ES2339421T3

ES2339421T3 - Administracion genica mediante liposoma dirigido.

Info

Publication number: ES2339421T3
Application number: ES01123562T
Authority: ES
Inventors: Esther H. Chang; Liang Xu; Kathleen Pirollo
Original assignee: Georgetown University
Current assignee: Georgetown University
Priority date: 1997-11-19
Filing date: 1998-11-19
Publication date: 2010-05-20
Anticipated expiration: 2018-11-19
Also published as: CN1616665A; EP1032369B1; CA2308584A1; DE69841536D1; JP2001522871A; HK1045641A1; DE69830249D1; DK1166775T3; DE69830249T2; PT1166775E; HK1035490A1; CN1191094C; CN1286630A; ATE459340T1; AU1464299A; AU759164B2; CN1616665B; CA2308584C; WO1999025320A1; JP2010263920A

Abstract

Vector para la administración de un virus a una célula diana dentro de un animal huésped, que comprende un complejo de un ligando de direccionamiento a la célula, un liposoma que comprende uno o más lípidos catiónicos, y el virus, en el que dichos lípidos catiónicos y el virus están presentes en el complejo en una relación de aproximadamente 104 - 107 lípidos catiónicos/partícula viral.

Description

Administración génica mediante liposoma dirigido.

La presente invención se refiere de forma general a la administración sistémica de una molécula terapéutica a través de un complejo liposómico que se dirige a un tipo de célula preseleccionado. Más en particular, la presente invención proporciona composiciones y procedimientos para la transferencia génica dirigida a células y terapia génica para cánceres humanos, en la que se administra una molécula terapéutica a la célula cancerosa diana a través de un complejo ligando/liposoma. El tratamiento de una enfermedad celular proliferativa (por ejemplo, el cáncer) resulta en una mejora sustancial de la eficacia de las intervenciones radioterapéuticas o quimioterapéuticas.

La terapia ideal para el cáncer sería la que se dirigiera selectivamente a una ruta celular responsable del fenotipo tumoral y que no fuera tóxica para las células normales. Hasta el momento, dicha terapia ideal sigue siendo precisamente esto, un ideal. Aunque los tratamientos contra el cáncer que comprenden terapia génica y moléculas antisentido son sustancialmente prometedores, existen algunos problemas que se deben abordar antes de que dicha promesa se haga realidad. Quizá el principal problema asociado a los tratamientos macromoleculares para el cáncer y otras enfermedades es la administración eficaz de la molécula o moléculas terapéuticas al sitio o sitios del cuerpo en el que son necesarias.

Otros han evaluado diversos sistemas de administración de ácido nucleico ("vectores") para el tratamiento del cáncer, incluyendo virus y liposomas. El vector ideal para la terapia génica del cáncer en humanos sería aquel que se pudiera administrar sistémicamente y a continuación dirigirse de forma específica y eficiente a las células tumorales, donde fuera que las mismas se encontraran dentro del cuerpo. Los procedimientos dirigidos por vector viral muestran una elevada eficiencia de transferencia génica, pero son deficientes en diversos aspectos. Las limitaciones de un enfoque viral están relacionadas con su falta de direccionamiento y con la presencia de elementos virales residuales que pueden ser inmunogénicos, citopáticos o recombinogénicos.

Una importante deficiencia de los vectores virales es su falta de especificidad respecto a células cancerosas. Debido a su incapacidad para ser dirigidos a los tumores, los vectores virales están limitados en su utilización a una administración directa y local, la cual no tiene capacidad para afectar a las metástasis, que representan la causa de muerte principal de la mayoría de pacientes con cáncer.

Los elevados títulos alcanzables y el tropismo celular que hacen atractivos los virus como terapia génica y vectores de administración de transferencia génica presentan algunas de sus mayores deficiencias. Aunque la preparación de nuevos virus con nuevas dianas de infección ha sido descrita en la bibliografía, dichos vectores resultan problemáticos debido a la necesidad de cultivar el virus hasta títulos elevados. En consecuencia, se ha dirigido una cantidad sustancial de atención a vectores no víricos para la administración de terapias moleculares, incluyendo la utilización en transferencia génica y terapia génica.

Se han obtenido algunos progresos en el desarrollo de formulaciones farmacéuticas no víricas de genes para la terapia in vivo en humanos, particularmente sistemas de transferencia génica mediados por liposoma catiónico. Los liposomas catiónicos están compuestos por bicapas lipídicas cargadas positivamente y se pueden complejar con ADN desnudo cargado negativamente simplemente mezclando lípidos y ADN de tal modo que el complejo resultante presente una carga neta positiva. El complejo es fácilmente enlazado y absorbido por las células, con una eficacia de transfección relativamente elevada. Las características de los liposomas catiónicos que los hacen versátiles y atractivos para la administración de ADN incluyen: sencillez de preparación, capacidad de complejar grandes cantidades de ADN, versatilidad en la utilización con cualquier tipo y tamaño de ADN o ARN, capacidad de transfectar muchos tipos diferentes de células (incluyendo células que no se dividen) y falta de inmunogenicidad o actividad biológicamente peligrosa. La utilización de liposomas ofrece una serie de ventajas sobre las metodologías víricas para la administración génica. Principalmente, dado que los liposomas no son agentes infecciosos capaces de autorreplicación, no presentan riesgo alguno de evolucionar hacia nuevos tipos de patógenos humanos infecciosos. Además, se ha puesto de manifiesto que los liposomas catiónicos son seguros y hasta cierto punto deficientes para la administración génica in vivo. Dado que los liposomas no son agentes infecciosos, se pueden formular por simple mezclado. Además, se ha puesto de manifiesto que los liposomas catiónicos son seguros y hasta cierto punto deficientes para la administración génica in vivo. Actualmente, se están llevando a cabo ensayos clínicos utilizando liposomas catiónicos para administración génica, y ya existen en el mercado liposomas para la administración de pequeños agentes terapéuticos moleculares (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos y antifúngicos).

Un inconveniente de los liposomas catiónicos consiste en que no presentan especificidad tumoral y tienen unas eficiencias de transfección relativamente bajas en comparación con los vectores virales. Sin embargo, se puede alcanzar un direccionamiento hacia células cancerosas a través de liposomas modificándolos a efectos de que presenten un ligando que sea reconocido por un receptor celular de superficie. La endocitosis mediada por receptor representa una ruta de internalización altamente eficaz en las células eucariotas. La presencia de un ligando en un liposoma facilita la entrada de ADN en las células a través del enlazamiento inicial de dicho ligando por parte de su receptor sobre la superficie celular, seguido de la internalización del complejo enlazado. Una vez internalizado, una cantidad suficiente de ADN puede escapar a la ruta endocítica y ser expresado en el núcleo celular.

\newpage

Actualmente, existe una base de conocimientos sustancial referente a las moléculas que residen en las superficies exteriores de las células cancerosas. Se pueden utilizar moléculas de superficie para dirigir selectivamente los liposomas a las células tumorales, ya que las moléculas que se encuentran en el exterior de dichas células tumorales son diferentes de las de las células normales. Por ejemplo, si un liposoma presenta la proteína transferrina (Tf) en su superficie, el mismo puede dirigirse a células cancerosas que presentan niveles elevados de receptor de transferrina.

Se ha examinado en diversos ligandos la capacidad de direccionamiento de liposomas, incluyendo el ácido fólico (folato), una vitamina necesaria para la síntesis de ADN, y la transferrina. Los niveles de receptor de folato y de receptor de transferrina son elevados en diversos tipos de células cancerosas, incluyendo de ovario, orales, de pecho, de próstata y de colon. La presencia de dichos receptores se puede correlacionar con el estado agresivo o proliferativo de las células tumorales. También se ha puesto de manifiesto que el receptor de folato se recicla durante la internalización del mismo en células con división rápida, tales como las células cancerosas. Además, se ha puesto de manifiesto que las macromoléculas y liposomas conjugados con transferrina y folato son absorbidas de forma específica por parte de células tumorales que presentan los receptores mediante endocitosis mediada por receptor. De este modo, los receptores de folato y transferrina se consideran útiles como marcadores tumorales de pronóstico para el cáncer y como dianas potenciales para la administración de fármacos en el tratamiento del crecimiento de células
malignas.

La falta de respuesta a la radioterapia y quimioterapia representa una necesidad médica no satisfecha en el tratamiento de muchos tipos de cáncer. A menudo, cuando el cáncer es recurrente, los tumores han adquirido mayor resistencia a la radiación o a los agentes quimioterapéuticos. La incorporación a las terapias anticáncer de un nuevo componente que provoque la sensibilización a dichas terapias tendría una importancia clínica enorme. Un modo en el que se podría alcanzar dicha sensibilización a la quimioterapia/radioterapia es a través de terapia génica dirigida.

Se ha establecido la importancia del papel del p53 en el control de la proliferación celular mediante la regulación de los fenómenos del ciclo celular y la inducción de la muerte celular programada (apoptosis). Dado que parece que la mayoría de agentes anticáncer funcionan induciendo apoptosis, la inhibición o las modificaciones en dicha ruta pueden conllevar el fracaso de los regímenes terapéuticos. En consecuencia, se ha sugerido una relación directa entre las anormalidades en el p53 y la resistencia a los tratamientos anticáncer citotóxicos (tanto quimioterapia como radioterapia). También se ha sugerido que la pérdida de la función del p53 puede contribuir a la resistencia cruzada frente a agentes anticáncer observada en algunas células tumorales. Diversos grupos han establecido una correlación positiva entre la presencia de p53 mutante y quimiorresistencia en fibrosarcomas de ratón y en cultivos tumorales primarios de carcinomas de pecho, carcinomas gástricos y de esófago humanos, así como en la leucemia linfoblástica crónica de células B. Además, se ha documentado que la quimiosensibilidad a través de la apoptosis se restableció mediante la expresión de wtp53 en injertos de ratón de carcinoma de pulmón de células no pequeñas que presentan p53 mutante.

Se ha establecido un papel para el gen supresor tumoral p53 en muchas rutas celulares críticas, particularmente en la respuesta celular a los daños en el ADN. Dichas rutas no incluyen únicamente la transcripción génica, la reparación del ADN, la estabilidad genómica, la segregación cromosómica y la senescencia, sino también la regulación de los fenómenos del ciclo celular y la modulación de la muerte celular programada (apoptosis). Por su papel en el control de los daños al ADN, el p53 se ha bautizado "guardián del genoma". Las células cancerosas se caracterizan por su inestabilidad genética, y se ha observado que las mutaciones en el p53 tienen lugar con una frecuencia extremadamente elevada en casi todos los tipos de cánceres humanos. De hecho, se ha sugerido que las alteraciones cuantitativas o cualitativas en el gen p53 tienen un papel en más de la mitad de todos los trastornos malignos humanos. Se ha puesto de manifiesto que la presencia de mutaciones en el p53 en los tipos más comunes de tumores humanos está asociada a un pronóstico clínico pobre. Además, raramente se encuentra p53 mutante (mt) en algunas de las formas más curables de cáncer, por ejemplo en el tumor de Wilms, el retinoblastoma, el cáncer testicular, el neuroblastoma y la leucemia linfoblástica aguda.

Diversos estudios han documentado el hecho de que la expresión de wt p53 ha eliminado, tanto in vitro como en modelos de injerto en ratón, el crecimiento de diversos desórdenes malignos, por ejemplo células tumorales de próstata, de cabeza y cuello, de colon, cervicales y pulmonares. Asimismo, se ha documentado que un complejo p53-liposoma inhibe parcialmente el crecimiento de glioblastoma humano e injertos de cáncer de pulmón humano en ratones. Además, Seung y otros han utilizado la introducción intratumoral mediada por liposoma de un constructo inducible por radiación que expresa TNF-alfa para inhibir el crecimiento de un injerto de fibrosarcoma murino tras la exposición a la radiación ionizante. Sin embargo, la expresión de p53 por sí sola, a pesar de que es capaz de inhibir parcialmente el crecimiento tumoral, no ha sido capaz de eliminar los tumores establecidos a largo plazo.

El desarrollo normal de los ratones con ausencia de wtp53 y las observaciones de un bloque G1 postirradiación en células que expresan p53 sugiere que el wt p53 funciona en la regulación de la célula tras daños o tensión en el ADN más que durante la proliferación y desarrollo. Dado que, según parece, muchas terapias anticáncer convencionales (quimioterapia y radiación) inducen daños en el ADN y parecen funcionar mediante la inducción de apoptosis, resulta plausible que las alteraciones en la ruta del p53 puedan conllevar el fracaso de los regímenes terapéuticos.

La ausencia de función del wt p53 también se ha asociado a un incremento de la resistencia a la radiación. También se ha puesto de manifiesto que la presencia de mt p53 y la consiguiente ausencia de un bloque G1 se correlacionan con una mayor resistencia a la radiación en algunos tumores humanos y líneas celulares. Los mismos incluyen líneas celulares tumorales humanas representativas de cáncer de cabeza y cuello, linfoma, vejiga, pecho, tiroides, ovario y cerebro.

Sobre la base de estas consideraciones, la terapia génica dirigida a restaurar la función del wtp53 en células tumorales debe reestablecer los puntos de control del ciclo celular dependientes del p53 y la ruta apoptópica, provocando de este modo la inversión de los serotipos resistentes a quimioterapia o radioterapia. En consistencia con este modelo, la quimiosensibilidad, junto con la apoptosis, se restableció mediante la expresión de wtp53 en injertos de ratón de carcinoma de pulmón de células no pequeñas que presentaban mtp53. Se han demostrado la quimiosensibilidad de injertos que incluyen la línea de células tumorales de pulmón p53 nulo H1299 y células de glioblastoma T98G, y la sensibilidad de injertos WiDr de cáncer de colon a cisplatina. También se puso de manifiesto una muerte celular aumentada por doxorrubicina o mitomicina C en las células tumorales de pulmón SK-Br-3 por transducción adenoviral de wtp53. Sin embargo, algunos estudios contradictorios indican que la relación entre la expresión de p53 y la quimiorresistencia pueden tener un componente específico de tejido o de tipo celular. También se ha puesto de manifiesto que la transfección de wtp53 mediante un vector adenovírico sensibiliza las células tumorales ováricas y colorrectales a la radiación. También se ha documentado que la administración de wtp53 mediada por adenovirus restaura la apoptosis funcional en una línea celular de carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello (SCCHN), lo que provoca la radiosensibilización de dichas células in vitro. Más significativamente, la combinación de adeno-wtp53 inyectado intratumoralmente y radiación ha conducido a la regresión tumoral completa y a largo plazo de tumores establecidos de injerto SCCHN.

El documento US-A-5635380 da a conocer un procedimiento para mejorar la administración de un ácido nucleico a una célula.

El documento WO-A-95/21259 da a conocer un procedimiento mediado por adenovirus de transfección con ácidos nucleicos.

Wang et al., PNAS (1995), vol. 92, páginas 3318-3322, dan a conocer la administración de oligodesoxirribonucleótidos antisentido contra el receptor de factor de crecimiento epidérmico humano en células KB cultivadas con liposomas conjugados a folato a través de polietilenglicol.

Xu et al., Human Gene Therapy (1997), vol. 8, páginas 467-475, dan a conocer la sensibilización de p53 mediada por transferrina-liposoma de carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello a la radiación in vitro.

Simoes et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. (1997), simposio 24, páginas 659-660, dan a conocer la mejora de una administración génica mediada por liposoma catiónico mediante péptidos de transferrina y fusogénicos.

La presente invención parte de la utilización convencional de vectores virales para la administración de moléculas terapéuticas para terapia génica, por ejemplo, tal como se da a conocer en Roth y otros (patente USA 5.747.469). Dichos vehículos utilizados en la actualidad presentan la capacidad limitada propia de una administración local. Se ha puesto de manifiesto que su ajuste a la administración intratumoral no solo resulta inadecuado a la hora de alcanzar todas las células dentro de la masa tumoral primaria, sino que es incapaz de alcanzar puntos de alteración metastásica.

En un aspecto, la presente invención proporciona un vector para la administración de un virus a una célula diana dentro de un animal huésped, que comprende un complejo de un ligando de direccionamiento a la célula, un liposoma que comprende uno o más lípidos catiónicos, y el virus, estando presentes los lípidos catiónicos y el virus en dicho complejo en una relación de aproximadamente 10^{4}-10^{7} lípidos catiónicos/partícula vírica. Las formas de realización específicas se refieren a liposomas catiónicos dirigidos a folato y transferrina para la administración de una molécula terapéutica a células cancerosas de un animal (incluyendo un humano) que contienen receptores de folato o transferrina.

En otro aspecto, la presente invención da a conocer composiciones farmacéuticas que comprenden el vector del párrafo anterior en un vehículo o portador farmacéuticamente compatible. Preferentemente, las composiciones se formulan para la administración intravenosa a un paciente humano que debe beneficiarse de la administración eficaz de la molécula terapéutica. Los complejos se disponen de un tamaño apropiado, de tal modo que se distribuyan a lo largo del cuerpo después de la administración intravenosa.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de un complejo para la preparación de un medicamento eficaz en la provisión de un ácido nucleico terapéutico a un animal que necesita dicho ácido nucleico, comprendiendo dicho complejo: un ligando de direccionamiento a la célula; un liposoma catiónico, y un virus que comprende un ácido nucleico terapéutico, en el que los lípidos catiónicos y el virus están presentes en el complejo en una relación de aproximadamente 10^{4}-10^{7} lípidos catiónicos/partícula viral.

Además, la presente invención se refiere a la utilización de un complejo para la preparación de un medicamento eficaz en el tratamiento o mejora del cáncer en un animal de sangre caliente, en la que dicho complejo comprende: un ligando de direccionamiento a la célula cancerosa; un liposoma que comprende uno o más lípidos catiónicos, y un virus que comprende un ácido nucleico terapéutico, en el que los lípidos catiónicos y el virus están presentes en el complejo en una relación de aproximadamente 10^{4}-10^{7} lípidos catiónicos/partícula viral.

Tal como se expone en la presente memoria en detalle, el tratamiento de un cáncer humano mediante la administración sistémica (por ejemplo, intravenosa) de un complejo que comprende un complejo de liposoma dirigido por el ligando que contiene un ácido nucleico que codifica wt p53 constituye una forma de realización importante de este aspecto de la presente invención.

La terapia génica en humanos mediante la administración sistémica de composiciones farmacéuticas que contienen complejos dirigidos de liposoma/ácido nucleico, en los que el ácido nucleico comprende un gen terapéutico bajo el control de una secuencia reguladora apropiada, da lugar a ejemplos importantes de la presente invención. La terapia génica para muchas formas de cánceres humanos se lleva a cabo mediante la administración sistémica de liposomas catiónicos dirigidos por folato o transferrina que contienen un ácido nucleico que codifica wt p53. Los datos presentados en la presente memoria demuestran la capacidad superior de dichos complejos de dirigirse específicamente a células tumorales y sensibilizarlas (debido a la expresión del gen wt p53), tumores primarios y metastásicos, a la radiación y/o la quimioterapia tanto in vitro como in vivo.

Un aspecto de la presente invención se refiere a mejoras en la preparación de liposomas, particularmente liposomas catiónicos dirigidos por el ligando, proporcionando liposomas con diámetros relativamente pequeños y consistentes. Tras la administración intravenosa, dichos liposomas de diámetro pequeño consistentes muestran la capacidad de circular por el corriente sanguíneo y dirigirse a tumores primarios y metástasis.

La presente invención aborda la necesidad de administrar moléculas terapéuticas sistémicamente con un grado elevado de especificidad de célula diana y una eficiencia elevada. Cuando se administran sistémicamente, los complejos según la presente invención son capaces de alcanzar, y dirigirse específicamente, a un desorden metastásico y también primario, cuando las células diana son células cancerosas humanas. Como resultado de la administración de la versión normal de tipo salvaje del gen supresor tumoral p53 mediante este sistema, los inventores han demostrado que los tumores se sensibilizan a la radioterapia y/o la quimioterapia. La elevada eficiencia de transfección de este sistema da lugar a un grado tan elevado de sensibilización que no solo se produce una inhibición del crecimiento del cáncer, sino que los tumores y metástasis preexistentes se eliminan por completo durante un período de tiempo prolongado. En algunos casos, dicho periodo es tan prolongado que se puede considerar que la patología ha sido curada.

La excepcional eficacia de este sistema se debe, en parte, al direccionamiento hacia el ligando del complejo liposoma-molécula terapéutica. Además, los lípidos catiónicos y neutros específicos que constituyen el complejo de liposoma, así como la relación de cada uno de ellos, se han modificado y optimizado a efectos de que la eficiencia de absorción de la molécula terapéutica sea ideal para el tipo específico de célula diana. La relación de liposoma con respecto a molécula terapéutica también se ha optimizado para el tipo de célula diana. Dicha optimización del complejo liposoma-molécula terapéutica, en combinación con la adición de un ligando de direccionamiento, da lugar a una eficacia sustancialmente mejorada cuando se administra junto con radioterapia o quimioterapia. Los expertos en la materia serán capaces de optimizar los complejos para administrar diversas moléculas terapéuticas a diversos tipos de célula.

Una característica importante de la presente invención consiste en la capacidad de administrar la molécula terapéutica a la célula diana mediante administración intravenosa sistémica. La capacidad de dirigirse a células específicas y transfectarlas eficientemente tras la administración intravenosa se obtiene mediante la combinación dada a conocer de seleccionar un ligando de direccionamiento apropiado y optimizar la relación entre lípido catiónico y lípido neutro en el liposoma. En el caso en el que las células diana son células tumorales, la administración sistémica del complejo de ligando-liposoma-molécula terapéutica permite la administración eficaz y específica de la molécula terapéutica a las metástasis y al tumor primario.

La presente invención no se limita a la utilización de ningún ligando de direccionamiento específico. El ligando puede ser cualquier ligando para el que se expresa inequívocamente un receptor en la célula diana. Los ligandos preferidos en la presente invención son el ácido fólico (esterificado a un lípido del liposoma) y la transferrina, presentando cada uno de estos ligandos propiedades ventajosas.

Los complejos de liposoma son capaces de penetrar aproximadamente veinte capas de células que rodean los vasos sanguíneos en un tumor. Se ha postulado que la terapia con gen wtp53 controla parcialmente el crecimiento celular mediante un "efecto espectador", que se puede relacionar con la inducción de la apoptosis por parte del wtp53. Este "efecto espectador" puede explicar la eficacia de los estudios in vivo citados en la presente memoria, y puede constituir un factor de contribución a la eficacia de la terapia de combinación. Sin embargo, en este momento se conoce relativamente poco acerca del mecanismo y la ruta implicados en este proceso para el p53. Se ha especulado que alguna señal apoptótica, hasta el momento desconocida, puede estar contenida en las vesículas que resultan de la apoptosis, y que finalmente fagocitan a las células vecinas. Alternativamente, esta señal apoptótica puede ser transferida a través de uniones de hueco, tal como se cree que es el caso para el ganciclovir fosforilado con el gen HSV-TK. La inducción de factores antiangiogénicos también puede contribuir al mencionado efecto espectador.

Recientemente, se ha documentado un complejo de liposoma-p53 no dirigido que inhibió parcialmente el crecimiento de injertos de glioblastoma humano in vivo. Además, Seung y otros (Cancer Res. 55, 5561-5565 (1995)) han utilizado la introducción intratumoral mediada por un liposoma comercial no dirigido (Lipofectin) de un constructo inducible por radiación que contiene TNF-alfa para inhibir parcialmente el crecimiento del injerto de un fibrosarcoma murino tras la exposición a 40 Gy de radiación ionizante. Xu y otros (Human Gene Therapy 8, 177-175 (1997)) han puesto de manifiesto que la introducción de 16 \mug de ADN p53 en un complejo de liposoma no dirigido fue capaz de inhibir parcialmente el crecimiento de tumores de ratón de injerto de cáncer de mama. Sin embargo, los complejos de liposoma-p53 dirigidos por ligando según la presente invención proporcionan capacidad de especificidad de célula diana, y una elevada eficiencia de transfección, asociada a la administración sistémica. Los estudios citados en la presente memoria son los primeros que utilizan un sistema de administración de este tipo en combinación con los tratamientos convencionales con radiación y agentes quimioterapéuticos para los tumores. Aunque la terapia génica con p53 por sí sola puede no resultar suficiente para eliminar completamente tumores a largo plazo, la combinación descrita en la presente memoria de una terapia génica con p53 mediada por liposoma y la terapia convencional (radiación y/o quimioterapia) es capaz de alcanzar no solo la inhibición del crecimiento, sino la regresión tumoral, poniendo de manifiesto un efecto sinérgico.

Los estudios in vivo descritos en la presente memoria demuestran que la combinación de la terapia génica sistémica con LipF-p53 o LipT-p53 y la radioterapia y/o quimioterapia convencionales es significativamente más eficaz que cualquiera de dichos tratamientos por sí solos. En el entorno clínico, generalmente se utilizan dosis de radiación de 65 a 75 Gy para tumores grandes y de 45 a 50 Gy para desórdenes microscópicos en el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello. Dados los efectos secundarios adversos conocidos asociados a dosis elevadas de radiación o quimioterapia, una sensibilización de los tumores que permitiera una menor dosis efectiva del tratamiento convencional presentaría enormes beneficios clínicos. Además, en el caso de la radiación, la restauración sistémica de la función del wtp53, que da lugar a una disminución de la dosis de radiación que se demuestra efectiva, permitiría una intervención terapéutica adicional en tumores con recurrencia.

En estudios que han utilizado tumores de injerto derivados de líneas celulares SCCHN que contienen wtp53 o mtp53, se puso de manifiesto que la introducción de wtp53 por administración intratumoral de un vector adenovírico fue capaz de inhibir el desarrollo de dichos tumores de injerto y de inducir apoptosis de los mismos, independientemente de su estatus de p53 endógeno. Similarmente, la introducción mediada por liposoma de wtp53 en injertos de glioblastoma (RT-2) y cáncer de pulmón (MCF-7), que tienen wtp53 endógeno, fue capaz de inhibir parcialmente el crecimiento de dichos tumores. Estos estudios indican el amplio potencial de la terapia génica con wtp53, independientemente del estatus del gen p53.

Las investigaciones en las que se basa la presente invención demuestran que el sistema del complejo de ligando-liposoma catiónico-molécula terapéutica puede suministrar el gen p53 in vivo selectivamente a tumores de diversos tipos, sensibilizándolos a la radiación y la quimioterapia. En consecuencia, la terapia génica sistémica con wtp53 mediada por el sistema de liposoma catiónico dirigido por ligando, un sistema dirigido a tumor relativamente seguro y eficiente, en combinación con radioterapia o quimioterapia convencionales, puede proporcionar una modalidad de tratamiento más efectiva no solo para tumores primarios, sino también para aquellos cánceres que no responden a la terapia inicial.

También se ha demostrado que el sistema de administración por liposoma dirigido es capaz de suministrar pequeñas moléculas de ADN (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido), así como agentes grandes, como partículas virales intactas. El suministro de estas pequeñas moléculas de ADN (antisentido) también fue capaz de sensibilizar las células tumorales a los agentes quimioterapéuticos. De este modo, los liposomas dirigidos según la presente invención tienen una amplia aplicación a la administración sistémica de agentes terapéuticos.

La descripción se refiere además a procedimientos para preparar complejos de ligando-liposoma-agente terapéutico. El procedimiento por el que se forma el complejo entre el liposoma-transferrina y la partícula viral proporciona un gran número de moléculas de transferrina sobre la superficie del complejo y, de este modo, aumenta la estabilidad del complejo a medida que el mismo se desplaza por el flujo sanguíneo. Además, cuando la molécula terapéutica es una partícula viral, el liposoma de transferrina también puede servir para disminuir la inmunogenicidad del virus bloqueando los antígenos virales.

Utilizando la presente invención, los inventores han demostrado un efecto significativo no solo en el control del crecimiento celular, y particularmente en el crecimiento de células tumorales, sino también en la remisión del tumor a largo plazo. La formación y crecimiento de células tumorales, también conocidos como transformación, describen la formación y la proliferación de células que han perdido su capacidad de control de la división celular, es decir, que son cancerosas. Diversos tipos diferentes de células transformadas pueden servir como dianas para los procedimientos y composiciones según la presente invención, tales como: carcinomas, sarcomas, melanomas, y una amplia variedad de tumores sólidos y similares. Aunque cualquier tejido que presente un crecimiento celular maligno puede ser una diana, los cánceres de cabeza y cuello, de pecho, de próstata, de páncreas, glioblastoma, cervical, de pulmón, liposarcoma, rabdomiosarcoma, coriocarcinoma, melanoma, retinoblastoma, de ovario, gástrico y colorrectal son dianas preferidas.

También se contempla la utilización de la presente invención para el direccionamiento a células no tumorales a efectos de administrar una molécula terapéutica. Aunque cualquier célula normal puede ser una diana, las dianas normales preferidas son las células dendríticas, las células endoteliales de los vasos sanguíneos, las células del pulmón, las células del pecho, las células de la médula ósea y las células hepáticas.

En la presente memoria, se da a conocer el hecho de que, cuando se ha administrado sistémicamente, el complejo liposoma-molécula terapéutica dirigido por ligando ha sido capaz de dirigirse específicamente a células tumorales y sensibilizarlas significativamente a la radiación y/o la quimioterapia, obteniéndose una inhibición significativa del crecimiento tumoral y una regresión de dicho tumor. El complejo liposoma catiónico-molécula terapéutica optimizado dirigido por ligando se puede administrar a través de otras vías de administración, tales como intratumoral, aerosol, percutánea, endoscópica, tópica, intralesional o subcutánea.

La invención y la presente descripción proporcionan, en algunas formas de realización, procedimientos y composiciones para la administración altamente específica para célula diana y eficiente, por administración sistémica, de un complejo liposoma-molécula terapéutica dirigido por ligando. Ejemplos de moléculas terapéuticas incluyen un gen, ADN de peso molecular elevado, ADN plásmido, un oligonucleótido antisentido, péptidos, ribozimas, ácidos nucleicos peptídicos, un agente químico tal como una molécula quimioterapéutica, o cualquier molécula grande, incluyendo, aunque sin limitarse a los mismos, ADN, ARN, partículas virales, factores de crecimiento y citoquinas, agentes de inmunomodulación y otras proteínas, incluyendo proteínas que, al ser expresadas, presentan un antígeno que estimula o inhibe el sistema inmune.

Recientemente, se han descrito procedimientos eficientes para la expresión a largo plazo de vectores de terapia génica (Cooper et al, 1997; Westphal y otros, 1998; Calos, 1996 y 1998). Dichos vectores pueden resultar útiles para extender y/o aumentar los niveles de expresión del sistema de administración liposómico dado a conocer. Se han dado a conocer diversos sistemas de vectores autónomos y episomales en las patentes USA 5.707.830 (Calos, M. P., 13 de enero de 1998); 5.674.703 (Woo, S. y otros, 7 de octubre de 1997) y 5.624.820 (Cooper, M. J., 29 de abril de 1997), cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria.

Calos se refiere a vectores de expresión episomales basados en virus de Epstein Barr útiles en la replicación autónoma en las células de mamíferos. Woo y otros se refieren a vectores de expresión episomales basados en el virus del papiloma para la replicación en células animales. Cooper et al. se refieren a vectores que contienen, como mínimo, un origen de replicación de virus del papiloma humano y una forma mutante de antígeno T grande de virus del papiloma humano para una expresión episomal a largo plazo en terapia génica humana.

Cuando la molécula terapéutica es el gen p53 o un oligonucleótido antisentido, la administración a través del complejo según la presente invención provoca la sensibilización de una célula o células, tal como una célula o células malignas, a la radiación o a un agente quimioterapéutico, de tal modo que las células son eliminadas por la terapia de combinación. Las células malignas se definen como células que han perdido su capacidad de control del ciclo de división celular, lo que da lugar a un fenotipo transformado o canceroso. Además de las células malignas, las células que pueden ser eliminadas utilizando la presente invención incluyen, por ejemplo, las células benignas pero no deseables, tales como las células de hiperplasia prostática benigna, células tiroideas hiperactivas, células de lipoma, así como células relacionadas con enfermedades autoinmunes, tales como células B que producen anticuerpos implicados en artritis, lupus, miastenia gravis, metaplasia escamosa, displasia y similares.

El complejo de ligando-liposoma-molécula terapéutica se puede formular en condiciones estériles en un período de tiempo razonable antes de su administración. Si la molécula terapéutica es una molécula que proporciona una susceptibilidad aumentada a otra terapia (tal como una susceptibilidad aumentada de las células cancerosas a la quimioterapia o radioterapia), dicha otra terapia se puede administrar antes o a continuación de la administración del complejo, por ejemplo dentro de 12 h a 7 días. Se puede utilizar una combinación de terapias, tal como quimioterapia y radioterapia, además de la administración de dicho complejo.

Las expresiones "puesta en contacto" o "expuesta", cuando se aplican a una célula, se utilizan en la presente memoria para describir el proceso por el cual una molécula terapéutica se administra a una célula, o se pone directamente en yuxtaposición con la célula diana, de tal modo que pueda interactuar de forma eficaz con dicha célula a efectos de producir un beneficio deseado a dicha célula o al animal huésped.

Cuando los complejos según la presente invención se utilizan como elemento de una terapia de combinación, por ejemplo para el tratamiento del cáncer en humanos, los mismos pueden ser utilizados en combinación con una amplia variedad de terapias utilizadas en el tratamiento del cáncer en humanos o animales. Dichas terapias incluyen la administración de agentes quimioterapéuticos y radioterapéuticos, tales como radiación gamma, rayos X, radiación UV, microondas, emisiones electrónicas y similares. Se pueden utilizar agentes quimioterapéuticos, tales como doxorrubicina, 5-fluorouracilo (5FU), cisplatina (CDDP), docetaxel, gemcitabina, pacletaxel, vinblastina, etopósido (VP-16), camptotecina, actinomicina-D, mitoxantrona y mitomicina C, en terapias de combinación según la presente invención.

Se pueden complejar diversos tipos diferentes de moléculas potencialmente terapéuticas con los complejos de ligando dirigido a célula/liposoma según la presente invención. Los mismos incluyen, sin limitarse a los mismos, moléculas de ADN de peso molecular elevado (genes), moléculas de ADN plásmido, pequeños oligonucleótidos, ARN, ribozimas, péptidos, agentes de inmunomodulación, ácidos nucleicos peptídicos, partículas virales, agentes químicos, tales como los agentes y fármacos quimioterapéuticos conocidos, factores de crecimiento, citoquinas y otras proteínas, incluyendo aquellas que, cuando se expresan, presentan un antígeno que estimula o inhibe el sistema inmunológico. En consecuencia, además de en terapia génica, la presente invención se puede utilizar para inmunoterapia o para la administración dirigida de fármacos.

También se pueden administrar agentes de diagnóstico a células diana a través de los complejos dados a conocer. Se pueden utilizar agentes que se pueden detectar in vivo tras la administración a un organismo multicelular. Los agentes diagnósticos de ejemplo incluyen materiales de elevada densidad electrónica, agentes de imagen por resonancia magnética y radiofármacos. Los radionucleidos útiles para el diagnóstico por imagen incluyen radioisótopos de cobre, galio, indio, renio y tecnecio, incluyendo los isótopos ^{64}Cu, ^{67}Cu, ^{111}En, ^{99m}Tc, ^{67}Ga o ^{68}Ga. Los agentes de diagnóstico por imagen dados a conocer por Low y otros (patente USA 5.688.488) son útiles en la presente invención, y dicha patente se incorpora como referencia en la presente memoria.

La composición de ligando-liposoma según la presente invención, que se compleja con la molécula terapéutica, puede estar constituida por un ligando, un lípido catiónico y un lípido neutro o auxiliar, siendo la relación de lípido catiónico a lípido neutro de aproximadamente 1:(0,5-3), preferentemente de 1:(1-2) (relación molar). Dicho ligando se puede enlazar, por ejemplo mediante acoplamiento químico, al lípido neutro, y mezclarse con el lípido catiónico y el lípido neutro en una relación molar de aproximadamente (0,1-20):100, preferentemente de (1-10):100, y más preferentemente de (2,5-5):100 (ligando-lípido:lípidos totales), respectivamente. El ligando-liposoma se mezcla con ADN u otras moléculas terapéuticas a efectos de formar un complejo. Las relaciones de ADN con respecto a lípidos están comprendidas en un intervalo de aproximadamente 1:(0,1-50), preferentemente de aproximadamente 1:(1-24), y más preferentemente de aproximadamente 1:(6-16) \mug/nmol. Para los oligonucleótidos antisentido, el complejo se forma mezclando el liposoma con los oligonucleótidos en una relación molar de aproximadamente (5-30):1 lípido:oligonucleótido, preferentemente de aproximadamente (10-25):1, y de la forma más preferida de aproximadamente 10:1.

Alternativamente, como en el caso de la transferrina, el ligando se puede mezclar sencillamente con los lípidos catiónicos y neutros. En este caso, los liposomas catiónicos se preparan con una relación molar de lípido catiónico con respecto a lípido neutro de aproximadamente 1:(0,5-3), preferentemente de 1:(1-2). La transferrina se mezcla con los liposomas catiónicos y, a continuación, con el ADN u otras moléculas terapéuticas. Las relaciones ADN/lípido/Tf están comprendidas dentro del intervalo de aproximadamente 1:(0,1-50):(0,1-100) \mug/nmol/\mug, preferentemente de aproximadamente 1:(5-24):(6-36), y más preferentemente de aproximadamente 1:(6-12):(8-15), respectivamente.

Otra característica única de los complejos según la presente invención es su tamaño relativamente pequeño distribuido homogéneamente (diámetro promedio menor de aproximadamente 100 nm, preferentemente menor de aproximadamente 75 nm, y más preferentemente un diámetro comprendido entre aproximadamente 35 y 75 nm (50 nm de promedio)). A efectos de alcanzar el tumor diana, los complejos deben ser resistentes a los agentes de degradación a los que se ven expuestos in vivo, y también deben ser capaces de atravesar las paredes de los vasos sanguíneos (capilares) y penetrar en el tejido diana. Los complejos según la presente invención exhiben una elevada resistencia a la degradación por parte de los elementos presentes en el suero. El tamaño permeable de los capilares de los tumores es habitualmente de 50-75 nm, y los complejos con un diámetro menor de aproximadamente 75 nm pueden atravesar fácilmente la pared capilar para alcanzar la diana. Sobre la base de los resultados de microscopia electrónica de transmisión, se pone de manifiesto que una única estructura laminada de tipo cebolla del complejo LipF-ADN y LipT-ADN juega un papel importante en el tamaño pequeño y, en consecuencia, en la elevada eficiencia de transfección del complejo según la presente invención observada in vitro y, particularmente, in vivo.

El ligando puede ser cualquier molécula que se enlace a la superficie de la célula diana, pero preferentemente a un receptor que se expresa en forma diferenciada en la célula diana. Dos ligandos particularmente preferidos son el folato y la transferrina. El lípido catiónico puede ser cualquier lípido catiónico, pero son preferidos el dioleoiltrimetilamonio propano (DOTAP) y el DDAB. El lípido neutro puede ser cualquier lípido neutro, siendo lípidos neutros preferidos la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) y el colesterol.

Se pueden utilizar diversos parámetros in vitro a efectos de determinar la eficacia de direccionamiento y administración de la composición, de tal modo que se pueden optimizar complejos particulares para administrar una molécula terapéutica deseada al tipo de célula diana seleccionada. Dichos parámetros incluyen, por ejemplo, la expresión de genes marcadores, tales como los genes de \beta-galactosidasa o luciferasa, la tinción inmunohistoquímica de las células diana para la proteína administrada, análisis Western blot de la expresión del producto proteínico del gen administrado, la modulación a la baja del gen diana debido al oligonucleótido antisentido administrado u otro oligonucleótido inhibidor, así como una sensibilización aumentada de las células diana a la radiación y/o a los agentes quimioterapéuticos.

En una forma de realización preferida, se contempla el hecho de que la región de expresión de p53 estará bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, tal como un promotor RSV o CMV. Actualmente, un promotor particularmente preferido es el promotor de citomegalovirus (CMV).

Los usos y composiciones de la presente invención son adecuados para dirigirse a una célula o células específicas in vitro o in vivo. Cuando las células diana están localizadas dentro de un animal de sangre caliente, por ejemplo células de cabeza y cuello, pecho, próstata, células pancreáticas o de glioblastoma, el complejo ligando-liposoma-molécula terapéutica se administra al animal en una forma farmacológicamente aceptable. Una "forma farmacológicamente aceptable", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la formulación del complejo ligando-liposoma-molécula terapéutica que se puede administrar a un animal, y también a la forma de poner en contacto a un animal con radiación, es decir a la manera por la que una zona del cuerpo de dicho animal se irradia, por ejemplo con radiación gamma, rayos X, radiación ultravioleta, microondas, emisiones electrónicas y similares. La utilización de radiación y ondas dañinas para el ADN es conocida por los expertos en radioterapia.

La presente invención también da a conocer procedimientos mejorados para tratar el cáncer, tanto primario como metastásico, los cuales comprenden, generalmente, la administración a un animal o un paciente humano que la requiere de una combinación terapéuticamente eficaz de un complejo ligando-liposoma-molécula terapéutica (por ejemplo, el gen p53), y de una terapia, tal como radiación o quimioterapia.

Generalmente, el complejo se administra al animal, habitualmente de manera sistémica, en forma de composición farmacéuticamente aceptable. En la realización preferida, la composición se administra sistémicamente por vía intravenosa. Sin embargo, se puede utilizar otras vías de administración, tales como aerosol, intratumoral, intralesional, percutánea, endoscópica, tópica o subcutánea.

El elevado grado de especificidad de células tumorales y capacidad de direccionamiento a tumor de la presente invención quedó demostrado por la expresión de un gen reportero tras su administración sistémica del complejo folato/transferrina-liposoma-\beta-gal. La expresión de \beta-galactosidasa se puso de manifiesto en hasta el 70% de los injertos de diversas células tumorales humanas, incluyendo JSQ-3, DU145 y MDA-MB-435, mientras que los tejidos y órganos normales, incluyendo los muy proliferativos del intestino y de médula ósea, no dieron muestras de transfección. La capacidad de direccionamiento a tumor altamente eficaz en la presente invención también se puso de manifiesto en los experimentos en los que se comprobó que las metástasis, e incluso micrometástasis del tamaño de unas pocas células, se habían transfectado específicamente tras la administración sistémica del complejo.

El sorprendente éxito de la presente invención se puso de manifiesto por el descubrimiento de que la administración sistémica del complejo folato-liposoma-wtp53 o transferrina-liposoma-wtp53, en combinación con radiación o quimioterapia, dio muy buenos resultados en estudios con un modelo de ratón desnudo. La elevada eficiencia de este sistema da lugar a un grado tan elevado de sensibilización de los tumores de injerto humano JSQ-3 y DU145 a la radiación, que no solo se produce una inhibición del crecimiento del cáncer sino que, en algunos experimentos, los tumores y metástasis preexistentes se eliminaron completamente durante un prolongado periodo de tiempo. En algunos casos, dicho periodo (más de un año sin enfermedad) es tan prolongado que se puede considerar que la patología ha sido curada. También se puso de manifiesto que los tumores de injerto de ratón desnudo de cáncer de mama humano MDA-MB-435 y cáncer pancreático humano PANC I se sensibilizaron considerablemente mediante la administración sistémica de complejo folato-liposoma-wtp53 o transferrina-liposoma-wtp53 a agentes quimioterapéuticos, incluyendo doxorrubicina, cisplatina, docetaxel o gemcitabina.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "transfección" se utiliza para describir la administración dirigida de una molécula terapéutica a células eucariotas utilizando el complejo ligando-liposoma según la invención y la introducción de la molécula terapéutica en la célula mediante diversos procedimientos, tales como endocitosis mediada por receptor. Preferentemente, la célula diana se puede seleccionar a través del ligando del complejo, de tal modo que dicho ligando se enlaza a un receptor que se expresa distintamente sobre la superficie de la célula
diana.

Las composiciones farmacéuticas preferidas según la presente invención son aquellas que incluyen, dentro de una solución o un tampón farmacéuticamente aceptables, un complejo que consiste en un ligando, un liposoma catiónico-neutro y una molécula terapéutica.

Otras formas de realización de la presente invención son kits para su utilización en la administración sistémica de una molécula terapéutica mediante el complejo ligando-liposoma, que se puede formular en forma de composiciones terapéuticas para la administración sistémica. Generalmente, los kits según la presente invención comprenden, dentro de recipientes separados y adecuados, una formulación farmacéutica del ligando, del liposoma y de la molécula terapéutica. En la forma de realización preferida, el ligando es folato o transferrina, el liposoma consiste en un lípido catiónico y un lípido neutro, y la molécula terapéutica es un constructo que soporte el wtp53 bajo control del promotor de CMV, o bien un oligonucleótido antisentido. Los tres componentes se pueden mezclar en condiciones estériles y se pueden administrar al paciente dentro de un periodo de tiempo razonable, habitualmente de 30 min a 24 horas, tras la preparación.

Los componentes del kit se proporcionan preferentemente en forma de soluciones o polvos secos. Preferentemente, los componentes proporcionados en forma de solución se formulan en agua para inyección estéril, junto con un tampón o tampones adecuados, agentes de control de la osmolaridad, antibióticos, etc. Los componentes proporcionados en forma de polvos secos se pueden reconstituir mediante la adición de un disolvente adecuado, tal como agua para inyección estéril.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas

La presente invención utiliza la administración sistémica de un complejo de administración ligando/liposoma catiónico para la administración dirigida a tumor de una molécula terapéutica a través de endocitosis mediada por receptor. En una de las formas de realización preferidas, los liposomas dirigidos por ligando se utilizan para administrar una molécula terapéutica que comprende un gen que codifica p53 de tipo salvaje (wt). El gen terapéutico se dirige y se administra de forma efectiva a células tumorales, lo que provoca la restauración de la función normal del gen p53, ausente en muchos tumores. Dicha restauración tiene un efecto profundo en la capacidad de tratamiento de los tumores. En otra forma de realización preferida, las moléculas terapéuticas que se administran son oligonucleótidos antisentido dirigidos contra los genes en la ruta de crecimiento celular. La modulación a la baja de dichos genes provoca la sensibilización de las células tumorales e injertos a la radiación y los agentes quimioterapéuticos. En otra forma de realización, la "molécula terapéutica" es un vector vírico intacto (por ejemplo, una partícula de adenovirus o retrovirus que contiene un ácido nucleico terapéutico) que se administra a la célula diana a través del complejo ligando/liposoma.

En otro aspecto, la presente invención da a conocer composiciones y procedimientos para llevar a cabo una terapia génica a efectos de restaurar la función del wtp53 en las células tumorales, lo que provoca la inversión de los fenotipos quimiorresistentes o radiorresistentes y, en consecuencia, la mejora de la capacidad de tratamiento del tumor mediante quimioterapia y/o radioterapia.

La presente invención da a conocer un procedimiento nuevo y mejorado para llevar a cabo una terapia génica del cáncer proporcionando un sistema de administración sistémico ("complejo") que se dirige específicamente a células tumorales, incluyendo metástasis, y da lugar a una modalidad de tratamiento del cáncer más efectiva. Dicho procedimiento utiliza un sistema de liposoma catiónico dirigido por ligando a efectos de administrar una molécula terapéutica a las células tumorales. En una de las formas de realización preferidas, dicha molécula terapéutica es wtp53. La inclusión de un ligando de direccionamiento a la célula (por ejemplo, un ligando de folato o transferrina) en el complejo liposoma-ADN aprovecha la capacidad de direccionamiento a tumor y la endocitosis mediada por receptor asociadas con el ligando para introducir el wtp53 de forma eficiente y específica en las células tumorales in vivo e in vitro. La consecuencia de dicha restauración de la función del wtp53 es un aumento de la sensibilización a la radioterapia y la quimioterapia convencionales, aumentando su eficacia y/o reduciéndose la dosis total de las mismas.

Las composiciones liposómicas de ejemplo se basan en el lípido catiónico DOTAP y en el lípido neutro fusogénico DOPE conjugados (por ejemplo, esterificados) con ácido fólico (a efectos de proporcionar ligando de folato), o simplemente mezclados con transferrina saturada con hierro. La relación entre los propios lípidos, así como la relación lípido:ADN, se optimizan para la administración in vivo, así como para diferentes tipos de células tumorales, por ejemplo adenocarcinoma frente a carcinoma de células escamosas. Los estudios in vitro demuestran que la adición del ligando hace aumentar sustancialmente la eficiencia de transfección para las células tumorales en comparación con la utilización de liposoma únicamente, incluso en presencia de niveles elevados de suero. La transfección de wtp53 mediante dicho procedimiento da lugar a una radiosensibilización sustancial in vitro de una línea celular de SCCHN previamente resistente a la radiación.

La capacidad de direccionamiento a tumor in vivo de este sistema se evaluó utilizando el gen reportero de \beta-galactosidasa en tres tipos diferentes de cáncer: SCCHN, cáncer de mama y cáncer de próstata. Estos estudios demostraron que, tras la administración intravenosa de los complejos, únicamente los tumores fueron transfectados, con una eficiencia comprendida entre el 50 y el 70%, mientras que los órganos y tejidos normales, incluyendo las muy proliferativas células de médula ósea y de criptas intestinales, no dieron ninguna muestra de expresión del gen reportero. Se observó cierta cantidad de complejo ligando-liposoma-ADN en los macrófagos. De forma muy significativa, incluso las micrometástasis de pulmón, bazo y nódulos linfáticos mostraron pruebas de una transfección altamente eficiente y específica.

Cuando el complejo de ligando-liposoma-wtp53 administrado sistémicamente se administró a ratones con injertos de SCCHN humanos resistentes a radiación, y se reanudó la radioterapia, los tumores experimentaron una regresión completa. El examen histológico de la zona afectada anteriormente por el tumor reveló la permanencia únicamente de tejido normal y de cicatrización, sin ningún indicio de células tumorales vivas. Este hecho contrastaba con los tumores de los animales tratados únicamente con el complejo ligando-liposoma-p53 o únicamente con radiación. En estos animales, se puso de manifiesto cierta cantidad de muerte celular. Sin embargo, permanecían núcleos de células tumorales vivas, lo que provocaba nuevamente el crecimiento de tumores en dichos animales. Sorprendentemente, no se observó ninguna recurrencia de los tumores en los animales que recibieron la terapia de combinación, ni siquiera un año tras la finalización del tratamiento. Se observaron resultados similares en ratones con injertos de tumor de próstata con radiación y agentes quimioterapéuticos, así como con injertos de cáncer de mama y cáncer de páncreas humanos con agentes quimioterapéuticos. En consecuencia, se considera que este sistema proporciona una forma más eficaz de terapia contra el cáncer.

En consecuencia, la presente invención representa una mejora significativa sobre las terapias experimentales actuales contra el cáncer, tales como la inyección local de vectores adenovíricos que portan una molécula terapéutica, tal como p53, que son frecuentemente incapaces de administrar una molécula terapéutica al tejido tumoral entero (masa tumoral primaria). La administración local también carece de la capacidad de llegar a las metástasis alejadas. La capacidad de direccionamiento específico proporcionada por la presente invención también resulta ventajosa por el hecho de que reduce los efectos secundarios que se pueden asociar con la absorción general no específica de la molécula terapéutica.

Cuando se administra junto con terapias adyuvantes, y cuando las células diana son células cancerosas, la absorción del complejo ligando-liposoma-molécula terapéutica por parte de las células diana no solo hace disminuir la velocidad de proliferación de dichas células, sino que provoca una mayor muerte celular de las mismas y una regresión tumoral a largo plazo. El sistema de administración según la presente invención hace predecir la prolongación de la supervivencia de los pacientes.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar formas de realización preferidas de la presente invención.

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Ejemplo 1

Construcción del vector de expresión p53

Este ejemplo describe la construcción de vectores de expresión p53. Los procedimientos utilizados son los comúnmente conocidos por los expertos en la materia. Sin embargo, la presente invención no se limita a ningún sector de expresión particular.

Los plásmidos lanzadera adenovíricos pRSVp53, pRSVpRo, pCMVp53 y pCMVpRo que contienen el ADNc sentido y antisentido de p53 se muestran en la figura 1. Estos plásmidos se construyeron clonando el fragmento de ADNc p53 XbaI de 1,7 kb en un vector lanzadera adenovírico. Davidson y otros, Experimental Neurobiology 125, 258-267 (1994) se incorpora como referencia en la presente memoria con el objetivo de dar a conocer la preparación de dichos vectores lanzadera. La orientación se determinó mediante digestión por restricción y se confirmó mediante secuenciación cíclica de ADN. Los plásmidos se expandieron en E. coli DH5\alpha y se purificaron por Qiagen Plasmid Mega/Giga Kits (Qiagen). Los plásmidos purificados se cuantificaron espectrofotométricamente con valores de A_{260}/A_{280} de aproximadamente 1,90. La electroforesis con gel de agarosa (0,8%) confirmó que más del 95% del ADN plásmido estaba superenrollado.

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Ejemplo 2

Síntesis de complejos ligando-liposoma-ADN

Este ejemplo describe un procedimiento adecuado para la producción del complejo ligando-liposoma-molécula terapéutica, en el que la molécula terapéutica es ADN plásmido. Se hacen reaccionar 15 mmol de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) en cloroformo seco con 20 mmol éster de N-hidroxisuccinimida de ácido fólico (véase Lee, R.J., y otros, J. Biol. Chem. 269, 3198-3204 (1994), que se incorpora como referencia a la presente memoria con el propósito de dar a conocer dichos procedimientos) en presencia de 20 mmol de trietilamina durante 4 horas a temperatura ambiente, y a continuación se lava 3 veces con PBS a efectos de obtener folato-DOPE en cloroformo. La cromatografía de capa fina (cloroformo:metanol:ácido acético, 80:20:5) reveló que más del 95% de DOPE (Rf = 0,65-0,70) se había convertido a folato-DOPE (Rf = 0,90-0,95). LipF(A) se preparó del modo siguiente: una solución en cloroformo de 5 \mumol de dioleoiltrimetilamonio propano (DOTAP), 5 \mumol de DOPE y 0,1 \mumol de folato-DOPE se mezclaron en un matraz de fondo redondo, y el cloroformo se evaporó a presión reducida. Se añadieron 10 ml de agua estéril a dicho matraz a efectos de suspender los líquidos, a continuación se sometió el contenido a sonicación durante 10 min en un sonicador de tipo baño a 4ºC. La concentración final de LipF(A) fue de 1 nmol/\mul de lípidos totales. El complejo LipF(A)-ADN para la utilización in vitro se preparó mezclando volúmenes iguales de LipF(A) y ADN en medio libre de folato RPMI-1640 libre de suero (Life Technologies, Inc.) e incubando a temperatura ambiente, con balanceo frecuente, durante 15-30 minutos. El ensayo de complejación de ADN puso de manifiesto que para la relación de 1 \mug de ADN:8-10 nmol de LipF(A), casi todo el ADN añadido se complejó con lípidos. Para los experimentos in vivo, se mezcló ADN plásmido (diluido en tampón HEPES, pH 7,4, sobre la base de la cantidad total de ADN/ratón) con LipF(A) (en agua) en una relación de 1 \mug de ADN/8-12 nmol de lípidos, y se incubaron durante 15-30 minutos a temperatura ambiente con balanceo frecuente. Se añadió una solución de dextrosa al 50% a efectos de alcanzar una concentración final del 5% de dextrosa, se mezcló por inmersión y se comprobó la aparición de indicios de precipitación (presencia de materia particulada o turbulencias). En ambos casos, se puso de manifiesto que los complejos de LipF(A)-ADN eran estables durante 24 horas a 4ºC en condiciones de oscuridad, sin pérdida sustancial de eficiencia de transfección.

Se prepararon liposomas catiónicos consistentes en dioleoiltrimetilamonio propano (DOTAP) y dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE) (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, EE.UU.). La concentración final de liposomas fue de 2 nmol/\mul. Se disolvió holo-transferrina (Tf, saturada de hierro, Sigma) en agua pura a 5 mg/ml. El complejo Tf-liposoma-ADN para experimentos in vitro se preparó tal como se describe en Cheng, P.W., Human Gene Therapy 7, 275-282 (1996) (que se incorpora a la presente memoria como referencia con el propósito de ilustrar la preparación del liposoma) con modificaciones. En resumen, se añadieron 12 nmol de liposomas a 18 mg de Tf en 100 \mul de EMEM libre de suero y se incubaron durante 5-15 min a temperatura ambiente con balanceo frecuente. A continuación, esta solución se mezcló con 1,2 \mug de ADN plásmido en 100 \mul de EMEM libre de suero y se incubó durante 15-30 minutos a temperatura ambiente con balanceo frecuente. El complejo preparado de Tf-liposoma (designado complejo LipT(A)-ADN) se utilizó para transfección celular in vitro inmediatamente, dentro de 1 hora tras la preparación, a pesar de que se puso de manifiesto que era estable, como mínimo, durante 24 horas con las mismas eficiencias de transfección. Se utilizó electroforesis en gel de agarosa para evaluar la complejación de ADN por LipT(A). Se comprobó que más del 90% del ADN se había complejado al liposoma. Para los estudios in vivo, el liposoma y la transferrina (en agua) se mezclaron e incubaron durante 5-15 minutos a temperatura ambiente con balanceo frecuente. A continuación, esta solución se mezcló con ADN (en tampón HERPES, pH = 7,4) y se incubó durante 15-30 minutos a temperatura ambiente con balanceo frecuente. Se añadió una solución de dextrosa al 50% a efectos de alcanzar una concentración final del 5% de dextrosa, se mezcló por inmersión y se comprobó la aparición de indicios de precipitación (presencia de materia particulada o turbulencias). En ambos casos, se puso de manifiesto que los complejos de LipT(A)-ADN eran relativamente estables durante 24 horas a 4ºC en condiciones de oscuridad, sin pérdida sustancial de eficiencia de transfección.

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Ejemplo 3

Optimización de folato-liposoma por tinción X-gal

Este ejemplo describe la optimización del complejo de folato-liposoma catiónico (LipF) según la presente invención para carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN). A efectos de optimizar la eficiencia de transfección para la línea celular JSQ-3 de SCCHN, el gen LacZ de E. coli, dirigido por un promotor SV40 en plásmido pSVb, se utilizó como reportero. La eficiencia de transfección se calculó sobre la base del porcentaje de células teñidas con X-gal. Tal como se muestra en la tabla 1, la presencia de ligando folato en el complejo hizo aumentar sustancialmente la expresión del gen reportero. El liposoma catiónico no enlazado a ligando (Lip(A)) dio lugar a una eficiencia de transfección del 10%-20% en JSQ-3, in vitro, mientras que LipF(A) dio lugar a que un 60%-70% de las células expresaran el gen de \beta-galactosidasa. La adición de 1 mM de ácido fólico libre a las células antes de la transfección fue capaz de bloquear los receptores de folato en las células, reduciéndose de este modo la eficiencia de transfección al 20%, similar a la observada con LipF(A). Estos resultados se muestran que la utilización de folato como ligando aumenta la eficiencia de transfección de los liposomas catiónicos, y que dicho efecto está mediado por el receptor de folato. Sobre la base de un estudio reciente que indica que la tinción X-gal podría infravalorar el alcance de expresión de gen \beta-galactosidasa en un 20% o más, resulta concebible que la eficiencia de transfección con el liposoma dirigido por ligando pueda exceder realmente el 70% indicado anteriormente.

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TABLA 1 Eficiencias de transfección in vitro para LipF(A) en células JSQ-3:*

1

*60% de células JSQ-3 confluentes, cultivadas en medio libre de folato en una placa de 24 pocillos, se transfectaron durante 5 horas con 0,5 ml de solución de transfección que contenía 1,2 \mug de pSVb. Tras 2 días adicionales en cultivo, las células se fijaron y tiñeron con X-gal. La eficiencia de transfección se calculó como porcentaje de células teñidas de azul.

**El folato se añadió inmediatamente antes de la transfección.

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Ejemplo 4

Optimización del sistema LipT(A) mediante ensayo con luciferasa

Este ejemplo describe la optimización del complejo de transferrina-liposoma catiónico (LipT) según la presente invención para carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN). El sistema LipT(A) se optimizó para la transfección de JSQ-3 utilizando los ensayos con luciferasa. El gen de luciferasa de luciérnaga dirigido por promotor de citomegalovirus (CMV) en plásmido pCMVLuc se utilizó como gen reportero (Promega). Se colocaron 5 x 10^{4} células JSQ-3/pocillo en una placa de 24 pocillos. 24 horas más tarde, las células se lavaron una vez con EMEM sin suero, y se añadieron 0,3 ml de EMEM sin suero o antibióticos a cada pocillo. El complejo de Tf-liposoma-pCMVLuc (LipT(A)-Luc) recién preparado, que contenía diferentes cantidades de ADN plásmido de hasta 1,0 \mug en 0,2 ml de EMEM, se añadió a las células. Tras una incubación de 5 horas a 37ºC y 5% de CO_{2}, se añadieron a cada pocillo 0,5 ml de EMEM suplementados con 20% de suero bovino fetal y 1 \mug/ml de hidrocortisona. 24 horas más tarde, las células se lavaron una vez con PBS, se lisaron con 100 \mul/pocillo de 1X Reporter Lysis Buffer (Promega), y las actividades de luciferasa expresadas se midieron con Luciferase Assay System (Promega) en un luminómetro. Se utilizó un estándar de luciferasa de luciérnaga recombinante (Promega) durante cada medición para convertir las lecturas del luminómetro de unidades relativas de luz (RLU) a la cantidad equivalente de luciferasa expresada. La concentración de proteína del lisado celular se midió utilizando el kit Bio-Rad DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories). Los resultados se expresaron como \mug de luciferasa equivalente por mg de proteína total. Las células JSQ-3 se transfectaron con LipT(A)-pCMVLuc (LipT(A)-Luc) para diferentes relaciones ADN/lípido en el complejo. La transferrina hizo aumentar sustancialmente la eficiencia de transfección de los liposomas catiónicos. En condiciones óptimas, es decir, una relación de ADN/lípido/Tf de 1 \mug/10 nmol/12,5 \mug, la luciferasa se expresó a 12,5 +/- 1,1 \mug/mg de proteína total, o 1,25% de proteína total, de 7 a 10 veces más que el liposoma solo, sin
transferrina.

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Ejemplo 5

Transfección in vitro de células JSQ-3 mediante LipT(A)-pSVb

Este ejemplo utiliza un ensayo colorimétrico cuantitativo de \beta-galactosidasa, tal como se describe en el ejemplo 3, a efectos de demostrar la eficiencia de transfección aumentada del complejo de transferrina-liposoma según la invención. Se utilizó \beta-galactosidasa (Boehringer) purificada como estándar. Los resultados se expresaron como miliunidades (mU) de \beta-galactosidasa equivalentes por mg de proteína total. Para los estudios histoquímicos de transfección de Tf-liposoma-pSVb, se transfectaron células JSQ-3 confluentes en un 60% en una placa de 24 pocillos se transfectaron durante 5 horas con 1,2 \mug de pSVb con o sin LipT(A). Tras 2 días adicionales en cultivo, las células se fijaron y tiñeron con X-gal. La eficiencia de transfección se calculó como porcentaje de células teñidas de azul. En ensayo cuantitativo de \beta-galactosidasa, las células JSQ-3 transfectadas en la condición óptima, con 0,5 ug de ADN/10^{5} células de LipT(A)-pSVb, expresaron 15,04 +/- 0,60 mU/mg de proteína total de \beta-galactosidasa sin suero, y 10,95 +/- 0,15 mU/mg con suero. En los estudios histoquímicos, la transfección con LipT(A)-pSVb dio lugar a que el 70%-80% de las células se transfectaran. La presencia de suero durante la transfección redujo ligeramente la eficiencia de transfección, pero incluso con suero, el 40-50% de las células se tiñeron de azul, mientras que el liposoma catiónico sin ligando dio lugar únicamente a una eficiencia del 10-20%. Estos resultados demostraron que la utilización de Tf como ligando hace aumentar sustancialmente la eficiencia de transfección de los liposomas catiónicos, incluso en presencia de
suero.

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Ejemplo 6

Direccionamiento selectivo a tumor y metástasis mediante el complejo ligando-liposoma in vivo

Este ejemplo demuestra la capacidad del liposoma complejado con folato o transferrina de dirigirse selectivamente al tejido tumoral in vivo. Se indujeron injertos mediante la inyección subcutánea de células JSQ-3, MDA-MB-435 o DU145. Se inyectaron 2,5 x 10^{6} (JSQ-3) ó 5 x 10^{6} (DU145) células en la zona lumbar, encima de la cola, de ratones desnudos atímicos hembra (NCr nu-nu) de 4-6 semanas. Se inyectaron 1 x 10^{7} células MDA-MB-435 subcutáneamente en el panículo adiposo mamario de los ratones. Para el modelo de metástasis, se inyectaron 1 x 10^{6} células JSQ-3 o MDA-MB-435 por vía intravenosa, a través de la vena de la cola, en los animales. LipF(A)-pSVb o LipF(D)-pSVb se prepararon tal como se describe en el ejemplo 2. Se inyectaron intravenosamente LipF-pSVb o plásmido pSVb solo (en dextrosa al 5%) a través de la vena de la cola, a 25 \mug de ADN plásmido/300 \mul/animal. Dos días y 10 días tras la inyección de ADN, se extirparon los tumores y los órganos de ratón, se cortaron en secciones de 1 mm, se lavaron una vez con PBS y se fijaron con formaldehído al 2%-glutaraldehído al 0,2% durante 4 horas a temperatura ambiente. Las secciones tumorales fijadas se lavaron 4 veces, cada una durante 1 hora, y se tiñeron con solución de X-gal más 0,1% de NP-40 (pH 8,5) a 37ºC durante una noche. Las secciones tumorales teñidas se incrustaron y seccionaron utilizando procedimientos histológicos normales y se contratiñeron con Nuclear Fast Red. Se examinaron cuatro secciones por tumor a efectos de evaluar la expresión del gen de \beta-galactosidasa, tal como indican las células teñidas de azul.

Se inyectaron por vía intravenosa LipF(A)-pSVb o pSVb solo en ratones desnudos portadores de injertos JSQ-3. Dentro de las siguientes 48 horas, el grupo inyectado con LipF(A)-pSVb mostró expresión del gen reportero en los tumores con una eficiencia de transfección in vivo de aproximadamente 40-50%. En cambio, con el plásmido pSVb solo, menos del 1% de las células tumorales se tiñeron para el gen reportero de \beta-galactosidasa. 10 días tras la administración intravenosa de LipF(A)-pSVb, tanto el porcentaje como la intensidad de la tinción azul en los tumores se redujeron sustancialmente, lo que indica que la transfección sistémica mediada por LipF(A) es transitoria. Los órganos vitales de los ratones inyectados con LipF(A)-pSVb mostraron únicamente macrófagos tales como células de Kupffer (hígado) o células de polvo (pulmón) con tinción azul, mientras que los propios hepatocitos y células alveolares de tumor permanecieron sin teñir. La selectividad del direccionamiento al tumor también se puso de manifiesto en los casos en los que se puso de manifiesto que el tumor invadía el músculo. El LipF(A)-pSVb transfectó únicamente el tumor, mientras que las células musculares permanecieron sin teñir. De forma más significativa, las muy proliferativas células de médula ósea y de criptas intestinales, aparentemente, no se transfectaron. Tanto las células de criptas como la médula ósea mostraron muy poca o ninguna (<1%) evidencia de tinción de gen reportero. La ausencia de transfección de LipF(A)-pSVb en la médula ósea y las células de criptas demuestra que el direccionamiento no es un efecto no selectivo de proliferación celular, sino que parece dirigirse a las células tumorales. Este hecho viene adicionalmente demostrado por la falta de tinción en las células endoteliales de los vasos sanguíneos, a pesar de que las mismas estuvieron expuestas a la concentración más elevada del complejo LipF(A)-pSVb a medida que el mismo viaja a través del flujo sanguíneo. Además, no se observó tinción en los centros de crecimiento linfoblástico del bazo, a pesar de que las células dendríticas mostraron tinción de \beta-galactosidasa.

Un problema esencial en la recurrencia y el tratamiento de cánceres es la metástasis. Para evaluar la capacidad del complejo LipF(A) de dirigirse a las células tumorales a parte del injerto subcutáneo, se inyectaron células JSQ-3 por vía intravenosa en ratones desnudos. Dos semanas tras la inyección, se formaron metástasis simuladas (islas de células tumorales en múltiples órganos). A continuación, se inyectaron por vía intravenosa los animales con LipF-pSVb y se examinó la expresión de \beta-galactosidasa en las metástasis simuladas. Se observó una extensa tinción de X-gal en una metástasis detectada en un nodo linfático torácico. En esta sección, se detectó un vaso sanguíneo (BV) rodeado por las células tumorales metastásicas. A pesar de que las células tumorales exhibieron una fuerte tinción de X-gal en 20-25 capas desde el vaso sanguíneo, no se observó ninguna expresión del gen reportero en las células endoteliales de dicho vaso sanguíneo, a pesar de que las mismas se vieron expuestas a la mayor concentración de complejo LipF(A)-pSVb a medida que el mismo viajaba a través del flujo sanguíneo. Estos resultados confirmaron la naturaleza selectiva de tumor del complejo LipF(A), y pusieron de manifiesto que las metástasis, así como los tumores primarios, pueden ser diana de liposomas que contienen folato.

Para evaluar el alcance de aplicabilidad de este sistema de administración ligado a folato y mediado por liposomas a cánceres distintos del SCCHN, también se llevaron a cabo experimentos con injertos de otras líneas celulares de tumores humanos, incluyendo líneas celulares de carcinoma de pecho humano MDA-MB-435, Hs578T, y la línea celular de cáncer de próstata humano DU145, que también es portadora de mt p53. En este caso, también una única inyección intravenosa de LipF(A)-pSVb puso de manifiesto la selectividad tumoral. Se observó un nivel elevado de expresión de \beta-galactosidasa en el tumor de panículo adiposo mamario MDA-MB-435, mientras que el tejido muscular normal adyacente permaneció sin teñir. La expresión de gen reportero no se detectó en tejidos no tumorales u órganos normales, incluyendo células de criptas intestinales y hepatocitos, mientras que los injertos subcutáneos de panículo adiposo mamario exhibieron un promedio del 50-70% de tinción azul. Dos semanas tras la inyección intravenosa de células MDA-MB-435, el LipF(A)-pSVb se administró sistémicamente mediante una única inyección en la vena de la cola. Incluso pequeñas metástasis de pecho simuladas en el pulmón exhibieron un nivel elevado de tinción, y el tejido pulmonar normal adyacente permaneció completamente sin teñir.

Se proporcionó a los ratones portadores de injertos DU145 una única inyección intravenosa de LipF(B)pSVb. Los tumores presentes en estos ratones también mostraron expresión del gen reportero, que representa una eficiencia de transfección in vivo, como mínimo, del 40-50%, un valor aproximadamente 50 veces mayor que el alcanzado con plásmido solo.

Los complejos de transferrina-liposoma, liposoma-pSVb y pSVb ADN se prepararon en dextrosa estéril al 5% en lugar de HBSS, a una relación de 1 \mug ADN/10 nmol liposoma/12,5 \mug transferrina. El modelo tumoral de ratón desnudo se estableció por inyección subcutánea de células JSQ-3 en el costado de ratones desnudos hembra de 4-6 semanas. Se inyectaron 30 \mug de pSVb ADN complejado con Tf-liposoma en 300 ml de volumen a cada ratón a través de la vena de la cola con una jeringuilla de 1 cm^{3} y una aguja de 30 G. En los grupos de control, se inyectó liposoma-pSVb o pSVb ADN sin liposoma. A los 2 días, los tumores en los ratones inyectados con LipT(A)-pSVb mostraron expresión del gen reportero, lo que representaba una eficiencia de transfección in vivo de aproximadamente 20-40%. En cambio, con plásmido pSVb solo, sin liposoma, menos del 1% de las células tumorales se tiñeron por la expresión del gen reportero. Diez días tras la administración intravenosa de LipT(A)-pSVb, se redujeron el porcentaje de células positivas y la intensidad de la tinción azul en los tumores, lo que indicaba que la transfección sistémica mediada por LipT(A) fue transitoria. Los órganos vitales de los ratones inyectados con LipT(A)-pSVb mostraron tinción únicamente de macrófagos (tales como células de polvo del pulmón y células de Kupffer del hígado), mientras que los hepatocitos y las células alveolares del pulmón permanecieron sin teñir. No se observó tinción en los centros de crecimiento linfoblástico del bazo, a pesar de que las células dendríticas exhibieron una tinción modesta. En resumen, la tinción histológica indicó que la administración del gen reportero mediante LipT(A) fue selectiva, tiñéndose más intensamente el injerto humano.

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Ejemplo 7

Expresión de proteína p53 exógena de tipo salvaje en células JSQ-3 transfectadas con LipF(A)-p53 y LipT(A)-p53

Este ejemplo pone de manifiesto la expresión de un gen exógeno, en este ejemplo particular p53 de tipo salvaje, en las células que se ponen en contacto y se transfectan mediante el sistema de administración según la presente invención. Habiendo optimizado la eficiencia de transfección tanto in vitro como in vivo, LipF(A) o LipT(A) se complejó al plásmido pCMVp53 de expresión de p53, que contiene ADNc de 1,7 kb de wt humano p53 (LipF(A)-p53) o (LipT(A)-p53). Para una respuesta a dosis de ADN de la expresión del gen p53, se colocaron 2 x 10^{5} células JSQ-3 en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Tras 24 horas, las células se lavaron una vez con EMEM sin suero y antibióticos, se transfectaron con 1 ml de solución de transfección que contenía LipF(A)-p53 en cantidades crecientes (0,25-8 \mug/10^{5} células) de ADN plásmido pCMVp53 complejado con LipF(A) o, como control, LipF(A)-pRo. Alternativamente, las células se transfectaron con LipT(A)-p53 o LipT(A)-pRo que contenían hasta 4 \mug de ADN plásmido/2 x 10^{5} células en una relación de 1 \mug ADN/10 nmol liposoma/15 \mug Tf en EMEM. Cinco horas tras la transfección, se añadieron 1 ml de EMEM complementado con 20% de FBS y 1 \mug/ml de hidrocortisona y se cultivaron durante otras 48 horas. Se recogieron las células transfectadas y se lisaron en tampón RIPA (Santa Cruz Biotechnology, Inc) y se llevó a cabo un análisis Western blot con el anticuerpo monoclonal pantrópico anti-p53 Ab-2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) utilizando procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia. Se cargaron 40 \mug de proteína total por carril.

Durante un curso de expresión del gen p53, se transfectaron 2 x 10^{5} células JSQ-3 con 2 \mug de pCMVp53 o pCMVpRo complejados con LipT(A). Las células se recogieron cada 24 horas durante 5 días tras la transfección y se utilizaron para llevar a cabo un análisis Western blot.

A efectos de investigar el efecto de la radiación sobre la expresión del gen p53, se transfectaron células JSQ-3 con LipT(A)-p53 o LipT(A)-pRo (2 \mug ADN/2 x 10^{5} células) durante 2 días, y a continuación se tripsinizaron e irradiaron en dosis progresivas de hasta 6 Gy de rayos gamma del ^{137}Cs en un irradiador J.L. Shepard and Associates Mark I. Las células irradiadas se volvieron a colocar en placas y se cultivaron durante otros 2 y 4 días antes de recolectarlas para el análisis Western blot.

Tras la transfección en células JSQ-3 in vitro, el análisis Western blot puso de manifiesto que la transfección con LipF(A)-p53 dio lugar a una expresión dependiente de la dosis de ADN y del tiempo del wtp53 exógeno. Como control, LipF(A) también se complejó con el plásmido pCMVpRo, que porta wt p53 en la orientación inversa (LipF(A)-pRo). La expresión de p53 en células JSQ-3 transfectadas con LipF(A)-pRo fue la misma que en las células no transfectadas. La expresión de wtp53 se observó a las 24 horas tras la transfección con LipF(A)-p53, con un pico a las 48 horas y volviéndose despreciable a las 120 horas de la transfección, poniendo de nuevo de manifiesto la naturaleza temporal de este sistema de administración de genes. La expresión transitoria resulta ventajosa, ya que permite inyecciones repetidas sin acumulación de wtp53.

Se utilizó el análisis Western blot para demostrar que el wtp53 transducido con LipT(A) estaba siendo expresado en las células JSQ-3. La transfección con dosis aumentadas de plásmido pCMVp53 de expresión de p53 complejado con LipT(A) (LipT(A)-p53) dio lugar a una expresión de wtp53 dependiente de la dosis de ADN, mientras que no se observó ninguna expresión de p53 exógeno en las células JSQ-3 transfectadas con LipT(A)-pRo, que porta ADNc de wtp53 en la orientación inversa bajo control del promotor CMV. La expresión de wtp53 en peso a partir de las 24 horas tras la transfección con LipT(A)-p53 presentó un pico al segundo día, reduciéndose posteriormente. 5 días tras la transfección, solo quedaban trazas de p53 exógeno, lo que indicaba que la expresión de wtp53 mediada por LipT(A) era transitoria.

Cuando las células JSQ-3 se irradiaron a las 48 horas tras la transfección con LipT(A)-p53 o LipF(A)-p53 (el pico de la expresión de wtp53), la expresión de wtp53 exógeno aumentó sustancialmente de acuerdo con las dosis de radiación gamma, y se mantuvo estable durante hasta 4 días, es decir, 6 días tras la transfección. Estos resultados ponen de manifiesto que la radiación gamma puede aumentar y/o estabilizar el wtp53 exógeno, lo que sugiere que el p53 exógeno se comporta de un modo análogo al wtp53 endógeno normal, del que se conoce que se estabiliza por exposición a la radiación.

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Ejemplo 8

Sensibilización de JSQ-3 a la radiación in vitro

Se ha puesto de manifiesto que la presencia de una forma mutada de p53 se correlaciona con una mayor resistencia a la radiación en algunos tumores y líneas celulares humanos (8, 10). En consecuencia, este ejemplo examina el efecto de la sustitución de wtp53 por transfección mediada por LipF(A) sobre la supervivencia a la radiación. La transfección de p53 mediada por LipF(A) fue capaz de sensibilizar las células JSQ-3 a la radiación de un modo dependiente de la dosis de ADN. En las condiciones óptimas de transfección, es decir, 3 \mug de ADN plásmido por 10^{5} células, el valor D_{10} se redujo sustancialmente desde el nivel altamente resistente encontrado en las células no transfectadas (6,65 +/- 0,43 Gy) hasta 4,33 +/- 0,06 Gy (p < 0,01). Esto representa aproximadamente una sensibilización aumentada de 6 a 10 veces a la muerte por radiación. Un valor D_{10} de 4,33 Gy (4 \mug/10^{5} células) es similar al de una línea celular de fibroblasto humano radiosensible H500 (D_{10} = 4,50 +/- 0,05 Gy), y está dentro del intervalo considerado radiosensible. Ni el plásmido pCMVp53 solo, ni el LipF(A)-pRo, tuvieron ningún efecto sensibilizador sustancial, sobre la base de los valores D_{10} (p > 0,05) (figura 5). En términos de supervivencia, esta reducción de más de 2 Gy representa un aumento espectacular de sensibilidad en los efectos de destrucción de la radiación ionizante. Clínicamente, este salto en la sensibilidad puede hacer que un tumor resistente sea curable con dosis convencionales de radiación.

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Ejemplo 9

Apoptosis inducida por transfección de p53 e irradiación gamma

Este ejemplo demuestra que la reintroducción del wtp53 utilizando el complejo optimizado de transferrina-liposoma según la presente invención es capaz de restaurar una ruta apoptótica dependiente de p53 funcional. Se transfectaron células JSQ-3 con LipT(A)-p53 o LipT(A)-pRo (1 a 3 \mug ADN/2 x 10^{5} células) y se recolectaron las células fijadas y flotantes cada día durante 3 días para el análisis del porcentaje de células apoptóticas. Para la apoptosis inducida por radiación, las células se transfectaron durante 2 días, a continuación se tripsinizaron y se irradiaron tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 8. Las células, de nuevo puestas en placas, se recolectaron 4 días después para realizar el porcentaje de células apoptóticas. Las células recolectadas se tiñeron con el kit Annexin V-FITC (Trevigen, Inc., Gaithersburg, EE.UU.) según el protocolo del fabricante. El Annexin V-FITC se enlaza específicamente a la fosfatidilserina presente en las células apoptóticas. Las células teñidas se analizaron utilizando un citómetro FACStar (Becton & Dickinson).

Para evaluar el efecto de la restauración de wtp53 en la inducción de la apoptosis, se transfectaron células JSQ-3 con LipT(A)-p53 o LipT(A)-pRo. Se observó una inducción clara de la apoptosis en la restauración de wtp53 mediada por LipT(A), de un modo dependiente de la dosis. El porcentaje de células apoptóticas presentó un pico en el segundo día de transfección, lo que se correlacionaba con los niveles de expresión de wtp53 en las células, tal como puso de manifiesto el análisis Western blot. A efectos de evaluar el efecto de la irradiación en la inducción de la apoptosis, las células transfectadas se trataron con diferentes dosis de radiación gamma. De 2 a 4 días más tarde, las células se tiñeron con Annexin V-FITC y se analizaron por citometría de flujo utilizando FACStar (Becton & Dickinson). La radiación gamma provocó un aumento sustancial del porcentaje de células apoptóticas únicamente en las células transfectadas con LipT(A)-p53, del 18,7% (0 Gy) al 38,7% (4 Gy) y 46,4% (6 Gy) 4 días tras la irradiación. No se observó ningún aumento en las células no transfectadas (UT) ni en las células tratadas únicamente con LipT(A) o LipT(A)-pRo. Dicho aumento fue dependiente de la dosis de radiación y se correlacionaba con los niveles de expresión de wtp53 obtenidos por análisis Western blot, lo que puso de manifiesto que el aumento de la apoptosis por radiación era proporcional al nivel de wtp53 en las células. Es decir, cuanto más wtp53 se expresaba, más apoptosis se
inducía.

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Ejemplo 10

Sensibilización de tumores de injerto JSQ-3 a la radiación mediante la administración sistémica de LipF(A)-p53

En este ejemplo, se demuestra la utilización del folato-liposoma-molécula terapéutica administrado de forma sistémica como procedimiento de tratamiento del cáncer. En este ejemplo particular, la molécula terapéutica es el gen p53 normal humano de tipo salvaje (pCMVp53).

El carcinoma de células escamosas del tracto aerodigestivo superior da lugar a una morbidez y una mortalidad significativas a pesar de las recientes mejoras terapéuticas. Generalmente, los pacientes que presentan la enfermedad en la etapa temprana (etapa I ó II) se tratan con cirugía o radiación, mientras que los pacientes, más frecuentes, que presentan la enfermedad avanzada (etapa III ó IV) se tratan generalmente con cirugía seguida de radiación. A pesar de ello, la mitad o más de los pacientes tratados para la enfermedad en etapa avanzada presentan recaída en el lugar de la enfermedad original o con metástasis lejanas, y terminan falleciendo. Presumiblemente, una proporción significativa de estos fracasos clínicos son debidos a la resistencia a la radiación en un subconjunto de células tumorales. En consecuencia, resulta previsible que el desarrollo de un procedimiento efectivo para sensibilizar los tumores de cabeza y cuello a la radioterapia tenga un efecto importante en el tratamiento de esta enfermedad.

Las formas mutantes (mt) del gen supresor tumoral p53 se han asociado en diversos estudios con un pronóstico clínico pobre para diversos tipos de afectaciones malignas. El p53 también puede estar involucrado en el desarrollo y el progreso del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN). Utilizando una variedad de procedimientos de detección, se han identificado anormalidades en el gen p53 y/o en su expresión en un 33%-100% de los tejidos SCCHN. La presencia de mt p53 también puede ser indicativa en SCCHN de una mayor frecuencia y una recurrencia más rápida del tumor. Se ha puesto de manifiesto que el p53 de tipo salvaje (wt) funciona en la regulación del ciclo celular tras daños o tensión en el ADN, más que durante la proliferación y desarrollo normales. Dado que también se ha detectado que la presencia de mt p53 se correlaciona con una resistencia aumentada a la radiación (RR) en algunos tumores y líneas celulares humanos, y dado que un elevado porcentaje de tumores de cabeza y cuello no responden a la terapia por radiación, resulta concebible que exista una relación de causa-efecto entre la ausencia de wtp53 funcional detectada en un elevado número de SCCHN y dicha RR observada. En consecuencia, la sustitución del wtp53 puede dar lugar a la sensibilización de dichos tumores a la radioterapia convencional.

Se inyectaron 2,5 x 10^{6} células JSQ-3 subcutáneamente en la zona lumbar, encima de la cola, de ratones desnudos atímicos hembra (NCr nu/nu) de 4-6 semanas. Cuando los tumores alcanzaron el tamaño apropiado, se proporcionaron inyecciones intravenosas de LipF(A)-p53, pCMVp53 o LipF(A)-pRo, a 8 \mug ADN/400 \mul 5% dextrosa/ratón, dos veces a la semana, hasta un total de 5 inyecciones. Tras 48 horas desde la inyección intravenosa inicial, los animales se fijaron en un soporte de plomo que permitía irradiar exclusivamente la zona del tumor, y se administró la primera dosis fraccionada de radiación ionizante de 2,5 Gy de ^{137}Cs. A continuación, se administraron 2,5 Gy cada 48 horas a los animales, hasta una dosis total de 25 Gy. A efectos comparativos, un grupo de ratones no transfectados y un grupo de ratones receptores de LipF(A)-p53 no recibieron ninguna radiación.

A los ratones desnudos atímicos portadores de tumores JSQ-3 subcutáneos de aproximadamente 25-40 mm^{3} se les aplicaron inyecciones intravenosas, a través de la vena de la cola, con LipF(A)-p53 dos veces a la semana (un total de 5 inyecciones) y únicamente la zona del tumor se expuso a dosis fraccionadas de radiación gamma (un total de 25 Gy). A efectos de determinar si la proteína p53 transfectada se expresaba en los tumores, se extirpó un tumor procedente de los grupos no transfectados, LipF(A)-p53 y LipF(A)-pRo, durante el curso del experimento (tras 3 inyecciones y 12,5 Gy). Se observó un nivel elevado de proteína p53 exógena en el tumor tratado con LipF(A)-p53, hecho que confirmaba que el complejo de folato-liposoma catiónico es capaz de administrar sistémicamente el gen wtp53 a los tumores. El tratamiento solo con radiación tuvo un efecto limitado en los tumores en los animales no transfectados. La inyección intravenosa de ADN plásmido pCMVp53, o LipF(A)-pRo, en combinación con radiación ionizante, indujo inicialmente cierta inhibición del crecimiento tumoral. Sin embargo, de forma análoga a las circunstancias clínicas, dichos tumores, tal como los de los animales no transfectados, empiezan a volver a crecer tras la interrupción del tratamiento por radiación. Aunque el tratamiento únicamente con LipF(A)-p53 fue capaz de inhibir el crecimiento tumoral durante un periodo de tiempo durante e incluso después de la finalización de las inyecciones intravenosas, también estos tumores empezaron a aumentar de tamaño a las dos semanas de la última inyección intravenosa. En cambio, un 75% de los tumores que recibieron la combinación de LipF(A)-p53 y radiación remitieron completamente, sin mostrar ninguna señal de recurrencia ni siquiera 130 días después del tratamiento por radiación. Además, el otro 25% mostró un tumor residual mínimo, que se mantuvo estático en un volumen del 10% del volumen tumoral original a lo largo del experimento. El examen histológico de dicha masa residual puso de manifiesto que la misma representa una cicatriz madura sin presencia de células tumorales proliferativas.

Actualmente, tras más de un año desde el cese del tratamiento, todos los animales de control han muerto o se les ha practicado eutanasia compasiva debido a la carga tumoral. Sin embargo, los animales que recibieron el tratamiento de combinación siguen sin presentar ningún signo de reproducción del tumor.

Se obtuvieron resultados similares a partir de otro experimento independiente, en el que los volúmenes tumorales iniciales estaban comprendidos entre 25 y 60 mm^{3}. En este caso, nuevamente, aproximadamente un año tras la irradiación, no se observa ningún rebrote del tumor en los animales que recibieron el tratamiento de combinación.

Esta es la primera demostración de regresión tumoral total mediada por un complejo liposoma-p53 administrado sistémicamente. Estos estudios in vivo demuestran que la combinación de la terapia génica sistémica con LipF(A)-p53 y radioterapia convencional es significativamente más eficaz que cualquiera de dichos tratamientos por sí solos.

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Ejemplo 11

Sensibilización de tumores de injerto JSQ-3 a la radiación mediante la administración sistémica de LipT(A)-p53

En este ejemplo, se demuestra la utilización del complejo transferrina-liposoma-molécula terapéutica administrado sistémicamente como procedimiento de tratamiento del cáncer. En este ejemplo particular, la molécula terapéutica es el gen p53 normal humano de tipo salvaje (pCMVp53).

Se inyectaron 2,5 x 10^{6} células JSQ-3 subcutáneamente en la zona lumbar, encima de la cola, de ratones desnudos atímicos hembra (NCr nu/nu) de 4-6 semanas. De 7 a 10 días más tarde, los tumores crecieron aproximadamente hasta 40-50 mm^{3} en el lugar de inyección. Se inyectaron por vía intravenosa a cada ratón LipT(A)-p53 o LipT(A)-pRo recién preparados, que contenían 8 \mug de ADN en 300 ml de dextrosa al 5%, a través de la vena de la cola, dos veces por semana, durante un total de 5 inyecciones. 48 horas después de la inyección intravenosa inicial, los animales se fijaron en un soporte de plomo de tal modo que solo la zona del tumor quedaba expuesta a la radiación gamma, y se administró la primera dosis fraccionada de radiación ionizante de 2,5 Gy de ^{137}Cs. A continuación, se administraron 2,5 Gy cada 48 horas a los animales, hasta una dosis total de 25 Gy. A efectos comparativos, se utilizaron como controles un grupo de ratones no transfectados, así como un grupo de ratones inyectados con LipT(A)-p53 que no recibieron ningún tipo de radiación. Los tamaños tumorales se midieron semanalmente de modo ciego.

Se llevaron a cabo dos experimentos independientes con tumores de injerto SCCHN (JSQ-3), con resultados similares. A los primeros ratones portadores de tumores JSQ-3 subcutáneos de aproximadamente 25-40 mm^{3} se les aplicaron inyecciones intravenosas, a través de la vena de la cola, con LipT(A)-p53 dos veces a la semana (un total de 5 inyecciones) y únicamente la zona del tumor se expuso a dosis fraccionadas de radiación gamma (un total de 25 Gy). Se observaron los efectos a corto plazo de la radiación sobre el crecimiento tumoral en las células transfectadas utilizando el control LipT(A)-CMVpRo. Se observó únicamente una inhibición mínima del crecimiento tumoral en los animales que recibieron el LipT(A)-CMVp53 sin radiación. En cambio, todos los tumores que recibieron la combinación de LipT(A)-CMVp53 y radiación mostraron una regresión prácticamente completa, sin mostrar ninguna señal de recurrencia ni siquiera 153 días después del tratamiento por radiación. En este momento, los animales portadores de tumores en los grupos de control han muerto o se han sometido a eutanasia compasiva debido a una carga tumoral excesiva. Sin embargo, un año tras la irradiación, el grupo de tratamiento de combinación (p53 y radiación) sigue sin mostrar ningún signo de reproducción del tumor. Como en el caso de los animales tratados con la combinación de LipF(A)-p53 y radiación, en un animal que había recibido el tratamiento de combinación, un mes tras el tratamiento, solo estaban presentes tejido cicatrizado y algunas células invasoras de Langerhans en el tejido residual del lugar del tumor original. Se observaron resultados similares en un segundo experimento in vivo.

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Ejemplo 12

Efecto de la terapia de combinación en un segundo modelo de cáncer

Este ejemplo pone de manifiesto que la eficacia de esta combinación novedosa de terapia génica con p53 dirigido a tumor mediada por liposoma y radioterapia convencional no se limita a SCCHN, aumentando la importancia clínica de este sistema. Se evaluó el efecto de la combinación de la terapia génica con p53 dirigida por folato y mediada por liposoma y la radiación sobre la línea celular prostática humana DU145 in vivo. Esta línea celular de adenocarcinoma procedía originalmente de una lesión cerebral de un paciente con un carcinoma metastásico extendido de la próstata y portador de mtp53. Los presentes inventores han puesto de manifiesto que dicha línea celular es resistente a la muerte celular por radiación gamma (D_{10} = 5,8 +/- 0,22 Gy), una de las principales formas de terapia adyuvante para dicha enfermedad. Experimentos anteriores in vitro sugirieron que la sustitución del lípido neutro DOPE por colesterol puede dar lugar a una mayor eficiencia de transfección en este tipo de célula tumoral. Sobre la base de la actividad de luciferasa, hemos puesto de manifiesto que el LipF(D) da lugar a un aumento en un factor mayor de cuatro en la eficiencia de transfección en comparación con el LipF(A) en las células DU145. En consecuencia, a los ratones portadores de tumores DU145 de aproximadamente 70 mm^{3} se inyectó por vía intravenosa, a través de la vena de la cola, LipF(D)-p53 aproximadamente cada 5 días (hasta un total de 5 inyecciones), y los tumores se expusieron a dosis fraccionadas de radiación gamma (hasta un total de 25 Gy). En este experimento, se utilizó como control una composición de liposoma-p53 no dirigida por folato (Lip(D)-p53). Los resultados con estos tumores prostáticos fueron bastante similares a los de los tumores SCCHN. La radiación sola, la administración de LipF(D)-pRo más radiación, y la administración de Lip(D)-p53 no dirigido más radiación, tuvieron cierto efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral durante el curso de los tratamientos. Sin embargo, todos estos tumores aumentaron rápidamente de tamaño una vez interrumpido el tratamiento. En cambio, la combinación de LipF(D)-p53 más radiación volvió a dar lugar a una regresión a largo plazo de los tumores, incluso en el día 84, que representan 64 días tras el tratamiento. El descenso observado en el volumen tumoral del grupo de control en el día 63 fue debido a la pérdida de animales en este grupo debido a la carga tumoral. Un segundo experimento con tumores de aproximadamente 100 mm^{3} arrojó resultados análogos, sin observarse reproducción del tumor incluso 47 días tras el cese total del tratamiento.

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Ejemplo 13

Quimiosensibilización de JSQ-3 a cisplatina (CDDP) in vitro

Además de la radiación, la quimioterapia se está utilizando de forma cada vez más habitual en el tratamiento del SCCHN. Dado que la ausencia de wtp53 funcional ha sido asociada con la falta de respuesta a la quimioterapia, en este ejemplo se examina el efecto de una terapia génica con wtp53 mediada por liposoma y facilitada por ligando sobre la sensibilización de la línea celular JSQ-3 de SCCHN a los agentes quimioterapéuticos. Se colocaron 1 x 10^{4} células/pocillo en una placa de 96 pocillos. 24 horas más tarde, las células se transfectaron con LipT(A)-p53. Dos días tras la transfección, se añadieron agentes antineoplásicos en concentraciones crecientes (por triplicado). Entre 4 y 6 días más tarde, se llevó a cabo el ensayo de proliferación celular XTT y se calcularon los valores de IC_{50}, la concentración de fármaco que proporciona una inhibición del crecimiento del 50%. Se puso de manifiesto que el tratamiento con 0,2 \mug de wtp53 ADN complejado con LipT(A) sensibilizaba sustancialmente las células JSQ-3 a CDDP y 5-FU, dos fármacos utilizados frecuentemente en quimioterapia adyuvante. Mientras que la transfección con el complejo LipT(A) solo, o con LipT(A) portador de wtp53 en orientación inversa (LipT(A)-pRo), dio lugar a cierta sensibilización a CDDP, se puso de manifiesto un nivel de sensibilización 24 veces mayor que el de las células no transfectadas en las células transducidas con LipT(A)-p53. Además, también se observó una sensibilización mayor en un factor de 15,4 de JSQ-3 al agente quimioterapéutico 5-FU tras la transfección con el complejo LipT(A)-p53.

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Ejemplo 14

Quimiosensibilización mediada por p53 tal como viene indicada por una inducción aumentada de la apoptosis

Este ejemplo examina el efecto de la restauración de wtp53 mediada por ligando-liposoma sobre la apoptosis inducida por agente quimioterapéutico. Se cultivaron células JSQ-3 en placas de 6 pocillos y se transfectaron con LipT(A)-p53, LipT(A)-pVec (el vector sin el gen p53) o LipT(A) solo, a 1 ó 2 \mug de ADN por 2 x 10^{5} células. 24 horas más tarde, se añadieron los agentes quimioterapéuticos a cada conjunto de placas, en concentraciones cercanas a los valores de IC_{50} para cada línea celular. Tras un día adicional de incubación, se recolectaron las células fijadas y flotantes y se tiñeron con Annexin V-FITC, que se enlaza específicamente a la fosfatidilserina presente en las células apoptóticas, utilizando un kit Annexin V-FITC (Trevigen, Inc., Gaithersgurg, EE.UU.) según el protocolo del fabricante. Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo FACStar (Becton & Dickinson).

Se observó una inducción de la apoptosis dependiente de la dosis de p53 ADN en las células tratadas con el complejo de wtp53 mediado por LipT según la presente invención. Además, la adición de agentes quimioterapéuticos (CDDP, Taxotere, 5-FU) en dosis cercanas a sus valores de IC_{50} indujo un aumento sustancial del porcentaje de células apoptóticas en la población únicamente en las células transfectadas con LipT(A)-p53, no en las no transfectadas (UT) y en las transfectadas solo con LipT(A) o LipT(A)-pVec. Este aumento fue dependiente de la dosis de p53 ADN y se correlacionó bien con los niveles de expresión de wtp53 observados en los análisis Western blot, lo que demuestra que el aumento de la apoptosis inducido por los agentes quimioterapéuticos es proporcional al nivel de wtp53 en las células, es decir, cuanto más wtp53 se expresa, más apoptosis se induce. El incremento en la apoptosis observado tras la combinación de LipT(A)-p53 más fármaco es sustancialmente mayor que la suma del agente quimioterapéutico solo (UT más fármaco) más la transfección de p53 solo (p53 sin fármaco), lo que indica un efecto sinérgico cuando la terapia génica con p53 se combina con agentes quimioterapéuticos.

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Ejemplo 15

Quimiosensibilización de MDA-MB-435 a cisplatina o doxorrubicina in vitro mediante ligando-liposoma-p53

En el tratamiento del cáncer de mama, la ausencia de respuesta de una proporción sustancial de tumores y sus metástasis a la quimioterapia adyuvante es una preocupación central. En este ejemplo, se examina la capacidad del sistema de administración según la presente invención de sensibilizar las células de cáncer de mama a los agentes quimioterapéuticos utilizados en la actualidad.

Se utilizó la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-435. El complejo ligando-liposoma utilizado fue la composición, que se había optimizado para las células escamosas de cabeza y cuello, un tipo celular histológico diferente del que se encuentra en el cáncer de mama. La transfección con LipT(A)-p53 aumentó el efecto de la doxorrubicina sobre las células MDA-MB-435 en un factor de cuatro y el efecto de CDDP prácticamente en un factor de 12, en comparación con las células no transfectadas. Tal como se había observado en las células de SCCHN, se produjo cierta sensibilización mediante el complejo LipT(A)-pRo. También en este caso, aunque todavía no se había optimizado para carcinomas mamarios, se observó una quimiosensibilización de las células de cáncer de mama de la transfección con LipT(A)-p53.

Se obtuvieron resultados incluso más sorprendentes utilizando la composición, LipF(C), adaptada para adenocarcinoma, el tipo celular histológico de la mayoría de cánceres de pecho. Como anteriormente, los valores de IC_{50} se determinaron mediante el ensayo XTT. La transfección con LipF(C)-p53 aumentó el efecto de la doxorrubicina sobre las células MDA-MB-435 en un factor de 73,6 y el efecto del taxol en un factor de 31,6, en comparación con las células no transfectadas. Tal como se había observado en las células de SCCHN, se produjo cierta sensibilización mediante el complejo LipF(C)-pRo. Estos resultados demuestran la quimiosensibilización de las células de cáncer de mama mediante la transfección con complejo de liposoma-p53 dirigido por transferrina y folato.

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Ejemplo 16

Quimiosensibilización de células de cáncer de mama mediante terapia génica con LipF-p53 in vivo

Este ejemplo pone de manifiesto la capacidad del complejo ligando-liposoma-molécula terapéutica según la invención administrado sistémicamente para ser un agente terapéutico eficaz contra las células cancerosas in vivo. Se inyectaron por vía intravenosa, a través de la vena de la cola, ratones portadores de tumores MDA-MB-435 de panículo adiposo mamario subcutáneo de aproximadamente 100 mm^{3} con LipF(C)-p53 durante 3-4 días para un total de ocho inyecciones. Se inyectó intravenosamente doxorrubicina (Dxr) (10 mg/kg) semanalmente durante 4 semanas. La combinación de LipF(C)-p53 y Dxr inhibió sustancialmente el crecimiento de los tumores. En un segundo experimento, se utilizaron dos composiciones de liposoma [LipF(E) y LipF(C)]. Ambas composiciones demostraron un efecto en combinación con Dxr, siendo superior la composición de LipF(C)-p53 que la de LipF(E)-p53.

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Ejemplo 17

Optimización de la transfección de ligando-liposoma en diferentes líneas celulares cancerosas

En este ejemplo, se explora adicionalmente el sistema ligando-liposoma catiónico, por lo que se prepara un panel de liposomas catiónicos dirigidos por ligando a efectos de optimizar la eficacia de transfección a una serie de células cancerosas humanas y de roedor.

Los liposomas catiónicos se prepararon del modo siguiente:

LipA DOTAP/DOPE: relación molar 1:1

LipB DDAB/DOPE: relación molar 1:1

LipC DDAB/DOPE: relación molar 1:2

LipD DOTAP/Col: relación molar 1:1

LipE DDAB/Col: relación molar 1:1

LipG DOTAP/DOPE/Col: relación molar 2:1:1

LipH DDAB/DOPE/Col: relación molar 2:1:1

1. Serie de folato: Cada una de las formulaciones anteriores más 1%-5% de folato-DOPE o folato-DSPE.

2. Serie de transferían: cada una de las formulaciones anteriores mezclada con holo-transferrina en medio o tampón, y a continuación mezclada con ADN plásmido de gen reportero en medio o tampón a efectos de formar el complejo.

Se utilizó el gen de luciferasa de luciérnaga en pCMVLuc plásmido o gen de \beta-galactosidasa de E. coli en pCMVb plásmido como gen reportero.

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Preparación de complejos ADN-liposoma

Los diversos complejos ADN-liposoma-folato se prepararon mezclando en tubos de polipropileno cantidades idénticas de medio libre de suero y ADN plásmido de gen reportero en tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM, pH 8,0), y cantidades idénticas de medio libre de suero con el folato-liposoma (LipA-F, LipB-F, LipC-F, LipD-F, LipE-F, LipG-F, LipH-F) en agua estéril (2 \mumol/ml de lípidos totales). Tras 10-15 min a temperatura ambiente, las dos soluciones se mezclaron e incubaron durante 15-30 min a temperatura ambiente con balanceo frecuente. Las relaciones ADN/lípido en la optimización estaban dentro del intervalo de 1:0,1 a 1:50 \mug/nmol.

Los diversos complejos ADN-liposoma-transferrina se prepararon mediante la adición de Tf (saturada de hierro, Sigma, 4-5 mg/ml en agua, filtrada con filtro de 0,22 mm) a medio libre de suero. 5-15 min más tarde, se añadió liposoma catiónico (LipA, LipB, LipC, LipD, LipE, LipG, LipH) y se mezcló. Tras entre 5 y 15 min de incubación a temperatura ambiente, con balanceo frecuente, se añadió una cantidad idéntica de medio que contenía ADN plásmido de gen reportero y se mezcló, y se incubó durante 15-30 min a temperatura ambiente con balanceo frecuente. Las relaciones ADN/lípido/Tf en la optimización están comprendidas dentro del intervalo de 1/(0,1-50)/(0,1-100) \mug/nmol/\mug.

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Líneas celulares

La optimización se llevó a cabo en las siguientes líneas celulares:

Células escamosas de carcinoma de cabeza y cuello humano: JSQ-3, HN17B, HN22a, HN-38, SCC-25.

Cáncer de mama humano: MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-453, MCF-7.

Cáncer de próstata humano: DU145, LNCaP, Ln-30, P4-20.

Cáncer de ovario humano: SKOV-3, PA-1.

Cáncer pancreático humano: PANC-1.

Cáncer de colon humano: SW480, LS174T, SK-CO-1

Glioblastoma humano: U-87.

Cáncer cervical humano: HTB-34, ME180

Cáncer de pulmón humano: CALU-3

Cáncer gástrico humano: Hs 746T.

Liposarcoma humano: SW 872.

Melanoma humano: SK-MEL-31.

Coriocarcinoma humano: JEG-3.

Rabdomiosarcoma humano: Hs 729T.

Retinoblastoma humano: Y79.

Epiteliales de pecho humano normal: Hs578Bst.

Endoteliales normales: HUV-EC-C.

Melanoma de ratón: B16/F10.

Cáncer de próstata de rata: PA-III, AT.61.

Cáncer de cerebro de rata: RT-2.

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Optimización mediante ensayo de luciferasa

Se colocaron 5 x 10^{4} células/pocillo en una placa de 24 pocillos. 24 horas más tarde, las células se lavaron una vez con medio sin suero, y se añadieron 0,3 ml de medio sin suero y antibióticos a cada pocillo. Los complejos de LipT-pCMVLuc o LipF-pCMVLuc recién preparados que contenían diferentes cantidades de medio con ADN plásmido (hasta 1,0 \mug en 0,2 ml) se añadieron a las células. Tras una incubación de 5 horas a 37ºC y 5% de CO_{2}, se añadieron a cada pocillo 0,5 ml de medio suplementado con 20% de suero bovino fetal. 24 horas más tarde, las células se lavaron una vez con PBS, se lisaron con 100 \mul/pocillo de 1X Reporter Lysis Buffer (Promega), y las actividades de luciferasa expresadas se midieron con Luciferase Assay System (Promega) en un luminómetro. La concentración de proteína del lisado celular se midió utilizando el kit Bio-Rad DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories). Los resultados se expresaron como unidad relativa de luz (RLU) por \mug de proteína total.

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Optimización mediante ensayo colorimétrico con \beta-galactosidasa

Se colocaron 1 x 10^{4} células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos o 5 x 10^{4} células/pocillo en una placa de 24 pocillos. 24 horas más tarde, las células se lavaron una vez con medio sin suero o antibióticos y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de solución de transfección que contenía diversas cantidades de LipT-pCMVb, LipF-pCMVb o pCMVb solo. Tras 5 horas a 37ºC, se añadió a cada pocillo una cantidad idéntica de medio que contenía un 20% de suero bovino fetal. 48 horas más tarde, las células se lavaron una vez con PBS y se lisaron en 1X Reporter Lysis Buffer (Promega). Los lisados celulares se trataron con 100 \mul de o-nitrofenil-\beta-galactopiranósido 150 \muM en Tris 20 mM (pH 7,5) que contenía MgCl_{2} 1 mM y \beta-mercaptoetanol 450 \muM a 37ºC durante 0,5 horas. La reacción se detuvo mediante la adición de 150 \mul/pocillo de Na_{2}CO_{3} 1 M. Se determinó la absorbancia a 405 nm. Se utilizó \beta-galactosidasa purificada (Boehringer) como estándar. Los resultados se expresaron como miliunidades de \beta-galactosidasa equivalente por \mug de proteína total.

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Tinción histoquímica

Para los estudios histoquímicos de transfección de ligando-liposoma-pCMVb, se transfectaron células con un 60% de confluencia (en una placa de 24 pocillos) durante 5 horas tal como se ha descrito anteriormente. Tras 2 días adicionales en cultivo, las células se fijaron y tiñeron con X-gal. La eficiencia de transfección se calculó como porcentaje de células teñidas de azul.

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Eficiencias de transfección de las diferentes composiciones de liposoma con diferentes líneas celulares

Tal como se indica en la tabla 2, el LipT(A) y LipT(D) demostraron la mayor eficiencia de transfección para células JSQ-3, de 3 a 8 veces más eficiente que otras formulaciones de liposoma. El LipT(D) fue el más eficiente para MDA-MB-435 y DU145. A una relación de 1/12/15 (ADN \mug/Lip nmol/Tf \mug) o mayor, el LipT(D) dio una elevada eficiencia a JSQ-3 y LipT(A) a células MDA-MB-435, pero la citotoxicidad se hizo evidente. Lo que es más importante, al preparar complejos de Tf-Lip-ADN para experimentos in vivo, el complejo para esta relación o una relación mayor (lípido) tiende a precipitar, la solución del complejo tiende a volverse turbulenta (es decir, no tan nítida como las soluciones preparadas con relaciones menores) y no estable. En consecuencia, la relación preferida de LipT es 1/10/12,5 (ADN \mug/Lip nmol/Tf \mug).

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TABLA 2

2

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De forma similar a la transferrina, LipF(A) y LipF(C) dieron el mejor resultado para células JSQ-3, de 2 a 8 veces más eficientes que otras formulaciones liposómicas (tabla 3). Interesantemente, los liposomas de folato dan lugar a patrones totalmente diferentes de eficacia en comparación con los liposomas de Tf en las células MDA-MB-435 y DU145, y también en otras líneas celulares. LipF(C) dio los mejores resultados para MDA-MB-435, y LipF(E) dio los mejores resultados para DU145 (tabla 3). Se obtuvieron resultados similares con una eficiencia menor en algunas líneas celulares cancerosas transfectadas con liposomas de DOTMA/DOPE con relaciones molares de 1:1 y 1:2.

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TABLA 3

4

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La tabla 4 muestra las formulaciones preferidas de ligando-liposoma para algunas de las líneas celulares que hemos sometido a ensayo in vitro utilizando el sistema ligando-liposoma dado a conocer en la presente invención. Debe indicarse que las composiciones óptimas para la transfección in vitro no son necesariamente las óptimas para la transfección in vivo. Sin embargo, la tendencia es que las composiciones preferidas in vitro son un buen punto de partida para llegar a las composiciones preferidas in vivo. En consecuencia, la optimización in vivo utilizando modelos de injerto de ratón desnudo resulta necesaria antes de los experimentos de terapia génica sistémica in vivo, tal como se da a conocer en la presente invención.

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TABLA 4

5

6

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Efecto del suero en la eficiencia de transfección de complejos ligando-liposoma

LipT(D) manifestó el nivel más elevado de eficiencia de transfección con la línea celular de glioblastoma humano U-87 sin suero. Sin embargo, en presencia de un 10% de suero, su eficiencia de transfección se redujo sustancialmente, mientras que LipT(A) mostró su mayor eficiencia en presencia de suero para esta línea celular. Para la línea celular de cáncer pancreático humano PANC-1, el suero pareció favorecer la transfección con algunas composiciones liposómicas, mostrando LipT(H) el nivel más elevado de eficiencia. También en este caso se observan diferentes patrones de eficiencia de transfección en diferentes líneas celulares, y diferentes efectos del suero sobre dicha deficiencia de transfección. Para el propósito de una transfección in vivo, los efectos del suero se deben tener en cuenta durante la optimización.

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Ejemplo 18

Quimiosensibilización de otras líneas celulares mediante terapia génica con wtp53 mediada por Tf-liposoma o folato-liposoma in vitro

Este ejemplo resume parte de los experimentos de quimiosensibilización mediada por p53 in vitro (ensayos XTT) llevados a cabo en las líneas celulares para las que se describe la transfección con liposomas acoplados a transferrina o acoplados a folato en el ejemplo 17. Los datos indicados en la siguiente tabla demuestran que la transfección génica de p53 mediada tanto por LipT como por LipF puede sensibilizar estas células tumorales a los agentes quimioterapéuticos. El efecto de quimiosensibilización depende del liposoma utilizado y de la dosis de ADN p53. VIN = vinblastina; DXR = doxorrubicina; CDDP = cisplatina. El factor de sensibilización se calcula a partir de los valores individuales de IC_{50}. Dosis de ADN = \mug de ADN aplicado por pocillo (aproximadamente 1 x 10^{4} células/pocillo en una placa de 96 pocillos).

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Ejemplo 19

Efecto de la combinación de LipF-p53 administrado sistémicamente y quimioterapia sobre el crecimiento de injertos administrados in vivo

La quimioterapia se utiliza cada vez más comúnmente en el tratamiento del cáncer de próstata. La ausencia de wtp53 funcional se ha asociado con la falta de respuesta a la quimioterapia. Este ejemplo examina el efecto de la combinación de ligando-liposoma-p53 y agentes quimioterapéuticos sobre el crecimiento de injertos de tumor de próstata in vivo.

Los ratones portadores de tumores de injerto DU145 subcutáneos de aproximadamente 100 mm^{3} se inyectaron, a través de la vena de la cola, con un complejo de ligando-liposoma-p53 utilizando folato como ligando de direccionamiento (LipF(B)-p53). El complejo liposómico se administró dos veces por semana (hasta un total de 5 inyecciones) junto con el agente quimioterapéutico docetaxel en una dosis de 10 mg/kg. El tratamiento de los animales con el complejo LipF(B)-p53 solo o con docetaxel solo no tuvo ningún efecto sustancial sobre el crecimiento del tumor. Sin embargo, el tratamiento con la combinación del complejo LipF(B)-p53 administrado sistémicamente según la presente invención más docetaxel produjo una regresión tumoral sustancial. Aunque el complejo utilizado no había sido completamente optimizado para células de tumor prostático, estos descubrimientos aportan argumentos en favor de la capacidad de los liposomas dirigidos administrados sistémicamente para suministrar wtp53 a los tumores, provocando su sensibilización a los agentes terapéuticos convencionales.

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Ejemplo 20

Efecto de la combinación de LipF-p53 administrado sistémicamente y quimioterapia sobre el crecimiento de injertos PANC-1 in vivo

Este ejemplo demuestra el efecto de la combinación de ligando-liposoma-p53 y agentes quimioterapéuticos sobre el crecimiento de injertos de tumor pancreático in vivo. Se indujeron tumores de injerto de la línea celular de cáncer pancreático PANC-1 mediante la inoculación subcutánea de más de 1 x 10^{7} células en ratones desnudos atímicos. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente un tamaño de 500-1.000 mm^{3}, se extirparon y se cortaron en trozos pequeños (<1 mm). Estos trozos de tumor recién preparados (suspendidos en PBS) se inocularon por vía subcutánea (utilizando una aguja de 14 g) en los costados de los ratones desnudos atímicos. Cuando los tumores alcanzaron un promedio de 100 mm^{3} de volumen, se inició el tratamiento. Mediante inyección intravenosa, los animales recibieron LipF(B)-p53. Este complejo de liposoma se administró dos veces por semana hasta un total de 7 inyecciones. El agente quimioterapéutico gemcitabina también se administró intraperitonealmente en una dosis de 60 mg/kg ó 120 mg/kg dos veces por semana. Se administraron un total de 13 inyecciones de gemcitabina. Un grupo de animales también recibió inyecciones intratumorales dos veces por semana de LipF(B)-p53 (hasta un total de 6) además de la administración intravenosa de LipF(B)-p53 y gemcitabina. Los grupos de control de animales que no recibieron ningún tratamiento, solo gemcitabina, solo LipF(B)-p53, o LipF(B) complejado con el vector pCMV sin p53 (LipF(B)-Vec), se sacrificaron por eutanasia debido a la carga tumoral en el día 54. En cambio, los tres grupos de animales que recibieron la combinación de LipF(B)-p53 y gemcitabina mostraron una inhibición sustancial del crecimiento de sus tumores, incluso 12 días tras la finalización del tratamiento. Este hecho fue particularmente evidente en el grupo que recibió inyecciones intravenosas e intratraqueales. En consecuencia, nuevamente, utilizando otro modelo tumoral, se puso de manifiesto que la combinación de ligando-liposoma-molécula terapéutica administrado sistémicamente y agente quimioterapéutico es sustancialmente más eficaz que las terapias disponibles en la actualidad.

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Ejemplo 21

Quimiosensibilización de células tumorales mediante oligonucleótidos antisentido mediados por liposoma y dirigidos por ligando in vitro e in vivo

Este ejemplo demuestra la capacidad del sistema de administración de ligando-liposoma-molécula terapéutica administrado sistémicamente según la presente invención para suministrar pequeños oligonucleótidos como molécula terapéutica. Además, este ejemplo demuestra la capacidad de la administración de pequeños oligonucleótidos mediante administración sistémica por ligando-liposoma para sensibilizar las células tumorales diana a los agentes quimioterapéuticos.

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Optimización de la composición de folato-liposoma (LipF) para diversos tipos de células tumorales

Empezando por el complejo ligando-liposoma derivado de las líneas celulares SCCHN y descrito anteriormente, se desarrollaron otras composiciones de ligando-liposoma optimizadas para la administración de oligonucleótidos HER-2 antisentido (AS-HER-2) a células tumorales. El oligonucleótido AS-HER-2 era un 15-mero complementario a una secuencia cercana al codón de iniciación del gen HER-2. (Pirollo y otros, BBRC 230, 196-201 (1997)).

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Saturación de liposomas mediante oligonucleótidos

Se prepararon diversas nuevas composiciones de folato-liposoma (LipF) variando el lípido catiónico y el lípido neutro en el complejo. También se incluyeron lípidos auxiliares en algunas composiciones. También se varió la relación lípido catiónico/lípido neutro. Utilizando oligonucleótido AS-HER-2 marcado con ^{32}P, se determinó la relación de liposoma a oligonucleótido que proporcionaba un enlace óptimo del oligonucleótido a las diversas composiciones. Un ejemplo de estos estudios se muestra en la tabla siguiente, en la que se establece una comparación entre las composiciones B y C de LipF frente a liposoma A, que es la composición de LipF optimizada para SCCHN.

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Existe una clara diferencia en el enlazamiento de oligonucleótido entre las tres composiciones. Sin embargo, se alcanza la saturación completa con las tres para una relación liposoma:oligonucleótido de 25:1. Sin embargo, para esta relación se observó una cantidad sustancial de toxicidad. Resulta también evidente a partir de estos datos que, para diferentes composiciones liposómicas, la relación óptima es extremadamente diferente.

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Absorción del oligonucleótido AS-HER-2 por parte de las líneas celulares tumorales con diversas composiciones de LipF

Se llevaron a cabo experimentos de transfección con las composiciones de LipF y la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-435, la línea celular JSQ-3 de SCCHN, la línea celular de tumor prostático DU145 y la línea celular de tumor pancreático PANC-1, a efectos de determinar la eficiencia de transfección de cada composición de LipF. Las composiciones utilizadas fueron las cuatro composiciones (designadas B-E) que resultaron tener el enlazamiento más eficaz del oligonucleótido. Las dos relaciones molares de liposoma:oligonucleótido utilizadas inicialmente en estos estudios fueron de 10:1 y 25:1, para las que se encontraron (véase anteriormente) los niveles más elevados de enlazamiento de oligonucleótido. Sin embargo, se puso de manifiesto que una relación de 25:1 resultaba tóxica para las células. En consecuencia, el resto de los experimentos se llevaron a cabo utilizando la relación de 10:1 (liposoma:oligonucleótido). Las transfecciones utilizando AS-HER-2 marcado con ^{32}P se llevaron a cabo tal como se ha descrito anteriormente para LipF(A)-p53 para SCCHN. Sin embargo, tras veinte horas de incubación a 37ºC, se eliminó el medio y las células se lavaron cinco veces con PBS. El medio y las aguas de lavado se combinaron y se determinó la cantidad de marcación no incorporada. La cantidad de oligonucleótido anti-HER-2 marcado con ^{32}P asociado a células se determinó comparando el nivel de ^{32}P dentro de las células con el oligonucleótido no incorporado. En estos estudios, LipF(A) es la composición optimizada originalmente para SCCHN. Tal como se muestra en la tabla siguiente, la composición B de LipF dio lugar al nivel más elevado de eficiencia de transfección en células cancerosas de pecho MDA-MB-435, mientras que la composición E de LipF resultó mejor para DU145 y PANC-1. En consecuencia, la composición B de LipF [LipF(B)] se utilizó para el resto de los estudios con MDA-MB-435, descritos a continuación.

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La concentración de oligonucleótido fue de 2 \muM.

La relación molar de liposomas:oligonucleótido fue de 10:1.

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Estabilidad de LipF(B)-AS-HER-2 in vitro y en sangre

Dado que un objetivo de estos estudios consistía en desarrollar un sistema de administración sistémica para oligonucleótidos antisentido, era importante determinar la estabilidad del complejo LipF(B)-AS-HER-2 en suero. En consecuencia, el complejo se añadió a un 50% de suero y se incubó a 37ºC. En diversos puntos temporales dentro del intervalo de 0-24 horas, se tomaron muestras, se marcaron los oligonucleótidos con ^{32}P y se determinó el porcentaje de degradación mediante PAGE. No se observó ninguna degradación del oligonucleótido AS-HER-2 cuando se complejó con LipF(B) durante 24 horas. En cambio, más del 50% del oligonucleótido libre se degradó a las 6 horas, y presentó una degradación casi completa a las 24 horas.

También se examinó la estabilidad en sangre de ratón, un entorno más análogo a la situación in vivo. Incluso tras 24 horas, más del 75% del oligonucleótido complejado se mantuvo intacto. En consecuencia, se concluyó que el sistema de administración dirigido por folato protege suficientemente el oligonucleótido en circulación para permitirle alcanzar de forma eficiente las células tumorales.

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Quimiosensibilización in vitro de células cancerosas mediante LipF-AS-HER-2

Se evaluó la capacidad del AS-HER-2 administrado por LipF(B) para sensibilizar células MDA-MB-435, JSQ-3, DU145 y U87 (glioblastoma humano) a los agentes quimioterapéuticos. La sensibilidad se determinó utilizando el ensayo de proliferación celular XTT. La transfección con LipF(B)-AS-HER-2 aumentó sustancialmente el efecto de destrucción del docetaxel hasta 435 células. La comparación de las células tratadas con AS-HER-2 mediado con LipF(B) y las células tratadas con un oligonucleótido de control (SC) de LipF(B) indicó un aumento en un factor de más de 30 en la sensibilización de 435 células a taxotere. En cambio, se observó únicamente un aumento del nivel de sensibilización en un factor de 2,5 tras la transfección con AS-HER-2 utilizando Lipofectin comercial (Life Technologies, Inc.). El tratamiento de células JSQ-3 con LipF(E)-AS-HER-2 aumentó el efecto del docetaxel en un factor de prácticamente 25. Además, el efecto de la cisplatina (CDDP) sobre las células JSQ-3 también se vio incrementado en un factor de más de 17 tras el tratamiento con AS-HER-2 complejado con liposoma A dirigido por transferrina (LipT(A)). Se observó un aumento en un factor de dos de la sensibilización de las células DU145 al docetaxel tras el tratamiento con LipF(E)-AS-HER-2. La línea celular de glioblastoma humano U87 mostró un aumento en un factor de más de 8 en la quimiosensibilidad al fármaco gemcitabina tras el tratamiento con LipF(B)-AS-HER-2.

A efectos de demostrar adicionalmente la utilización del complejo de liposoma dirigido como vector para la administración de una terapia génica antisentido, se examinó la capacidad del LipF(B) portador de un oligonucleótido anti-RAS (AS-RAS, una secuencia 11-mera complementaria a la secuencia cercana al codón de iniciación del gen) para sensibilizar células de carcinoma pancreático PANC-1 al docetaxel. En este caso, el tratamiento con LipF(B)-AS-RAS también indujo un aumento en un factor de más de 70 de la sensibilidad al fármaco. Los datos muestran que la terapia génica antisentido mediada por LipF(B) puede llevar a un aumento sustancial en la eficacia de los agentes quimioterapéuticos en células cancerosas humanas previamente resistentes.

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Estudios in vivo

Se examinó la capacidad del LipF(B)-AS-HER-2 para dirigirse a tumores de injerto MDA-MB-435 preexistentes y sensibilizarlos al agente quimioterapéutico docetaxel in vivo evaluando la regresión tumoral, así como la inhibición del crecimiento tumoral. Se inyectó en ratones hembra atímicos (Ncr nu/nu) portadores de tumores de injerto de panículo adiposo mamario MDA-MB-435 de aproximadamente 70 mm^{3} intravenosamente, a través de la vena de la cola, LipF(B)-AS-HER-2 (a aproximadamente 0,6 mM de oligonucleótidos) cada dos días hasta un total de 11 inyecciones. También se administraron a estos animales un total de 11 dosis intravenosas de docetaxel (aproximadamente 20 mg/kg/dosis cada dos días). Se observó una inhibición del crecimiento tumoral muy grande en los animales que recibieron la combinación de LipF(B)-AS-HER-2 y docetaxel. En cambio, solo se observó una inhibición mínima del crecimiento en los ratones que recibieron únicamente AS-HER-2. Además, a pesar de que se observó cierto efecto del docetaxel, estos tumores empezaron a aumentar rápidamente de tamaño tras el cese del tratamiento. En consecuencia, la administración sistémica dirigida por liposoma de oligonucleótidos antisentido, en este caso AS-HER-2, fue claramente capaz de sensibilizar dichos tumores al agente quimioterapéutico, inhibiendo significativamente el crecimiento tumoral prácticamente tres semanas tras la finalización del tratamiento.

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Ejemplo 22

Direccionamiento a adenovirus por liposomas con transferrina

La mejora de la eficiencia y la especificidad de la transferencia génica sigue siendo un objetivo importante en el desarrollo de nuevas estrategias de terapia génica. Los adenovirus (Ad) son vectores altamente eficientes, pero están limitados por la ausencia de especificidad de direccionamiento tumoral y una inmunogenicidad sustancial. Se ha documentado el hecho de que los lípidos catiónicos pueden formar complejos no covalentes con adenovirus y mejorar la eficiencia de la transferencia génica. Sin embargo, los lípidos catiónicos siguen sin presentar especificidad de direccionamiento.

En este ejemplo, se demuestra que el vector ligando-liposoma según la presente invención también puede formar un complejo con partículas de adenovirus, aumentándose de este modo su eficiencia de transferencia génica, y más sustancialmente su especificidad de direccionamiento. Además, la utilización del sistema de administración ligando-liposoma-molécula terapéutica según la presente invención, cuando dicha molécula terapéutica es una partícula de adenovirus intacta, permite un direccionamiento eficiente de las células tumorales y una administración sistémica de adenovirus terapéuticos para la terapia génica, un enfoque novedoso de la terapia génica.

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Preparación del complejo transferrina-liposoma-adenovirus

En el estudio, se utilizó el adenovirus deficiente en su replicación de serotipo 5 que contenía el gen de \beta-galactosidasa de E. coli LacZ bajo el promotor de CMV, Ad5LacZ. En el estudio se utilizó Ad5LacZ a razón de 1,1 x 10^{12} partículas (pt)/ml, ó 5,5 x 10^{9} unidades formadoras de placa (pfu)/ml, en PBS (pH 7,4) más 3% de sucrosa. Se disolvió holo-transferrina (Tf, saturada de hierro, Sigma) en agua a 4-5 mg/ml y se filtró con un filtro de 0,22 mm. En primer lugar, la Tf se diluyó hasta 0,5 mg/ml en tampón HEPES 10 mM (pH 7,4), tras lo cual se añadieron diferentes cantidades de Tf a 50 \mul de tampón HEPES en tubos de microcentrifugación y se mezclaron bien. Tras 5-10 min de incubación a temperatura ambiente, se añadió Lip(A) (relación molar DOTAP:DOPE 1:1) a 0,1 nmol/\mul a los tubos, de tal modo que las relaciones lípido/Tf estaban comprendidas dentro del intervalo 1 nmol/1-10 \mug. Las soluciones se mezclaron bien y se incubaron a temperatura ambiente durante 5-10 min. se añadieron 1 x 10^{6} - 1 x 10^{7} pt de adenovirus a cada tubo, de tal modo que las relaciones lípido catiónico/adenovirus estaban comprendidas dentro del intervalo de 1 x 10^{3} a 1 x 10^{7} moléculas de lípido/pt. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 10-15 min y a continuación se añadieron 150 \mul de EMEM sin suero a cada una de ellas.

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Transducción adenovírica in vitro

Se colocaron 5 x 10^{4} células JSQ-3/pocillo en una placa de 24 pocillos. 24 horas más tarde, las células se lavaron una vez con EMEM sin suero, y se añadieron 0,3 ml de EMEM sin suero o antibióticos a cada pocillo. Se añadieron los complejos Ad5LacZ o Tf-Ad5LacZ en diferentes relaciones en 200 \mul de EMEM a cada pocillo por duplicado. La relación virus/células estaba comprendida entre 20 y 2.000 partículas víricas/célula (pt/célula). Tras 4 horas de incubación a 37ºC y 5% de CO_{2}, con balanceo ocasional, se añadieron 0,5 ml de EMEM con 20% de suero. Tras 2 días de cultivo, las células se lavaron una vez con PBS y se lisaron en 1X Reporter Lysis Buffer (Promega). Los lisados celulares se centrifugaron, se transfirieron a una placa de 96 pocillos por duplicado, se incubaron con 100 \mul de o-nitrofenil-\beta-galactopiranósido en Tris 20 mM (pH 7,5) que contenía MgCl_{2} 1 mM y \beta-mercaptoetanol 450 \muM a 37ºC durante 30 min. La reacción se detuvo mediante la adición de 150 \mul/pocillo de Na_{2}CO_{3} 1 M. La absorbancia se determinó a 405 nm en un lector de placa de ELISA. Se utilizó \beta-galactosidasa purificada (Boehringer) para generar una curva estándar. Los resultados se expresaron como miliunidades (mU) de \beta-galactosidasa equivalentes por mg de proteína total.

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Tinción histoquímica

Para los estudios histoquímicos de transducción de LipT-Ad5LacZ, se transfectaron células con un 60% de confluencia en una placa de 24 pocillos durante 5 horas con soluciones de transfección, tal como se ha descrito anteriormente. Tras 2 días adicionales en cultivo, las células se fijaron y tiñeron con X-gal. La eficiencia de transfección se calculó como porcentaje de células teñidas de azul.

Para una dosis vírica de 500 pt/célula o 2,5 MOI (multiplicidad de infección, o pfu/célula), 10 mU/\mug de proteína de producto de gen reportero \beta-galactosidasa fueron expresados por Ad5LacZ solo. El virus complejado a transferrina-liposoma, LipT-Ad5LacZ, en una relación de 1 x 10^{4} moléculas de lípido catiónico/pt, dio lugar a una expresión del gen reportero de 23,5 mU/\mug de proteína. LipT-Ad5LacZ a razón de 1 x 10^{5} moléculas de lípido/pt dio lugar a una expresión de 30,7 mU/\mug, mientras que LipT-Ad5LacZ a razón de 1 x 10^{6} moléculas/pt dio lugar a una expresión de 30,8 mU/\mug. Esto representa un aumento en un factor de 2,4, 3,07 y 3,08, respectivamente, en la transducción génica con respecto a Ad5LacZ solo. Aparentemente, la saturación se alcanzó para 1 x 10^{5} moléculas de lípido/pt.

Para una dosis de 1.000 pt/célula (ó 5 MOI), LipT-Ad5LacZ a razón de 10^{4} lípidos/pt, mostraron un aumento en un factor de 2,6 en la expresión de gen reportero, mientras que LipT-Ad5LacZ a razón de 10^{5} lípidos/pt dio lugar a un aumento en un factor de 2,8, y LipT-Ad5LacZ a razón de 10^{6} lípidos/pt, un nivel mayor en un factor de 3,8 de expresión de gen reportero que Ad5LacZ solo. Un complejo de liposoma sin transferrina dio lugar solo a una mejora limitada. En consecuencia, las relaciones óptimas de complejo LipT-Ad5LacZ eran aparentemente de aproximadamente 10-1.000 lípidos catiónicos/molécula de Tf, y de aproximadamente 10^{4} - 10^{7} lípidos catiónicos/pt, preferentemente de aproximadamente 15-50 lípidos catiónicos/molécula de Tf y aproximadamente 10^{6} lípidos catiónicos/pt. Si la relación lípidos/pt es demasiado alta, se puede producir precipitación.

La tinción histoquímica puso de manifiesto que Ad5LacZ solo dio lugar a una eficiencia de transducción del 20-30%, mientras que el adenovirus complejado con transferrina-liposoma LipT-Ad5LacZ a 10^{6} lípidos/pt dio lugar a una eficiencia del 70-90%.

Se evaluó la capacidad de complejar adenovirus de otras composiciones liposómicas. LipT(B) (relación molar DDAB/DOPE, 1:1) y LipT(D) (relación molar DOTAP/Col, 1:1) mostraron una transducción génica adenovírica mejorada en la línea celular de cáncer de próstata humano DU145.

El sistema de administración de ligando-liposoma según la presente invención también se complejó con adenovirus de serotipo 5 deficiente en su replicación que contenía 1,7 kb de gen wt p53 humano (LipT(D)-Adp53). El complejo LipT(D)-Adp53 se inyectó por vía intravenosa en ratones desnudos portadores de tumores de injerto de cáncer de próstata DU145. El análisis Western blot (llevado a cabo 72 horas tras la inyección) del tumor demostró la presencia de bandas adicionales que representaban la proteína wt p53 humana exógena presente en el tejido tumoral. No se observaron secuencias de wt p53 exógena adicionales en los tejidos normales (por ejemplo de hígado, pulmón o bazo) del animal tratado. Estos datos ponen de manifiesto que el sistema de administración de ligando-liposoma-molécula terapéutica según la presente invención es capaz de administrar adenovirus como "molécula terapéutica" específicamente a tejido tumoral tras la administración sistémica.

Los resultados anteriores demostraron que los liposomas catiónicos con transferrina pueden complejar adenovirus y mejorar sustancialmente la transducción génica adenovírica. La administración de complejos de ligando-liposoma-adenovirus representa un enfoque novedoso en la terapia génica humana.

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Ejemplo 23

Transducción génica retroviral dirigida por transferrina-liposoma

Los vectores retrovirales son unos de los vectores de terapia génica más ampliamente utilizados en los ensayos clínicos. Como en el caso de los vectores adenovíricos, los vectores retrovirales están limitados por una especificidad tumoral pobre y una inmunogenicidad significativa. En este ejemplo se demuestra que, como en el caso de los adenovirus, el vector ligando-liposoma según la presente invención también puede formar un complejo con partículas de retrovirus, aumentándose de este modo su eficiencia de transferencia génica, y más significativamente su especificidad de direccionamiento. Además, la utilización del sistema de administración ligando-liposoma-molécula terapéutica según la presente invención, cuando dicha molécula terapéutica es una partícula de retrovirus intacta, permite un direccionamiento eficiente de las células tumorales y una administración sistémica de vectores retrovirales para la terapia génica.

En este estudio, se utilizaron retrovirus deficientes en su replicación que contenían el gen LacZ de E. coli, RvLacZ, a razón de 1 x 10^{10} partículas (pt)/ml que contenían 3 x 10^{7} unidades transformadoras (TU)/ml. Se disolvió holo-transferrina (Tf, saturada de hierro, Sigma) en agua a 4-5 mg/ml y se filtró con un filtro de 0,22 mm. El complejo LipT-RvLacZ se preparó de forma similar a la preparación de LipT-Ad5LacZ descrita anteriormente en el ejemplo 21. En resumen, primeramente se diluyó la Tf hasta 0,5 mg/ml en tampón HEPES 10 mM (pH 7,4). Se añadieron diferentes cantidades de Tf a 50 \mul de tampón HEPES en tubos de microcentrifugación y se mezclaron bien. Tras 5-10 min de incubación a temperatura ambiente, se añadió liposoma catiónico Lip(A) (relación molar DOTAP:DOPE 1:1). Las soluciones se mezclaron bien y se incubaron a temperatura ambiente durante 5-10 min. Se añadieron 1 x 10^{6} - 1 x 10^{7} pt de retrovirus a cada tubo, de tal modo que las relaciones lípido catiónico/retrovirus estaban comprendidas dentro del intervalo de 1 x 10^{3} a 1 x 10^{7} moléculas de lípido/pt. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 10-15 min y a continuación se añadieron 150 \mul de EMEM sin suero a cada una de ellas. Se llevó a cabo una transducción retroviral in vitro tal como se ha descrito en el ejemplo 21. La relación virus/célula está comprendida entre 100 y 2.000 partículas virales/célula (pt/célula).

Para una dosis de 1.000 pt/célula o 3 MOI (multiplicidad de infección, o TU/célula), LipT-RvLacZ a 10^{5} lípidos/pt dio lugar a un incremento en un factor de 1,5 en la expresión de gen reportero. LipT-RvLacZ a 10^{6} lípidos/pt dio lugar a un aumento en un factor de 2,3 en el nivel de expresión en comparación con RvLacZ solo. El complejo de liposoma sin transferrina dio lugar solo a una mejora limitada. En consecuencia, las relaciones óptimas de complejo LipT-RvLacZ eran aparentemente de aproximadamente 10-1.000 lípidos catiónicos/molécula de Tf, y de aproximadamente 10^{4} - 10^{7} lípidos catiónicos/pt, preferentemente de aproximadamente 15-50 lípidos catiónicos/molécula de Tf y aproximadamente 10^{6} lípidos catiónicos/pt. Si la relación lípidos/pt es demasiado alta, se puede producir precipitación.

La tinción histoquímica puso de manifiesto que RvLacZ solo dio lugar a una eficiencia de transducción del 20-30%, mientras que el retrovirus complejado con transferrina-liposoma LipT-RvLacZ (10^{6} lípidos/pt) dio lugar a una eficiencia del 60-80%.

Los resultados anteriores demuestran que los complejos de transferrina-liposomas catiónicos se pueden complejar con retrovirus y aumentar sustancialmente la transducción génica retroviral.

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Ejemplo 24

Análisis por microscopia electrónica del complejo ligando-liposoma-ADN

Los liposomas se pueden observar en un microscopio electrónico (EM), tal como un microscopio electrónico de transmisión (TEM) con tinción negativa o un microscopio electrónico de barrido (SEM). EM puede revelar la estructura y la distribución de tamaño de los complejos de liposoma. EM también puede ser utilizado para llevar a cabo el control de calidad de la preparación de los liposomas.

En este ejemplo, se pone de manifiesto una estructura de transferrina-liposoma única y nueva que puede dar lugar a la estabilidad y la eficacia observada con el complejo ligando-liposoma-molécula terapéutica según la presente invención descrito en la presente memoria.

Los complejos ligando-liposoma catiónico fueron observados en un microscopio electrónico de transmisión con tinción negativa. En el estudio, se utilizó una rejilla de cobre con recubrimiento de Formvar y carbón (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, EE.UU.). Los complejos de ligando-liposoma-pCMVp53 se prepararon tal como se describe en los ejemplos 2 y 17. Se colocó una gota de complejo de liposoma sobre dicha rejilla. Tras 5 minutos, el exceso de líquido se eliminó por acción capilar con papel de filtro en el borde de la rejilla. A continuación, se añadió una gota de acetato de uranio al 4% a la rejilla para la tinción negativa. Tras 5 minutos, el exceso de líquido también se eliminó tal como se ha descrito anteriormente. La rejilla se secó en aire a temperatura ambiente durante 15 min antes de introducirse en la cámara de muestras de TEM. En este estudio se utilizaron JOEL 1200EX o JOEL 100S siguiendo las indicaciones del fabricante. Se tomaron fotografías en magnitudes de 10-50 k, 60 kVolt. Las muestras de liposoma de la rejilla se prepararon, se tiñeron y se observaron dentro de la siguiente hora.

Muchas publicaciones han indicado que los complejos de liposoma catiónico-ADN presentan una estructura diversa y un tamaño que varía entre 100 nm y 1.000 nm. En nuestro estudio, hemos observado inesperadamente que los complejos de ligando-liposoma-ADN preparados según la presente invención presentan un tamaño mucho menor y una distribución de tamaño mucho más uniforme. En particular, los complejos de LipT(A)-p53 presentan un tamaño comprendido entre 30 y 100 nm, preferentemente entre 35 y 65 nm (con un promedio de aproximadamente 50 nm). Dado que el propio liposoma catiónico Lip(A) tiene un tamaño de 15-40 nm, con un promedio de 25 nm, cuando la transferrina se complejó con Lip(A), el tamaño no varió apreciablemente. Sin embargo, se observaron unas paredes o membranas liposómicas más gruesas, lo que indicaba que la transferrina se había complejado sobre la membrana liposómica. A partir de las fotografías ampliadas, se observó una estructura irregular o acéntrica tipo cebolla en el núcleo del complejo LipT(A)-ADN. También se observó una etapa intermedia de formación de la estructura, por ejemplo una etapa intermedia en la condensación de la cadena de ADN por LipT(A). Cuando el tiempo de incubación para mezclar LipT(A) con ADN se redujo de 15 a 5 minutos, se observó más esta etapa intermedia.

Sobre la base de las observaciones de TEM, se pone de manifiesto que la estructura única del complejo LipT-ADN puede tener un papel importante en la elevada deficiencia de transfección génica observada in vitro y, particularmente, in vivo. La estructura nuclear acéntrica de tipo cebolla se puede formar mediante las etapas siguientes durante la formación del complejo LipT(A)-ADN:

Etapa 1:: diversos (4-8 o más) Tf-liposomas se ponen en contacto con cada molécula de ADN, fijándose a la cadena de ADN mediante interacción electrostática.

Etapa 2:: cada Tf-liposoma envuelve o condensa la cadena de ADN, formando estructuras laminares individuales a lo largo de la misma.

Etapa 3:: las estructuras laminares se condensan, formando una estructura nuclear laminar. Esta estructura nuclear sólida es menor en tamaño que la suma de los 4-8 Tf-liposomas.

Etapa 4:: durante la condensación final, puede tener lugar una transición de fase desde la fase laminar a una fase hexagonal invertida, lo que da lugar a la estructura irregular o acéntrica de tipo cebolla.

Se cree que esta fase hexagonal invertida (H_{II}) es sustancialmente más eficaz que la fase de estructura laminar (L_{II}) en la transfección, y se puede relacionar con la liberación y administración de ADN (Koltover, I. Science 281: 78,1998). Utilizando microscopia electrónica de fractura criogénica, Sternberg, B. (Biochim Biophys Acta 1998; 1375:23-35) ha descrito una estructura de "chincheta de cabeza redonda" en los complejos DDAB/Col de liposoma catiónico-ADN que presenta la mayor actividad de transfección in vivo. Dicho autor creyó que dicha elevada actividad in vivo estaba relacionada con pequeños (100-300 nm) complejos estabilizados, mientras que la elevada actividad in vitro se asocia con los precipitados lipídicos hexagonales. En la bibliografía no se encuentra disponible ningún análisis ultraestructural de los complejos ligando-liposoma catiónico-ADN. Los presentes inventores creen que, en presencia de transferrina u otros ligandos, la transición L_{II} a H_{II} tiende a producirse y la estructura nuclear irregular o a céntrica de tipo cebolla se ve estabilizada por el ligando. En cuanto al mecanismo de transición de fase laminar a invertida, además del sugerido por Koltover, los ligandos pueden tener un papel importante. La Tf fijada sobre la superficie liposómica, o el folato enlazado sobre la superficie liposómica, pueden ayudar o acelerar la transición de fase, dando lugar a las estructuras nucleares acéntricas de tipo cebolla altamente eficientes.

En las condiciones de preparación dadas a conocer en la presente memoria, más del 95% de los complejos LipT(A)-ADN presentan la estructura nuclear irregular o acéntrica de tipo cebolla. Si no se produce dicha transición, las estructuras laminares condensadas de las etapas 3-4 forman preferentemente una estructura nuclear regular o centrada de tipo cebolla para ser estables. Esa transición de L_{II} a H_{II} y estabilización por Tf puede explicar la elevada eficiencia de transfección génica in vivo inesperada.

Dado que la complejación es un proceso en cuatro etapas, es importante, a la hora de preparar el complejo, llevar a cabo una incubación durante un tiempo suficiente entre cada etapa de mezclado, aplicando agitación frecuente, a efectos de permitir que la estructura nuclear acéntrica de tipo cebolla se forme completamente. Para los procedimientos de preparación dados a conocer en la presente memoria, el tiempo de incubación debe ser de aproximadamente 5-15 minutos tras cada mezclado y de aproximadamente 10-30 minutos tras el mezclado con ADN, preferentemente de aproximadamente 15-30 minutos.

Otra característica única de los liposomas según la presente invención es su tamaño más pequeño distribuido homogéneamente (diámetro menor de aproximadamente 100 nm, preferentemente menor de aproximadamente 75 nm, y más preferentemente un diámetro comprendido entre aproximadamente 35-65 nm (50 nm de promedio)). Para alcanzar el tumor diana in vivo, los liposomas deben ser en primer lugar resistentes al suero y a continuación pasar a través de la pared del vaso sanguíneo (capilar). Los complejos según la presente invención exhiben una elevada resistencia a la degradación por parte del suero. El tamaño permeable de los capilares en los tumores es habitualmente de 50-75 nm; en consecuencia, los complejos pueden pasar a través de la pared capilar para alcanzar la diana.

La estructura TEM del complejo LipF(B)-ADN es similar a la de LipT(A)-ADN, y dicho complejo presenta un intervalo de tamaños de 30-100 nm, preferentemente de 35-75 nm (promedio de 50 nm) en diámetro. También se observaron las estructuras nucleares irregulares o acéntricas de tipo cebolla únicas. La transición de fase de laminar a hexagonal invertida puede tener lugar en un proceso similar en 4 etapas, que explica la inesperadamente elevada eficiencia de transfección génica in vivo.

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Ejemplo 25

Estabilidad de los complejos ligando-liposomas catiónicos

La estabilidad es un factor importante en los fármacos liposómicos. Las soluciones liposómicas deben ser estables durante un prolongado periodo de tiempo tras la preparación a efectos de permitir el transporte y almacenamiento sin pérdida sustancial de sus actividades biológicas/farmacéuticas, con el fin de que resulten útiles como agentes terapéuticos. A la luz de la futura aplicación clínica del complejo ligando-liposoma-molécula terapéutica según la presente invención, los presentes inventores han examinado la estabilidad de los complejos ligando-liposomas y los complejos ligando-liposoma-ADN.

Lip(A) se preparó en agua y se almacenó en atmósfera de nitrógeno en la oscuridad a 4ºC durante diversos períodos de tiempo de hasta 6 meses. El día del ensayo, se utilizaron los liposomas almacenados, así como Lip(A) recién preparado, para obtener el complejo LipT(A)-pCMVb. A continuación, el complejo se utilizó para transfectar células JSQ-3 utilizando el ensayo de transfección tal como se ha descrito en el ejemplo 5. No se observó ninguna diferencia apreciable en el nivel de expresión transgénica entre las preparaciones de Lip(A) que ya habían sido almacenadas durante diversos períodos de tiempo y el Lip(A) recién preparado. En un experimento separado, una preparación de Lip(A) almacenada durante 12 meses conservaba >90% de su actividad de transfección. La solución de transferrina (5 mg/ml en agua) y de ADN plásmido de pCMVb (0,5-1,0 \mug/ml) en Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) se prepararon por separado. Se puso de manifiesto que los complejos de folato-liposoma tenían el mismo grado de estabilidad.

Los liposomas, la Tf y el ADN plásmido son individualmente estables durante su almacenamiento. Sin embargo, cuando se mezclan para formar el complejo LipT-ADN, dicho complejo es inestable durante un prolongado periodo de tiempo. Por ejemplo, el complejo LipT-ADN fue estable únicamente durante unos pocos días. En el día 3, únicamente se conservaba el 50% de la actividad de transfección. Para LipF-ADN, se conservaba únicamente el 60% de actividad de transfección tras 24 horas, con una pérdida de actividad prácticamente completa 3 días tras la preparación.

Sobre la base de estas observaciones, parece que los componentes de los complejos ligando-liposoma-molécula terapéutica según la presente invención se pueden suministrar ventajosamente en forma de kit. Los componentes se pueden mezclar secuencialmente el día de su utilización añadiendo en primer lugar la Tf al liposoma, seguido de la solución de ADN (incubando 10-15 min entre cada mezclado), y a continuación añadir dextrosa hasta el 5%. El complejo se debe administrar tan rápidamente como sea posible, preferentemente dentro de las primeras 24 horas tras su preparación.

Claims

1. Vector para la administración de un virus a una célula diana dentro de un animal huésped, que comprende un complejo de un ligando de direccionamiento a la célula, un liposoma que comprende uno o más lípidos catiónicos, y el virus, en el que dichos lípidos catiónicos y el virus están presentes en el complejo en una relación de aproximadamente 10^{4} - 10^{7} lípidos catiónicos/partícula viral.

2. Vector según la reivindicación 1, en el que el virus comprende un ácido nucleico terapéutico.

3. Vector según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el virus es un adenovirus o un retrovirus.

4. Vector según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el virus es un virus recombinante.

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5. Vector según la reivindicación 2, en el que el ácido nucleico codifica:

(a): una proteína; o

(b): un oligonucleótido antisentido.

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6. Vector según la reivindicación 2, en el que el ácido nucleico codifica p53 de tipo salvaje.

7. Vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando de direccionamiento a la célula es un ligando de direccionamiento a la célula tumoral.

8. Vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando de direccionamiento a la célula es un folato.

9. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ligando de direccionamiento a la célula es transferrina.

10. Vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el liposoma comprende además un lípido neutro o auxiliar.

11. Vector para administrar in vivo una molécula de ácido nucleico terapéuticamente eficaz a un animal que padece un tumor, consistiendo dicho vector esencialmente en un complejo de un ligando de direccionamiento a la célula seleccionado de entre el grupo constituido por folato y transferrina, un liposoma catiónico que comprende uno o más lípidos catiónicos y un virus que comprende un ácido nucleico terapéutico, en el que los lípidos catiónicos y los virus están presentes en el complejo en una relación de aproximadamente 10^{4} - 10^{7} lípidos catiónicos/partícula viral.

12. Vector según la reivindicación 11, en el que el ácido nucleico codifica p53 de tipo salvaje.

13. Composición farmacéutica que comprende un vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Utilización de un complejo para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer, en el que dicho complejo comprende: un ligando de direccionamiento a la célula; un liposoma catiónico; y un virus que comprende un ácido nucleico terapéutico que codifica p53, en el que los lípidos catiónicos y el virus están presentes en el complejo en una relación de aproximadamente 10^{4} - 10^{7} lípidos catiónicos/partícula viral.

15. Utilización según la reivindicación 14, en la que el ligando de direccionamiento a la célula es folato o transferrina, el liposoma es un liposoma catiónico y el ácido nucleico terapéutico codifica p53 de tipo salvaje.

16. Utilización según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en la que el medicamento comprende el complejo y un vehículo farmacéuticamente aceptable en una composición farmacéuticamente aceptable.

17. Utilización de un complejo para la preparación de un medicamento eficaz en el tratamiento o mejora del cáncer en un animal de sangre caliente, en la que dicho complejo comprende: un ligando de direccionamiento a la célula cancerosa; un liposoma que comprende uno o más lípidos catiónicos, y un virus que comprende un ácido nucleico terapéutico, estando presentes los lípidos catiónicos y el virus en el complejo en una relación de aproximadamente 10^{4} - 10^{7} lípidos catiónicos/partícula viral.

18. Utilización según la reivindicación 17, en la que el complejo comprende un ligando de direccionamiento a la célula seleccionado de entre el grupo constituido por folato y transferrina, un liposoma catiónico, y en la que el virus comprende un ácido nucleico que codifica p53 de tipo salvaje.

19. Utilización según la reivindicación 17 o la reivindicación 18, en la que el medicamento es apto para su utilización simultánea, separada o secuencial con un agente quimioterapéutico anticanceroso o con radioterapia anticancerosa.

20. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en la que el medicamento es apto para la administración intratumoral.

21. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, en la que el medicamento es apto para la administración sistémica.

22. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, en la que el medicamento es apto para la administración intravenosa.

23. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que los lípidos catiónicos y el virus están presentes en el complejo en una relación de aproximadamente 10^{5} - 10^{7} lípidos catiónicos/partícula viral.

24. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que los lípidos catiónicos y el virus están presentes en el complejo en una relación de aproximadamente 10^{6} lípidos catiónicos/partícula viral.

25. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22, en el que los lípidos catiónicos y el virus están presentes en el complejo en una relación de aproximadamente 10^{5} - 10^{7} lípidos catiónicos/partícula viral.

26. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22, en el que los lípidos catiónicos y el virus están presentes en el complejo en una relación de aproximadamente 10^{6} lípidos catiónicos/partícula viral.

27. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, ó 23 ó 24 para su utilización en medicina.