ES2261429T3

ES2261429T3 - Protooncogen 2 de cancer humano de cuello de utero y la proteina que codifica.

Info

Publication number: ES2261429T3
Application number: ES01948102T
Authority: ES
Inventors: Jin Woo Kim
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-11-28
Filing date: 2001-07-09
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2021-07-09
Also published as: EP1346039A4; JP2004514446A; WO2002044370A1; EP1346039B1; KR100426453B1; DE60118382D1; CN1476478A; EP1346039A1; AU2001269584A1; US6905844B2; JP3730623B2; ATE321858T1; KR20020041550A; US20040029199A1; DE60118382T2; CN1246458C; CA2430331A1

Abstract

Protooncogén 2 de cáncer humano de cuello de útero que tiene la secuencia de ácido nucleico SEQ ID No: 1.

Description

Protooncogén del cáncer de cuello uterino y la proteína que codifica.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo protooncogén y la proteína que codifica, y más particularmente, a un protooncogén de cáncer humano del cuello del útero y a la proteína que se deriva de él, que puede ser utilizado en la diagnosis de varios cánceres.

Estado de la técnica anterior

Todo animal superior, incluyendo el hombre, posee aproximadamente 100.000 genes, pero sólo se expresan alrededor del 15% de ellos, y las características de los procesos biológicos del individuo, por ejemplo, la génesis, la diferenciación, la homeostasis, las respuestas a estímulos, el control de la segmentación celular, el envejecimiento y la apoptosis (muerte celular programada), se determinan por la manera en la que se expresan los genes (ver Liang, P. y A. B. Pardee, Science, 257: 967-971 (1992)).

Las causas de fenómenos patológicos como la tumorigénesis son las mutaciones de genes que provocan cambios en el modo en que los genes se expresan. Así, se han llevado a cabo estudios comparativos de la expresión de genes en diferentes células para proporcionar las bases para establecer aproximaciones validas para la comprensión de diversos fenómenos biológicos.

Por ejemplo, el método de visualización diferencial de ARNm (DD) sugerido por Liang y Pardee es efectivo a la hora de la dilucidación de la naturaleza de los genes supresores de tumores, de los genes relacionados con el ciclo celular y de los genes reguladores de la transcripción que controlan la apoptosis (ver Liang, P. and A. B. Pardee supra). Además, el método DD se ha utilizado ampliamente en el examen de las interrelaciones de varios genes en una célula.

Es conocido que la tumorigénesis está provocada por varios cambios genéticos como la pérdida de heterozigosidad cromosómica, la activación de oncogenes y la inactivación de genes supresores de tumores, por ejemplo, del gen p53 (ver Bishop, J. M., Cell, 64: 235-248(1991); y Hunter, T., Cell, 64: 249-270(1991)). Además, se ha descrito que del 10 al 30% de los cánceres humanos surgen de la activación de oncogenes a través de la amplificación de protooncogenes.

Así, la activación de protooncogenes juega un papel importante en la etiología de muchos tumores y existe la necesidad de identificar protooncogenes.

El presente inventor ha intentado la dilucidación del mecanismo involucrado en la tumorigénesis del cáncer del cuello del útero, y sorprendentemente ha encontrado que un nuevo protooncogén, el gen humano del cáncer del cuello del útero humano se sobreexpresa específicamente en células cancerosas. Este protooncogén se puede utilizar satisfactoriamente en diagnosis, prevención y tratamiento de varios cánceres, por ejemplo leucemia, linfomas, cáncer de colon, de mama, de riñón, de estómago, de pulmón, de ovario y del cuello del útero.

Explicación de la invención

En consecuencia, el objeto primario de la presente invención es proporcionar un nuevo protooncogén.

Otros objetos de la invención son proporcionar:

un vector recombinante que contiene dicho protooncogén y un microorganismo modificado con él;

una proteína codificada en dicho protooncogén;

un kit para la diagnosis del cáncer que contiene dicho protooncogén;

un kit para la diagnosis del cáncer que contiene dicha proteína;

un gen antisentido que tiene una secuencia de bases complementaria a la de dicho protooncogén; y

un procedimiento para el tratamiento o la prevención del cáncer mediante la utilización de dicho gen antisentido.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un nuevo protooncogén con la secuencia SEQ ID No: 1.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un vector recombinante que contiene dicho protooncogén y un microorganismo modificado con dicho vector.

De acuerdo con un aspecto más de la presente invención, se proporciona una proteína con la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 2 que deriva de dicho protooncogén.

Breve descripción de las figuras

Otros objetos y características de la presente invención se desprenderán de la siguiente descripción de la invención junto a los ya mencionados, al considerarla en conjunto con las figuras anexadas, las cuales muestran, respectivamente:

Fig. 1: Identificación por DD de la expresión genética alterada en un tejido normal del cuello del útero, tejido primario de cáncer del cuello del útero, tejido de ganglio linfático en metástasis y en una línea de células cancerosas del cuello del útero (CUMC-6).

Fig. 2: Resultados de los análisis por transferencia northern para los genes HCCR-2 expresados en tejidos del cuello uterino normales, en tejidos de cáncer del cuello del útero y en líneas celulares de cáncer de cuello del útero (CaSki y CUMC-6).

Fig. 3A: Resultados de análisis por transferencia northern de genes HCCR-2 expresados en 12 muestras de múltiples tejidos humanos normales.

Fig. 3B: Resultados obtenidos con la misma muestra de la Fig. 3A hibridada con \beta-actina;

Fig. 4A: Resultados de análisis por transferencia northern de genes HCCR-2 expresados en líneas celulares de cáncer humano;

Fig. 4B: Resultados obtenidos con la misma muestra de de la Fig. 4A hibridada con \beta-actina;

Fig. 5A: Resultados de análisis por transferencia northern de genes HCCR-2 expresados en tejidos tumorales humanos y sus homólogos normales;

Fig. 5B: Resultados obtenidos con la misma muestra de de la Fig. 5A hibridizada con \beta-actina;

Fig. 6: Imagen de contraste de fase de células salvajes del tipo NIH/3T3 cultivadas en monocapa;

Fig. 7: Imagen de contraste de fase de células del tipo NIH/3T3 transfectadas con HCCR-2 cultivadas en monocapa (células HCCR-2M);

Fig. 8: Tinción con hematoxilina-eosina de células del tipo NIH/3T3 transfectadas con HCCR-2 cultivadas en monocapa;

Fig. 9: Tumorigenicidad de células NIH/3T3 transfectadas con HCCR-2 en ratón desnudo.

Fig. 10: Tinción con hematoxilina-eosina de nódulos tumorales subcutáneos derivados de células del tipo NIH/3T3 transfectadas con HCCR-2 en ratones desnudos.

Fig. 11: Imagen de contraste de fase de células del tipo HCCR-2MN originadas en ratones desnudos.

Fig. 12: Resultados de PAGE-dodecil sulfato sódico (SDS) mostrando los patrones de expresión de proteína antes y después de la inducción IPTG;

Fig. 13: Resultado del análisis por transferencia western de células NIH/3T3 sin transfección (cepa salvaje), NIH/3T3 transfectadas únicamente con el vector pcDNA3 (pcDNA3) y células NIH/3T3 transfectadas con HCCR-2 (células HCCR-2M).

Fig. 14: Resultado del análisis por transferencia western de tejidos tumorales humanos de riñón, mama, pulmón, ovario y estómago y sus homólogos normales.

Figs. 15A y 15B: Resultados de tinciones inmunohistoquímicas de la proteína HCCR-2 expresada en leucocitos normales y en células leucémicas humanas (X200);

Figs. 16A y 16B: Resultados de tinciones inmunohistoquímicas de la proteína HCCR-2 expresada en leucocitos normales y en tejido humano de linfoma (X200);

Figs. 17A y 17B: Resultados de tinciones inmunohistoquímicas de la proteína HCCR-2 expresada en tejido de mama normal y en cáncer de mama humano (X200);

Figs. 18A y 18B: Resultados de tinciones inmunohistoquímicas de la proteína HCCR-2 expresada en tejido normal de colon y en cáncer de colon humano (X100);

Figs. 19A y 19B: Resultados de tinciones inmunohistoquímicas de la proteína HCCR-2 expresada en tejido normal de riñón y en tejido de cáncer riñón humano (X100);

Figs. 20A y 20B: Resultados de tinciones inmunohistoquímicas de la proteína HCCR-2 expresada en tejido normal del cuello del útero y en tejido de cáncer de cuello del útero humano (X100);

Fig. 21: Imagen de contraste de fase de células epiteliales 293 de riñón embrionario humano cultivadas en monocapa;

Fig. 22: Imagen de contraste de fase de células epiteliales 293 transfectadas con HCCR-2 cultivadas en monocapa (células HCCR-2H);

Fig. 23: Tinción con hematoxilina-eosina de células epiteliales 293 transfectadas con HCCR-2;

Fig. 24: Tumorigenicidad de células epiteliales 293 transfectadas con HCCR-2 en ratón desnudo.

Fig. 25: Tinción con hematoxilina-eosina de nódulos tumorales subcutáneos derivados de células epiteliales 293 transfectadas con HCCR-2 en ratones desnudos.

Fig. 26: Imagen de contraste de fase de células HCCR-2HN derivadas de ratones desnudos cultivadas en monocapa; y

Fig. 27: Resultados de análisis por transferencia northern de células epiteliales 293 de cepa salvaje y de células epiteliales 293 transfectadas con HCCR-2 (clones A, B, C, D y E).

Descripción detallada de la invención

El nuevo protooncogén de la presente invención, es decir cáncer de útero humano 2 (a continuación "protooncogén HCCR-2"), consiste en 2003 pares de bases y tiene la secuencia de ADN SEQ ID No. 1.

En la SEQ ID No. 1, el marco abierto de lectura completo correspondiente a las bases Nos. 63 a 977 es una región de codificación de proteína y la secuencia de aminoácidos predicha que se deriva de ella se muestra en la SEQ ID No. 2, que consiste en 304 aminoácidos ("proteína HCCR-2").

Además la región representada por los nucleótidos Nos. 321 a 380 de la SEQ ID No. 1 codifica un único dominio de transmembrana que tiene la secuencia predicha del aminoácido Nos. 87 a 106 de la SEQ ID No. 2. Esto sugiere que el protooncogén de la presente invención en un gen asociado a membrana.

En el extremo C-terminal de la proteína HCCR-2 se encuentra un único sitio potencial de N-glicosilación (correspondiente a las bases Nos. 831 a 839 de la SEQ ID NO: 1 y a los aminoácidos Nos. 257 a 259 de la SEQ ID NO: 2), lo que sugiere que la HCCR-2 es una proteína de membrana de tipo II. La señal de poliadenilación corresponde a los nucleótidos Nos. 1894-1898 de la SEQ ID No. 1.

Considerando la degeneración de los codones y qué codones son los preferidos en un animal específico para la expresión del protooncogén de la presente invención pueden hacerse varios cambios y modificaciones en las secuencias de ADN de SEQ ID No:1, por ejemplo en su área de codificación, sin alterar adversamente la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada, o en el área de no codificación sin afectar adversamente la expresión del protooncogén. Por lo tanto, la presente invención también incluye en su ámbito de protección un polinucleótido con sustancialmente la misma secuencia de bases que el protooncogén inventivo. Tal y como se usa en la presente descripción, "sustancialmente el mismo polinucleótido" se refiere a un nucleótido con una secuencia de bases que muestra un 80% o más, preferiblemente un 90% o más, más preferiblemente un 95% o más de homología con el protooncogén de la presente invención.

La proteína expresada a partir del protooncogén de la presente invención consiste en 304 aminoácidos y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 2. El peso molecular de tal proteína es aproximadamente 45 kDa. Aún y así, pueden realizarse varias sustituciones, adiciones y/o deleciones de residuos de aminoácidos de la proteína sin afectar adversamente a la función de la proteína. Además, puede utilizarse un fragmento de la proteína cuando sea necesario para ciertos propósitos. Estas modificaciones también se incluyen en el ámbito de la presente invención. De esta manera la presente invención incluye en su ámbito de protección un polipéptido sustancialmente con la misma secuencia de aminoácidos que la proteína derivada de del oncogén de la presente invención. Tal y como se usa en la presente descripción, "sustancialmente el mismo polipéptido" se refiere a un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que muestra un 80% o más, preferiblemente un 90% o más, más preferiblemente un 95% o más de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2.

El protooncogén, o la proteína, de la presente invención pueden obtenerse de tejidos humanos cancerosos o pueden sintetizarse utilizando un método convencional de síntesis de ADN o de péptidos. Además, el gen así preparado puede insertarse en un vector convencional para obtener un vector de expresión que puede, a su vez, introducirse en un apropiado hospedante, por ejemplo un microorganismo como una E. coli o levadura, o en una célula animal como una célula humana o de ratón.

\newpage

Entonces, el hospedador transformado puede ser utilizado para la producción del ADN o la proteína de la invención a gran escala. Por ejemplo, E. coli JM109 se transforma con el vector de expresión pCEV-LAC (Miki, T. et al., Gene, 83 137-146 (1989))que contiene el gen HCCR-2 de la invención (designado como HCCR9/pCEV-LAC) para obtener una E. coli transformante designada JM109/HCCR2 que se depositó el 11 de octubre de 1999 en la Colección Koreana de Cultivos Tipo (KCTC) (dirección: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), #52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon, 305-333, República de Korea) bajo el número de acceso KCTC 0668BP, bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes.

En la preparación del vector, las secuencias de control de la expresión, por ejemplo el promotor, el terminador, la secuencia de auto replicación y la señal de secreción, se seleccionan apropiadamente dependiendo de la célula hospedante utilizada.

La sobrexpresión del protooncogén de la presente invención no ocurre en tejidos normales del cuello del útero, pero sí en tejidos de cáncer del cuello del útero y en líneas celulares de cáncer del cuello del útero. Esto sugiere que el protooncogén de la presente invención induce el cáncer del cuello del útero. Además, cuando una célula normal de fibroblasto, por ejemplo la línea celular NIH/3T3, es transfectada con el protooncogén de la presente invención, se producen células anormales. Las caracterizaciones morfológicas mediante microscopios ópticos y electrónicos muestran que la célula anormal tiene la forma de una célula tumoral.

Cuando se inyecta la célula fibroblasto normal transfectada con el protooncogén de la invención en la zona lateral posterior de un ratón desnudo, se observa tumorigénesis a los 21 días desde la inyección, el tamaño del tumor es de 1 cm x 1 cm en 40 días. Utilizando el método de tinción de hematoxilina-eosina, se puede confirmar que las células del tumor son cancerosas.

Adicionalmente a los tejidos epiteliales como el tejido de cáncer del cuello del útero, la sobreexpresión del protooncogén de la presente invención también se observa en otros varios tumores cancerosos como son la leucemia, el linfoma, el cáncer de mama, de riñón, de ovario, de pulmón y el de estómago. De esta manera, se cree que el protooncogén de la presente invención es un factor común a todas las formas de varios cánceres y que éste puede ser utilizado ventajosamente en la diagnosis de varios cánceres y en la producción de un animal transformado así como en una terapia génica antisentido.

Un método de diagnóstico que puede llevarse a cabo utilizando el protooncogén de la presente invención puede comprender, por ejemplo, los pasos de la hibridación de ácidos nucleicos separados del fluido corporal del sujeto con una sonda que contenga el protooncogén de la presente invención o uno de sus fragmentos, y la determinación de si el sujeto tiene el protooncogén utilizando un método de detección convencional del estado de la técnica. La presencia del protooncogén puede detectarse fácilmente mediante el marcaje de la probeta con un radioisótopo o una enzima. Así, se incluye en el ámbito de protección de la presente invención un kit de diagnóstico del cáncer que contiene el protooncogén de la presente invención.

También se incluye en el ámbito de protección de la presente invención el animal transformado que se produce al introducir el protooncogén de la presente invención en un mamífero, por ejemplo una rata. En la producción de dicho animal transformado, se prefiere introducir el protooncogén de la invención en un huevo fertilizado de un animal antes del 8º estadio del ciclo celular. El animal transformado puede ser utilizado ventajosamente en la exploración de agentes cancerígenos o anticancerígenos como los antioxidantes.

La presente invención también proporciona un gen antisentido útil para terapia génica. Como se utiliza a lo largo de la descripción, el término "un gen antisentido" significa un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que es totalmente o parcialmente complementaria a la secuencia del ARNm que se transcribe del protooncogén que tiene la secuencia de bases SEQ ID No: 1 o un fragmento de ella, dicho nucleótido es capaz de prevenir la expresión del marco abierto de lectura (ORF) del protooncogén acoplándose él mismo al sitio de enlace proteico del
ARNm.

La presente invención también incluye en su ámbito de protección un procedimiento para el tratamiento o la prevención del cáncer en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del gen antisentido de la invención.

En la terapia génica antisentido de la invención, el gen antisentido de la presente invención se administra a un sujeto de manera convencional para prevenir la expresión del protooncogén. Por ejemplo, el ADN antisentido se mezcla con un derivado de poli-L-lisina hidrolizada mediante interacciones electroestáticas de acuerdo con el método descrito por Kim, J.S. et al. (J. Controlled Release, 53: 175-182(1998)) y el ODN antisentido mezclado resultante se administra por vía intravenosa a un sujeto.

La presente invención incluye también en su ámbito de protección una composición anticáncer que comprende el gen antisentido de la presente invención como principio activo, en asociación con excipientes farmacéuticamente aceptables u otros aditivos si es necesario.

\newpage

Preferiblemente, la composición farmacéutica de la presente invención se formula para la administración mediante inyección.

La cantidad del gen antisentido administrado debe determinarse en función de varios factores relevantes incluyendo la condición a tratar, la vía de administración escogida, la edad y el peso de cada paciente, y de la severidad de los síntomas del paciente.

La proteína expresada a partir del protooncogén de la invención puede utilizarse en la producción de un anticuerpo útil como herramienta de diagnóstico. El anticuerpo de la presente invención puede prepararse en forma de anticuerpo monoclonal o policlonal según cualquiera de los métodos conocidos en el estado de la técnica mediante la utilización de una proteína con la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 2 o cualquiera de sus fragmentos. El diagnóstico del cáncer puede llevarse a cabo mediante la utilización de cualquiera de los métodos conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA), ensayos radioinmunológicos (RIA), ensayos tipo sándwich, tinción inmunohistoquímica, por transferencia western o inmunoensayos por transferencia en gel poliacílico, para estimar si la proteína se ha expresado en el fluido corporal del sujeto. De esta manera, también se incluye en el ámbito de protección de la presente invención un kit de diagnóstico del cáncer que contiene la proteína con la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 2.

Utilizando el protoncogén de la invención puede establecerse una línea celular continua viable, y tal línea celular puede obtenerse, por ejemplo, de tejidos tumorales formados en el lomo de un ratón desnudo mediante la inyección de células fibroblasticas transformadas con el protooncogén de la presente invención. Las líneas celulares así preparadas puedes utilizarse ventajosamente en la búsqueda de agentes anticancerígenos.

Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos del ámbito de protección de la presente invención.

Ejemplo 1

Visualización diferencial de ARNm

Paso 1

Aislamiento de ARN total

Durante la histerectomía se obtuvieron muestras de tejido normal exocervical de pacientes con mioma uterino y se obtuvieron muestras de tejido de cáncer del cuello del útero primario sin tratar y de nódulos linfáticos iliáticos metásticos durante la realización de histerectomías radicales. Se cultivó la línea celular CUMC-6 (Kim JW et al., Gynecol Oncol, 62: 230-240 (1996)) en un medio Waymouth MB 751/1.

Se extrajeron los ARNs totales de las muestras de tejido y de las células mediante un sistema comercial (RNeasy total RNA Kit, Qiagen Inc., Alemania), y se eliminaron los ADN contaminantes mediante un kit de limpieza Message (GenHunter Corp., Brookline, MA).

Paso 2

Visualización diferencial

La visualización diferencial se llevó a cabo según Liang et al. (Science, 257: 967-971 (1992); y Cáncer Res.,52: 6966-6968 (1992)) con las siguientes modificaciones menores.

Se sometió a 0,2 \mug de los ARNs totales obtenidos en el Paso 1 a transcripción inversa utilizando el cebador de SEQ ID No: 3, como un cebador oligo-dT asociado (RNAimage kit, GenHunter), seguido de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando el mismo cebador asociado y el mer arbitrario 5' 13 (RNAImage primer set 1, H-AP 1-32) en presencia de 0,5 mM de dATP marcado con \alpha-^{35}S (1200 Ci/mmol). El ciclo térmico se repitió 40 veces, cada ciclo se compuso de: 95ºC durante 40 seg., 40ºC durante 2 min. y 72ºC durante 40 seg., finalmente se llevó a cabo la reacción a 72º durante 5 min. El producto de PCR así obtenido se sometió a electroforesis en geles de secuenciación al 6% en poliacilamida, seguida de autoradiografía.

La Fig. 1 muestra los resultados de la visualización diferencial de tejido normal exocervical, de tejido de cáncer de cuello del útero, de tejido metástico y de la línea celular CUMC-6 de cáncer de cuello de útero utilizando el cebador oligo-dT asociado HT1 1C (SEQ ID No: 5) y el mer arbitrario 5'' 13 de SEQ ID No: 3 donde la flecha indica el fragmento de 206 pb, llamado CC214, expresado en el tejido de cáncer del cuello del útero y de nódulos linfáticos iliáticos comunes, y en la línea celular de cáncer humano CUMC-6.

La banda del fragmento CC214 se eliminada del gel secuenciador seco y se hirvió en agua durante 15 min. para eluir el fragmento CC214. El fragmento CC214 se sometió a PCR en las mismas condiciones, excepto que se omitió el dATP marcado con \alpha-^{35}S y los 20 \muM de dNTPs. El fragmento amplificado de CC214 se clonó en el vector pGEM-T Easy utilizando el sistema TA Cloning (Promega, EE.UU.) y su secuencia de nucleótidos se determinó mediante el sistema de secuenciación Sequenase Versión 2.0 DNA(United States Biochemical Co., EE.UU.). Se llevaron a cabo análisis comparativos de la secuencia de nucleótidos del fragmento CC214 en la base de datos GenBank utilizando los programas BLAST y FASTA y el resultado mostró que este fragmento tiene poca similitud con alguna de las secuencias registradas en la base de datos GenBank.

Ejemplo 2

Exploración de librerías de ADNc

Para la obtención de un clon de cadena de longitud completa de ADNc (denominado HCCR-2) se exploró una librería de ADNc de fibroblastos de bacteriófagos \lambdagt11 de pulmón embrionario humano (generosamente proporcionada por el Prof. IY Chung de la Universidad de Hanyang, Seúl, Korea) mediante hibridación de placa con sondas ADNc CC214 cebadas aleatoriamente y marcadas con ^{32}P (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Se determinó la secuencia de nucletidos de la cadena de longitud completa del clon ADNc HCCR-2.

El clon de la longitud total de la cadena ADNc HCCR-2 contiene un injerto de 2003 pb con la secuencia de nucleótidos SEQ ID No: 1 y un marco abierto de lectura completo que corresponde a las bases Nos. 63 a 977 y que es una región de codificación de proteínas, la secuencia de aminoácidos predicha que se deriva de éste se muestra en SEQ ID No: 2 y consiste en 304 aminoácidos. Además, la región representada por los nucleótidos No. 321 a 380 de la SEQ ID No:1 codifica un único dominio transmembrana para el que se predice la secuencia de aminoácidos Nos. 87 a 106 de la SEQ ID No: 2. Esto sugiere que el protooncogén de la presente invención es un gen enlazado a membrana.

En el extremo C-terminal de la proteína HCCR-2 se presenta un único sitio potencial de N-glicosilación (correspondiente a las bases Nos. 831 a 839 de la SEQ ID No: 1 y a los aminoácidos Nos. 257 a 259 de la SEQ ID No: 2), lo que sugiere que la proteína HCCR-2 es una proteína de membrana de tipo II. La señal de poliadenilación corresponde a los nucleótidos Nos. 1894-1898 de SEQ ID No: 1.

La secuencia de nucleótidos del clon de cadena de longitud completa de ADNc HCCR-2 se registró en GenBank con el número de acceso AF315598. La longitud completa de ADNc HCCR-2 se introdujo en el vector pCEV-LAC (Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146 (1989)) para obtener la E. coli designada JM109/HCCR2, depositada el 11 de octubre de 1999 en la Colección Koreana de Cultivos Tipo (Dirección: #52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon 305-333, República de Korea) con el número de acceso KCTC 0668BP.

Ejemplo 3

Análisis por transferencia northern

Para determinar el nivel de expresión del gen HCCR-2 en varios tejidos normales, tejidos cancerosos y líneas celulares cancerosas se llevó a cabo un análisis por transferencia northern como se detalla a continuación.

Se prepararon ARNs totales a partir de tejido exocervical normal, de tejido de cáncer primario de cuello del útero y de líneas celulares de cáncer humano de cuello del útero CaSki (ATCC CRL 1550) y CUMC-6 repitiendo el procedimiento del Paso 1 del Ejemplo 1. 20 \mug del ARN total se desnaturalizó y se hizo una electroforesis a través de gel de agarosa al 1% de formaldehído y fue transferido a membranas de nylon (Boehringer-Mannheim, Alemania). Las transferencias se hibridizaron durante la noche a 42ºC con una sonda ADNc cebada aleatoriamente y marcada con ^{32}P, preparada mediante un sistema de marcaje aleatorio de cebadores Rediprime II (Amersham, Inglaterra). Los resultados del análisis por transferencia northern se repitieron consistentemente dos veces, como se cuantificó mediante densitometría y las mismas transferencias se hibridaron con una sonda \beta-actina para confirmar la integridad del
ARNm.

También se llevaron a cabo análisis de transferencia northern, según las recomendaciones del proveedor, utilizando 12 tejidos múltiples normales humanos (Clontech) y líneas celulares de cáncer humano (Clontech).

La Fig. 2 muestra los resultados de los análisis por transferencia northern de tejidos normales del cuello del útero, de tejidos de cáncer primario del cuello del útero y de líneas celulares de cáncer del cuello del útero CUMC-6 y CaSki mediante la sonda HCCS-1 de ADNc; y la misma transferencia hibridada con una sonda de \beta-actina. Como se puede extraer de la Fig. 2, el nivel de expresión del gen HCCR-2 era elevado en los tejidos de cáncer del cuello del útero y en las líneas celulares de cáncer del cuello del útero pero prácticamente ausente en todos los tejidos normales del cuello del útero.

La Fig. 3A muestra los resultados del análisis por transferencia northern de tejidos humanos normales, es decir, tejidos cerebrales, de corazón, de músculo esquelético, de colon, de timo, de bazo, de riñón, de hígado, de intestino delgado, de placenta, de pulmón y de leucocitos de sangre periférica, utilizando sondas de ADNc HCCR-2; y la fig. 3B, la misma transferencia hibridada con una sonda de \beta-actina. Como se puede observar en la Fig. 3A, el ARNm HCCR-2 (\sim2.0 kb) está presente débilmente o ausente en muchos de los tejidos normales, pero el nivel de expresión era alto en el tejido normal de riñón.

La Fig. 4A muestra el resultado del análisis por transferencia northern para el gen HCCR-2 expresado en líneas celulares humanas de leucemia y linfoma, es decir, célula HL-60 de leucemia promielocítica, célula HeLa de cáncer de cuello del útero, célula K-562 de leucemia mielógena crónica, célula MOLT-4 de leucemia linfoblástica, célula Raji de linfoma de Burkitt, célula SW480 de cáncer de colon, célula A549 de cáncer de pulmón y célula G361 de melanoma mediante la sonda de ADNc HCCR-2; y la Fig. 4B, la misma transferencia hibridada con una sonda de \beta-actina. Como se puede observar en la Fig. 4A y Fig. 4B, el HCCR-2 se transcribe en un nivel alto en las líneas celulares humanas de leucemia y linfoma, como son las K-562 de leucemia mielógena crónica, las Raji de linfoma de Burkitt, las MOLT-4 de leucemia linfoblástica y las HL-60 de leucemia promielocítica y también en las HeLa de cáncer de cuello del útero.

En particular, las K-562, MOLT-4 y HL-60 muestran niveles de transcripción más elevados comparados con los de leucocito normal en un factor de aproximadamente 190, 90, y 70 respectivamente. Los niveles de expresión de HCCR-2 en las líneas celulares SW480 de cáncer colo-rectal, las A549 de cáncer de pulmón y las G361 de melanoma son inferiores que aquellas de leucemia y linfoma.

Además, se llevaron a cabo análisis por transferencia northern de tejidos de cáncer humano de riñón, mama, pulmón, ovario, y estómago y de sus homólogos normales. Como se muestra en la Fig. 5A, el HCCR-2 se transcribió en un nivel alto en las células humanas de cáncer, mientras que la expresión del gen HCCR-2 es difícilmente observable en las células normales. La Fig. 5B muestra los resultados obtenidos con las mismas muestras hibridadas con una sonda de \beta-actina para confirmar la integridad del ARNm.

Ejemplo 4

Construcción de los vectores de expresión y transformación de células animales

Paso 1

Preparación de un vector que contiene HCCR-2

Se construyó un vector de expresión que contiene la región de codificación de HCCR-2 como se detalla a continuación.

Primero, se insertó todo el ADNc HCCR-2 obtenido en el Ejemplo 2 dentro del sitio de restricción Sail de un vector de expresión procariota pCEV-LAC (Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146 (1989)). A su vez, el fragmento Sall se aisló del vector pCEV-LAC/HCCR-2.

Seguidamente, se digirió el pcDNA3 (Invitrogen) con Xhol para conseguir un final compatible con Sall. El fragmento de Sall que contenía la longitud completa de la secuencia de codificación de HCCR-2 se insertó en el pcDNA3 digerido en Xhol. Para introducir el vector de expresión pcDNA3/HCCR-2 resultante dentro de las células NIH/3T3 (ACTC CRL, 1658, EE.UU.) se utilizó lipofectamina (Gibco BRL), seguida de selección en un medio complementado con G418 (Gibco). Las células NIH/3T3 transfectadas con HCCR-2 se denominaron "células HCCR-2M". Se preparó otra población de células NIH/3T3 que contenían únicamente pcDNA3 como control y se designaron como "células pcDNA3".

Paso 2

Células fibroblásticas NIH/3T3 transfectadas con el protooncogén HCCR-2

La célula normal de cepa salvaje NIH/3T3, una línea celular fibroblástica diferenciada, es una célula fibrosa con un núcleo largo y delgado y una cantidad escasa de citoplasma tal y como muestra la Fig. 6. Cuando HCCR-2 se expresa en las NIH/3T3 que expresan HCCR-2 (las células HCCR-2M) obtenidas en el Paso 1, la forma de la célula cambia a una forma poligonal con un núcleo oval y un citoplasma ancho, como muestra la Fig. 7.

Las células NIH/3T3 transfectadas con HCCR-2 cultivadas en monocapa que se tiñen con hematoxina-eosina exhiben polimorfismo nuclear, nucléolos diferenciados, patrones de cromatina granulares, células tumorales gigantes y figuras mitóticas atípicas como muestra la Fig. 8.

Ejemplo 5

Tumorigenicidad de las células HCCR-2M en animales

Para el análisis de la tumorigenicidad se inyectaron 5 x 10^{6} células NIH/3T3 transfectadas con HCCR-2 (células HCCR-2M) subcutaneamente en la zona lateral posterior del tronco de 10 ratones (5 semanas de edad, atímicos nu/nu de estirpe BALB/c). Los ratones desnudos se sacrificaron cuando los tumores subcutáneos llegaron a los 1,5-2,5 cm de diámetro.

La totalidad de los 10 ratones a los que se les inyectó mostraron tumores palpables después de 21 días, tal y como se muestra en la Fig. 9.

Los ratones desnudos portadores de aloinjertos HCCR-2M mostraron características de un carcinoma epitelial. La Fig. 10 muestra la tinción de hematoxina-eosina de los nódulos tumorales subcutáneos tomados de los ratones desnudos. Las secciones de los nódulos tumorales revelaron los típicos nidos de células epiteliales separados por estromas fibrosos.

Ejemplo 6

Establecimiento de una nueva línea celular a partir de tejido de tumor inducido por las células HCCR-2M

Las células obtenidas a partir del tejido del tumor del Ejemplo 5 se cultivó de manera convencional utilizando un 20% de suero fetal bovino y las células cultivadas se designaron como células HCCR-2MN con características citológicas similares a la células HCCR-2M in vitro como muestra la Fig. 11.

Ejemplo 7

Determinación del tamaño de la proteína expresada después de la transfección de E. coli con el protooncogén HCCR-2

Se insertó un protooncogén completo HCCR-2 de SEQ ID No: 1 dentro del sitio de clonación múltiple del vector pET-32b(+) (Novagen) y el vector pET-32b(+)/HCCR-2 resultante se transfectó dentro de E. coli BL21( ATCC 47092). La E. coli transfectada se incubó utilizando un medio de caldo LB en un incubador rotatorio agitador, diluido al 1/100, e incubado durante 3 horas. Se añadieron 1 mM de \beta-D-tiogalacto-piranósido de isopropilo (IPTG, Sigma) para inducir la síntesis de proteínas.

Las células de E. coli del cultivo se rompieron mediante sonicación y se sometieron a electroforesis en gel utilizando un 12% de dodecil sulfato de sodio (SDS) antes y después de la inducción por IPTG. La Fig. 12 muestra los resultados SDS-PAGE que exhiben un patrón de expresión de la proteína para la cepa E. coli BL21 transfectada con el vector pET-32b(+)/HCCR-2.

Después de la inducción IPTG se observa una banda significante de proteína alrededor de 45 kDa. Ésta proteína de fusión de 45 kDa contuvo alrededor de 20 kDa de la proteína Trix-Tag tioredoxina expresada en el gen dentro del vector pET-32b(+).

Ejemplo 8

Producción del anti-cuerpo

La proteína de fusión de 45 kDa aislada de la cepa de E. coli BL21 transfectada con el vector pET-32b(+)/HCCR-2 del Ejemplo 7 se purificó mediante la utilización de un kit His-Bind (Novagen). El ensayo de transferencia inmunológica del péptido purificado confirmó la presencia de una cantidad mayor de proteína de 45 kDa.

A continuación, se inmunizaron subcutáneamente 3 veces por semana con 1 mg del péptido así obtenido dos ratas Sprague-Dawley de 6 semanas de edad. Se obtuvieron muestras de sangre de las ratas inmunizadas y se centrifugaron para obtener el suero policlonal. La actividad anti-HCCR-2 del suero policlonal se determinó y se confirmó mediante ensayos de inmunoabsorción acoplado a enzimas (1:10.000)

Ejemplo 9

Ensayo inmunológico de transferencia para confirmar la especificidad del anticuerpo

Para los análisis por transferencia western, la célula identificada en la Fig. 7 se recogió y se destruyó en un tampón de muestra Laemmli según el método descrito por Laemmli (Nature, 227: 680-685(1970)). La proteína celular se separó mediante un 10% de SDS-PAGE y se transfirió eléctricamente a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con el suero policlonal de rata anti-HCCR-2 preparado en el Ejemplo 8 durante 16 h. Después del lavado las membranas se incubaron con una solución fijadora que contenía una dilución de 1:1.000 de inmunoglobilina anti-rata de cabra conjugada con peroxidasa (Jackson InmunoResearch) como anticuerpo secundario. Las proteínas se revelaron mediante una kit de detección por transferencia ECL-Western (Amersham).

Como se muestra en la Fig. 13, la proteína HCCR-2 se sobreexpresa en las células HCCR-2, cuando en las cepas salvajes y en las células transfectadas únicamente con el vector (pcDNA3) sólo se observan bandas tenues. Este resultado ilustra la especificidad de los anticuerpos Anti-HCCR-2 del suero policlonal.

Además, el anticuerpo HCCR-2 del suero policlonal reconoció aproximadamente proteína de 45 kDa en extractos proteicos humanos de diferentes tejidos. Como se muestra en la Fig. 14, los tejidos de tumores humanos, incluyendo carcinomas de riñón, de mama, de pulmón, de ovario y de estómago mostraron una expresión de la proteína HCCR-2 superior comparada con la de sus homólogos normales.

Ejemplo 10

Tinción Inmunohistoquímica

Para la determinación del nivel de expresión de la proteína HCCR-2 en varios tejidos normales y tejidos de cáncer, se llevaron a cabo tinciones inmunohistoquímicas según el método del complejo avidin-biotin-peroxidasa (Hsu, S.M. et al., Histochem Cytochem, 29: 577-580 (1981)) como se detalla a continuación.

Se desenceraron los tejidos embebidos en parafina utilizando xileno, se trataron con etanol de grado, se rehidrataron después de eliminar la parafina y se lavaron con agua. Entonces, los tejidos se colocaron en una solución de paro de peróxidos constituida por peróxido de hidrógeno durante 30 minutos para finalizar la actividad endógena de la peroxidasa, se trató con una solución de suero bloqueador (Zymed Laboratories, CA, EE.UU.) durante 30 minutos para bloquear los enlaces no específicos, se trató con el anticuerpo primario, se dejó durante la noche a 4ºC, se lavó con un tampón salino de fosfato (PBS), se trató con el anticuerpo secundario con biotina (Zymed) durante 30 min., y se lavó con PBS. A continuación, los tejidos se trataron con un conjugado enzimático durante 30 minutos, se lavaron con PBS, se trataron con aminoetilocarbazol (Zymed) como cromógeno durante 18 minutos. A continuación las secciones del tejido se contrastaron con hematoxina.

La Fig. 15 muestra los resultados de la tinción inmunohistoquímica de leucocitos normales (A) y de células leucémicas (B). Los leucocitos normales muestran una intensidad de expresión negativa y las células leucémicas muestran una fuerte intensidad positiva de expresión.

La Fig. 16 muestra los resultados de la tinción inmunohistoquímica de linfocitos normales (A) y de tejido de linfoma (B). Los linfocitos normales muestran una intensidad de expresión negativa y el tejido del linfoma muestra una fuerte intensidad positiva de expresión en el citoplasma.

La Fig. 17 muestra los resultados de la tinción inmunohistoquímica de tejido mamario normal (A) y de tejido tumoral de mama (B). El tejido mamario normal muestra una intensidad de expresión negativa y el tejido tumoral de mama muestra una fuerte intensidad positiva de expresión en el citoplasma.

La Fig. 18 muestra los resultados de la tinción inmunohistoquímica de tejido normal de colon (A) y de tejido de cáncer de colon (B). El tejido normal de colon muestra una intensidad de expresión negativa y el tejido de cáncer de colon muestra una fuerte intensidad positiva de expresión en el citoplasma.

La Fig. 19 muestra los resultados de la tinción inmunohistoquímica de tejido normal de riñón (A) y de tejido de cáncer renal (B). El tejido normal de riñón muestra una intensidad de expresión negativa y el tejido de cáncer renal muestra una fuerte intensidad positiva de expresión en el citoplasma.

La Fig. 20 muestra los resultados de la tinción inmunohistoquímica de tejido normal del cuello del útero (A) y de tejido de cáncer del cuello del útero (B). El tejido normal del cuello del útero muestra una intensidad de expresión negativa y el tejido de cáncer del cuello del útero muestra una fuerte intensidad positiva de expresión.

Ejemplo 11

Construcción de vectores de expresión y transformación de células humanas

Paso 1

Preparación de un vector que contiene HCCR-2

De la manera siguiente, se construyó un vector de expresión que contenía la región de codificación de HCCR-2.

Primero, todo en ADNc HCCR-2 obtenido en el Ejemplo 2 se insertó en el sitio de restricción Sall de un vector de expresión procariota pCEV-LAC (Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146 (1989)). A continuación, el fragmento Sall se aisló del vector pCEV-LAC/HCCR-2.

A continuación, el pcDNA3 (Invitrogen) se digirió con Xhol para obtener un final compatible con Sall. El fragmento Sal que contenía la secuencia de codificación completa de HCCR-2 se insertó en el pcDNA3 digerido en Xhol. Se utilizó lipofectamina (Gibco GRL) para introducir el vector de expresión pcDNA3/HCCR-2 resultante dentro de células epiteliales 293 de riñón embrionario humano (ACTC CRL, 1573, EE.UU.), seguido de la selección en un medio complementado con G418 (Gibco). Las células epiteliales 293 transfectadas con HCCR-2 resultantes se denominaron "células HCCR-2H".

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Paso 2

Células epiteliales 293 transfectadas con el protooncogén HCCR-2

Las células epiteliales 293 de riñón embrionario humano de cepa salvaje es una línea celular fibroblástica diferenciada, es una célula fibrosa con un núcleo largo y delgado y una cantidad escasa de citoplasma tal y como muestra la Fig. 21. Cuando HCCR-2 se expresa en las células epiteliales 293 que expresan HCCR-2 (las células HCCR-2H) obtenidas en el Paso 1, la forma de la célula cambia a una forma poligonal con un núcleo oval y un citoplasma ancho, como muestra la Fig. 22.

Las células epiteliales 293 transfectadas con HCCR-2 y cultivadas en monocapa que se tiñen con hematoxina-eosina exhiben polimorfismo nuclear, nucléolos diferenciados, patrones de cromatina granulares, células tumorales gigantes y figuras mitóticas atípicas como muestra la Fig. 8.

Ejemplo 12

Tumorigenicidad del protooncogén HCCR-2H en animal

Para el análisis de la tumorigenicidad se inyectaron 5 x 10^{6} células epiteliales 293 de riñón embrionario humano transfectadas con HCCR-2 (células HCCR-2H) subcutáneamente en la zona lateral posterior del tronco de 10 ratones (5 semanas de edad, atímicos nu/nu de estirpe BALB/c). Los ratones desnudos se sacrificaron cuando los tumores subcutáneos llegaron a los 1,5-2,5 cm de diámetro.

La totalidad de los 10 ratones a los que se les inyectó mostraron tumores palpables después de 20 días, tal y como se muestra en la Fig. 24.

Los ratones desnudos portadores de aloinjertos HCCR-2M mostraron características de un carcinoma epitelial. La Fig. 25 muestra la tinción de hematoxina-eosina de los nódulos tumorales subcutáneos tomados de los ratones desnudos. Las secciones de los nódulos tumorales revelaron los típicos nidos de células epiteliales separados por estromas fibrosos.

Ejemplo 13

Establecimiento de una nueva línea celular a partir de tejido de tumor inducido por las células HCCR-2H

Las células obtenidas a partir del tejido del tumor del Ejemplo 12 se cultivaron de manera convencional utilizando un 20% de suero fetal bovino y las células cultivadas se designaron como células HCCR-2HN con características citológicas similares a las de las células HCCR-2H in vitro como muestra la Fig. 26.

Además, se llevaron a cabo análisis de transferencia northern de las cepas salvajes de las células epiteliales 293 y de las células epiteliales 293 transfectadas con HCCR-2 (clones A, B, C, D y E). Como muestra la Fig. 27, HCCR-2 se transcribió en un nivel alto en los cinco clones, mientras que la expresión del gen HCCR-2 es difícilmente apreciable en la cepa salvaje de la célula epitelial 293.

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<110> KIM, Jin Woo

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<120> Protooncogén 2 de cáncer humano de cuello de útero y la proteína que codifica

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<130> KJW-0613

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<160> 6

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<170> KOPATIN 1.5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 2003

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (63)…(974)

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (321)…(380)

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<223> dominio transmembrana único

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<400> 1

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1

2

3

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<210> 2

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<211> 304

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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4

5

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<210> 3

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<211> 13

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador arbitrario

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

aagctttctc tgg

\hfill

13

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 16

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador oligo-dT unido a H-T11G

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<400> 4

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagttttttt tttttg

\hfill

16

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 16

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador oligo-dT unido a H-T11C

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

aagctttttt tttttc

\hfill

16

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<210> 6

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<211> 16

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador oligo-dT unido a H-T11A

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

aagctttttt ttttta

\hfill

16

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Claims

1. Protooncogén 2 de cáncer humano de cuello de útero que tiene la secuencia de ácido nucleico SEQ ID No: 1.

2. Protooncogén 2 de cáncer humano de cuello del útero que tiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a las bases Nos 63 a 977 de la SEQ ID No: 1 y que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID No:2.

3. Proteína que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 2.

4. Vector que comprende el protooncogén según las reivindicaciones 1 ó 2.

5. Microorganismo transformado con el vector según reivindicación 4.

6. Microorganismo según la reivindicación 5, que es E. coli JM109/HCCR2 (Número de Acceso: KCTC 0668BP).

7. Procedimiento para la preparación de la proteína según la reivindicación 3 que comprende el cultivo del microorganismo según la reivindicación 5 ó 6.

8. Kit para el diagnóstico del cáncer que comprende el protooncogén según la reivindicación 1 ó 2.

9. Kit para el diagnóstico del cáncer que comprende la proteína según la reivindicación 3.

10. Gen antisentido con una secuencia de bases que es complementaria a la secuencia del ARNm transcrito del protooncogén según la reivindicación 1 y que es capaz de unirse al ARNm para inhibir la expresión de dicho protooncogén.

11. Composición para la prevención o el tratamiento del cáncer que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del gen antisentido según la reivindicación 10 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.