp．Med． 166:1597-1602 (1987)； Cozzolino等、Proc．Natl． Acad
． Sci． USA 86:2369-2373 (1989)）。第２に、活性な成熟ＩＬ−１βは、細胞
死を受ける細胞から放出されるらしい。マウスのマクロファージについての研究
は、活性型の放出は単に細胞の溶解又は細胞内容物の漏れのためではないらしい
ことを示唆している。マウスの腹膜のマクロファージをリポ多糖（ＬＰＳ）で刺
激し、細胞外ＡＴＰにさらすことにより細胞死を誘導して受けさせたときには、
成熟した活性ＩＬ−１βが培養上清中に放出された。対照的に、細胞を削ること
により傷つけたときは、ＩＬ−１βが専ら不活性なプロ型で放出された（Hoggui
st等、Proc． Natl． Acad． Sci． USA 88:8485-8489 (1991)）。
ＩＣＥとCed-3との間の類似性は、ＩＣＥが細胞死に関与するという仮説を強
く支持する。Ced-3が細胞死に必要であるので、１つの示唆は、ＩＣＥも又細胞
死に必
要であるというものである。ＩＬ−１βが細胞死を引き起こし得ることはあり得
ることである。或は、ＩＣＥは、ＩＬ−１βの他に産物を生成することが出来て
、その内の１種又はそれ以上が細胞死を引き起こし得るのであろう。ＩＣＥ転写
物はＩＬ−１βの発現を欠く細胞において検出されるという観察（Cerretti等、
1992 前出）は、この考えを支持する。
線虫のced-3遺伝子に関連するヒト遺伝子の発見は、線虫のced-3遺伝子と構造
的に関連し及び／又は類似する細胞死遺伝子が種々の生物に存在するという考え
と一致する。この考えは、脊椎動物及び無脊椎動物並びに恐らくは微生物及び植
物を含む種々の生物に起きる細胞死並びに種々の発生及び病理的状況において認
められる細胞死が共通の遺伝的機構を共有するという証拠によって支持される。
この仮説に対する証拠は、実施例２において検討する。ＩＣＥの構造的関係は、
それが線虫の細胞死遺伝子ced-3の哺乳動物における等価物であることを示唆す
る。ＩＣＥのｃＤＮＡ配列を図１０に示す（配列番号３）。ced-3 ／ＩＣＥ遺伝子ファミリー及びそれらの利用
ＩＣＥ及びced-3遺伝子を用いて、他の生物からの遺伝子を含む更なる構造的
に関連した遺伝子を単離することが出来る。かかる遺伝子は、ced-3及びＩＣＥ
遺伝子の両方から導かれたプローブ並びに核酸ハイブリダイゼーション、ＤＮＡ
のポリメラーゼ連鎖反応増幅、ｃＤＮ
Ａ又はゲノムライブラリーのスクリーニング及び発現ライブラリーの抗体スクリ
ーニングを含む公知技術を用いて同定することが出来る。これらのプローブは、
これらの遺伝子に特異的である遺伝子の全部又は一部、これらの遺伝子によりコ
ードされるＲＮＡ、コードされる蛋白質の配列から誘導された変性オリゴヌクレ
オチド、及びコードされる蛋白質に対する抗体であってよい。これらの遺伝子及
びそれらの蛋白質産物の配列を用いて、構造的に類似する遺伝子及び蛋白質につ
いて、ＤＮＡ及び蛋白質のデータベースをスクリーニングすることも出来る。
構造的に関連した遺伝子を多くの生物において検出するための１つの戦略は、
最初に、プローブの源に分類学的に密接に関連した動物を調べることである（例
えば、ced-3から誘導したプローブを用いて他の蠕虫を調べ又はＩＣＥから誘導
したプローブを用いて他の哺乳動物を調べる）。密接に関連した種は、一層離れ
た関係の生物より、そのプローブで検出される関連遺伝子又は遺伝子産物を有す
ることは一層ありそうである。次いで、ced-3若しくはＩＣＥとこれらの新たな
遺伝子との間で保存された配列を用いて、関連の密接度が一層低い種に由来する
類似の遺伝子を同定することが出来る。更に、これらの新規な遺伝子は、他の動
物の分子を調べるために用いることの出来る更なる配列を提供する（それらの分
子の幾つかはこれらの新規な遺伝子若しくは遺伝子産物と
は共通の保存された領域を有するが、元のプローブとは保存された領域を共有し
なくてよい）。この分類学的に一層密接な生物における構造的に関連した遺伝子
を一層離れた関係の生物における遺伝子への足掛かりとして利用する戦略は、系
統樹に沿っての歩行ということが出来る。
ced-3、ＩＣＥ及び上記のようにして得られた関連遺伝子は、共に、構造的に
関連した遺伝子のファミリーを構成する（ここでは、ced-3／ＩＣＥ遺伝子ファ
ミリーと呼ぶ）。これらの更なるファミリーメンバーの少なくとも幾つかが細胞
死及び／又はプロテアーゼ活性を示すであろうことは大いにありそうなことであ
る。これらの新規な遺伝子を、公知のアッセイ方法を用いてプロテアーゼ活性に
ついて試験することが出来る。例えば、新規な遺伝子によりコードされる蛋白質
の配列は、Ced-3において認められたように、ＩＣＥのものに類似した活性部位
及び基質特異性を示し得る。次いで、この活性を、以前に記載された一過性発現
アッセイ及び精製酵素アッセイ（Cerretti等、Science 256:97-100 (1992);Thor
nberry等、Nature 356:768-774 (1992)）を用いて確かめることが出来る。細胞
死活性を、トランスジェニック線虫を用いて、バイオアッセイにおいて試験する
ことが出来る。ＩＣＥ遺伝子等の細胞死遺伝子の候補をCed-3欠損突然変異動物
に注入して、その遺伝子がced-3突然変異を補うか否かを決定することが出来る
。発現ライブラ
リーも又、このアッセイによって細胞死遺伝子についてスクリーニングすること
が出来る。
細胞死活性を有するｃｅｄ−３、ＩＣＥ及び他の関連遺伝子を用いて、細胞死
を減じ又は増大させる薬剤を開発し及び同定することが出来る。細胞死を減じる
薬剤は、細胞死により特徴付けられる病気及び状態例えば、心筋梗塞、卒中、ウ
イルスその他の病原体感染（例えば、ヒト免疫不全ウイルス）、外傷性脳傷害、
神経及び筋肉退行性疾患、並びに加齢等を治療するために潜在的に有用である。
細胞死を引き起こす薬剤を用いて、望ましくない細胞集団例えば新生物成長及び
他の癌細胞、感染細胞、並びに自己反応性抗体を産生する細胞等を制御し又は減
じることが出来る。望ましくない生物例えば病害虫、寄生虫及び組換えによる生
物等も又、かかる薬剤により無力化し若しくは殺すことが出来る。
ＩＣＥは、ある種の白血病の成長に関連している（Sakai等、J. Exp. Med. 16
6:1597 (1987);Cozzolino等、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:2369 (1989);
Estrov等、Blood 78:1476 (1991); Bradbury等、Leukemia 4:44 (1990)； Delwe
l等、Blood 74:586(1991)）。ヒトＩＣＥ遺伝子が、ヒトの癌において見られる
ＤＮＡ再配置に頻繁に関与する部位である染色体の位置１１ｑ２３にマップされ
るという観察は、更に、ＩＣＥが癌に関与することを示唆している。ＩＣＥが恐
らく細胞死において機能しているという発見は、ＩＣＥ及び
他の関連遺伝子が、ｃｅｄ−３と同様に、癌成長を制御する薬剤を開発するため
に利用出来ることを意昧する。
更に、細胞死が哺乳動物の毛の成長において重要な役割を演じていることから
、細胞死を制御することによって脱毛を引き起こし又は阻止することが出来るで
あろうことはありそうに見える。線虫の発生における細胞死を阻止する遺伝子（
ced-9）に構造的に関連しているヒト遺伝子であるbcl-1が毛嚢において細胞周期
に依存する様式で発現されていることが見出された。ced-9は、細胞死遺伝子ced
-3及びced-4の活性を打ち消すことによって作用することが示された。これらの
発見は共に、ced-3、ced-4及びced-9遺伝子に等価な遺伝子が哺乳動物の毛の成
長及び消失の生理に関与することを示唆する。
細胞死を増大させる薬剤は、ced-3、ＩＣＥ、及び他のced-3／ＩＣＥファミリ
ーメンバー、それらのＲＮＡ及び蛋白質産物、これらの遺伝子及びコードされる
産物の構成的に活性化された突然変異体、並びにこれらの蛋白質のぺプチド性及
び非ペプチド性模倣物を含んで良い。細胞死を減じる薬剤は、細胞死遺伝子のｍ
ＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡ、又は突然変異体の細胞死遺伝子若しくは
コードされる産物（もはや細胞死を引き起こさず及び、野生型遺伝子の機能を邪
魔する）を含んで良い。更に、細胞死遺伝子のアゴニスト及びアンタゴニストを
含む薬剤を、これらの遺伝子又はそれらの遺伝
子産物をバイオアッセイにおける標的として用いてデザインし又は同定すること
が出来る。これらのバイオアッセイを、野生型、突然変異体、又はトランスジェ
ニック線虫において行なうことが出来、そこでは、プログラムされた細胞死の変
化が有効なアゴニスト又はアンタゴニストの指標である。バイオアッセイは又、
標的細胞死遺伝子でトランスフェクトした培養細胞においても実施することが出
来、それに試験する物質を導入する。細胞死のアンタゴニストについてのバイオ
アッセイにおいて、培養細胞を、標的細胞死遺伝子の活性を誘導する条件下に置
くべきである。
C.elegansを用いるバイオアッセイの利用を下記により例示する：
１）ced-3を不活性化し、それ故にプログラムされた細胞死を阻止する薬剤又は
遺伝子をスクリーニングするための正常な野生型線虫の利用；
２）ced-3を活性化し、それ故に過剰の細胞死を引き起こす薬剤又は遺伝子をス
クリ−ニングするための正常な野生型線虫の利用；
３）ced-3突然変異により引き起こされる過剰細胞死を阻止する薬剤又は遺伝子
を同定するためのced-3を過剰発現するか又は構成的に活性化されたced-3遺伝子
を発現する突然変異体線虫の利用；
４）ced-3突然変異を模倣し又は補う薬剤又は遺伝子を同定するためのｃｅｄ−
３を過少発現するか又は不活性化し
たced-3遺伝子を発現する突然変異体線虫の利用;
５）ＩＣＥ又は他のced-3／ＩＣＥファミリーのメンバーのの野生型若しくは変
異型何れかが過剰細胞死を引き起こすトランスジェニック線虫（不活性化した内
在性ced-3遺伝子を有するもの）の、トランス遺伝子の活性を打ち消す薬剤又は
遺伝子を同定するための利用；及び６）細胞死を阻止するトランス遺伝子を有す
るトランスジェニック線虫（例えば、後述するような、ced-3、ＩＣＥ又は関連
遺伝子の阻止断片を発現するトランス遺伝子）の、この阻止を克服して細胞死を
引き起こす薬剤を同定するための利用。
薬剤は、拡散、摂食、マイクロインジェクション、粒子銃による撃ち込み又は
他の方法によって線虫に導入することが出来る。それらは、抽出物（例えば、細
菌、カビ又は植物の）及び化合物ライブラリー等の伝統的起源から得ることが出
来、又は一層新しい理諭的薬剤デザインの方法によって提供され得る。配列比較
及び／又は突然変異分析により得られるこれらの遺伝子又は遺伝子産物の機能的
に重要な領域の情報は、薬剤デザインのための基礎を提供することが出来る。遺
伝子を線虫にマイクロインジェクションしてトランスジェニック線虫を生成する
ことが出来る。個々の遺伝子又はｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡライブラリーをこの
方法にてスクリーニングすることが出来る。
アゴニスト及びアンタゴニストは、細胞死遺伝子でな
いが細胞死遺伝子と相互作用し、細胞死遺伝子を制御し又は迂回する遺伝子から
導くことも出来る。かかる相互作用遺伝子は、上記のバイオアッセイ並びに線虫
のイン・ビトロ遺伝学により試験することが出来る。この後者の方法において、
相互作用遺伝子は、ced-3突然変異を抑制し又は促進する第２の突然変異として
同定される。次いで、これらの相互作用遺伝子の配列を用いて、他の生物におけ
る構造的に関連する相互作用遺伝子を同定することが出来る。
同様に、ced-3、ＩＣＥ及び他のファミリーメンバー及びそれらのコードされ
た産物を用いて、抗炎症剤を開発し又は同定することが出来る。ＩＣＥ活性を増
大させる薬剤は又、ウイルスその他の感染に対する炎症応答を増強するのにも有
用であり得る。
更に、多くの構造的に関連する遺伝子の利用可能性は、構造的比較を行なうこ
とを可能にする。これらの遺伝子又はそれらのコードされた産物の保存された領
域又は特徴が細胞死及び／又はプロテアーセ活性にとって機能的に重要であるこ
とはありそうなことである。この情報は、これらの遺伝子の活性を真似し又は影
響を与える薬剤をデザインし又は選択するのに役立ち得るであろう。
更に、ced-3／ＩＣＥファミリーメンバー又はそれらのコードされた産物の内
の機能性ドメインの保存は、これらの遺伝子が類似の活性を有することのみなら
ず、そ
れら及びそれらのコードされた産物が類似の機構によって機能することをも示唆
する。これは、保存された領域内の突然変異、保存された領域に基く模倣物、及
び１つのced-3／ＩＣＥ遺伝子又はコードされた蛋白質の保存された領域の機能
に影響を与えるアゴニスト及びアンタゴニストが、ファミリー内の他の遺伝子又
はコードされた蛋白質に、同様に影響を与えるであろうことを示唆する。これは
、ＩＣＥ及び炎症を阻止するためのCed-3インヒビターの利用、並びにＩＣＥを
阻止することにより作用してced-3遺伝子を阻止し及び細胞死を減じる抗炎症剤
の利用を後援する原理的説明である（後述）。
更に、ced-3及びＩＣＥ遺伝子の細胞死及び／又は炎症活性に影響を与える薬
剤は又、これらの遺伝子の未だ発見されていない他の活性にも影響を与え得る。
ＩＬ−１β及びＩＣＥの生物学は、現在、不完全に理解されているだけであり、
ＩＬ−１β及びＩＣＥの両方の他の機能が発見されるであろうことは非常にあり
そうなことである。これらは、これらの分子の個々のサイトカイン的活性及び蛋
白質分解活性が関与する新規な活性又は新規な生理的過程又は病気を含み得る。
何れかの場合に、ＩＣＥ活性に影響を与える薬剤（阻害性蛋白質部分等）が新規
な活性及び過程に影響を与えることはありそうなことである。
更に、ced-3／ＩＣＥファミリーの１つのメンバーの活性を変え又は真似る突
然変異又は薬剤を、保存領域を
共有する他のファミリーメンバーに影響を与える突然変異及び薬剤に関して知ら
れていることに基いて作ることが出来る。他のファミリーメンバーにおいて見出
されたものに対応する保存領域内の突然変異を用いて類似の効果を生じることが
出来る。例えば、ced-3中の分析された不活性化点突然変異９つの内の５つは、
ＩＣＥとCed-3との間で保存されたアミノ酸の変化を生じていることが見出され
た（図６Ａ〜Ｂ）。Ced-3中のアミノ酸置換に対応するＩＣＥ中のアミノ酸置換
も又、不活性化を生じることが予想される。これらの阻害性アミノ末端遺伝子部
分及び下記の構成的に活性なカルボキシル末端遺伝子部分は、ced-3／ＩＣＥフ
ァミリーの遺伝子内に作る事の出来る対応する突然変異の更なる例である。
Ced-3、ＩＣＥ及び関連蛋白質の比較は又、ＩＣＥ及び関連酵素の基質特異性
への洞察をも与え得る。ＩＣＥについての以前の研究は、一致した共通の開裂部
位を同定しなかった。Ced-3及びＩＣＥの自己開裂部位の比較は、プロ−ＩＬ−
１βの開裂部位と共に、開裂が常にＡｓｐ残基の後ろで起きることを示す。この
理由により、Ced-3、ＩＣＥ及び関連蛋白質が、幾つかのアスパラギン酸残基の
後ろで又は、恐らく低効率で、すべてのアスパラギン酸残基の後ろで開裂するプ
ロテアーゼであることはありそうなことである。
ced-3／ＩＣＥファミリーメンバーの更なる利用は、ヒトその他の生物におけ
る細胞死及び炎症を含む病気の
診断用プローブ（ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド及び抗体）を提供するこ
とである。かかる病気がced-3／ＩＣＥ遺伝子及びそれらの遺伝子産物の異常と
関係することはありそうなことである。これらのプローブを用いて、遺伝子及び
コードされるＲＮＡ及び蛋白質産物の配列、レベル及び／又は活性の異常を検出
することが出来る。これらの病気は、遺伝的であり得て、その場合、これらのプ
ローブを患者又は誕生前試験に用いることが出来、或は非遺伝的かもしれず、そ
の場合には、ＲＮＡ及び蛋白質を試験することが出来る。特に、ＩＣＥが推定上
の細胞死遺伝子であるという発見は、この遺伝子及びその誘導体分子を、細胞死
により特徴付けられる病気の診断用プローブとして潜在的に有用なものとする。
同様に、ced-3及びその誘導体分子は、炎症が証拠である病理における異常を検
出するために潜在的に有用である。これらのプローブの有用性は、公知の生理的
機能を有する一層多くの遺伝子がced-3及びＩＣＥと構造的に関連していること
が見出された場台に、増大され得る。ced-3及びマウスＮＥＤＤ−２遺伝子の構造的関連性
データベース検索は又、他の哺乳動物蛋白質がCed-3蛋白質に類似しているこ
とをも示した（図７）。マウスＮＥＤＤ−２蛋白質は、Ced-3のカルホキシル末
端に対して２７％アミノ酸同一性及び５５％類似性を有する。ＮＥＤＤ−２蛋白
質は、マウス胚の脳において発現され且つ成体マウスの脳においてずっと僅かに
発現しており
、この蛋白質は、マウスの中枢神経系の発生に関与すると考えられている（Kuma
r等、Biochem. Biophys.Res. Comm. 185(3):1155-1161 (1992)）。ＮＥＤＤ−２
及びCed-3遺伝子産物の間の構造的類似性は、ＮＥＤＤ−２遺伝子が、発生中に
生じる細胞死過程にも関与するということを示唆し、更に、線虫のced-3遺伝子
に構造的及び機能的に関連する遺伝子が種々の生物において機能しているという
仮説を支持する。興昧深いことに、ＮＥＤＤ−２のアミノ酸配列は、ヒトＩＣＥ
のそれに有意に類似していない。
Ced-3及びＮＥＤＤ−２のアミノ酸配列の類似性は更に、突然変異n1129, n116
4,n2426及びn1163から生じるCed-3における変化に対応する蛋白質における変化
を生じるＮＥＤＤ−２遺伝子の突然変異がＮＥＤＤ−２遺伝子を不活性化するこ
とを示唆する。
この発明は、細胞死を制御するのに有用な、ＮＥＤＤ−２遺伝子、公知のced-
3突然変異に対応する突然変異したＮＥＤＤ−２遺伝子、野生型及び突然変異遺
伝子によりコードされるＲＮＡ及び蛋白質、並びにこれらの遺伝子及び遺伝子産
物から導かれる模倣物及び他の薬剤のすべて又は部分を含む。
図８Ａ及び８Ｂは、それぞれ、３つの線虫種（C．briggsae, C. elegans及びC
. vulgaris）のCed-3蛋白質、ヒト及びマウスのＩＣＥ及びマウスのＮＥＤＤー
２蛋白質（図８Ｂのみ）のアミノ及びカルボキシル末端領域の整列を示している
。これらの図に示すように（箱に入れた部分）、多数のアミノ酸が、これらの構
造的に関連する蛋白質間で完全に保存されており、それ故、機能的に重要である
ことはありそうなことである。これらの部位の突然変異は、これらの遺伝子の活
性を変えることが予想されよう。ced-3遺伝子の阻害部分
Ced-3遺伝子の部分を含む融合構築物は、野生型のC．ｅｌｅｇａｎｓにおいて
発現されるときに、プログラムされた細胞死を阻害することが見出された。これ
らの構築物を図１１Ａに図式表示する。ＢＧＡＦＱ構築物は、E．coli lacZ遺伝
子の５’側と融合したced-3遺伝子部分及びlacZの３’側と融合した他のced-3部
分を含む。この５’ced-3部分は、図３に示した配列のヌクレオチド１から約３
００塩基対上流に位置するＢａｍＨＩ部位からヌクレオチド５８５０のＳａｌＩ
部位までのゲノム配列である。この部分は、ＳＬＩアクセプター部位（ヌクレオ
チド２１６１）の５’側配列に及び、アミノ末端領域の３７２コドンを含む。Ｂ
ＧＡＦＱの３’ced-3部分は、ced-3遺伝子内のヌクレオチド５９２７のＮｏｔＩ
部位から図３の配列のヌクレオチド７６５３の約１．５
ｋｂ下流に位置するＡｐａＩ部位までのゲノム配列である。この部分は、３９８
から終端（コドン５０３）までのカルボキシル末端コドン及び３’側非翻訳配列
を含む。
ＰＢＡ構築物は、ＢＧＡＦＱ内と同じＢａｍＨＩ部位からヌクレオチド３０２
０（７）ＢｇｌＩＩ部位までのゲノム配列であるced-3遺伝子の一層小さい部分
をlacZ遺伝子の５’側に融台して有する（図１１Ａ）。このced-3部分は、ＳＬ
Ｉアクセプター部位の５’側配列に及びアミノ末端領域の最初の１４９コドンを
含む。
両構築物は、pBluescriptベクター（Stratagene）及びFireのpPDベクター（EM
BO J. 5:2673-2690 (1986)）からのlacZ構築物を含む断片を用いて作成した。la
cZ含有部分は、最初の１１コドンを除いてすべてのlacZコード配列を有する。更
に、台成のイントロン及び核局在信号がlacZ遺伝子の上流にあり、unc-54遺伝子
の３’末端の断片がlacZ遺伝子の下流にある（図１１Ｂ）。構築物ＰＢＡは、図
１１Ｂに示すAndy FireのベクターpPD22.04からのlacZ構築物を含むＢａｍＨＩ
−ＡｐａＩ断片をced-3含有プラスミッドpJ40のＢｇｌＩＩ−ＡｐａＩ断片に挿
入することにより作成した。pPD22.04からの同じlacZ構築物を含むＳａｌＩ−Ｅ
ａｇＩ断片をＮｏｔＩ部位を有しないpJ40であるpJ40AのＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断
片に挿入することにより構築物ＢＧＡＦＱを作成した。
表２は、野生型線虫にこれらの２種の構築物を注入した結果を示している。こ
れらの結果は、ＢＧＡＦＱ及びＰＢＡ融合構築物が、通常は線虫の発生において
起きる細胞死を阻害することを示している。これらの融台構築物は、更に、細胞
死を阻止し及び見掛け上関連するced-9の機能喪失突然変異により引き起こされ
る生存不能を阻害することが認められた（該ced-9遺伝子は、線虫の発生中にあ
る種の細胞を死から保護するよう機能し、ced-3及び第２の細胞死遺伝子ced-4を
打ち消すことにより機能することが示されている）。
両構築物は、野生型線虫においてβ−ガラクトシダーゼ活性を発現する。pBlu
escriptベクターは真核生物用の転写又は翻訳開始部位を含んでいないので、こ
れらの信号は、恐らくced-3遺伝子部分が融合したlacZの５’側により与えられ
るのであろう。更に、ＰＢＡ構築物が細胞死を阻害するように働くので、阻害に
必要なＢＧＡＦＱ内のced-3部分は、lacZの上流に融台した部分である（lacZの
下流に位置する部分と対照的に）。多分、ＢＦＡＧＱの内でＢａｍＨＩ部位から
ヌクレオチド３０２０までの領域のみが必要なのであろう（なぜなら、これがＰ
ＢＡに含まれるすべてであるから）。
ＰＢＡced-3部分を含むがlacＺ部分を何ら含まない構築物は、細胞死を阻害し
なかったが、これは、lacZ部分への融合が阻害遺伝子部分の発現又は作用に必要
であることを示唆している。
これらの観察は、Ced-3蛋白質のアミノ末端部分が恐らくE. coliβ−ガラクト
シダーゼ部分との結合においてC. elegansのプログラムされた細胞死を阻害する
ように作用することが出来ることを示している。一つのもっともらしい機構は、
このCed-3蛋白質の部分が負の優性又はアンチモルフ的様式で作用して正常Ced-3
蛋白質の活性を阻害することである。（Ced-3蛋白質の不活性化はプログラムさ
れた細胞死の不在を生じることが知られている。）かかる優性の負の活性は、部
分的Ced-3蛋白質を、正常Ced-3蛋白質に結台し、それにより不活性化した結果で
あろう（構造的に類似のＩＣＥ蛋白質の活性型が２量体であるという発見はこの
モデルと一致する）。或は、部分的Ced-3蛋白質が、正常Ced-3蛋白質が相互作用
して機能するに違いない分子と結合することが出来、この相互作用を阻害するこ
とによりCed-3活性を阻害する。
ＩＣＥのCed-3蛋白質に対する構造的類似性のために、ＩＣＥのアミノ末端部
分をコードする融合構築物も又ced-3遺伝子の活性を阻害することが予想されよ
う。特に、ＢＧＡＦＱ及びＰＢＡのced-3遺伝子部分に対応するＩＣＥ遺伝子の
これらの部分（即ち、ＩＣＥコドン１〜２９８及びコドン１〜１１１）又はこれ
らの活性な一部分は、ced-3を阻害することが予想される。この推論の更なる拡
張は、任意の構造的に関連する任意のced-３／ＩＣＥファミリーメンバーの対応
遺伝子部分がced-
３活性に対する阻害効果をも有するであろうを示唆する。
更に、ced-3及びＩＣＥ遺伝子の構造的関係は、ＩＣＥ酵素が、ＩＣＥ遺伝子
のアミノ末端部分並びに他の構造的に関連する遺伝子例えばced-3の対応部分を
含む融合構築物によっても阻害され得るであろうことを意昧する。
ced-3、ＩＣＥ、及びced-3遺伝子を阻害する関連遺伝子の部分の同定は、これ
らの遺伝子部分を含む発現用構築物又はそれらのコードする産物をバイオアッセ
イにおいて細胞死活性について試験することによって行なうことが出来る。ＩＣ
Ｅを阻害する遺伝子部分又はコードされる産物の同定は、前に記載されたＩＣＥ
活性用アッセイを用いて行なうことが出来る。例えば、１）野生型の蠕虫にced-
3又は他の構造的に関連する遺伝子例えばＩＣＥ等の部分を注入してそれらがプ
ログラムされた細胞死を阻害するかどうかを決定することが出来、２）ＩＣＥ蛋
白質又は他の構造的に類似の蛋白質例えばCed-3等の部分は、線虫又は培養哺乳
動物細胞においてＩＣＥ及びプロ−ＩＬ−１βと同時発現（co-expressed）させ
てそれらがＩＬ−１β前駆体のＩＣＥ触媒される開裂を阻害するかどうかを見る
ことが出来、及び３）ＩＣＥ又は類似蛋白質例えばCed-3等のアミノ酸又はコー
ド配列の部分を含むぺプチド又は核酸を、精製したＩＣＥ及び合成基質を用いて
試験することが出来る。
ced-3遺伝子、ＩＣＥ及び構造的に関連する遺伝子の阻害部分、それらのコー
ドされたＲＮＡ及び蛋白質並びにこれらの蛋白質の非ペプチド摸倣物を用いて細
胞死及び／又は炎症を減じることが出来、それ故、これらの過程を含む病気の治
療に有用である。これらのコードされた蛋白質並びにぺプチド及び非ペプチド摸
倣物を、種々の公知の薬剤送達方法及び経路によって送達することが出来る。例
えば、それらを経口若しくは他の非経口経路により又は非経口でない経路により
投与することが出来る（例えば、筋肉注射、腹膜内又は静脈注射で、又は局所投
与による）。或は、これらの遺伝子部分を含む発現用構築物を、異種転写及び翻
訳信号又はこれらの遺伝子部分に本来的に備わった信号を用いて作ることが出来
る。これらの構築物を、遺伝子治療の種々の方法例えばレトロウイルス感染によ
って細胞内に送達することが出来る。
興味深いことに、ＢＧＡＦＱ及びＰＢＡのced-3部分に対応するそれらのＩＣ
Ｅ遺伝子部分は、２つの自己開裂部位のそれぞれにおける開裂により生じる断片
をほぼコードする（アミノ酸１０３〜２９７）。この観察は、プロ酵素の活性Ｉ
ＣＥへの自己蛋白質分解による変換がその蛋白質の阻害アミノ末端部分を切り離
すことを含んでいることを示唆する。活性ＩＣＥは、約２０及び１０キロダルト
ンのサブユニットからなるヘテロ２量体である（Thornberry等、Nature 356:768
-774 (1992)）。こ
れらのサブユニットは、ＩＣＥプロ酵素から誘導されることが示され、アミノ酸
１２０〜２９７（ｐ２０）及び３１７〜４０４（ｐ１０）に対応する。動力学的
研究は、これらの２つのサブユニットの会合が酵素活性に必要であることを示唆
する。この蛋白質のアミノ末端領域がこの会合を邪魔することはあり得ることで
ある。
これは、阻害アミノ末端領域が欠失した突然変異蛋白質が構成的に活性である
ことを意味する。従って、Ced-3、ＩＣＥ及び関連蛋白質のカルボキシル末端部
分、並びにこれらの部分を発現する構築物及びＲＮＡは、細胞死及び／又はＩＬ
−１β産生を増大させるのに潜在的に有用である。利用し得る構築物は、活性酵
素の２つのサブユニットをコードするＩＣＥのカルボキシル領域を発現するもの
、並びにこれらのサブユニットの各々を別々に発現するものを含む。更に、イン
・ビトロでＩＣＥ酵素活性に必要でないＩＣＥのアミノ領域が、イン・ビボでの
ＩＣＥ活性又はＩＣＥ活性の制御に重要であることはあり得ることである。ced-
3突然変異の２つがこの領域にマップされるという発見は、この考えと一致する
。この理由のために、Ced-3、ＩＣＥ又はCed-3／ＩＣＥ遺伝子ファミリーメンバ
ーのアミノ領域を発現する構築物も又利用することが出来る。更に、Ced-3部分
のカルボキシル末端に類似のＮＥＤＤ−２蛋白質も又、細胞死を引き起こす構成
的活性を示す。従って、ＮＥＤＤ−２の全部又は活性部分、並びにＮＥＤＤ−２
蛋白質をコー
ドするＤＮＡ及びＲＮＡは、発現した場合に細胞死活性を生じると予想されよう
。Ced-3、ＩＣＥ及び他のCed-3／ＩＣＥファミリーの蛋白質のカルボキシル末端
領域並びにＮＥＤＤ−２蛋白質、これらの蛋白質及び蛋白質断片をコードするＤ
ＮＡ及びＲＮＡから誘導される活性分子、並びにペプチド及び非ペプチド模倣物
を含む薬剤が、望ましくない細胞集団例えば癌細胞、感染細胞、自己反応性抗体
を産生する細胞及び毛嚢細胞等のサイズを制御し又は減じるために潜在的に有用
である。かかる薬剤は又、望ましくない生物例えば寄生虫、病害虫及び遺伝子工
学的に作られた生物等を無力化し又は殺すためにも有用であり得る。例えば、多
くの線虫は、ヒト、動物及び植物の寄生虫である。細胞死のインヒビターとしてのＩＣＥインヒビター
Ced-3蛋白質におけるＩＣＥの活性部位（活性システイン及び周囲のアミノ酸
）の保存は、Ced-3が類似の機構によってその基質と相互作用するシステインプ
ロテアーゼであることを意昧する。故に、この機構を邪魔するＩＣＥのインヒビ
ター又はこれらのインヒビターの化学アナログがCed-3機能をも阻害することは
ありそうなことである。
下記のＩＣＥ認識部位：
Ｐ４−−Ｐ３−−Ｐ２−−Ｐ１
Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ
又はＰ２がＡｌａ、 Ｈｉｓ、 Ｇｌｎ、 Ｌｙｓ、 Ｐｈｅ、
Ｃｈａ若しくはＡｓｐである置換された部位を含むぺプチドアルデヒドは、ＩＣ
Ｅのプロテアーゼ活性の有効な、特異的な且つ可逆的なインヒビターであること
が示された（Thornberry等、Nature 356:768-774(1992)）。これらの分子は、Ｉ
ＣＥの基質のプロ−ＩＬ−１βと結合してＩＣＥと競争する遷移アナログとして
作用すると考えられる。３つのかかるインヒビターが記載された：インヒビタ−
Ｂ（Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＣＨＯ）；インヒビターＣ（Ａｃ
−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＣＨＯ）；及びインヒビターＤ（Ａｃ
−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ＣＨＯ）。勿論、インヒビターＢが、Ｋi
＝０．７６ｎＭであり、ＤのＫi＝３ｎＭ及びＣのＫi＝１．５μＭと比較して最
も強力である。
更に、牛痘ウイルスのcrmA遺伝子が、ＩＣＥを特異的に阻害するサーピン（se
rpin）をコードしていることが見出された（Ray等、Cell 69:597-604 (1992)）
。このサーピンは、ＩＣＥの蛋白質分解活性化を阻止することによって作用する
。このＩＣＥのインヒビターは又、構造的に類似の蛋白質例えばCed-3等を阻害
することも予想される。crmA遺伝子及び精製したcrmA蛋白質を得るための方法は
、記載されている（Pickup等、Proc. Natl.Acad. Sci. USA 83:7698-7702 (1986
); Ray等、1992年、前出）。この発明は、ＩＣＥのインヒビター（例えば、ペプ
チドアルデヒド特にインヒビターＢ、及びCrmA
蛋白質）の、細胞死活性を減じるための、そうして、細胞死によって特徴付けら
れる病気の治療ための薬剤としての利用を含む。
当業者は、ここに記載する発明の特定の具体例の多くの等価物を認識し、又は
常例的実験を用いて確かめることが出来る。後記の請求の範囲は、かかる等価物
を含むものである。例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡの機能的等価物は、核酸配列であ
り得る。例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡの機能的等価物は、遺伝コードの縮重によっ
て、特に請求項に記載したのと同じ蛋白質をコードする核酸配列であり得る。蛋
白質の機能的等価物は置換した又は修飾したアミノ酸配列であって良い（ここに
、置換又は修飾は、蛋白質の活性又は機能を変化させない）。化学的に類似のア
ミノ酸（例えば、酸性アミノ酸と他の酸性アミノ酸）が置換するような「沈黙の
」アミノ酸置換は、如何にして蛋白質の機能的等価物が生成され得るかの例であ
る。核酸又は蛋白質の機能的等価物も又、非必須配列の欠失により生成され得る
。
下記の実施例は、この発明を説明するが、何ら制限する意図のものではない。実施例１ Ced-3 遺伝子のクローン化、配列決定及び特性決定
材料と方法一般的方法及び系統
C. elegansの培養に有用な技術は、Brenner（Genetics 77:71-94 (1974)）によ
り記載された。すベての系統は、２０℃で成長した。野生型の親系統は、C．ele
gansの変種Bristol系統Ｎ２、Bergerac系統EM1002（Emmons等、Cell 32:55-65 (
1983)）、C. briggsae及びC. vulgaris （V. Ambrosから得たもの）であった。
用いた遺伝的マーカーは、下記の通りである。これらのマーカーは、Brenner
（1974年、前出）、及びHodgkin等（The Nematode Caenorhabditis elegans, Wo
od andCommunity of C. elegans Researchers編、ColdSpring Harbor Laborator
y, 1988, pp491-584）により記載されたものである。遺伝学的命名法は、標準体
系（Horvitz等、Mol. Gen. Genet. 175:129-133(1979)に従っている：
LG I: ced-1(e1375);unc - 54(r323)
LG VI: unc-31(e928),unc-30(e191),ced-3(n717,n718,
n1040, n1129, n1163,n1164, n1165, n1286.
n1949, n2426, n2430, n2433), unc-26(e205),
dpy-4(e1166)
LG V: egl-1(n986); unc - 76(e911)
LG X: dpy-3(e27)ｃｅｄ−３の更なる対立遺伝子の単離
非相補性スクリーニングを、ced-3の新たな対立遺伝子を単離するためにデザ
インした。ced-3（ｎ７１７）について異型接合（欠損に対してトランス）の動
物が生存力
を有している（Ellis及びHorvitz, Cell 44:817-829(1986)）ので、突然変異誘
発により生成した完全に機能喪失したced-3対立遺伝子を有する動物は、たとえ
新たな対立遺伝子が同型接合で生存力を有していても、ced-3（ｎ７１７）に対
してトランスで生存力を有するであろうことが予想された。１４のＥＭＳ突然変
異誘発したegl-1雄を、ced-3(n717) unc-26 (e205); egl-1(n487);dpy (e27)両
性個体とつがわせた。このスクリーニングで、ｅｇｌ−１をマーカーとして用い
た。egl-1における優性突然変異は、２匹の両性個体のプログラムされた細胞死
を受ける特異的ニューロン（ＨＳＮ）を生じさせる（Trent等、Genetics 104:61
9-647 (1983)）。egl-1の突然変異した表現型は、ｃｅｄ−３における突然変異
がプログラムされた細胞死をブロックするので、ced-3；egl-1系統において抑制
される。egl-1雄をＥＭＳで突然変異誘発して、ced-3 (n717)、unc-26(e205);egl
-1 (n487);dpy-3 (e27)と交雑させた。殆どの交雑子孫は、ced-3について異型接
合であり且つegl-1について同型接合であるために、産卵欠損であった。稀な産
卵能力のある動物を、ced-3の新たな対立遺伝子を有するものの候補としてピッ
クアップした。ＥＭＳ突然変異誘発した動物の約１０，０００のＦ１交雑子孫か
ら４匹のかかる動物を単離した。これらの新たな突然変異を、それらがced-3の
劣性突然変異を有することを確認するために同型接合させた。分子生物学
分子生物学の標準技術を用いた（Maniatis等、Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, 1983）。
この仕事では、次の２つのコスミドライブラリーを大いに用いた：ベクターｐ
ＨＣ７９中の７０００クローンのＳａｕ３ＡＩ部分消化ゲノムライブラリー及び
べクターｐＪＢ８中の６０００クローンのＳａｕ３ＡＩ部分消化ゲノムライブラ
リー （Ish-Horowicz及びBurke,Nucleic Acids Res. 9:2989 (1981)）。
ＭＭＭ−Ｃ１の「右」端を、それをＨｉｎｄＩＩＩで切って自己ライゲーショ
ンによってクローン化した。ＭＭＭ−Ｃ１の「左」端を、それをＢｇｌＩＩ又は
ＳａｌＩで切って自己ライゲーションによってクローン化した。
Ｊｃ８の「右」端を、Ｊｃ８をＥｃｏＲＩで消化して自己ライゲーションによ
って作成した。Ｊｃ８の「左」端を、Ｊｃ８をＳａｌＩによって消化して自己ラ
イゲーションによって作成した。
C. elegansＲＮＡをグアニジンイソチオシアネートを用いて抽出した（Kim及
びHorvitz, Genes & Dev. 4:357-371 (1990)）。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、ポリ（
ｄＴ）カラムにより、全ＲＮＡから選択した（Maniatis等、1983、前出）。ステ
ージ同調させた動物を調製するために、蠕虫を異なる発生ステージで同調さ
せた（Meyer及びCasson, Genetics 106:29-44 (1986)）。
ＤＮＡ配列決定用に、Henikoff（Gene 28:351-359(1984)）により開発された
手順によって一連の欠失を作った。ＵＳ Biochemicalsから得たシーケナーゼ及
びプロトコールを若干改変して用いてＤＮＡ配列を決定した。
サザーンブロット用のＴｃ１ＤＮＡプローブは、Bergerac Tcl要素（Emmons等
、Cell 32:55-65 (1983)）を含むｐＣｅ２００１であった。酵素は、New Englan
dBiolabsから購入し、放射性ヌクレオチドはAmershamから購入した。
プライマー伸長手順は、Robert E. Kingstonによるプロトコール（Ausuber等
編、Current Protocols inMolecular Biology, Publishing Associates and Wil
ey-Interscience, New York, p.4.8.1）に従つた。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、GeneAmp Kit（Perkin Elmer）によって
提供された標準プロトコールを用いて行なった。プライマー伸長及びＰＣＲに用
いたプライマーは、次の通りである：
生殖系列のトランスフォーメーシヨン
マイクロインジェクションの手順は、若干の改変を加えた（コスミドＤＮＡを
ＣｓＣ１勾配により２回精製した）が、基本的には A. Fire（EMBO J. 5:2673-
2680(1986)）の手順によるものである。欠失コスミドを注入するときには、ミニ
プレップＤＮＡを用いた。ミニプレップＤＮＡを調製するために、スーパーブロ
ス（１２ｇのバクトトリプトン、２４ｇの酵母エキス、８ｍｌの５０％グリセロ
ール、９００ｍｌのＨ2Ｏをオートクレーブし、オートクレーブ後に１００ｍｌ
の０．１７ＭＫＨ2ＰＯ4及び０．７２Ｍ ＫＨ2ＰＯ4を添加した）中のオーバー
ナイト細菌培養１．５ｍ１からのＤＮＡを、Maniatis等（１９８３ 前出）に記
載のアルカリ溶解法によって抽出した。ＤＮＡをＲＮアーセで処理（３７℃、３
０分）し、次いで、プロテアーゼＫで処理（５５℃、３０分）して、フェノール
で及び次いでクロロホルムで抽出し、２回沈殿させ（最初に０．３Ｍ酢酸ナトリ
ウム中で、２回目は、０．１Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ７．２中で）、そして５μｌ
の注入用緩衝液に再懸濁させた（A.Fire 1986 前出に記載の通り）。注入用の
ＤＮＡ濃度は、１００μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌにわたった。
すべてのトランスフォーメーション実験は、ced-1
(e1735);unc-31 (e928) ced-3 (n717)系統を用いた。unc-31を同時トランスフォ
ーメーシヨンのマーカーとして用いた（Kim及びHorvitz, 1990前出）。ced-1は
、Ced-3表現型の評価を容易にするために存在した。ced-1中の突然変異は、細胞
死の包み込み（engulfment）過程をブロックし、これは死細胞の死骸を野生型動
物におけるよりも長期間存続させる（Hedgecock等、Science 220:1277-1280 (19
83)）。Ced-3表現型を、若いＬ１動物の頭内に存在する死細胞数で評価した。コ
スミドC10D8又はC10D8のプラスミッドサブクローンをC14G10（unc-31(+)含有）
と、２：１〜３：１の比で混合してUnc-31(+)トランスフォーマントが試験する
コスミド又はプラスミッドをなお含む機会を増大させた。通常、１実験で２０〜
３０匹の動物に注射した。注射した動物の非-UncＦ１子孫を、３〜４日後に単離
した。非-Unc子孫の約１／２〜１／３は、非-Unc表現型をＦ２子孫に伝えてトラ
ンスフォーマント系統を樹立した。かかる非-Uncトランスフォーマントの若いL1
子孫を、Nomarski光学素子を用いて頭内に存在する死細胞数についてチェックし
た。
結果更なるced-3対立遺伝子の単離
前に存在したced-3対立遺伝子のすべてが、Ced表現型を示す生存可能な突然変
異体を検出するためにデザインしたスクリーニングにおいて単離された（Ellis
及び
Horvitz. Cell 44:817-829 (1986)）。かかるスクリーニングは、系統的に、任
意のクラスの同型接合として生存不能なced-3突然変異を見落とした。この理由
のために、ced-3の劣勢の致死対立遺伝子を単離し得る計画をデザインした。ced
-3の４つの新たな対立遺伝子（n1163, n1164, n1165, n1286）をこの方法で単離
した。新たな対立遺伝子が、C. elegans遺伝子中のＥＭＳによるヌル突然変異の
発生について予想される頻度（Brenner, Genetics 77:71-94 (1974);Greenwald
及びHorvitz, Genetics 96:147-160 (1980)）に近い２５００中に約１個の頻度
で単離され、すべての４対立遺伝子が同型接合で生存可能であるので、ced-3の
ヌル対立遺伝子は生存可能である。ced-3近くのＲＦＬＰマッピング
Ｔｃｌは、共通実験室Bristol系統及びBergerac系統において不動であると考
えられるC. elegans転移因子である（Emmons等、Cell 32:55-65 (1983)）。Bris
tol系統には３０コピーのＴｃｌがあるが、他方、Bergerac系統には４００コピ
ーより多いＴｃｌがある（Emmons等、1983年 前出； Finney,博士論文、マサ
チューセッツ、Cambridge, Massachusetts Institute of Technology,1987）。C
. elegansゲノムのサイズが小さい（一倍体ゲノムサイズ８×１０7ｂｐ）（Suls
ton及びBrenner,Genetics 77:95-104 (1976)）ので、Bristol系統及びBergerac
系統の間のＴｃｌによる多形性は、約２００
ｋｂ毎に１つ生じることが予想されよう。制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）を遺伝
的マーカーとして用いて、伝統的な突然変異体表現型と同じやり方でマップする
ことが出来る。任意の興昧ある遺伝子の近くでBristol系統及びBergerac系統間
で二形性であるＴｃｌ因子をマップするために一般的計画をデザインした（Ruvk
un等、Genetics 121:501-516 (1989)）。一度特定のＴｃｌの興昧ある遺伝子へ
の緊密な連鎖が確立されれば、そのＴｃｌをクローン化して染色体歩行を開始す
るために用いることが出来る。
５．１ｋｂのBristol特異的なＴｃｌのＥｃｏＲＩ断片を、仮に、ｃｅｄ−３
に最も近いＴｃｌを含むとして同定した。このＴｃｌ断片を、Ｔｃｌ含有 C. el
egansBristolのゲノムＤＮＡ断片のセットからのコスミドを用いてクローン化し
た。４６のかかるＴｃｌ含有コスミドからＤＮＡを調製して、サザーンブロット
を用いて５．１ｋｂのＥｃｏＲＩＴｃｌ含有断片を含むコスミドをスクリーニン
グして同定した。２つのかかるコスミドＭＭＭ−Ｃ１及びＭＭＭ−Ｃ９を同定し
た。この５．１ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をＭＭＭ−Ｃ１からｐＵＣ１３（Promega
）中にサブクローン化した。Ｔｃｌの両端がＥｃｏＲＶ部位を含む（Rosenzweig
等、Nucleic AcidsRes. 11:4201-4209 (1983)）ので、ＥｃｏＲＶを用いて５．
１ｋｂ（７）ＥｃｏＲＩ断片からＴｃｌを除去し、このＴｃｌ含有断片のユニー
クなフランキング領域のみを含
むプラスミッドを生成した。次いで、このプラスミッドを用いて特定のＴｃｌを
、他のＴｃｌ因子の邪魔を受けずに、マップした。
unc-30（e191） ced-3 （n717） dpy-4 （e1166） /+++の雄をBergerac（EM10
02）両性個体と交雑させて、Unc非-Dpy又はDpy非-Unc組換え体をＦ２子孫の中か
ら選び出した。それらの組換え体を自家受精させて、unc-30（e191） dpy-4 （B
ergerac）又はunc-30（Bergerac）dpy-4（e1166）の何れかについて同型接合の
系統を単離した。これらの組換え体系統のｃｅｄ遺伝子型を同定した後に、これ
らの系統からＤＮＡを調製した。これらの組換え体からのＤＮＡのサザーンブロ
ットを、５．１ｋｂＥｃｏＲＩＴｃ１断片のフランキング配列を用いて調べた。
このプローブは、Bristol Ｎ２中に５．１ｋｂの断片及びBergerac中に３．４
ｋｂの断片を検出した。５つのunc-30 ced-3 dpy（+Berg）組換え体の内の５つ
、及び1つのunc-30（+Berg） ced-3 dpy-4組換え体の内の１つがBristolパター
ンを示した。１０のunc-30（+Berg）dpy-4組換え体の内の９がBergeracパターン
を示した。唯一のunc-30（+Berg）dpy-4組換え体がced-3及び５．１ｋｂＴｃ１
因子間の交差型から生じた。ced-3とdpy-4との間の遺伝的距離は、２マップ単位
（ｍｕ）である。従って、Ｔｃｌ因子は、ced-3の右側０．１ｍｕの位置にある
。
コスミドＭＭＭ−Ｃ１及びＭＭＭ−Ｃ９を用いて、任
意の前にマップされたゲノムＤＮＡコスミドがこれらの２つのコスミドと重複す
るか否かを試験した。ced-3に近いクローン化領域を一方向に伸長した重複コス
ミドの含有物を同定した。
ＭＭＭ−Ｃ１をこの内容物（contig）に関して配向させるために、ＭＭＭ−Ｃ
１の両端をサブクローン化し、これらのサブクローンを用いて最も近いコスミド
Ｃ４８Ｄ１を調べた。ＭＭＭ−Ｃ１の「右」端は、Ｃ４８Ｄ１とハイブリダイズ
しないが、他方、「左」端は、ハイブリダイズする。それ故、ＭＭＭ−Ｃ１の「
右」端は、この内容物より更に伸長している。この内容物を伸長するために、Ｍ
ＭＭ−Ｃ１の「右」端を用いて２つのコスミドライブラリーのフィルターを調べ
た（Coulson等、Proc.Natl.Acad. Sci. USA 83:7821-7825 (1986)）。１つのク
ローンＪｃ８が、この内容物と逆の配向でＭＭＭ−Ｃ１を伸長することが見出さ
れた。
Bergerac及びBristol系統間のRFLPを用いてこの内容物を遺伝地図に関して配
向させた。Bristol （N2）及びBergerac（EM1002）ＤＮＡを種々の制限酵素で
消化して様々なコスミドについて調べてRFLPを探した。一度かかるRFLPが見出さ
れれば、ced-3及びunc-26間の、並びにunc-30及びced-3間の、Bristol及びBerge
rac系統の組換え体からのＤＮＡを用いて、ced-3に関するRFLPの位置を決定した
。
この内容物の一端を表すＪｃ８の「右」端は、N2及び
EM1002ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化した場合に、RFLP（nP33）を検出する。３
つのced-3 （+Berg） unc-26間の組換え体からのＤＮＡのサザーンブロットを
、Ｊｃ８の「右」端を用いて調べた。３つの+Berg unc-26組換え体の内の３つが
Bristolパターンを示したが、他方、２つのced-3 unc-26（+Berg）組換え体の内
の２つはBergeracパターンを示した。従つて、nP33は、unc-26の非常に近く又は
その右側にマップされた。
Ｊｃ８の「左」端も又、ＨｉｎｄＩＩＩ RFLP（nP34）を検出した。同じサザ
ーンブロットをＪｃ８「左」端を用いて再度調べた。２つのced-3 unc-26（+Ber
g）組換え体の内の２つ及び３つのced-3（+Berg） unc-26組換え体の内の２つが
Bergeracパターンを示した。３つのced-3（+Berg） unc-26組換え体の内の１つ
がBristolパターンを示した。ced-3とunc-26との遺伝的距離は０．２ｍｕである
。従って、nP34は、ced-3とunc-26との間（ced-3の右側約０．１ｍｕ）にマップ
された。
５．１ｋｂのＥｃｏＲＩＴｃｌ断片のフランキング配列（名称ｎＰ３５）を用
いて組換え体の同じセットを調ベた。３つのced-3（+Berg） unc-26組換え体の
内の２つ及び２つのced-3 unc-26 （+Berg）組換え体の内の２つがBristolパタ
ーンを示した。従って、ｎＰ３５も又、ced-3とunc-26との間（ced-3の右側約０
．１ｍｕ）に位置されることが見出された。
ＨｉｎｄＩＩＩ RFLPを含むコスミドT10H5 （nP36）及びＨｉｎｄＩＩＩ RF
LPを含むコスミドB0564 （nP37）を用いた類似の分析は、nP36及びnP37がunc-30
の非常に近く又はその右側にマップされることを示した。
これらの実験は、ced-3遺伝子を３つのコスミドの間に位置させた。RFLP、並
びにced-3、unc-30及びunc-26の染色体ＩＶ上の位置、並びにそれらのこれらの
コスミドに対する関係を図１に示す。マイクロインジェクションにより、コスミ
ドC37G8及びC33F2がunc-30遺伝子を運ぶことが示された（John Sulston，私信）
。従って、このced-3遺伝子を含む領域は、２つのコスミドの間に限られた。こ
れらの結果を図１にまとめてある。生殖系列トランスフォーメーションによるced-3の相補
ced-3遺伝子を含む候補であるコスミドをced-3突然変異体にマイクロインジェ
クションしてそれらが突然変異体の表現型を救済するか否かを見た。マイクロイ
ンジェクション手順は、改変を加えたA. Fire（EMB0 J. 5:2673-2680 (1986)）
の手順であった。ced-3の表現型はNomarski光学素子を用いてのみ試験すること
が出来るので、unc-31（運動性欠損変異体）を同時トランスフォーメーションの
マーカーとして用いた（Kim及びHorvitz，Genes & Dev. 4:357-371 (1990)）。
コスミドC14G10unc-31(+)）及び候補のコスミドをced-1（e1375）；unc-31 （e9
28）ced-3（n717）両性個体中に同時注入し、Ｆ１の非-Uncトランスフォーマン
トを単離して
非-Unc表現型が伝えられ且つトランスフォーマントの系統として樹立され得るか
否かを見た。かかるトランスフォーマントの若いＬ１子孫を、細胞死の存在につ
いてNomarski光学素子を用いて試験してCed-3表現型が抑制されるか否かを見た
。unc-31を含むコスミドC14G10単独では、ced-3突然変異休に注入した際にced-3
活性を救済しない。表４に、これらのトランスフォーメーション実験の結果をま
とめてある。
表３に示すように、注入した３つのコスミド（C43C9、W07H6及びC48D1）の内
で、C48D1のみがCed-3表現型を救済した（２／２非-Uncトランスフォーマントが
Ced-3表現型を救済した）。これらのトランスフォーマントの内の１つnEX1は、
注入されたコスミドの染色体外配列によって救済される（Way及びChalfie、Cell
54:5-16 (1988)）が、それは、非−Unc Ced(+)動物の子孫の５０％しか非−Unc
Ced(+)でないので、不安定な複製として維持されるようである。他のトランスフ
ォーマントの非−Unc Ced(+)表現型（nIS1）がその子孫のすべてに伝えられてい
るので、それは恐らくインテグレートしたトランスフォーマントである。Ｌ１ce
d-1動物は、頭内に平均２３の細胞の死骸を含む。Ｌ１ ced-1; ced-3動物は、
その頭内に平均０．３の細胞の死骸を含む。ced-1;unc-31 ced-3; nIS1及びced-
1; unc-31;nEX2動物は、その頭内にそれぞれ平均１６．４及び１４．５の細胞の
死骸を含む。これらの結果から、C48D1がced-3遺
伝子を含むことが結論された。
ced-3をコスミドC48D1内にもっと正確に位置させるために、このコスミドをサ
ブクローン化し、そのサブクローンをced-3突然変異体を救済する能力について
試験した。C48D1DNAを、このコスミド内を稀にしか切断しない制限酵素で消化し
、残ったコスミドを自己ライゲーションさせてサブクローンを生成した。次いで
、かかるサブクローンをced-3突然変異体に注入して補充現象を探した。C48D1を
ＢａｍＨＩで消化して自己ライゲーションした場合には、残りの１４ｋｂサブク
ローン（名称C48D1-28）が、ced-3突然変異体中に注入したときにCed-3表現型を
救済することが見出された（図２及び表４）。次いで、C48D1-28をＢｇｌＩＩで
部分消化して自己ライゲーションさせた。種々の長さのクローンを単離して、ce
d-3を救済するそれらの能力について試験した。
C48D1-28の１．７ｋｂのＢｇｌＩＩ断片を含まない１つのクローンC48D1-43は
、ced-3を救済することが出来た（図２及び表４）。C48D1-43を、ＢａｍＨＩ及
びＡｐａＩで消化して１０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ断片を単離することによ
り更にサブクローン化した。この断片をｐＢＳＫＩＩ＋内にサブクローン化して
ｐＪ４０を生成した。ｐＪ４Ｏは、ced-3突然変異体内にマイクロインジェクシ
ョンしたときにCed-3＋表現型を復活させることが出来る。ｐＪ４０を、２ｋｂ
のＢｇｌＩＩ−
ＡｐａＩ断片を欠失させてｐＪ１０７を生成することによってサブクローン化し
た。ｐＪ１０７も又、ced-3突然変異体にマイクロインジェクションした場合にC
ed-3表現型を救済することが出来た。ｐＪ１０７の左側の０．５ｋｂの欠失を、
ＥｘｏＩＩＩ消化によって、Ced-3活性に影響を与えずに作成することが出来た
（ｐＪ１０７ｄｅ１２８及びｐＪ１０７ｄｅ１３４）；事実、１つのトランスジ
ェニック系統nEX17は、完全なCed-3活性を復活した。しかしながら、このced-3
救済能力は、ｐＪ１０７の左側で１ｋｂを欠失したときに有意に減少し（ｐＪ１
０７ｄｅ１１２及びｐＪ１０７ｄｅ１２７）、ｐＪ１０７の右側で１．８ｋｂの
ＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩ断片を欠失したときには完全に除去された（ｐＪ５５及び
ｐＪ５６）が、これは、このＳａｌＩ部位がced-3コード領域内にあるらしいこ
とを示唆している。これらの実験から、ced-3は、７．５ｋｂのＤＮＡ断片に位
置された。これらの結果は、図２及び表４にまとめてある。ced-3転写物
ｐＪ１０７を用いてＮ２ＲＮＡのノーザンブロットを調べて、２．８ｋｂのバ
ンドを検出した。この転写物は１２のced-3突然変異体動物に存在するが、後の
分析は、１２のced-3突然変異体対立遺伝子すべてが、このｍＲＮＡをコードす
るゲノムＤＮＡにおける突然変異を含む（下記参照）ことを示し、従って、この
ＲＮＡが
ced-3転写物であることを確立した。
このced-3の発生時の発現パターンを、種々のステージ（卵、Ｌ１〜Ｌ４幼虫
及び若い成虫）の動物からのＲＮＡのノーザンブロットをced-3ｃＤＮＡサブク
ローンｐＪ１１８とハイブリダイズさせることにより測定した。かかる分析は、
ced-3転写物が、殆どのプログラムされた細胞死が起きる期間である胚発生中に
最も豊富であることを明らかにしたが、それは又、Ｌ１〜Ｌ４幼虫ステージの間
にも検出され、若い成虫において比較的高レベルで存在している。この結果は、
ced-3がプログラムされた細胞死を受ける細胞においてのみ発現されるのではな
いことを示唆している。
ced-3及びced-4は、共に、C. elegansにおけるプログラムされた細胞死に必要
であるので、これらの遺伝子の１つが、他の遺伝子の転写の調節器として作用し
ているのかもしれない。ced-4がced-3の転写を調節するのか否かを調べるために
、ced-4突然変異体（n1162，n1416, n1894,及びn1920）の卵からＲＮＡを調製し
て、ノーザンブロットをced-3 ｃＤＮＡサブクローンｐＪ１１８を用いて調べ
た。各レーンのＲＮＡの存在をアクチンＩプローブを用いて確認した。かかる実
験は、ced-3転写物のレベルがced-4突然変異体において正常であることを示した
。これは、ced-4がced-3の転写調節器ではありそうもないことを示している。ced-3 ｃＤＮＡの単離
ced-3のｃＤＮＡを単離するために、ｐＪ４０をプローブとして用いてＮ２の
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした（Kim及びHorvitz, Genes & Dev. 4
:357-371 (1990)）。７つのｃＤＮＡクローンを単離した。これらのｃＤＮＡは
、２つのグループに分けることが出来る。１つは３．５ｋｂであり、他方は２．
５ｋｂである。各グループからの１つのｃＤＮＡをサブクローン化して更に分析
した。ｐＪ８５は、３．５ｋｂのｃＤＮＡを含んでいる。実験は、ｐＪ８５が関
係のないｃＤＮＡに融合されたced-3 ｃＤＮＡを含み；Ｎ２のノーザンブロッ
トにおいて、ｐＪ８５挿入物が２つのＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、及びＮ
２ＤＮＡのサザーンブロットにおいて、ｐＪ８５がｐＪ４０ （ced-3ゲノムＤ
ＮＡ）より１つ多いとハイブリダイズすることを示した。ｐＪ８７は２．５ｋｂ
のｃＤＮＡを含んでいる。ノーザンブロットにおいて、ｐＪ８７は２．８ｋｂＲ
ＮＡとハイブリダイズし、サザーンブロットにおいて、ｐＪ４０がハイブリダイ
ズするバンドとのみハイブリダイズする。従って，ｐＪ８７はced-3 ｃＤＮＡ
のみを含む。
ｐＪ８７がced-3 ｃＤＮＡを含むことを示すために、フレームシフト突然変
異を、ｐＪ８７ｃＤＮＡ中のＳａｌＩ部位に対応するｐＪ４０のＳａｌＩ部位に
作成した。フレームシフト突然変異を含む構築物は、ced-3突然変異体動物にマ
イクロインジェクションしたときにCed-3表現型を救済することが出来なかった
が、これ
は、ced-3活性が除去されたことを示唆している。ced-3配列
ｐＪ８７のＤＮＡ配列を決定した（図３）。ｐＪ８７は、５０３アミノ酸のオ
ープンリーディングフレームを有する２．５ｋｂの挿入物を含んでいる（図３；
配列番号２）。このｃＤＮＡの５’末端は、２５ｂｐのポリＡ／Ｔ配列を含むが
、それは恐らくクローニングのアーティファクトでありゲノム配列中には存在し
ないであろう。このｃＤＮＡは、末端にポリＡ配列を有しており、それが転写物
の完全な３’末端を含んでいることを示唆している。３’末端の３８０ｂｐの欠
失を有するゲノム構築物がやはりced-3突然変異体を救済することが出来るので
、ｐＪ８７挿入物の１ｋｂは、非翻訳３’領域であり、そのすべてがced-3発現
に必須であるのではない（ｐＪ１０７及びその誘導体、図２参照）。
ced-3 ｃＤＮＡから得られたＤＮＡ配列を確認し、ced-3遺伝子の構造を研究
するために、プラスミッドｐＪ１０７中のced-3遺伝子のゲノム配列を決定した
（図３：配列番号１）。ced-3ゲノム及びｃＤＮＡ配列の比較は、ced-3遺伝子が
５４〜１１９５ｂｐにわたる大きさの７つのイントロンを有することを示した（
図４Ａ）。４つの最大のイントロン並びに開始コドンの５’側配列は、反復要素
を含むことが見出された（図３）。５つの型の反復要素が見出されたが、その幾
つかは以前に他のC. elegans遺伝子の非コード領域において特性決
定されている。例えば、fem-1 （Spence等、Cell 60:981-990 (1990)）、lin-1
2（J. Yochem、私信）、及びmyoD（Krause等、Cell 63:907-919(1990)）等。こ
れらの内で、反復１はfem-1及びmyoD中にも、反復３はlin-12及びfem-1中に、反
復４はlin-12中に見出され、反復２及び５は新規な反復要素である。
プライマー伸長及びＰＣＲ増幅の組合せを用いて、ced-3転写物の５’末端の
位置及び性質を測定した。２っのプライマー （Pex1及びPex2）をプライマー伸
長反応に用いた。Pex1反応は、２つの主要なバンドを生じたが、他方、Pex2反応
は１つのバンドを与えた。Pex2のバンドは、大きさにおいて、Pex1反応からのも
つと小さいバンドに対応し、長さにおいて、C. elegansスプライスリーダー（Be
ktesh, Genes & Devel. 2:1277-1283(1988)）に、ゲノム配列の２１６６位置の
コンセンサススプライスアクセプターにてトランススプライスされる可能な転写
物に一致した（図３）。もっと大きいPex1バンドの性質は不明である。
このトランススプライスされたメッセージの野生型蠕虫における存在を確認す
るために、全C. elegansＲＮＡを、SLI-Log5及びSL2-Log5プライマー対を用いて
ＰＣＲ増幅し、その後に、SL1-オリゴ10及びSL2-オリゴ10を用いて再増幅した。
SL1反応は、予想された長さの断片を生じた。この断片の同定を配列決定によっ
て確認した。従って、ced-3転写物の殆どではなくても、少なくとも
幾つかは SL1にトランススプライスされる。この結果に基づいて、ced-3メッセ
ージの開始コドンを、ゲノム配列の位置２２３２にコードされるメチオニンとし
た（図３）。
１２のＥＭＳ誘導したced-3対立遺伝子のＤＮＡ配列も決定した（図３及び表
１）。この１２の内の９は、ミスセンス突然変異である。１２の内の２つは、ナ
ンセンス突然変異であり、ced-3の翻訳が時期尚早に停止してしまうのであろう
。これらのナンセンスced-3突然変異は、ced-3遺伝子が生存能力に必須でないこ
とを確かめた。１２の突然変異の内の１つは、保存されたスプライシングアクセ
プターＧの変化であり、他方は、スプライス部位の７０％保存されたＣの変化を
有し、それは又、たとえスプライシングが正しくても終止コドンを生成すること
も出来た。興味深いことに、これらのＥＭＳ誘導した突然変異は、この蛋白質の
Ｎ末端側１／４又はＣ末端側半分の何れかにある。事実、１２の突然変異の内の
９は、この蛋白質の少なくとも１００アミノ酸をコードするced-3の領域内に生
じる。突然変異は、特に、ced-3遺伝子の中央部分には存在しない（図４Ａ）。Ced-3蛋白質はセリンに富む領域を含む
このCed-3蛋白質は、非常に親水性であり、トランスメンブレンドメインと思
われる有意に疎水性の領域を見出すことが出来ない（図５）。Ced-3蛋白質はセ
リンに富んでいる。Ced-3蛋白質のアミノ酸７８〜２０５の内
で、１２７アミノ酸の内の３４がセリンである。セリンは、しばしば、セリン／
スレオニンプロテインキナーゼの標的となる（Edelman, Ann. Rev. Biochem. 56
:567-613 (1987)）。例えば、プロテインキナーゼＣは、セリンが塩基性残基の
アミノ及びカルボキシル側に隣接したときにセリンをリン酸化することが出来る
（Edelman,1987 前出）。Ced-3蛋白質中のセリンの４つは、アルギニンと隣接
している（図６Ａ〜Ｂ）。同じセリン残基は又、関連するＳｅｒ／Ｔｈｒキナー
ゼの標的でもあり得る。
Ced-3蛋白質の機能的に重要な領域を同定するために、２つの関連する線虫種C
. briggsae（配列番号５）及びC. vulgaris（配列番号６）からのced-3遺伝子を
含むゲノムＤＮＡをクローン化して配列決定した。これらの３種のced-3遺伝子
産物の配列比較は、これらの蛋白質のセリンリッチでない領域が高度に保存され
ていることを示した（図９）。C. briggsae及びC. vulgarisにおいて、セリンリ
ッチ領域内の多くのアミノ酸は、C.elegans Ced-3蛋白質と比べて類似していな
い。セリンリッチ領域内で重要なものは、正確なアミノ酸配列ではなくて全体的
にセリンリッチであるという特徴であるらしい。
この仮説は又、C. elegansにおけるced-3突然変異の分析によっても支持され
る：１２のＥＭＳ誘導突然変異の内の何れもセリンリッチ領域にはなく、これは
、この領域内の突然変異がCed-3蛋白質の機能に影響せず、それ故、ced-3突然変
異についてのスクリーニングにおいて単離され得なかったのであろうことを示唆
している。実施例２ 脊椎動物及び無脊椎動物における細胞死の一般的機構
特定の文献において報告された従来の研究の結果は、脊椎動物並びに無脊椎動
物を含む多様な生物における細胞死が遺伝子の活性化を含む一般的な機構を共有
していることを示唆する。これらの研究は、ある種の観察が
幾人かの人々をして脊椎動物の細胞死を線虫及び昆虫等の無脊推動物で認められ
るプログラムされた細胞死から区別させるにもかかわらず、C. elegansのced-3
及びced-4遺伝子に類似する遺伝子が脊椎動物に起きる細胞死に関与するのであ
ろうという仮説と一致する。ある種の脊椎動物の細胞死は、ced-3及びced-4によ
り制御されるC. elegansにおけるプログラムされた細胞死とある種の特徴を共有
している。例えば、ヒナの後根神経節中のニューロンの１４％までは、それらの
誕生の直後に何らの分化の徴候も示さないうちに死ぬ（Carr及びSimpson, Dev.
Brain Res. 2:57-162 (1982)）。ced-3及びced-4の様な遺伝子がこのクラスの脊
椎動物の細胞死においてよく機能し得るのであろう。
遺伝的モザイク分析は、ced-3及びced-4遺伝子が、細胞−細胞相互作用を通し
て作用し得ないように、プログラムされた細胞死を受ける細胞により発現される
ことを示唆した（Yuan及びHorvitz, Dev. Biol. 138:33-41(1990)）。脊椎動物
中の多くの細胞死は、それらが標的組織との相互作用によって制御されているよ
うに見えることで異なるようである。例えば、標的由来の成長因子の欠乏が脊椎
動物のニューロン細胞死の原因であると考えられている（Hamburger及びOppenhe
im, Neurosci.Comment. 1:39-55 (1982); Thoenen等、SelectiveNeuronal Death
, Wiley, New York, 1987, Vol． 126,82-85頁）。しかしながら、類似の遺伝
子及び機構を含
む細胞死の経路が種々の方法で誘発され得るので、このクラスの細胞死であって
もced-3及びced-4の様な遺伝子と関係することはあり得よう。この考えを支持す
るものは、脊椎動物並びに無脊椎動物細胞の死がＲＮＡ及び蛋白質合成のインヒ
ビターによって阻止され得ることを示す幾つかのイン・ビトロ及びイン・ビボの
研究である（遺伝子の活性化がこれらの細胞死に必要であることを示唆している
）（Martin等、J. Cell Biol. 106:829-844 (1988); Cohen及びDuke, J. Immuno
l. 132:38-42(1984); Oppenheim及びPrevette, Neurosci. Abstr.14:368 (1988)
; Stanisic等、Invest. Urol. 16:19-22 (1978); Oppenheim等、Dev. Biol. 138
:104-113(1990); Fahrbach及びTruman, Selective NeuronalDeath, Ciba Founda
tion Symposium, 1987, No． 126,65-81頁）。これらの死ぬ脊椎動物及び無脊椎
動物細胞で誘導される遺伝子が、C. elegansのced-3及びced-4遺伝子と構造的に
関連している細胞死遺伝子であるということはあり得る。
C.elegansにおける細胞死が脊椎動物における細胞死に機構的に類似している
という仮説をやはり支持するものは、C. elegansの遺伝子ced-9の蛋白質産物が
配列においてヒト蛋白質Bcl-2に類似しているという観察である。ced-9は、細胞
が線虫の発生中にプログラムされた細胞死を受けることを、ced-3及びced-4の活
性を打ち消すことによって阻止することが示された（Hengartner
等、Nature 356:494-499 (1992)）。このbcl-2遺伝子は又、細胞死に対して細胞
を保護することにも関係している。ced-9及びbcl-2が相互作用する遺伝子及び蛋
白質が類似していることはありそうに見える。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人
（Ａ）名称：Massachusetts Institute of
Technology
（Ｂ）通り：77 Massachusetts Avenue
（Ｃ）市：Cambridge :
（Ｄ）州：マサチューセッツ
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）郵便番号：０２１３９
（ｉｉ）発明の名称：Ｃｅｄ−３及び関連蛋白質の
インヒビター
（ｉｉｉ）配列の数： １４
（ｉｖ）コンピューター読み取り可能形式：
（Ａ）媒体型：ディスケット
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：７６５３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ （genomic）
（ｘｉ）配列（配列番号１）：
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：５０３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列（配列番号２）：
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１３７３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１８．．１２３２
（Ｄ）他の情報：／産物＝「ヒト インターロイキン−１βコンバ
ーターゼ」
（ｘｉ）配列（配列番号３）：
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：４０４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列（配列番号４）：
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：５０５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号：ｕｎｓｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：各Ｘａａ
（ｘｉ）配列（配列番号５）：
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：４８０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号：ｕｎｓｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：各Ｘａａ
（ｘｉ）配列（配列番号６）：
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列（配列番号７） ：
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列（配列番号８） ：
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列（配列番号９） ：
（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列（配列番号１０）：
（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列（配列番号１１）：
（２）配列番号１２の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列（配列番号１２）：
（２）配列番号１３の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１７１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列（配列番号１３）：
（２）配列番号１４の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：４０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列（配列番号１４）：
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＷ
38/00 ＡＤＵ
38/46 ＡＢＥ
48/00 ＡＢＮ 8314−4Ｃ
Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4Ｃ
Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ 9152−4Ｂ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ
// Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4Ｃ
9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＢＥ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ
(72)発明者 シャハム，シャイ
アメリカ合衆国 02116 マサチューセッ
ツ，ボストン，コモンウェルス アベニュ
ー 132，ナンバー ９
【要約の続き】
む）を記載する。