ES2273863T3 - Celula cancerigena humana y animal transgenico portador de un protooncogen humano y kit para el diagnostico de cancer utilizand0 dicho protoocogen. - Google Patents
Celula cancerigena humana y animal transgenico portador de un protooncogen humano y kit para el diagnostico de cancer utilizand0 dicho protoocogen. Download PDFInfo
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Abstract
Una célula de mamífero transformada con un vector de expresión que comprende un protooncogen humano que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, la cual es la línea celular de ratón HCCR-1M depositada como KCTC 0923BP o la línea celular humana HCCR-1H depositada como KCTC 0922BP.
Description
Célula cancerígena humana y animal transgénico
portador de un protooncogén humano y kit para el diagnóstico de
cáncer utilizando dicho protooncogén.
La presente invención se relaciona con una
célula de mamífero cancerosa transformada con un vector de expresión
que comprende un protooncogén humano que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO: 1; un embrión de mamífero no humano que
comprende una construcción de ácido nucleico que contiene el
protooncogén; un mamífero no humano canceroso transgénico que
proviene del embrión de mamífero no humano; y un kit para el
diagnóstico del cáncer de mama, de riñón, de ovario o de estómago en
el que se utiliza el protooncogén.
En los animales superiores, incluyendo el
hombre, cada individuo posee aproximadamente 100.000 genes, pero
sólo se expresan alrededor del 15% de ellos, y las características
de los procesos biológicos del individuo, por ejemplo, la génesis,
la diferenciación, la homeostasis, las respuestas a estímulos, el
control del ciclo celular, el envejecimiento y la apoptosis (muerte
celular programada), están determinadas dependiendo de qué genes se
expresan (Liang, P. y A. B. Pardee, Science, 25 7:
967-971 (1992)).
Los fenómenos patológicos como la tumorigénesis
están causados por mutaciones de genes, las cuales provocan cambios
en el modo en que los genes se expresan.
Se ha descrito que la tumorigénesis está
provocada por varios cambios genéticos como la pérdida de
heterozigosidad cromosómica, la activación de oncogenes y la
inactivación de genes supresores de tumor, por ejemplo, el gen p53
(Bishop, J. M., Cell, 64, 235-248 (1991); y
Hunter, T., Cell, 64, 249-270 (1991)).
Además, se ha descrito que del 10 al 30% de los cánceres humanos
surgen de la activación de oncogenes a través de la amplificación de
protooncogenes.
Así, la activación de protooncogenes juega un
papel importante en la etiología de muchos tumores y existe la
necesidad de identificar protooncogenes.
El presente inventor describió que un
protooncogén, el de cáncer humano de cuello del útero 1
(HCCR-1), se sobreexpresa específicamente en células
cancerosas (Publicación de patente Coreana abierta No
2001-39566). Con la finalidad de revelar el
mecanismo involucrado en la tumorigénesis, el presente inventor se
ha propuesto la preparación de una línea celular cancerosa y de un
mamífero transgénico que desarrolla cáncer utilizando el
protooncogén
HCCR-1.
HCCR-1.
Por lo tanto, es un objeto de la presente
invención proporcionar una célula de mamífero que tiene introducido
el protooncogén HCCR-1.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un embrión de mamífero no humano portador del
protooncogén HCCR-1, y un mamífero no humano
transgénico que proviene del embrión de mamífero no humano.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un kit para el diagnóstico del cáncer de mama, de
riñón, de ovario o de estómago utilizando el protooncogén
HCCR-1.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporciona una célula de mamífero transformada con un
vector de expresión que comprende el protooncogén humano
HCCR-1 que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ
ID NO: 1.
Los objetos y características mencionados de la
presente invención se desprenderán de la siguiente descripción de
realizaciones preferidas, consideradas conjuntamente con las figuras
que se adjuntan, en las que:
Las Figs. 1A y 1B son las respectivas figuras de
contraste de fase de células HCCR-1M cultivadas en
monocapa y células NIH/3T3 naturales parentales;
La Fig. 2 es el resultado de la tinción con
hematoxilina-eosina de células
HCCR-1M cultivadas en monocapa;
La Fig. 3 es una imagen de microscopio
electrónico de transmisión de células HCCR-1M;
La Fig. 4 es una fotografía del ratón
"nude" con aloinjerto de células HCCR-1M
mostrando los nódulos tumorales palpables;
La Fig. 5 es el resultado de la tinción con
hematoxilina-eosina de los nódulos tumorales
palpables tomados del ratón "nude" con aloinjerto de células
HCCR-1M;
La Fig. 6 es una imagen de microscopio
electrónico de transmisión de los nódulos tumorales palpables
tomados del ratón "nude" con aloinjerto de células
HCCR-1M;
Las Figs. 7A a 7D son los resultados de los
análisis inmunohistoquímicos que muestran la expresión de fibras de
reticulina, queratina, de antígeno de membrana epitelial y
vimentina, respectivamente, en los nódulos tumorales palpables
tomados del ratón "nude" con aloinjerto de células
HCCR-1M;
La Fig. 8 es una figura de contraste de fase de
células HCCR-1MN cultivadas en monocapa;
Fig. 9 es el resultado del análisis por
transferencia western que muestra la expresión del protooncogén
HCCR-1 en células HCCR-1M y
HCCR-1MN;
Las Figs. 10A y 10B son las figuras de contraste
de fase de células HCCR-1H cultivadas en monocapa y
de células 293 naturales parentales, respectivamente;
La Fig. 11 es el resultado de la tinción con
hematoxilina-eosina de los nódulos tumorales
palpables tomados del ratón "nude" con xenoinjerto de células
HCCR-1H;
Las Figs. 12A a 12C son los resultados de los
análisis inmunohistoquímicos que muestran respectivamente la
expresión de citoqueratina 8, citoqueratina 19 y vimentina, en los
nódulos tumorales tomados del ratón "nude" con xenoinjerto de
células HCCR-1H;
La Fig. 13 es el resultado del análisis por
transferencia northern que muestra la expresión del protooncogén
HCCR-1 en células HCCR-1H;
La Fig. 14 es un gráfico que muestra las
actividades proteína quinasa C de célula NIH/3T3 natural parental,
comparada con célula NIH/3T3 transfectada con el vector pcDNA3 y
célula HCCR-1M;
La Fig. 15 es un gráfico que muestra las
actividades telomerasa de la célula 293 control positivo, de la
célula control negativo, de célula NIH/3T3 natural parental,
comparada con célula NIH/3T3 transfectada con el vector pcDNA3 y
células HCCR-1M;
Las Figs. 16A a 16C son los resultados de los
análisis por transferencia northern que muestran respectivamente la
expresión de los genes egr-1, c-fos
y gliceraldehído-2-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH), en célula HCCR-1M;
La Fig. 17A es el resultado del análisis por
transferencia western que muestra la expresión del gen supresor de
tumores p53 en célula HCCR-1H; y la Fig. 17B,
\beta-actina de la misma transferencia;
La Fig. 18 es el resultado de la
inmunoprecipitación que muestra la expresión del supresor de tumores
p53 en célula HCCR-1H;
Las Figs. 19A, 19C, 19E, 19G y 19I son los
resultados de los análisis por transferencia western que muestran
respectivamente la expresión de los genes MDM2, Bax, p21WAF1,
p16INK4A y p14^{ARF} en célula HCCR-1H; y las
Figs. 19B, 19D, 19F, 19H y 19J, la \beta-actina en
cada una de las transferencias anteriores;
La Fig. 20A es el resultado del análisis por
transferencia western que muestra la proteína GST en el precipitado
obtenido mediante la inmunoprecipitación de la proteína FLAG de la
célula CHO cotransfectada con el vector que expresa la proteína de
fusión de FLAG y HCCR-1 y el vector de expresión de
la proteína de fusión de GST y D52; y la Fig. 20B, la proteína PLAG
en el precipitado obtenido mediante inmunoprecipitación de la
proteína GST;
La Fig. 21 es un diagrama esquemático de la
construcción de ácido nucleico que contiene el protooncogén
HCCR-1;
La Fig. 22 es un ratón transgénico canceroso que
proviene de un embrión que tiene introducido el protooncogén
HCCR-1;
La Fig. 23 es una fotografía del tumor de mama
del ratón transgénico que proviene del embrión que lleva introducido
el protooncogén HCCR-1;
La Fig. 24 es el resultado de la tinción con
hematoxilina-eosina del tumor de mama tomado del
ratón transgénico que proviene del embrión que lleva introducido el
protooncogén HCCR-1;
La Fig. 25 es una imagen de microscopio
electrónico de transmisión del tumor de mama tomado del ratón
transgénico que proviene del embrión que lleva introducido el
protooncogén HCCR-1;
La Fig. 26A es el resultado del análisis por
transferencia northern que muestra la expresión del
protooncogén
HCCR-1 en tejidos tumorales de mama, de hígado, de ovario y de estómago; y la Fig. 26B, muestra la misma transferencia hibridada con sonda de \beta-actina;
HCCR-1 en tejidos tumorales de mama, de hígado, de ovario y de estómago; y la Fig. 26B, muestra la misma transferencia hibridada con sonda de \beta-actina;
La Fig. 27 es el resultado del análisis por
transferencia western que muestra la expresión del protooncogén
HCCR-1 en tejidos tumorales humanos de tumor de
mama, de riñón, de ovario, y de estómago; y
La Fig. 28 es el resultado del análisis de
hibridación in situ por fluorescencia que muestra la posición
del protooncogén HCCR-1 en el cromosoma humano.
El protooncogén humano (de aquí en adelante
"protooncogén HCCR-1") de SEQ ID NO: 1 que se
utiliza en la preparación de la célula de mamífero y del mamífero no
humano transgénico inventivos está localizado en el brazo largo
(12q) del 12º cromosoma y tiene un marco abierto de lectura que
codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO: 2 y peso molecular de aproximadamente 50 kDa.
Considerando la degeneración de los codones y
los codones preferidos en un animal específico donde se expresará el
protooncogén de HCCR-1, pueden hacerse varios
cambios y modificaciones de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID
NO: 1, por ejemplo en su región codificante, sin alterar
adversamente la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada, o
en la región no codificante sin afectar adversamente la expresión
del protooncogén HCCR-1. Por lo tanto, la presente
invención también incluye, en su alcance, un polinucleótido que
tiene sustancialmente la misma secuencia de bases que el
protooncogén HCCR-1, y un fragmento de la misma. Tal
y como se utiliza aquí, "sustancialmente el mismo
polinucleótido" se refiere a un polinucleótido cuya secuencia de
bases muestra un 80% o más, preferiblemente un 90% o más, más
preferiblemente un 95% o más de homología con el protooncogén
HCCR-1.
El protooncogén HCCR-1 puede
obtenerse a partir de tejidos de cáncer humano o sintetizarse
utilizando un método convencional de síntesis de ADN. Además, el
protooncogén HCCR-1 obtenido de esta manera puede
insertarse en un vector convencional para la preparación de un
vector de expresión.
El vector de expresión puede, a su vez,
introducirse en una célula de mamífero apropiada para obtener una
célula de mamífero transfectada con el vector de expresión. Por
ejemplo, las células NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), una línea celular de
fibroblastos de ratón diferenciada, y las células 293 (ATCC CRL
1573), una línea celular de riñón embrionario humano, fueron
transfectadas con el vector de expresión
pcDNA3/HCCR-1 que contiene el protooncogén
HCCR-1 para obtener las células NIH/3T3 y 293
transfectadas con el protooncogén HCCR-1, designadas
como células HCCR-1M y HCCR-1H,
respectivamente, las cuales fueron depositadas en la Colección
Coreana para Cultivos Tipo (Korean Collection for Type Cultures,
KCTC) (dirección: #52, Oun-dong,
Yusong-ku, Taejon, 305-333,
República de Corea) el 26 de diciembre de 2000, bajo los números de
acceso KCTC 0923BP y KCTC 0922BP, respectivamente, de acuerdo con
los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del
Procedimiento en Materia de Patentes.
La célula de mamífero inventiva obtenida de esta
manera sobreexpresa el protooncogén HCCR-1 y muestra
características morfológicas de células gigantes tumorales.
Concretamente, la célula de ratón HCCR-1M tiene una
forma poligonal, núcleo lobulado con nucléolos prominentes, un
retículo endoplasmático rugoso (rER) y complejos de Golgi bien
desarrollados, y microvellosidades en la superficie de la célula, y
muestra figuras mitóticas atípicas. La célula humana
HCCR-1H tiene unas dimensiones celulares y una
celularidad mayores que la célula natural.
La célula de mamífero inventiva presenta
tumorigenicidad y por lo tanto un mamífero con injertos de la célula
de mamífero inventiva desarrolla un tumor, por ejemplo, un tumor
palpable. Además, una célula de mamífero aislada del tumor presenta
tumorigenicidad. Por ejemplo, una célula de ratón, designada como
HCCR-1MN, aislada de un tumor palpable de un ratón
"nude" injertado con células HCCR-1M tiene
características morfológicas similares a aquellas de la célula
HCCR-1M.
La célula de mamífero inventiva produce una gran
cantidad de proteína HCCR-1 que interactúa con la
proteína D52 (número de acceso GenBank NM003288), de la que se ha
descrito que está asociada con el carcinoma de mama (Byrne, J.A.,
et al., Cancer Res., 55, 2896-2903 (1995); y
Byrne, J.A., et al., Oncogene, 16, 873-881
(1998)). Ésta también aumenta las actividades de una proteína
quinasa C celular (PKC) y de la telomerasa, induce la pérdida de
algunos controles concretos de las etapas del ciclo celular, y
suprime la expresión de egr-1, por lo que predispone
a las células a la conversión maligna. En este proceso, la expresión
del gen supresor de tumores p53 involucrado en el control del ciclo
celular incrementa mientras que la mayoría de las proteínas p53 se
inactivan llevando, por lo tanto, a conversión maligna. El
protooncogén HCCR-1 induce la inactivación funcional
del supresor de tumores p53 en un nivel aguas arriba (en inglés,
"upstream"). Por lo tanto, si se identifica un fragmento del
protooncogén HCCR-1 que regula el gen p53, puede
recuperarse la actividad p53 mediante el cambio de la secuencia de
nucleótidos correspondiente.
Además, una construcción de ácido nucleico que
comprende el protooncogén HCCR-1 puede introducirse
en un embrión de un mamífero no humano apropiado, por ejemplo, un
ratón, y el embrión de mamífero obtenido de esta manera puede
implantarse en el útero de un receptor apropiado y permitir que se
desarrolle para acabar obteniendo un mamífero transgénico. El método
de preparación de un mamífero transgénico es bien conocido en el
estado de la técnica, y es preferible introducir la construcción de
ácido nucleico en un embrión en el estadio embrionario de 8 células
o anterior.
El mamífero transgénico no humano obtenido de
esta manera sobreexpresa el protooncogén HCCR-1 y
desarrolla un adenocarcinoma intracanalicular papilar de mama que
muestra los siguientes aspectos característicos: nódulo bien
definido sin cápsula; estructuras papilares y estructuras
glandulares o en forma de huso; necrosis extensiva localizada en la
zona central; células cuboides y ovoides con límites poco definidos;
tejidos normales de mama alrededor suyo; y una cantidad
significativa de citoplasma eosinófilo granular.
Se puede obtener un embrión transgénico no
humano cruzando un mamífero transgénico macho y una hembra. Un
ejemplo de embrión transgénico es el embrión de ratón FVB/N
(denominado como embrión de ratón HCCR-1) que es
portador de la construcción de ácido nucleico que tiene la
estructura de la Fig. 21, que se depositó bajo el número de acceso
KCTC 0924BP en la Colección Coreana para Cultivos Tipo (Korean
Collection for Type Cultures, KCTC) (dirección: #52,
Oun-dong, Yusong-ku, Taejon,
305-333, Republica de Corea) el 26 de diciembre de
2000 de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest sobre el
Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los
Fines del Procedimiento en Materia de Patentes.
Puesto que la célula de mamífero y el mamífero
transgénico no humano inventivos, sobreexpresan el protooncogén
HCCR-1 para desarrollar cáncer, son utilizados
ventajosamente en el cribado de agentes cancerígenos o
anticancerígenos, por ejemplo, antioxidantes.
Además, el protooncogén HCCR-1
se sobreexpresa en cánceres de mama, de riñón, de ovario y de
estómago, y por lo tanto, su producto puede ser utilizado con
efectividad en el diagnóstico de los cánceres. El diagnóstico del
cáncer puede realizarse mediante la reacción del ARNm o de una
muestra de proteína tomada de tejido de mama, de riñón, de ovario o
de estómago de un sujeto, con una sonda o un anticuerpo que se una
específicamente al ARNm o a la proteína expresada por el
protooncogén HCCR-1; y detectando el ARNm o la
proteína HCCR-1 según varios métodos conocidos en el
estado de la técnica, y determinando de esta manera si el sujeto ha
sobreexpresado productos del protooncogén HCCR-1.
La presencia del producto del protooncogén puede ser fácilmente
detectable mediante el marcaje de la sonda o del anticuerpo con un
radioisótopo o un enzima. Por lo tanto, la presente invención
también proporciona un kit para el diagnóstico del cáncer de mama,
de riñón, de ovario o de estómago, que comprende una sonda o un
anticuerpo que se une específicamente a un ARNm o a proteína
expresada por el protooncogén HCCR-1. Ejemplos de
sondas incluyen un polinucleótido o un oligonucleótido que tiene una
secuencia de nucleótidos complementaria al ARNm transcrito del
protooncogén HCCR-1 o un fragmento del ARNm que se
une específicamente al ARNm HCCR-1, y
preferiblemente tenga la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3.
La sonda puede obtenerse a partir de tejidos humanos o puede
sintetizarse utilizando un método convencional de síntesis de ADN.
Además, el anticuerpo puede obtenerse según los métodos
convencionales presentes en el estado de la técnica.
Los siguientes Ejemplos se proporcionan a modo
de ilustración adicional de la presente invención sin suponer una
limitación de su alcance.
Ejemplo 1 de
Referencia
Se fijaron células o tejidos con glutaraldehído
al 2,5% en un tampón fosfato (pH 7,4) y a continuación, se fijaron
con un 2% de tetróxido de osmio. Las muestras se deshidrataron en
una serie gradual de etanoles y se fijaron en Epon 812. Se tiñeron
secciones ultrafinas de ellos con acetato de uranilo y citrato de
plomo, y se fotografiaron mediante TEM (JEOL 1.200 EX, Tokio,
Japón).
Ejemplo 2 de
Referencia
Se recogieron y se lisaron las células en un
tampón de muestra Laemmli según el método descrito por Laemmli
(Nature, 227, 680-685 (1970)). Las proteínas
celulares se separaron mediante un SDS-PAGE al 10% y
se transfirieron mediante electricidad a membranas de nitrocelulosa.
Las membranas se incubaron con el anticuerpo. Después del lavado,
las membranas se incubaron con una solución fijadora que contenía
una dilución de 1:1.000 de inmunoglobulina antirata de cabra
conjugada con peroxidasa (Jackson InmunoResearch) como anticuerpo
secundario. Las proteínas se revelaron mediante un kit de detección
por transferencia western ECL (Amersham).
Ejemplo 3 de
Referencia
Los tejidos se incubaron con un anticuerpo
primario y a continuación se cortaron con un grosor de 5 \mum. La
unión del anticuerpo primario se visualizó mediante un anticuerpo
secundario biotinado, avidina, peroxidasa de rábano biotinada y AEC
(aminoetil carbazol) como cromógeno (kits
HISTOSTAIN-BULK, Zymed).
Ejemplo 4 de
Referencia
Se extrajeron ARNs totales de las muestras de
tejido o de células mediante un sistema comercial (RNeasy total RNA
Kit, Qiagen Inc., Alemania), y se eliminaron los contaminantes de
ADN utilizando un kit de limpieza Message (GenHunter Corp.,
EE.UU.).
Ejemplo 5 de
Referencia
Se hizo una electroforesis a través de gel de
agarosa al 1% de formaldehído de 20 \mug de los ARNs totales y se
transfirió a membranas de nylon
(Boehringer-Mannheim, Alemania). La transferencia se
hibridó durante la noche a 42ºC con una sonda marcada aleatoriamente
con ^{32}P, que fue obtenida mediante un sistema de marcaje
aleatorio de cebadores Rediprime II (Amersham, Inglaterra). Los
resultados del análisis por transferencia northern se repitieron de
la misma manera dos veces, tal como se cuantificó mediante
densitometría y la misma transferencia se hibridó con una sonda
\beta-actina para confirmar la integridad del
ARNm.
Ejemplo 1 de
Preparación
E. coli
JM-109/HCCR-1 (KCTC 0667BP) tiene un
vector de expresión pCEV-LAC/HCCR-1
que contiene el ADNc de HCCR-1 de longitud completa
representado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. Se
cultivaron células E. coli
JM-109/HCCR-1 y se aisló el vector
de expresión pCEV-LAC/HCCR-1. El
vector de expresión pCEV-LAC/HCCR-1
obtenido de esta manera se escindió con SalI para obtener un
fragmento de ADN de 2,1 kb que contenía la longitud completa del
ADNc de HCCR-1.
El vector de expresión de mamífero pcDNA3
(Invitrogene) se digirió con Xhol para conseguir un extremo
compatible con SalI. El fragmento SalI de 2,1 kb se ligó al pcDNA3
digerido con Xhol para obtener el vector de expresión
pcDNA3/HCCR-1 que contenía el ADNc
HCCR-1 de longitud completa.
Ejemplo 2 de
Preparación
Se cultivaron células E. coli
JM-109/HCCR-1 (KCTC 0667BP) y se
aisló el vector de expresión
pCEV-LAC/
HCCR-1 con el objetivo de obtener proteínas HCCR-1 útiles para la preparación del anticuerpo anti-HCCR-1. El vector de expresión pCEV-LAC/HCCR-1 se sometió a la reacción en cadena de la polimerasa (en inglés, PCR) utilizando cebadores de SEQ ID NOs: 4 y 5 para amplificar una región del ADN que va desde el nucleótido 123 hasta el 473 de la SEQ ID NO: 1 (los residuos de aminoácido 39 a 155 de la SEQ ID NO: 2). El producto de la PCR obtenido de esta manera se insertó en las dianas de restricción BamHI/SalI del vector pMAL-p2 (New England Biolab, EE.UU.) para obtener un vector recombinante (denominado pMAL-p2/HCR-1-c-terminal), y a continuación, se transformó E. coli BL21 (ATCC CRL 47092) con el vector recombinante pMAL-p2/HCR-1-c-terminal. El transformante se cultivó en medio LB y el cultivo resultante se diluyó 100 veces en volumen con medio LB. El cultivo diluido se incubó durante 3 horas y, a continuación, se le añadió \beta-D-tiogalactopiranósido de isopropilo 1 mM (IPTG, Sigma) para inducir la expresión del protooncogén HCCR-1. Se expresó el fragmento C-terminal de la proteína HCCR-1 fusionada con la proteína de unión de maltosa (en inglés MBP, 42 kDa) que proviene del vector pMAL-p2 que tiene un peso molecular de aproximadamente 64 kDa,. La proteína de fusión de 64 kDa se purificó del cultivo utilizando la proteína de fusión pMAL y un sistema de purificación (New England Biolab., EE.UU.).
HCCR-1 con el objetivo de obtener proteínas HCCR-1 útiles para la preparación del anticuerpo anti-HCCR-1. El vector de expresión pCEV-LAC/HCCR-1 se sometió a la reacción en cadena de la polimerasa (en inglés, PCR) utilizando cebadores de SEQ ID NOs: 4 y 5 para amplificar una región del ADN que va desde el nucleótido 123 hasta el 473 de la SEQ ID NO: 1 (los residuos de aminoácido 39 a 155 de la SEQ ID NO: 2). El producto de la PCR obtenido de esta manera se insertó en las dianas de restricción BamHI/SalI del vector pMAL-p2 (New England Biolab, EE.UU.) para obtener un vector recombinante (denominado pMAL-p2/HCR-1-c-terminal), y a continuación, se transformó E. coli BL21 (ATCC CRL 47092) con el vector recombinante pMAL-p2/HCR-1-c-terminal. El transformante se cultivó en medio LB y el cultivo resultante se diluyó 100 veces en volumen con medio LB. El cultivo diluido se incubó durante 3 horas y, a continuación, se le añadió \beta-D-tiogalactopiranósido de isopropilo 1 mM (IPTG, Sigma) para inducir la expresión del protooncogén HCCR-1. Se expresó el fragmento C-terminal de la proteína HCCR-1 fusionada con la proteína de unión de maltosa (en inglés MBP, 42 kDa) que proviene del vector pMAL-p2 que tiene un peso molecular de aproximadamente 64 kDa,. La proteína de fusión de 64 kDa se purificó del cultivo utilizando la proteína de fusión pMAL y un sistema de purificación (New England Biolab., EE.UU.).
A continuación, se administró
intraperitonealmente 1 mg de la proteína de fusión por semana tres
veces a diez conejos New Zealand blancos de tres meses de edad, cada
uno con un peso aproximado de 2,5 kg. Se tomó la muestra de sangre
de los ratones inmunizados y se centrifugó para obtener un suero que
contuviera anticuerpos policlonales.
Ejemplo
1
Las células NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), una línea
celular de fibroblastos de ratón diferenciada, fueron transfectadas
con el vector de expresión pcDNA3/HCCR-1 obtenido en
el Ejemplo 1 de Preparación utilizando Lipofectamina (Gibco BRL), y
las células NIH/3T3 resultantes se cultivaron en un medio Waymouth
MB 752/1 suplementado con G418 (Gibco) para obtener las células
NIH/3T3 transfectadas con el protooncogén HCCR-1,
designadas como HCCR-1M, que fue depositada en la
Colección Coreana para Cultivos Tipo (Korean Collection for Type
Cultures, KCTC) el 26 de diciembre de 2000 bajo el número de acceso
KCTC 0923BP.
\newpage
Ejemplo
2
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1
excepto que se utilizaron células 293 (ATCC
CRL-1573) en vez de células NIH/3T3 para obtener la
célula 293 transfectada con el protooncogén HCCR-1,
designada como HCCR-1, que fue depositada en la
Colección Coreana para Cultivos Tipo (Korean Collection for Type
Cultures, KCTC) el 26 de diciembre de 2000 bajo el número de acceso
KCTC 0922BP.
Ejemplo
Comparativo
El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió
excepto que se utilizó el vector pcDNA3 (Invitrogen) en vez del
vector pcDNA3/HCCR-1 para obtener células
comparativas transfectadas con el vector pcDNA3.
Ejemplo
3
Paso
1
Las células HCCR-1M obtenidas en
el Ejemplo 1 se cultivaron en monocapa en un medio Waymouth MB 752/1
y las células HCCR-1M resultantes se examinaron
mediante un microscopio de contraste de fase. Se utilizaron células
NIH/3T3 naturales parentales como control.
Las Figs. 1A y 1B son las respectivas figuras de
contraste de fase de HCCR-1M cultivadas en monocapa
y de células NIH/3T3 naturales parentales. Como se puede apreciar de
las Figs. 1A y 1B, las células NIH/3T3 naturales son unas células en
forma de huso con un núcleo largo y delgado y una escasa cantidad de
citoplasma, mientras que las células HCCR-1M tienen
una forma poligonal con un núcleo oval y un citoplasma ancho.
Paso
2
Las células HCCR-1M obtenidas en
el Ejemplo 1 se cultivaron en monocapa en un medio Waymouth MB 752/1
y las células HCCR-1M resultantes se tiñeron con
hematoxilina-eosina.
La Fig. 2 es el resultado de la tinción con
hematoxilina-eosina de células
HCCR-1 cultivadas en monocapa. Como puede apreciarse
en la Fig. 2, las células HCCR-1M muestran
polimorfismo nuclear, nucleolos diferenciados, patrones de cromatina
granulada, células gigantes tumorales y figuras mitóticas
atípicas.
Paso
3
Las células HCCR-1M obtenidas en
el Ejemplo 1 se sometieron a TEM según el procedimiento del Ejemplo
1 de Referencia.
La Fig. 3 es la fotografía TEM de la célula
HCCR-1M, donde la escala representa la longitud de 3
\mum y el marco es una ampliación del área indicada por el círculo
(escala, 1 \mum). Como puede apreciarse en la Fig. 3, las células
HCCR-1M tienen microvellosidades en la superficie de
la célula, un núcleo lobulado con nucléolos prominentes, retículo
endoplasmático (rER) y complejos de Golgi bien desarrollados
(círculo).
Dichos resultados muestran que la célula
HCCR-1M tiene características morfológicas de célula
gigante tumoral.
Ejemplo
4
Se inyectaron subcutáneamente 5 x 10^{6}
células HCCR-1M obtenidas en el Ejemplo 1 en la zona
lateral posterior del tronco de 9 ratones (5 semanas de edad,
atímicos nu/nu de antecedentes BALB/c).
Todos los 9 ratones "nude" a los que se les
inyectaron células HCCR-1M mostraron tumores
palpables después de 21 días. La Fig. 4 es una fotografía de los
ratones "nude" portadores de aloinjertos de células
HCCR-1M. Esto sugiere que las células
HCCR-1M presentan tumorigenicidad.
Cuando los tumores subcutáneos llegaron a los
1,5-2,5 cm de diámetro, se sacrificaron los ratones
"nude" y se les extirparon los tumores para utilizarlos en el
siguiente análisis del tumor y en el establecimiento de una línea
celular.
Ejemplo
5
Las características de los nódulos tumorales de
los ratones "nude" inducidos por aloinjertos de
HCCR-1M se examinaron como se describe a
continuación.
Paso
1
Los nódulos tumorales obtenidos en el Ejemplo 4
se tiñeron con hematoxilina-eosina.
La Fig. 5 es el resultado de la tinción con
hematoxilina-eosina (x250) de los nódulos tumorales.
Como puede apreciarse en la Fig. 5, los nódulos tumorales tienen
nidos de células epiteliales típicos separados por estroma
fibroso.
Paso
2
Los nódulos tumorales obtenidos en el Ejemplo 4
se sometieron a TEM según el procedimiento del Ejemplo 2 de
Referencia.
La Fig. 6 es la fotografía tomada mediante TEM
de los nódulos tumorales donde la escala representa una longitud de
3 \mum y el marco es una ampliación del área indicada por el
círculo (escala, 0,5 \mum). Como puede apreciarse de la Fig. 6,
las células de los nódulos tumorales tienen orgánulos bien
desarrollados y están fuertemente enlazadas mediante desmosomas.
Esto sugiere que las células HCCR-1M se convirtieron
en células epidérmicas.
Paso
3
Los nódulos tumorales obtenidos en el Ejemplo 4
se sometieron a inmunohistoquímica según el procedimiento del
Ejemplo 3 de Referencia utilizando cada uno de los anticuerpos anti
fibra de reticulina, antiqueratina, antiEMA (antígeno de la membrana
epitelial) y antivimentina (DAKO) como anticuerpo primario.
Las Figs. 7A a 7D son los resultados de los
análisis inmunohistoquímicos (x250) que muestran la expresión de
fibras de reticulina, de queratina, de EMA y de vimentina,
respectivamente, en los nódulos tumorales. Como puede apreciarse de
las Figs. 7A a 7D, los nidos de células estaban envueltos por fibras
de reticulina (Fig. 7A) y las células mostraban la coexpresión de
marcadores epiteliales, tales como la queratina (Fig. 7B) y EMA
(Fig. 7C) y del marcador mesenquimal vimentina (Fig. 7D). Estos
resultados sugieren que el protooncogén HCCR-1
provocó la conversión de las células NIH/3T3 mesenquimales a células
epiteliales.
Particularmente, la célula NIH/3T3 mesenquimal
introducida con un oncogén se transforma en sarcoma, mientras el
ratón "nude" portador de aloinjertos de célula
HCCR-1M desarrolla un tumor palpable.
Ejemplo
6
Las células fueron aisladas de los nódulos
tumorales obtenidos en el Ejemplo 4 y a continuación se cultivaron
en medio Waymouth MB 752/1 suplementado con suero fetal bovino al
20%, las cuales se designaron como célula
HCCR-1MN.
Ejemplo
7
Las células HCCR-1MN obtenidas
en el Ejemplo 6 se sometieron a microscopia de contraste de fase
repitiendo el procedimiento del Paso 1 del Ejemplo 3.
La Fig. 8 es la figura de contraste de fase
(x300) de células HCCR-1MN cultivadas en monocapa.
Como puede apreciarse de la Fig. 8, las células
HCCR-1MN tienen unas características morfológicas
similares a las de las células HCCR-1M representadas
en el Paso 1 del Ejemplo 3.
Ejemplo
8
Las células HCCR-1M y
HCCR-1MN, obtenidas en los Ejemplos 1 y 6
respectivamente, fueron sometidas a un análisis por transferencia
western según el procedimiento del Ejemplo 2 de Referencia
utilizando el suero antiHCCR-1 obtenido en el
Ejemplo 2 de Preparación, para examinar la expresión del
protooncogén HCCR-1 en células
HCCR-1M y HCCR-1MN. Para la
comparación, en el análisis por transferencia western se utilizaron
las células NIH/3T3 naturales parentales y las células NIH/3T3
comparativas obtenidas en el Ejemplo Comparativo.
La Fig. 9 es el resultado del análisis por
transferencia western que muestra la expresión del protooncogén
HCCR-1M en células HCCR-1M y
HCCR-1MN. Como puede apreciarse de la Fig. 9, la
proteína HCCR-1 está sobreexpresada en las células
HCCR-1M y HCCR-1MN, pero no en las
células NIH/3T3 naturales parentales ni en las células comparativas
NIH/3T3 transfectadas con el vector pcDNA3, tal como indica la banda
débil.
Ejemplo
9
Las células HCCR-1H se
sometieron a microscopia de contraste de fase según el procedimiento
del Paso 1 del Ejemplo 3, para examinar las características
morfológicas de la célula HCCR-1H. Las células 293
naturales parentales fueron utilizadas como control.
Las Figs. 10A y 10B son las respectivas figuras
de contraste de fase (300x) de las células HCCR-1H
cultivadas en monocapa y de las células 293 naturales parentales;
Como puede apreciarse de las Figs. 10A y 10B, la célula
HCCR-1H ha incrementado sus dimensiones celulares y
su celularidad en comparación con la célula 293 natural.
Ejemplo
10
El procedimiento del Ejemplo 4 se repitió
utilizando las células HCCR-1H obtenidas en el
Ejemplo 2 para examinar la tumorigenicidad de las células
HCCR-1H.
Los ratones "nude" portadores de
xenoinjertos de células HCCR-1H mostraron tumores
palpables después de 21 días. Esto sugiere que las células
HCCR-1H presentan tumorigenicidad.
Cuando los tumores subcutáneos llegaron a
1-1,5 cm de diámetro, se sacrificaron los ratones
"nude" y se les extirparon los tumores para utilizarlos en el
siguiente análisis del tumor.
Ejemplo
11
Las características de los nódulos tumorales
inducidos por los aloinjertos de HCCR-1H, de los
ratones "nude" se examinaron como se describe a
continuación.
Paso
1
Los nódulos tumorales obtenidos en el Ejemplo 10
se tiñeron con hematoxilina-eosina.
La Fig. 11 es el resultado (x250) de la tinción
con hematoxilina-eosina de los nódulos tumorales
palpables. Como puede apreciarse de la Fig. 11, el nódulo tumoral
tiene características de los carcinomas celulares epiteliales
típicos, es decir, forma celular atípica, pleomorfismo,
agrandamiento nucleolar, y un aumento en la relación entre el
volumen del núcleo y el del citoplasma.
Paso
2
Los nódulos tumorales obtenidos en el Ejemplo 10
fueron sometidos a inmunohistoquímica según el procedimiento
descrito en el Ejemplo 3 de Referencia utilizando cada uno de los
anticuerpos anticitoqueratina-8,
anticitoqueratina-19 y antivimentina (DAKO) como
anticuerpo primario.
Las Figs. 12A a 12B son los resultados de los
análisis inmunohistoquímicos (x250) que muestran respectivamente la
expresión de citoqueratina-8,
citoqueratina-19 y vimentina, en los nódulos
tumorales palpables. Como puede apreciarse de las Figs. 12A a 12C,
las células tumorales mostraron coexpresión de marcadores
epiteliales, tales como la citoqueratina-8 y -19
(Fig. 12A y 12B) y del marcador mesenquimal vimentina (Fig. 12C).
Estos resultados sugieren que el protooncogén provocó la conversión
de las células 293 mesenquimales a células epiteliales.
Ejemplo
12
Para examinar el nivel de expresión del
protooncogén HCCR-1 en las células
HCCR-1H, se aislaron los ARNs totales de las células
HCCR-1H obtenidas en el Ejemplo 2 según el
procedimiento del Ejemplo 4 de Referencia y se sometieron a
transferencia northern según el procedimiento del Ejemplo 5 de
Referencia utilizando sonda de ADNc HCCR-1 obtenida
aleatoriamente y marcada con ^{32}P.
La Fig. 13 es el resultado del análisis por
transferencia northern que muestra la expresión del protooncogén
HCCR-1 en las células HCCR-1H y en
las células 293 naturales parentales. Como se puede apreciar de la
Fig. 13, en las células HCCR-1H se sobreexpresó
aproximadamente 2,1 kb de transcrito único de ARNm, pero no en las
células 293 naturales parentales.
Ejemplo
13
Para examinar el mecanismo de tumorigénesis
inducido por el protooncogén HCCR-1 en las células
de ratón, se valoraron como se describe a continuación, las
anormalidades en las actividades de la proteína quinasa C (PKC) y de
la telomerasa, la pérdida de puntos de control del ciclo celular, la
alteración de la expresión de egr-1, de
c-fos y de GADPH, de los cuales se ha descrito que
son relevantes en el proceso de la tumorigénesis.
Paso
1
Generalmente, los tumores desarrollan
secundariamente anormalidades en el proceso de transducción de señal
mediada por la PKC. Para asegurar que la HCCR-1
modula la actividad proteína quinasa C (PKC), se llevó a cabo un
ensayo de PKC utilizando células NIH/3T3 naturales parentales,
células NIH/3T3 comparativas transfectadas con el vector pcDNA3
obtenidas en el Ejemplo Comparativo y células
HCCR-1M obtenidas en el Ejemplo 1.
La actividad de la PKC se midió utilizando el
sistema de ensayo SigmaTECT™ Protein Kinase C Assay System (Promega)
según la instrucciones del fabricante. La actividad PKC se definió
como la diferencia de las cantidades de PKC incorporadas en el
sustrato por minuto en ausencia y en presencia de fosfolípidos. Cada
valor es la media \pm desviación estándar (d.e.) de tres
experimentos independientes.
La Fig. 14 es el gráfico que muestra las
actividades PKC de la célula NIH/3T3 natural parental, la célula
NIH/3T3 comparativa transfectada con el vector pcDNA 3 y la célula
HCCR-1M. Como puede apreciarse de la Fig. 14, la
actividad PKC de las células HCCR-1M es
aproximadamente 10 veces mayor que la de las células naturales. Esto
sugiere que el protooncogén aumenta la actividad PKC celular.
Paso
2
Basándose en lo descrito que la PKC induce un
incremento marcado en la actividad telomerasa, se llevó a cabo un
ensayo de la actividad telomerasa utilizando células NIH/3T3
naturales, células NIH/3T3 comparativas transfectadas con el vector
pcDNA3 obtenidas en el Ejemplo Comparativo y células
HCCR-1 obtenidas en el Ejemplo 1.
La actividad telomerasa se midió utilizando el
kit PCR-ELISA para telomerasa (Boehringer Mannheim,
EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las células humanas
inmortalizadas de riñón humano positivas para la telomerasa
incluidas en el kit fueron utilizadas como control positivo. Como
control negativo se utilizaron células 293 tratadas previamente con
RNasa. Los ensayos se llevaron a cabo con una cantidad de extracto
equivalente a 1 x 10^{3} células. Los resultados muestran la media
promedio de los valores de la densidad óptica (OD) de cuatro
separados independientes (media \pm d.e.).
La Fig. 15 es el gráfico que muestra las
actividades telomerasa de las células de control positivo, las
células de control negativo, las células NIH/3T3 naturales
parentales, las células NIH/3T3 comparativas transfectadas con el
vector pcDNA3 y las células HCCR-1M. Como puede
apreciarse de la Fig. 15, las células NIH/3T3 naturales mostraron
una actividad telomerasa detectable, mientras que las células
HCCR-1 tienen la actividad telomerasa incrementada
en un factor de aproximadamente 7 en comparación con las células
naturales parentales. La actividad telomerasa de las células de
control positivo es alta, mientras que la de las células de control
negativo no es detectable. Estos resultados concuerdan con el
estudio previo (Holt, S. E., Wright, W. E. and Shay J. W. Mol.
Cell Biol. 16, 2932-2939 (1996)), lo que sugiere
que la célula HCCR-1 tiene una actividad de la
telomerasa alta inducida por la PKC activada.
Paso
3
Las células tumorales normalmente han sufrido
daños en los genes que regulan directamente sus ciclos celulares.
Con el fin de examinar si existió una alteración en las propiedades
de crecimiento de las células HCCR-1M, se
determinaron los perfiles del ciclo celular como se describe a
continuación.
Se cultivaron células HCCR-1M y
células NIH/3T3 naturales parentales en la fase
mid-log y se frenó el crecimiento mediante 36 horas
de incubación en un medio DMEM con un 0,5% de suero fetal bovino.
Las células fueron tratadas con tripsina, se recogieron y se fijaron
en etanol al 70%. A 2 x 10^{6} células se les añadieron 50
\mug/ml de una solución de tinción de ioduro de propidio (Sigma) y
100 unidades por ml de RNasa A (Boerhinger Mannheim). Después de 30
min. de incubación, el contenido de ADN celular se determinó
mediante un análisis de fluorescencia a 488 nm utilizando un FACS
Caliber (Becton Dickinson). Se analizó un mínimo de 1 x 10^{4}
células por muestra con el programa informático Modfit 5.2.
Se determinó el porcentaje de células NIH/3T3
naturales parentales y de células HCCR-1 en las
fases G_{0}/G_{1}, S y G_{2}/M, y los resultados se muestran
en la Tabla 1.
Como puede apreciarse de la Tabla 1, los
porcentajes de células NIH/3T3 naturales y de células
HCCR-1 en la fase S fueron 20,6% y 31,5%,
respectivamente. Estos resultados sugieren que hubo un
desplazamiento significativo de la población de células
HCCR-1M de la fase G_{0}/G_{1} a la fase S.
Para evaluar la progresión del ciclo celular
dependiente de suero, se cultivaron células HCCR-1M
y células NIH/3T3 naturales parentales en un medio DMEM con un 0,5%
de suero fetal bovino durante 36 horas para detener el crecimiento.
Las células se transfirieron a un medio DMEM con un 20% de suero
fetal bovino y se recogieron a tiempos indicados para determinar el
porcentaje de células en las fases G_{0}/G_{1}, S y G_{2}/M.
Los resultados se muestran en la Tabla II.
\vskip1.000000\baselineskip
Como puede apreciarse de la Tabla II, el
porcentaje de células NIH/3T3 naturales parentales en la fase S en
la hora 0 fue del 8%, mientras que el porcentaje de células
HCCR-1M en la fase S fue del 21,8%. Estos resultados
sugieren que la sobreexpresión constituva del protooncogén
HCCR-1 permitía una relativa resistencia a la
detención de G_{0}/G_{1} inducida por la privación de suero.
Después de transferir las células a un medio DMEM que contiene un
20% de suero para liberar a las células de la detención del
crecimiento, en las poblaciones de las células
HCCR-1M en la fase S hubieron incrementos por encima
del 10% en comparación con las células NIH/3T3 naturales. De esta
manera, la sobreexpresión del protooncogén HCCR-1
podrían desregular el crecimiento celular acortando la fase
G_{0}/G_{1} e incrementando la población de células en fase
S.
Paso
4
En base al hecho de que los patrones de
expresión de egr-1, c-fos y GAPDH
están involucrados en la formación tumoral, se examinaron, como se
describe a continuación, los patrones de expresión de
egr-1, de c-fos y de GAPDH en
células HCCR-1M obtenidas en el Ejemplo 1.
Se detuvo el crecimiento de células
HCCR-1M y células NIH/3T3 naturales parentales en
fase mid-log mediante incubación en un medio DMEM
con un 0,5% de suero fetal bovino durante 36 horas (periodo de
quiescencia). Las células se transfirieron a un medio DMEM fresco
con un 20% de suero fetal bovino y se cultivaron durante 0, 15, 30,
60 y 120 min. para estimular el crecimiento (etapa mitótica). Se
aislaron los ARNs totales de las células quiescentes y mitóticas
según el procedimiento del Ejemplo 4 de Referencia y se sometieron a
transferencia northern según el procedimiento del Ejemplo 5 de
Referencia utilizando sonda de ADNc de egr-1,
c-fos y GAPDH obtenida aleatoriamente y marcada con
^{32}P.
Las Figs. 16A, 16B y 16 C son los resultados de
las transferencias northern que muestran la expresión de
egr-1, de c-fos y de GAPDH
respectivamente en las células HCCR-1H y en las
células NIH/3T3 naturales parentales. Como puede apreciarse de las
Figs. 16A a 16C, las células HCCR-1M mitóticas
muestran una marcada regulación negativa de la expresión de
egr-1, una regulación positiva de GAPDH y no
muestran diferencia significativa en la expresión de
c-fos comparado con las células naturales.
Estos resultados sugieren que la desregulación
del gen HCCR-1 en las células NIH/3T3 de ratón puede
provocar la activación de la PKC o de la telomerasa, la pérdida de
los puntos de control del ciclo celular, y la regulación negativa de
la expresión de egr-1 y por lo tanto predispone a
las células a la conversión maligna.
Ejemplo
14
Para examinar el mecanismo de tumorigénesis
inducido por el protooncogén HCCR-1 en una célula
humana, se valoraron como se describe a continuación los patrones de
expresión de los genes supresor de tumores p53, MDM2, Bax, p21WAF1,
p16INK4A y p14^{ARF}, que han sido descritos como relevantes para
el tumor.
Paso
1
Para examinar el patrón de expresión de p53 en
células HCCR-1H, se llevaron a cabo análisis por
transferencia western y northern tal como se describe a
continuación.
Se lisaron las células HCCR-1H
obtenidas en el Ejemplo 2 y las células 293 naturales parentales, y
sus lisados se sometieron a transferencia western utilizando
anticuerpo anti-p53 monoclonal DO-7
(aminoácidos 37 a 45; Novocastra Laboratories, Ltd., UK) que
únicamente reacciona con el p53 natural; o Ab-5
(clon DO-7) (aminoácidos 37 a 45; NEOMARKERS, INC.,
CA) que reacciona con p53 natural y mutante, según el procedimiento
del Ejemplo 2 de Referencia. La misma transferencia se hizo
reaccionar con anticuerpo \beta-actina de ratón
anti-humano (Sigma), para confirmar el contenido
total de proteína.
La Fig. 17A es la transferencia western que
muestra la expresión del supresor de tumores p53 en células
HCCR-1H y células 293 naturales parentales; y la
Fig. 17B es la transferencia western mostrando la
\beta-actina de la misma transferencia: Como puede
apreciarse de la Fig. 17A, los niveles de proteína p53 estaban
claramente elevados en las células HCCR-1H, en
comparación con las células 293 naturales parentales.
Además, las células HCCR-1H
obtenidas en el Ejemplo 2 se cultivaron en un medio libre de
metionina RPMI 1640 con un 2% de suero fetal bovino y 2 mM de
glutamina (Sigma) durante 2 horas y a continuación se marcaron con
100 \mul de metionina L^{35}S (Amersham). Las células se lavaron
con tampón 1X Hanks (Gibco, EE.UU.), y a continuación se cultivaron
más en un medio RPMI 1640 normal con L-metionina
durante 0,5, 1, 2 o 4 horas. Las células se disolvieron en una
solución de inmunoprecipitación (50 mM Tris [pH 8,0], 5 mM de EDTA,
150 mM de NaCl, 1% NP-40, 1mM de fluoruro de
fenilmetilsulfonilo, 10 mM de benzamidina, 1\mug de pepsatina por
ml, 10 mM de bisulfito de sodio), se lavaron con 50 \mul de
solución de proteína A-sefarosa y a continuación se
cuantificaron. El lisado celular se sometió a inmunoprecipitación
(Kessler, S.W., J. Immunol., 115, 1617-1623
(1975)) utilizando anticuerpo anti-p53 seguido de
SDS-PAGE. El procedimiento anterior se repitió
utilizando células de hepatoma Hep 3B (ATCC HB-8064)
como control sin gen p53.
\newpage
La Fig. 18 es el resultado de la
inmunoprecipitación que muestra la expresión del supresor de tumores
p53 en células HCCR-1H y células 293 naturales
parentales. Como puede apreciarse de la Fig. 18, los niveles de
proteína p53 están claramente elevados en las células
HCCR-1H en comparación con las células 293 naturales
parentales. Por lo tanto, se cree que en el mecanismo de la
tumorigénesis inducido por el protooncogén HCCR-1,
la proteína p53 tiene un alto nivel de expresión pero permanece en
una forma inactiva que no suprime el tumor.
Paso
2
Puesto que el gen p53 es una parte de un bucle
regulatorio que también incluye a MDM2, Bax y p14^{ARF},
influenciando directamente los genes supresores de tumores p21WAF1 y
p16INK4A, se evaluaron los patrones de expresión de MDM2, Bax,
p14^{ARF}, p21WAF1 y p16INK4A.
Se llevó a cabo una transferencia western según
el procedimiento del Ejemplo 2 de Referencia utilizando las células
HCCR-1H obtenidas en el Ejemplo 2; y los anticuerpos
anti-MDM2, anti-Bax,
anti-p21WAF1 y anti p16INK4A (Oncogene Research
Products, EE.UU.), y p14^{ARF}(Lab Vision, EE.UU.). La
misma transferencia se hizo reaccionar con anticuerpo
anti-\beta-actina para confirmar
el contenido total de proteína.
Las Figs. 19A, 19C, 19E, 19G y 19I son los
resultados de los análisis por transferencia western que muestran
respectivamente la expresión de MDM2, Bax, p21WAF1, p16INK4A y
p14^{ARF} en las células HCCR-1H; y las Figs. 19B,
19D, 19F, 19H y 19J son la \beta-actina en cada
una de las transferencias anteriores. Como puede apreciarse de las
Figs. 19A, 19C, 19E y 19G, los niveles de la proteína MDM2, Bax,
p21WAF1, p16INK4A y p14^{ARF} son inferiores en comparación con
las células 293 naturales parentales. Estos resultados sugieren que
la sobrexpresión de HCCR-1 puede inhibir
específicamente la transcripción de MDM2, Bax, p21WAF1 y p16INK4A, y
por lo tanto reducir sus niveles de proteína.
Resumiendo estos resultados en conjunto con los
del Paso 1, se cree que la sobreexpresión del gen
HCCR-1 incrementa la estabilidad de p53, pero que la
proteína p53 no forma un bucle autoregulatorio que regule la
expresión del MDM2, bax y p21WAF1 de manera positiva. En particular,
como puede apreciarse de las Figs. 19E a 19G, la familia de
proteínas inhibidoras de quinasa p21WAF1 y p16INK4A estaba regulada
negativamente en las células HCCR-1H mediante un
mecanismo independiente de p53. Como puede apreciarse de la Fig.
19I, p14^{ARF} no parecía estar expresada de manera aberrante ni
en las células 293 naturales parentales ni en las células
HCCR-1H. Estos resultados sugieren que la alteración
del bucle MDM2-p14^{ARF} no es un mecanismo del
mismo tipo que la inactivación de p53.
Los resultados anteriores en conjunto con los
del Paso 3 del Ejemplo 13 indican que la sobreexpresión del
protooncogén HCCR-1, tanto en células de ratón como
de humano, puede afectar al control del ciclo celular y tiene una
correlación con los reguladores del ciclo celular p53 y p21.
Paso
3
Para determinar una pareja de
HCCR-1 en la interacción
proteína-proteína, se realizó un cribado de doble
híbrido en levadura tal como se describe a continuación.
Se cultivaron células E. coli
JM-109/HCCR-1 (KCTC 0667BP) de donde
se aisló el vector de expresión
pCEV-LAC/HCCR-1. El vector de
expresión pCEV-LAC/HCCR-1 se
escindió con SalI y el protooncogén HCCR-1 obtenido
de esa manera se insertó en los sitios BamHI/SalI de un vector doble
híbrido en levadura (en inglés, "yeast two-hybrid
vector") (Clontech, EE.UU.) que contiene el dominio de unión a
ADN pLexA para obtener el vector
pLexA-HCCR-1 que expresa una
proteína de fusión del dominio de unión a ADN pLexA con la proteína
HCCR-1. El vector
pLexA-HCCR-1 se mezcló con levadura
EGY48 (Clontech, EE.UU.) y se calentó a 42ºC durante 10 min. para
transformar la levadura. La levadura resultante se transformó con
una librería de ADNc de cerebro fetal humano fusionada por el mismo
método con pB42AD que contiene el dominio activante de pLexA
(Clontech, EE.UU.). Se realizaron ensayos "filter lift" de
\beta-galactosidasa mediante la replicación en
placas del transformante a placas de selección Trp^{-}, Leu^{-},
His^{-}. Cuando un transformante tiene un gen pareja derivado de
una librería de ADNc, la proteína pareja fusionada con el dominio de
unión activante de pLexA se une con la proteína
HCCR-1 fusionada con el dominio de unión a ADN de
pLexA para formar una colonia azul en un medio de placa que contiene
X-gal. Para eliminar falsos positivos, se llevó a
cabo un ensayo de "Yeast Mating Assay" (Guarente, L., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90, 1639-1641
(1993)).
De los clones obtenidos de esta manera se cribó
un gen que codificara una pareja de interacción
proteína-proteína de HCCR-1.
La colonia obtenida de esta manera se cultivó en
un medio de glucosa y se extrajo el vector que contenía el gen
pareja utilizando partículas de vidrio. El vector se introdujo en
E. coli KC8 (Clontech, EE.UU.) mediante electroporación y las
células resultantes E. coli KC8 se colocaron en una placa con
medio mínimo M9 para seleccionar un transformante. El ADN plasmídico
se extrajo del transformante y se transformaron E. coli
DH5\alpha con el ADN plasmídico y se cultivó en medio LB para
amplificar el ADN plasmídico. El ADN plasmídico se extrajo del
cultivo y se escindió con HindIII para obtener un fragmento de 1 kb
que contenía el gen pareja. Se determinó la secuencia de nucleótidos
del gen pareja para identificar el gen TPD52L2 (Número de Acceso
GenBank NM003288). La proteína D52 codificada por el gen TPD52L2 se
identificó en un principio a través de su alto nivel de expresión en
carcinoma de mama humano, y está relacionado con la transducción de
señales mediadas por calcio y con la proliferación celular (Byrne,
J.A., et al., Cancer Res., 55, 2896-2903
(1995); y Byrne, J.A., et al., Oncogene, 16,
873-881 (1998)).
Paso
4
Se llevó a cabo la cotransfección como se
describe a continuación para examinar la interacción entre las
proteínas HCCR-1 y D52.
Se cultivaron las células E. coli
JM-109/HCCR-1 (KCTC 0667BP) de donde
se aisló el vector de expresión
pCEV-LAC/HCCR-1. El vector de
expresión pCEV-LAC/HCCR-1 se
escindió con SalI y el ADNc de HCCR-1 de longitud
completa obtenido de esta manera se insertó en el sitio SalI del
vector de expresión N-terminal
pFALG-CMV (Sigma, EE.UU.) para obtener el vector de
expresión pFLAG-HCCR-1 que expresa
una proteína de fusión de FLAG con HCCR-1. El gen
TPD52L2 obtenido en el Paso 3 se insertó en el sitio NotI del vector
de expresión pcDNA3 (Invitrogen, EE.UU.) para obtener el vector de
expresión pGST-TPD52L2 que expresa una proteína de
fusión de GST con D52.
Se cotransfectaron células CHO con los vectores
de expresión pFLAG-HCCR-1 y
pGST-TPD52L2 y a continuación se cultivaron en medio
RPMI 1640. Después de 48 horas, las células CHO se trataron con
tripsina y se recogieron. Las células CHO se lavaron con PBS y a
continuación se resuspendieron en tampón IP (10 mM de
Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM de NaCl, 1% de NP40, 2 mM
de vanadato de sodio, 10 mM de fluoruro de sodio, 10 mM de
pirofosfato de sodio, 5 mM de EDTA, 10 \mug/ml de aprotinina, 10
\mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de pepsatina, 1 mM de fluoruro
de fenilmetilsulfonilo). La suspensión celular se pasó por una aguja
de calibre 27 y el lisado celular resultante se agitó para separar
las células no lisadas en forma de pellet celular. El sobrenadante
se preaclaró mezclándolo con partículas de IgG preinmune y proteína
A (Sigma, EE.UU.). Se inmunoprecipitaron las proteínas de fusión
FLAG-HCCR-1 o
GST-TPD52L2 del lisado celular utilizado anticuerpos
anti-FLAG o anti-GST (Sigma, EE.UU.)
(Kesler, S.W., J. Immunol., 115, 1617-1623
(1975)). Las muestras de proteína residual se sometieron a
transferencia western utilizando anticuerpos
anti-GST o anti-FLAG según el
procedimiento descrito en el Ejemplo 2 de Referencia.
Las Figs. 20A y 20B son los resultados de los
análisis por transferencia western que muestran la expresión de la
proteína GST y de la proteína PLAG, respectivamente. Como puede
apreciarse de las Figs. 20A y 20B, se detectó la proteína de fusión
en ambos precipitados. Estos resultados sugieren que la proteína D52
interacciona con la proteína HCCR-1.
Ejemplo
15
Con el fin de asegurar que el protooncogén
HCCR-1 induce la tumorigénesis in vivo, se
preparó un ratón transgénico que expresa el protooncogén
HCCR-1 bajo el promotor CMV.
Para obtener el ADNc de HCCR-1
útil en la preparación de un ratón transgénico, se cultivaron
células E. coli JM-109/HCCR-1
(KCTC 0667BP) de donde se aisló el vector de expresión
pCEV-LAC/HCCR-1. El vector de
expresión pCEVLAC/HCCR-1 se escindió con SalI y el
ADNc de HCCR-1 de longitud completa obtenido de esta
manera se insertó en el sitio Xhol del vector de expresión pcDNA3
para obtener el vector de expresión
pcDNA3-HCCR-1. El vector de
expresión pcDNA3-HCCR-1 se escindió
con SalI y XmnI, se sometió a electroforesis en gel de agarosa al
0,7%, y se aisló por elución eléctrica. El fragmento de ADN aislado
se sometió a diálisis contra una solución 10 mM de
Tris-HCl (pH 7,4)/0,2 mM de EDTA y se ajustó a una
concentración final de 4 ng/ml. La estructura del ADN resultante
contiene el promotor CMV, el gen del ADNc de HCCR-1
y la secuencia poliA de la hormona de crecimiento bovina (bGH) como
muestra la Fig. 21.
El ADN se microinyectó en un zigoto de ratón de
la cepa FVB/N (Samyuk Corp., CAMTAKO, Corea) según el método de
microinyección de ADN pronuclear (Gordon, J.W., et al., Pro.
Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77, 7382-7384 (1980)):
La solución de ADN se microinyectó en el pronúcleo del zigoto en la
etapa de 1 célula y el zigoto resultante se incubó durante 20 horas
para seleccionar el embrión en la etapa de 2 células. El embrión en
la etapa de 2 células se implantó en el oviducto de un ratón ICR
receptor pseudoembarazado (Samyuk Corp., CAMTAKO, Corea). Se obtuvo
progenie de ratones a partir del ratón receptor, y se sometieron
muestras de ADN obtenidas de biopsias de la cola de los ratones de
la progenie a análisis de transferencia southern.
La Fig. 22 es el ratón transgénico que proviene
del embrión al que se le ha introducido el protooncogén
HCCR-1. Como puede apreciarse de la Fig. 22, la masa
tumoral mide aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm y se aprecia en el área
axilar derecha adyacente a la mama.
El tumor se aisló y se examinó a simple
vista.
La Fig. 23 es una fotografía del tumor de mama
del ratón transgénico. Como puede apreciarse de la Fig. 23, el tumor
del ratón transgénico es un único nódulo bien definido y sin
cápsula.
Para el examen de las características
morfológicas del tumor, éste se tiñó con
hematoxilina-eosina. La Fig. 24 es el resultado de
la tinción con hematoxilina-eosina del tumor. Como
puede apreciarse de la Fig. 24 el tumor consiste en estructuras
papilares y glandulares o estructuras en forma de huso. Se aprecia
una necrosis extensiva en la parte central. Se observa tejido
mamario normal adyacente al tumor. Las células ovoides o cuboides
presentan unos límites indefinidos y una cantidad moderada de
citoplasma eosinófilo granular. Las células tumorales tienen un
núcleo grande, pleomórfico e hipercromático y muchas mitosis,
incluyendo algunas formas atípicas. Se aprecian nucléolos pequeños
aunque bien definidos. Estos resultados sugieren que el tumor del
ratón transgénico muestra características del adenocarcinoma papilar
intracanalicular de mama.
La Fig. 25 es la fotografía de microscopio
electrónico de transmisión del tumor, donde la escala representa una
longitud de 2 \mum. Como puede apreciarse de la Fig. 25, las
células tumorales ovoides tienen abundantes orgánulos
citoplasmáticos. Los núcleos presentan grumos y marginación de la
cromatina y nucléolos bien definidos. El citoplasma está lleno de
algunas mitocondrias y muchos rER vesiculados. Se aprecian algunos
desmosomas.
El embrión del ratón transgénico se denominó
HCCR-1, que se depositó el 26 de diciembre de 2000
en la Colección Coreana para Cultivos Tipo bajo en número de acceso
KCTC 0924BP.
Ejemplo
16
Para examinar la expresión del protooncogén
HCCR-1 en tejidos tumorales de mama, de riñón, de
ovario, y de estómago, se aisló el ARN total de los tejidos
tumorales de mama, de riñón, de ovario, y de estómago según el
procedimiento del Ejemplo 4 de Referencia y se sometió a un análisis
por transferencia northern según el procedimiento del Ejemplo 5 de
Referencia utilizando sonda de ADNc HCCR-1 obtenida
aleatoriamente y marcada con ^{32}P. Para la comparación, los
procedimientos de arriba se repitieron utilizando tejidos normales
de mama, riñón, ovario, y estómago.
La Fig. 26A es el resultado del análisis por
transferencia northern que muestra la expresión del
protooncogen
HCCR-1 en tejidos tumorales de mama, de riñón, de ovario y de estómago; y la Fig. 26B muestra la misma transferencia hibridada con una sonda de \beta-actina. Como puede apreciarse de las Figs. 26A y 26B, los tejidos tumorales de mama, de riñón, de ovario y de estómago mostraron una expresión incrementada del protooncogén HCCR-1 en comparación con los tejidos normales.
HCCR-1 en tejidos tumorales de mama, de riñón, de ovario y de estómago; y la Fig. 26B muestra la misma transferencia hibridada con una sonda de \beta-actina. Como puede apreciarse de las Figs. 26A y 26B, los tejidos tumorales de mama, de riñón, de ovario y de estómago mostraron una expresión incrementada del protooncogén HCCR-1 en comparación con los tejidos normales.
Para examinar la proteína HCCR-1
expresada en los tejidos tumorales de mama, de riñón, de ovario, y
de estómago, se sometieron los tejidos tumorales de mama, de riñón,
de ovario y de estómago a un análisis por transferencia western
utilizando el suero antiHCCR-1 obtenido en el
Ejemplo 2 de Preparación según el procedimiento del Ejemplo 2 de
Referencia.
La Fig. 27 es el resultado del análisis por
transferencia western que muestra la expresión del protooncogén
HCCR-1 en tejidos humanos cancerosos de mama, de
riñón, de ovario, y de estómago. Como puede apreciarse de la Fig.
27, los tejidos humanos tumorales de mama, de riñón, de ovario y de
estómago mostraron una expresión incrementada de la proteína
HCCR-1 de 50 kDa en comparación con los
correspondientes tejidos normales.
Ejemplo
17
Se marcó el ADNc de HCCR-1 de
longitud completa obtenido en el Ejemplo 1 Preparativo mediante el
kit de marcaje aleatorio Random Prime Kit Labelling (Promega,
EE.UU.) para obtener una sonda. Se cribó la librería genómica lambda
de placenta humana (Human Lambda Genomic Library (Stratagene,
EE.UU.)) utilizando la sonda para obtener el ADN genómico de 20
kb.
El ADN genómico se sometió a una hibridación
in situ por fluorescencia (FISH) (Cherif, D., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87, 6639-6649
(1990)): Se marcó el ADN genómico dispuesto en un portaobjetos con
SpectrumRed-dUTP utilizando un kit Nick Translation
(Vysis, EE.UU.). El portaobjetos se observó con un microscopio de
fluorescencia Zeiss. Los cromosomas se contratiñeron con DAPI
(Sigma, EE.UU.).
La Fig. 28 es el resultado del análisis de
hibridación in situ por fluorescencia que muestra que el
protooncogén HCCR-1 está localizado en el brazo
largo (12q) del 12º cromosoma.
Aunque la materia de la invención ha sido
descrita e ilustrada con referencia a las realizaciones preferidas,
para el experto en la materia será evidente que pueden realizarse
varios cambios y modificaciones.
<110> KIM, Jin Woo
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CÉLULA CANCEROSA DE MAMÍFERO Y
MAMÍFERO TRANSGÉNICO PORTADOR DE PROTOONCOGEN HUMANO Y KIT PARA
DIAGNOSTICAR EL CÁNCER QUE UTILIZA DICHO PROTOONCOGEN.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> pca10102/KJW
\vskip0.400000\baselineskip
<150> KR 2001-41
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-01-02
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<170> KOPATIN 1.5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(1088)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(83)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (435)..(494)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> dominio transmembrana
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 360
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido que se une
específicamente al ARNm HCCR-1.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctggacatt ttgtcacc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> diana de restricción de BamHI
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggcaactag gatccaggca tttct
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> diana de restricción de SalI
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgacgcag ttcccacagg tgtgccatg
\hfill29
Claims (6)
1. Una célula de mamífero transformada con un
vector de expresión que comprende un protooncogén humano que tiene
la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, la cual es la línea
celular de ratón HCCR-1M depositada como KCTC 0923BP
o la línea celular humana HCCR-1H depositada como
KCTC 0922BP.
2. Un embrión mamífero no humano portador de una
construcción de ácido nucleico introducida que comprende un
protooncogén humano que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID
NO: 1.
3. El embrión de mamífero de la reivindicación
2, donde el mamífero es el ratón FVB.
4. El embrión de mamífero de la reivindicación
3, que es el embrión de ratón HCCR-1 depositado como
KCTC 0924BP.
5. Un mamífero no humano canceroso transgénico
que proviene del embrión de cualquiera de las reivindicaciones 2 a
4.
6. El mamífero transgénico de la reivindicación
5, donde el cáncer es un adenocarcinoma intracanalicular papilar de
mama.
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