ES2273705T3

ES2273705T3 - Fabricacion de proteinas en hojas plisadas beta con propiedades de union especificas.

Info

Publication number: ES2273705T3
Application number: ES00944034T
Authority: ES
Inventors: Ulrike Fiedler; Rainer Rudolph
Original assignee: Scil Proteins GmbH
Current assignee: Navigo Proteins GmbH
Priority date: 1999-07-13
Filing date: 2000-07-13
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2020-07-13
Also published as: WO2001004144A2; JP4597177B2; US20070111287A1; CA2378871C; CA2378871A1; EP1780279A1; JP4221174B2; PT1200583E; CN101693889A; EP1200583A2; JP2003504081A; JP2008019276A; DE50013610D1; EP1200583B1; CN1371415A; DE19932688B4; WO2001004144A3; DK1200583T3; US7601803B1; AU5827800A

Abstract

Procedimiento para la preparación de una proteína con una estructura de lámina beta plegada y una propiedad de unión similar a anticuerpo frente a una ligando con las siguientes etapas: a) Selección de una proteína con una estructura cristalina conocida o una estructura proteica 3D del grupo de las cristalinas, esferulinas, proteínas de choque por calor, proteínas de choque por frío, fibronectinas y proteínas de hélice fi; b) selección de un ligando; c) Determinación de los aminoácidos expuestos en superficie de la proteína de la etapa a); d) Mutagénesis del ADN que codifica la proteína con estructura de lámina beta plegada mediante la sustitución, deleción y/o inserción de aminoácidos expuestos en superficie en como mínimo dos cadenas beta expuestas en superficie de cómo mínimo dos láminas beta plegadas expuestas en superficie, manteniéndose la estructura de lámina beta plegada; e) Expresión de los mutantes obtenidos en la etapa d) en un sistema de expresión apropiado; f) Poner en contactolas proteínas obtenidas en la etapa d) con un ligando de la etapa b); g) Selección y aislamiento de las proteínas mutadas que se unen a las contrapartes de unión seleccionadas en la etapa b) formando una propiedad de unión similar a anticuerpo nueva o mejorada, entendiéndose como nueva propiedad de unión similar a anticuerpo frente a un ligando, que la proteína de la etapa a) no presenta ninguna propiedad de unión similar a anticuerpo sin la sustitución, deleción y/o inserción y que después de la sustitución, deleción y/o inserción presenta una nueva propiedad de unión similar a anticuerpo frente al ligando de b), o que la proteína de la etapa a) presenta una propiedad de unión similar a anticuerpo antes de la sustitución, deleción o inserción y que después de la sustitución, deleción o inserción posee otra propiedad de unión nueva o una propiedad de unión mejorada frente al ligando de b).

Description

Fabricación de proteínas en hojas plisadas beta con propiedades de unión específicas.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de proteínas de lámina beta plegada con nuevas propiedades específicas de unión similares a anticuerpos o con propiedades específicas de unión similares a anticuerpos modificadas, así como a una proteína con una propiedad de unión especifica similar a anticuerpo. Los anticuerpos y sus derivados se utilizan en muchos campos de la terapia humana y veterinaria, del diagnóstico así como en la monitorización. Un problema en la utilización de los anticuerpos presentes en la naturaleza es su preparación. En la actualidad, igual que antes, se lleva a cabo la producción de los anticuerpos en sistemas de cultivo celulares, un procedimiento que es muy caro. Para algunas aplicaciones, por ejemplo la preparación de proteínas de fusión o una utilización en terapia que haga necesaria una retirada rápida en sangre y una buena penetración en tejido, el tamaño de las moléculas de anticuerpo presentes en la naturaleza representa otro problema (Colcher et al., 1998). Las moléculas de anticuerpo recombinantes, por ejemplo las scFv's (Bird et al., 1988), los minianticuerpos (Pack, y Plückthun, 1992) o los anticuerpos biespecíficos (Holliger y Winter, 1993) se construyen mayoritariamente sólo a partir de los dominios de unión a antígeno de los anticuerpos (VH y VL). Debido a su tamaño considerablemente disminuido muestran una penetración en tejido mejorada y también son más apropiados para la fusión con otras proteínas que los anticuerpos completos. Como contrapartida, los fragmentos de anticuerpos recombinantes son a menudo realmente inestables, tienen escasas afinidades y debido a los puentes disulfuro a formar, son difíciles de preparar de forma recombinante. Algunos procedimientos para la estabilización y mejora de la afinidad de los fragmentos de anticuerpo recombinantes incluyen, entre otros, el análisis de diferentes secuencias peptídicas enlazadoras y la introducción de puentes disulfuro (Glockshuber et al., 1992, Brinkmann, 1997). La secuencia y longitud de las secuencias peptídicas de unión pueden influenciar tanto la estabilidad frente a proteasas como la afinidad de los fragmentos de anticuerpo (Pantoliano et al., 1991). La introducción de puentes disulfuro adicionales en las regiones framework conservadas de los dominios variables puede conducir a una mayor resistencia al calor (Young et al., 1995) y a los agentes desnaturalizantes, así como a un mejor rendimiento de la expresión heteróloga. Sin embargo, muchas scFv's presentan sin embargo una escasa estabilidad y ya a 37ºC tienden a la agregación. La inestabilidad puede juzgarse asimismo mediante la utilización del cebador común de clonación del fragmento Fv, a través del cual pueden introducirse nuevas mutaciones desestabilizadoras. La producción de fragmentos de anticuerpo en un sistema bacteriano se lleva a cabo mayoritariamente mediante la segregación en el espacio periplasmático, siendo posible también en este contexto la optimización en relación al estado redox así como a la expresión simultánea de asistentes al plegamiento.

El objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la preparación de proteínas que presenten propiedades de unión similares a anticuerpo nuevas o modificadas, sin embargo sin mostrar al mismo tiempo las desventajas descritas más arriba de las moléculas de anticuerpo completas o recombinantes.

El objeto mencionado más arriba se resuelve mediante el procedimiento según la invención para la preparación de proteínas según la reivindicación 1. Las realizaciones preferidas de la invención se deducen a partir de las reivindicaciones dependientes y de la siguiente descripción.

Mediante la modificación de la superficie de una proteína de lámina beta plegada se obtienen en la proteína novedosas propiedades de unión no presentes anteriormente. Dichas propiedades de unión se obtienen mediante mutagénesis de una región de lámina beta plegada. Las proteínas de lámina beta plegadas novedosas son similares en estructura y estabilidad a las proteínas de partida a pesar de las propiedades de unión de novo. Las proteínas de partida para el diseño de las moléculas de unión novedosas son proteínas con una estructura en lámina beta plegada predominante, por ejemplo la gamma-cristalina, una proteína estructural del cristalino. En base a la estructura cristalina, por ejemplo mediante análisis computacional, se seleccionan regiones y aminoácidos en la lámina beta plegada de la proteína de partida que se exponen en la superficie y de esta manera están expuestas al disolvente así como a posibles ligandos. En el gen que codifica la proteína de partida, dichas regiones o posiciones de aminoácidos se someten a mutagénesis con procedimientos de ingeniería genética. Se preparó a nivel de ADN un gran número de genes mutados (banco o biblioteca) que codificaban los diferentes mutantes de proteínas de lámina beta plegada. El aislamiento de los mutantes con las propiedades de unión novedosas deseadas se llevó a cabo con ayuda de un sistema de selección apropiado, por ejemplo el sistema de exposición de fagos. En el sistema de exposición de fagos, se expone la totalidad de los mutantes de proteína preparados sobre la superficie de bacteriófagos (banco de exposición de fagos). Se investigan dichos fagos recombinantes en relación a su capacidad de unión a moléculas diana deseadas. Los fagos que exponen en su superficie mutantes de lámina beta plegada con una unión específica a la molécula diana, se enriquecen mediante una repetición del screening y se aíslan. Los genes que codifican mutantes de lámina beta plegada con capacidad de unirse, se obtienen a partir de los fagos y se expresan en un sistema de expresión apropiado, por ejemplo E. coli. Sorprendentemente, con el procedimiento descrito se consigue preparar proteínas con propiedades de unión específicas a partir de proteínas de lámina beta plegadas las cuales no presentan ningún tipo de propiedades de unión específicas, aislándose los mutantes con la especificidad deseada a partir de la biblioteca mediante la utilización de un procedimiento de screening apropiado. Dependiendo de las propiedades de las proteínas de unión, los mutantes de cadena beta plegada obtenidos, los mutantes de cadena beta plegada preparados con el sistema descrito presentan ventajas, por ejemplo frente a los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpo recombinantes, en relación al tamaño, estabilidad y producción en forma activa funcional en sistemas heterólogos, preferentemente bacterianos. Dichas propiedades mejoradas de los mutantes de cadena beta plegada novedosos permite, por ejemplo, la substitución de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos recombinantes o anticuerpos catalíticos así como abrir rangos de aplicación completamente nuevos.

La solución según la invención, por ejemplo respecto a la problemática de los anticuerpos indicada, se basa en proporcionar un procedimiento para el diseño de proteínas con propiedades de unión específicas que presentan una alta estabilidad frente a valores de pH bajos, agentes desnaturalizantes y temperatura elevada, es decir, que resisten condiciones en las cuales son inestables los anticuerpos. La creación de estructuras de lámina beta plegada con propiedades de unión similares a anticuerpos es el objeto de la presente invención. Las proteínas pequeñas con una elevada estabilidad natural son especialmente apropiadas para el diseño. Mediante la modificación de su superficie se producen, de forma ilustrativa, nuevas propiedades de unión específicas en la proteína según la invención, manteniéndose al mismo tiempo la estabilidad.

Según la invención, se selecciona como una clase posible de proteínas estables, a modo de ejemplo, las cristalinas. Las cristalinas, las proteínas estructurales del cristalino, no están sometidas a "turnover" celular y muestran como consecuencia propiedades de estabilidad extraordinarias (Mandal et al., 1987, Rudolph et al., 1990). Las gamma-cristalinas, una clase de las cristalinas en vertebrados, son proteínas monoméricas con una masa molecular de aproximadamente 22 kDa. El motivo estructural principal de las gamma cristalinas es una lámina beta plegada antiparalela (Hazes y Hol, 1992, Richardson et al., 1992, Hemmingsen et al., 1994). Las gamma-cristalinas constan de dos dominios globulares muy similares, un domino N-terminal y un dominio C-terminal, los cuales están unidos entre sí mediante un péptido de unión en forma de V. El patrón de plegamiento característico de las gamma-cristalinas (Motivo "Greek-Key", Slingsby, 1985, Wistow y Piatigorsky, 1988) es muy probablemente el origen de la notable termoestabilidad así como la estabilidad frente a agentes desnaturalizantes (Mandal et al., 1987). La gamma-II-cristalina de ojo de ternero es una proteína de 21 kDa con un número extraordinariamente elevado (7) de cisteínas para su tamaño, las cuales se encuentran en estado reducido en condiciones fisiológicas.

La gamma-II-cristalina no presenta en el estado plegado normal ningún tipo de propiedades de unión. La modificación (mutagénesis) según la invención de una región seleccionada de dicha proteína expuesta a disolventes, la cual está compuesta por el motivo estructural de lámina beta plegada, condujo sorprendentemente a la modificación de la estructura de la superficie y del patrón de carga de la proteína y por tanto a la obtención de nuevas propiedades de unión. Para ello se seleccionaron sólo regiones o posiciones de aminoácidos que no están implicadas de forma determinante en el mantenimiento de la estructura de la proteína. La mutagénesis de una pequeña proteína de lámina beta plegada (Riddle et al., 19976) ha mostrado que las proteínas pueden formar en un alto porcentaje la estructura nativa de la lámina beta plegada de forma correcta, a pesar de presentar considerables modificaciones de la secuencia.

Ya existían ensayos para la mutagénesis de regiones de proteína determinadas con el objetivo de aislar moléculas con propiedades de unión mejoradas o nuevas en el caso de fragmentos de anticuerpo (Nissim et al., 1994, de Kruif et al., 1995), de proteínas con propiedades de unión ya presentes (receptores, proteínas inhibidoras, proteínas de unión a ADN) así como de bibliotecas de péptidos (Cortese et al., 1995, Haaparanta y Huse, 1995, McConell et al., 1996). En el caso de anticuerpos se someten a mutagénesis sólo los dominios de unión a antígeno, los cuales se encuentran presentes como regiones de bucle. Este es también el caso de la mayoría del resto de proteínas, por ejemplo tendamistat (McConell y Hoess, 1995) o el citocromo b_{562} (Ku y Schultz, 1995). También aquí se someten a mutagénesis las regiones de bucle. Algunos ejemplos de mutagénesis en hélices alfa son los dominios Z de la proteína A (Nord et al., 1997) y el dominio de dedo de zinc CP-1 (Choo y Klug, 1995). En las mutagénesis llevadas a cabo hasta ahora se modificaba exclusivamente la especificidad de unión, partiéndose siempre de proteínas que ya presentaban propiedades de unión. En ningún caso se ha utilizado una proteína sin propiedades de unión, ni tampoco se había modificado de forma dirigida un motivo estructural de lámina beta plegada. En el procedimiento descrito en el presente documento se ha llevado a cabo por primera vez una mutagénesis dirigida en una proteína sin ningún tipo de propiedades de unión en la rígida región de la lámina beta plegada. Por este motivo, se produjo de forma sorprendente una proteína con considerable estabilidad y con propiedades de unión específicas en comparación con las moléculas de anticuerpo.

El sistema de exposición de fagos sirve como sistema apropiado para el aislamiento de proteínas de lámina beta plegada sometidas a mutagénesis con nuevas propiedades de unión creadas. El sistema permite un screening muy eficiente de un gran repertorio de variantes de proteínas en base a sus propiedades de unión específicas (Smith, 1985). Para ello cada una de las variantes de proteína se presenta en la superficie de un fago filamentoso y puede interaccionar con las moléculas diana inmovilizadas en una fase fija. Las proteínas que se unen a las moléculas diana pueden obtenerse mediante elución de los fagos. Después de aislar el ADN de los fagos, puede determinarse la secuencia de ADN de las variantes de proteína que se unen de forma específica. Además del sistema de exposición de fagos, pueden utilizarse también otros sistemas de selección, por ejemplo de exposición de bacterias (Stahl y Uhlen, 1997) o de exposición de ribosomas (Hanes et al., 1997).

Sorprendentemente, mediante la invención descrita se consigue, por ejemplo, modificar la superficie de la proteína de lámina beta plegada gamma-II-cristalina, muy estable mediante mutagénesis dirigida específica de sitio en la lámina beta plegada, de manera que se produce una proteína con propiedades de unión específicas a partir de la proteína sin capacidad de unión. Mediante una modificación al azar de ocho posiciones de aminoácido se lleva a cabo por primera vez una mutagénesis en una molécula armazón dentro de una región relativamente rígida de la proteína. De esta manera, a partir de la proteína de lámina beta plegada gamma-II-cristalina se produce una especie proteica "similar a anticuerpo" en cuanto a sus propiedades de unión específica. La gamma-II-cristalina u otras proteínas de lámina beta plegada pequeñas y estables pueden utilizarse de forma general como moléculas armazón novedosas para el diseño de propiedades de unión novedosas mediante el procedimiento descrito. Las proteínas de lámina plegada beta modeladas pueden sustituir por ejemplo a anticuerpos recombinantes en diferentes aplicaciones. Debido a su tamaño relativamente pequeño (20 kDa) son apropiadas como contraparte de fusión de otras proteínas funcionales (preparación de proteínas multifuncionales). Se encuentran otras posibilidades de aplicación en la terapia génica, donde pueden utilizarse como módulos para el direccionamiento celular específico de los vectores para terapia génica y en la inmunización intracelular. La estabilidad de las proteínas de unión novedosas permite además aplicaciones que no pueden realizarse actualmente con anticuerpos recombinantes, por ejemplo en el diagnóstico y terapia en la medicina humana y en la medicina veterinaria, en biosensores y en la bioseparación. Otros campos de aplicación son la industria farmacéutica y cosmética en general así como el análisis y eliminación de sustancias tóxicas.

A continuación se describen algunas realizaciones preferidas de la invención.

Las proteínas con estructura de lámina beta plegada seleccionadas para mutagénesis según la invención no muestran propiedades de unión o muestran propiedades de unión tales que parece deseable una modificación, en particular una mejora.

Las proteínas con estructura de lámina beta plegada son conocidas. Un ejemplo de una clase de proteínas con lámina beta plegada son las cristalinas, en particular las alfa-cristalinas, las beta-cristalinas y las gamma-cristalinas. Pueden utilizarse básicamente las cristalinas de todos los géneros animales, por ejemplo de los animales vertebrados, los roedores, las aves y los peces. Otros ejemplos de proteínas con estructura en lámina beta plegada que pueden someterse a mutagénesis según la invención son: las esferulinas, las proteínas de choque por calor, las proteínas de choque por frío, las proteínas de hélice beta y las fibronectinas. Por ejemplo se someten a mutagénesis según la invención unidades discretas o dominios de dichas proteínas con estructura de lámina beta plegada, a modo de ejemplo, las cristalinas.

Entre las cristalinas se prefiere nombrar especialmente la gamma-cristalina, de la cual ha podido demostrarse a modo de ejemplo según la invención, que su estructura de lámina beta plegada puede modificarse, es decir, someterse a mutagénesis, de tal manera que se producen nuevas propiedades de unión o nuevas actividades catalíticas, que por ejemplo son comparables a una molécula de anticuerpo. Un ejemplo de gamma-cristalina es la gamma-II-cristalina.

Algunos ejemplos de proteínas de hélice beta se encuentran, entre otros, en Jenkins J. et al., J. Struct. Biol., 1998, 122 (1-2): 236-46, Pickersgill, R. et al., J. Biol. Chem., 1998, 273 (38), 24600-4 y Ratees C.R. et al., Science, 1995, 270 (5238), 997-1000.

La estructura de lamina beta plegada se define en cuanto a que se encuentra en forma plana y casi totalmente extendida. Al contrario que las hélices alfa, las cuales se forman a partir de una porción continua de la cadena peptídica, las láminas plegadas beta pueden construirse a partir de diferentes regiones de la cadena polipeptídica. De esta manera, regiones distantes en la estructura primaria pueden alcanzar una proximidad inmediata. Una cadena beta tiene normalmente 5-10 aminoácidos de longitud y se encuentra casi completamente extendida. Las cadenas beta se encuentran tan próximas entre sí que se forman puentes de hidrógeno entre los grupos C=O de una cadena y los grupos NH de la otra cadena y viceversa. Las láminas beta plegadas pueden estar formadas por varias cadenas y tienen una estructura plana. Al mismo tiempo, el átomo C-alfa se encuentra siempre de forma alternativa por encima o por debajo de la superficie plana. Las cadenas laterales de los aminoácidos siguen este patrón y por eso se dirigen de forma alternativa una vez hacia arriba y una vez hacia abajo. Dependiendo de la orientación de la cadena beta, se diferencia entre láminas plegadas paralelas y antiparalelas. Según la invención, ambas pueden someterse a mutagénesis y utilizarse para la preparación de las proteínas deseadas.

Para la mutagénesis de la estructura de lámina beta plegada se seleccionan aquellas regiones de lámina beta plegada en la proteína que se encuentran cercanas a la superficie. Los aminoácidos expuestos en la superficie pueden identificarse en función a la estructura de rayos X. En el caso de que no exista ninguna estructura cristalina, pueden intentar predecirse mediante un análisis computacional la región de lámina beta plegada expuesta en la superficie y las posiciones de aminoácidos discretos expuestos en base a la estructura primaria existente (www.embl-
heidelberg.de/predictprotein/predict protein.html) o modelar la estructura proteica 3D (www.expasy.ch/swissmo/
SWISS-MODEL.html) y de esta manera obtenerse evidencia sobre los aminoácidos probablemente expuestos en superficie.

Sin embargo, también es posible llevar a cabo mutagénesis en la lámina beta plegada suprimiendo la preselección de las posiciones de aminoácidos a someter a mutagénesis, lo cual implica mucho tiempo. Aquellas regiones de ADN que codifican estructuras de lámina beta plegada, se aíslan a partir de su entorno de ADN, se someten a una mutagénesis al azar y finalmente se integran en el ADN que codifica la proteína a partir de la cual se extrajeron. A continuación se añade un procedimiento de selección de mutantes con las propiedades de unión deseadas y/o propiedades catalíticas y/o propiedades fluorescentes.

En otra forma de realización de la invención tal como se ha realizado más arriba, se seleccionan las regiones de lámina beta plegada cercanas a la superficie y dentro de estas regiones seleccionadas se identificasn las posiciones de aminoácidos a someter a mutagénesis. Dichas posiciones de aminoácidos seleccionados de esta manera pueden someterse a mutagénesis dirigida a nivel de ADN, es decir, un codón que codifica un determinado aminoácido se sustituye por un codón que codifica por otro aminoácido específico preseleccionado o dicha sustitución se lleva a cabo en el contexto de una mutagénesis al azar, de tal manera que se determina la posición de aminoácido a sustituir pero no se determina el codón que codifica el nuevo aminoácido, todavía indefinido.

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Los aminoácidos expuestos en la superficie están expuestas al disolvente circundante. Hablamos de aminoácidos expuestos en superficie cuando la accesibilidad de los aminoácidos en la proteína es mayor del 8% en comparación con la accesibilidad de los aminoácidos en el tripéptido modelo Gly-X-Gly. Dichas regiones de proteína, o bien dichas posiciones de aminoácido aisladas también son posiciones de unión preferidas para ligandos, las cuales deben seleccionarse según la invención. Las contrapartes de unión pueden ser antígenos o sustratos o análogos de estado de transición del sustrato, por ejemplo.

Según la invención pueden someterse a mutagénesis prácticamente todas las proteínas que muestren en la superficie estructuras de lámina beta plegada expuestas a un disolvente o a un ligando. Aquí entran en consideración principalmente aquellas proteínas que sean especialmente estables, es decir, que sean resistentes a la desnaturalización o que sean suficientemente "pequeñas".

Bajo el término "someter a mutagénesis" se entiende, según la invención, la modificación de uno o más aminoácidos expuestos en la superficie en la cadena polipeptídica con una estructura de lámina beta plegada. Bajo esta definición entran por ejemplo las sustituciones de aminoácidos, donde se sustituye un aminoácido con propiedades determinadas relacionadas con su polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad o hidrofilicidad por un aminoácido con otra propiedad, por ejemplo la sustitución de un aminoácido hidrofóbico no polar por un aminoácido polar, de un aminoácido cargado negativamente por un aminoácido cargado positivamente, etc. La expresión "someter a mutagénesis" comprende también inserciones y deleciones de uno o varios aminoácidos. Es un prerrequisito que las mutaciones de aminoácidos expuestos en superficie en como mínimo dos cadenas beta comprendan como mínimo una lámina beta plegada. Las mutaciones se realizan preferentemente dirigidas a posiciones de aminoácido aisladas en la lámina plegada beta o en regiones seleccionadas de la lámina beta plegada. Las mutagénesis pueden estar presentes en una región o en varias regiones de la estructura de lámina beta plegada. Las modificaciones pueden comprender aminoácidos vecinos o también aminoácidos en la lámina beta plegada que se encuentran separados entre sí. Las modificaciones pueden comprender también aminoácidos que se encuentran en láminas beta plegadas diferentes, es decir, en más de una lámina beta plegada. Las inserciones, deleciones o sustituciones de uno o varios aminoácidos se localizan en como mínimo dos cadenas beta expuestas en superficie y como mínimo en una lámina beta plegada expuesta en superficie. En este contexto puede sustituirse, seleccionarse o insertarse en una cadena beta expuesta en superficie uno o varios aminoácidos, es decir, una cadena beta expuesta en superficie puede presentar varias mutaciones, siempre y cuando se mute como mínimo dos cadenas beta expuestas en superficie. En otra realización preferida se somete a mutagénesis como mínimo dos láminas beta plegada expuestas en superficie, sometiéndose a mutagénesis en cada una de ellas una cadena beta expuesta a superficie, es decir, cada una de las láminas beta plegadas expuestas en superficie presenta como mínimo una cadena beta expuesta en superficie sometida a mutagénesis. En otra realización de la invención, las láminas beta plegadas expuesta a superficie sometidas a mutagénesis se disponen de forma antiparalela, tratándose preferentemente cómo mínimo de dos láminas beta plegadas dispuestas de forma antiparalela. Por ejemplo, se prefiere según la invención someter a mutagénesis dos o tres cadenas beta expuestas en superficie. También es posible según la invención someter a mutagénesis cuatro o más cadenas beta expuestas a superficie. Además es posible someter a mutagénesis como mínimo dos cadenas beta en como mínimo dos láminas beta plegadas, prefiriéndose una mutagénesis de tres cadenas beta en dos láminas beta plegadas antiparalelas.

En una realización de la invención, la mutagénesis se lleva a cabo mediante el ensamblaje de oligonucleótidos de ADN con el codón de aminoácido NNK. Evidentemente, pueden utilizarse también otros codones (tripletes).

Las mutaciones son tales que la estructura de lámina beta plegada se mantiene. En general, la mutagénesis se encuentra en la cara exterior de una región de lámina beta plegada expuesta en la superficie de la proteína y estable. Esta engloba tanto mutagénesis específicas de sitio como también mutagénesis al azar. Las mutagénesis específicas de sitio que comprenden una región relativamente pequeña en la estructura primaria (aproximadamente 3-5 aminoácidos) pueden realizarse con los kits comerciales Stratagene (QuickChange) o Bio-Rad (kit de mutagénesis in vitro Muta-Gene phagemid) (véase US-A-5,789,166; US-A-4,873,192).

En las mutagénesis específicas de sitio para regiones más amplias debe emplearse un casete de ADN, obteniéndose la región a someter a mutagénesis mediante el ensamblaje de oligonucleótidos que comprenden posiciones mutadas y posiciones no modificadas (Nord et al., 1997; McConell y Hoess, 1995). Las mutagénesis al azar pueden realizarse mediante la multiplicación del ADN en cepas mutágenas o mediante una amplificación por PCR (PCR propensa a error) (por ejemplo Pannekoek et al., 1993). Para ello se utiliza una polimerasa con una relación de error aumentada. Para aumentar el grado de las mutagénesis introducidas, o para combinar diferentes mutaciones, pueden combinarse las mutaciones en los fragmentos de PCR mediante el mezclado de ADN (Stemmer, 1994). La revisión de Kuchner y Arnold (1997) ofrece una visión general de dichas estrategias de mutagénesis en enzimas. Para llevar a cabo dichas mutagénesis al azar en una región de ADN seleccionada, debe construirse también un casete de ADN que sirva para la mutagénesis.

Las moléculas de ADN obtenidas en la etapa de mutagénesis se expresan en un sistema de expresión apropiado. Se prefieren aquellos sistemas de expresión que faciliten la posterior selección y aislamiento de mutantes con las propiedades de unión deseadas y/o la actividad catalítica o bien enzimática deseada. Los vectores de expresión y los sistemas de expresión de este tipo son conocidos por un experto en la materia y ya se han descrito con más detalle anteriormente. Evidentemente, también es posible utilizar otros sistemas de expresión que permitan la selección según la invención de mutantes con propiedades o actividades específicas.

Preferentemente, para la expresión y selección se utiliza el sistema de exposición de fagos, en el cual la totalidad de los mutantes preparados a nivel de ADN se clonan en un fagémido y se expresan en la superficie de fagos. En el caso de proteínas con cisteínas reducidas, en una realización especialmente preferida de la invención, puede añadirse GSH para mejorar la exposición y selección de los mutantes.

En el procedimiento de la invención se preparan proteínas mutadas, moléculas de ADN mutadas, moléculas de ARN mutadas derivadas de las anteriores y fragmentos funcionales mutados derivados de las anteriores que codifican una proteína con una estructura de lámina beta plegada mutada capacitada para tener una propiedad de unión similar a anticuerpo nueva o modificada a un ligando deseado. La expresión "fragmento funcional" se refiere a subunidades, dominios y epítopos de la proteína con estructura de lámina beta plegada que se han mutado según la invención y que poseen las propiedades de unión y actividades deseadas o que son en parte responsables de ello.

La selección y el aislamiento de mutantes con las propiedades de unión similar a anticuerpo deseadas se lleva a cabo de manera conocida per se. Algunos ejemplos de procedimientos de selección y de procedimientos de aislamiento de mutantes con propiedades de unión nuevas o modificadas y con actividades catalíticas se describen con más detalle a continuación:

En el caso de selección de propiedades de unión deseadas, se ponen en contacto proteínas mutadas o fragmentos funcionales mutados de las mismas con sus contrapartes de unión. Mediante procedimientos apropiados de verificación se seleccionan los mutantes con las propiedades de unión deseadas.

En el caso de selección de una actividad catalítica, lo cual no se encuentra per se en las reivindicaciones, las proteínas mutadas o los fragmentos funcionales mutados de las mismas se asocian con los sustratos y finalmente se seleccionan considerando la actividad enzimática deseada, mediante procedimientos de verificación apropiados.

Una selección de actividad catalítica puede llevarse a cabo de varias maneras:

1. Exposición de fagos

Acoplamiento de análogos de estados de transición en una fase fija y selección del banco de mutantes en base a lo anterior. Dichas sustancias son análogos a estados de transición del sustrato, que se producen normalmente en una conversión enzimática de un sustrato a un producto (producto del estado de transición del sustrato). Evidentemente, para ello, debe haberse dilucidado el estado de transición del sustrato. También es posible llevar a cabo un screening de la capacidad de unión del sustrato.

2. Sin exposición de fagos

Clonación de los mutantes en un sistema de expresión bacteriano y cultivo en placa de las bacterias recombinantes para formar colonias aisladas. La proteína mutante puede expresarse en las bacterias mediante la adición de inductores (por ejemplo IPTG) al medio de cultivo. El medio de cultivo debe contener además el sustrato en base a cuya conversión debe llevarse a cabo el screening. El sustrato debe formar durante la conversión un producto identificable, por ejemplo coloreado. Las bacterias que expresan un mutante que convierte el sustrato en el medio de cultivo, toman otro color a través de este proceso. Un ejemplo sería el screening de actividad beta-galactosidasa y la conversión de X-Gal (coloración azul) (Zhang et al., 1997).

3. El experto en la materia conoce también otros procedimientos de verificación

Además de las variantes de la formación de color pueden seleccionarse mutantes de proteínas que proporcionan una nueva resistencia (adición de antibióticos al medio nutriente) o que permiten un crecimiento en medio nutriente mínimo, en el cual la bacteria "normal" no crece. Aquí puede aprovecharse la ventaja de crecimiento de las bacterias con los nuevos mutantes de proteínas (Crameri et al., 1997).

4. Expresión y secreción de las proteínas mutantes

Por ejemplo en bacterias, obtención del sobrenadante y evaluación de la actividad enzimática a seleccionar deseada (You y Arnold, 1996). La presente invención resuelve el problema de obtener proteínas con nuevas propiedades de unión o con nuevas propiedades catalíticas sometiendo a mutagénesis proteínas con estructuras de lámina beta plegada en dicho motivo estructural. Se seleccionan dichas proteínas que poseen las propiedades de unión nuevas o modificadas deseadas, preferentemente que poseen propiedades de unión mejoradas o dichas proteínas que poseen las actividades enzimáticas o catalíticas nuevas o modificadas deseadas, preferentemente que poseen actividades enzimáticas o catalíticas mejoradas. Mediante el sistema según la invención es posible incluso modificar proteínas de lámina beta plegada que no poseen propiedades de unión o que no poseen propiedades enzimáticas, de manera que después de la mutagénesis en la lámina beta plegada consiguen propiedades de unión o propiedades catalíticas.

Bajo el término "propiedades de unión" se entiende según la invención la afinidad específica de un antígeno con un anticuerpo. Después de la mutagénesis llevada a cabo según la invención, la proteína de lámina beta plegada posee propiedades similares a anticuerpo y asocia las ventajas de la alta especificidad de unión de un anticuerpo con las propiedades de estabilidad ventajosas de una proteína de lámina beta plegada. Las proteínas de lámina beta plegadas con propiedades similares a anticuerpo preparadas según la invención pueden poseer también una función
catalítica.

Bajo el término modificación de las propiedades de unión se entiende según la invención tanto un empeoramiento como también una mejora de dichas propiedades, prefiriéndose una mejora.

Según la invención, bajo el término "proteína con una nueva propiedad de unión específica similar a antígeno" se entiende una proteína que previamente no poseía ninguna propiedad de unión específica y que a través de la mutagénesis dirigida de aminoácidos expuestos en superficie en como mínimo dos cadenas beta expuestas en superficie de cómo mínimo una lámina beta plegada expuesta en superficie, posee desde ahora una propiedad de unión específica. Bajo esta definición se encuentran también aquellas proteínas que ya tenían antes de la mutagénesis una propiedad de unión específica similar a anticuerpo y después de la mutagénesis en la lámina beta plegada poseen otra propiedad de unión específica adicional.

La invención engloba también aquellas proteínas que ya poseen una propiedad de unión específica y que después de la mutagénesis de aminoácidos expuestos en superficie en como mínimo dos cadenas beta expuestas en superficie de cómo mínimo una lámina beta plegada expuesta en superficie, consigue una mejora, o expresado en términos generales, una modificación, de sus propiedades de unión específicas.

El procedimiento según la invención y las proteínas preparadas según el mismo también se diferencian de las proteínas y procedimientos del estado de la técnica, en las cuales las estructuras de lámina beta plegada se modificaron mediante mutagénesis al azar, en cuanto a que aquellas mutagénesis no estaban dirigidas a las estructuras beta plegadas, sino a la proteína en conjunto y en particular no estaban dirigidas a los aminoácidos expuestos en superficie en como mínimo dos cadenas beta expuestas en superficie de cómo mínimo una lámina beta plegada expuesta en superficie, o que no afectaban a los aminoácidos de este tipo expuestos en superficie.

En una realización preferida de la invención, que se describe a modo de ejemplo a continuación, se ha seleccionado la gamma-cristalina como ejemplo de una proteína con estructura de lámina beta plegada, como punto de partida para la mutagénesis. Para ello, primero se seleccionan posiciones de aminoácidos expuestas en superficie mediante análisis estructurales y se someten a mutagénesis mediante procedimientos de mutagénesis conocidos per se. Los mutantes obtenidos se expresan en un sistema de expresión asimismo conocido y apropiado. La selección se dirigió a aquellos mutantes cuyos aminoácidos expuestos en superficie en la lámina beta plegada de la gamma-cristalina mostraron una unión específica al antígeno BSA-estradiol-17-hemisuccinato. Ciertamente se aislaron varios mutantes con la propiedad de unión deseada, pero sólo uno mostraba los intercambios de aminoácidos esperados. Así se obtuvo una molécula no inmunoglobulina similar a anticuerpo basada en la proteína de partida gamma-cristalina.

Mediante el procedimiento según la invención es posible preparar realmente una enorme cantidad de mutantes. Simplemente la mutagénesis de ocho posiciones de aminoácido permite la formación de 2,6 x 10^{10} diferentes especies de proteínas, en las cuales puede evaluarse las propiedades de unión deseadas y las actividades catalíticas deseadas.

Además se ha mostrado según la invención que pueden modificarse las propiedades de fluorescencia de una proteína con estructura de lámina beta plegada mediante mutagénesis de sus aminoácidos expresados en superficie.

Los genes mutados obtenidos pueden multiplicarse en sistemas apropiados y pueden expresarse las proteínas. Algunos sistemas de expresión apropiados son los sistemas procariotas o eucariotas. El ADN que codifica la proteína mutante se traslada por ejemplo a un vector apropiado, por ejemplo un vector de expresión y se introduce en una célula huésped mediante transformación, transfección o infección. Evidentemente, la unión a secuencias reguladoras que controlan de forma dirigida la expresión del ADN mutado heterólogo, es ventajoso.

Como célula huésped puede utilizarse una célula huésped eucariota superior, por ejemplo una célula de mamífero o una célula huésped eucariota inferior, por ejemplo una célula de levadura o una célula procariota, por ejemplo una célula bacteriana. Un ejemplo de una posible célula huésped bacteriana es E. coli o B. subtilis. También es posible utilizar sistemas de translación libres de células para la preparación de proteínas utilizando ARN derivado del ADN de la presente invención. Algunos sistemas de clonación y expresión apropiados se describen en diferentes manuales de biología molecular, de biotecnología y de tecnología génica. Algunos ejemplos son Sambrook et al., 1989 y Ausubel et al., 1994.

La invención descrita de forma general se detalla a continuación mediante un ejemplo de realización y las figuras adjuntas. El ejemplo debe entenderse como una forma posible de la invención y la invención no debe limitarse a dicha realización particular.

Las siguientes figuras muestran

Fig. 1: Oligonucleótidos para en ensamblaje de los mutantes de gamma-cristalina.

Fig. 2: Representación esquemática del ensamblaje de oligonucleótidos y PCR subsiguiente sobre cuentas magnéticas cargadas con estreptavidina (MB). Las posiciones indicadas como X marcan las posiciones de aminoácidos modificadas al azar.

Fig. 3: Representación esquemática de la amplificación de la región no mutada de la gamma-II-cristalina.

Fig. 4: Oligonucleótidos para la amplificación de la región no mutada de la gamma-II-cristalina.

Fig. 5: Representación esquemática del casete de expresión pCANTAB 5E-gamma-Icristalina. g3-SS: secuencia del péptido señal de la proteína del fago G3; E-Tag: 11 aminoácidos para la determinación inmunológica; fd Gen 3: proteína de cubierta 3 minoritaria del fago filamentoso M13.

Fig. 6: ELISA de fagos policlonales con fagos enriquecidos después del tercer panning. Las placas de microvaloración se recubrieron con el conjugado BSA-beta-estradiol 17-hemisuccinato o sólo con BSA como control. Se representa de forma yuxtapuesta la unión de los fagos de tipo salvaje con gamma-II-cristalina (GC-WT), de los fagos del banco de partida (GCUC-1) y de los fagos enriquecidos en cada respectivo antígeno por panning sucesivos (fagos E-17).

Fig. 7: Secuencia parcial de ADN de los mutantes de gamma-II-cristalina 12 A (Mu 12A) que se unen a BSA-estradiol-17-hemisuccinato en el fagémido pGCKT 8-3 y de la gamma-II-cristalina de tipo salvaje en pCANTAB 5E. En cursiva y en subrayado se marcan las dianas de restricción introducidas Sfi I (5'), Bst EII (3'). En negrita se indica los codones de las posiciones de aminoácidos modificadas al azar.

Fig. 8: Secuencias de aminoácidos derivadas de los mutantes de gamma-II-cristalina 12 A (Mu 12A) que se unen a BSA-estradiol-17-hemisuccinato y de la gamma-II-cristalina de tipo salvaje (WT) después de la expresión en los fagémidos y de la disociación del péptido señal. Las posiciones de aminoácidos modificadas al azar se indican en negrita y los aminoácidos efectivamente sustituidos se indican en negrita y subrayados. Los aminoácidos introducidos adicionalmente en la región N-terminal a través de la diana de restricción Sfi I y la fusión de E-Tag en el extremo C-terminal se indican en cursiva y subrayados.

Fig. 9: Secuencia del cebador utilizado en el vector pET-20B para la clonación de Mu 12A y de la gamma-II-cristalina.

Fig. 10: Secuencia de proteína derivada de los mutantes 12 A que se unen a BSA-estradiol-17 y de la gamma-II-cristalina después de la expresión en pET-20b. Las posiciones de aminoácidos modificadas al azar se indican en negrita y los aminoácidos efectivamente sustituidos se indican en negrita y subrayados. Los aminoácidos introducidos adicionalmente en la región C-terminal mediante la clonación incluyendo el resto de histidina 6 se indica en cursiva y subrayado.

Fig. 11: Unión dependiente de la concentración de los mutantes 12A al conjugado BSA-beta-estradiol 17-hemisuccinato. Se investigó la unión de los mutantes (12A) y de la gamma-II-cristalina (WT) al conjugado (BSA-estr. 17) y a BSA como control.

Fig. 12: Estabilidad de los mutantes 12A frente al agente desnaturalizante Guanidina. Se representan los máximos de emisión después de la incubación de las proteínas purificadas de los mutantes 12A y de la gamma-II-cristalina con diferentes concentraciones de guanidina y a tiempos diferentes.

Fig. 13: Espectro de emisión de fluorescencia de la gamma-cristalina de tipo salvaje y de las mutantes 12A en fosfato sódico 50 mM, pH 6,5. La señal de fluorescencia (fig. 13A) se midió a una longitud de onda de excitación de 280 nm. La concentración de proteína era de 100 \mug/ml. La figura 13B muestra el espectro de absorción de las muestras de proteínas utilizadas para la medición de la fluorescencia. La absorción se determinó en una cubeta de 1 cm de grosor.

Ejemplo Preparación de un mutante de la \gamma-cristalina con unión específica a la hormona estradiol

A continuación se ilustra el diseño de nuevas proteínas con estructura de lámina beta plegada y capacidad de unión antigénica, sobre una mutante de la proteína bovina \gamma-cristalina (\gamma-II), que reconoce específicamente la hormona estradiol. Se prepara una nueva proteína con estructura en lámina beta plegada estable y con especificidad de unión, a través de la modificación dirigida de posiciones de aminoácido seleccionadas de una lámina beta plegada expuesta en superficie. Tras la elección de la región más apropiada o de los aminoácidos más apropiados para una mutagénesis en la lámina beta plegada, se llevó a cabo una mutagénesis específica de sitio a nivel de ADN, la preparación de un banco de mutantes de lámina beta plegada en un fagémido, lo cual permite expresar y seleccionar los mutantes en base a las nuevas propiedades de unión en el sistema de exposición de fagos. Se comparó el mutante aislado con la proteína de partida \gamma-II-cristalina en relación a sus nuevas propiedades.

Selección de una región adecuada para la mutagénesis de \gamma-cristalina

Se seleccionaron los dominios N-terminales de la \gamma-II-cristalina para realizar la mutagénesis en base a la estructura de rayos X de gamma-II-cristalina (Wistow et al., 1983). En total se identificaron ocho amino ácidos que conforman un mismo segmento expuesto. Los amino ácidos elegidos forman parte de estructura en lámina beta plegada y presumiblemente no participan en el mantenimiento de la estructura. Se trata de residuos (posiciones amino acídicas) que están expuestos al disolvente y por tanto también a posibles ligandos. Los ocho aminoácidos Lys 2, Thr 4, Tyr 6, Cys 15, Glu 17, Ser 19, Arg 36 y Asp 38 comprenden una superficie de aproximadamente el 6,1% de la superficie global de la proteína.

Preparación de un reservorio de mutantes del gen de la \gamma-II-cristalina

A través de una mutagénesis específica de sitio se variaron al azar las ocho posiciones de aminoácidos. De esta manera se pueden formar hasta 2.6 x 10^{10} especies de proteínas distintas. El segmento a mutar se obtuvo a nivel del ADN por superposición de oligonucleótidos aislados. Tras lo cual, se llevó a cabo la clonación en un fagémido apto para la herramienta Sistema de exposición de fagos.

Ensamblaje de Oligos

Para la mutagénesis se fijaron a una fase sólida 227 pares de bases que comprendían la región 5' de los mutantes \gamma-II-cristalina con las ocho posiciones variadas al azar así como las dianas de restricción enzimática adecuadas. En total se emplearon para ello 10 oligonucleótidos (aislados), de los cuales 3 comprendían las posiciones de aminoácidos variadas al azar (figura 1). En las ocho posiciones por mutar se introdujeron en la síntesis del cebador (primer) la combinación NN(T/G), lo que teóricamente da lugar a 32 diferentes codones en una posición (según, Nord et al., 1997). Al principio del ensamblaje se fijaron oligonucleótidos biotinilizados sobre cuentas magnéticas: Magnetic Beads (MBs) de la firma Dynal (M-280). Tras varios ciclos de fijación, ligación y polimerización se pudo amplificar por PCR el reservorio de regiones mutantes de la \gamma-II-cristalina ensamblado en la fase sólida (figura 2). Los productos de la PCR, de aproximadamente 250 pb de longitud, comprendían una diana de restricción Sfi I en 5' y una diana de restricción de Bst EII en 3'. Todos los oligonucleótidos utilizados para el ensamblaje se emplearon en una concentración de 100 pmol/\mul. Primero se ensamblaron los cebadores GCLIE1B y GCLIE2P. Para ello 4 \mul de cada cebador se suspendieron en 36 \mul de tampón de lavado y ligación WB (WB-Buffer: 1M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA) y se incubaron a 70ºC durante 5 minutos. Tras la unión de los dos cebadores y posterior incubación de cinco minutos a 70ºC, se enfrió lentamente la mezcla de cebadores a temperatura ambiente. A continuación se mezclaron 4 \mul de la solución del híbrido de cebadores GCLIE1B/GCLIE2P con 56 \mul de tampón WB y se añadieron a 300 \mug de cuentas MBs cargadas con estreptavidina, previamente lavadas con tampón de lavado y unión. Tras una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente se llevó a cabo el lavado de las cuentas MPs con tampón WB y tampón TE (Tris-EDTA: 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA). A las cuentas MBs acopladas con el primer híbrido de cebadores se añadió un cebador que actúa de fragmento puente, el cual se había preparado de la siguiente manera: 4 \mul del cebador GCLIB4P o GCLI5P se añadieron a 36 \mul de tampón 1x de ligación de GIBCO BRL (50 mM Tris-HCl 7.5, 10 mM MgCl_{2}, 1 mMATP, 1 mM DTT, 5% (p/v) polietilenglicol-8000). Tras una incubación a 70ºC durante 5 minutos se juntaron ambas preparaciones, se volvieron a incubar a 70ºC durante 5 minutos y se dejó enfriar la mezcla a temperatura ambiente. A continuación se añadió a la mezcla 4 \mul de GCLI3P y 16 \mul de tampón 1x de ligación, que a su vez se habían incubado previamente 5 minutos a 70ºC. Tras la adición de doce unidades de T4-ADN-ligasa (casa comercial GIBCO BRL) y 8 \mul de tampón 1x de ligación se incubó la preparación de reacción durante 1 hora a temperatura ambiente. 12 \mul de este fragmento puente GCLIE3P/GCLIB4P/GCLI5P se transfierieron a 54 \mul de tampón de ligación con 6 unidades de ligasa, se añadieron a las cuentas MBs previamente lavadas que contenían el primer cebador y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Al finalizar la reacción de ligación se lavaron los MBs dos veces con tampón TE y se resuspendieron en 64 \mul de tampón 1x de ligación con 8 unidades de enzima ligasa. A continuación se añadieron a las cuentas MBs 8 \mul del híbrido de cebador GCLI6P/GCLIB7P, cuyo ensamblaje es análogo al de GCLIB4P/GCLIB5P. La ligación se llevó a cabo nuevamente a lo largo de 1 hora a temperatura ambiente. Tras un doble lavado de las cuentas MBs en tampón se adicionaron a éstas 12 \mul del segundo fragmento puente GCLIB8P/GCLIE9P/GCLIE10 y se ligaron a lo largo de 1 hora. La preparación del segundo fragmento procede de forma análoga al primer fragmento, primero se ensamblaron GCLIE9P y GCLIE10 y después se unieron con GCLIB8P. Las cuentas MBs recubiertas de los cebadores inmovilizados se lavaron a continuación de nuevo con tampón TE. Los subsiguientes procesos de polimerización de ADN y ligación rellenaron los huecos en la segunda hebra. Para ello las cuentas MBs fueron incubadas durante 30' a 37ºC en la siguiente solución tampón: 52.5 \mul H_{2}O, 6 \mul Tampón L de la casa comercial Boehringer (100 mM TrisHCl pH 7.5, 100 mM MgCl_{2}, 10 mM ditioeritritol), 0.5 \mul de deoxinucleotidos trifosfato (dNTP'S, 25 mM cada NTP) \mul y 1 \mul con dos unidades del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I (casa comercial Boeringer). Siguió la reacción de ligación tras doble lavado de las cuentas MBs en tampón TE e incubación durante 1 hora. En 100 \mul de preparación hay 10 unidades de ligasa. Después de una etapa de lavado repetida dos veces con tampón TE, se separaron las cadenas de ADN no unidas de forma covalente a las cuentas MBs mediante el tratamiento 40 \mul de 0.1 M NaOH durante 30 segundos y se resuspendieron en 60 \mul de TE. La PCR para amplificar el banco se realizó utilizando las cuentas MBs como molde. La reacción de PCR (50 \mul) se llevó a cabo de la siguiente manera: 6 \mul de cuentas MBs, 5 \mul de tampón 10x de PCR de la casa comercial Stratagene: 100 mM KCl, 100 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}, 200 mM Tris-HCl pH 8.75, 20 mM MgSO_{4}, 1% detergente Triton X-100, 1 mg/ml BSA), 1 \mul (2.5 unidades) de polimerasa de ADN Pfu (casa comercial Stratagene), 0.5 \mul de dNTP's (25 mM cada NTP), 0.35 \mul GCLIE1B, 0.35 \mul GCLIA11B y 36.8 \mul de H_{2}O. La reacción de PCR comprendió 35 ciclos con un etapa de unión de 1 minuto a 55ºC, una etapa de amplificación por la polimerasa de 1.5 minutos a 72ºC, una etapa de desnaturalización a 95ºC de 1 minuto y una etapa final de amplificación de 5 minutos a 72ºC.

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Preparación del fagémido pGCKT 8-3

Partiendo del fagémido pCANTAB 5E (PRAS-Kit de Pharmacia Biotech) se construyó un derivado para la clonación del banco de los mutantes de la \gamma-II-cristalina. Se amplificó la región 3' (C-terminal) del gen de la \gamma-II-cristalina así como la región 5' no mutada por PCR empleando el plásmido pGII (Mayr et al., 1994) como molde y los cebadores GCFORNOT y GCBACKSfiBst (Figuras 3, 4).

Las dianas de restricción introducidos por los cebadores, Sfi I-(GCBACKSfiBst) y Not-I (GCFORNOT), permiten la inserción de los productos de PCR en el fagémido pCANTAB5E. Con el cebador GCBACKSfiBst se integró adicionalmente un diana de restricción Bst EII en el gen \gamma-II-cristalina que permite la clonación de los fragmentos mutados de \gamma-II-cristalina. La inserción de-novo de dianas de restricción no conduce a una modificación de la secuencia de amino ácidos de la \gamma-II-cristalina. Tras secuenciarlo, el producto de PCR se clonó como fragmento Sfi I/Not I en el fagémido pCANTAB 5E, cortado en su sitios Sfi I y Not I. El fagémido así obtenido fue el punto de partida para la elaboración del banco de exposición de fagos de la \gamma-II-cristalina.

Preparación de un banco de los mutantes de \gamma-II-cristalina y clonación de la proteína \gamma-II-cristalina de tipo salvaje

El fagémido pGCKT 8-3 se fragmentó con las enzimas de restricción Bst EII y Sfi I y se trató con fosfatasa (Fosfatasa shrimps, casa comercial USB). El ADN fragmentado se separó después de cada fragmentación por electrofóresis sobre gel, las fracciones fragmentadas del vector se recortaron y se aislaron del gel de agarosa mediante electroelución. Antes de cada uno de los siguientes tratamientos enzimáticos se llevó a cabo una extracción fenol/cloroformo y una precipitación del ADN con glicógeno. El conjunto de ADN amplificado por PCR que contiene la región mutada de \gamma-II-cristalina, se fragmentó con las enzimas de restricción Sfi I y Bst EII. Para la ligación de los productos de PCR en el fagémido preparado pGCKT 8-3 se emplearon en total 440 ng de fagémido y 110 ng de producto de PCR. Las ligaciones se llevaron a cabo con 44 unidades en total de T4-DNA-ligasa (casa comercial GIBCO BRL) en alícuotas de 20 \mul a 16ºC durante la noche. Tras inactivar la ligasa a lo largo de 20 minutos a 70ºC, se desionizaron las reacciones de ligación a lo largo de 1 hora mediante diálisis de perfusión. A continuación se transformaron fracciones de 30 \mul de E. coli-TG electrocompetentes con 15 \mul de cada ligación dializada, respectivamente. Tanto para la preparación de las células electrocompetentes así como la transformación se llevaron a cabo según se ha descrito en el manual PRAS-Kit. Las células transformadas se sembraron sobre placas SOBAG que comprendían glucosa y ampicilina (100 \mug/ml) y se incubaron a 30ºC durante una noche (ver manual de PRAS-Kit, casa comercial Pharmacia-Biotech). El banco GCUC-1 obtenida comprendía 250 000 clones originales. Los clones se recogieron en un medio de YT-Medium 2x (ver manual de PRAS-Kits) que contenía un 1% de glucosa y un 20% de glicerina, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80ºC. El factor de amplificación del banco se estimó en 7 x 10^{6}. La proporción de clones recombinantes en el banco GCUC-1 fue de 97%. La secuenciación de clones elegidos al azar dio como resultado que se había logrado introducir nuevos codones con la varianza deseada. Mediante análisis de Western-Blot se pusieron de manifiesto niveles de expresión del banco del 30-60%.

Como experimentos de control se amplificó el ADN de \gamma-II-cristalina con los cebadores GCFORNOT (5' GAGT
CATTCTGCGGCCGCATAAAAATCCATCACCCGTCTTAAAGAACC3') y GCBACKSFI (5' CATGCCATGACT
CGCGGCCCAGCCGGCCATGGGGAAGATCA CTTTTTACGAGGAC 3') y el plásmido pGII (Mayr et. al., 1994) como molde. El producto de PCR secuenciado se clonó en el fagémido pCANTAB 5E, cortado previamente con las enzimas Sfi I/Not I, se fragmentó con las mismas enzimas Not I y Sfi I.

Construcción de los sistemas de exposición de fagos y selección de las nuevas propiedades de unión

Para la selección de los mutantes \gamma-II-cristalina cuantíen base a sus propiedades de unión, se empleó el sistema de exposición de fagos comercial (PRAS casa comercial Pharmacia-Biotech). En los fagémidos empleados pCANTAB 5E (wt \gamma-II-cristalina) y pGCKT 8-3 (mutantes \gamma-II-cristalina) se ha fusionado la región N-terminal con el péptido señal G3 y la región C-terminal con un E-tag, que facilita la detección inmunológica de las proteínas (Figura 5). Dependiendo de la cepa bacteriana utilizada, el codón amber de parada que sigue al E-Tag se reconoce (E. coli-HB 2151) y la proteína \gamma-II-cristalina se segrega al periplasma tras desprenderse el péptido señal, o bien el codón es ignorado por la maquinaria de transcripción (E. coli TG 1) y la proteína \gamma-II-cristalina se sintetiza como fusión con la proteína de recubrimiento minoritaria del fago filamentoso M13 y tras la ruptura del péptido señal, se anclada en la membrana interna de la célula E. coli. Tras la adición de fagos asistentes, pueden formarse fagos recombinantes que exponen sobre su superficie las variantes de la \gamma-II-cristalina.

Optimización de las condiciones de cultivo para el banco GCUC-1 y para los fagos de \gamma-II-cristalina salvaje

Siguiendo las instrucciones de cultivo del manual PRAS no se obtuvieron fagos recombinantes, y no se detectaron las proteínas fusión esperadas (gamma-II-cristalina/proteína 3) por el análisis Western-Blot. Sólo tras añadir glutation (GSH) reducido, durante la formación de los fagos, se modificó el estado redox del periplasma de la célula bacteriana y así se crearon las condiciones favorables para el ensamblaje de fagos. En la utilización del clon de la gamma-II-cristalina sólo pudieron detectarse los fagos que llevaban la proteína de fusión mediante la adición de GSH. Con concentraciones crecientes de GSH aumentó también la proporción de fagos con \gamma-II-cristalina. Se determinó que la concentración óptima de GSH era 8 mM. Una posible causa de la deficiente expresión de \gamma-II-cristalina sobre la superficie del fago sin adición de GSH podría ser la elevada proporción de cisteínas reducidas (7) en la \gamma-II-cristalina. Al alcanzar la gamma-cristalina parcialmente plegada el periplasma, podría producirse plegamientos indebidos así como la formación de agregados de la proteína mediante la formación de puentes disulfuro en las condiciones predominantemente oxidativas del periplasma. Esto podría así mismo reprimir el ensamblaje de fagos. En general, en el caso de emplearse proteínas ricas en cisteínas reducidas en el sistema de exposición de fagos, la adición de GSH mejora sensiblemente la formación de fagos recombinantes.

Proceso de selección con el banco de exposición de fagos GCUC-1

Para el screening del banco GCUC-1 se esterilizó todo el material de vidrio a 200ºC durante 4 horas y todo el material de plástico con Helipur durante una hora. El panning del banco GCUC-1 se llevó a cabo con BSA-beta-estradiol 17-hemisuccinato (casa comercial Sigma) como antígeno. Como fase sólida para el panning se emplearon microplacas como fase sólida (Maxisorp. casa comercial Sigma). La estringencia de las etapas de lavado aumentó durante el transcurso de los tres ciclos de panning. Para el primer cultivo se inocularon 100 ml de 2x Medio-YTcon 2% de glucosa y ampicilina (100 \mug/ml) con 50 \mul del banco GCUC-1. Las bacterias crecieron a 37ºC y 300 rpm hasta una densidad óptica OD_{600} de 0,4. A 10 ml de este cultivo bacteriano se le añadieron 800 \mul de fagos-asistentes M13K07 (1 x 10^{11} pfu/ml, GIBCO BRL). A continuación se realizó una incubación a 37ºC durante 30 minutos sin agitación y durante otros 30 minutos con ligera agitación (50 rpm). El pellet bacteriano se obtuvo por centrifugación durante 20' a 1500 rpm (rotor Sorvall SS 34) a temperatura ambiente, y se resuspendió en 100 ml de 2x Medio-YT con 8 mM de GSH, 100 \mug/ml de ampicilina y 50 \mug/ml de canamicina. La formación de los fagos recombinantes tuvo lugar durante una incubación durante una noche a 30ºC y 300 rpm. El sobrenadante con los fagos recombinantes se obtuvo por doble centrifugación de 15 minutos a 10.800 g y subsiguiente filtración (tamaño de poro: 0.45 \mum). La concentración de los fagos se llevó a cabo mediante la adición de una solución 1/5 PEG/NaCl (20%PEG-8000, 2.5 M NaCl) al sobrenadante, una incubación de una hora sobre hielo, así como un doble centrifugado de 30 minutos a 4ºC y 3300 g. El pellet de fago obtenido se resuspendió en 4 ml de PBS pH 7.2 y se separó el resto de partículas celulares por centrifugación (10 minutos, 11.600 g, temperatura ambiente). Para el proceso de selección (panning) se mezcló 1 ml de la solución de fagos concentrada, con 1 ml de una solución de BSA (6% BSA en PBS, pH 7.2) y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Fracciones de 100 \mul de cada solución de fagos así tratada se añadió sobre los pocillos de las placas de microvaloración recubiertas con antígeno preparadas como se indica a continuación. Las microplacas de absorción NUNC se recubrieron a lo largo de la noche con el antígeno BSA-beta-estradiol 17-hemisuccinato. En total se añadió 100 \mul de solución de antígeno (100 \mug/ml PBS pH 7.6) por pocillo a 10 pocillos en total. Después del tratamiento los pocillos se lavaron hasta 3 veces con tampón PBS, pH 7.6. El bloqueo de los sitios de unión libres se realizó con una solución al 3% de BSA/PBS, de unión inespecífica, a pH 7.2 durante 2 horas a temperatura ambiente. Antes de añadir los fagos tratados con BSA se lavaron los pocillos dos veces con una solución tampón PBS (pH 7.2). El panning se llevó a cabo con un movimiento suave de las microplacas a lo largo de 30 minutos (20 rpm) así como una subsiguiente incubación de 90 minutos sin agitación a temperatura ambiente. Los fagos unidos inespecíficamente se eliminaron lavando diez veces con tampón PBS, pH 7.2/0.1% Tween -20 y diez veces con sólo tampón PBS, pH 7.2. Los fagos unidos se eluyeron mediante la adición de 100 \mul de trietilamina 100 mM por pocillo y una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente. La neutralización de los fagos eluídos en condiciones básicas (1 ml) se llevó acabo por adición de 500 \mul de 1M Tris-HCl pH 7.4. 750 \mul de estos fagos se emplearon para la infección de 9 ml de células TG-1, crecidas sobre placas con medio mínimo y una densidad óptica (OD600) de 0.4-0.5. Para ello se incubaron las bacterias con los fagos durante 30 minutos a 37ºC. Los ligandos con capacidad de unión especialmente fuerte, que no se desprenden de las microplacas con tratamiento básico, se fijaron mediante la infección directa de las células TG-1. Para ello 100 \mul de las células TG-1 cultivadas se añadieron directamente sobre los pocillos de las microplacas. Tras una incubación de 30 minutos a 37º se desprendieron las células TG-1 y se juntaron con las infectadas con las soluciones de fagos procedentes de la elución. Las bacterias infectadas se sembraron sobre placas SOBAG de 16x16 cm y fueron incubadas durante la noche a 30ºC. Para la determinación por valoración se empleó cada vez 1 \mul de los fagos concentrados y eluídos. Los clones bacterianos obtenidos se desprendieron de las placas SOBAG con 12.5 ml 2x YT y 20% de glicerina. El segundo y tercer panning se realizó de forma análoga al primero con las siguientes modificaciones: El nuevo cultivo de fagos se llevó a cabo con 20 \mul del banco desprendida de las placas en 20 ml de medio de cultivo. 2 ml del cultivo bacteriano se emplearon para la infección con los fagos asistentes (relación bacterias/fagos: 1/20). El lavado de las microplacas se realizó en el caso del segundo panning primero 15 veces con PBS/Tween-20 y después 10 veces con PBS y en el tercer panning primero 20 veces con PBS/Tween-20 y después 10 veces con PBS.

Experimentos de ELISA para la comprobación del enriquecimiento y de la unión específica

La determinación del enriquecimiento en fagos de unión específica al antígeno se llevó a cabo mediante un ensayo ELISA de fagos policlonales. Aparte de los fagos eluídos se analizaron a modo de comparación los fagos provenientes del banco de partida: GCUC-1 y la \gamma-II-cristalina de tipo salvaje. Se recubrieron placas Maxisorp NUNC con 100 \mul de BSA-estradiol 17 hemisuccinato o BSA en una concentración de 2 \mug/ml PBS pH 7.6 durante la noche a temperatura ambiente. Después de lavar 3 veces los pocillos con PBS a pH 7.6 se realizó un bloqueo de 2 horas a 37ºC con 3% de leche en polvo trébol de la suerte/PBS, pH 7.2 y subsiguientes lavados (3x) con PBS, pH 7.6. Los fagos recombinantes aislados tras el cultivo y aún sin concentrar, se bloquearon inicialmente una hora a temperatura ambiente (1:1 Mezcla de leche en polvo (Marvel)/PBS pH 7.6. 100 \mul de los fagos bloqueados se aplicaron en pocillos y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Después de lavar cada uno de los pocillos tres ceves con PBS/Tween-20 y PBS, se llevó a cabo una incubación con el anticuerpo conjugado anti-M13-POD (casa comercial Farmacia-Biotech, dilución 1:5000 en 3% trébol de la suerte/PBS) durante 1 hora a 37ºC. Tras el lavado de las placas se comprobó la unión al enzima con 100 \mul del sustrato: Immuno-Pure-TMB (casa comercial Pierce). La reacción de color se interrumpió añadiendo 100 \mul de ácido sulfúrico (H_{2}SO_{4}) 2M y la extinción fue fijada a 450 nm. El resultado del enriquecimiento de los fagos tras el tercer panning, que se unen al conjugado BSA-Estradiol, se representan en la
figura 6.

Aislamiento y Caracterización de fagos individuales con unión específica al conjugado

De los clones bacterianos obtenidos tras el tercer panning, se seleccionaron 80 clones individuales. De los clones se aislaron fagos que se estudiaron con la técnica de ELISA en cuanto a su capacidad de unión antigénica. El cultivo de clones bacterianos aislados se llevó a cabo en 100 \mul de medio YT con 2% de glucosa y 100 \mug/ml de ampicilina durante la noche con ligera agitación (100 rpm) en microplacas de polipropileno (casa comercial NUNC). 2 \mul de estos cultivos bacterianos se diluyeron 1:100 veces en el mismo medio de cultivo y se cultivaron a 37ºC y a 100 rpm hasta alcanzar una OD_{600} de 0.4. Se obtuvieron fagos de la misma forma descrita para el proceso de selección. Para el cultivo de fagos se emplearon microplacas de polipropileno de la casa comercial TECAN. Para el análisis ELISA se bloquearon a temperatura ambiente durante 1 hora 200 \mul del sobrenadante (sin concentrar) obtenido tras centrifugar, con 40 \mul de 6x tampón PBS/18% Marvel. De los 80 clones analizados, 30 mostraron una clara especificidad de unión para BSA-Estradiol 17 hemisuccinato y no para el BSA empleado paralelamente. En los experimentos control los fagos con \gamma-II-cristalina de tipo salvaje no mostraron ninguna clase de unión a BSA-Estradiol 17 hemisuccinato. 14 de los ligandos escogidos se secuenciaron con los cebadores marcados con IRD 800 pCANR1LAB (5' CCATGATTACGCC
AAGCTTTGGAGCC 3') y GCLISEQ (5' CTGAAAGTGCCGGTGTGTTGC 3'). La secuenciación no detectó más que en 1 caso una variante \gamma-II-cristalina (Mu 12A), mutada exclusivamente en las ocho posiciones de aminoácido mutadas al azar. En una serie de clones se identificaron desplazamientos en el marco de lectura de los codones, los cuales teóricamente causan cambios funcionales en la proteína pero no exclusivamente en la región esperada. Dichos mutantes frame-shift no se siguieron procesando.

Caracterización del Mutante en la estructura en lámina beta plegada 12A

La expresión de la proteína fusión Mu12A – proteína de cubierta 3 minoritaria en la superficie de los fagos recombinantes así como la expresión de Mu 12A en la cepa E. coli HB 2151 se detectó mediante análisis de Western-Blot, empleando como anticuerpos Anti-G3P y Anti-E-Tag, respectivamente (casa comercial Pharmacia-Biotech). La secuencia de ADN del mutante 12A en el fagémido pGCKT 8-3 y la \gamma-II-cristalina de tipo salvaje se reflejan en la figura7. La secuencia comienza con una diana de restricción Sfi I, que ya está presente en el fagémido de partida pCANTAB 5E, y termina en el caso de pGCKT 8-3 con la diana de restricción Bst EII, introducida de nuevo en el gen \gamma-II-cristalina, o bien con la secuencia original en el caso del gen de tipo salvaje de la \gamma-II-cristalina. Las secuencias que se derivan de estos genes se representan en la figura 8. La variación al azar de los codones de la posición 36 no conduce a un cambio en el aminoácido arginina en esta posición. La modelización por ordenador del mutante 12A pone de manifiesto que los cambios de amino ácidos no conducen a grandes cambios en la estructura proteica en comparación con la proteína de partida. Sin embargo lo que sí se observa es un cambio neto en la carga general de la proteína hacia valores positivos.

Expresión del Mutante 12A en pET-20b

Para caracterizar detalladamente el mutante 12A se realizó un cambio de plásmido de clonación: el ADN se introdujo en el plásmido pET-20b (casa comercial Novagen). Este plásmido permite una alta expresión del ADN recombinante en la cepa E. coli BL 21, así como una ligera disminución de las proteínas ajenas. Los genes se expresan en este caso sin péptido señal pero con una fusión C-terminal con 6 residuos de histidina. El ADN del mutante 12A y de la \gamma-II-cristalina de tipo salvaje se amplificó por PCR empleando el correspondiente fagémido de ADN y el cebador GC 20bback12A/GC de 20 bases para el mutante 12A y GC 20bbackWT/GC de 20 bases para el tipo salvaje. Los fragmentos de PCR se cortaron con las enzimas de restricción Nde I/Bam HI y se clonaron en el vector pET 20b previamente tratado con las mismas enzimas. Las secuencias teóricas del mutante 12A y de la \gamma-II-cristalina tras expresarse en pET-20b se reflejan en la figura 10. Los diez residuos N-terminales del mutante 12A se confirmaron por secuenciación proteica.

Cultivo y purificación del mutante y del tipo salvaje en pET-20b

Para un estudio exhaustivo de las propiedades de unión y de la estabilidad del mutante se produjeron grandes cantidades de la proteína mutante 12A y de la proteína de tipo salvaje. Se transformaron células BL-21 con el plásmido pET-20b/Mu12A y pET-20b/\gamma-II-cristalina, respectivamente. Para el cultivo de los clones se diluyó un medio de cultivo 1:100 de LB-Medium/100\mug/ml ampicilina y el cultivo se agitó a 200 rpm y 37º C hasta una DO_{600} de 0.5. La expresión de \gamma-II-cristalina se indujo por adición de IPTG (concentración final: 1 mM). La segunda incubación del cultivo se llevó a cabo durante la noche a 30ºC y a 200 rpm. Las células bacterianas se recogieron por centrifugación a 600 rpm (rotor Sorvall GS3), 4ºC durante 10 minutos. El pellet celular se resuspendió en 30 ml de tampón PBS 2x añadiendo 150 \mul de PMSF 200 mM y 10 \mul de enzima ADNasa (casa comercial Boeringer). A continuación se realizó una doble ruptura celular con la presa de Gaulin 800-1000 PSIG. El sobrenadante con las proteínas solubles se obtuvo tras la centrifugación de la suspensión de proteínas a 20 000 rpm (rotor Sorvall SS 34) durante 1 hora y a 4ºC. La purificación de las proteínas \gamma-II-cristalina, dotadas de 6 residuos de histidina, se llevó a cabo por cromatografía de afinidad a 4ºC. 8 ml de Ni-NTA se equilibraron con 50 ml de tampón PBS 2x/10 mM imidazol. El sobrenadante con las proteínas solubles se dejó durante la noche con el material equilibrado de la columna agitando lentamente en un agitador de rodillos en batch. Tras trasvasar la suspensión a una columna cromatográfica, se llevó a cabo un lavado con tampón PBS 2x/imidazol 10 mM/NaCl 300 mM. La elusión de la proteína unida se llevó a cabo con PBS 2x/imidazol 250 mM. Al as proteínas eluídas se les añadió DTT (concentración final: 10 mM). A continuación se realizaron dos pasos de diálisis a 4ºC, cada uno de ellos de 8 horas: el primero con 100 mM tampón sodio-fosfato/1 mM EDTA/1 mM DTT y el segundo con 10 mM tampón sodio-fosfato pH 6.0/1 mM EDTA. El sobrenadante obtenido tras la última centrifugación (20 000 rpm con rotor SS 34, 30 minutos, 4ºC) contenía las proteínas purificadas (Mu 12A y \gamma-II-cristalina, respectivamente), que se emplearon a continuación para los ensayos de unión y estabilidad.

Para estudiar la unión específica del mutante 12A al conjugado BSA-estradiol 17 hemisuccinato se realizó un análisis de ELISA, utilizando concentraciones crecientes de la proteína mutante 12A-His-Tag (mutante 12A dotada de una His-Tag) purificada. Como controles se emplearon cantidades crecientes de \gamma-II-cristalina (igualmente con His-Tag) y se estudió la unión de ambas proteínas purificadas a BSA. El análisis de ELISA, que es dependiente de la concentración, se llevó a cabo sobre placas NUNC-Tm. El recubrimiento con antígeno del conjugado BSA-estradiol-17 hemisuccinato y BSA, respectivamente, tuvo lugar durante la noche a temperatura ambiente, con 100 \mul de antígeno a una concentración de 20 \mug/ml PBS pH 7.6. Después de lavar (2x PBS pH 7.6) y bloquear las placas (3% Marvel/PBS durante 2 horas a 37ºC) se añadieron 1-13 \mul de la solución proteica original (concentración 0.63 mg/ml) de proteína pura Mu 12A y \gamma-II-cristalina, respectivamente, a un total de 100 \mul de medio de reacción (PBS, 3% Marcel, x \mul de proteína). Las reacciones se incubaron en pocillos a 37ºC durante 2 horas. Como anticuerpos secundarios se emplearon el anticuerpo Tetra His de casa comercial Qiagen en dilución 1:3000 y el anticuerpo Anti-ratón-POD (casa comercial Sigma), en dilución 1:2000. Los anticuerpos se diluyeron en una solución tamponante de Marvel/PBS y se repartieron 100 \mul por pocillo para una incubación de 1 hora a 37º C. La reacción del sustrato se llevó a cabo como descrito para el análisis policlonal ELISA de los fagos. El resultado de este ELISA, representado en la figura 11, demuestra claramente que sólo con concentraciones crecientes del mutante 12A, se registran valores crecientes de extinción. No se observó ningún aumento con \gamma-II-cristalina. Así mismo no se observó ninguna reacción con BSA. De esta forma queda demostrada la especificidad de unión del mutante 12A en comparación con la proteína de partida.

Para el estudio de la estabilidad se registraron curvas de desnaturalización con guanidina como agente desnaturalizante con la proteína mutante 12A y la proteína \gamma-II-cristalina. Para ello se incubaron las proteínas purificadas a 20 \mug/ml con concentraciones crecientes de guanidinio durante uno a tres días a 20ºC. En total se prepararon 15 concentraciones de guanidinio en un intervalo de 0 a 5.5 M en una solución de 1 mM DTT/0.1 M tampón sodio-fosfato pH 6.0. Para cada muestra se registraron espectros de emisión fluorescente tras uno y tres días, respectivamente. La longitud de onda de excitación fue de 280 nm. En la figura 12 se muestran las máximas de emisión observadas con respecto a la concentración de guanidinio. La estabilidad de la \gamma-II-cristalina de tipo salvaje es mayor tanto después de uno como después de tres días a la del mutante 12A. Sin embargo en comparación con anticuerpos, la estabilidad de la proteína mutante es mucho mayor.

Modificación de las propiedades fluorescentes de la proteína 12A

Para verificar si el mutante 12A poseía propiedades fluorescentes diferentes a la proteína salvaje, se registraron espectros de fluorescencia. Para ello se excitaron 100 \mug/ml de la proteína de tipo salvaje y de la mutante 12A, respectivamente (en 50 mM de tampón sodio fosfato pH 6.0) a 280 nm. La fluorescencia se midió en una longitud de onda de 300 a 400 nm en una cubeta de 1 cm de grosor. La anchura de paso era de 5 nm tanto para la excitación como para la emisión.

La señal de Fluorescencia detectada mostró para ambas proteínas su máximo a 329 nm. Sin embargo la intensidad de fluorescencia del mutante 12A fue sólo del 86% en comparación con la de la proteína de tipo salvaje (100%), véase la figura 13A. El número total de fluoróforos son idénticos en el mutante 12A y en el tipo salvaje. Sin embargo, las modificaciones en la secuencia del mutante (Y \rightarrow K en posición 8 y C \rightarrow Y en posición 15) provocan un cambio en la señal fluorescente. La diferencia en la intensidad de la fluorescencia puede tener como origen en el hecho de que el residuo de tirosina en posición 8 y/o 15 presenta propiedades de fluorescencia distintas.

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<210> 1

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Secuencia sintética

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<213> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótico

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cgcgcgcgtc tcacaaagat acatgccatg actcgcggcc cagcc

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<212> ADN

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<213> Secuencia sintética

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<213> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótico

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<400> 2

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gccgcaggaa gtactggtga ccctggtagt tggggcgctc atacagcatc

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<213> Secuencia sintética

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ccatcagccc catcagcgaa ctttgccgca ggaagtactg g

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<213> Secuencia sintética

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<211> 26

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótico

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatgattac gccaagcttt ggagcc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótico

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgaaagtgc cggtgtgttg c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

2

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótico

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccccatggcc ggctgggccg cgagtcatgg catgtatctt tgtgagacgc gcgcg

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótico

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccatgggg nnkatcnnkt ttnnkgagga ccgggg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótico

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggccctgg aagccccggt cctc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótico

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttccagggc cacnnktacn nktgcnnkag cgactgcccc aacc

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleático

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcagcccta tttcagccgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótico

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatggagtta cagcggctga aatagggctg caggttgggg cagtcgc

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótico

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtaactcca tcnnkgtgnn kagcggctgc tggatgctgt atgag

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótico

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgccccaact accagggtca ccagtacttc ctgcggc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

3

\hskip1.9cm

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

6

Claims

1. Procedimiento para la preparación de una proteína con una estructura de lámina beta plegada y una propiedad de unión similar a anticuerpo frente a una ligando con las siguientes etapas:

a): Selección de una proteína con una estructura cristalina conocida o una estructura proteica 3D del grupo de las cristalinas, esferulinas, proteínas de choque por calor, proteínas de choque por frío, fibronectinas y proteínas de hélice \beta;

b): selección de un ligando;

c): Determinación de los aminoácidos expuestos en superficie de la proteína de la etapa a);

d): Mutagénesis del ADN que codifica la proteína con estructura de lámina beta plegada mediante la sustitución, deleción y/o inserción de aminoácidos expuestos en superficie en como mínimo dos cadenas beta expuestas en superficie de cómo mínimo dos láminas beta plegadas expuestas en superficie, manteniéndose la estructura de lámina beta plegada;

e): Expresión de los mutantes obtenidos en la etapa d) en un sistema de expresión apropiado;

f): Poner en contacto las proteínas obtenidas en la etapa d) con un ligando de la etapa b);

g): Selección y aislamiento de las proteínas mutadas que se unen a las contrapartes de unión seleccionadas en la etapa b) formando una propiedad de unión similar a anticuerpo nueva o mejorada,

entendiéndose como nueva propiedad de unión similar a anticuerpo frente a un ligando, que la proteína de la etapa a) no presenta ninguna propiedad de unión similar a anticuerpo sin la sustitución, deleción y/o inserción y que después de la sustitución, deleción y/o inserción presenta una nueva propiedad de unión similar a anticuerpo frente al ligando de b), o que la proteína de la etapa a) presenta una propiedad de unión similar a anticuerpo antes de la sustitución, deleción o inserción y que después de la sustitución, deleción o inserción posee otra propiedad de unión nueva o una propiedad de unión mejorada frente al ligando de b).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que los aminoácidos expuestos en superficie se han sometido a mutagénesis en como mínimo dos o tres cadenas beta expuestas a superficie o que se ha sometido a mutagénesis cuatro o más cadenas beta expuestas en superficie o que en 1 cadena beta expuesta en superficie se ha sometido a mutagénesis uno o más aminoácidos o que los aminoácidos se han sometido a mutagénesis en más de 1 lámina beta plegada.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada por el hecho de que los aminoácidos expuestos en superficie se han sometido a mutagénesis en tres cadenas beta expuestas en superficie en dos láminas beta plegadas expuestas en superficie antiparalelas.

4. Procedimiento según una o cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que se utiliza una cristalina de animales vertebrados, preferentemente roedores, aves o peces.

5. Procedimiento según una o cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que se utiliza una alfa-, beta- o gamma-cristalina, preferentemente una gamma-cristalina.

6. Procedimiento según una o cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que se utiliza una proteína gamma-II-cristalina.

7. Procedimiento según una o cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que la proteína se somete a mutagénesis en una región de la lámina beta plegada expuesta a un disolvente y/o a un ligando.

8. Procedimiento según una o cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que la proteína se somete a mutagénesis en una estructura de lámina beta plegada de un dominio o de una unidad de la proteína.

9. Procedimiento según una o cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que se utiliza una gamma-II-cristalina que se obtiene mediante la sustitución, deleción o inserción de uno o más de los aminoácidos Lys 2, Thr 4, Tyr 6, Cys 15, Glu 17, Ser 19, Arg 36 y Asp 38 en la gamma-II-cristalina.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por el hecho de que la proteína presenta una especificidad de unión de estradiol o de su conjugado BSA-\beta-estradiol-17-hemicuccinato.

11. Procedimiento según una o cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que la proteína presenta una especificidad de unión de estradiol o de su conjugado BSA-\beta-estradiol-17-hemisuccinato con la secuencia de aminoácidos: SEQ ID No. 19 o SEQ ID No. 21.

12. Procedimiento según una o cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que se combina con otras proteínas o con otras sustancias no proteicas.

13. Procedimiento según una o cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que la mutagénesis comprende una mutagénesis de posiciones de aminoácidos específicas (mutagénesis específica de sitio) o de posiciones de aminoácido no específicas (mutagénesis al azar) en la lámina beta plegada.

14. Procedimiento según una o cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que los mutantes de la etapa e) se expresan en células procariotas o eucariotas, en sistemas libres de células en forma de complejo con ribosomas o sobre la superficie de células de plantas o de animales, de células de levadura o de fagos, virus o bacterias.

15. Procedimiento según una o cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que en la etapa h) se multiplican los genes que codifican las proteínas mutantes de la etapa g) y se expresan las proteínas.

16. Proteína con estructura de lámina beta plegada con una especificidad de unión para el estradiol o para su conjugado BSA-\beta-estradiol-17-hemisuccinato, siendo la proteína cuya estructura cristalina se conoce, una gamma-II-cristalina, la cual se obtiene mediante sustitución, deleción o inserción de uno o más de los aminoácidos Lys 2, Thr 4, Tyr 6, Cys 15, Glu 17, Ser 19, Arg 36 y Asp 38 en la gamma-II-cristalina.

17. Proteína según la reivindicación 16, caracterizado por el hecho de que presenta una especificidad de unión para el estradiol o su conjugado BSA-\beta-estradiol-17-hemisuccinato con la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 19 ó SEQ ID No. 21.