ES2273699T3 - Metodos y composiciones para terapia genetica no viral para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas. - Google Patents

Abstract

Uso de una formulación lipídica extruida farmacéuticamente aceptable que comprende DOTAP y al menos uno de colesterol o un derivado de colesterol o una mezcla de colesterol en combinación con un ácido nucleico bajo el control de un promotor y que codifica para un polipéptido antiproliferativo, en la fabricación de un medicamento para estimular o provocar la apoptosis en células cancerígenas, en el que el polipéptido antiproliferativo es una proteína supresora de tumores seleccionada de Rb, p53, p14, p15, p16, p19, INK4c, p21, p27, p73, una fusión p16-p27, una fusión p21-p27, p56RB, E2F-1, NOEY2, DCC, APC, NF-1, NF-2, PTEN, FHIT, C-CAM, E-cadherina, MEN-I, MEN-II, ZAC1, VHL, FCC, MCC, PMS1, PMS2, MLH-1, MSH-2, DPC4, BRCA1, BRCA2, mda-7, DBCCR-1 o WT-1.

Description

Métodos y composiciones para terapia génica no viral para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas.

Antecedentes de la invención A. Campo de la invención

La presente invención se refiere a generalmente a los campos de la oncología y la terapia génica. Más particularmente, se refiere a la formulación de productos farmacéuticos a base de lípidos. En realizaciones específicas, se refiere a formulaciones no virales a base de lípidos relacionadas con la administración génica para tratar enfermedades hiperproliferativas.

B. Descripción de la técnica relacionada 1. Terapia génica

La terapia génica es un campo emergente en la investigación biomédica con un foco en el tratamiento de la enfermedad mediante la introducción de ácidos nucleicos recombinantes terapéuticos en células somáticas de los pacientes. Se han iniciado diversos ensayos clínicos que usan terapias génicas e incluyen la terapia génica de diversos cánceres, SIDA, fibrosis quística, deficiencia de adenosina desaminasa, enfermedad cardiovascular, enfermedad de Gaucher, artritis reumatoide, y otras. Actualmente, el vehículo preferido para la administración de agentes de terapia génica es el adenovirus. Las ventajas de usar adenovirus como agente de terapia génica son la alta eficacia de transducción, infección de células que no están en división, fácil manipulación de su genoma, y baja probabilidad de recombinación no homóloga con el genoma del huésped. Sin embargo, las estrategias de terapia génica adenoviral padecen muchos problemas intrínsecos incluyendo la posibilidad de una respuesta inmunitaria del paciente, una posible incapacidad para repetir la administración de vectores virales, una dificultad en la generación con altos títulos virales, y la posibilidad de producción de virus infeccioso. Los sistemas de administración no virales proporcionan un vehículo de terapia génica alternativo que carece de uno o más de estos problemas.

2. Transferencia génica basada en lípidos

Las formulaciones no virales a base de lípidos proporcionan una alternativa a las terapias génicas adenovirales. Aunque muchos estudios de cultivo celular han documentado la transferencia génica no viral basada en lípidos, la administración génica sistémica a través de formulaciones a base de lípidos ha sido limitada. Una limitación principal de la administración génica basada en lípidos no viral es la toxicidad de los lípidos catiónicos que comprenden el vehículo de administración no viral. La toxicidad in vivo de los liposomas explica parcialmente la discrepancia entre los resultados de la transferencia génica in vitro e in vivo. Otro factor que contribuye a estos datos contradictorios es la diferencia en la estabilidad del liposoma en presencia y ausencia de proteínas séricas. La interacción entre los liposomas y las proteínas séricas tiene un drástico impacto sobre las características de estabilidad de los liposomas (Yang y Huang, 1997). Los liposomas catiónicas atraen y se unen a proteínas séricas cargadas negativamente. Los liposomas recubiertos por proteínas séricas o bien se disuelven o bien se captan por macrófagos que conducen a su eliminación de la circulación. Los métodos de administración liposomales in vivo actuales usan aerosolización, inyección subcutánea, intradérmica, intratumoral o intracraneal para evitar los problemas de estabilidad y toxicidad asociados con los lípidos catiónicos en circulación. Las interacciones de los liposomas y las proteínas plasmáticas es responsable en gran parte de la disparidad entre la eficacia de la transferencia génica in vitro (Feigner et al., 1987) e in vivo (Zhu et al., 1993; Philip et al., 1993; Solodin et al., 1995; Liu et al., 1995; Thierry et al., 1995; Tsukamoto et al., 1995; Aksentijevich et al., 1996).

Los avances recientes en las formulaciones de liposomas han mejorado la eficacia de la transferencia génica in vivo (Templeton et al. 1997; documento WO 98/07408). Una composición liposomal novedosa compuesta por un razón equimolar de 1,2-bis(oleiloxi)-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP) y colesterol aumenta significativamente la transferencia génica in vivo sistémica, aproximadamente 150 veces. La formulación lipídica de DOTAP:colesterol se dice que forma una estructura única denominada un "liposoma intercalado". Se notifica que esta formulación "intercala" ADN entre una bicapa invaginada o estructura de "jarrón". Las características beneficiosas de estos liposomas incluyen una carga positiva o negativa o \rho, estabilización coloidal por el colesterol, empaquetamiento bidimensional del ADN y aumento de la estabilidad sérica.

La producción de formulaciones lipídicas se consigue a menudo mediante sonicación o extrusión en serie de mezclas liposomales tras (I) evaporación en fase inversa (II) deshidratación-rehidratación (III) diálisis de detergentes y (IV) hidratación de película delgada. Una vez fabricadas, las estructuras lipídicas pueden usarse para encapsular compuestos que son tóxicos (quimioterápicos) o lábiles (ácidos nucleicos) cuando están en circulación. La encapsulación liposomal ha dado como resultado una menor toxicidad y una semivida sérica más prolongada para tales compuestos (Gabizon et al., 1990). Numerosos tratamientos de enfermedades están usando estrategias de transferencia génica basadas en lípidos para mejorar las terapias convencionales o establecer terapias novedosas, en particular terapias para tratar enfermedades hiperproliferativas.

3. Cáncer

La homeostasis del tejido normal es un proceso altamente regulado de proliferación celular y muerte celular. Un desequilibrio de o bien la proliferación celular o bien la muerte celular pueden convertirse en un estado canceroso (Solyanik et al., 1995; Stokke et al., 1997; Mumbyand Walter, 1991; Natoli et al., 1998; Magi-Galluzzi et al., 1998). Por ejemplo, el cáncer cervicouterino, de riñón, pulmón, pancreático, colorrectal y cerebral son sólo unos cuantos ejemplos de los muchos cánceres que pueden resultar (Erlandsson, 1998; Kolmel, 1998; Mangrayand King, 1998; Gertig y Hunter, 1997; Mougin et al., 1998). De hecho, la aparición de cáncer es tan elevada que se atribuyen más de 500.000 muertes al año al cáncer sólo en los Estados Unidos.

El mantenimiento de la proliferación celular y la muerte celular está regulado al menos parcialmente por protooncogenes. Un protooncogén puede codificar para proteínas que inducen la proliferación celular (por ejemplo, sis, erbB, src, ras y myc), proteínas que inhiben la proliferación celular (por ejemplo, Rb, p53, NF1 y WT1) o proteínas que regulan la muerte celular programada (por ejemplo, bcl-2) (Ochiet al., 1998; Johnson y Hamdy, 1998; Liebermann et al., 1998). Sin embargo, los reordenamientos genéticos o mutaciones para estos protooncogenes, da como resultado la conversión de un protooncogén en un potente oncogén que produce cáncer. A menudo, una única mutación puntual es suficiente para transformar un protooncogén en un oncogén. Por ejemplo, una mutación en el codón 12 o 13 en el gen K-ras puede convertir el protooncogén en un oncogén.

Actualmente, existen pocas opciones eficaces para el tratamiento de muchos tipos comunes de cáncer. El ciclo de tratamiento para un individuo dado depende del diagnóstico, el estadio hasta el que se ha desarrollado la enfermedad y factores tales como la edad, sexo y salud general del paciente. Las opciones más convencionales del tratamiento del cáncer son la cirugía, radioterapia y quimioterapia. La cirugía desempeña un papel fundamental en el diagnóstico y tratamiento del cáncer. Normalmente, se requiere un enfoque quirúrgico para la biopsia y para extirpar un crecimiento canceroso. Sin embargo, si el cáncer se ha metastatizado y está extendido, es improbable que la cirugía dé como resultado una cura y debe tomarse un enfoque alternativo. La radioterapia, quimioterapia e inmunoterapia son alternativas al tratamiento quirúrgico del cáncer (Mayer, 1998; Ohara, 1998; Ho et al., 1998). La radioterapia implica un direccionamiento preciso de radiación de alta energía para destruir células cancerígenas y de manera muy similar a la cirugía, es eficaz principalmente en el tratamiento de células cancerígenas localizadas, no metastatizadas. Los efectos secundarios de la radioterapia incluyen irritación cutánea, dificultad para tragar, sequedad de boca, náuseas, diarrea, caída del cabello y pérdida de energía (Curran, 1998; Brizel, 1998).

La quimioterapia, el tratamiento del cáncer con fármacos anticancerígenos, es otro modo de terapia contra el cáncer. La eficacia de una terapia con fármaco anticancerígeno dado está limitada a menudo por la dificultad para lograr la administración del fármaco en la totalidad de los tumores sólidos (el-Kareh y Secomb, 1997). Las estrategias quimioterápicas se basan en el crecimiento de un tumor sólido, en el que el fármaco anticancerígeno selecciona como diana las células cancerígenas que se dividen rápidamente. La mayoría de los enfoques quimioterápicos incluyen la combinación de más de un fármaco anticancerígeno, lo que se ha demostrado que aumenta la tasa de respuesta de una amplia variedad de cánceres (patente de los EE.UU. 5.824.348; patente de los EE.UU. 5.633.016 y patente de los EE.UU. 5.798.339). Un efecto secundario principal de los fármacos para quimioterapia es que también afectan a células de tejidos normales, siendo las células que es más probable que se vean afectadas las que se dividen rápidamente (por ejemplo, médula ósea, tracto gastrointestinal, sistema reproductor y folículos pilosos). Otros efectos secundarios de los fármacos para quimioterapia son llagas en la boca, dificultad para tragar, sequedad de boca, náuseas, diarrea, vómitos, fatiga, hemorragia, caída del cabello e infección. Pueden usarse otras formas de quimioterapia para tratar trastornos hiperproliferativos no cancerosos. Estos incluyen el uso de quimioterápicos convencionales tales como metotrexato y ciclofosfamida para enfermedades hiperproliferativas tales como artritis reumatoide y psoriasis. La quimioterapia pata enfermedades hiperproliferativas también puede incluir agentes inmunosupresores tales como esteroides, azatioprina, ciclosporina y agentes inmunomoduladores tales como derivados del ácido fumárico.

También puede usarse la administración de fármacos lipídicos en combinación con terapia fotodinámica o en combinación con retinoides, terapias biológicas tales como antagonistas de citocinas y monoclonales (por ejemplo, antagonista del receptor de TNF-alfa) o inhibidores enzimáticos tales como difluorometilornitina. Podrían usarse inhibidores de metaloproteinasas de la matriz en combinación con la invención descrita (por ejemplo, bromocriptina y butirede).

La inmunoterapia, un área que evoluciona rápidamente en la investigación del cáncer, es aún otra opción para el tratamiento de ciertos tipos de cánceres. Por ejemplo, el sistema inmunitario identifica las células tumorales como extrañas y, por tanto, se seleccionan como objetivo para su destrucción por el sistema inmunitario. Desafortunadamente, la respuesta normalmente no es suficiente para impedir la mayoría de los crecimientos tumorales. Sin embargo, recientemente ha habido una atención en el área de la inmunoterapia para desarrollar métodos que aumenten o complementen los mecanismos de defensa naturales del sistema inmunitario. Ejemplos de inmunoterapias actualmente en investigación o en uso son adyuvantes inmunitarios (por ejemplo, Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitroclorobenceno y compuestos aromáticos) (patente de los EE.UU. 5.801.005; patente de los EE.UU. 5.739.169; Hui y Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), terapia con citocinas (por ejemplo, interferones \alpha, \beta y \gamma; IL-1, GM-CSF y TNF) (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998) terapia génica (por ejemplo, TNF, IL-1, IL-2, p53) (Qin et al., 1998; Austin-Ward y Villaseca, 1998; patente de los EE.UU. 5.830.880 y patente de los EE.UU. 5.846.945) y anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anti-gangliósido GM2, anti-HER-2, anti-p185) (Pietras et al., 1998; Hanibuchi et al., 1998; patente de los EE.UU. 5.824.311).

Tal como se mencionó anteriormente, los protooncogenes desempeñan un papel importante en la biología del cáncer. Por ejemplo, los supresores de tumores Rb, p53, NF1 y WT1 son esenciales para el mantenimiento del fenotipo no tumorigénico de las células (revisado por Soddu y Sacchi, 1998). Se ha encontrado que aproximadamente el 50% de todos los cánceres están asociados con mutaciones del gen p53, que da como resultado la pérdida de las propiedades como supresor de tumores de p53 (Levine et al., 1991; Vogelstein y Kinzler, 1992; Hartmann et al., 1996a; Hartmann et al., 1996b). La alta incidencia de mutaciones del gen p53 en el cáncer ha llevado a muchos grupos de investigación a investigar p53 como una vía de tratamiento del cáncer a través de transferencia o sustitución génica. Los protooncogenes sis, erbB, src, ras y myc, que codifican para proteínas que inducen la proliferación celular, y los protooncogenes de la familia Bcl-2 que regulan la muerte celular programada también desempeñan importantes papeles en el fenotipo no tumorigénico de las células.

La administración lipídica de ácidos nucleicos para la terapia de transferencia o sustitución génica puede usarse sola, o en combinación con los tratamientos descritos anteriormente para proporcionar un medio para sensibilizar células hiperproliferativas y/o neoplásicas para terapias convencionales. La administración sistémica de ácidos nucleicos tendrá el potencial de seleccionar como diana células metastáticas así como cancerígenas de tumores sólidos y cancerosas, precancerosas y no cancerosas.

La optimización de la administración lipídica de fármacos mediante la administración sistémica permitiría el tratamiento de células hiperproliferativas en todo el organismo. Por tanto, existe la necesidad de una formulación lipídica farmacéutica que pueda dar la transferencia eficaz de ácidos nucleicos para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas. Además, la administración lipídica de fármacos puede aumentar la eficacia de la transferencia génica a células diana. Además, existe la necesidad de un vehículo de administración lipídico, farmacéuticamente aceptable, estable que pueda administrar productos farmacéuticos, en particular productos farmacéuticos a base de ácidos nucleicos, para el tratamiento de células hiperproliferativas con expresión alterada de protooncogenes. Por ejemplo, los documentos WO 93/24640, WO98/20857 y Templeton, NS et al. (1997) Nature Biotechnology, 15, 647-651 describen complejos de ADN:vehículo lipídico y el documento WO 98/07408 describe complejos de ADN y liposomas de DOTAP:colesterol extruidos. Xu, M et al. (1997) Human Gene Therapy, 8, 177-185 describen una terapia génica parenteral con p53 que inhibe tumores de mama humano in vivo a través de un mecanismo de espectador ("bystander") sin evidencia de toxicidad.

Sumario de la invención

Por tanto, es un objetivo de la presente invención proporciona una formulación lipídica extruida farmacéuticamente aceptable que comprende DOTAP y al menos uno de colesterol o un derivado de colesterol o una mezcla de colesterol en combinación con un ácido nucleico que representa o codifica para una proteína antiproliferativa para tratar un sujeto con una enfermedad hiperproliferativa. Se contempla que cualquiera de los ácidos nucleicos de la presente invención pueden estar bajo el control u operativamente unidos a un promotor.

La frase "dirigido a" en el contexto de proteínas y polipéptidos "dirigidos a" una proteína o polipéptido seleccionado como diana se refiere a la inhibición de la actividad, o bien directa o bien indirectamente, de la proteína o polipéptido seleccionado como diana.

La formulación de un vehículo lipídico extruido farmacéuticamente aceptable para la transferencia de ácidos nucleicos en la presente invención comprende DOTAP y al menos uno de colesterol o un derivado de colesterol o una mezcla de colesterol en combinación con un ácido nucleico que representa o codifica para una proteína antiproliferativa, tal como se especifica en las reivindicaciones. Tras la administración de la formulación a un sujeto con una enfermedad hiperproliferativa, se transfiere un constructo de expresión que comprende un ácido nucleico terapéutico bajo el control de un promotor que es activo en células eucariotas, a las células a través de un vehículo a base de lípidos. El producto génico terapéutico puede expresarse directamente por las células hiperproliferativas, estimulando así una detención del crecimiento o respuesta apoptótica. Adicional o alternativamente, puede expresarse por células en las proximidades de las células hiperproliferativas para modular indirectamente su hiperproliferación. Un ejemplo sería la transferencia de genes antiproliferativos o apoptóticos hasta células vasculares tumorales, conduciendo así a un proceso antiangiogénico; otro ejemplo implica un efecto de espectador en el que una célula no hiperproliferativa expresa y secreta el producto génico terapéutico de modo que las células próximas que no expresan el producto se ven afectadas de manera similar.

En ciertas realizaciones preferidas, la formulación lipídica farmacéuticamente aceptable incluye DOTAP en una concentración que oscila entre 1 y 8 mM. En realizaciones más preferidas, el lípido farmacéuticamente aceptable es una formulación que comprende DOTAP en una concentración que oscila entre 2 y 7 mM. En realizaciones todavía más preferidas, el lípido farmacéuticamente aceptable es una formulación que comprende DOTAP en una concentración que oscila entre 3 y 6 mM. Lo más preferiblemente, el lípido farmacéuticamente aceptable es una formulación que comprende DOTAP en una concentración de aproximadamente 4 a 5 mM.

En ciertas realizaciones preferidas, la formulación lipídica farmacéuticamente aceptable incluye colesterol o un derivado de colesterol o una mezcla de colesterol en una concentración que oscila entre 1 y 8 mM. En realizaciones más preferidas, el colesterol o derivado de colesterol o mezcla de colesterol se incluye en una concentración que oscila entre 2 y 7 mM. En realizaciones todavía más preferidas, el lípido farmacéuticamente aceptable es una formulación que comprende el colesterol o derivado de colesterol o mezcla de colesterol en una concentración que oscila entre 3 y 6 mM. Lo más preferiblemente, el lípido farmacéuticamente aceptable es una formulación que comprende el colesterol o derivado de colesterol o mezcla de colesterol en una concentración en una concentración de aproximadamente 4 a 5 mM.

Preferiblemente, el DOTAP y colesterol o derivado de colesterol o mezcla de colesterol se incluyen en una razón molar de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:3, más preferiblemente de 2:1 a aproximadamente 1:2, y lo más preferiblemente de aproximadamente 1:1. También se contempla que la formulación lipídica o liposoma se extruya una o más veces.

El ácido nucleico terapéutico es un oncogén, en el que el oncogén es un gen que codifica para un supresor de tumores. El ácido nucleico terapéutico puede codificar para una proteína de fusión que representa una o más de estas especies. El ácido nucleico terapéutico puede codificar para un mimético polipeptídico de una o más de estas especies. Se prevé que el ácido nucleico terapéutico puede usarse en diversas combinaciones para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas. Pueden administrarse combinaciones de ácidos nucleicos terapéuticos mediante una única formulación lipídica o mediante la administración de múltiples formulaciones lipídicas. Estas combinaciones pueden incluir los genes para moléculas inmunomoduladoras tales como IL-2, F42K, GM-CSF y/o IL-12. Los genes adicionales incluyen antagonistas inmunomoduladores (por ejemplo, antagonistas del receptor de TNF-alfa).

La proteína antiproliferativa es una proteína supresora de tumores, en la que el supresor de tumores es Rb, p53, p14, p15, p16, p19, INK4c, p21, p27, p73, una fusión p16-p27, una fusión p21-p27, p56^{RB}, E2F-1, NOEY2, DCC, APC, NF-1, NF-2, PTEN, FHIT, C-CAM, E-cadherina, MEN-I, MEN-II, ZAC1, VHL, FCC, MCC, PMS1, PMS2, MLH-1, MSH-2, DPC4, BRCA1, BRCA2, MDA-7, DBCCR-1, p57, Barx2, E1A, apoptina, o WT-I. En realizaciones particularmente preferidas, el supresor de tumores es p53. Una "proteína antiproliferativa" se refiere a una proteína o polipéptido que puede reducir o inhibir el crecimiento, la tasa de crecimiento o la proliferación de una célula, incluyendo una célula hiperproliferativa o célula tumoral. Proteínas antiproliferativas incluyen proteínas que provocan la apoptosis.

En ciertas realizaciones preferidas, la formulación lipídica farmacéuticamente aceptable comprende además un resto de selección de diana. Realizaciones más preferidas incluyen un resto de selección de diana que es un péptido, un ligando o un anticuerpo. En realizaciones todavía más preferidas, el péptido incluye una secuencia de RGD o GFE. En ciertas realizaciones preferidas el péptido tiene una longitud de desde 3 hasta 30 aminoácidos, se prefiere más una longitud de desde 3 hasta 20 aminoácidos, y lo más preferido es una longitud de desde 4 hasta 10 aminoácidos. Más preferiblemente, el péptido es un péptido cíclico.

En ciertas realizaciones preferidas, el resto de selección de diana comprende un ligando que es un sustrato para una proteína de superficie celular. En realizaciones adicionalmente preferidas, el ligando es un sustrato para integrinas, proteoglucanos, glucoproteínas, receptores, y transportadores. En realizaciones todavía adicionalmente preferidas, el resto de selección de diana comprende un anticuerpo que se une a una proteína de superficie celular. Lo más preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo frente al receptor Her-1.

El ácido nucleico terapéutico puede ser lineal, ramificado o circular. Puede ser de cadena sencilla, doble o triple o una mezcla. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico terapéutico contiene un promotor. El promotor puede aislarse de cualquier fuente natural, puede ser sintético, o puede ser quimérico, es decir, partes del mismo pueden provenir de múltiples fuentes incluyendo la síntesis. En ciertas realizaciones preferidas, el promotor es CMV IE, VEGF, CEA, dectina-1, dectina-2, CD11c humano, F4/80, SM22-alfa o clase II de CMH. Más preferiblemente el promotor es CMV IE. En otra realización preferida el vector de expresión comprende además una señal de poliadenilación. El ácido nucleico terapéutico también puede contener un potenciador transcripcional. El potenciador puede aislarse de cualquier fuente natural, puede ser totalmente sintético, o puede ser quimérico, es decir, partes del mismo pueden provenir de múltiples fuentes incluyendo la síntesis. En ciertas realizaciones preferidas el potenciador se deriva de CMV. El ácido nucleico terapéutico también puede contener un intrón. El intrón puede aislarse de cualquier fuente natural, puede ser sintético, o puede ser quimérico, es decir, partes del mismo pueden provenir de múltiples fuentes incluyendo la síntesis. En ciertas realizaciones preferidas, el intrón se deriva de CMV. El ácido nucleico terapéutico puede ser no replicante, condicionalmente replicante, o replicante en la célula huésped. El ácido nucleico terapéutico puede incluir señales secretoras de proteínas o secuencias de translocación que permiten que su producto de proteína pase de una célula a otra célula o a la circulación.

Se contempla en la presente invención el uso de la formulación lipídica par la fabricación de un medicamento para tratar trastornos hiperproliferativos que comprende administrar una cantidad eficaz de la formulación lipídica a un paciente que necesita tratamiento antiproliferativo. En ciertas realizaciones preferidas, la enfermedad hiperproliferativa de interés puede ser cualquier trastorno en el que la homeostasis celular normal está alterada y un desequilibrio de la proliferación celular y muerte celular conduce a una desregulación de la proliferación celular. La hiperproliferación mencionada anteriormente puede conducir a estados de enfermedad neoplásicos, preneoplásicos y no neoplásicos. Se contempla adicionalmente que una enfermedad neoplásica hiperproliferativa sea el cáncer, en el que el cáncer se deriva de la desregulación de la proliferación de una célula somática, madre o germinal de diversos tejidos. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, cáncer de pulmón, de cabeza, de cuello, de mama, de páncreas, de próstata, renal, de huesos, testicular, cervicouterino, gastrointestinal, linfoma, de ovarios, leucemia, mieloma, de esófago, de piel, de tiroides, de hígado, de cerebro, colorectal y de vejiga.

En ciertas realizaciones preferidas, la enfermedad hiperproliferativa no es cancerosa. En realizaciones preferidas adicionales, las enfermedades hiperproliferativas no cancerosas incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, cardiopatía, adenoma, leiomioma, lipoma, hemangioma, fibroma, enfermedad inflamatoria del intestino, osteoartritis, y psoriasis. Se contempla todavía adicionalmente que el trastorno hiperproliferativo sea la enfermedad de oclusión vascular, más preferiblemente reestenosis vascular.

También se contemplan en la presente invención diversas maneras de poner en contacto las células diana con una formulación lipídica farmacéuticamente aceptable. En esos métodos de tratamiento se incluyen la inyección o administración intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intramuscular, intranasal, intravesicular, intravítrea, intravaginal, rectal e intratumoral; infusión, infusión continua; perfusión localizada; bañar las células diana directamente o mediante un catéter; administración tópica; o absorción transdérmica; y/o aerosolización, instilación. En ciertas realizaciones preferidas, la formulación se administra al lecho del tumor antes o tras la resección del tumor.

Se prevé que los tratamientos serán administraciones o bien sencillas o bien múltiples mediante uno o una combinación de los métodos de tratamiento mencionados anteriormente. Los tratamientos se administrarán directamente, localmente, regionalmente y/o sistémicamente con el fin de poner en contacto las células diana.

Se prevé, en la presente invención, que la formulación se administra al paciente antes, durante o tras la quimioterapia, cirugía o radioterapia. Preferiblemente, la formulación lipídica se administra menos de 72 horas antes de la quimioterapia, cirugía o radioterapia. Más preferiblemente, la formulación lipídica se administra menos de 24 horas antes de la quimioterapia, cirugía o radioterapia. En otra realización preferida, la formulación lipídica se administra menos de 72 horas tras la quimioterapia, cirugía o radioterapia. Más preferiblemente, la formulación lipídica se administra menos de 24 horas tras la quimioterapia, cirugía o radioterapia. Se prevé adicionalmente que la invención puede practicarse como un tratamiento en sí misma.

Las enfermedades hiperproliferativas diseminadas se tratan comúnmente con agentes quimioterápicos. Las características de los agentes quimioterápicos limitan el tiempo y grado de la exposición del paciente. Se prevé, en la presente invención, que la eficacia de quimioterapia puede mejorarse combinando tratamientos quimioterápicos y por formulación lipídica. Quimioterapias de combinación incluyen, por ejemplo, cisplatino, carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalán, clorambucil, bisulfan, nitrosurea, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina, etopósido, tamoxifeno, taxol, transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina, vinblastina, taxotere, y metotrexato o cualquier análogo o variante derivada de los
mismos.

Tal como se utiliza en el presente documento la descripción, "un" o "una" puede significar uno o más. Tal como se utiliza en el presente documento en la(s) reivindicación(ones), cuando se utilizan junto con la palabra "que comprende", las palabras "un" o "una" significan uno o más de uno. Tal como se utiliza en el presente documento "otro" puede significar al menos un segundo o más.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se facilitan únicamente a modo de ilustración, ya que varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención según las reivindicaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor mediante referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en el presente documento.

Figura 1. Efecto terapéutico del tratamiento con p53 y FHIT complejado a liposoma de DOTAP:Chol sobre xenoinjertos de cáncer de pulmón humano subcutáneo. Figura 1a. Se dividieron ratones portadores de tumor H1299 subcutáneo en tres grupos (8 animales/grupo) y se trataron diariamente para un total de seis dosis (100 \mug/dosis), tal como sigue: sin tratamiento (\blacklozenge), ADN de plásmido de p53 (\square) y complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma (\blacksquare) (figura 1a); sin tratamiento (\blacklozenge), complejo de DOTAP:Chol-ADN de pAd:liposoma (\square) y complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma (\blacksquare) (figura 1b). Se midieron los tumores usando calibres y se calculó la significación estadística usando la prueba de la t de Student. Cada punto de tiempo representa el volumen promedio del tumor medio para cada grupo. Las barras representan el error estándar. Figura 2B. Expresión del gen p53 y muerte celular apoptótica tras tratamiento con DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma. Se recogieron los tumores H1299 subcutáneos de los animales que no recibieron tratamiento, plásmido de p53 o el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma a las 48 horas tras el tratamiento. Se analizó la producción de proteína p53 mediante inmunohistoquímica y muerte celular apoptótica mediante tinción TUNEL. El porcentaje de células que producen la proteína p53 (39%) (figura 1c) y que experimentan muerte celular apoptótica (32%) (figura 1d) en los tumores que reciben el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma fue significativo (p = 0,001) frente al porcentaje de células en los grupos sin tratamiento y de tratamiento con plásmido de p53. Figuras 1d-f. Efecto terapéutico del complejo de DOTAP:Chol-ADN de FHIT:liposoma sobre xenoinjertos de tumor de pulmón. Se dividieron ratones desnudos portadores de tumor H1299 y A549 en cuatro grupos (7 animales/grupo) y se trataron diariamente para un total de seis dosis (100 \mug/dosis), tal como sigue: sin tratamiento, ADN de plásmido de FHIT, el complejo de DOTAP:Chol-ADN de CAT:liposoma y complejo de DOTAP:Chol-ADN de FHIT:liposoma. Tratamientos del tumor H1299 (figura 1e) y tratamientos del tumor A549 (figura 1f). se inhibió significativamente el crecimiento del tumor en los animales portadores del tumor H1299 (p = 0,02) y A549 (p = 0,001) tratados con el complejo de DOTAP:Chol-ADN de FHIT:liposoma. Las barras indican el
error estándar.

Figura 2. Efectos del tratamiento intravenoso con complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma extruido o complejo de DOTAP:Chol-ADN de FHIT:liposoma sobre metástasis de pulmón. Figura 2a. Inhibición de metástasis de pulmón H1299 tras tratamiento con complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma. Ratones SCID/beige portadores del tumor de pulmón H1299 o bien no se trataron o bien se trataron diariamente para un total de seis dosis (50 \mug/dosis) con ADN de plásmido de p53, el complejo de DOTAP:DOPE-ADN de p53:liposoma, el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma no extruido, el complejo de DOTAP:Chol-ADN de CAT:liposoma extruido o el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma extruido. Cada grupo estaba compuesto por ocho animales. Se inhibió significativamente el crecimiento del tumor metastático (p = 0,001) en ratones tratados con complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma extruido en comparación con el crecimiento en los otros grupos (figura 2a). Figura 2b. Inhibición de metástasis de pulmón A549 tras tratamiento con complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma. Ratones nu/nu portadores del tumor de pulmón A549 o bien no se trataron o bien se trataron diariamente para un total de seis dosis (50 \mug/dosis) con el complejo de DOTAP:Chol-ADN de CAT:liposoma extruido o el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma extruido. Cada grupo estaba compuesto por ocho animales. Se inhibió significativamente el crecimiento del tumor metastático (p = 0,001) en ratones tratados con complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma extruido en comparación con el crecimiento en los dos grupos control. Figura 2c. Inhibición de metástasis de pulmón A549 tras tratamiento con complejo de DOTAP:Chol-ADN de FHIT:liposoma. Se dividieron ratones nu/nu portadores de tumor de pulmón A549 en cuatro grupos y se trataron como sigue: sin tratamiento, tratamiento con ADN de plásmido de FHID, tratamiento con complejo de DOTAP:Chol-ADN de CAT:liposoma y tratamiento con complejo de DOTAP:Chol-ADN de FHIT:liposoma diariamente para un total de seis dosis (50 \mug/dosis). Cada grupo estaba compuesto por seis animales. Hubo una reducción significativa en el número de tumores de pulmón (p = 0,007) en ratones tratados con complejo de DOTAP:Chol-ADN de FHIT:liposoma. En todos los experimentos, se recogieron los pulmones 2 semanas después del último tratamiento y se contaron las metástasis sin conocer el grupo de tratamiento. Las barras indican el error estándar.

Figura 3. Experimentos de supervivencia en ratones tratados con los tratamientos de complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma. Se les inyectó a ratones SCID/beige hembra 10^{6} células de tumor H1299 (seis animales/grupo) y se les inyectó a ratones BALB/c nu/nu 10^{6} células de tumor A549 (siete animales/grupo) a través de la vena de la cola. Se dividieron los animales en cuatro grupos y se trataron diariamente, tal como sigue: sin tratamiento, tratamiento con ADN de plásmido de p53, tratamiento con el complejo de DOTAP:Chol-ADN de CAT:liposoma o tratamiento con el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma. Los animales en cada grupo recibieron un total de seis dosis (50 \mug/dosis) y se monitorizaron diariamente para evaluar la morbimortalidad. Se estimó la supervivencia de los animales usando pruebas de los rangos con signo de Wilcoxon y Kaplan-Meier. La supervivencia aumentó significativamente en los animales portadores de tumor de pulmón H1299 tratados con el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma (p = 0,001) en comparación con la supervivencia en los animales control que o bien no recibieron tratamiento o bien tratamiento con ADN de plásmido de p53 o el complejo de DOTAP:Chol-ADN de CAT:liposoma (figura 3a). Los animales a los que se les inyectó H1299 mostraron diseminación del tumor a diversos órganos y tejidos, incluyendo los ganglios linfáticos cervicales, colon, mesenterio e hígado. La supervivencia también aumentó significativamente en los animales portadores de tumor de pulmón A549 tratados con el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma (p = 0,04) en comparación con la supervivencia en los animales de los grupos control (figura 3b).

Descripción de las realizaciones ilustrativas

La presente invención contempla la formulación lipídica farmacéuticamente aceptable, que comprende DOTAP y colesterol, un derivado de colesterol o una mezcla de colesterol, y un ácido nucleico que codifica para una proteína antiproliferativa, antisentido o ribozima para la administración del ácido nucleico dentro de células hiperproliferativas o dentro de células próximas a las células hiperproliferativas. En una realización, el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa de este tipo implica la administración intravenosa de un lípido y un complejo de constructo de expresión de p53 a las células hiperproliferativas, que posteriormente expresan la proteína p53 de tipo natural. Entonces, las células hiperproliferativas expresan p53, dando como resultado la estasis, destrucción o lisis de las células hiperproliferativas.

A. Enfermedad hiperproliferativa

Puede tratarse una variedad de enfermedades hiperproliferativas con la formulación de la presente invención. Algunas de las enfermedades hiperproliferativas contempladas para su tratamiento en la presente invención son la psoriasis, artritis reumatoide (AR), oclusión vascular, incluyendo reestenosis vascular, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), artrosis (A) y lesiones preneoplásicas en la boca, próstata, mama, pulmón, etc. También se incluye adenoma, leiomioma, lipoma, hemangioma, y fibroma. La presente invención tiene ramificaciones importantes particularmente con respecto a una enfermedad hiperproliferativa: el cáncer.

El cáncer se ha convertido en una de las principales causas de mortalidad en los países occidentales, segunda tan sólo por detrás de la cardiopatía. Las estimaciones actuales calculan que una persona de cada tres en los EE. UU. desarrollará cáncer, y que una persona de cada cinco morirá de cáncer. Los cánceres pueden considerarse como células alteradas que han perdido los mecanismos reguladores del crecimiento normales.

Actualmente hay tres categorías principales de oncogenes, que reflejan sus diferentes actividades. Una categoría de oncogenes codifican para proteínas que inducen la proliferación celular. Una segunda categoría de oncogenes, denominada genes supresores de tumores o antioncogenes, funciona para inhibir el exceso de proliferación celular. La tercera categoría de oncogenes o bien bloquea o bien o induce la apoptosis codificando para proteínas que regulan la muerte celular programada. Los miembros dentro de cada una de estas categorías pueden ser tóxicos cuando se expresan en las células. Esta toxicidad puede ser inaceptable durante la producción de productos farmacéuticos basados en virus en sistemas de mamíferos. La toxicidad inherente de estos ácidos nucleicos no es un problema con respecto a los procedimientos de fabricación de la presente invención. Se prevé utilizar la presente invención en la fabricación de dichos ácidos nucleicos tóxicos. Esto no limita la presente invención a la fabricación de los ácidos nucleicos tóxicos ya que también pueden fabricarse ácidos nucleicos menos tóxicos o no tóxicos.

En algunas realizaciones, el tratamiento de una amplia variedad de estados cancerosos o tipos de tejidos/órganos está dentro del alcance de la invención, por ejemplo, melanoma, de pulmón de células no pequeñas, de pulmón de células pequeñas, pulmón, hepatocarcinoma, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, leucemia, sangre, cerebro, piel, ojo, lengua, encía, neuroblastoma, cabeza, cuello, mama, pancreático, próstata, renal, huesos, testículos, ovarios, mesotelioma, cervicouterino, gastrointestinal, linfoma, cerebro, colon o vejiga. En realizaciones todavía más preferidas, la enfermedad hiperproliferativa que se trata según la presente invención es artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, osteoartritis, leiomiomas, ademomas, lipomas, hemangiomas, fibromas, oclusión vascular, reestenosis, aterosclerosis, lesiones preneoplásicas, carcinoma in situ, leucoplasia oral vellosa o psoriasis.

En una realización de la presente invención, el tratamiento de enfermedad hiperproliferativa implica la administración intravenosa de un constructo de expresión de ácido nucleico terapéutico para tratar células hiperproliferativas. Se contempla que las células hiperproliferativas expresarán el ácido nucleico, restaurando así una función perdida, complementando una función existente, reduciendo una función proliferativa, o añadiendo una nueva proteína que da como resultado una detención del crecimiento, destrucción o lisis de células hiperproliferativas; un ácido nucleico de este tipo codificará para una proteína antiproliferativa. Un polipéptido o proteína antiproliferativa es una que reduce o inhibe el crecimiento, proliferación o tasa de crecimiento de una célula, o una que provoca o aumenta la apoptosis de una célula. Las tres principales categorías de oncogenes se tratan a continuación y se enumeran en la
tabla 1.

1. Inductores de la proliferación celular

Las proteínas que inducen o provocan la proliferación (crecimiento) celular se clasifican en diversas categorías que dependen de la función. La característica común de todas estas proteínas es su capacidad para regular la proliferación celular. Por ejemplo, una forma de PDGF, el oncogén sis, es un factor de crecimiento secretado. Los oncogenes surgen en raras ocasiones de genes que codifican para factores del crecimiento, y en la actualidad, sis es el único factor del crecimiento oncogénico conocido que se produce de manera natural. Se contempla que se utilice un ARNm antisentido, o una ribozima, dirigida contra un inductor particular de la proliferación celular (proteína potenciadora del crecimiento) para evitar la expresión del inductor de la proliferación celular.

Las proteínas fins, erbA, erbB y neu son receptores de factores de crecimiento. Las mutaciones de estos receptores dan como resultado la pérdida de la función regulable. Por ejemplo, una mutación puntual que afecta al dominio transmembrana de la proteína receptora neu da como resultado el oncogén neu. El oncogén erbA se deriva del receptor intracelular para la hormona tiroidea. Se cree que el receptor erbA oncogénico modificado compite con el receptor endógeno de la hormona tiroidea, provocando la muerte controlada.

La clase más grande de oncogenes son las proteínas transductoras de señales (por ejemplo, src, abl y ras). La proteína src, es una proteína citoplásmica-tirosina cinasa, y su transformación de protooncogén a oncogén resulta en algunos casos de mutaciones en el residuo 527 de la tirosina. En cambio, la transformación de la proteína GTPasa ras de protooncogén a oncogén, en un ejemplo, resulta de una mutación de valina a glicina en el aminoácido 12 en la secuencia, reduciendo la actividad GTPasa de ras.

Las proteínas jun, fos y myc son proteínas que ejercen directamente sus efectos sobre las funciones nucleares como factores de transcripción. La tabla 1 enumera una variedad de los oncogenes descritos en esta sección y muchos de los no descritos.

2. Inhibidores de la proliferación celular

Los oncogenes supresores de tumores funcionan para inhibir el exceso de proliferación celular (es decir, proteína antiproliferativa). La inactivación de estos genes destruye o reduce su actividad inhibidora, dando como resultado una proliferación no regulada. Por tanto, la versión de tipo natural de estos supresores de tumores inhibe la proliferación, y por consiguiente es antiproliferativa. Los supresores de tumores p53, p16 y C-CAM se describen a continua-
ción.

Se han encontrado niveles elevados de p53 mutante en muchas células transformadas mediante carcinogénesis química, radiación ultravioleta, y varios virus. El gen p53 es una diana frecuente de la inactivación mutacional en una amplia variedad de tumores humanos y ya se ha documentado que es el gen más frecuentemente mutado en los cánceres humanos comunes. Está mutado en más del 50% de NSCLC humano (Hollstein et al., 1991) y en un amplio espectro de otros tumores.

El gen p53 codifica para una fosfoproteína de 393 aminoácidos que puede formar complejos con proteínas huéspedes tales como T grande y E1B. La proteína se encuentra en células y tejidos normales, pero en concentraciones que son mínimas comparadas con células transformadas o tejidos tumorales.

Se reconoce el p53 de tipo natural como un regulador del crecimiento importante en muchos tipos de células. Sin embargo, al contrario que otros oncogenes, se sabe que se producen mutaciones puntuales en al menos 30 codones distintos, creando a menudo alelos dominantes que producen desviaciones en el fenotipo de la célula sin una reducción hasta la homocigosidad. Adicionalmente, muchos de estos alelos negativos dominantes parecen tolerarse en el organismo y pasar en la línea germinal. Diversos alelos mutantes parecen oscilar desde mínimamente disfuncionales hasta alelos negativos dominantes, fuertemente penetrantes, (Weinberg, 1991).

Otro inhibidor de la proliferación celular es p16. Las transiciones principales del ciclo de la célula eucariótica se activan por cinasas dependientes de ciclina, o CDK. Una CDK, la cinasa dependiente de ciclina 4 (CDK4), regula el avance a través de la fase G_{1}. La actividad de esta enzima puede ser fosforilar Rb al final de G_{1}. La actividad de CDK4 se controla por una subunidad activadora, ciclina de tipo D, y por una subunidad inhibidora, la p16^{INK4}. Se ha caracterizado bioquímicamente p16^{INK4} como una proteína que se une específicamente a, e inhibe, CDK4, y por tanto puede regular la fosforilación de Rb (Serrano et al., 1993; Serrano et al., 1995). Dado que la proteína p16^{INK4} es un inhibidor de CDK4 (Serrano, 1993), la deleción de este gen puede aumentar la actividad de CDK4, dando como resultado la hiperfosforilación de la proteína Rb. También se sabe que p16 regula la función de
CDK6.

p16^{INK4} pertenece a una clase recién descrita de proteínas inhibidoras de CDK que también incluye p16^{B}, p21^{WAF1}, p57^{KIP2} y p27^{KIP1}. El gen p16^{INK4} se mapea en 9p21, una región de cromosoma frecuentemente eliminada en muchos tipos de tumores. Las mutaciones y deleciones homocigóticas del gen p16^{INK4} son frecuentes en líneas celulares de tumores humanos. Esta evidencia sugiere que el gen p16^{INK4} es un gen supresor de tumores. Sin embargo, esta interpretación se ha puesto en duda por la observación de que la frecuencia de las alteraciones del gen p16^{INK4} es muy inferior en tumores sin cultivar primarios que en líneas celulares cultivadas (Caldas et al., 1994; Cheng et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994; Kamb et al., 1994; Mori et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Nobori et al., 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al., 1995). La restauración de la función del p16^{INK4} de tipo natural mediante transfección con un vector de expresión de plásmidos redujo la formación de colonias por algunas líneas celulares de cánceres humanos (Okamoto,1994; Arap, 1995).

C-CAM se expresa en casi todas las células epiteliales (Odin y Obrink, 1987). C-CAM, con un peso molecular aparente de 105 kDa, se aisló originariamente de la membrana plasmática del hepatocito de ratas mediante su reacción con anticuerpos específicos que neutralizan la agregación celular (Obrink, 1991). Estudios recientes indican que, estructuralmente, C-CAM pertenece a la superfamilia de la inmunoglobulina (Ig) y su secuencia es sumamente homóloga al antígeno carcinoembrionario (ACE) (Lin y Guidotti, 1989). Utilizando un sistema de expresión de baculovirus, Cheung et al. (1993) demostraron que el primer dominio de Ig de C-CAM es crítico para la actividad adhesiva
celular.

Se sabe que las moléculas de adhesión celular, o CAM, están implicadas en una compleja red de interacciones moleculares que regulan el desarrollo de los órganos y la diferenciación celular (Edelman, 1985). Datos recientes indican que la expresión aberrante de las CAM puede estar implicada en la tumorigensis de varios neoplasmas; por ejemplo, la expresión disminuida de E-cadherina, que se expresa predominantemente en las células epiteliales, está asociada con la progresión de varias clases de neoplasmas (Edelman y Crossin, 1991; Frixen et al., 1991; Bussemakers et al., 1992; Matsura et al., 1992; Umbas et al., 1992). Además, Giancotti y Ruoslahti (1990) demostraron que aumentar la expresión de la integrina \alpha_{5}\beta_{1} mediante transferencia génica puede reducir la tumorigenicidad de las células de ovario de hámster chino in vivo. Ahora se ha mostrado que C-CAM suprime el crecimiento tumoral in vitro e
in vivo.

Otros supresores de tumores que pueden emplearse según la presente invención incluyen p14, p15, p19, GAX, p56^{RB}, INK4c, RB, APC, FHIT, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, VHL, MMAC1, mda-7, DBCCR-1,FCC y MCC (véase la tabla 1).

3. Reguladores de la muerte celular programada

La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso que se produce de manera esencial para el desarrollo embrionario normal, mantener la homeostasis en tejidos adultos, y suprimir la carcinogenesis (Kerr et al., 1972). Se ha demostrado que la familia de proteínas Bcl-2 y proteasas similares ICE son reguladores importantes y efectores de la apoptosis en otros sistemas. La proteína Bcl-2, descubierta junto con el linfoma folicular, desempeña un papel predominante en el control de la apoptosis y la mejora de la supervivencia celular en respuesta a diversos estímulos apoptóticos (Bakhshi et al., 1985; Cleary y Sklar, 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto y Croce, 1986). Ahora se reconoce que la proteína Bcl-2 conservada con la evolución es un miembro de una familia de proteínas relacionadas que pueden categorizarse como agonistas de la muerte celular o antagonistas de la muerte
celular.

Posteriormente a este descubrimiento, se ha mostrado que Bcl-2 actúa para suprimir la muerte celular activada por una variedad de estímulos. Además, ahora resulta claro que hay una familia de proteínas reguladoras de la muerte celular Bcl-2 que comparten en común homologías de secuencia y estructurales. Se ha mostrado que estos diferentes miembros de la familia tienen o bien funciones similares a Bcl-2 (por ejemplo, Bcl_{XL}, Bcl_{W}, Mcl-1, Al, Bfl-1) o bien contrarrestan la función de Bcl-2 y provocan la muerte celular (por ejemplo, Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri, Bcl_{Xs}). Las proteínas que provocan la muerte celular son proteínas antiproliferativas; por el contrario, las células que suprimen la apoptosis son proteínas que potencian el crecimiento.

TABLA 1 Oncogenes

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4. Enfermedades hiperproliferativas distintas del cáncer

Se prevé que puedan tratarse enfermedades hiperproliferativas distintas del cáncer administrando un constructo de expresión de ácidos nucleicos terapéutico que puede provocar una respuesta antihiperproliferativa. Algunas de las enfermedades hiperproliferativas contempladas para su tratamiento en la presente invención son psoriasis, artritis reumatoide (AR), enfermedad inflamatoria del intestino (EII), osteoartritis (OA), adenoma, fibroma, hemangioma, lipoma y lesiones preneoplásicas en el pulmón.

B. Transformación mediada por liposomas

Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una bicapa lipídica y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas lipídicas separadas por un medio acuoso. Se forman de manera espontánea cuando se suspenden los lípidos en un exceso de disolución acuosa. Los componentes lipídicos experimentan una autoreestructuración antes de la formación de estructuras que atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh y Bachhawat, 1991). Las moléculas lipófilas o las moléculas con regiones lipófilas también pueden disolverse en o asociarse con la capa lipídica.

1. Preparación de liposomas

La presente invención se refiere a liposomas de una composición específica que forman una estructura estable y son excipientes eficaces de principios biológicamente activos. Los liposomas pueden llevar ácidos nucleicos biológicamente activos, de tal modo que los ácidos nucleicos están completamente secuestrados. El liposoma puede contener uno o más ácidos nucleicos y se administra a un huésped mamífero para administrar de manera eficaz su contenido a una célula diana. Los liposomas en la presente invención comprenden DOTAP y colesterol o un derivado del colesterol. En ciertas realizaciones, la razón de DOTAP con respecto a colesterol, derivado de colesterol o mezcla de colesterol es de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10, de aproximadamente 9:1 a aproximadamente 1:9, de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 1:8, de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 1:7, de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 1:6, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:5, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:4, de aproximadamente 3:1 a 1:3, más preferiblemente de 2:1 a 1:2, y lo más preferiblemente de 1:1. En realizaciones preferidas adicionales, las concentraciones de DOTAP y/o de colesterol son de aproximadamente 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 25 mM, o 30 mM. Las concentraciones de DOTAP y/o de colesterol pueden estar entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 20 mM, 1 mM y aproximadamente 18 mM, 1 mM y aproximadamente 16 mM, aproximadamente 1 mM y aproximadamente 14 mM, aproximadamente 1 mM y aproximadamente 12 mM, aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM, 1 y 8 mM, más preferiblemente 2 y 7 mM, todavía más preferiblemente 3 y 6 mM y lo más preferiblemente 4 y 5 mM. Los derivados de colesterol pueden sustituirse fácilmente para el colesterol o mezclarse con el colesterol en la presente invención. Muchos derivados de colesterol se conocen por el experto. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a acetato de colesterol y oleato de colesterol. Una mezcla de colesterol se refiere a una composición que contiene al menos un colesterol o un derivado de colesterol.

La formulación también se extruye utilizando una membrana o filtro, y esto puede llevarse a cabo múltiples veces. Las técnicas de este tipo son muy conocidas por aquellos expertos en la materia, por ejemplo en Martin (1990). La extrusión puede llevarse a cabo para homogeneizar la formulación o limitar su tamaño.

Las formulaciones de la presente invención son extremadamente estables y pueden complejar ácidos nucleicos a lo largo de un amplio intervalo de razones de ácido nucleico:liposoma. Este "intervalo" permite la optimización de los complejos para la administración in vivo. La estabilidad de los liposomas de DOTAP:colesterol a altas concentraciones de liposomas y ADN permite además un aumento de las concentraciones de ADN para la administración y expresión.

Un método contemplado para preparar liposomas en ciertas realizaciones es calentar, sonicar y extruir secuencialmente los lípidos a través de filtros de tamaño de poro decreciente, dando como resultado de este modo la formación de estructuras de liposomas estables pequeñas. Esta preparación produce complejos de liposomas o liposomas sólo de un tamaño uniforme y apropiado, que son estructuralmente estables y producen una actividad máxima.

Por ejemplo, en ciertas realizaciones de la presente invención se contempla que los liposomas de DOTAP:colesterol se preparan mediante los métodos de Templeton et al. (1997). Por tanto, en una realización, se mezcla DOTAP (lípido catiónico) con colesterol (lípido neutro) a concentraciones equimolares. Esta mezcla de lípidos pulverizados se disuelve entonces con cloroformo, se seca la disolución para dar una película fina y se hidrata la película en agua que contiene el 5% de dextrosa (p/v) para dar una concentración final de 20 mM de DOTAP y 20 mM de colesterol. La película lipídica hidratada se hace rotar en un baño de agua a 50°C durante 45 minutos, después a 35°C durante 10 minutos adicionales y se deja a temperatura ambiente durante la noche. Al día siguiente se sonica la mezcla durante 5 minutos a 50°C. Se transfiere la mezcla sonicada a un tubo y se calienta durante 10 minutos a 50°C. Se extruye secuen-
cialmente esta mezcla mediante filtros de jeringa de tamaño de poro decreciente (1 \mum, 0,45 \mum, 0,2 \mum, 0,1 \mum).

También se contempla que puedan combinarse otras formulaciones de liposomas y métodos de preparación para conferir las características de liposoma de DOTAP:colesterol deseadas. Se describen métodos alternativos para preparar formulaciones a base de lípidos para la administración de ácidos nucleicos por Saravolac et al. (W0 99/18933). Se detallan métodos en los que las composiciones de lípidos se formulan específicamente para encapsular ácidos nucleicos. En otra formulación de liposomas, un vehículo anfipático denominado microvehículo de dilución de disolvente (SDMC, solvent dilution microcarrier) permite la integración de moléculas particulares en la bicapa del vehículo lipídico (patente de los EE.UU. número 5.879.703). Los SDMC pueden utilizarse para administrar lipopolisacáridos, polipéptidos, ácidos nucleicos y similares. Naturalmente, puede utilizarse cualquier otro método de preparación de liposomas por el experto para obtener una formulación de liposomas deseada en la presente invención.

2. Administración de ácidos nucleicos mediada por liposomas

En ciertas realizaciones, se administran in vivo genes antihiperproliferativos por medio de liposomas para tratar enfermedades hiperproliferativas. La administración de ácidos nucleicos mediada por liposomas y la expresión de ADN foráneo in vitro ha sido exitosa (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). Wong et al. (1980) demostró la viabilidad de la administración mediada por liposomas y la expresión de ADN foráneo en células de hepatoma, HeLa y embriones de pollo cultivadas.

En un ejemplo de la presente invención, se prepara el complejo de liposomas (complejo de ADN:lípido o lipoplejo de ADN) diluyendo un ácido nucleico dado y lípidos en el 5% de dextrosa en agua para obtener una concentración apropiada de ácido nucleico y lípidos. Se mezclan volúmenes iguales de ácido nucleico y lípidos, a una concentración para obtener aproximadamente 25 \mug, 50 \mug, 75 \mug, 100 \mug,110 \mug, 120 \mug, 125 \mug, 130 \mug, 140 \mug, 150 \mug, 160 \mug, 170 \mug, 180 \mug, 190 \mug, 200 \mug, 210 \mug, 220 \mug, 225 \mug, 230 \mug, 240 \mug, 250 \mug, 260 \mug, 270 \mug, 275 \mug, 280 \mug, 290 \mug, 300 \mug, 310 \mug, 320 \mug, 325 \mug, 330 \mug, 340 \mug, 350 \mug, 360 \mug, 370 \mug, 375 \mug, 400 \mug, 425 \mug, 450 \mug, 500 \mug, 550 \mug, 600 \mug, 650 \mug, 700 \mug, 750 \mug, 800 \mug, 850 \mug, 900 \mug, 950 \mug, o 1000 \mug de ácido nucleico por 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM,10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 22 mM, 24 mM, 26 mM, 28mM, 30 mM, 32 mM, 34 mM, 36 mM, 38 mM, o 40 mM de lípidos por 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 7000, 8000, 9000, o 10.000 \mul, así como 15, 20, 25, o 50 ml añadiendo el ácido nucleico rápidamente a la superficie de la disolución lipídica seguido de dos expulsiones rápidas hacia arriba y hacia abajo para efectuar un mezclado rápido.

Pueden añadirse varios ácidos nucleicos a estos liposomas en un amplio intervalo de concentraciones. Se añaden los ácidos nucleicos a los liposomas preferiblemente a una concentración de 20, 25, 50, 75, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 275, 300, 350, 375, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, o 1000 \mug por 50, 100,150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 7000, 8000, 9000, o 10.000 \mul, así como 15, 20, 25, 50 ml de volumen final. Estas concentraciones varían ampliamente dependiendo de la razón de DOTAP con respecto a colesterol, derivado de colesterol o mezcla de colesterol en la preparación de liposoma particular. La cantidad de dosis real de liposoma-ácido nucleico administrada a una paciente puede determinarse mediante factores físicos y fisiológicos tales como la masa corporal, gravedad del estado, idiopatía del paciente y la vía de administración. Teniendo en cuenta estas consideraciones, puede determinarse fácilmente la dosis de complejo de liposoma-ácido nucleico para un sujeto particular y/o curso del tratamiento.

Tal como se describió en otras secciones, los liposomas de la presente invención que contienen ácido nucleico pueden administrarse por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía intraarterial, por vía intraperitoneal, por vía intralesional, por vía intracraneal, por vía intraarticular, por vía intraprostática, por vía intrapreural, por vía intratraqueal, por vía intranasal, por vía intravitreal, por vía intravaginal, por vía rectal, por vía tópica, por vía intratumoral, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía subcutánea, por vía intravesicular, por vía mucosa, por vía intrapericardial, por vía oral y/o utilizando aerosol, inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada bañando las células diana directamente o por medio de un catéter y/o lavado.

3. Restos de selección como diana para la administración de liposomas

La presente invención proporciona también un medio de selección como diana, de modo que pueden administrarse los liposomas a tipos celulares específicos. Debido a que el ácido nucleico está secuestrado en la cavidad del liposoma, se consigue una administración objetivo mediante la adición de ligandos sin comprometer la capacidad de estos liposomas para unir y administrar grandes cantidades del ácido nucleico. Se contempla que esto permitirá la administración en tejidos y órganos específicos. La especificidad de selección como diana de los sistemas de administración a base de ligandos se basa en la distribución de los receptores de ligandos en diferentes tipos celulares. El ligando de selección como diana puede estar asociado o bien covalentemente o bien no covalentemente con el complejo lipídico.

Ligandos de selección como diana son cualquier ligando específico para un componente característico de la región seleccionada como diana. Los ligandos de selección como diana preferidos incluyen proteínas tales como anticuerpos policlonales o monoclonales, fragmentos de anticuerpos, o anticuerpos quiméricos, enzimas u hormonas, o azúcares tales como mono, oligo y polisacáridos. En ciertas realizaciones de la invención, los ligandos de selección como diana contemplados interactúan con integrinas, proteoglucanos, glucoproteínas, receptores o transportadores. Los ligandos adecuados incluyen cualquiera que sea específico para células del órgano diana, o para estructuras del órgano diana expuestas a la circulación como resultado de una patología local, tal como tumores.

En ciertas realizaciones de la presente invención, con el fin de aumentar la transducción de células resistentes, para aumentar la transducción de células diana, o para limitar la transducción de células no deseadas, se asocian restos (ligandos) de selección de anticuerpo o péptidos cíclicos como diana con el complejo lipídico. El resto de selección de anticuerpo como diana en ejemplos particulares es un anticuerpo anti-receptor de EGF monoclonal. El EGF estimula el crecimiento y la proliferación celular mediante la interacción con un receptor de EGF. Los receptores de EGF se distribuyen sobre la superficie celular de varios órganos y están presentes en las nalgas, heridas, dermis y tumores. En realizaciones particulares, el resto que selecciona péptidos como diana es un péptido cíclico que contiene en su secuencia un motivo de unión a integrina RGD. Los ligandos tales como el péptido RGD que se unen a las integrinas sobre la superficie celular pueden mediar en la internalización, aumentando así la eficacia de la administración del complejo seleccionado como diana. El péptido de selección como diana puede incluir una secuencia RGDFV, en la que el péptido incluye la secuencia RGD en la que el péptido tiene una longitud de desde 3 hasta 30 aminoácidos. En otras realizaciones el motivo de unión a la integrina RGD tiene una longitud de desde 3 hasta 20 aminoácidos o una longitud de 4 a 10 aminoácidos. En realizaciones particulares de la presente invención, el motivo de unión a integrina RGD es un péptido que tiene una longitud de 5 aminoácidos. Aunque se prefieren péptidos cíclicos que contienen el motivo de unión a integrina RGD en su secuencia, también pueden utilizarse péptidos lineales en la presente invención. Los ligandos pueden identificarse cribando (panning) bibliotecas de exposición en fago frente a las células y/o tejidos de interés.

También se contempla en la presente invención un resto de selección como diana que comprende un ligando peptídico que se une al receptor de EGF (por ejemplo, EGF o un fragmento de EGF).

Se han descrito más los liposomas que seleccionan específicamente células del sistema nervioso central de mamíferos como (patente de los EE.UU. número 5.786.214). Los liposomas están compuestos esencialmente por N-glutarilfosfatidiletanolamina, colesterol y ácido oleico, en los que se conjuga un anticuerpo monoclonal específico para la neuroglía con los liposomas.

La presente invención contempla además que el liposoma pueda complejarse con un virus hemaglutinante (HVJ). Se ha demostrado que esto facilita la fusión con la membrana celular y promueve la entrada en la célula del ADN encapsulado en liposomas (Kaneda et al., 1989). En otras realizaciones, el liposoma puede complejarse o emplearse junto con proteínas cromosómicas no histonas nucleares (HMG-1) (Kato et al., 1991). Todavía en otras realizaciones, puede complejarse o emplearse el liposoma junto con ambos HVJ y HMG-1.

Los anticuerpos descritos por Nicholson et al. (patente de los EE.UU. número 5.902.584), que se unen al dominio extracelular G-CSF pueden utilizarse en la presente invención para la selección de liposomas como diana. Alternativamente, pueden utilizarse fragmentos de anticuerpos monoclonales para administrar como diana a órganos específicos en el animal incluyendo el cerebro, corazón, pulmones o hígado. Se describe a modo de ejemplo un método para seleccionar como diana partículas virales para células que carecen de un marcador específico a una única célula (patente de los EE.UU. número 5.849.718). Por ejemplo, el anticuerpo A puede tener especificidad para el tumor, pero también para el tejido pulmonar y cardiaco normal, mientras que el anticuerpo B tiene especificad para el tumor pero también para células hepáticas normales. Claramente, el uso del anticuerpo A o anticuerpo B solo para administrar un ácido nucleico antiproliferativo al tumor daría como resultado posiblemente un daño indeseado en las células pulmonares y cardiacas o hepáticas. Sin embargo, el anticuerpo A y anticuerpo B puede utilizarse juntos para una selección de células como diana mejorada. Por tanto, el anticuerpo A se acopla a un gen que codifica para un ácido nucleico antiproliferativo y se administra, por medio de un sistema de captación mediado por un receptor, a un tumor así como al tejido cardiaco y pulmonar. Sin embargo, el gen no se transcribe en estas células ya que carecen de un factor de transcripción necesario. El anticuerpo B se acopla a un gen universalmente activo que codifica para el factor de transcripción necesario para la transcripción del ácido nucleico antiproliferativo y se administra a las células tumorales y hepáticas. Por tanto, en las células cardiacas y pulmonares sólo se administra el ácido nucleico antiproliferativo inactivo, en las que no se transcribe, no conduciendo a efectos adversos. En las células hepáticas, el gen que codifica para el factor de transcripción se administra y se transcribe, pero no tiene ningún efecto porque no está presente ningún gen de ácido nucleico antiproliferativo. Sin embargo, en las células tumorales se administran ambos genes y puede activarse el factor de transcripción del ácido nucleico antiproliferativo, conduciendo a efectos tóxicos específicos al tumor.

Pueden emplearse muchos otros ligandos para esta etapa de selección como diana de la preparación de liposomas, dependiendo del sitio seleccionado como diana para la administración de liposomas. En ciertas realizaciones, se contempla que los liposomas seleccionan como diana tipos celulares específicos mediante endocitosis mediada por un receptor. Por ejemplo, la lactosil ceramida, y los péptidos que seleccionan como diana las proteínas relacionadas con el receptor LDL, tales como la apoliproteína E3 ("Apo E") han resultado satisfactorios para dirigir liposomas al hígado (Spanjer y Scherphof, 1983; WO 98/0748). La asialoglucoproteína, asialofetuina, que contiene residuos galactosilo terminales, también ha demostrado que dirige liposomas al hígado (Spanjer y Scherphof, 1983; Hara et al., 1996). Los azúcares manosilo, fucosilo o N-acetil glucosamina, cuando se acoplan a la estructura principal de un polipéptido, se unen al receptor de manosa de alta afinidad (patente de los EE.UU. número 5.432.260, incorporada específicamente en el presente documento como referencia en su totalidad). Por tanto, estas glucoproteínas pueden conjugarse con los liposomas de la presente invención y se contemplan como útiles para seleccionar células específicas como diana (por ejemplo, macrófagos).

El folato y el receptor de folato también se han descrito como útiles para la selección celular como diana (patente de los EE.UU. número 5.871.727). En este ejemplo, la vitamina folato se acopla al complejo. El receptor de folato tiene una alta afinidad para su ligando y se expresa en exceso sobre la superficie de varias líneas celulares malignas, incluyendo los tumores de pulmón, de mama y de cerebro. También pueden utilizarse antifolatos tales como el metotrexato como ligandos para la selección como diana. Los sistemas de administración mediados por transferrina seleccionan como diana un amplio intervalo de células de replicación que expresan el receptor de la transferrina (Gilliland et al., 1980).

La adición de ligandos para la selección como diana para la administración de genes para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas permite la administración de genes cuyos productos génicos son más tóxicos que los sistemas no seleccionados como diana. Ejemplo de genes más tóxicos que pueden administrarse incluyen genes proapoptóticos tales como genes Bax y Bak más derivados de virus y otros patógenos tales como el E4orf4 adenoviral y la fosforilasa de nucleósido purina de E.coli, un denominado "gen suicida" que convierte el profármaco 6-metilpurina desoxirribósido en la purina tóxica 6-metilpurina. Otros ejemplos de genes suicidas utilizados con la terapia con profármacos son el gen de la citosina desaminasa de E. coli y el gen de la timidina cinasa de VHS.

También es posible utilizar complejos lipídicos seleccionados como diana o no seleccionados como diana para generar virus modificados o recombinantes in vivo. Por ejemplo, pueden utilizarse dos o más plásmidos para introducir secuencias retrovirales más un gen terapéutico en una célula hiperproliferativa. Las proteínas retrovirales proporcionadas en trans de uno de los plásmidos permitirían el empaquetamiento del segundo plásmido que lleva genes terapéuticos. Por tanto, las células transducidas, se convertirían en un sitio para la producción de retrovirus no replicantes que llevan el gen terapéutico. Estos retrovirus podrían entonces infectar células cercanas. El promotor para el gen terapéutico puede o no ser inducible o específico para el tejido.

De manera similar, el ácido nucleico transferido puede representar el ADN para un genoma viral que replica condicionalmente o de replicación competente, tal como un genoma adenoviral que carece de toda o parte de la región adenoviral E1a o E2b o que tiene uno o más promotores específicos para el tejido o inducibles que ejecutan la transcripción desde las regiones E1a y/o E1b. Esta ácido nucleico replicante o replicante condicional puede contener o no un gen terapéutico adicional tal como un gen supresor de tumores o antioncogen.

5. Conjugación liposoma-ligando

Los liposomas de la invención pueden dirigirse a regiones específicas del organismo mediante la unión de ligandos de selección como diana específicos para proporcionar una rápida acumulación y concentración de liposomas y, en consecuencia, de moléculas de ácido nucleico, en un tejido designado. Los ligando contemplados para su uso en la presente invención pueden conjugarse a los liposomas mediante una variedad de métodos.

Se han utilizado mucho los reactivos de reticulación bifuncionales para una variedad de fines incluyendo la preparación de matrices de afinidad, la modificación y estabilización de diversas estructuras, la identificación de sitios de unión a ligando y receptor, y estudios estructurales. Los reactivos homobifuncionales que llevan dos grupos funcionales idénticos demostraron ser altamente eficaces para inducir la reticulación entre subunidades de macromoléculas o macromoléculas idénticas y diferentes, y unir ligandos polipeptídicos a sus sitios de unión específicos. Los reactivos heterobifuncionales contienen dos grupos funcionales diferentes. Aprovechando las reactividades diferenciales de los dos grupos funcionales diferentes, puede controlarse la reticulación tanto selectiva como secuencialmente. Los reactivos de reticulación bifuncionales pueden dividirse según la especificidad de sus grupos funcionales, por ejemplo, grupos amino, sulfhidrilo, guanidino, indol, carboxilo específicos. De éstos, los reactivos dirigidos a los grupos amino libres se han convertido en especialmente populares debido a su disponibilidad comercial, facilidad de síntesis y las suaves condiciones de reacción en las que pueden aplicarse. Una mayoría de los reactivos de reticulación heterobifuncionales contienen un grupo amino-reactivo primario y un grupo tiol-reactivo.

Métodos a modo de ejemplo para ligandos de reticulación a liposomas se describen en la patente de los EE.UU. número 5.603.872 y la patente de los EE.UU. número 5.401.511. Varios ligandos pueden estar unidos covalentemente a las superficies liposómicas mediante la reticulación de los residuos de amina. Los liposomas, en particular, las vesículas multilamelares (MLV) o vesículas unilamelares tales como los liposomas microemulsionados (MEL) y los liposomas unilamelares grandes (LUVET), que contienen cada uno fosfatidiletanolamina (PE), se han preparado mediante procedimientos establecidos. La inclusión de PE en el liposoma proporciona un residuo funcional activo, una amina primaria, sobre la superficie liposómica para fines de reticulación. Los ligandos tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) se han unido satisfactoriamente a liposomas PE. Los ligandos se unen covalentemente a sitios diferenciados en las superficies liposómicas. El número y la densidad superficial de estos sitios vendrán dictados por la formulación liposómica y el tipo de liposoma. Las superficies liposómicas también pueden tener sitios para una asociación no covalente. Para formar conjugados covalentes de ligandos y liposomas, los reactivos de reticulación pueden estudiarse para determinar su eficacia y biocompatibilidad. Los reactivos de reticulación incluyen glutaraldehido (GAD), oxirano bifuncional (OXR), etilenglicol diglicidil éter (EGDE), y una carbodiimida soluble en agua, preferiblemente 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC). Mediante la química compleja de reticulación, se establece la unión de los residuos de teamina de la sustancia de reconocimiento y los liposomas.

En otro ejemplo, se describen los reactivos de reticulación heterobifuncionales y los métodos para utilizar los reactivos de reticulación (patente de los EE.UU. número 5.889.155). Los reactivos de reticulación combinan un residuo de hidrazida nucleófilo con un residuo de maleimida electrófilo, permitiendo el acoplamiento, en un ejemplo, de aldehídos a tioles libres. El reactivo de reticulación puede modificarse para reticular varios grupos funcionales y es por tanto útil para reticular polipéptidos y azúcares. La tabla detalla ciertos reticulantes heterobifuncionales considerados útiles en la presente invención.

TABLA 2

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En casos en los que un polipéptido particular no contiene un residuo responsable para un reactivo de reticulación dado en su secuencia nativa, pueden utilizarse cambios genéticos de conservación o de aminoácidos sintéticos en la secuencia primaria.

El ligando de selección como diana puede o bien anclarse en la parte hidrófoba del complejo o bien unirse a los grupos reactivos terminales de la parte hidrófila del complejo. El ligando de selección como diana puede unirse al liposoma por medio de una unión a un grupo reactivo, por ejemplo, en el extremo distal del polímero hidrófilo. Grupos reactivos preferidos incluyen grupos amino, grupos carboxílicos, grupos hidrazida y grupos tiol. El acoplamiento del ligando de selección como diana al polímero hidrófilo puede llevarse a cabo mediante métodos habituales de química orgánica que son conocidos por los expertos en la técnica. La concentración total del ligando de selección como diana puede ser de desde el 0,01 hasta el 10% en moles.

6. Vectores y señales de regulación

Los vectores de la presente invención se diseñan, principalmente, para transformar células hiperproliferativas con un gen terapéutico bajo el control de promotores eucariotas regulados (es decir, inducible, reprimible, específico para el tejido) o para transformar las células cercanas, tales como la vasculatura tumoral. También, los vectores contendrán normalmente un marcador seleccionable si, por ninguna otra razón, para facilitar su producción in vitro. Sin embargo, los marcadores seleccionables pueden desempeñar un papel importante para producir células recombinantes y por tanto una discusión de los promotores es útil en el presente documento. La tabla 3 y la tabla 4 a continuación, enumeran elementos potenciadores y elementos promotores inducibles, respectivamente.

7. Potenciadores y promotores virales y eucariotas

Para su uso en la presente invención se prefiere el promotor de citomegalovirus (CMV). Este promotor está disponible comercialmente de Invitrogen en los vectores pcDNAIII y pVAX1, que se prefieren para su uso en la presente invención. También se contemplan como útiles en la presente invención los promotores de dectina-1 y dectina-2. A continuación hay una lista de promotores virales adicionales, potenciadores/promotores celulares y potenciadores/promotores inducibles que podrían utilizarse en combinación con la presente invención. Adicionalmente también podría utilizarse cualquier combinación de potenciador/promotor (según la Eukaryotic Promoter Data Base EPDB (Base de datos de promotores eucariotas)) para ejecutar la expresión de genes estructurales que codifican para enzimas de tratamiento de oligosacáridos, proteínas accesorias de plegamiento de proteínas, proteínas marcadoras seleccionables o una proteína heteróloga de interés.

Otra señal que puede resultar ser útil es una señal de poliadenilación (por ejemplo, hGH, BGH, SV40).

Los elementos de los sitios de unión a ribosomas internos (internal ribosome binding sites (IRES)) se utilizan para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los elementos IRES pueden evitar el modelo de barrido de ribosomas de traducción cap-dependiente 5'-metilada y empezar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Se han descrito los elementos IRES de dos miembros de la familia picomavirus (polio y encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonenberg, 1988), así como un IRES de un mensaje de mamíferos (Macejak y Samow, 1991). Los elementos IRES pueden unirse a marcos de lectura abiertos heterólogos. Los marcos de lectura abiertos múltiples pueden transcribirse juntos, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierto es accesible para los ribosomas para la traducción eficaz. Pueden expresarse múltiples genes de manera eficaz utilizando un único promotor/potenciador para transcribir un único simple.

TABLA 3 Elementos inducibles

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TABLA 4 Otros elementos promotores/potenciadores

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Los promotores y potenciadores que controlan la transcripción de genes que codifican para proteínas en células eucariotas incluyen múltiples elementos genéticos. La maquinaria celular puede reunir e integrar la información de regulación transportada por cada elemento, permitiendo a los diferentes genes desarrollar patrones de regulación transcripcional distintos, a menudo complejos.

El término promotor se utilizará en el presente documento para referirse a un grupo de módulos de control transcripcional que se agrupan alrededor del sitio de inicio para la ARN polimerasa II. Muchas de las ideas sobre cómo se organizan los promotores derivan de análisis de diversos promotores virales, incluyendo los de la timidina cinasa (tk) del VHS y las unidades de transcripción temprana de SV40. Estos estudios, aumentados por trabajos más recientes, han mostrado que los promotores están compuestos por módulos funcionales diferenciados, consistiendo cada uno en aproximadamente 7-20 pb de ADN, y conteniendo uno o más sitios de reconocimiento para proteínas activadoras transcripcionales.

Al menos un módulo de cada promotor funciona para posicionar el sitio de inicio para la síntesis de ARN. El mejor ejemplo conocido es la caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de una caja TATA, tales como el promotor para el gen de la desoxinucleotidil transferasa terminal de mamíferos y el promotor para los genes tardíos de SV 40, un elemento diferenciado que recubre el propio sitio ayuda a fijar el lugar de inicio.

Los elementos de promotor adicionales regulan la frecuencia del inicio transcripcional. Normalmente, se localizan en la región de 30-110 pb en sentido 5' del sitio de inicio, aunque recientemente se ha mostrado que varios promotores contienen igualmente elementos funcionales en sentido 3' del sitio de inicio. La separación entre los elementos es flexible, de modo que se conserva la función del promotor cuando se invierten los elementos o se mueven unos con respecto a otros. En el promotor tk, la separación entre los elementos puede aumentarse hasta 50 pb de separación antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar o bien cooperando o bien independientemente para activar la transcripción.

Los potenciadores se detectaron originalmente como elementos genéticos que aumentaban la transcripción de un promotor ubicado en una posición separada en la misma molécula de ADN. Esta capacidad para actuar sobre una gran distancia tenía pocos precedentes en los estudios clásicos de la regulación transcripcional procariota. Trabajos posteriores han mostrado que las regiones de ADN con actividad potenciadora se organizan de manera muy parecida a los promotores. Es decir, están compuestas por muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se une a una o más proteínas transcripcionales.

La distinción básica entre potenciadores y promotores es operacional. Una región de potenciador en su totalidad debe poder estimular la transcripción a distancia; esta necesidad no necesita ser verdad para una región de promotor o sus elementos componentes. Por otra parte, un promotor debe tener uno o más elementos que dirigen el inicio de la síntesis de ARN en un sitio particular y con una orientación particular, mientras que los potenciadores carecen de estas especificidades. A parte de esta distinción operacional, los potenciadores y promotores son entidades muy similares.

Los promotores y potenciadores tienen la misma función general de activar la transcripción en la célula. A menudo se superponen y son contiguos, pareciendo a menudo que tienen una organización modular muy similar. Tomadas juntas, estas consideraciones sugieren que los potenciadores y promotores son entidades homólogas y que las proteínas activadoras transcripcionales unidas a estas secuencias pueden interaccionar con la maquinaria de transcripción celular fundamentalmente de la misma manera.

En cualquier caso, se entenderá que los promotores son elementos de ADN que cuando se colocan de manera funcional en sentido 5' de un gen conducen a la expresión de ese gen. La mayoría de los constructos transgénicos de la presente invención se colocan funcionalmente en sentido 3' de un elemento de promotor.

Los ácidos nucleicos de esta invención también pueden contener uno o más intrones. Se ha encontrado que la inclusión de un intrón en muchos casos conduce a un aumento de los niveles de expresión transgénica. También pueden incluirse intrones que contienen sitios de unión para factores de transcripción. El ácido nucleico puede incluir una secuencia conductora para potenciar la traducción tal como la secuencia conductora triparental de adenovirus.

Los ácidos nucleicos de esta invención pueden ser lineales, ramificados o circulares. Una realización preferida de la presente invención utiliza plásmidos que llevan un casete de expresión eucariota así como secuencias procariotas que permiten la replicación en sistemas de producción procariotas. Estos plásmidos pueden ser no replicantes en un huésped mamífero, condicionalmente replicantes, o replicantes. Un ejemplo de plásmidos replicantes serían los que contienen un origen de replicación y gen EBNA1 del virus de Epstein Barr. Un ejemplo de un plásmido condicionalmente replicante sería uno en el que el gen EBNA-1 está bajo el control de un promotor específico de la célula, específico del tumor o inducible.

C. Formulaciones farmacéuticas y administración de ácidos nucleicos

Según la presente invención, se contempla una formulación de un lípido farmacéuticamente aceptable para la administración de ácidos nucleicos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas. Las enfermedades hiperproliferativas que han de tratarse con mayor probabilidad en la presente invención son aquéllas que resultan de mutaciones en un oncogén y/o la expresión reducida de una proteína de tipo natural en las células hiperproliferativas. Ejemplos de enfermedades hiperproliferativas contempladas para su tratamiento son el cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de huesos, cáncer testicular, cáncer cervicouterino, cáncer gastrointestinal, linfomas, lesiones preneoplásicas en el pulmón, cabeza y cuello, cuello uterino, intestino, páncreas otros órganos; así como cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de vejiga, y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa que pueda tratarse administrando un ácido nucleico que codifique para una proteína con propiedades antiproliferativas. Ejemplos de otros estados hiperproliferativos incluyen pero no se limitan a adenomas, hipertrofia prostática benigna, neoplasia intraepitelial, endometriosis, y pólipos del colon.

En ciertas realizaciones, la presente invención también se refiere a formulaciones de una o varias composiciones de ácidos nucleicos para la administración a un mamífero. Para el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa en el ser humano, se considera que se usará una formulación farmacéutica de lípidos, que comprende DOTAP y colesterol, un derivado de colesterol o una mezcla de colesterol, y un ácido nucleico bajo el control de un promotor que puede funcionar en células eucariotas (por ejemplo, CMV IE, dectina-1, dectina-2). También se entenderá que, en caso deseado, las composiciones de lípido: ácido nucleico descritas en el presente documento también pueden administrarse en combinación con otros agentes, por ejemplo, diversos agentes farmacéuticamente activos. Mientras que la composición comprenda al menos un ácido nucleico, no existe prácticamente ningún límite para otros componentes que también pueden incluirse, siempre que los agentes adicionales no causen un efecto adverso significativo al organismo durante la administración.

Los expertos en la técnica conocen bien la formulación de disoluciones de excipiente y excipientes farmacéuticamente aceptables, así como el desarrollo de regímenes de tratamiento y dosificación adecuados para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en una diversidad de regímenes de tratamiento, incluyendo por ejemplo la formulación y la administración intradérmica, parenteral, intravenosa, intramuscular, intranasal, intrapericárdica, mucosa, tópica, en aerosol y oral.

D. Composiciones inyectables y administración

Para destruir células, inhibir el crecimiento celular, inhibir metástasis, reducir el tumor o el tamaño de tejido y de otro modo invertir o reducir el fenotipo maligno de las células tumorales, usando los métodos y composiciones de la presente invención, se entrará en contacto generalmente con una célula hiperproliferativa con el constructo de expresión terapéutica. Las vías de administración variarán, naturalmente, con la localización y naturaleza de la lesión, e incluyen, por ejemplo la formulación y la administración intradérmica, transdérmica, parenteral, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutánea, percutánea, intratraqueal, intraperitoneal, intratumoral, de perfusión, lavado, inyección directa, y oral. Las formulaciones de la invención pueden administrarse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más veces. También pueden administrarse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más veces al día, o pueden administrarse cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, ó 7 días, o cada 1, 2, 3, 4,ó 5 semanas, o cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ó 12 meses.

Se contempla específicamente la inyección intratumoral, o inyección en la vasculatura del tumor para tumores diferenciados, separados, accesibles. También puede ser apropiada la administración local, regional o sistémica. Para tumores de > 4 cm, el volumen que debe administrarse será de aproximadamente 4-10 ml (preferiblemente 10 ml), mientras que para tumores de < 4 cm, se utilizará un volumen de aproximadamente 1-3 ml (preferiblemente 3 ml). Las inyecciones múltiples administradas como única dosis comprenden aproximadamente volúmenes de 0,1 a aproximadamente 0,5 ml. Ventajosamente el liposoma: ácido nucleico puede ponerse en contacto mediante la administración de inyecciones múltiples en el tumor, espaciadas en intervalos de aproximadamente 1 cm.

En el caso de una intervención quirúrgica, la presente invención puede utilizarse de manera preoperatoria, para permitir la resección en un sujeto con un tumor inoperable. Alternativamente, puede utilizarse la presente invención en el momento de la cirugía, y/o después de la misma, para tratar una enfermedad residual o metastásica. Por ejemplo, puede inyectarse o perfundirse un lecho tumoral con una formulación de DOTAP: colesterol que comprende un constructo de ácido nucleico que codifica para una proteína antiproliferativa. Puede continuarse la perfusión tras la resección, por ejemplo, dejando un catéter implantado en el lugar de la cirugía. También se prevé un tratamiento postquirúrgico periódico.

En caso apropiado puede aplicarse una administración continua, por ejemplo cuando se extirpa un tumor y se trata el lecho tumoral para eliminar una enfermedad residual, microscópica. Se prefieren la administración a través de jeringuilla o cateterismo. Una perfusión continua de este tipo puede tener lugar durante un periodo de desde aproximadamente 1-2 horas, hasta aproximadamente 2-6 horas, hasta aproximadamente 6-12 horas, hasta aproximadamente 12-24 horas, hasta aproximadamente 1-2 días, hasta aproximadamente 1-2 semanas o más siguiendo el inicio del tratamiento. Generalmente, la dosis de la composición terapéutica a través de la perfusión continua será equivalente a la administrada por una única inyección o múltiples inyecciones, ajustadas por un periodo de tiempo durante el que se produce la perfusión.

También pueden variar los regímenes de tratamiento, y con frecuencia dependen del tipo de tumor, la localización del tumor, la progresión de la enfermedad, y la salud y edad del paciente. Obviamente, ciertos tipos de tumor requerirán un tratamiento más agresivo, aunque al mismo tiempo, ciertos pacientes no podrán tolerar protocolos más agotadores. El médico será el más adecuado para tomar tales decisiones en base a la eficacia y toxicidad (si existe) conocidas de las formulaciones terapéuticas.

En ciertas realizaciones, puede ser que no pueda resecarse el tumor que está tratándose, al menos inicialmente. Los tratamientos con formulaciones terapéuticas de liposomas pueden incrementar la capacidad de resección del tumor debido a la reducción en los márgenes o por la eliminación de ciertas partes particularmente invasivas. Siguiendo con los tratamientos, puede ser posible una resección. Los tratamientos adicionales posteriores a la resección servirán para eliminar una enfermedad residual microscópica en el lugar del tumor.

Un ciclo de tratamiento típico, para un tumor primario o un lecho tumor tras la extirpación, implicará múltiples dosis. El tratamiento típico para un tumor primario implica una aplicación de 6 dosis durante un periodo de tiempo de dos semanas. Puede repetirse el régimen de dos semanas una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más veces. Durante un ciclo de tratamiento, puede volver a evaluarse la necesidad para completar las dosificaciones planificadas.

El método preferido para la administración del constructo de expresión lípido: ácido nucleico en células hiperproliferativas en la presente invención es la inyección por vía intravenosa. Sin embargo, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse alternativamente por vía parenteral, intradérmica, intramuscular, o incluso intraperitoneal tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.543.158; en la patente de los EE.UU. número 5.641.515 y en la patente de los EE.UU. número 5.399.363 (incorporada cada una específicamente en el presente documento como referencia en su totalidad). Puede administrarse la inyección de los constructos de ácidos nucleicos mediante una jeringuilla o cualquier otro método utilizado para la inyección de una disolución, siempre que el constructo de expresión pueda pasar a través del calibre particular de la aguja requerida para la inyección. Recientemente se ha descrito un sistema de inyección novedoso sin aguja (patente de los EE.UU. número 5.846.233) que tiene una cánula que define una cámara de ampolla para contener la disolución y un dispositivo de energía para extraer la disolución de la cánula hacia el lugar de administración. También se ha descrito un sistema de jeringuilla para su uso en terapia génica que permite inyecciones múltiples de cantidades predeterminadas de una disolución precisamente a cualquier profundidad (patente de los EE.UU. número 5.846.225).

Las disoluciones o la suspensión de liposomas, particularmente las formulaciones multivirales, de los compuestos activos en forma de base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua, en disoluciones tamponadas, y mezclarse de manera adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse las dispersiones en glicerol, glicoles de polietileno líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen dispersiones o disoluciones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación improvisada de dispersiones o disoluciones inyectables estériles (patente de los EE.UU. número 5.466.468, incorporada específicamente en el presente documento como referencia en su totalidad). En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una inyectabilidad sencilla. Debe ser estable en las condiciones de producción y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El excipiente puede ser un medio de dispersión o disolvente que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Puede llevarse a cabo la prevención de la acción de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares o cloruro de sodio. Puede llevarse a cabo la absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Para formulaciones multivirales los compuestos de excipiente, el liposoma, se preparan en suspensiones estériles que son adecuadas para administrar al ser
humano.

Para formulaciones virales únicas, pueden usarse suspensiones de los compuestos activos en el excipiente de liposoma con y sin componentes adicionales tal como se describe en la solicitud momentánea.

Para la administración parenteral en una disolución acuosa, por ejemplo, deberá tamponarse adecuadamente la disolución en caso necesario y en primer lugar conseguir que el diluyente líquido sea isotónico con una solución salina o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratumoral e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán los medios acuosos estériles que pueden emplearse en relación a la presente descripción. Por ejemplo, puede disolverse una dosis en 1 ml de disolución de NaCl isotónico o bien añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el lugar propuesto de infusión, (véase por ejemplo "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente ocurrirá alguna variación de la dosificación dependiendo del estado del sujeto que se esté tratando. En cualquier caso, la persona responsable de la administración determinará la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para la administración al ser humano, las preparaciones deberían cumplir con una esterilidad, pirogenicidad, normas de pureza y seguridad general como requieren las normas de la Oficina de Biología de la FDA.

Se preparan las disoluciones inyectabes estériles incorporando los compuestos activos y excipientes en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros componentes enumerados anteriormente, según se requiera, se preparan mediante un procedimiento aséptico y/o seguidas de una esterilización filtrada. Generalmente, se preparan las dispersiones incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio básico de dispersión y los demás componentes requeridos a partir de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado en vacío y de liofilización que consiguen un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional a partir de una disolución filtrada previamente de manera estéril del mismo.

Pueden formularse las composiciones descritas en el presente documento en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de (una) proteína(s) asociada(s) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídricos o fosfóricos, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio, o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, se administrarán las disoluciones de una manera compatible con una formulación de dosificación y en tal cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran de manera sencilla en una diversidad de formas farmacéuticas tales como disoluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco y similares.

Tal como se usa en el presente documento, "excipiente" incluye cualquier y todos disolventes, medios de dispersión, excipientes, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de retardo de la absorción e isotónicos, disoluciones de excipiente, suspensiones, coloides, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas se conoce bien en la técnica. Salvo en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en la composición terapéutica. En las composiciones también pueden incorporarse principios activos suplementarios.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a composiciones y entidades moleculares que no producen una reacción perjudicial alérgica o similar cuando se administra al ser humano. En la técnica se entiende bien la preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como un principio activo. Normalmente, se preparan tales composiciones como suspensiones o disoluciones inyectables, así como líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en, un líquido antes de la inyección.

E. Formas adicionales de administración

Adicionalmente a los métodos de administración descritos anteriormente, también se contemplan las siguientes técnicas como métodos alternativos de administración terapéutica de ácidos nucleicos. La sonoforesis (es decir, el ultrasonido) se ha utilizado y descrito en la patente de los EE.UU. número 5.656.016 (incorporada específicamente en el presente documento como referencia en su totalidad) como un dispositivo para aumentar la tasa y eficacia de permeación del fármaco en y a través del sistema circulatorio. De forma similar, se ha utilizado la electroporación para administrar genes in vivo (Suzuki et al., 1998). Otras alternativas de administración del fármacos contempladas son la inyección intraósea (patente de los EE.UU. número 5.779.708), dispositivos de microchip (patente de los EE.UU. número 5.797.898), formulaciones oftálmicas (Bourlais et al., 1998), matrices transdérmicas (patente de los EE.UU. número 5.770.219 y patente de los EE.UU. número 5.783.208), administración rectal (patente de los EE.UU. número 5.811.128) y administración controlada por retroalimentación (patente de los EE.UU. número 5.697.899), incorporada cada una específicamente en el presente documento como referencia en su totalidad).

F. Productos farmacéuticos y tratamiento del cáncer

La presente invención se refiere al tratamiento de diversas enfermedades hiperproliferativas. El tratamiento implicará tratar a un individuo con una cantidad eficaz de una formulación lipídica, tal como de describió anteriormente, que contiene un ácido nucleico de interés. Generalmente se describe una cantidad eficaz como aquella cantidad suficiente para mejorar reducir, minimizar o limitar de manera detectable y repetida la extensión de la enfermedad o sus síntomas. Pueden aplicarse definiciones más rigurosas, incluyendo la eliminación, erradicación o cura de la enfermedad.

Con el fin de incrementar la efectividad de un complejo de liposoma: ácido nucleico puede ser deseable combinar estas composiciones con otros agentes eficaces en el tratamiento de la enfermedad hiperproliferativa, tal como agentes anticancerígenos. Un agente "anticancerígeno" puede afectar negativamente al cáncer en un sujeto, por ejemplo, destruyendo células cancerígenas, induciendo la apoptosis en células cancerígenas, reduciendo la tasa de crecimiento de células cancerígenas, reduciendo la incidencia o el número de metástasis, reduciendo el tamaño del tumor, inhibiendo el crecimiento tumoral, reduciendo el suministro de sangre a un tumor o células cancerígenas, promoviendo una respuesta inmunitaria contra células cancerígenas o un tumor, previniendo o inhibiendo la progresión de cáncer, o alargando la vida de un sujeto con cáncer. Los agentes anticancerígenos incluyen agentes biológicos (terapia biológica), agentes quimioterápicos, y agentes radioterápicos. Más generalmente, se proporcionarán estas otras composiciones en una cantidad combinada eficaz para destruir o inhibir la proliferación de la célula. Este proceso puede implicar la puesta en contacto de las células con el constructo de expresión y el (los) agente(s) o factor(es) múltiple(s) al mismo tiempo. Esto puede conseguirse poniendo en contacto la célula con una única composición única o formulación farmacéutica que incluya ambos agentes, o poniendo en contacto la célula con dos formulaciones o composiciones distintas, al mismo tiempo, en las que una composición incluye el constructo de expresión y la otra incluye el (los) segundo(s) agente(s).

La resistencia de la célula tumoral a los agentes de quimioterapia y radioterapia representa un problema principal en la oncología clínica. Un objetivo de la investigación actual del cáncer es encontrar maneras de mejorar la eficacia de la quimio y radioterapia combinándola con la terapia génica. Por ejemplo, el gen (HS-tK) timidita-quinasa del herpes simple, cuando se administra a tumores cerebrales mediante un sistema de vector retroviral, indujo con éxito la susceptibilidad al agente antiviral ganciclovir (Culver, et al., 1992). En el contexto de la presente invención, se considera que podrá usarse la terapia génica antiproliferativa de forma similar en combinación con una intervención quimioterápica, radioterápica, o inmunoterápica, adicionalmente a otros agentes reguladores del ciclo celular o pro-apoptóticos.

Para destruir las células, inhibir el crecimiento celular, inhibir la metástasis, disminuir el tamaño del tumor o del tejido y de otro modo invertir o reducir el fenotipo maligno de las células tumorales, usando los métodos y composiciones de la presente invención, generalmente se pondrá en contacto una célula hiperproliferativa con el constructo de expresión terapéutico. Esto podrá combinarse con composiciones que comprendan otros agentes eficaces en el tratamiento de células hiperproliferativas. Se proporcionarán estas composiciones en una cantidad combinada eficaz para destruir o inhibir la proliferación de la célula. Este proceso puede implicar poner en contacto las células con el constructo de expresión y el (los) agente(s) o factor(es) al mismo tiempo. Esto puede conseguirse poniendo en contacto la célula con una composición única o formulación farmacológica que incluya ambos agentes, o poniendo en contacto la célula con dos composiciones o formulaciones distintas, al mismo tiempo, en las que una composición incluye un ácido nucleico y la otra incluye el segundo agente.

Alternativamente, la terapia de complejo lipídico puede preceder o seguir al otro tratamiento con agentes en intervalos que oscilan desde minutos hasta semanas. En las realizaciones en las que el otro agente y ácido nucleico se aplican separadamente a la célula, se garantizará generalmente que no finalizó un periodo significativo de tiempo entre el tiempo de cada administración, de modo que el agente y el ácido nucleico todavía podrán ejercer un efecto ventajosamente combinado sobre la célula. En tales casos, se considera que puede ponerse en contacto la célula con ambas modalidades dentro de aproximadamente 12-24 h entre sí y, más preferiblemente, dentro de aproximadamente 6-12 h entre sí. Sin embargo, en algunas situaciones, puede ser deseable extender el periodo de tiempo para el tratamiento de manera significativa, en el que entre las administraciones respectivas caen de varios días (2, 3, 4, 5, 6 ó 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ó 8).

Pueden emplearse diversas combinaciones, la terapia génica es "A" y el agente terapéutico o radio o quimioterápico es "B":

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

La administración de los constructos terapéuticos de ácidos nucleicos de la presente invención a un paciente seguirán protocolos generales para la administración de productos quimioterápicos, teniendo en cuenta la toxicidad, si existe, del vector. Se espera que los ciclos de tratamiento se repitan lo necesario. También se contempla que pueden aplicarse diversas terapias estándar, así como la intervención quirúrgica, en combinación con la terapia de formulación lipídica descrita.

Las composiciones acuosas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz del compuesto, disuelto o disperso en un medio acuoso o excipiente farmacéuticamente aceptable. A tales composiciones también puede hacerse referencia como inóculos. Las frases "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refieren a composiciones y entidades moleculares que no producen ninguna reacción perjudicial adversa, alérgica o similar cuando se administra a un animal, o ser humano de manera apropiada. Tal como se usa en el presente documento, "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de retardo de la absorción e isotónicos y similares. En la técnica se conoce bien el uso de tales medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas. Salvo en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. En las composiciones también pueden incorporarse principios activos suplementarios.

Los tratamientos pueden incluir varias "dosis unitarias". La dosis unitaria se define por contener una cantidad predeterminada de la composición terapéutica calculada para producir las respuestas deseadas en combinación con su administración, es decir, la vía y el régimen de tratamiento apropiados. La cantidad que ha de administrarse, y la formulación y vía particular, se encuentran dentro de la experiencia de los expertos en las técnicas clínicas. También es importante el sujeto que va a tratarse, en particular el estado del sujeto y la protección deseada. No necesita administrarse una dosis unitaria como una única inyección pero puede comprender una infusión continua durante un periodo establecido de tiempo. De manera conveniente, la dosis unitaria de la presente invención puede describirse en términos de masa (\mug) de ácido nucleico del ácido nucleico en el complejo lipídico. Las dosis unitarias oscilan desde 1, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 Pg y superiores.

Preferiblemente, los pacientes tendrán una función adecuada de médula ósea (definida como un recuento de granulocitos absoluto periférico de > 2.000/mm^{3} y un recuento de plaquetas de 100.000/mm^{3}), una función adecuada del hígado (bilirrubina < 1,5 mg/dl) y una función renal adecuada (creatinina < 1,5 mg/dl).

Una de las realizaciones preferidas de la presente invención implica el uso del complejo lípido: ácido nucleico para administrar los genes terapéuticos a células hiperproliferativas para el tratamiento del cáncer. Las células cancerígenas incluyen los cánceres de pulmón, de cerebro, de próstata, de riñón, de hígado, de ovario, de mama, de piel, de estomago, de esófago, de cabeza y cuello, de testículos, de colon, del recto, del cuello uterino, del sistema linfático y de sangre. De particular interés son los carcinomas de pulmón de células no pequeñas incluyendo los carcinomas de las células escamosas, adenocarcinomas y carcinomas no diferenciados de células grandes.

Según la presente invención puede tratarse el cáncer inyectando directamente el complejo lipídico en un tumor. También se considera la administración local o regional, con respecto al tumor. Finalmente, puede realizarse una administración sistémica. Cuando sea apropiado, puede aplicarse también una administración continua, por ejemplo, cuando se extirpa un tumor y se trata el lecho tumoral para eliminar la enfermedad residual, microscópica. Se prefiere la administración a través de jeringuilla, infusión o cateterismo. Una perfusión continua de este tipo puede tener lugar durante un periodo de desde aproximadamente 1-2 horas, hasta aproximadamente 2-6 horas, hasta aproximadamente 6-12 horas, hasta aproximadamente 12-24 horas, hasta aproximadamente 1-2 días, hasta aproximadamente 1-2 semanas o más siguiendo el inicio del tratamiento. Generalmente, la dosis de la composición terapéutica a través de la perfusión continua será equivalente a la dada por una única inyección o múltiples inyecciones, ajustadas por un periodo de tiempo durante el que se produce la perfusión.

Para tumores de > 4 cm, el volumen que debe administrarse será de aproximadamente 4-10 ml (preferiblemente 10 ml), mientras que para tumores de < 4 cm, se usará un volumen de aproximadamente 1-3 ml (preferiblemente 3 ml). Las inyecciones múltiples administradas como dosis única comprenden aproximadamente volúmenes de 0,1 a aproximadamente 0,5 ml. Ventajosamente el complejo lipídico puede ponerse en contacto mediante la administración de inyecciones múltiples en el tumor, espaciadas en intervalos de aproximadamente 1 cm.

En ciertas realizaciones, puede ser que no pueda resecarse el tumor que está tratándose, al menos inicialmente. Los tratamientos con formulaciones terapéuticas de complejos lipídicos pueden incrementar la capacidad de resección del tumor debido a la reducción en los márgenes o por la eliminación de ciertas partes particularmente invasivas. Siguiendo con los tratamientos, puede ser posible una resección. Los tratamientos adicionales con complejos lipídicos posteriores a la resección servirán para eliminar una enfermedad residual microscópica en el lugar del
tumor.

Un ciclo de tratamiento típico, para un tumor primario o un lecho tumor tras la extirpación, implicará múltiples dosis. El tratamiento típico para un tumor primario implica una aplicación de 6 dosis durante un periodo de tiempo de dos semanas. Puede repetirse el régimen de dos semanas una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más veces. Durante un ciclo de tratamiento, puede volver a evaluarse la necesidad para completar las dosificaciones planificadas. Para la administración sistémica pueden administrarse los complejos de liposomas desde 0,5 hasta varias horas mediante infusión con un diluyente farmacéuticamente aceptable tal como dextrosa al 5% en agua, solución de Ringer, NaCl al 0,5%. La administración sistémica puede producirse una vez a la semana durante múltiples semanas por un ciclo de meses.

Preferiblemente, los pacientes tendrán una función adecuada de médula ósea (definida como un recuento de granulocitos absoluto periférico de > 2.000/mm^{3} y un recuento de plaquetas de 100.000/mm^{3}), una función adecuada del hígado (bilirrubina < 1,5 mg/dl) y una función renal adecuada (creatinina < 1,5 mg/dl).

1. Terapia génica

En otra realización más, el tratamiento secundario es una terapia génica secundaria en la que se administra un segundo polinucleótido terapéutico antes, después o simultáneamente a un primer polinucléotido terapéutico. Alternativamente, puede utilizarse un único vector que codifique para ambos genes. Dentro de la invención se engloban una variedad de proteínas, algunas de las cuales se han descrito anteriormente en la solicitud momentánea.

2. Quimioterapia

Las terapias cancerígenas también incluyen una variedad de terapias de combinación con ambos tratamientos basados en productos químicos y radiación. Las quimioterapias de combinación incluyen, por ejemplo, cisplatino (CDDP), carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalán, clorambucilo, bisulfano. Puede utilizarse una amplia variedad de agentes quimioterápicos en combinación con el uso de moléculas de ácido nucleico en una formulación lipídica farmacéuticamente aceptable en la presente invención. El término "quimioterapia" se refiere al uso de fármacos para tratar cáncer. Se utiliza un "agente quimioterápico" para connotar un compuesto o composición que se administra en el tratamiento de cáncer. Estos agentes o fármacos se clasifican por su modo de actividad dentro de una célula, por ejemplo, si y en qué fase afectan al ciclo celular. Alternativamente, un agente puede caracterizarse basándose en su capacidad para entrecruzar directamente ADN, para intercalarse en ADN, o para inducir aberraciones mitóticas y cromosómicas, afectando a la síntesis de ácidos nucleicos. La mayor parte de los agentes quimioterápicos entra dentro de las categorías siguientes: agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, hormonas corticosteroides, inhibidores mitóticos, y nitrosoureas, y cualquier variante análoga o derivada de los mismos. Se contempla que las formulaciones de ácido nucleico descritas en el presente documento pueden utilizarse en combinación con uno o más de estos agentes según la presente invención.

a. Agentes alquilantes

Los agentes alquilantes son fármacos que interaccionan directamente con ADN genómico para evitar que proliferen las células cancerígenas. Esta categoría de fármacos quimioterápicos representa agentes que afectan a todas las fases del ciclo celular, es decir, no son específicos de la fase. Los agentes alquilantes pueden aplicarse para tratar la leucemia crónica, el linfoma de no-Hodgkin, la enfermedad de Hodgkin, el mieloma múltiple y cánceres particulares de mama, de pulmón y de ovario. Incluyen: busulfano, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida (citoxan), dacarbazina, ifosfamida, mecloretamina (mustargen), y melfalán. Puede utilizarse troglitazona para tratar el cáncer en combinación con cualquiera o más de estos agentes alquilantes, algunos de los cuales se tratan a continuación.

i. Busulfano

El busulfano (también conocido como myleran) es un agente alquilante bifuncional. El busulfano se conoce químicamente como dimetanosulfato de 1,4-butanodiol.

El busulfano no es un análogo estructural de la mostaza nitrogenada. El busulfano está disponible en forma de comprimidos para la administración oral. Cada comprimido ranurado contiene 2 mg de busulfano y los componentes inactivos estearato de magnesio y cloruro de sodio.

El busulfano está indicado para el tratamiento paliativo de leucemia mielógena (mieloide, mielocítica, granulocítica) crónica. Aunque no es curativo, el busulfano reduce la masa granulocítica total, mitiga los síntomas de la enfermedad, y mejora el estado clínico del paciente. Aproximadamente el 90% de los adultos con leucemia mielógena crónica no tratada previamente obtendrán una remisión hematológica con una regresión o estabilización de la visceromegalia que sigue al uso de busulfano. Ha demostrado ser mejor que la irradiación esplénica con respecto a los tiempos de supervivencia y al mantenimiento de los niveles de hemoglobina, y ser equivalente a la irradiación en el control de la esplenomegalia.

ii. Clorambucilo

El clorambucilo (también conocido como leukeran) es un agente alquilante bifuncional del tipo de la mostaza nitrogenada que se ha encontrado activo frente a enfermedades neoplásicas humanas seleccionadas. El clorambucilo se conoce químicamente como ácido 4-[bis(2-cloroetil)amino]-benzenobutanoico.

El clorambucilo está disponible en forma de comprimidos para la administración oral. Se absorbe rápida y completamente desde el tracto gastrointestinal. Tras una única dosis oral de 0,6-1,2 mg/kg, se alcanzan niveles pico de clorambucilo en plasma en una hora y se estima la semivida terminal del fármaco original en 1,5 horas. Puede utilizarse de 0,1 a 0,2 mg/kg/día o de 3 a 6 mg/m^{2}/día o alternativamente 0,4 mg/kg para el tratamiento antineoplásico. Los expertos en la técnica conocen bien los regímenes de tratamiento y pueden encontrarse en la "Physicians Desk Reference" y en "Remington's Pharmaceutical Sciences" a los que se hace referencia en el presente docu-
mento.

El clorambucilo está indicado en el tratamiento de leucemia linfática (linfocítica) crónica, linfomas malignos que incluyen linfosarcoma, linfoma de folículos gigantes y enfermedad de Hodgkin. No es curativo en ninguno de estos trastornos pero puede producir una paliación clínicamente útil.

iii. Cisplatino

El cisplatino se ha utilizado ampliamente para tratar cánceres tales como el carcinoma de ovario o testicular metastásico, cáncer de vejiga avanzado, cáncer de cabeza o cuello, cáncer cervicouterino, cáncer de pulmón u otros tumores. El cisplatino puede utilizarse sólo o en combinación con otros agentes, con dosis eficaces utilizadas en aplicaciones clínicas de 15-20 mg/m^{2} durante 5 días cada tres semanas durante un total de tres ciclos. Las dosis a modo de ejemplo pueden ser de 0,50 mg/m^{2}, 1,0 mg/m^{2}, 1,50 mg/m^{2}, 1,75 mg/m^{2}, 2,0 mg/m^{2}, 3,0 mg/m^{2}, 4,0 mg/m^{2}, 5,0 mg/m^{2}, 10 mg/m^{2}. Desde luego, todas estas dosis son a modo de ejemplo, y se espera que cualquier dosis entre estos puntos también sea útil en la invención.

El cisplatino no se absorbe por vía oral y por tanto debe administrarse mediante inyección por vía intravenosa, subcutánea, intratumoral o intraperitoneal.

iv. Ciclofosfamida

La ciclofosfamida es 2H-1,3,2-oxazafosforin-2-amino-N,N-bis(2-cloroetil)tetrahidro-2-oxido monohidratado; calificado como Citoxan disponible de Mead Johnson; y Neosar disponible de Adria. La ciclofosfamida se prepara por condensación de 3-amino-1-propanol con dicloruro fosforamídico de N,N-bis(2-cloretilo) [(ClCH_{2}CH_{2})_{2}N-POCl_{2}] en disolución de dioxano con la influencia catalítica de trietilamina. La condensación es doble, implicando ambos grupos amino e hidroxilo, llevando a cabo así la ciclación.

A diferencia de otros alquilantes de \beta-cloroetilamino, éste no cicla fácilmente para dar la forma de etilenimonio activa hasta que no se activa por las enzimas hepáticas. Por tanto, la sustancia es estable en el tracto gastrointestinal, se tolera bien y es eficaz por las vías de administración oral y parenteral y no produce vesicación local, necrosis, flebitis o incluso dolor.

Las dosis adecuadas para adultos incluyen, por vía oral, de 1 a 5 mg/kg/día (normalmente en combinación), dependiendo de la tolerancia gastrointestinal; o de 1 a 2 mg/kg/día; por vía intravenosa, inicialmente de 40 a 50 mg/kg en dosis divididas durante un periodo de 2 a 5 días o de 10 a 15 mg/kg cada 7 a 10 días o de 3 a 5 mg/kg dos veces por semana o de 1,5 a 3 mg/kg/día. Puede administrarse una dosis de 250 mg/kg/día como un antineoplásico. Debido a los efectos adversos gastrointestinales, se prefiere la vía de administración intravenosa para la carga. Durante el mantenimiento, se desea normalmente un recuento de leucocitos de 3000 a 4000/mm^{3}. A veces, el fármaco se administra también por vía intramuscular, mediante infiltración o en cavidades corporales. Está disponible en formas farmacéuticas para la inyección de 100, 200 y 500 mg, y comprimidos de 25 y 50 mg; se remite al experto en la técnica a "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª edición, capítulo 61, incorporado en el presente documento como referencia, para los detalles sobre las dosis para la administración.

v. Melfalán

El melfalán, también conocido como alkeran, mostaza de L-fenilalanina, mostaza de fenilalanina, L-PAM, o L-sarcolisina, es un derivado de la fenilalanina de la mostaza nitrogenada. El melfalán es un agente alquilante bifuncional que es activo frente a enfermedades neoplásicas humanas selectivas. Se conoce químicamente como 4-[bis(2-cloroetil)amino]-L-fenilalanina.

El melfalán es el isómero L activo del compuesto y se sintetizó por primera vez en 1953 por Bergel y Stock; el isómero D, conocido como medfalán, es menos activo frente a ciertos tumores animales, y la dosis necesaria para producir efectos sobre los cromosomas es mayor que la requerida con el isómero L. La forma racémica (DL-) se conoce como merfalán o sarcolisina. El melfalán es insoluble en agua y tiene un pka_{1} de \sim2,1. El melfalán está disponible en forma de comprimidos para la administración oral y se ha utilizado para tratar el mieloma múltiple.

La evidencia disponible sugiere que aproximadamente de un tercio a un medio de los pacientes con mieloma múltiple muestran una respuesta favorable a la administración oral del fármaco.

El melfalán se ha utilizado en el tratamiento del carcinoma de ovario epitelial. Un régimen comúnmente empleado para el tratamiento del carcinoma de ovario ha sido administrar melfalán en una dosis de 0,2 mg/kg diariamente durante cinco días como un único ciclo. Los ciclos se repiten cada cuatro o cinco semanas dependiendo de la tolerancia hematológica (Smith and Rutledge, 1975; Young et al., 1978). Alternativamente, la dosis de melfalán utilizada podría ser tan baja como 0,05 mg/kg/día o tan alta como 3 mg/kg/día o cualquier dosis entre estas dosis o superior a estas dosis. Necesariamente se producirá alguna variación en la dosificación dependiendo del estado del sujeto que va a tratarse. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual.

b. Antimetabolitos

Los antimetabolitos perturban la síntesis de ADN y ARN. A diferencia de los agentes alquilantes, influyen específicamente en el ciclo celular durante la fase S. Se han utilizado para combatir leucemias crónicas además de los tumores de mama, de ovario y el tracto gastrointestinal. Los antimetabolitos incluyen 5-fluorouracilo (5-FU), citarabina (Ara-C), fludarabina, gemcitabina, y metotrexato.

i. 5-fluorouracilo

El 5-fluorouracilo (5-FU) tiene el nombre químico de 5-fluoro-2,4(1H,3H)-pirimidindiona. Se piensa que su mecanismo de acción es mediante el bloqueo de la reacción de metilación del ácido desoxiuridilíco para dar ácido timidílico. Por tanto, el 5-FU interfiere con la síntesis del ácido desoxirribonucleico (ADN) e inhibe en menor extensión la formación de ácido ribonucleico (ARN). Dado que el ADN y el ARN son esenciales para la proliferación y división celular, se piensa que el efecto del 5-FU es crear una deficiencia de timidina que conduzca a la muerte celular. Por tanto, el efecto del 5-FU se encuentra en células que se dividen rápidamente, una característica de los cánceres metastá-
sicos.

c. Antibióticos antitumorales

Los antibióticos antitumorales tienen tanto actividad antimicrobiana como citotóxica. Estos fármacos también interfieren con el ADN mediante la inhibición química de enzimas y la mitosis o alteración de membranas celulares. Estos agentes no son específicos de fase de manera que actúan en todas las fases del ciclo celular. Por tanto, se utilizan ampliamente para una variedad de cánceres. Ejemplos de antibióticos antitumorales incluyen bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina (adriamicina), e idarubicina, algunos de los cuales se tratan con más detalle a continuación. Estos compuestos, utilizados ampliamente en la práctica clínica para el tratamiento de neoplasmas, se administran a través de inyecciones en bolo por vía intravenosa en dosis que oscilan desde 25-75 mg/m^{2} en intervalos de 21 días para adriamicina, hasta 35-100 mg/m^{2} para etopósido por vía intravenosa u oral.

i. Doxorubicina

El hidrocloruro de doxorubicina, hidrocloruro de 5,12-naftacendiona, (8s-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxi-a-L-lixo-hexopiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxilo (hidrocloruro de hidroxidaunorubicina, adriamicina) se utiliza en un amplio espectro antineoplásico. Se une al ADN e inhibe la síntesis de ácido nucleico, inhibe la mitosis y favorece las aberraciones cromosómicas.

Administrado solo, es el fármaco de primera elección para el tratamiento del adenoma tiroideo y el carcinoma primario de células hepáticas. Es un componente de las 31 combinaciones de primera elección para el tratamiento de tumores de ovario, de endometrio y de mama, carcinoma broncogénico de células pequeñas, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma gástrico, retinoblastoma, neuroblastoma, micosis fungoide, carcinoma de páncreas, carcinoma de próstata, carcinoma de vejiga, mieloma, linfoma histiocítico difuso, tumor de Wilms, enfermedad de Hodgkin, tumores suprarrenales, sarcoma osteogénico, sarcoma de las partes blandas, sarcoma de Ewing, rabdomiosarcoma y leucemia linfocítica aguda. Es un fármaco alternativo para el tratamiento de cánceres de las células de islote pancreático, uterinocervical, testicular y suprarrenal. También es un inmunosupresor.

La doxorubicina se absorbe muy poco y debe administrarse por vía intravenosa. Las farmacocinéticas son multicompartimentales. Las fases de distribución tienen semividas de 12 minutos y 3,3 h. La semivida de eliminación es aproximadamente de 30 h. Del cuarenta al 50% se secreta en la bilis. La mayor parte del resto se metaboliza en el hígado, parcialmente en un metabolito activo (doxorubicinol), pero algún porcentaje se excreta en la orina. En presencia de insuficiencia hepática, debe reducirse la dosis.

Las dosis apropiadas son, por vía intravenosa, en adultos, de 60 a 75 mg/m^{2} en intervalos de 21 días o de 25 a 30 mg/m^{2} en cada uno de 2 ó 3 días sucesivos repetido en intervalos de 3 ó 4 semanas o 20 mg/m^{2} una vez a la semana. La dosis más baja que debe utilizarse en pacientes ancianos, cunado existe depresión de médula ósea anterior ocasionada por la quimioterapia anterior o invasión de médula neoplásica, o cuando se combina el fármaco con otros fármacos supresores mielopoyéticos. La dosis debe reducirse en el 50% si la bilirrubina en suero se encuentra entre 1,2 y 3 mg/dL y en el 75% si es superior a 3 mg/dL. La dosis total de toda la vida no debe superar los 550 mg/m^{2} en pacientes con una función del normal corazón y los 400 mg/m^{2} en personas que han recibido irradiación mediastinal. Alternativamente, 30 mg/m^{2} en cada uno de 3 días consecutivos, repetido cada 4 semanas. Las dosis a modo de ejemplo pueden ser de 10 mg/m^{2}, 20 mg/m^{2}, 30 mg/m^{2}, 50 mg/m^{2}, 100 mg/m^{2}, 150 mg/m^{2}, 175 mg/m^{2}, 200 mg/m^{2}, 225 mg/m^{2}, 250 mg/m^{2}, 275 mg/m^{2}, 300 mg/m^{2}, 350 mg/m^{2}, 400 mg/m^{2}, 425 mg/m^{2}, 450 mg/m^{2}, 475 mg/m^{2}, 500 mg/m^{2}. Desde luego, todas estas dosificaciones son a modo de ejemplo, y también se espera que cualquier dosificación entre estos puntos sea útil en la invención.

ii. Daunorubicina

El hidrocloruro de daunorubicina, hidrocloruro de 5,12-naftacendiona, (8S-cis)-8-acetil-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxi-a-L-lixohexanopiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-10-metoxilo; también calificado como cerubidina y disponible de Wyeth. La daunorubicina se intercala en el ADN, bloquea la ARN polimerasa dirigida a ADN e inhibe la síntesis de ADN. Puede prevenir la división celular en dosis que no interfieren con la síntesis de ácido nucleico.

En combinación con otros fármacos, se incluye en la quimioterapia de primera elección de la leucemia mielocítica aguda en adultos (para la inducción de la remisión), la leucemia linfocítica aguda y la fase aguda de la leucemia mielocítica crónica. La absorción oral es baja, y debe administrarse por vía intravenosa. La semivida de distribución es de 45 minutos y la de eliminación, aproximadamente de 19 h. La semivida de su metabolito activo, daunorubicinol, es de aproximadamente 27 h. La mayor parte de la daunorubicina se metaboliza en el hígado y también se secreta en la bilis (aproximadamente el 40%). Debe reducirse la dosificación en caso de insuficiencia renal o hepática.

Las dosis adecuadas son (equivalentes de base), por vía intravenosa, en adultos menores de 60 años, de 45 mg/m^{2}/día (30 mg/m^{2} para pacientes mayores de 60 años) durante 1, 2 ó 3 días cada 3 ó 4 semanas o de 0,8 mg/kg/día durante de 3 a 6 días cada 3 ó 4 semanas; no deben administrarse más de 550 mg/m^{2} en una vida total, solamente excepto 450 mg/m^{2} si ha habido irradiación torácica; en niños, 25 mg/m^{2} una vez a la semana a menos que la edad sea menor de 2 años o la superficie corporal sea inferior a 0,5 m, caso en el que se utiliza el programa de adultos en base al peso. Está disponible en formas farmacéuticas inyectables (equivalente de base) de 20 mg (como el equivalente de base a 21,4 mg del hidrocloruro). Las dosis a modo de ejemplo pueden ser de 10 mg/m^{2}, 20 mg/m^{2}, 30 mg/m^{2}, 50 mg/m^{2}, 100 mg/m^{2}, 150 mg/m^{2}, 175 mg/m^{2}, 200 mg/m^{2}, 225 mg/m^{2}, 250 mg/m^{2}, 275 mg/m^{2}, 300 mg/m^{2}, 350 mg/m^{2}, 400 mg/m^{2}, 425 mg/m^{2}, 450 mg/m^{2}, 475 mg/m^{2}, 500 mg/m^{2}. Desde luego, todas estas dosificacines son a modo de ejemplo, y se espera que cualquier dosificación entre estos puntos también sea útil en la invención.

iii. Mitomicina

La mitomicina (también conocida como mutamicina y/o mitomicina-C) es un antibiótico aislado del caldo de Streptomyces caespitosus que ha demostrado tener actividad antitumoral. El compuesto es térmicamente estable, tiene un punto de fusión alto, y es muy soluble en disolventes orgánicos.

La mitomicina inhibe selectivamente la síntesis del ácido desoxirribonucleico (ADN). El contenido en guanina y citosina se correlaciona con el grado de entrecruzamiento inducido por mitomicina. A altas concentraciones del fármaco, también se suprimen la síntesis de ARN celular y de proteínas.

En humanos, la mitomicina se aclara rápidamente del suero tras la administración intravenosa. El tiempo requerido para reducir la concentración en suero en el 50% tras una inyección en bolo de 30 mg es de 17 minutos. Tras la inyección de 30 mg, 20 mg, o 10 mg por vía i.v., las concentraciones en suero máximas fueron de 2,4 mg/mL, 1,7 mg/mL, y 0,52 mg/mL, respectivamente. En primer lugar la aclaración se realiza por el metabolismo en el hígado, pero el metabolismo también se produce en otros tejidos. La tasa de aclaración es inversamente proporcional a la concentración en suero máxima debido a, se piensa, la saturación de las rutas de degradación. Aproximadamente el 10% de una dosis de mitomicina se excreta sin cambiar en la orina. Dado que se saturan las rutas metabólicas a dosis relativamente bajas, el porcentaje de una dosis excretada en la orina aumenta con el aumento de la dosis. En niños, la excreción de mitomicina administrada por vía intravenosa es similar.

iv. Actinomicina D

La actinomicina D (dactinomicina) [50-76-0]; C_{62}H_{86}N_{12}O_{16} (1255,43) es un fármaco antineoplásico que inhibe a la ARN polimerasa dependiente de ADN. Es un componente de las combinaciones de primera elección para el tratamiento de coriocarcinoma, rabdomiosarcoma embrionario, tumor testicular y tumor de Wilms. Los tumores que dejan de responder al tratamiento sistémico responden algunas veces a la perfusión local. La dactinomicina potencia la radioterapia. Es un inmunosupresor secundario (eferente).

La actinomicina D se utiliza en combinación con la cirugía primaria, radioterapia y otros fármacos, particularmente vincristina y ciclofosfamida. La actividad antineoplásica también se ha observado en el tumor de Ewing, sarcoma de Kaposi, y sarcomas de las partes blandas. La dactinomicina puede ser eficaz en mujeres con casos avanzados de coriocarcinoma. También produce respuestas sistemáticas en combinación con clorambucilo y metotrexato en pacientes con carcinomas testiculares metastásicos. A veces puede observarse una respuesta en pacientes con enfermedad de Hodgkin y linfomas de no-Hodgkin. La dactinomicina también se ha utilizado para inhibir las respuestas inmunológicas, particularmente el rechazo de los transplantes renales.

La mitad de la dosis se excreta intacta en la bilis y el 10% en la orina; la semivida es de aproximadamente 36 h. El fármaco no pasa la barrera hematoencefálica. La actinomicina D se suministra como un polvo liofilizado (0/5 mg en cada vial). La dosis diaria habitual es de 10 a 15 mg/kg; esta se administra por vía intravenosa durante 5 días; si no se encuentran manifestaciones de toxicidad, pueden administrarse ciclos adicionales en intervalos de 3 a 4 semanas. Las inyecciones diarias de 100 a 400 mg se han administrado a niños durante de 10 a 14 días; en otros regímenes, se han utilizado de 3 a 6 mg/kg, para un total de 125 mg/kg, y dosis de mantenimiento semanal de 7,5 mg/kg. Aunque es más seguro administrar el fármaco dentro del tubo de una infusión intravenosa, se han administrado inyecciones intravenosas directas con la precaución de descartar la aguja utilizada para retirar el fármaco del vial con el fin de evitar una reacción subcutánea. Las dosis a modo de ejemplo pueden ser de 100 mg/m^{2}, 150 mg/m^{2}, 175 mg/m^{2} 200 mg/m^{2}, 225 mg/m^{2}, 250 mg/m^{2}, 275 mg/m^{2}, 300 mg/m^{2}, 350 mg/m^{2}, 400 mg/m^{2}, 425 mg/m^{2}, 450 mg/m^{2}, 475 mg/m^{2}, 500 mg/m^{2}. Desde luego todas estas dosificaciones son a modo de ejemplo, y se espera que cualquier dosificación entre estos puntos sea útil en la invención.

v. Bleomicina

La bleomicina es una mezcla de antibióticos glicopéptidicos citotóxicos aislados de una cepa de Streptomyces verticillus. Aunque no se conoce el mecanismo de acción exacto de la bleomicina, la evidencia disponible parece indicar que el modo principal de acción es la inhibición de la síntesis de ADN con alguna evidencia de menor inhibición de la síntesis de proteínas y de ARN.

En ratones, se encuentran altas concentraciones de bleomicina en la piel, pulmones, riñones, peritoneo, y sistema linfático. Se ha encontrado que las células tumorales de la piel y los pulmones tienen altas concentraciones de bleomicina en contraste con las bajas concentraciones encontradas en el tejido hematopoyético. Las bajas concentraciones de bleomicina encontradas en la médula ósea pueden estar relacionadas con los altos niveles de enzimas que degradan la bleomicina encontradas en ese tejido.

En pacientes con un aclaramiento de creatinina de >35 mL por minuto, la semivida de eliminación terminal en plasma o suero de bleomicina es de aproximadamente 115 minutos. En pacientes con un aclaramiento de creatinina de <35 mL por minuto, la semivida de eliminación terminal en plasma o suero aumenta exponencialmente a medida que disminuye el aclaramiento de creatinina. En seres humanos, del 60% al 70% de una dosis administrada se recupera en la orina como bleomicina activa. La bleomicina puede administrarse por las vías intramuscular, intravenosa, o subcutánea. Es muy soluble en agua.

La bleomicina debe considerarse como un tratamiento paliativo. Ha demostrado ser útil en el tratamiento de los siguientes neoplasmas o bien como un único agente o bien en combinaciones probadas con otros agentes quimioterápicos aprobados en carcinoma de células escamosas tales como de cabeza y cuello (que incluye boca, lengua, amígdalas, nasofaringe, orofaringe, seno, paladar, labio, mucosa bucal, encía, epiglotis, laringe), de piel, de pene, de cuello uterino, de vulva. Se ha utilizado también en el tratamiento de linfomas y carcinoma testicular.

Debido a la posibilidad de una reacción anafilactoide, los pacientes de linfoma deben tratarse con dos unidades o menos para las primeras dos dosis. Si no se produce ninguna reacción aguda, entonces puede seguirse el programa de dosificación regular.

Tienen lugar mejoras en la enfermedad de Hodgkin y tumores testiculares y se observan en 2 semanas. Si no se observa mejora en este tiempo, la mejora es poco probable. Los cánceres de células escamosas responden más lentamente, algunas veces requieren tanto como 3 semanas antes de que se observe cualquier mejora.

d. Hormonas corticosteroides

Las hormonas corticosteroides son útiles para tratar algunos tipos de cáncer (linfoma, leucemias, y mieloma múltiple). Aunque se han usado estas hormonas en el tratamiento de muchos estados que no son cáncer, se consideran fármacos de quimioterapia cuando se implementan para matar o ralentizar el crecimiento de las células cancerígenas. Las hormonas corticosteroides pueden incrementar la eficacia de otros agentes de quimioterapia, y por consiguiente, se usan con frecuencia en politratamientos. Prednisona y dexametasona son ejemplos de hormonas corticosteroides.

e. Inhibidores mitóticos

Los inhibidores mitóticos incluyen alcaloides vegetales y otros agentes naturales que pueden inhibir o bien la síntesis de proteína requerida para la mitosis o división celular. Operan durante una fase específica durante el ciclo celular. Los inhibidores mitóticos comprenden docetaxel, etopósido (VP16), paclitaxel, taxol, vinblastina, vincristina, y vinorelbina.

i. Etopósido (VP16)

El VP16 se conoce también como etopósido y se usa fundamentalmente para el tratamiento de tumores testiculares, en combinación con bleomicina y cisplatino para carcinoma de células pequeñas del pulmón. También es activo contra los linfomas distintos al de Hodgkin, leucemia no linfocítica aguda, carcinoma de la mama, y sarcoma de Kaposi asociado con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).

El VP16 está disponible como una disolución (20 mg/ml) para administración intravenosa y como cápsulas rellenas de líquido de 50 mg para uso oral. Para el carcinoma de células pequeñas del pulmón, la dosis intravenosa (en politerapia) puede ser de tanto como 100 mg/m^{2} o de tan poco como 2 mg/m^{2}, rutinariamente de 35 mg/m^{2}, al día durante 4 días, a 50 mg/m^{2}, al día durante 5 días también se han usado. Cuando se administran por vía oral, la dosis debe ser el doble. Así, las dosis para carcinoma de células pequeñas de pulmón pueden ser tan altas como 200-250 mg/m^{2}. La dosis intravenosa para el cáncer testicular (en politerapia) es de 50 a 100 mg/m^{2} al día durante 5 días, o 100 mg/m^{2} en días alternos, durante tres dosis. Los ciclos de terapia se repiten normalmente cada 3 a 4 semanas. El fármaco debe administrarse lentamente durante una infusión de 30 a 60 minutos para evitar hipotensión arterial o broncoespasmo, que se deben probablemente a los disolventes usados en la formulación.

ii. Taxol

El taxol es un agente antimitótico experimental, aislado a partir de la corteza del fresno, Taxus breviofolia. Éste se une a la tubulina (en un sitio distinto del usado por los acaloides de la vinca) y promueve la reunión de microtúbulos. Actualmente, el taxol se está evaluando clínicamente; tiene actividad contra melanoma y carcinoma malignos de los ovarios. Las dosis máximas son 30 mg/m^{2} al día durante 5 días o de 210 a 250 mg/m^{2} administradas una vez cada 3 semanas. Por supuesto, todas estas dosificaciones son a modo de ejemplo, y también se espera que cualquier dosificación entre estos puntos sea de utilidad en la invención.

iii. Vinblastina

La vinblastina es otro ejemplo de alcaloide vegetal que puede usarse en combinación con la terapia génica para el tratamiento de cáncer y precáncer. Cuando las células se incuban con vinblastina, tiene lugar una disolución de microtúbulos.

Se ha informado de una absorción impredecible tras la administración oral de vinblastina o vincristina. En las dosis clínicas habituales la concentración máxima de cada fármaco en plasma es aproximadamente 0,4 mM. La vinblastina y vincristina se unen a proteínas del plasma. Se concentran exhaustivamente en plaquetas y en menor grado en leucocitos y eritrocitos.

Tras la inyección intravenosa, la vinblastina tiene un patrón multifásico de eliminación del plasma; tras la distribución, el fármaco desaparece del plasma con semividas de aproximadamente 1 y 20 horas. La vinblastina se metaboliza en el hígado para dar deacetilvinblastina derivada biológicamente activa. Se detecta intacta en la orina aproximadamente el 15% de una dosis administrada, y se recupera aproximadamente el 10% en las heces tras la excreción biliar. Las dosis deben reducirse en pacientes con disfunción hepática. Se indica al menos una reducción del 50% en la dosificación si la concentración de bilirrubina en plasma es superior a 3 mg/dl (aproximadamente 50 mM).

El sulfato de vinblastina está disponible en preparaciones por inyección. El fármaco se administra por vía intravenosa; deben tomarse precauciones especiales contra extravasación subcutánea, debido a que esto puede provocar ulceración e irritación dolorosa. El fármaco no debe inyectarse en una extremidad con problemas de circulación. Tras una única dosis de 0,3 mg/kg de masa corporal, la mielosupresión alcanza su máximo en de 7 a 10 días. Si no se alcanza un nivel moderado de leucocitopenia (aproximadamente 3000 células/mm^{3}), debe aumentarse la dosis semanal gradualmente en incrementos de 0,05 mg/kg de masa corporal. En regímenes diseñados para curar el cáncer testicular, se usa vinblastina en dosis de 0,3 mg/kg cada 3 semanas independientemente de los recuentos de células sanguíneas o la toxicidad.

El uso clínico más importante de la vinblastina es junto con bleomicina y cisplatino en la terapia curativa de tumores metastásicos testiculares. Se ha informado de respuestas beneficiosas en diversos linfomas, particularmente en la enfermedad de Hodgkin, en los que puede notarse una mejora importante en del 50 al 90% de los casos. La eficacia de la vinblastina en una alta proporción de linfomas no disminuye cuando la enfermedad no responde a agentes alquilantes. También es activa en el sarcoma de Kaposi, neuroblastoma, y enfermedad de Letterer-Siwe (histiocitosis X), así como en carcinoma de la mama y coriocarcinoma en mujeres.

Se determinarán dosis de vinblastina por los médicos según las necesidades individuales de los pacientes. Pueden administrarse de 0,1 a 0,3 mg/kg o también pueden administrase de 1,5 a 2 mg/m^{2}. Alternativamente, puede administrarse 0,1 mg/m^{2}, 0,12 mg/m^{2}, 0,14 mg/m^{2}, 0,15 mg/m^{2}, 0,2 mg/m^{2}, 0,25 mg/m^{2}, 0,5 mg/m^{2}, 1,0 mg/m^{2}, 1,2 mg/m^{2}, 1,4 mg/m^{2}, 1,5 mg/m^{2}, 2,0 mg/m^{2}, 2,5 mg/m^{2}, 5,0 mg/m^{2}, 6 mg/m^{2} 8 mg/m^{2}, 9 mg/m^{2}, 10 mg/m^{2}, 20 mg/m^{2}. Por supuesto, todas estas dosificaciones son a modo de ejemplo, y se espera que cualquier dosificación entre estos puntos sea de utilidad en la invención.

iv. Vincristina

La vincristina bloquea la mitosis y produce la detención de la metafase. Parece probable que la mayoría de las actividades biológicas de este fármaco puede explicarse mediante su capacidad para unirse específicamente a la tubulina y para bloquear la capacidad de la proteína de polimerizarse en microtúbulos. A través del trastorno de los microtúbulos del aparato mitótico, la división celular se detiene en la metafase. La incapacidad para segregar cromosomas correctamente durante la mitosis conduce, presumiblemente, a la muerte celular.

La toxicidad relativamente baja de la vincristina para las células de la médula normales y células epiteliales, hace este agente poco común entre los fármacos antineoplásicos, y se incluye a menudo en combinación con otros agentes mielosupresores.

Se ha informado de absorción imprevisible tras la administración oral de vinblastina o vincristina. En las dosis clínicas habituales, la concentración máxima de cada fármaco en plasma, es aproximadamente de 0,4 mM.

La vinblastina y vincristina se unen a las proteínas del plasma. Éstas se concentran exhaustivamente en las plaquetas y en menor grado en leucocitos y eritrocitos. La vincristina tiene un patrón multifásico de eliminación del plasma; la semivida terminal es de aproximadamente 24 horas. El fármaco se metaboliza en el hígado, pero no se ha identificado ningún derivado biológicamente activo. Las dosis deben reducirse en pacientes con disfunción hepática. Se indica al menos una reducción del 50% en la dosificación si la concentración de bilirrubina en plasma es superior a 3 mg/dl (aproximadamente 50 mM).

El sulfato de vincristina está disponible como una disolución (1 mg/ml) para inyección intravenosa. La vincristina usada junto con corticosteroides es en la actualidad el tratamiento elegido para inducir remisiones en leucemia infantil; las dosificaciones óptimas para estos fármacos parecen ser vincristina, por vía intravenosa, 2 mg/m^{2} de área de superficie corporal, a la semana, y prednisona, por vía oral, 40 mg/m^{2}, al día. Los pacientes adultos con la enfermedad de Hodgkin o linfomas distintos a los de Hodgkin normalmente reciben vincristina como parte de un protocolo complejo. Cuando se usa en el régimen MOPP, la dosis recomendada de vincristina es de 1,4 mg/m^{2}. Dosis altas de vincristina parecen tolerarse mejor por niños con leucemia que por adultos, que pueden sufrir toxicidad neurológica grave. La administración del fármaco más frecuentemente que cada 7 días o en dosis más altas, parece incrementar las manifestaciones tóxicas sin mejora proporcional en la tasa de respuesta. También deben tomarse precauciones para evitar la extravasación durante la administración intravenosa de vincristina. La vincristina (y vinblastina) puede infundirse en el suministro sanguíneo arterial de los tumores en dosis varias veces mayores que las que pueden administrarse por vía intravenosa con una toxicidad comparable.

La vincristina ha sido eficaz en la enfermedad de Hodgkin y otros linfomas. Aunque, de algún modo, parece ser menos beneficiosa que la vinblastina cuando se usa sola en la enfermedad de Hodgkin, cuando se usa con mecloretamina, prednisona y procarbazina (el régimen denominado MOPP), es el tratamiento preferido para los estadíos avanzados (III y IV) de esta enfermedad. En linfomas distintos a los de Hodgkin, la vincristina es un agente importante, particularmente cuando se usa con ciclofosfamida, bleomicina, doxorrubicina, y prednisona. La vincristina es más útil que la vinblastina en leucemia linfocítica. Se ha informado de una respuesta beneficiosa en pacientes con una variedad de otros neoplasmas, particularmente tumor de Wilm, neuroblastoma, tumores cerebrales, rabdomiosarcoma y carcinomas de la mama, vejiga, y los sistemas reproductores masculino y femenino.

Se determinarán dosis de vincristina para el uso por los médicos según las necesidades individuales de los pacientes. Pueden administrarse de 0,01 a 0,03 mg/kg o puede administrarse de 0,4 a 1,4 mg/m^{2} o también puede administrarse de 1,5 a 2 mg/m^{2}. Alternativamente pueden administrarse 0,02 mg/m^{2}, 0,05 mg/m^{2}, 0,06 mg/m^{2}, 0,07 mg/m^{2}, 0,08 mg/m^{2}, 0,1 mg/m^{2}, 0,12 mg/m^{2}, 0,14 mg/m^{2}, 0,15 mg/m^{2}, 0,2 mg/m^{2}, 0,25 mg/m^{2} como infusión intravenosa constante. Por supuesto, todas estas dosificaciones son a modo de ejemplo, y se espera que cualquier dosificación entre estos puntos también sea de utilidad en la invención.

f. Nitrosureas

Las nitrosureas, como los agentes alquilantes, inhiben las proteínas reparadoras de ADN. Se usan para tratar linfomas distintos a los de Hodgkin, mieloma múltiple, melanoma maligno, además de tumores cerebrales. Los ejemplos incluyen la carmustina y lomustina.

i. Carmustina

La carmustina (carmustina estéril) es una de las nitrosuresa usadas en el tratamiento de determinadas enfermedades neoplásicas. Es 1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitrosourea. Son laminillas de color amarillo pálido liofilizadas o una masa solidificada con un peso molecular de 214,06. Es altamente soluble en alcohol y lípidos, y poco soluble en agua. La carmustina se administra mediante infusión intravenosa tras la reconstitución como se recomienda.

Aunque generalmente se está de acuerdo en que la carmustina alquila el ADN y ARN, no tiene resistencia cruzada con otros alquilantes. Como con otras nitrosoureas, puede también inhibir varios procesos enzimáticos clave mediante carbamoilación de aminoácidos en proteínas.

Se indica la carmustina como terapia paliativa como agente único o en politerapia establecida con otros agentes de quimioterapia aprobados en tumores cerebrales tales como glioblastoma, glioma del tronco encefálico, medulobastoma, astrocitoma, ependimoma y tumores cerebrales metastásicos. También se ha usado en combinación con prednisona para tratar el mieloma múltiple. Se ha probado que la carmustina es útil en el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin y en linfomas distintos a los de Hodgkin, como terapia secundaria en combinación con otros fármacos aprobados en pacientes que sufren una recaída mientras se tratan con la terapia primaria, o que no responden a la terapia primaria.

La carmustina estéril está disponible comúnmente en viales de dosis única de 100 mg de material liofilizado. La dosis recomendada de carmustina como agente único en pacientes no tratados previamente es de 150 a 200 mg/m^{2} por vía intravenosa cada 6 semanas. Ésta puede administrarse como una dosis única o dividida en inyecciones diarias tales como de 75 a 100 mg/m^{2} en 2 días sucesivos. Cuando se usa carmustina en combinación con otros fármacos mielosupresores o en pacientes en los que la reserva de la médula ósea es reducida, las dosis deben ajustarse en consecuencia. Dosis posteriores a la dosis inicial deben ajustarse según la respuesta hematológica del paciente a la dosis anterior. Se entiende, por supuesto, que pueden usarse otras dosis en la presente invención, por ejemplo 10 mg/m^{2}, 20 mg/m^{2}, 30 mg/m^{2}, 40 mg/m^{2}, 50 mg/m^{2}, 60 mg/m^{2}, 70 mg/m^{2}, 80 mg/m^{2}, 90 mg/m^{2}, 100 mg/m^{2}. Se remite al experto a, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª Edición, capítulo 61. Alguna variación en la dosificación tendrá lugar, necesariamente, dependiendo del estado del sujeto que se está tratando. La persona responsable de la administración, determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para cada sujeto.

ii. Lomustina

La lomustina es una de las nitrosoureas usadas en el tratamiento de determinadas enfermedades neoplásicas. Es 1-(2-cloroetil)-3-ciclohexil-1-nitrosourea. Es un polvo amarillo de fórmula empírica C_{9}H_{16}ClN_{3}O_{2} y un peso molecular de 233,71. La lomustina es soluble en metanol al 10% (0,05 mg por ml) y en alcohol absuluto (70 mg por ml). La lomustina es relativamente insoluble en agua (< 0,05 mg por ml). Está relativamente sin ionizar a pH fisiológico. Componentes inactivos en las cápsulas de lomustina son: estearato de magnesio y manitol.

Aunque generalmente se está de acuerdo en que la lomustina alquila el ADN y ARN, no tiene resistencia cruzada con otros alquilantes. Como con otras nitrosoureas, también puede inhibir varios procesos enzimáticos clave mediante la carbamoilación de aminoácidos en proteínas.

La lomustina puede administrarse por vía oral. Tras la administración por vía oral de lomustina radioactiva a dosis que oscilan desde 30 mg/m^{2} hasta 100 mg/m^{2}, aproximadamente la mitad de la radioactividad administrada se excretó en forma de productos de degradación en un plazo de 24 horas. La semivida del suero de los metabolitos oscila desde 16 horas hasta 2 días. Los niveles de los tejidos son comparables a los niveles del plasma a los 15 minutos después de la administración intravenosa.

La lomustina ha mostrado ser útil como agente único además de otras modalidades de tratamiento, o politerapia establecida con otros agentes de quimioterapia aprobados en tumores cerebrales tanto primarios como metastásicos, en pacientes que ya se han sometido a procedimientos de radioterapia y/o quirúrgicos apropiados. También se ha probado que es eficaz en la terapia secundaria contra la enfermedad de Hodgkin en combinación con otros fármacos aprobados en pacientes que sufren una recaída mientras se tratan con la terapia primaria, o que no responden a la terapia primaria.

La dosis recomendada de lomustina en adultos y niños como agente único en pacientes no tratados previamente es de 130 mg/m^{2} como una dosis oral única cada 6 semanas. En individuos con función de la médula ósea comprometida, las dosis deben reducirse a 100 mg/m^{2} cada 6 semanas. Cuando la lomustina se usa en combinación con otros fármacos mielosupresores, las dosis deben ajustarse en consecuencia. Se entiende que pueden usarse otras dosis por ejemplo, 20 mg/m^{2}, 30 mg/m^{2}, 40 mg/m^{2}, 50 mg/m^{2}, 60 mg/m^{2}, 70 mg/m^{2}, 80 mg/m^{2}, 90 mg/m^{2}, 100 mg/m^{2}, 120 mg/m^{2} o cualquier dosis entre estas cifras según lo determinado por los médicos que es necesario para el individuo que se trata.

g. Agentes varios

Algunos agentes de quimioterapia no se clasifican en las categorías previas en base a sus actividades. Sin embargo, se contempla que se incluyen dentro del método de la presente invención para el uso en politerapias de cáncer con terapia génica que implican formulaciones lipídicas. Incluyen amsacrina, L-asparginasa, tretionina, y factor de necrosis tumoral ((TNF), Tumor Necrosis Factor), algunos de los cuales se discuten a continuación.

i. Factor de necrosis tumoral

El factor de necrosis tumoral (TNF; caquectina) es una glucoproteína que mata algunos tipos de células cancerígenas, activa la producción de citocinas, activa macrófagos y células epiteliales, promueve la producción de colágeno y colagenasas, es un mediador inflamatorio y también un mediador del choque septicémico y promueve el catabolismo, fiebre y sueño. Algunos agentes infecciosos provocan un retroceso del tumor a través de la estimulación de la producción del TNF. El TNF puede ser bastante tóxico cuando se usa solo en dosis eficaces, de modo que probablemente, los regímenes óptimos lo usarán en dosis inferiores en combinación con otros fármacos. Sus acciones inmunosupresoras se potencian mediante el interferón gamma, de modo que la combinación es potencialmente peligrosa. Se ha encontrado también que un híbrido de TNF e interferón-\alpha tienen actividad anticancerígena.

3. Radioterapia

Otros factores que provocan daño en el AND y se han usado exhaustivamente incluyen los que son comúnmente conocidos como rayos \gamma, rayos X, y/o la administración dirigida de radioisótopos a células tumorales. Se contemplan también otras formas de factores que dañan el ADN tales como microondas e irradiación UV. Es más probable que todos estos factores efectúen una amplia gama de daños en el ADN, en los precursores de ADN, en la replicación y reparación de ADN, y en la reunión y mantenimiento de los cromosomas. La dosificación oscila para intervalos de rayos X desde dosis diarias de 50 a 200 roentgenios para periodos de tiempo prolongados (3 a 4 semanas), hasta dosis únicas de 2000 a 6000 roentgenios. Los intervalos de dosificación para radioisótopos varían ampliamente, y dependen de la semivida del isótopo, la fuerza y el tipo de radiación emitida, y de la captación por las células neoplásicas.

Los términos "contactado" y "expuesto", cuando se aplican a una célula, se usan en el presente documento para describir el proceso mediante el que constructo terapéutico y un agente de quimioterapia o radioterapia se administran a una célula diana o se colocan en yuxtaposición directa con la célula diana. Para conseguir estasis o muerte celular, ambos agentes se administran en una célula en una cantidad combinada eficaz para matar la célula o evitar que se divida.

4. Inmunoterapia

Los inmunoterapéuticos, generalmente, se basan en el uso de células y moléculas efectoras inmunes para seleccionar como diana y destruir células cancerígenas. El efector inmune puede ser, por ejemplo, un anticuerpo específico para algún marcador en la superficie de una célula tumoral. El anticuerpo solo puede servir como un efector de terapia o puede reclutar otras células para efectuar realmente la muerte celular. El anticuerpo puede estar conjugado a un fármaco o toxina (de quimioterapia, radionúclido, cadena A de la ricina, toxina del cólera, toxina del pertussis, etc.) y servir solamente como un agente de selección como diana. Alternativamente, el efector puede ser un linfocito que lleva una molécula de superficie que interactúa, o bien directamente o bien indirectamente, con una diana de célula tumoral. Diversas células efectoras incluyen células T citotóxicas y células NK. La transferencia del gen Mda-7 a células tumorales provoca muerte celular y apoptosis. Las células tumorales apoptóticas se rescatan por células reticuloendoteliales que incluyen células dendríticas y macrófagos y están presentes en el sistema inmunitario para generar inmunidad antitumoral (Rovere et al., 1999; Steinman et al., 1999). La forma soluble de la proteína MDA-7 tiene una estructura y actividades similares a la citocina, tales como activación de inmunocitos. La combinación de modalidades terapéuticas, es decir, actividad citotóxica directa y activación inmunitaria mediante MDA-7, proporcionará un beneficio terapéutico en el tratamiento del cáncer.

La inmunoterapia puede usarse también como parte de una terapia combinada, junto con la terapia génica con Ad-mda7. El enfoque general para la terapia combinada se discute a continuación. En un aspecto de la inmunoterapia, la célula tumoral debe tener algún marcador que es responsable de la selección como diana, es decir no está presente en la mayoría de las otras células. Muchos marcadores tumorales existen y cualquiera de ellos puede ser adecuado para seleccionar como diana en el contexto de la presente invención. Marcadores tumorales comunes incluyen antígenos carcinoembrionarios, antígeno específico de la próstata, antígeno asociado al tumor del aparato urinario, antígeno fetal, tirosinasa (p97), gp68, TAG-72, HMFG, antígeno sialil Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de estrógeno, receptor de laminina, erb B y p155. Un aspecto alternativo de la inmunoterapia es combinar el efecto proapoptótico, mediado por el tratamiento con Ad-mda7 con efectos estimulantes inmunitarios. El último puede ser inherente a la proteína MDA-7 soluble. Sin embargo, también existen moléculas estimulantes inmunitarias alternativas que incluyen: citocinas tales como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, IFN-gamma, quimiocinas tales como MIP-1, MCP-1, IL-8 y factores de crecimiento tales como el ligando FLT3. Combinando moléculas estimulantes inmunitarias, o bien como proteínas o bien usando administración génica en combinación con Ad-mda7 aumentará los efectos antitumorales (Ju et al., 2000)

a. Inmunoterapia pasiva

Existen varios enfoques diferentes distintos para la inmunoterapia pasiva. Pueden clasificarse en los siguientes: inyección de anticuerpos solos; inyección de anticuerpos acoplados a toxinas o agentes de quimioterapia; inyección de anticuerpos acoplados a isótopos radiactivos; inyección de anticuerpos antiidiotipo; y finalmente, purgación de células tumorales en la médula ósea.

En inmunoterapia pasiva se emplean preferiblemente anticuerpos monoclonales humanos ya que producen pocos o ningún efecto secundario en el paciente. Sin embargo, su aplicación está limitada de algún modo por su escasez y hasta el momento se han administrado únicamente por vía intralesional. Se han administrado anticuerpos monoclonales humanos para los antígenos gangliósidos por vía intralesional a pacientes que sufren de melanoma recurrente cutáneo (Irie & Morton, 1986). Se observó una regresión en seis de cada diez pacientes, tras inyecciones intralesionales, diarias o semanales. En otro estudio, se consiguió un éxito moderado a partir de inyecciones intralesionales de dos anticuerpos monoclonales humanos (Irie et al., 1989).

Puede ser favorable administrar más de un anticuerpo monoclonal dirigido contra dos antígenos diferentes o incluso anticuerpos con una especificidad múltiple de antígeno. Los protocolos de tratamiento también pueden incluir la administración de linfocinas u otros potenciadores inmunitarios tal como describe por Bajorin et al., (1988). El desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos se describe en con más detalle en otra parte de la memoria descriptiva.

b. Inmunoterapia activa

En la inmunoterapia activa, se administra un péptido antigénico, polipéptido o proteína, o una composición o "vacuna" de células tumorales autólogas o alogénicas, generalmente con un adyuvante bacteriano distinto (Ravindranath & Morton, 1991; Morton & Ravindranath, 1996; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al., 1993). En la inmunoterapia del melanoma, aquellos pacientes que obtienen una respuesta elevada de IgM con frecuencia sobreviven mejor que aquéllos que no obtienen ningún anticuerpo de IgM o pocos (Morton et al., 1992). Los anticuerpos de IgM son con frecuencia anticuerpos transitorios y la excepción a la regla parece ser los anticuerpos antigangliósidos o anticarbohidratos.

c. Inmunoterapia adoptiva

En la inmunoterapia adoptiva, se aíslan in vitro los linfocitos circulatorios del paciente, o linfocitos infiltrados en el tumor, activados por linfocinas tales como IL-2 o transducidos con genes para la necrosis tumoral, y vuelven a administrarse (Rosenberg et al., 1988; 1989). Para conseguir esto, se administraría a un animal, o paciente humano, una cantidad inmunológicamente eficaz de linfocitos activados en combinación con una composición de péptidos antigénicos con adyuvante incorporado tal como se describe en el presente documento. De la manera más preferible, los linfocitos activados serán las propias células del paciente que anteriormente se aislaron a partir de una muestra de sangre o tumor y se activaron (o "expandieron") in vitro. Esta forma de inmunoterapia ha producido diversos casos de regresión de melanoma y carcinoma renal, pero el porcentaje de pacientes que responden fue escaso en comparación con aquéllos que no respondieron.

5. Cirugía

Aproximadamente el 60% de personas con cáncer será sometido a cirugía de algún tipo, lo que incluye la cirugía preventiva, diagnóstica o de estadificación, curativa y paliativa. La cirugía curativa es un tratamiento del cáncer que puede usarse junto con otras terapias, tales como el tratamiento de la presente invención, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia génica, inmunoterapia y/o terapias alternativas.

La cirugía curativa incluye la resección en la que se elimina, extirpa, y/o destruye todo o parte del tejido canceroso. La resección de tumor se refiere a la eliminación física de al menos parte de un tumor. Adicionalmente a la resección del tumor, el tratamiento mediante cirugía incluye la cirugía láser, la criocirugía, la electrocirugía, y la cirugía controlada microscópicamente (cirugía de Moh). También se contempla que puede usarse la presente invención junto con la eliminación de cánceres superficiales, precánceres, o cantidades adicionales de tejido normal.

Tras la escisión de parte de todas las células cancerosas, tejido, o tumor, puede formarse una cavidad en el organismo. El tratamiento puede llevarse a cabo mediante perfusión, inyección directa o aplicación local del área con una terapia anticancerígena adicional. Un tratamiento de este tipo puede repetirse, por ejemplo, cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días, o cada 1, 2, 3, 4 y 5 semanas o cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ó 12 meses. Estos tratamientos también pueden ser de dosis variables.

6. Otras terapias anticancerígenos

Se contempla que pueden usarse otras terapias y agentes en combinación con la presente invención para mejorar la eficacia terapéutica de tratamiento. Estos agentes adicionales incluyen agentes inmunomodulatorios, agentes que afectan la regulación ascendente o receptores de superficie celular y uniones GAP, agentes citostáticos y de diferenciación, inhibidores de la adhesión celular, agentes que aumentan la sensibilidad de las células hiperproliferativas a inductores apoptóticos, u otros agentes biológicos. Los agentes inmunomodulatorios incluyen el factor de necrosis tumoral; interferón alfa, beta, y gamma; IL-2 y otras citocinas; F42K y otros análogos de citocinas; o MIP-1; MIP-1 beta, MCP-1, RANTES, y otras quimiocinas. También se contempla que la regulación ascendente de los receptores de superficie celular o sus ligandos tales como el ligando Fas/Fas, DR4 o DR5/TRAIL (ligando Apo-2) potenciarían las capacidades de inducción de la apoptosis de la presente invención mediante el establecimiento de un efecto autocrino o paracrino en células hiperproliferativas. Los aumentos en la señalización intercelular mediante la elevación del número de uniones GAP incrementarían los efectos antihiperproliferativos sobre la población celular hiperproliferativa contigua. En otras realizaciones, pueden usarse agentes citostáticos o de diferenciación en combinación con la presente invención para mejorar la eficacia antihiperproliferativa de los tratamientos. Se contempla que los inhibidores de la adhesión celular mejoran la eficacia de la presente invención. Ejemplos de inhibidores de la adhesión celular son los inhibidores de la cinasa de adhesión focal (FAK) y la lovastatina. Además se contempla que podrían usarse otros agentes que aumenten la sensibilidad de una célula hiperproliferativa a la apoptosis, tales como el anticuerpo c225, en combinación con la presente invención para mejorar la eficacia del tratamiento.

Otra forma de terapia para su uso junto con la quimioterapia, radioterapia o terapia biológica incluye la hipertermia, que es un procedimiento en el que el tejido de un paciente se expone a altas temperaturas (de hasta 106ºF). Pueden estar implicados dispositivos de calentamiento externos o internos en la aplicación de la hipertermia local, regional o de todo el organismo. La hipertermia local supone la aplicación de calor a un área reducida, tal como un tumor. El calor puede generarse externamente con ondas de alta frecuencia que seleccionan un tumor como diana desde un dispositivo externo al organismo. El calor interno puede implicar una sonda estéril, que incluye hilos finos, calientes o tubos huecos rellenos de agua caliente, una antena de microondas implantada, o electrodos de radiofrecuencia.

Para una terapia regional, se calienta el órgano o la extremidad de un paciente, que se consigue usando dispositivos que producen alta energía, tales como imanes. Alternativamente, puede eliminarse algo de la sangre del paciente y calentarse antes de perfundirse en un área que se calentará internamente. El calentamiento de todo el organismo también puede implementarse en casos en los que el cáncer se ha extendido por todo el organismo. Para este propósito pueden usarse envolturas de agua caliente, cera caliente, bobinas inductivas, y cámaras térmicas.

También puede usarse la terapia hormonal junto con la presente invención o en combinación con cualquier otra terapia contra el cáncer descrita previamente. Puede emplearse el uso de hormonas en el tratamiento de ciertos cánceres tales como el cáncer de mama, próstata, ovarios, o cervicouterino para reducir el nivel o bloquear los efectos de ciertas hormonas tales como la testosterona o el estrógeno. Este tratamiento se usa con frecuencia en combinación con al menos una terapia más contra el cáncer como una opción de tratamiento o para reducir el riesgo de metás-
tasis.

G. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para mostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas descritas en los siguientes ejemplos representan técnicas que el inventor ha descubierto que funcionan bien en la práctica de la invención y por lo tanto puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, a la luz de la presente descripción, los expertos en la técnica deberían apreciar que pueden realizarse diversos cambios en las realizaciones específicas descritas y todavía obtenerse un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención según las reivindicaciones.

Ejemplo 1 Materiales y métodos

Animales. Se adquirieron ratones desnudos BALB/c y ratones Beige/SCID macho y hembra de 3 a 6 semanas de edad de Harlan Inc. (Indianápolis, IN) y Charles River Laboratories, respectivamente. Los animales se alojaron en unidades específicas libres de patógenos del Departamento de Medicina y Cirugía Veterinaria en el Centro Oncológico M. D. Anderson.

Preparación de formulación lipídica. Se prepararon liposomas de DOTAP:colesterol mediante los métodos de Templeton et al. (1997). Brevemente, se mezcló DOTAP (lípido catiónico) con colesterol (lípido neutro) a concentraciones equimolares. Entonces, se disolvió esta mezcla de lípidos en polvo con cloroformo de calidad para HPLC (Mallinckrodt) en un matraz redondo de 1 L. Se secó la disolución lipídica para dar una película delgada a 30ºC durante 30 minutos utilizando un evaporador giratorio Buchi. Se secó adicionalmente el matraz que contenía la película delgada a vacío durante 15 minutos. La película se hidrató en agua que contenía dextrosa al 5% (p/v) para dar una concentración final de DOTAP 20 mM y colesterol 20 mM. Se rotó la película lipídica hidratada en un baño de agua a 50°C durante 45 minutos y luego a 35ºC durante 10 minutos adicionales. La mezcla se dejó en reposo a temperatura ambiente durante toda la noche. Al día siguiente, la mezcla se sonicó durante 5 minutos a 50ºC. Se transfirió la mezcla sonicada a un tubo y se calentó durante 10 minutos a 50°C. Se extruyó la mezcla secuencialmente a través de filtros de jeringa Whatman de tamaño de poro decreciente (1 \mum, 0,45 \mum, 0,2 \mum, 0,1 \mum). El de 0,2 \mum y 0,1 \mum eran filtros Anotop de Whatman. El filtrado se almacenó a 4°C bajo gas argón.

Preparación de complejo lipídico. Se preparó complejo lipídico (complejo de ADN:lípido) el día de la aplicación. Se diluyeron el ADN y los lípidos en dextrosa al 5% en agua para obtener una concentración adecuada de ADN y lípidos. Se mezclaron volúmenes iguales de ADN y lípidos a una concentración para obtener 100 \mug de ADN/lípidos 5 mM/100 \mul mediante la adición rápida de ADN a la superficie de la disolución lipídica seguida de dos expulsiones rápidas hacia arriba y hacia abajo desde una pipeta Pipetman.

Caracterización del complejo lípidico. Se produjeron complejos lipídicos según se describió anteriormente y se sometieron a electroforesis a 60-80 V/cm^{2} a través de gel de agarosa al 0,8% utilizando 1XTBE como tampón de migración a temperatura ambiente durante 1-2 horas. El ADN es visible como una banda teñida con bromuro de etidio característica de plásmido fuente no cortado. El ADN:lípido no es visible con esta técnica debido al tamaño del complejo y su incapacidad para entrar en el gel de azarosa. Se determinó el tamaño medio de partícula mediante dispersión de luz dinámica utilizando un analizador de tamaño de partícula Coulter N4. El tamaño de partícula promedio es de 310-320 nm. Los diversos ADN no alteraron el tamaño de partícula del complejo lipídico.

Reactivos y líneas celulares. Se adquirió DOTAP de Avanti Polar Lipids. Se adquirió colesterol (de alta pureza) de Calbiochem. Las líneas de células tumorales H1299, A549, H322, y H226Br fueron un obsequio del Dr. Adi Gazdar y Dr. John Minna, del Centro Médico de la Universidad del Sudoeste de Texas, Dallas, Tx.

Preparación de células. Ensayo de transfección in vitro. Las células se sembraron en placas a una densidad de 5 x 10^{5} células por 60 mm^{2} en medio RPMI/FBS al 10% y se cultivaron en CO_{2} al 5% a 37°C.

Inyecciones en la vena de la cola. Las células se sembraron en placas a una confluencia de aproximadamente el 20-40% en medio de RPMI/FBS al 10%, complementado con penicilina, estreptomicina y fungizona, y se cultivaron en CO_{2} al 5% a 37°C hasta una confluencia de aproximadamente el 80%. Las células A549 se hicieron crecer y se mantuvieron en medio F12 de Ham en vez de RPMI. Las células se lavaron dos veces con PBS, se tripsinizaron y se contaron. Las células se diluyeron hasta una concentración de 1 x 10^{6} células/200 \mul en PBS.

Inyecciones subcutáneas. Se sembraron en placa las células a una densidad de confluencia de aproximadamente el 20-40% en placas de 150 mm^{2} en medio RPMI/FBS al 10% y se hicieron crecer en CO_{2} al 5% a 37°C hasta una confluencia de aproximadamente el 80%. Las células se lavaron dos veces con PBS, se tripsinizaron y se contaron. Las células se diluyeron hasta una concentración de 5 x 10^{6} células/100 \mul en PBS.

Inducción de tumor sólido mediante inyección subcutánea. Se les inyectó por vía subcutánea a ratones desnudos BALB/c 5 x 10^{6} células tumorales en 100 \mul de PBS.

Inducción de tumor de pulmón mediante inyección en la vena de la cola. Se les inyectó a ratones Beige SCID a través de la vena de la cola 1 x 10^{6} células tumorales en 200 \mul de PBS utilizando una aguja de inyección de calibre 27.

Análisis de la expresión de la proteína p53. Se detectó la expresión de p53 mediante inmunotransferencia de tipo Western de las células transfectadas. Se determinó la expresión de p53 in vivo mediante la tinción inmunohistoquímica de secciones de tumor.

Ejemplo 2 Administración génica in vitro de complejo lipídico a líneas de células tumorales

Se utilizaron estudios de transfección in vitro para demostrar la transferencia génica de complejo lipídico en las líneas de células tumorales utilizadas en estudios posteriores. Se utilizó un complejo de lípido:ácido nucleico que contiene un constructo de expresión que codifica para la proteína fluorescente verde (GFP, complejo lipídico-GFP) como un constructo indicador. Se estudiaron las eficacias de la transferencia génica en las líneas de células tumorales H1299, H322, H226Br, y A549. Se sembraron las líneas celulares en placas tal como se describió anteriormente y se hicieron crecer durante toda la noche. Al día siguiente, se transfectaron las células con 5 \mul de complejo lipídico-GFP (50 \mug/100 \mul de complejo lipídico-GFP) y se hicieron crecer en medio libre de suero durante 3 horas a 37°C en CO_{2} al 5%. Después de una incubación de 3 horas, se aspiró el medio libre de suero y se sustituyó por medio completo. Las células se hicieron crecer durante toda la noche a 37°C en CO_{2} al 5%. Las células se recogieron al día siguiente y se lavaron dos veces con PBS. Las células se resuspendieron en un volumen final de 300 \mul de PBS. Se cuantificó la fluorescencia de GFP utilizando análisis de separación de células asistida por flujo (FACS) (Coulter Corpora-
tion).

Ejemplo 3 Administración génica in vivo en complejo lipídico

Se administró complejo lipídico-\betagal mediante inyección en la vena de la cola en ratones desnudos BALB/c hembra de 3-4 semanas de edad. Se realizaron estudios de transferencia génica de complejo lipídico al pulmón mediante tinción histoquímica e inmunohistoquímica habitual para determinar la expresión de \betagal. A los ratones desnudos se les inyectó (1) Ad-\betagal a 10^{9} ufp, (2) ADN de \betagal 100 \mug/200 \mul de volumen y (3) complejo lipídico-\betagal 100 \mug/lípidos 5 mM en un volumen de 200 \mul. Se sacrificaron los ratones 48 horas después de la inyección y se exsanguinaron. Se recogió tejido de pulmón de cada grupo experimental y se montaron en el compuesto O.C.T. para las criosecciones. Se cortaron los tejidos montados en O.C.T. en secciones de 4-6 \mum de espesor. Las criosecciones se montaron sobre portaobjetos recubiertos de silano, se secaron al aire a temperatura ambiente y se tiñeron histoquímicamente para determinar la expresión de LacZ utilizando sustrato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido (X-Gal) (Sigma) tal como se describió anteriormente (Turner et al. 1990). Después de enjuagar con agua durante 5 minutos, las secciones se contratiñeron con hematoxilina de Meyer (Sigma) o rojo neutro (Fisher), se deshidrataron en etanol, se sumergieron durante 5 minutos en xileno y se montaron bajo cubreobjetos. Se incluyeron animales control no tratados para garantizar la especificidad de la tinción.

Se contaron las células positivas y negativas para la actividad de lacZ bajo un microcopio con un aumento de 200x de manera doble ciega. Los animales tratados con Ad-\betagal presentaron un aumento de células positivas del 4% sobre el fondo. Los animales tratados con complejo lipídico-\betagal presentaron un aumento de células positivas del 11% sobre el fondo. Puede concluirse que la administración in vivo de complejo lipídico-\betagal transfecta a las células de pulmón con una eficacia más alta que lo que hace Ad-\betagal. Estos datos, así como los datos publicados anteriormente confirman la utilidad de los complejos lipídicos para la administración de ácidos nucleicos al pulmón.

Ejemplo 4 Administración in vivo de complejo lipídico-gen P53 a tumores subcutáneos H1299

Para la administración in vivo de complejo lipídico-P53, se les inyectó por vía subcutánea a ratones desnudos BALB/c hembra de 3-4 semanas de edad, 5 x 10^{6} células tumorales H1299 por animal. Los animales se trataron cinco días después de la inyección de H1299 mediante inyección intratumoral de 200 \mul de complejo lipídico-P53 (100 \mug de ADN/lípido 5 mM). Se midieron los tumores cada dos días. Los grupos de tratamiento eran: 1) sin tratamiento 2) inyección intratumoral cada día durante 6 días de complejo lipídico-ADN de P53 (100 \mug en un volumen de 200 \mul) 3) inyección intratumoral cada día durante 6 días de ADN de P53 (100 \mug en un volumen de 200 \mul). Se midió el tamaño del tumor cada dos días durante 16 días. El complejo lipídico-ADN de P53 mostró una inhibición significativa del crecimiento del tumor comparada con sin tratamiento y sólo ADN.

Ejemplo 5 Administración intravenosa de complejo lipídico-gen P53 a metástasis pulmonar de H1299

Se estableció un modelo de tumor de pulmón mediante la inyección de 1 x 10^{6} células tumorales H1299 en 200 \mul de PBS a través de la vena de la cola de ratones Beige/SCID. Tres días después de la inyección, se administraron 100 \mul de complejo lipídico-p53 (50 \mug de ADN/lípidos 5 mM) a través de una inyección en la vena de la cola. Los tratamientos se continuaron cada dos días durante un total de 6 tratamientos. Se sacrificaron los animales el día 21 y se les inyectó tinta china por vía intratraqueal. Se visualizaron los nódulos tumorales pulmonares revelando los pulmones en disolución de Feketes y se contaron mediante inspección visual con la ayuda de un microscopio de disección. Los animales control presentaron aproximadamente 400 nódulos pulmonares. Los animales tratados con complejo lipídico-p53 presentaron aproximadamente 10 nódulos pulmonares por animal. La administración de complejo lipídico-P53 a través de una inyección en la vena de la cola redujeron significativamente la formación de tumores en los pulmones de ratones Beige/SCID.

Ejemplo 6 Administración intravenosa de complejo lipídico-gen P53 y análisis de la expresión del gen P53 en tumores subcutáneos H1299

Se estableció un modelo de tumor subcutáneo mediante la inyección de 5 x 10^{6} células tumorales H1299 en 100 \mul de PBS en ratones desnudos BALB/c. Se administró a los ratones 100 \mul de complejo lipídico-p53 (50 \mug de ADN) a través de la vena de la cola 5 días después de la inyección subcutánea de células tumorales. Se sacrificaron los animales 24 horas después del tratamiento y se recogieron tejidos. Se recogieron tejidos de pulmón, bazo e hígado y se fijaron en formalina. Se analizaron las secciones de tejido utilizando tinción inmunohistoquímica habitual para la proteína P53. La inmunotinción detectó niveles significativos de expresión de la proteína P53 en células tumorales. La ausencia de tratamiento y ADN de p53 solo no dieron como resultado proteína P53 detectable.

Ejemplo 7 Administración de complejo lipídico-P53 potenciada por selección de diana a células tumorales resistentes a la transfección por el complejo lipídico-P53

Aunque las células H1299 se transfectaron fácilmente in vitro con complejo lipídico-\betagal, otras líneas celulares fueron resistentes. Se ha demostrado anteriormente que las líneas de células tumorales H322, H226Br, y A549 presentan frecuencias de transfección de complejo lipídico bajas. En un intento de potenciar la transfección de líneas celulares resistentes, se asociaron restos de selección de péptidos cíclicos o anticuerpos como diana con el complejo lipídico-\betagal. El resto de selección de anticuerpos como diana es un anticuerpo monoclonal anti-receptor de EGF. El resto de selección de péptidos como diana es un péptido cíclico que contiene en su secuencia un motivo de unión a integrina RGD. Estos restos de selección como diana se asociaron de manera no covalente con el complejo lipídico. Se contempla que una unión covalente del resto de selección como diana potenciará adicionalmente la eficacia de selección como del complejo lipídico. Los complejos lipídicos con restos de selección como diana asociados mostraron una transfección potenciada de células A549 in vitro comparado con complejos lipídicos sin restos de selección como diana.

Ejemplo 8 Materiales y métodos

Materiales. Se adquirieron todos los lípidos (DOTAP, DOPE, colesterol) de Avanti Polar Lipids (Albaster, AL). El medio RPMI-1640, el medio Ham/F12 y el suero bovino fetal (FBS) se adquirieron de GIBCO-BRL-Life Technologies (Nueva York, NY). El anticuerpo FHIT de conejo antihumano policlonal y el anticuerpo p53 de ratón antihumano monoclonal (BP53.12) se obtuvieron de Zymed Laboratories (San Francisco, CA) y Santa-Cruz Biotechnology, Inc. (Palo Alto, CA) respectivamente.

Líneas celulares y animales. Las líneas celulares de carcinoma de pulmón de células no pequeñas humano, H1299 (p53^{nulo}/FHIT^{-}) y A549 (p53^{+}/FHIT^{-}) se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo y se mantuvieron en medio RPMI-1640 y Hams-F12 complementado con FBS al 10%, glutamato al 1% y antibióticos. Se obtuvo la línea celular de fibrosarcoma murino, 2337m, que es mutante para p53 murino del Dr. Isaiah J. Fidler, Centro Oncológico M.D. Anderson y se mantuvo en DMEM complementado con FBS al 10%. Se hicieron pasar regularmente y se sometieron a prueba las células para determinar la presencia de micoplasma. Los ratones C3H hembra de 4-6 semanas de edad (NCI, Frederick, MD), los ratones desnudos (nu/nu) BALB/c (Harlan-Sprague Dawley Inc., Indianápolis, IN), y los ratones SCID/Beige (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) que se utilizaron en el estudio se mantuvieron en un entorno libre de patógenos y se manipularon según las directrices institucionales establecidas para el cuidado y el uso de animales.

Síntesis de liposomas y preparación de la mezcla de ADN: liposomas

Se sintetizaron y extruyeron liposomas (DOTAP 20 mM:Chol, y DOTAP 20 mM:DOPE) a través de filtros Whatman (Kent, Reino Unido) de tamaño decreciente (1,0, 0,45, 0,2, y 0,1 \mum) tal como se describió anteriormente (Templeton, 1997). Se almacenaron los liposomas sintetzados bajo gas argón a 4°C. Se prepararon nuevos los complejos de ADN:liposomas dos o tres horas antes de la inyección en la vena de la cola en los ratones. Brevemente, se mezclaron en volúmenes iguales disolución madre de DOTAP:Chol (20 mM) o DOTAP:DOPE (20 mM) y disolución madre de ADN diluido en dextrosa al 5% en agua (D5W) para dar una concentración final de DOTAP:Chol 4 mM-150 \mug de ADN en un volumen final de 300 \mul (razón 1:2,6) ("Chol" se refiere al colesterol). La disolución y el mezclado de todos los reactivos se realizó a temperatura ambiente. Los reactivos se mezclaron suavemente en un tubo Eppendorf de 1,5 ml por pipeteado. Se añadió la disolución de ADN en la superficie del liposoma y se mezcló rápidamente arriba y abajo dos veces con la punta de la pipeta. La mezcla de ADN:liposomas así preparada estaba libre de precipitados y se utilizó para todos los experimentos in vivo.

Análisis de la medición de tamaño de partícula. Se analizaron complejos de ADN-liposomas preparados recientemente para determinar el tamaño medio de partícula utilizando el analizador de tamaño de partícula N4 (Coulter, Miami, FL). El tamaño medio de partícula promedio de los complejos de ADN-liposomas osciló entre 300-325
nm.

Eficacia de transfección in vivo en tumores subcutáneos, pulmón normal y pulmones portadores de tumores. Antes de comenzar el experimento, los ratones nu/nu se sometieron a 3,5 Gy de irradiación corporal total utilizando una fuente de cesio según las directrices institucionales. A continuación, a los ratones se les inyectó por vía subcutánea células tumorales H1299 de gen p53 nulo (5 x 10^{6}/100 \mul de PBS) en el costado derecho. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 4-5 mm^{3}, se les inyectó una dosis única de complejo de DOTAP:Chol-ADN:liposoma (100 \mug de ADN de Lac-Z) por vía intratumoral. Cuarenta y ocho horas después de la inyección, se sacrificaron los ratones mediante inhalación de CO_{2} y se extirparon y analizaron los tumores histoquímicamente para determinar la expresión de \beta-galactosidasa (Couffinhal, 1997). Se cortaron los tumores en secciones de 4 \mum de espesor, se tiñeron para \beta-galactosidasa y se evaluaron mediante microscopía óptica.

Se determinó la expresión de proteína FHIT y p53 en tumores mediante el análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Brevemente, se recogieron tumores subcutáneos H1299 a los que se les inyectó complejo de DOTAP:Chol-ADN:liposoma (100 \mug de ADN de Lac-Z, CAT, p53, y FHIT) a las 48 horas y se homogeneizaron en tampón de Laemelli. Se determinó la concentración de proteína utilizandon el reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Fremont, CA) y se analizaron 50 \mug de proteína total mediante electroforesis SDS-PAGE. Se detectaron las proteínas p53 y Fhit utilizando el anticuerpo p53 de ratón antihumano (BP53.12) y anticuerpo FHIT de conejo antihumano tal como se descrbió anteriormente (Ji et al., 1999; Hamada et al., 1996; Sozzi et al., 1997).

Para determinar la eficacia de transfección en pulmones normales, se les inyectó a los ratones complejos de DOTAP:Chol-ADN de Lac-Z o p53:liposoma por vía intravenosa (i.v.) a través de la vena de la cola. Cuarenta y ocho horas después de la inyección, se sacrificaron los animales mediante inhalación de CO_{2} y se recogieron los pulmones y se congelaron rápidamente para el análisis de \beta-galactosidasa o se fijaron en formalina para el análisis de p53. Se cortaron y analizaron las secciones de tejido histoquímicamente (\beta-gal) o inmunohistoquímicamente (p53) tal como se describió anteriormente (Couffinhal, 1997). Para determinar la eficacia de transfección en tumores de pulmón in vivo, se les inyectó a los ratones desnudos 1 x 10^{6} células tumorales A549 suspendidas en 200 \mul de PBS i.v. a través de la vena de la cola. De dos a tres semanas más tarde, se inyectó una dosis única de complejo de ADN de Lac-Z o FHIT-DOTAP:Chol:liposoma (50 \mug) o ADN de plásmido desnudo (50 \mug) a través de la vena de la cola. Se recogieron los pulmones cuarenta y ocho horas más tarde y se analizaron para determinar la expresión de proteína mediante análisis histoquímico (\beta-gal) o inmunohistoquímico (Fhit) (Couffinhal, 1997; Sozzi et al., 1997).

Evaluación del crecimiento del tumor y tratamientos in vivo . Antes de comenzar todos los experimentos que involucran al crecimiento y tratamientos de tumores subcutáneos, se irradiaron ratones nu/nu (3,5 Gy) utilizando una fuente de cesio para potenciar la captación de los tumores. En todos los experimentos, se les inyectó 5 x 10^{6} células tumorales (H1299, A549) suspendidas en 100 \mul de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en el costado dorsal derecho. Cuando el tumor alcanzó un tamaño de 4-5 mm^{3}, se aleatorizaron los animales en grupos y se inició el tratamiento. Se realizaron inyecciones intratumorales bajo anestesia utilizando metoxiflurano (Schering Plough, Kenilworth, NJ) según directrices institucionales. Se registraron mediciones del tumor cada dos días sin conocer los grupos de tratamiento, y se calculó el volumen utilizando la fórmula V (mm^{3}) = a x b^{2}/2, en la que "a" es la dimensión más grande y "b" el diámetro perpendicular (Georges et al., 1993). Se presentaron los datos de eficacia antitumoral como volúmenes de tumor acumulativos para todos los animales en cada grupo para tener en cuenta tanto el tamaño como el número de tumores.

Para los experimentos de p53, se dividieron los animales portadores de tumores H1299 tumor en tres grupos. Se trataron grupos de ocho animales de la siguiente manera: el grupo 1 no recibió tratamiento, el grupo 2 recibió ADN de plásmido de p53 (100 \mug/dosis) y el grupo 3 recibió el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma (100 \mug/dosis) diariamente para un total de seis dosis. En un experimento separado pero idéntico, se incluyó un grupo control adicional que recibió complejo de DOTAP:Chol-ADN de pAd:liposoma. Todas las demás condiciones experimentales y programas de tratamiento fueron idénticos.

Para los experimentos de FHIT, se establecieron tumores subcutáneos H1299 y A549 en ratones desnudos. Para cada tipo de tumor, se establecieron cuatro grupos de tratamiento que comprendieron siete animales por grupo. Los grupos de tratamiento incluyeron: el grupo 1 no recibió tratamiento, el grupo 2 recibió ADN de plásmido de FHIT (100 \mug/dosis), el grupo 3 recibió complejo de DOTAP:Chol-ADN de CAT:liposoma (100 \mug/dosis) y el grupo 4 recibió complejo de DOTAP:Chol-ADN de FHIT:liposoma (100 \mug/dosis). Se trataron los animales diariamente para un total de seis dosis. En todos los experimentos, se determinaron las diferencias estadísticas en el tamaño del tumor utilizando la prueba de la t de Student.

Evaluación de metástasis de pulmón y tratamientos in vivo . Para establecer las metástasis de pulmón, se les inyectó a ratones SCID/Beige hembra por vía intravenosa a través de la vena de la cola 10^{6} células tumorales H1299 suspendidas en 200 \mul de PBS estéril. Tres días más tarde, se dividieron los ratones en seis grupos y se trataron tal como sigue: sin tratamiento (grupo 1), ADN de plásmido de p53 desnudo (grupo 2), complejo de DOTAP-DOPE-ADN de p53:liposoma (grupo 3), complejo de DOTAP:Chol-ADN de CAT DNA:liposoma (grupo 4), complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma no extruido (grupo 5) y complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma (grupo 6). Había ocho ratones en cada grupo. Se trataron los ratones con 50 \mug de ADN de plásmido o 50 \mug de complejo de ADN:liposoma i.v. a través de la vena de la cola utilizando una aguja de calibre 27 diariamente para un total de seis dosis. Dos semanas después de la última dosis, se sacrificaron los animales mediante inhalación de CO_{2}. Se les inyectó a los pulmones de cada uno de los ratones de los seis grupos tinta china por vía intratraqueal y se fijaron en disolución de Feketes (Kataoka et al., 1998). Se determinó el efecto terapéutico del tratamiento sistémico con gen p53 contando el número de tumores metastásicos en cada pulmón bajo un microscopio de disección sin conocer los grupos de tratamiento. Se analizaron los datos y se interpretaron como estadísticamente significativos si el valor de p era < 0,05 mediante la prueba de la suma de rangos de Mann-Whitney.

Se utilizó el modelo de tumor A549 para determinar el efecto terapéutico de los genes supresores de tumores p53 y FHIT sobre células tumorales de pulmón p53 de tipo natural. Se les inyectó a los ratones (nu/nu) células tumorales A549 (1 x 10^{6}) i.v. a través de la vena de la cola. El día 6, se dividieron los ratones en cuatro grupos (n=6 ó 8 animales por grupo) y recibieron el siguiente tratamiento. El grupo 1 no recibió tratamiento, el grupo 2 recibió ADN de plásmido de p53 o FHIT, el grupo 3 recibió complejo de DOTAP:Chol-ADN de CAT:liposoma extruido y el grupo 4 recibió complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma extruido o DOTAP:Chol-ADN de FHIT:liposoma. Se trataron los animales diariamente para un total de seis dosis (50 \mug/dosis). Después de la última dosis, se sacrificaron los ratones y se determinó el efecto terapéutico de los tratamientos con complejo de ADN de p53:liposoma y del complejo de ADN de FHIT:liposoma tal como se describió para el modelo H1299/SCID/Beige.

Análisis inmunohistoquímico. Se recogieron tumores subcutáneos H1299 establecidos en ratones nu/nu que o bien no se habían tratado o se habían tratado con ADN de plásmido de p53 o tratado con complejo de ADN de p53:liposoma y se fijaron en formalina tamponada al 4%, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 \mum de espesor. Se tiñeron las secciones de tejido para determinar la expresión del gen p53 tal como se describió anteriormente (Fujiwara et al., 1993; Fujiwara et al., 1995). Se analizó el número de células tumorales que se tiñeron de manera positiva para p53 con microscopía de campo claro y se cuantificó sin conocimiento previo de los grupos de tratamiento. Se analizaron un total de al menos cinco campos por muestra. Para determinar el destino de las células tumorales tras el tratamiento, se tiñeron los tumores subcutáneos y las secciones de pulmón portadoras de tumor para determinar la muerte celular apoptótica utilizando desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt) (Boehringer Mannheim) y se contratiñeron con azul de metileno o verde de metilo tal como se describió anteriormente (Fujiwara et al., 1993; Fujiwara et al., 1995). En todos los procedimientos de tinción, se incluyeron controles negativos apropiados.

Histopatología. Para determinar el efecto terapéutico del gen p53 sobre tumores de pulmón metastásicos, se recogieron pulmones portadores de tumores de ratones nu/nu a los 21 días después del tratamiento y se evaluaron histopatológicamente para determinar el tamaño de tumor, viabilidad e índice mitótico. Un patólogo sin concomiendo previo de los grupos de tratamiento realizó el análisis.

Experimentos de supervivencia. Para determinar la eficacia del tratamiento sistémico, se realizaron experimentos de supervivencia utilizando los dos modelos de tumor de pulmón metastásico (H1299, A549). Brevemente, se les inyectó a los ratones SCID/Beige hembra 10^{6} células tumorales H1299 a través de la vena de la cola. Seis días más tarde, se dividieron los ratones en cuatro grupos de seis ratones cada uno tal como sigue: el grupo 1 no recibió tratamiento, el grupo 2 recibió ADN de plásmido de p53, el grupo 3 recibió complejo de DOTAP:Chol-ADN de CAT:liposoma y el grupo 4 recibió DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma. El programa de tratamiento consistió en seis inyecciones diarias de ADN de plásmido desnudo o complejo de ADN:liposoma en volúmenes de 100 \mul (50 \mug de ADN/dosis). Se monitorizaron los ratones diariamente después de la última inyección. Los animales moribundos se sacrificaron mediante inhalación de CO_{2}. Se extirparon los pulmones, corazón, hígado, bazo, cerebro, riñón, colon, ovarios, páncreas y hueso de cada animal y se analizaron histopatológiamente para determinar la presencia de tumores diseminados y la toxicidad asociada al tratamiento. Se analizaron las diferencias estadísticas en curvas de supervivencia actuarial utilizando las pruebas de estimación de supervivencia de Kaplan-Meier y de rangos con signo de
Wilcoxon.

Se utilizó el modelo de tumor metastásico A549 para evaluar el efecto del complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma sobre tumores que tienen el gen p53 de tipo natural. Brevemente, se les inyectó a ratones nu/nu 10^{6} células tumorales A549 i.v. a través de la vena de la cola. Seis días más tarde, se dividieron los ratones en cuatro grupos (grupos 1 a 4) de siete ratones cada uno. Las condiciones experimentales y el programa de tratamiento eran idénticos a los utilizados para el modelo de tumor de pulmón H1299-SCID/Beige. Se calculó el efecto de administrar complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma complejo sobre la supervivencia utilizando la prueba de estimación de supervivencia de Kaplan-Meier y de rangos de Wilcoxon.

Análisis estadístico: Se calculó la significación estadística de los resultados experimentales utilizando la prueba de la t de Student para las mediciones del tumor, la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney para metástasis de pulmón, la prueba de rangos logarítmicos de Wilcoxon y la prueba de supervivencia de Kaplan-Meier para los experimentos de supervivencia de los animales.

Ejemplo 9 Transfección in vivo en pulmón normal, xenoinjertos de tumor primario y tumores de pulmón metastásicos experimentales

Se determinó la capacidad de los liposomas de DOTAP:Chol extruidos para transfectar y administrar eficazmente ADN de plásmido en pulmón normal, xenoinjertos de tumor de pulmón subcutáneo y tumores de pulmón metastásicos experimentales usando plásmidos de expresión que codifican para \beta-galactosidasa bacteriana (Lac-Z), p53 humano, o proteína Fhit humana. 48 horas tras una única inyección i.v. en la vena de la cola de liposomas de DOTAP:Chol complejados con ADN de plásmido de Lac-Z o ADN de plásmido de p53 humano (50 \mug de ADN) que eran de 300-325 nm de tamaño, se observó en gran parte que las células epiteliales alveolares (neumocitos de tipo II) y las células endoteliales del pulmón producían \beta-galactosidasa o proteína p53. Algunos macrófagos alveolares expresaron el transgén. Por el contrario, no se observó expresión génica en animales a los que se les inyectó ADN de plásmido de p53 desnudo (50 \mug).

Para determinar si podría conseguirse expresión génica también en tumores primarios sólidos, se establecieron tumores de pulmón H1299 humano por vía subcutánea en ratones desnudos. Cuarenta y ocho horas tras una inyección intratumoral única de complejo de DOTAP:Chol:ADN de LacZ:liposoma, el 25% de las células tumorales produjeron \beta-galactosidasa, tal como se muestra mediante tinción histoquímica. Por el contrario, no se observó producción de \beta-galactosidasa en los tumores control no tratados. La inyección intratumoral de liposomas de DOTAP:Chol complejados a FHIT (50 \mug de ADN) dio como resultado la producción de proteína Fhit, tal como se determinó mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Los animales a los que se les inyectaron liposomas de DOTAP:Chol complejados a ADN de CAT sirvieron como controles. De manera similar, se observó la expresión de la proteína p53 mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western.

Se evaluó también la capacidad para transfectar tumores metastásicos de pulmón A549 humanos experimentales establecidos en ratones desnudos. Una única inyección en la vena de la cola de liposomas de DOTAP:Chol complejados a ADN de plásmido de FHIT o Lac-Z (50 \mug) en ratones portadores de tumor de pulmón dio como resultado que un 10% de las células tumorales produjesen \beta-galactosidasa y proteína Fhit a las 48 horas.

Ejemplo 10 Evaluación in vivo de la supresión del crecimiento tumoral local por P53 y FHIT

Se evaluó la capacidad del complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma para suprimir el crecimiento de tumores subcutáneos de pulmón humanos H1299 de gen p53 nulo en ratones nu/nu. Se dividieron los ratones portadores de tumor en tres grupos: uno sin recibir tratamiento, uno con tratamiento con ADN de plásmido de p53 desnudo y uno con tratamiento con el complejo de liposoma de DOTAP:Chol-ADN de p53 diariamente para un total de seis dosis (100 \mug/dosis). Se inhibió significativamente el crecimiento del tumor (p = 0,001) en ratones tratados con el complejo de liposoma de DOTAP:Chol-p53 (figura 1a) en comparación con el crecimiento del tumor en los grupos sin tratamiento y control con ADN de plásmido de p53.

Para demostrar adicionalmente los efectos supresores de tumor específicos del gen p53 administrado mediante liposomas de DOTAP:Chol, en un conjunto separado de experimentos, se dividieron los animales portadores de tumor H1299 subcutáneo en tres grupos, uno sin recibir tratamiento, uno con tratamiento con liposoma de DOTAP:Chol complejado a ADN de plásmido irrelevante (pAd) y uno con tratamiento con el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53 diariamente para un total de seis dosis (100 \mug/dosis). No se observó una inhibición significativa del crecimiento del tumor en animales que o bien no se trataron o bien se trataron con el liposoma de DOTAP-Chol complejado a ADN de plásmido irrelevante (figura 1b). Por el contrario, los animales tratados con el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma mostraron una inhibición del tumor significativa (p = 0,01).

Se obtuvo una evidencia adicional de que el efecto terapéutico observado era debido a la expresión del gen p53 extirpando los tumores subcutáneos 48 horas tras la inyección y analizándolos para determinar la expresión del gen p53 mediante inmunohistoquímica. Se observó la expresión del gen p53 en el 39% de las células tumorales en los animales que recibieron el complejo de liposoma de DOTAP:Chol-p53, (figura 1c) (p = 0,001), en comparación con el porcentaje de tumores control que o bien no se trataron o bien se trataron con ADN de plásmido de p53. El análisis de la muerte de células tumorales apoptótica mostró que el 32% de las células tumorales en los ratones que recibieron el complejo de liposoma de DOTAP:Chol-p53 fueron positivas en estudios TUNEL (p = 0,001) (figura 1d). Los tumores de ratones control que o bien no se trataron o bien se trataron con ADN de plásmido de p53 mostraron una muerte celular apoptótica mínima (figura 1d).

De manera similar, se evaluó el efecto terapéutico del gen supresor de tumores FHIT sobre tumores subcutáneos H1299 y A549 en ratones desnudos. Los ratones portadores de cada tipo de célula tumoral (H1299 y A549) se dividieron en cuatro grupos: uno que no recibió tratamiento, uno con tratamiento con ADN de plásmido de FHIT desnudo, uno con tratamiento con complejo de liposoma de DOTAP:Chol-ADN de CAT, y uno con tratamiento con el complejo de liposoma de DOTAP:Chol-ADN de FHIT diariamente para un total de seis dosis (100 \mug/dosis). Se observó una inhibición del crecimiento significativa de los tumores H1299 (p = 0,02) (figura 1E) y los tumores A549 (p = 0,001) (figura 1F) en ratones tratados con el complejo de liposoma de DOTAP:Chol-ADN de FHIT comparado con el crecimiento del tumor en los tres grupos control para cada tipo de tumor.

Ejemplo 11 Evaluación in vivo de ADN plásmido de P53 y FHIT complejado a liposomas de DOTAP:Chol para el tratamiento de metástasis de pulmón experimental

Se comparó la eficacia de liposomas extruidos de DOTAP:Chol, con respecto a liposomas no extruidos de DOTAP:Chol, y otra formulación de liposoma convencional (DOTAP:DOPE) en un modelo de xenoinjerto terapéutico de metástasis de pulmón humano usando las células cancerígenas de pulmón humano H1299 y A549. Hubo una reducción significativa (p < 0,001) en el número de metástasis en los pulmones de ratones SCID/BEIGE portadores de tumor H1299 de gen p53 nulo que recibieron el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma extruido (figura 2a) en comparación con el número en los ratones que no recibieron tratamiento, ADN de plásmido de p53, el complejo de DOTAP:Chol-ADN de CAT:liposoma extruido, el complejo DOTAP:DOPE-ADN de p53:liposoma, o el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma no extruido. Además, se inhibió el crecimiento del tumor metastásico en los animales tratados con el complejo de DOTAP:Chol-ADN de CAT:liposoma extruido y el complejo DOTAP:DOPE-ADN de p53:liposoma comparado con el crecimiento del tumor en ratones que no recibieron tratamiento, ADN de plásmido de p53, el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53 no extruido. Sin embargo, los efectos inhibidores del tumor fueron mínimos.

Para determinar si los efectos inhibidores del tumor mediados por el gen p53 observados se restringían a tumores con gen p53 mutado o nulo, se estudiaron los efectos del complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma en células tumorales A549, que son homocigóticas para el gen p53 de tipo natural y forman metástasis de pulmón tras la inyección en la vena de la cola en ratones nu/un. Se observó una reducción significativa (p = 0,001) en el número de metástasis en los ratones tratados con el complejo DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma extruido comparado con el número de metástasis en ratones control que o bien no se trataron o bien se trataron con el complejo DOTAP:Chol-ADN de CAT:liposoma (figura 2b), descartándose así la posibilidad de que la inhibición mediada por el gen p53 se limitara a tumores con el gen p53 mutado o nulo. No se observó diferencia significativa en el número de metástasis entre los dos grupos control.

También se evaluó la capacidad del gen supresor de tumores FHIT para inhibir metástasis de pulmón formadas por células tumorales A549 en ratones desnudos. Se observó una reducción significativa (p = 0,007) en el número de metástasis tumorales en los animales tratados con el complejo de DOTAP:Chol-ADN de FHIT:liposoma (figura 2c). Por el contrario, los animales control que no se trataron, se trataron con ADN de plásmido de FHIT, o se trataron con el complejo DOTAP:Chol-ADN de FHIT:liposoma no mostraron una reducción significativa en el número de metástasis tumorales.

Ejemplo 12 El tratamiento de tumores de pulmón con complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53: liposoma da como resultado muerte apoptótica de células tumorales

Para determinar el destino de las células tumorales tras el tratamiento con el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma, se analizaron histológicamente tumores de pulmón A549 de ratones nu/nu y se evaluó la muerte celular apoptótica mediante tinción TUNEL. El examen histopatológico de las secciones de pulmón de ratones tratados con el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma mostró la presencia de muy pocas metástasis que eran pequeñas y contenían sólo unas cuantas células tumorales viables. Además, el número de metástasis tumorales en los pulmones de estos animales fue significativamente menor que en los animales control. Además, se había producido muerte celular apoptótica en estos tumores, tal como se demostró mediante tinción TUNEL. Por el contrario, los pulmones de los ratones control que no recibieron tratamiento mostraron varios tumores grandes con numerosas mitosis y sin evidencia de muerte celular apoptótica.

Ejemplo 13 Supervivencia animal en un modelo de cáncer de pulmón humano diseminado

Para determinar la eficacia del complejo de gen supresor de tumores liposomal extruido administrado de manera sistémica, se realizaron experimentos de supervivencia usando los modelos de tumor con metástasis de pulmón H1299 y A549. Se dividieron ratones SCID/BEIGE portadores de tumor de pulmón H1299 en cuatro grupos, tal como sigue: sin tratamiento (grupo 1), ADN de plásmido de p53 (grupo 2), complejo de DOTAP:Chol-ADN de CAT:liposoma (grupo 3), y complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma (grupo 4). Se inyectó a los animales diariamente a través de la vena de cola para un total de seis dosis (50 \mug/dosis) y se monitorizaron diariamente tras el último tratamiento para evaluar la morbimortalidad. Los ratones de los grupos 1, 2, y 3 murieron debido a la carga tumoral entre 30 y 60 días tras la inyección de células tumorales (tiempo de supervivencia medio: 38 días en el grupo 1, 40 días en el grupo 2 y 41 días en el grupo 3). Por el contrario, los ratones tratados con el complejo de DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma (grupo 4) sobrevivieron durante un periodo significativamente más largo (supervivencia media: 76 días; p = 0,001). De hecho, el 33% de los ratones del grupo 4 estaban todavía vivos en el día 150 al final del experimento (figura 3a). Los análisis postmortem de los órganos de los animales en los cuatro grupos no mostraron toxicidad relacionada con el tratamiento. Sin embargo, se reveló diseminación de los tumores de pulmón a múltiples órganos y sitios que incluyeron los ganglios linfáticos cervicales, intestino, ganglios linfáticos mesentéricos, hígado, riñón, bazo, páncreas, glándulas suprarrenales, ovarios, útero, cavidad peritoneal con ascitis y hueso.

También se evaluó la supervivencia en ratones nu/nu portadores de tumor de pulmón A549. Tras la inyección de células tumorales, se dividieron los animales en cuatro grupos, tal como sigue: sin tratamiento (grupo 1), ADN de plásmido p53 (grupo 2), complejo de DOTAP:Chol-ADN de CAT:liposoma (grupo 3), y complejo de DOTAY:Chol-ADN de p53:liposoma (grupo 4). El programa de tratamiento fue idéntico al seguido en el modelo H1299/SCID/BEIGE. Los ratones en el grupo 4, que recibieron el complejo DOTAP:Chol-ADN de p53:liposoma, mostraron una supervivencia prolongada (supervivencia media, 96 días; p = 0,04) en comparación con los tres grupos control (supervivencia media: 50 días en el grupo 1, 49 días en el grupo 2, y 52 días en el grupo 3) (figura 3b). Los análisis histopatológicos de diversos órganos revelaron una extensa difusión tumoral en los pulmones de los cuatro grupos de animales, pero no se observó la diseminación a otros órganos en los animales de ninguno de los cuatro grupos. Además, no se observó toxicidad relacionada con el tratamiento en los animales de ninguno de los cuatro grupos.

Todas las composiciones y métodos descritos y reivindicados en el presente documento pueden realizarse y ejecutarse sin excesiva experimentación a la luz de la presente descripción. Aunque los métodos y composiciones de esta invención se han descrito en cuanto a las realizaciones preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que pueden aplicarse variaciones a los métodos y composiciones y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito en el presente documento sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención según las reivindicaciones. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes, que están tanto química como fisiológicamente relacionados, pueden sustituirse por los agentes descritos en el presente documento mientras se logren resultados iguales o similares. Todos los sustitutos y modificaciones similares de este tipo evidentes para los expertos en la técnica se consideran que están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención, según se define en las reivindicaciones adjuntas.

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Las siguientes referencias, en el grado en el que proporcionan procedimientos ejemplos u otros detalles suplementarios a los expuestos en el presente documento, se incorporan específicamente en el presente documento como referencia.

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Claims (41)

1. Uso de una formulación lipídica extruida farmacéuticamente aceptable que comprende DOTAP y al menos uno de colesterol o un derivado de colesterol o una mezcla de colesterol en combinación con un ácido nucleico bajo el control de un promotor y que codifica para un polipéptido antiproliferativo, en la fabricación de un medicamento para estimular o provocar la apoptosis en células cancerígenas, en el que el polipéptido antiproliferativo es una proteína supresora de tumores seleccionada de Rb, p53, p14,p15, p16, p19, INK4c, p21, p27, p73, una fusión p16-p27, una fusión p21-p27, p56^{RB}, E2F-1, NOEY2, DCC, APC, NF-1, NF-2, PTEN, FHIT, C-CAM, E-cadherina, MEN-I, MEN-II, ZAC1, VHL, FCC, MCC, PMS1, PMS2, MLH-1, MSH-2, DPC4, BRCA1, BRCA2, mda-7, DBCCR-1 o WT-1.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la formulación comprende DOTAP en una concentración que varía desde 1 hasta 8 mM.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que la formulación comprende DOTAP en una concentración que varía desde 2 hasta 7 mM.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que la formulación comprende DOTAP en una concentración que varía desde 3 hasta 6 mM.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que la formulación comprende DOTAP en una concentración desde 4 hasta 5 mM.

6. Uso según la reivindicación 1, en el que la formulación comprende el colesterol o el derivado de colesterol o la mezcla de colesterol en una concentración que varía desde 1 hasta 8 mM.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que la formulación comprende el colesterol o el derivado de colesterol o la mezcla de colesterol en una concentración que varía desde 2 hasta 7 mM.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que la formulación comprende el colesterol o el derivado de colesterol o la mezcla de colesterol en una concentración que varía desde 3 hasta 6 mM.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que la formulación comprende el colesterol o el derivado de colesterol o la mezcla de colesterol en una concentración desde 4 hasta 5 mM.

10. Uso según la reivindicación 1, en el que la formulación incluye el DOTAP y se incluyen el colesterol o el derivado de colesterol o la mezcla de colesterol en una razón molar de desde 3:1 hasta 1:3.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que la formulación incluye el DOTAP y se incluyen el colesterol o el derivado de colesterol o la mezcla de colesterol en una razón molar de 1:1.

12. Uso según la reivindicación 1, en el que el polipéptido supresor de tumores es p53.

13. Uso según la reivindicación 1, en el que la composición comprende además un resto de selección como diana.

14. Uso según la reivindicación 13, en el que el resto de selección como diana es un péptido, un ligando, o un anticuerpo.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que el resto de selección como diana comprende un péptido que incluye una secuencia RGD.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que el péptido incluye una secuencia RGDFV.

17. Uso según la reivindicación 1, en el que el péptido tiene una longitud de desde 3 hasta 30 aminoácidos.

18. Uso según la reivindicación 17, en el que el péptido tiene una longitud de desde 3 hasta 20 aminoácidos.

19. Uso según la reivindicación 18, en el que el péptido tiene una longitud de desde 4 hasta 10 aminoácidos.

20. Uso según la reivindicación 17, en el que el péptido es un péptido cíclico.

21. Uso según la reivindicación 20, en el que el péptido cíclico tiene una longitud de 5 aminoácidos.

22. Uso según la reivindicación 14, en el que el resto de selección como diana comprende un ligando que es un sustrato para la proteína de la superficie celular.

23. Uso según la reivindicación 22, en el que la proteína de la superficie celular es una integrina, proteoglucano, glucoproteína, receptor, o transportador.

24. Uso según la reivindicación 14, en el que el resto de selección como diana comprende un anticuerpo que se une a una proteína de la superficie celular.

25. Uso según la reivindicación 24, en el que el anticuerpo es un anticuerpo frente al receptor Her-1.

26. Uso según la reivindicación 1, en el que el promotor es CMV IE, CEA, VEGF, AFP, promotor de surfactante pulmonar, dectina-1, dectina-2, CD11c humana, F4/80, SM22, CEA, tirosinasa, inducible por tet o represible por tet, RSV, MLP, o un promotor de clase II de CMH.

27. Uso según la reivindicación 1, en el que el cáncer es cáncer de pulmón, cabeza y cuello, pancreático, próstata, renal, de huesos, testicular, de mama, cervicouterino, gastrointestinal, linfoma, cerebral, de mama, de ovario, leucemia, mieloma, colorectal, de esófago, de piel, de tiroides, de hígado o vejiga.

28. Uso según la reivindicación 1, en el que la formulación se administra al paciente mediante inyección intratumoral, inyección intratraqueal, inyección intravenosa, inyección intraperitoneal, instilación intravesical, infusión intraarterial, inyección intrapericardial, inyección intramuscular, aplicación tópica, aerosolización, exposición a la mucosa, por vía oral o por lavado.

29. Uso según la reivindicación 1, en el que la formulación se administra más de una vez.

30. Uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento es para la administración al paciente mediante inyección intratumoral.

31. Uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento es para la administración al paciente por vía intravenosa.

32. Uso según la reivindicación 1, en el que el cáncer comprende un tumor.

33. Uso según la reivindicación 32, en el que el medicamento es para su administración a un lecho tumoral antes o después de la resección del tumor.

34. Uso según la reivindicación 33, en el que el medicamento es para su administración al lecho tumoral tanto antes como después de la resección del tumor.

35. Uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento es para su administración al paciente antes de la quimioterapia, cirugía, inmunoterapia, terapia hormonal o radioterapia.

36. Uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento es para su administración durante la quimioterapia, cirugía, inmunoterapia, terapia hormonal o radioterapia.

37. Uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento es para su administración después de la quimioterapia, cirugía, inmunoterapia, terapia hormonal o radioterapia.

38. Uso según la reivindicación 37, en el que el medicamento es para su administración menos de 72 horas antes de la quimioterapia, cirugía, inmunoterapia, terapia hormonal o radioterapia.

39. Uso según la reivindicación 38, en el que el medicamento es para su administración menos de 24 horas antes de la quimioterapia, cirugía, inmunoterapia, terapia hormonal o radioterapia.

40. Uso según la reivindicación en el que el medicamento es para su administración menos de 72 horas después de la quimioterapia, cirugía, inmunoterapia, terapia hormonal o radioterapia.

41. Uso según la reivindicación, en el que el medicamento es para su administración menos de 24 horas después de la quimioterapia, cirugía, inmunoterapia, terapia hormonal o radioterapia.