ES2273693T3 - Nutraceuticos basados en proteina de soja. - Google Patents

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Abstract

Uso de un polipéptido de lunasina que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 1 o un fragmento activo de la misma que comprenda al menos el motivo Arg-Gly-Asp seguido por al menos un motivo hexa-Asp/Glu en la fabricación de una formulación para la quimioprevención del cáncer en el que dicha formulación comprenda al menos el 50% en peso de polipéptido de dicho polipéptido lunasina y menos del 10% en peso de polipéptido del polipéptido Inhibidor Bowman-Birk.

Description

Nutracéuticos basados en proteína de soja.
Introducción Campo de la invención
El campo de la invención son proteínas de soja que tienen efectos quimiopreventivos.
Antecedentes
El concepto de que los factores dietéticos desempeñan un papel importante en la etiología de diferentes tipos de cáncer está bien fundamentado por datos epidemiológicos (World Cancer Fund, 1997). Por ejemplo, existen muchas evidencias que sugieren que las dietas que contienen grandes cantidades de productos derivados de la soja están asociadas a bajas tasas generales de mortalidad por cáncer, particularmente por cáncer de colon, de mama y de próstata, lo que ha impulsado la identificación de los compuestos específicos de la soja que pudieran ser responsables de los efectos preventivos del cáncer (Messina y Barnes, 1991; Kennedy, 1995).
Se ha demostrado que un inhibidor de proteasa derivado de la soja, el inhibidor Bowman-Birk (IBB), es particularmente eficaz como agente quimiopreventivo (Kennedy, 1998). El IBB ha sido caracterizado como una proteína de 8 kDa, con una secuencia y estructura definidas (revisado por Birk, 1985); sin embargo, la mayoría de los estudios en los que se demuestra la eficacia del IBB han usado BBIC, un extracto de soja enriquecido en IBB. El BBIC es altamente eficaz para suprimir la carcinogénesis (1) inducida por diversos carcinógenos, (2) en tres diferentes sistemas de modelo animal (ratas, ratones y hámsters) y en sistemas de transformación in vitro (Kennedy y col., 1993), (3) en varios tejidos/órganos (colon, hígado, pulmón, esófago y epitelio bucal, (4) cuando se lo administra a animales por diferentes vías (i.p., i.v., tópica, dietética), (5) que incluye diferentes tipos de tumores (carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, angiosarcomas, etc, (6) en diferentes tipos celulares (células epiteliales en el hígado, colon, pulmón, esófago y mucosa del interior de la mejilla así como también en células del tejido conjuntivo (fibroblastos, tanto in vitro como en el hígado) que originan angiosarcomas. Por lo tanto, la capacidad quimiopreventiva del BBIC ha quedado demostrada en diversos sistemas de ensayo de carcinogénesis, logrando la condición de Nuevo Fármaco de Investigación en la FDA en 1992 (IND nº. 34671), actualmente en la etapa de ensayos clínicos en humanos.
Bibliografía citada
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Resumen de la invención
La invención proporciona el use de un polipéptido de lunasina en la fabricación de formulaciones para suministrar cantidades eficaces de lunasina como nutracéutico. En particular, la invención proporciona el uso de un polipéptido de lunasina que comprende la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº: 1 o un segmento activo del mismo, que comprenda al menos el motivo Arg-Gly-Asp; seguido por al menos un motivo hexa-Asp/Glu para la fabricación de una formulación quimiopreventiva para el cáncer, en la que dicha formulación comprende al menos 50% en peso de polipéptido de dicho polipéptido de lunasina y menos de 10% en peso de polipéptido del polipéptido Inhibidor Bowman-Birk. En otras realizaciones, la composición comprende preferentemente al menos 70%, con mayor preferencia al menos 98%, y con máxima preferencia 100% en peso de polipéptido del polipéptido de lunasina; y menos del 2%, preferentemente menos del 0,5%, con mayor preferencia menos del 0,1% y con máxima preferencia 0% en peso de polipéptido del polipéptido Inhibidor Bowman-Birk. Las formulaciones pueden ser suministradas o administradas por uno cualquiera de una gran variedad de procedimientos de administración conveniente, bien conocidos en la técnica, (ver, por ejemplo Goodman y Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Novena Edición) incluyendo ingestión oral, contacto tópico por la piel utilizando técnicas bien conocidas de administración dérmica, por introducción en los líquidos fisiológicos como sangre, líquido sinovial, líquido intersticial, etc.
En otras realizaciones, la formulación es para:
- administración oral de un polipéptido de lunasina
- administración tópica de un polipéptido de lunasina por el contacto de la piel con dicha formulación; o
- introducción de dicha formulación en los líquidos fisiológicos para administrar un polipéptido de lunasina.
Los procedimientos para producir dichas formulaciones por medio de la purificación de polipéptidos de lunasina al nivel de pureza requerido y combinando dichos polipéptidos de lunasina con un excipiente farmacéuticamente aceptable en una unidad de dosificación activa por vía oral también se desvelan en este documento. El material de origen de la lunasina puede ser semillas de soja, un sistema recombinante de expresión del polipéptido lunasina, lunasina producida sintéticamente o un extracto o fracción de la misma. Los excipientes y las dosificaciones adecuados pueden ser fácilmente determinados empíricamente tomando como referencia los datos existentes sobre BBIC.
Descripción detallada de realizaciones particulares de la invención
Las siguientes descripciones de realizaciones particulares y ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no como limitación. A menos que se indique lo contrario o se manifieste de otro modo, en estas descripciones y a lo largo de esta memoria descriptiva, los términos "un"/"una" significan uno o más, el término "o" significa y/o y las secuencias de polinucleótidos se entiende que incluyen hebras opuestas, así como también "esqueletos" alternativos que se describen en este documento.
Se ha demostrado que una pequeña subunidad peptídica de una albúmina 2S aislada de semilla de soja, a la que se ha denominado lunasina, tiene actividad antimitótica cuando se expresa en células de mamífero (Galvez AF y de Lumen BO, 1999 y USSN 08/938.675). A diferencia de otros agentes antimitóticos que alteran la función microtubular, se ha demostrado que cuando el gen de lunasina es transfectado y expresado dentro de la célula, la lunasina se une preferentemente a cromatina hipoacetilada en las células transfectadas con lunasina, lo que conduce al desplazamiento de las proteínas del cinetocoro durante la mitosis.
El polipéptido de lunasina también contiene un motivo RGD funcional (Arg-Gly-Asp). Cuando se aplica exógenamente a cultivos de células de mamíferos, la lunasina se une a las integrinas de la membrana celular por el tripéptido RGD y subsecuentemente entra al citoplasma por translocación de membrana. Las cantidades relativamente pequeñas de lunasina que entran al núcleo por difusión pasiva y en la prometafase (cuando se produce la desintegración de la membrana nuclear) son suficientes para unirse de manera eficaz a regiones de cromatina hipoacetilada. Sin embargo, a diferencia de las células transfectadas con lunasina, que expresan grandes cantidades de lunasina de manera constitutiva, la lunasina internalizada no parece afectar el ensamblaje del cinetocoro, ya que las células experimentan mitosis normales. En cambio, la lunasina inhibe la transformación de células fibroblásticas embrionarias normales en tumores cancerosos por agentes carcinogénicos. La afinidad de unión de lunasina a las regiones de nucleosomas deacetilados es consistente con un papel anticarcinogénico de la lunasina como supresor sustituto de tumores, evitando la acetilación de la cromatina y la activación de oncogenes en células con genes mutados supresores de tumores. La propiedad de adherencia celular de la lunasina también confiere un beneficio adicional, al evitar la diseminación del cáncer por unión competitiva a las integrinas de membrana requeridas por las células metastásicas para el acoplamiento a la matriz extracelular y para la proliferación.
También se ha demostrado que el inhibidor de proteasa Inhibidor Bowman-Birk (BBIC), derivado de soja, que se ha comprobado que es un quimioprotector contra diferentes tipos de cáncer en modelos animales in vitro e in vivo, contiene lunasina como componente principal. De hecho, la eliminación de la lunasina del BBIC por inmunoextracción redujo significativamente la capacidad del BBIC para inhibir la transformación mediada por carcinógeno de las células C3H. Además, usando cantidades equimolares, se demostró que la lunasina es más eficaz que el BBIC en la prevención de la formación de tumores inducidos por carcinógeno. Estos hallazgos indican que la lunasina es un (si no es "el") componente anticarcinógeno activo del BBIC.
De acuerdo a esto, según se usa en este documento, el término lunasina se refiere a compuestos que comprenden el polipéptido natural lunasina de la soja (coincidentemente purificada y secuenciada por Odani y col., 1987 (Ser Lys Trp Gln His Gln Gln Asp Ser Cys Arg Lys Gln Leu Gln Gly Val Asn Leu Thr Pro Cys Glu Lys His Ile Met Glu Lys Ile Gln Gly Arg Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp, ID SEC Nº: 1) y los segmentos activos de dicha secuencia que comprenden por lo menos el motivo Arg-Gly-Asp seguido al menos por un motivo hexa-Asp/Glu. Los polipéptidos de lunasina preferidos comprenden los restos 33-43, de preferencia 21-43, más preferentemente 10-43, y con la máxima preferencia 1-43 de la ID SEC Nº: 1. Los compuestos ejemplares lunasina-del (usando nuevamente la nomenclatura convencional N\rightarrowC) que han demostrado ser eficaces para inhibir la carcinogénesis en modelos animales e in vitro, incluyen:
lunasina-del-1: fusión de MRG - restos 32-43 de ID SEC Nº: 1
lunasina-del-2: fusión de \alpha-tubulina - restos 32-43 de ID SEC Nº: 1
lunasina-del-3: fusión de \beta-tubulina - restos 27-42 de ID SEC Nº: 1
lunasina-del-4: fusión de MAP2 - restos 5-43 de ID SEC Nº: 2
lunasina-del-5: fusión de Mapmodulina - restos 32-43 de ID SEC Nº: 1
lunasina-del-6: fusión de GFP - restos 32-43 de ID SEC Nº: 1
lunasina-del-7: fusión de MAP4 - restos 23-42 de ID SEC Nº: 1
lunasina-del-8: fusión de FLAGG - restos 9-43 de ID SEC Nº: 1
lunasina-del-9: fusión de CICLINA A - restos 32-43 de ID SEC Nº: 1
lunasina-del-10: fusión de CICLINA B1 - restos 32-43 de ID SEC Nº: 1
lunasina-del-11: fusión de CICLINA B2 - restos 19-42 de ID SEC Nº: 1
lunasina-del-12: fusión de CICLINA B3 - restos 13-43 de ID SEC Nº: 1
lunasina-del-13: fusión de SH2 - octa-aspartato
lunasina-del-14: fusión de SH3 - octa-aspartato
lunasina-del-15: fusión de ID SEC Nº: 1, restos 27-34-MRG-octa-aspartato
lunasina-del-16: fusión de ID SEC Nº: 1, restos 27-34 - ID SEC Nº: 1, restos 27-34 - octa-aspartato
lunasina-del-17: fusión de MRG-tetra-aspartato-tetra glutamato.
El Péptido Lunasina Inhibe la Transformación Mediada por Carcinógeno de Células Fibroblásticas de Ratón C3H 10T1/2 en Células Tumorales. Los experimentos realizados usando el mismo ensayo de transformación in vitro que se usó para determinar la propiedad quimiopreventiva del BBIC demostraron que el agregado exógeno del péptido lunasina a concentraciones tan bajas como 10 nM (10 nM a 10 mM) inhibe la transformación de células fibroblásticas normales de embrión de ratón (C3H 10T1/2) en focos tumorales por agentes carcinogénicos, MCA (3-metilcolantreno) y DMBA (7,12-dimetilbenceno[a] antraceno). La deleción del extremo ácido carboxilo (lunasina-del-C) y el motivo RGD de adherencia celular (lunasina-GRG) elimina el efecto inhibitorio, indicando que estos dominios son esenciales.
La lunasina es un Componente Principal del Inhibidor de Proteasa Bowman-Birk (BBIC) de Soja, una Conocida Sustancia Preventiva del Cáncer. Los inhibidores de proteasa, a diferencia de otras potenciales clases de preventivos del cáncer estudiados, tienen varias características que se ha demostrado son válidas también para la lunasina. La diferencia más extraordinaria es su capacidad para alterar la carcinogénesis de una manera irreversible. Cuando se detiene la administración de BBIC ya sea en experimentos in vitro o in vivo, las células o los tumores malignos no aparecen en los sistemas de ensayo usados (Kennedy, 1994). Por el contrario, los agentes quimiopreventivos como la vitamina E, el b-caroteno y los retinoides tienen un efecto reversible en los sistemas in vitro, donde sí se originan células transformadas cuando estos agentes quimiopreventivos son eliminados de células cultivadas tratadas con carcinógeno. Los inhibidores de proteasa también difieren de otros agentes quimiopreventivos en que son eficaces a niveles extremadamente bajos (nM), mientras que los otros agentes son eficaces solamente a muy altos niveles (mM). La relación dosis-respuesta de la supresión de carcinogénesis por BBIC es inusual ya que niveles de dosis de BBIC tienen los mismos efectos supresores en un intervalo que varía a lo largo de varios órdenes de magnitud. En tercer lugar, la sorprendente capacidad de los inhibidores de proteasa para suprimir tantos cánceres diferentes los hacen diferentes de la mayoría de los agentes quimiopreventivos. Sus propiedades anticancerosas no están restringidas a órganos/tejidos específicos.
La lunasina, como el BBIC, pertenece a la misma clase de familia de albúminas 2S y ambos se preparan de forma similar. Se ha demostrado por análisis de inmunotransferencia de Western que la lunasina es un componente principal de las preparaciones de BBIC disponibles en el comercio (Sigma). En un ensayo de inmunotransferencia ejemplar, el carril 3 que contenía una preparación en bruto de inhibidor de tripsina (polvo soluble Tipo II-S de Soja, Sigma T 9128) mostró una banda principal de proteína a 16 kDa que se iluminó en la inmunotransferencia. IBB es una proteína de 8 kDa que se sabe se dimeriza en solución. El carril 4 que contenía BBIC (Inhibidor Bowman-Birk, de polvo liofilizado de soja, Sigma T9777) mostró dos bandas proteicas, 8 kDa y 16 kDa, y ambas se iluminaron en la inmunotransferencia. La lunasina, que tiene 2 restos cisteína, puede formar puentes disulfuro con IBB (como monómero y como dímero) que tiene 14 restos cisteína. Esto demuestra claramente que la lunasina se encuentra en BBIC como un componente principal. Además, se demostró que la extracción de lunasina del BBIC por columna de afinidad con anticuerpo antilunasina y por tratamiento con resina, redujo significativamente la capacidad del BBIC para inhibir la transformación de células C3H. Esta evidencia, junto con la capacidad de la lunasina para inhibir la transformación de células C3H mediada por carcinógeno, indica que la lunasina es una principal (si no la más importante) molécula quimiopreventivamente activa en el BBIC. De hecho, los datos indican que BBIC podría actuar protegiendo a la lunasina de la digestión en el tracto gastrointestinal. La capacidad de la lunasina para entrar en células de mamíferos y luego modular la función de la cromatina ahora proporciona un mecanismo racional para explicar la propiedad quimiopreventiva del BBIC, así como también una guía para el uso de la lunasina como un nutracéutico o suplemento nutricional, particularmente como un agente anticarcinogénico. Por ejemplo, sustituyendo BBI por lunasina a dosis y rutas de administración comparables, es eficaz en estudios celulares y animales (ver las patentes de EE.UU. Nº 5.618.679; 5.616.492; 5.614.198; 5.505.946; 5.376.373; 5.338.547).
Modificación de la Cromatina y Supresión de Tumores. Nuestra hipótesis es que la capacidad de la lunasina para unirse a la cromatina es el mecanismo subyacente de la capacidad antimitótica del gen de lunasina y de la propiedad preventiva del cáncer del péptido lunasina. Una serie de estudios sugiere enfáticamente que la modificación de la cromatina está relacionada con vías de supresión de tumores (DePinho, 1998; Brehm y col., 1998; Magnaghi-Jaulin, 1998; Pazin y Kadonaga, 1997; Hassig y col., 1997; Laherty y col., 1997). Por ejemplo, la proteína del retinoblastoma Rb forma un complejo con E2F (una familia de factores de transcripción controlada por Rb) y HDAC1 (la principal deacetilasa de histona de mamíferos que modula la estructura de la cromatina) en células de mamíferos. Rb reprime el promotor regulado por E2F reclutando HDAC1 la cual deacetila las histonas centrales produciendo una asociación más estrecha entre el ADN y los nucleosomas, impidiendo de esta manera la unión de los factores de transcripción a elementos de reconocimiento del ADN. El complejo Rb/HDAC/E2F podría ser el objetivo de los virus transformadores que conducen a la liberación de la supresión y a un estado de transformación total. La unión de lunasina a la región hipoacetilada de la cromatina puede suprimir la génesis de tumores en un contexto diferente. Si bien la deacetilación causa una asociación más firme del ADN con los nucleosomas de los cromosomas condensados, conduciendo a un cambio a una estructura de mayor orden; también deja expuestas las cargas positivas en los restos lisina, lo que permitiría que la lunasina se uniese a las histonas de las secuencias terminales impidiendo el proceso reversible de acetilación/deacetilación. Consecuentemente, la expresión de los genes es reprimida de manera más o menos permanente. Los estudios en animales demuestran que la lunasina sobrevive eficazmente a la digestión, es absorbida y termina en los tejidos. La evidencia ha demostrado que la lunasina es internalizada en la célula por la vía del motivo RGD (es decir que no hay internalización cuando el motivo -RGD- está suprimido) y llega al interior del núcleo por difusión pasiva debido a su tamaño de 4 kDa y durante la prometafase, cuando la envoltura nuclear se desintegra. Finalmente, la lunasina se une a las histonas centrales de los nucleosomas e inhibe la transformación de la célula en presencia de carcinógenos, reprimiendo la transcripción como se describe más arriba.
<110> de Lumen, Benito O. Galvez, Alfredo F.
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<120> Nutracéuticos de Proteína de Soja
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<130> B99-089
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<140> 09/303.814
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<141> 1999-04-30
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<160> 1
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 43
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<212> PRT
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<213> soja
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<400> 1
1

Claims (10)

1. Uso de un polipéptido de lunasina que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 1 o un fragmento activo de la misma que comprenda al menos el motivo Arg-Gly-Asp seguido por al menos un motivo hexa-Asp/Glu en la fabricación de una formulación para la quimioprevención del cáncer en el que dicha formulación comprenda al menos el 50% en peso de polipéptido de dicho polipéptido lunasina y menos del 10% en peso de polipéptido del polipéptido Inhibidor Bowman-Birk.
2. Uso de acuerdo a la reivindicación 1, en el que la composición comprende al menos 90% en peso de polipéptido de dicho polipéptido lunasina y menos del 1% en peso de polipéptido de polipéptido Inhibidor Bowman-Birk.
3. Uso de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en el que el polipéptido lunasina comprende 33-43 de la ID SEC Nº: 1.
4. Uso de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2,en el que el polipéptido lunasina comprende los restos 21-43 de la ID SEC Nº: 1.
5. Uso de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en el que el polipéptido lunasina comprende los restos 10-43 de la ID SEC Nº: 1.
6. Uso de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en el que el polipéptido lunasina comprende los restos 1-43 de la ID SEC Nº: 1.
7. Uso de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en el que el polipéptido lunasina consiste en los restos 1-43 de la ID SEC Nº: 1.
8. Uso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha formulación es para la administración por vía oral de un polipéptido de lunasina.
9. Uso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha formulación es para la administración por vía tópica de un polipéptido de lunasina poniendo en contacto la piel con dicha formulación.
10. Uso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha formulación es para la introducción de dicha formulación dentro de un líquido fisiológico para la administración de un polipéptido de lunasina.
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