ES2274513T3 - Procedimiento de produccion de plantas transgenicas, completamente transformadas en generacion to, a partir de meristemos. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCESO DE PRODUCCION DE PLANTAS TRANSGENICAS, COMPLETAMENTE TRANSFORMADAS EN GENERACION TO, QUE COMPRENDE: A) UNA ETAPA DE TRANSFORMACION GENETICA DE UN EXPLANTE MERISTEMATICO, B) UNA ETAPA DE CULTIVO SELECTIVO QUE PERMITE EL DESARROLLO ESPECIFICO, ENTRE TODAS LAS CELULAS TRANSFORMADAS, DE LAS QUE SON EN ORIGEN MERISTEMOS SECUNDARIOS Y/O CELULAS CAPACES DE GENERAR MERISTEMOS FOLIARES NEOFORMADOS; C) LA REGENERACION, A PARTIR DEL MATERIAL CELULAR OBTENIDO DURANTE LA ETAPA B) DE PLANTAS TRANSGENICAS.

Description

Procedimiento de producción de plantas transgénicas, completamente transformadas en generación T_{0}, a partir de meristemos.

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de plantas transgénicas a partir de meristemos, dichas plantas se transforman completamente en la generación T_{0}.

En la actualidad, se aplican habitualmente las técnicas de ingeniería genética para la mejoría de las especies vegetales. Dichas técnicas permiten la introducción de caracteres nuevos difíciles o imposibles de introducir por otras técnicas clásicas. A pesar de la evolución de dichas técnicas, existen sin embargo determinadas especies que difícilmente se prestan a la transformación o que no se pueden regenerar a partir de unos explantes diferenciados, como unos cotiledones o unas hojas. Para dichas especies (por ejemplo, el girasol, el algodón, el guisante, la judía, la soja, etc....), se ha demostrado que dichas dificultades podían, en parte, ser superadas utilizando como explante para la transformación, un explante meristemático, por ejemplo un meristemo apical.

La utilización de meristemos permite la regeneración de plantas fértiles sin etapa de colagenasa. La técnica de regeneración a partir de meristemos se aplica a un gran número de especies diferentes y, dentro de una misma especie, a un gran número de genotipos. Gracias a dicha técnica, se han podido transformar y regenerar numerosas especies recalcitrantes (ver por ejemplo: Bidney et al., Plant Molecular Biol. 18, 301-313, 1992; Bidney et al., Proc. 13e Int. Sunflower Conf. Vol II, Pisa Sept. 1992; Schrammeijer et al, Plant Cell Rep. 9: 55-60, 1990; Christou et al, The Plant Journal,2 (3), 283-290, 1992; Gambley et al, Plant Cell Rep. 12: 343-348, 1993; Russel et al, Plant Cell Rep. 12: 165-169, 1993).

Dicho procedimiento adolece sin embargo de algunos inconvenientes. La frecuencia de la transformación es extremadamente baja y las plantas regeneradas son casi exclusivamente quiméricas, es decir determinados tejidos se transforman mientras que otros no. Dicha característica deriva del hecho que el meristemo produce el material celular origen de todos los tejidos de diversos órganos de la planta (tallo, raíces, hojas). Ahora bien, sea cual sea la técnica utilizada, la operación de transformación, sólo conduce a la transformación de un número restringido de células dentro del explante, dichas células se reparten de forma aleatoria. El meristemo no está siempre completamente transformado después de dicha manipulación. Las plantas regeneradas a partir de un meristemo que ha sufrido una etapa de transformación son por lo tanto quiméricas. Unas plantas completamente transgénicas sólo se obtienen en la descendencia y esto, a condición de que las células de la línea germinal hayan sido afectadas por la transformación. Dicho tipo de procedimiento se describe por ejemplo en: Bidney et al., Plant Molecular Biol. 18, 301-313, 1992; Schrammeijer et al Plant Cell Rep. 9: 55-60, 1990.

Los inconvenientes que se presentan en la obtención de plantas quiméricas son conocidos en la técnica, pero no se ha podido aportar ninguna solución. Se ha descrito un sistema de marcaje que permite reconocer, de entre las plantas quiméricas T_{0}, las que habían sufrido una transformación de la línea germinal y que por lo tanto eran susceptibles de transmitir el nuevo carácter a su descendencia (Christou et al., The Plant Journal, 2 (3), 283-290, 1992). Dicho procedimiento facilita la obtención, en la generación siguiente, de plantas completamente transformadas, pero las plantas producidas en la generación T_{0} son siempre quiméricas.

Hoy en día, no existe un procedimiento que permite producir, de forma sistemática y previsible, unas plantas transgénicas completamente transformadas en generación T_{0} a partir de explantes meristemáticos.

La presente invención resuelve dicho problema técnico. La invención se basa en la puesta a punto, por los inventores, de un procedimiento que permite enriquecer los meristemos en células transformadas, para desembocar en unos meristemos completamente transformados, es decir unos meristemos cuyas células se transforman. Según la invención, la regeneración de plantas se efectúa después exclusivamente a partir de dichos explantes completamente transformados, lo que garantiza el carácter transgénico de las plantas obtenidas. Los inventores han demostrado igualmente que, en determinadas condiciones, se puede inducir la neoformación de meristemos y de yemas foliares neoformadas en las hojas de explantes obtenidos de meristemos. No se ha descrito nunca en la bibliografía la existencia de dichas yemas foliares neotransformadas, que contienen unos meristemos foliares neoformados. El procedimiento de la invención permite asimismo la obtención de dichos meristemos foliares neoformados en un estado completamente transformado. Constituyen entonces un material celular excelente para la regeneración de plantas completamente transformadas en T_{0}.

En térmicos generales, la invención proporciona por lo tanto un procedimiento de producción de meristemos completamente transformados, y un procedimiento que permite regenerar exclusivamente a partir de dichos explantes, unas plantas completamente transgénicas en T_{0}.

La presente solicitud describe un procedimiento de plantas transgénicas, completamente transformadas en generación T_{0}, que comprende:

a)

una etapa de transformación genética de un explante meristemático, y

\newpage

b)

una etapa de cultivo selectivo que permite el desarrollo específico, de entre todas las células transformadas, de las que son el origen de los meristemos secundarios y/o de las que son capaces de dar lugar a unos meristemos foliares neoformados;

c)

la regeneración, a partir del material celular obtenido en la etapa ii) de plantas transgénicas.

En el contexto de la presente invención, el término "explante meristemático" significa un explante constituido esencialmente o exclusivamente de tejido meristemático o de tejido susceptible de convertirse, a lo largo de su desarrollo, en meristemático. Según la invención, dicho término engloba principalmente:

-

un meristemo apical (igualmente conocido en la técnica como "meristemo primario"), particularmente un meristemo apical caulinario, es decir origen del tallo;

-

una yema foliar neoformada;

-

una parte de una hoja joven capaz de dar lugar a unas yemas foliares neoformadas.

El término "yema foliar neoformada" significa una yema que se encuentra sobre la epidermis superior de una hoja. Contiene un meristemo foliar neoformado. Su desarrollo se induce de forma "artificial" gracias a una serie de condiciones de cultivo precisas.

La naturaleza de dichos diferentes explantes se describe con detalle más adelante.

El término "meristemo secundario" significa un meristemo nacido de un meristemo primario. En particular, dicho término se refiere, en el contexto de la invención, a los meristemos axilares, situados en la axila de las hojas y responsables de la construcción de las ramas laterales de la planta.

El término "yema axilar" significa una yema situada en la axila de una hoja, que contiene un meristemo secundario.

El término "meristemo foliar neoformado" significa un meristemo contenido en una yema foliar neoformada. La formación de dichos meristemos está provocada "artificialmente" por unas condiciones de cultivo que se definirán más adelante.

A nivel celular, los meristemos secundarios y los meristemos foliares neoformados presentan una organización estructural y un funcionamiento idéntico a los del meristemo principal, pero presentan unos tamaños más pequeños. Por otra parte, los meristemos foliares neoformados son más pequeños que los meristemos secundarios.

Los trabajos que conducen a la elaboración de la presente invención se basan en los principios morfogenéticos siguientes. El meristemo apical contiene, en la axila de las Primordia foliares, de las células que, de forma predeterminada, darán lugar al nacimiento, por multiplicación celular, de unos meristemos secundarios. Puede que, en el momento de una operación de transformación genética, dichas células "pre-programadas" sean transformadas. Los meristemos secundarios obtenidos de la multiplicación de dichas células estarán compuestos exclusivamente por células transformadas. Ocurre lo mismo para las células que, en unas condiciones de cultivo favorables, darían lugar a unos meristemos foliares neoformados. Por consiguiente, las plantas regeneradas a partir de dichos meristemos secundarios transformados y a partir de los meristemos foliares neoformados transformados serían completamente transgénicas.

Los inventores han puesto a punto un sistema de cultivo selectivo que favorece el desarrollo, de entre las células transformadas, de las que son el origen de los meristemos secundarios y de los meristemos foliares neoformados. Se han eliminado las otras células.

Preferentemente, le cultivo selectivo comprende las etapas siguientes:

i)

cultivo, en un medio selectivo, del explante meristemático que ha sufrido la etapa de transformación;

ii)

extracción de las yemas axilares transformadas y eventualmente de las yemas foliares neoformadas transformadas, obtenidas a lo largo de la etapa i);

iii)

cultivo sobre un medio selectivo de las yemas transformadas obtenidas según ii);

iv)

repetición por lo menos una vez de las etapas ii) y iii).

Más particularmente, la invención se refiere a un procedimiento de producción de plantas transgénicas, completamente transformadas en generación T_{0} que comprende:

a.

una etapa de transformación genética de un explante meristemático;

b.

cultivo en un medio de cultivo selectivo del explante que ha sufrido la etapa de transformación;

c.

extracción de las yemas axilares transformadas y eventualmente de las yemas foliares transformadas, obtenidas a lo largo de la etapa b.;

d.

cultivo en un medio selectivo de las yemas transformadas obtenidas según la etapa c.;

e.

repetición por lo menos una vez de las etapas c. y d. de forma que se obtienen unos meristemos secundarios completamente transformados y eventualmente unos meristemos foliares neoformados, completamente transformados;

f.

regeneración, a partir del material celular obtenido en la etapa e. de plantas transgénicas.

En otros términos, según la invención, el explante que ha sufrido la etapa de transformación se pone en cultivo en un medio selectivo, durante un tiempo determinado. Cuando aparecen algunos brotes y algunas hojas, se interrumpe el cultivo y se extraen las yemas axilares y, si es necesario las yemas foliares neoformadas, que están por lo menos en parte transformadas. El estado transformado se reconoce gracias al marcador selectivo. Las yemas se repican y se cultivan después en un medio selectivo hasta que produzcan, a su vez, unas yemas axilares y eventualmente unas yemas foliares neoformadas. Se interrumpe el cultivo y se extraen de nuevo las yemas transformadas y se ponen en cultivo. Al repetir varias veces este ciclo de "cultivo de duración limitada/extracción de las yemas", se procede a obtener unas yemas completamente transformadas. De hecho, con cada ciclo, el número de células transformadas en la yema y la proporción de células transformadas en relación con las células no transformadas aumenta gracias a la multiplicación celular. Por lo tanto se repiten los ciclos hasta que se obtienen unas yemas completamente transformadas. Una yema completamente transformada se reconoce mediante su capacidad para producir un brote que presenta, en todas partes, una coloración verde característica de su capacidad para resistir la inhibición por el marcador selectivo, que corresponde al estado transformado. La regeneración de la planta transgénica se lleva a cabo a partir de unas yemas axilares o de unas yemas foliares neoformadas.

El término "agente selectivo" significa, en el contexto de la invención, un agente que favorece el desarrollo de las células transformadas. El agente selectivo utilizado normalmente es la kanamicina. En este caso, la secuencia heteróloga introducida en el momento de la transformación comprende un gen que codifica para la resistencia a la kanamicina, por ejemplo el NPT II. La kanamicina actúa mediante el bloqueo de los ribosomas citoplasmáticos. Por consiguiente, una planta resistente a la kanamicina es verde porque es capaz de fabricar unos cloroplastos funcionales, mientras que una planta no resistente presenta una coloración amarilla o blanca característica de la ausencia de cloroplastos funcionales. Dicho fenómeno permite la selección visual de los transformantes. Se seleccionan las yemas foliares neoformadas verdes y las yemas axilares verdes; se eliminan la yema principal, la plántula principal y todas las partes de la planta que son blancas o amarillas.

El hecho de eliminar la yema principal favorece el desarrollo de las yemas axilares, particularmente cuando se trata de una especie de dominancia apical como en el girasol seleccionado.

El número de ciclos de cultivo selectivo es preferentemente de por lo menos 2, incluyendo el primer cultivo del explante meristemático que ha sufrido la etapa de transformación. El número de ciclos debe ser suficiente para permitir la obtención de yemas completamente transformadas. Generalmente, deben aplicarse 3 ciclos, pero podría ser necesario, en determinadas especies o con determinadas técnicas de transformación, llevar a cabo más, por ejemplo 4, 5 ó 6 ciclos.

De forma general, cada etapa de cultivo en un medio de cultivo dura aproximadamente 15 días pero puede variar entre 1 y 3 semanas, según la especie. La duración de cada etapa de cultivo debe ser suficiente para permitir la aparición de brotes que presentan por lo menos una hoja. Si el ciclo de selección se repite 3 veces, la duración total de la etapa de cultivo selectivo será de aproximadamente 6 semanas, el agente selectivo está presente durante la totalidad de dicho periodo. Si es necesario, se puede incorporar asimismo un gen trazador, por ejemplo GUS, en el momento de la transformación para permitir el análisis del estado de la transformación.

La eficacia del procedimiento de la presente invención es inesperada ya que el conjunto de las etapas de cultivo selectivo según la invención, presenta una duración sensiblemente más elevada que la practicada habitualmente (por ejemplo 6 semanas en vez de 2 semanas). Ahora bien, la mayoría de autores han indicado que la kanamicina presentaba unos efectos nefastos sobre la regeneración de la planta (Schrammeijer et al., Plant Cell Rep. 9: 55-60, 1990). Los procedimientos de transformación y de regeneración, desarrollados hasta la actualidad, tenían por lo tanto la tendencia a minimizar la duración de la etapa de selección (Bidney et al., Proc. 13º Int. Sunflower Conf. Vol II, Pisa Sept 1992). De hecho los inventores actuales han demostrado que un periodo de cultivo selectivo prolongado sobre kanamicina no ejerce ningún efecto inhibidor sobre la regeneración de la planta, contrariamente a lo se han indicado en la bibliografía.

En cuanto a la etapa de transformación del explante meristemático, se puede emplear cualquier técnica adecuada. Dicha etapa comprende el contacto del explante meristemático con Agrobacterium que contiene una secuencia heteróloga destinada a ser introducida en las células vegetales, en unas condiciones que permiten la transferencia del ADN.

Se pueden citar a modo de ejemplo de técnicas de transformación, el bombardeo del explante meristemático con unas micropartículas, el contacto del explante con Agrobacterium se realiza o bien de forma simultánea, o bien después del bombardeo. Dicha técnica permite realizar un número elevado de microheridas en el explante, lo que es necesario para la transferencia del ADN por Agrobacterium. En el caso de un bombardeo y de una transformación simultánea, se envuelven las micropartículas con Agrobacterium (EP-A-0486234). Preferentemente, el contacto con Agrobacterium se lleva a cabo después de un bombardeo aplicando por ejemplo la técnica utilizada en el documento EP-A-0486233. Las micropartículas están constituidas normalmente de oro o de tungsteno.

Otra técnica de transformación consiste en poner en contacto el explante meristemático con una suspensión de Agrobacterium. En este caso, resulta preferible realizar unas heridas sobre el explante, por ejemplo cortándolo con un escalpelo, para facilitar la transformación.

La etapa de transformación comprende asimismo un periodo de cocultivo del explante con Agrobacterium. Esta presenta una duración de 2 a 4 días, resultan preferibles 3 días. El medio de cocultivo puede ser cualquier medio normalmente utilizado para esta finalidad. Un medio particularmente ventajoso es el medio M2 al que se añade BAP, como se describe en los ejemplos siguientes.

El Agrobacterium es principalmente Agrobacterium tumefaciens. Se pueden emplear varias cepas, por ejemplo la cepa GV2260 o LBA 4404. Como vector, se puede citar el plásmido binario pGA 492-GI, o incluso el p35 GUS intrón. La pareja "cepa/vector" puede influir en la eficacia de la transformación. Resulta preferible utilizar la cepa LBA 4404 con el vector pGA 492-GI.

La secuencia de ácido nucleico destinada a ser introducida en las células vegetales presenta todas las secuencias susceptibles de conferir a la planta unos rasgos de interés agronómico. Se puede citar como ejemplo una secuencia que confiere una resistencia a los insectos, a los herbicidas o a las patologías fúngicas (por ejemplo Sclerotinia sclerotorium o Botrytis cinerea, uno o varios genes de las proteínas de reserva de semillas, o que mejoran la calidad de las proteínas de reserva, de las secuencias que modifican la maduración del fruto, de las secuencias que confieren una resistencia a los virus, uno o varios ribozimas, una o varias secuencias anti-sentido, uno o varios genes implicados en el metabolismo de los ácidos grasos o de los aminoácidos o uno o varios genes implicados en la esterilidad masculina.

Además, la secuencia heteróloga comprende asimismo una secuencia que codifica para un agente que permite la selección de transformantes, por ejemplo un agente que confiere una resistencia a un antibiótico como la kanamicina, a la G418 o la neomicina. El vector comprende las secuencias reguladoras necesarias para la expresión estable de la secuencia heteróloga. Como promotor se puede citar el promotor 35S, el 35S doble con el potenciador (enhancer) de la traducción \Omega o el promotor de la ubiquitina que procede del girasol. Resulta particularmente preferible el terminador de NOS.

Las etapas de transformación y de cultivo selectivo descritas anteriormente forman parte de un conjunto de operaciones que permiten, a partir del explante, regenerar unas plantas transgénicas. El procedimiento de la invención, en su conjunto, puede resumirse de este modo:

1. Preparación del explante meristemático;

2. Utilización de la etapa de transformación del explante, como se ha descrito anteriormente;

3. Utilización de la serie de etapas de selección, como se ha expuesto anteriormente;

4. Regeneración de plantas transgénicas a partir de unas estructuras obtenidas al final de los ciclos de selección.

Según el procedimiento de la invención, la preparación del explante meristemático consiste en una etapa de precultivo de un meristemo apical, o de un semi-meristemo apical, durante 5 a 30 días, preferentemente entre 5 a 8 días.

El medio de precultivo es un medio se cultivo celular vegetal al que se ha añadido una citoquinina y más particularmente 6-Bencilaminopurina (denominada a continuación como BAP). Preferentemente, el medio es el medio MS (Murashige-Skoog) al que se han añadido de 0,05 a 2,0 mg/l de BAP, por ejemplo 0,1 mg/l de BAP, sin otra hormona adicional.

Los inventores han demostrado que la etapa de precutlivo y suduración ejercen una influencia importante sobre el desarrollo del explante. Cuando tiene una duración superior a 9 ó 10 días, aparecen en las hojas unas yemas foliares neoformadas. Los brotes regenerados sobre el meristemo apical presentan por lo tanto unas hojas que presentan unas yemas foliares neoformadas sobre la epidermis superior.

Según esta variante de la invención, es posible antes de la etapa de transformación, extirpar las yemas foliares neoformadas o bien simplemente extraer unos trozos de las hojas, y utilizarlos en la etapa de transformación. Según una forma de realización de la invención, el explante meristemático sometido a la transformación puede por lo tanto estar constituido ya sea por una parte de una hoja obtenida después de por lo menos 9 días de precultivo susceptible de proporcionar unas yemas foliares neoformadas, o bien por unas yemas foliares neoformadas extirpadas.

En el caso en el que el precultivo dura entre 5 y 12 días, el meristemo apical sirve normalmente directamente de explante meristemático en la etapa de transformación. En este caso, las yemas foliares neoformadas son inducidas durante la etapa de precultivo propiamente dicha, pero sólo aparecen durante el desarrollo posterior, por ejemplo durante el cocultivo o durante el cultivo sobre un medio selectivo.

Según la invención, se puede utilizar el mismo medio de cultivo para las etapas de precultivo, de cocultivo y de selección. Dicho medio es preferentemente el medio MS al que se ha añadido BAP a una concentración de 0,05 a 2,0 mg/l, preferentemente 0,1 mg/ml. Normalmente, la BAP es la única fitohormona presente en el medio. En particular, resulta preferible que dicho medio no contenga ni ácido giberélico ni ácido indolacético, particularmente cuando se trata de un medio de precultivo. Se puede añadir asimismo al medio, durante las etapas de precultivo y de cocultivo, un compuesto fenólico, por ejemplo, la acetosiringona, capaz de activar los genes vir de Agrobacterium. Se considera adecuada una concentración de aproximadamente 200 \muM. Para la etapa de cultivo selectivo, el medio contiene por lo menos un agente selectivo, ventajosamente la kanamicina, a una concentración comprendida entre 50 y 200 mg/l, preferentemente 50 mg/l, y eventualmente, unos agentes bacteriostáticos.

Los meristemos apicales se obtienen mediante la germinación de semillas maduras descorticadas y esterilizadas. El procedimiento de germinación consiste generalmente en el cultivo de las semillas en un medio de germinación, preferentemente solidificado, por ejemplo el medio MS en el que los macro- y microelementos están eventualmente reducidos a la mitad. La germinación tiene una duración comprendida entre 2 a 4 días, preferentemente 4 días, a una temperatura preferentemente de 25ºC con un fotoperiodo de 16 horas aproximadamente.

Después de las etapas de precultivo, de transformación y de selección, se lleva a cabo una etapa de regeneración a partir de las yemas y de los brotes completamente transformados. Los medios de cultivo y las condiciones son las que se aplican habitualmente en la técnica para la especie en cuestión. Para el girasol, las condiciones de regeneración están indicadas en los ejemplos siguientes.

Además del procedimiento de producción de plantas transgénicas descritos anteriormente, la presente invención se refiere asimismo a las yemas foliares neoformadas y los meristemos secundarios completamente transformados obtenidos a lo largo del procedimiento. Se refiere asimismo a las plantas transgénicas completamente transformadas en generación T_{0} obtenidas a partir de unos explantes meristemáticos.

El procedimiento de la invención presenta numerosas ventajas. Resulta especialmente más eficaz que los procedimientos de la técnica anterior ya que la regeneración sólo se realiza si el explante se ha transformado completamente. Las técnicas existentes implicaban, por el contrario, la regeneración de todos los meristemos que han sufrido la operación de transformación, seguida de la selección, de entre las plantas quiméricas obtenidas, aquellas cuya línea germinal se había transformado. El procedimiento de la invención permite por lo tanto un ahorro de tiempo y de medios importante.

Además, el rendimiento, en plantas transgénicas obtenidas según dicho procedimiento resulta particularmente más elevado que el obtenido según las técnicas anteriores. Por ejemplo, para el girasol, el 92% de las plantas regeneradas proporcionan por lo menos una planta transgénica en la descendencia (tabla 8 siguiente). Dicho número debe compararse con 0,2% al 2% referido por Bidney et al, Plant Molecular Biol., 18, 301-313, 1992.

El procedimiento de la invención se aplica a numerosas especies vegetales y más particularmente a las dicotiledóneas, principalmente a las que son difíciles de transformar y de regenerar. Se citará por ejemplo el algodón, la soja, las especies vegetales oleaginosas, por ejemplo el girasol, las especies que pertenecen a la familia de las leguminosas, por ejemplo el guisante, la judía o incluso las especies que pertenecen a la familia de las cucurbitáceas, por ejemplo el calabacín. Dentro de dichas especies, se pueden emplear numerosos genotipos diferentes. El girasol resulta particularmente preferido.

Se ilustran diferentes aspectos de la invención en las figuras:

La figura 1 muestra el protocolo de transformación de hojas obtenidas de semi-meristemos para el análisis de la expresión de la Glucuronidasa en los brotes axilares regenerados a partir de las yemas foliares neoformadas.

Leyenda

1-

semilla

2-

medio de germinación M0, 2 días

3-

disección de los ápices; eliminación de los cotiledones, de la radícula y de la primera hoja

4-

sección del ápice en dos mitades

5-

precultivo de los semi-meristemos en el medio M2 que contiene acetosiringona a 200 \muM durante 30 días

6-

yema foliar neoformada

7-

brotes axilares inducidos a partir de semi-meristemos

8-

extracción de las hojas que presentan unas yemas foliares neoformadas iniciadas en la cara superior

9-

extracción de las hojas sin yema foliar neoformada

10-

bombardeo y 3 días de cocultivo con Agrobacterium tumefaciens de las hojas sobre el medio M2 que contiene la acetosiringona a 200 \muM

11-

cultivo en el medio M2 que contiene augmentin a 400 mg/l durante 15 días

12-

brotes axilares

13-

desarrollo de yemas foliares neofomadas en brotes axilares

14-

análisis de la expresión de la glucuronidasa en los brotes axilares inducidos a partir de yemas foliares neoformadas aparecidas sobre las hojas

15-

explante foliar

16-

focos de células transformadas GUS+

17-

zonas celulares transformados GUS+

18-

líneas celulares transformados GUS+

19-

yemas axilares transformadas GUS+

La figura 2 muestra el protocolo de transformación de semi-meristemos para el análisis de la expresión de la Glucuronidasa.

Leyenda

1-

semilla

2-

medio de germinación M0, 2 días

3-

disección de los ápices; eliminación de los cotiledones, de la radícula y de la primera hoja

4-

sección del ápice en dos mitades

5-

precultivo de los semi-meristemos en el medio M2 que contiene acetosiringona a 200 \muM durante 5 días

6-

bombardeo y 3 días de cocultivo con Agrobacterium tumefaciens de los semi-meristemos en el medio M2 que contiene la acetosiringona a 200 \muM

7-

cultivo de los semi-meristemos bombardeados y cocultivados en el medio M2 que contiene augmentin a 400 mg/l durante 15 días

8-

yema foliar neoformada

9-

brotes axilares inducidos a partir los semi-meristemos

10-

brote axilar

11-

cal en la base

12-

análisis de la expresión de la glucuronidasa en los brotes axilares inducidos a partir de semi-meristemos

13-

focos de células transformadas GUS+

14-

zonas celulares transformadas GUS+

15-

yemas foliares neoformadas transformadas GUS+

16-

líneas celulares transformados GUS+

17-

yemas axilares transformadas GUS+

La figura 3 muestra la selección de brotes axilares transformados y regenerados a partir de yemas foliares neoformadas sobre las hojas o a partir de semi-meristemos.

Leyenda

1-

semi-meristemos bombardeados y cocultivados según el protocolo definido en el ejemplo 2

2-

hojas obtenidas de los semi-meristemos bombardeados y cocultivados según el protocolo definido en el ejemplo 1

Primer cultivo de selección sobre kanamicina

3-

yema foliar neorformada verde resistente a la kanamicina

4-

cultivo de los explantes en el medio M2 que contiene augmentin a 400 mg/l y kanamicina a 50 mg/ml durante 15 días

5-

parte blanca no transformada sensible a la kanamicina

6-

brote axilar verde resistente a la kanamicina

7-

parte verde transformada resistente a la kanamicina

8-

extracción de los brotes axilares verdes

9-

extracción de los brotes foliares neoformados verdes. Segundo cultivo de selección sobre kanamicina:

10-

cultivo de los brotes axilares verdes, de los brotes foliares neorformados verdes y de los pousses axilares verdes en el medio M2 que contiene augmentin a 400 mg/l y kanamicina a 50 mg/ml durante 15 días

11-

brote foliar neorformado verde resistente a la kanamicina

12-

parte blanca no transformada sensible a la kanamicina

13-

yema axilar verde resistente a la kanamicina

14-

parte verde resistente a la kanamicina

15-

brote axilar verde resistente a la kanamicina

16-

extracción de las yemas axilares verdes

17-

extracción de las yemas foliares neoformadas verdes

18-

extracción de los brotes axilares verdes

La figura 4 muestra la regeneración de plantas transformadas.

Leyenda Tercer cultivo de selección sobre kanamicina

1-

cultivo de las yemas axilares verdes, de las yemas foliares neoformadas verdes y de los brotes axilares verdes en el medio M2 que contiene augmentin a 400 mg/l y kanamicina a 50 mg/ml durante 15 días

2-

extracción de los brotes axilares verdes

3-

brote axilar quimérico con unas partes blancas no transformadas y unas partes verdes transformadas,

4-

cultivo en el sistema SORBAROD al que se ha añadido medio M3 durante 30 días en la cámara de cultivo

5-

enraizamiento

6-

lavado del medio M3, adición de medio M4

7-

planta enraizada

8-

cultivo en el sistema SORBAROD durante 10 días en cámara de cultivo

9-

planta no arraigada

10-

desarrollo

11-

cultivo en el sistema SORBAROD en invernadero durante 10 días

12-

desarrollo y aclimatación

13-

repicado en turba en unos tiestos de las plantas enraizadas, injerto sobre porta-injertos de unas plantas no enraizadas, cultivo en invernadero

14-

floración, autofecundación

15-

crecimiento.

Ejemplo 1 Transformación de hojas obtenidas de semi-meristemos para el análisis de la expresión de la glucuronidasa en los brotes regenerados a partir de yemas foliares neoformadas (Figura 1) 1.1 Preparación de los semi-meristemos

Se utilizan para estos experimentos las semillas de girasol (Helianthus annuus) de las líneas (Ha300, RHa 274, RHa 297, RHa 356, RHa 359 RHa 362), dos poblaciones LG60 y LG61 derivados de crecimientos interespecíficos con Helianthus petiolaris y diversas líneas suministradas por LIMAGRAIN GENETICS (Les Alleuds). Las semillas se descortican para eliminar los tegumentos, después se esterilizan durante 20 minutos en lejía a 12º de cloro al que se han añadido 1 ml/l de Tween 80. Las semillas descorticadas se lavan a continuación 5 veces con agua destilada estéril. Las semillas se ponen en remojo a continuación 1 hora en agua destilada estéril, después se elimina la película que recubre la semilla. Las semillas desnudas se esterilizan de nuevo 2 minutos en lejía a 6º de cloro, se lavan 3 veces con agua destilada estéril y se secan sobre papel de filtro en la campada de flujo laminar. Las semillas secas se ponen a continuación a germinar después en medio M0: macroelementos, microelementos, Fe-EDTA y vitaminas del medio MS (Murashige y Skoog, 1962- Physiologia Plantarum, 15: 473-497) al que se ha añadido 10 g/l de sacarosa, de 7 g/l de agar-agar, pH 5,8; y se han puesto a germinar en una cámara de cultivo a una temperatura de 26º con 16 horas de luz (50 \mu Einstein/m2 de intensidad lumínica), durante dos días. Las semillas germinadas se extraen, se eliminan los cotiledones y las radículas así como la parte apical del ápice. El cilindro de algunos milímetros de diámetro obtenido de este modo se corta a continuación en dos mitades en el eje de las inserciones cotiledóneas. Dicho explante que contiene un semi-meristemo apical se denomina semi-meristemo.

1.2- Cultivo de los semi-meristemos

Los semi-meristemos se ponen a continuación en cultivo en el medio M2 (macroelementos, microelementos, Fe-EDTA y vitaminas del medio MS) al que se han añadido 10 g/l de sacarosa, 0,1 mg/l de BAP, 8 g/l de agar-agar, pH: 5,8 a 6) que contiene 200 \muM de acetosiringona durante 30 días en una sala de cultivo a una temperatura de 26ºC con 16 horas de luz (50 \mu Einstein/m2 de intensidad lumínica). Durante este periodo de cultivo los semi-meristemos desarrollan unos brotes procedentes de los meristemos secundarios en la axila de los primordios foliares. Después de 10 días de cultivo, aparecen unas protuberancias en la cara superior de las hojas. Dichas protuberancias, que son unos meristemos foliares neoformados se transforman en yemas foliares neoformadas (Figura 1). Dichas yemas se obtienen a partir de neoformaciones de meristemos vegetativos a partir de las células epidérmicas y subepidérmicas de la cara superior de las hojas.

Después de 30 días de cultivo, se extraen las hojas que presentan unos meristemos secundarios o unas yemas foliares neoformadas y las hojas sin yemas foliares neoformadas. (Figura 1).

1.3 Bombardeo y cocultivo de las hojas obtenidas de semi-meristemos

Dichas hojas son bombardeadas con un cañón de partículas de helio (Particle Inflow Gun, PIG) (FINER et al, 1992- Plant Cell Reports, 11: 323-328) con unas partículas de tungsteno (0,2 \mum a 2 \mum de diámetro) para realizar unas microheridas sobre los explantes.

Las partículas de tungsteno (50 mg) se esterilizan en 500 \mul de etanol al 95% durante 20 minutos después se lavan 4 veces por centrifugación en agua estéril (10.000 rpm durante 1 minuto). Las partículas estériles se recuperan en 300 \muL de tampón TE (Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM). Se ha utilizado un volumen de 2 \mul de partículas desnudas para cada bombardeo. Se depositan las hojas con la cara superior hacia arriba sobre una plana de Petri de 5 cm de diámetro que contiene agua gelificada a 15 g/l. Las placas de Petri que contienen los explantes se colocan dentro de un cañón y se aplica un vacío de 29 inchs de Hg. El bombardeo de las partículas se lleva a cabo a una presión de 8 bares a una distancia de 16 cm entre el cañón y los explantes a bombardear.

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Los explantes bombardeados se colocan a continuación en una placa de Petri de 9 cm de diámetro que contiene el medio M2 al que se han añadido 200 \muM de acetosiringona. Se deposita sobre el explante una gota (1 a 10 \mul) de una suspensión de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 desarmada (HOEKEMA et al., 1983- Nature, 303: 179-180) procedente de un cultivo over-night a una densidad óptica Do = 2 a una longitud de onda de 600 nm. La cepa LBA 4404 contiene el vector binario pGA492-GI (AN, 1986- Plant Physiol, 81: 86-91) portador del gen NPTII que confiere la resistencia a la kanamicina bajo el control del promotor pNOS (HERRERA ESTRELLA et al., 1983- EMBO J., 2: 987-995) y del terminador t-NOS (DEPICKER et al, 1982- Mol. Appl. Genet., 1: 561-573) en el que se ha insertado en el sitio Sca I, el gen GUS intrón bajo el control del promotor p35S del CaMV y del terminador t-NOS (VANCANNEYT et al., 1990-Mol. Gen. Genet., 220:245-250). Los explantes bombardeados e inoculados con Agrobacterium tumefaciens se cocultivan durante 3 días a una temperatura de 26ºC con 16 horas de luz (50 \mu Einstein/m^{2}). La asociación del bombardeo con unas partículas desnudas y el cocultivo con Agrobacterium tumefaciens permite provocar mediante el bombardeo unas microheridas en las células de las hojas y en los meristemos secundarios. Dichas microheridas aseguran la penetración de la bacteria y una mayor eficacia de transformación según el procedimiento de Bidney et al, 1992 (Plant Mol. Biol., 18, 301-313).

1.4- Cultivo de las hojas y regeneración de brotes a partir de yemas foliares neoformadas

Después del cocultivo, los explantes son repicados en una placa de Petri que contiene medio M2 al que se ha añadido augmentin a 400 mg/ml y se colocan durante 15 días en una cámara de cultivo (16 horas de luz, 15 \mu Einstein/m^{2}, 23ºC y 8 h de oscuridad, 21ºC).

Después de 15 días de cultivo, las yemas foliares neoformadas aparecidas o ya presentes sobre las hojas bombardeadas y cocultivadas, se han desarrollado en brotes que presentan de 1 a 5 hojas y un tallo corto. Dichos brotes se separan y se colocan en un tampón para el análisis de la actividad glucuronidasa (Figura 1).

1.5 Análisis de la actividad glucuronidasa en los brotes obtenidos de yemas foliares neotransformadas

Los brotes obtenidos de las yemas foliares neoformadas se sumergen en un tampón GUS que contiene 1 mg/ml de X-gluc. (ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucurónico ciclohexilamonio) (JEFFERSON, 1987- Plant Mol. Biol. Rep., 5: 387-405) infiltrados al vacío e incubados 24 h a 37ºC en la oscuridad.

Después de 24 h de incubación, las células transformadas que han expresado el gen GUS, presentan una actividad glucuronidasa (descritas actividad GUS+), son capaces de hidrolizar el X-Glu y liberan un compuesto de color azul.

Diferentes tipos de zonas de células transformadas que presentan una actividad GUS+ resultan visibles después de una incubación de 24 h (Figura 1).

-

Unos focos de algunos milímetros de diámetro localizados en la superficie de las hojas de los brotes regenerados a partir de meristemos foliares neoformados. Dichos focos proceden de células de meristemos foliares neoformados transformados en el momento del bombardeo y del cocultivo.

-

Unas zonas amplias de células transformadas pueden ser o bien unos discos azules de diámetro superior a 5 mm o bien unas semi-hojas azules, o bien unas líneas de células azules. Dichas zonas amplias proceden de células transformadas situadas en el interior de los meristemos de yemas foliares neoformados que han dado lugar a unas descendencias celulares completamente transformadas (semi-hojas-discos y líneas celulares).

-

En algunos casos, se han observados unas yemas o meristemos secundarios azules que expresan la glucuronidasa en la axila de las hojas de los brotes. Dichos meristemos secundarios se han transformado completamente. Proceden o bien de células internas de los meristemos foliares neoformados y cocultivados que han producido a lo largo del crecimiento y de la diferenciación un brote axilar en la axila de una hoja, o bien de células transformadas en la superficie de la hoja que ha neoformado unos meristemos foliares neoformados y después de una yema secundaria.

Los resultados de la tabla 1 ilustran el porcentaje de hojas bombardeadas y cocultivadas que han proporcionado unos brotes que presentan unos focos de células GUS+, ya sea de zonas amplias de células GUS+, o bien de los meristemos secundarios GUS. La mayoría de explantes foliares bombardeados regeneran unos brotes a partir de yemas foliares neoformadas que contienen unos focos GUS+ (80%), y de unas zonas amplias GUS+ (55%). Dichos brotes son unas plántulas quiméricas compuestas de una mezcla de células transformadas y no transformadas.

100

Dichos brotes proporcionarán una descendencia transformada genéticamente únicamente si existen unas células transformadas en la zona del meristemo que contiene las células germinales origen de los óvulos o de las semillas de polen. Por otra parte, el 2% de explantes foliares bombardeados y cocultivados contienen unas yemas axilares transformadas situadas en la axila de las hojas llevadas por los brotes obtenidos a partir de yemas axilares neoformadas. El origen unicelular de dichas yemas axilares implica que están completamente transformadas y proporcionarán una descendencia de plantas transformadas según la segregación Mendeliana (por lo menos ¾ de las plantas transformadas y ¼ de plantas no transformadas).

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Ejemplo 2 Transformación de semi-meristemos para el análisis de la expresión de la glucuronidasa en los brotes regenerados a partir de semi-meristemos (Figura 2) 2.1 Preparación de los semi-meristemos

La preparación de los semi-meristemos es idéntica a la presentada en el ejemplo 1 (parte 1.1).

2.2 Precultivo de los semi-meristemos

Los semi-meristmeos se ponen en precultivo durante 1, 5, 8 y 12 días en el medio M2 que contiene acetosiringona a 200 \muM a una temperatura de 26ºC con 16 h de luz (50 \mu Einstein/m^{2}).

Después del precultivo los semi-meristemos forman pequeños brotes desarrollados a partir de los meristemos secundarios y del meristemo apical. El desarrollo de dichos brotes está en función de la duración de precultivo. Cuanto más largo es el periodo de precultivo, más se desarrollan los brotes. A los 12 días de precultivo, los brotes presentan unas hojas y unas yemas foliares neoformadas en la superficie superior de las hojas (Figura 2).

2.3 Bombardeo y cocultivo de los semi-meristmeos precultivados

Después del precultivo, se bombardean los semi-meristemos y se cocultivan según el protocolo descrito en el ejemplo 1 parte 1.3.

2.4 Cultivo de los semi-meristemos bombardeados y cocultivados

Los semi-meristemos una vez precultivados, bombardeados y cocultivados se ponen en cultivo en unas placas de Petri de 9 cm de diámetro que contiene el medio M2 al que se han añadido 400 mg/l de augmentin y se han colocado en una cámara de cultivo (16 horas de luz, 15 \mu Einstein/m^{2}, a una temperatura de 23ºC y 8 horas de oscuridad, 21ºC).

Después de 15 días de cultivo, se han desarrollado varios brotes que presentan de 1 a 5 hojas y un tallo a partir de las yemas axilares, del meristemo apical y también de las yemas foliares neoformadas aparecidas en la superficie superior de las hojas.

2.5 Análisis de la actividad glucuronidasa en los brotes obtenidos de los semi-meristemos (Figura 2)

Los brotes formados a partir de unos semi-meristemos se separan y se analizan para la expresión de la actividad glucuronidasa. Las condiciones del ensayo de la actividad glucuronidasa se describen en el ejemplo 1 parte 1.5. Se han observados unas zonas de células que presentan actividad glucuronidasa (Figura 2):

-

unos focos de células transformadas azules que expresan la glucuronidasa (GUS+)

-

unas zonas amplias de células o de líneas celulares que expresan la glucuronidasa (GUS+)

-

unos meristemos secundarios en la axila de las hojas completamente azules que expresan la glucuronidasa (GUS+)

-

además en el caso de las transformaciones de los semi-meristemos precultivados (1 a 12 días) de las yemas foliares neoformadas transformadas GUS+ aparecen en la cara superior de las hojas (Figura 2). Dichas yemas foliares neoformadas se obtienen de células transformadas localizadas sobre las hojas jóvenes en el momento del bombardeo y del cocultivo del meristemo. Dichas células se desarrollan rápidamente en yemas foliares neoformadas. El origen unicelular de dichas yemas foliares neoformadas permite obtener unas yemas completamente transformadas que proporcionarán unas plantas completamente transformadas.

1

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Las frecuencias de transformación obtenidas por bombardeo de los semi-meristemos son elevadas, 38 al 70% de los semi-meristemos bombardeados y cocultivados presentan unos focos GUS+ y del 26 al 47% presentan unas amplias zonas de GUS+ (Tabla 2).

Los porcentajes de semi-meristemos bombardeados y cocultivados que presentan unas amplias zonas GUS+ son los más elevados cuando los semi-meristemos se precultivan 5 días (40%) y 8 días (47%) (Tabla 2).

Sólo los semi-meristemos precultivados 5 días han proporcionado unos brotes con unas yemas axilares o foliares neoformadas completamente azules.

Dichas yemas axilares o foliares neoformadas completamente transformadas proporcionarán unas plantas completamente transformadas cuya descendencia será por lo menos de ¾ de plantas transformadas y de ¼ de plantas no transformadas. Una duración de 5 días de precultivo es por lo tanto la duración óptima para el protocolo estándar descrito en la presente invención.

Ejemplo 3 Transformación de semi-meristemos o de hojas obtenidas de semi-meristemos (Figuras 3 y 4) 3.1- Transformación de hojas obtenidas de semi-meristemos

La preparación y el precultivo de los semi-meristemos, el bombardeo y el cocultivo de las hojas obtenidas de semi-meristemos se han realizado según el protocolo descrito en el ejemplo 1 (partes 1.1, 1.2 y 1.3).

3.2- Transformación de los semi-meristemos

La preparación, el precultivo, el bombardeo y el cocultivo de los semi-meristemos se han realizado según el protocolo descrito en el ejemplo 2 (partes 2.1, 2.2 y 2.3).

3.3- Selección de los brotes resistentes a la kanamicina 3.3.1- Primer cultivo en selección en presencia de kanamicina (Figura 3)

Después del cocultivo, los explantes (semi-meristemos u hojas) se colocan en una placa de Petri de 9 cm de diámetro que contiene el medio M2 al que se han añadido 400 mg/l de augmentin y 50, 100, 200 y 400 mg/l de kanamicina.

Las placas que contienen los explantes se colocan en una cámara de cultivo (16 horas de luz, 15 \mu Einstein/m^{2}, a una temperatura de 23ºC y 8 horas de oscuridad, 21ºC) durante 15 días de cultivo. A lo largo de dicho cultivo, los explantes se desarrollan para proporcionar unos brotes que presenten de 1 a 5 hojas y un tallo corto (Figura 3).

Después de 15 días de cultivo en el medio de cultivo selectivo que contiene la kanamicina, los brotes regenerados presentan unos aspectos diferentes según la cantidad de células transformadas resistentes a la kanamicina que los componen:

-

unos brotes que presentan unos hojas con unas zonas blancas o amarillas compuestas de células no transformadas sensibles a la kanamicina y de zonas verdes compuestas de células transformadas resistentes a la kanamicina.

-

unos brotes que presentan unas yemas axilares verdes en la axila de las hojas a lo largo del desarrollo. Dichas yemas axilares verdes se transforman y se desarrollan en brotes axilares en presencia de kanamicina.

-

unos brotes que presentan sobre sus hojas unas yemas foliares neoformadas amarillas o blancas no transformadas, sensibles a la kanamicina.

-

unos brotes completamente blancos o amarillos no transformados, sensibles a la kanamicina

-

unos brotes que presentan sobre las hojas unas yemas o unos meristemos foliares neoformados verdes en desarrollo, resistentes a la kanamicina.

3.3.2- Segundo cultivo de selección en presencia de kanamicina (Figura 3)

Los brotes axilares, las yemas axilares verdes y los meristemos o brotes foliares neoformados verdes se repican en el medio M2 que contiene augmentin a 400 mg/l y de kanamicina (50-100-200 y 400 mg/l) y se incuban en las mismas condiciones de cultivo que las descritas anteriormente (parte 3.3.1) durante 15 días.

Después de dicho periodo de cultivo, las yemas axilares y las yemas foliares neoformadas han desarrollado nuevamente unos brotes (Figura 3).

-

determinados brotes no transformados están completamente blancos lo que indica una sensibilidad a la kanamicina.

-

determinados brotes presentan unas hojas que presentan unas partes verdes compuestas de células transformadas resistentes a la kanamicina y unos partes blancas compuestas por células no transformadas sensibles a la kanamicina.

La presencia de brotes, no completamente transformados indica que al final del primer cultivo todas las yemas axilares y yemas foliares neoformadas no se han transformado completamente y han dado lugar a unos brotes quiméricos compuestos por una mezcla de células transformadas y no transformadas.

-

determinados brotes quiméricos presentan unos meristemos secundarios o unas yemas axilares verdes resistentes a la kanamicina.

-

determinados brotes quiméricos presentan unas hojas con las zonas verdes y unas zonas blancas que presentan unas yemas o meristemos foliares neoformados verdes resistentes a la kanamicina.

-

determinados brotes presentan unas hojas verdes que presentan unas yemas axilares o unos meristemos secundarios verdes. Dichos brotes compuestos de células transformadas son resistentes a la kanamicina.

Dichos brotes completamente verdes que proceden de las yemas axilares o de las yemas o meristemos foliares neoformados se desarrollan. Dichos brotes están compuestos por un gran número de células transformadas resistentes a la kanamicina.

En los brotes obtenidos al final del segundo cultivo, se han observado un determinado número de brotes completamente verdes mientras que al final del primer cultivo, no se ha observado ningún brote completamente verde, lo que indica que algunas yemas axilares o foliares neoformadas cultivadas en el segundo cultivo en presencia de kanamicina se han transformado completamente.

3.3.3- Tercer cultivo de selección en presencia de kanamicina (Figura 4)

Los brotes completamente verdes, las yemas axilares verdes y las yemas o meristemos o brotes foliares neoformados verdes se separan y se repican en el medio M2 y se cultivan como se ha descrito anteriormente (parte 3.3.1) (Figuras 3 y 4).

Después de 15 días de cultivo se han desarrollado unos brotes a partir de dichos explantes. La mayoría de los brotes son completamente verdes y se desarrollan rápidamente sobre el medio M2 que contiene kanamicina. Dichos brotes están completamente transformadas. Un pequeño número de brotes presenta todavía unas zonas verdes y unas zonas de células blancas. Se han eliminado dichos brotes quiméricos (Figura 4).

Sólo se han repicado los brotes verdes en un sistema de cultivo SORBAROD. El sistema de cultivo SORBAROD consiste en un mini-invernadero cerrado y estéril que contiene unos cilindros de celulosa humidificados con el medio M3 (macro-elementos, microelementos, Fe-EDTA y vitaminas del medio MS) al que se han añadido 10 mg/l de sacarosa. El mini-invernadero se ha perforado con 3 orificios recubiertos por una membrana que asegura los intercambios gaseosos y que equilibra la humedad relativa interior con la humedad relativa exterior.

Los brotes verdes obtenidos del tercer cultivo se plantan en unos cilindros de celulosa y se instalan en los mini-invernaderos SORBAROD (Figura 4). Los mini-invernaderos se colocan en una cámara de cultivo (16 horas de luz, a una temperatura de 23ºC, 15 \mu Einstein/m^{2} y 8 horas de oscuridad, 21ºC). Después de 30 días de incubación, las plantas transformadas se enraizan y se desarrollan. A continuación se elimina el medio M3 mediante pipeteado y se lavan los cilindros 3 veces con agua destilada estéril después se humidifican los cilindros con el medio M4 (macro-elementos, microelementos, Fe-EDTA y vitaminas del medio MS) desprovistos de sacarosa. Después de 10 días de cultivo en una cámara de cultivo, las plantas desarrollan unas grandes hojas y alcanzan un tamaño de 2 a 3 cm. Los mini-invernaderos SORBAROD se transfieren al invernadero (temperatura 26ºC-fotoperiodo 16 h/8 h) durante 10 días. Durante este periodo, las plantas enraizadas se desarrollan y se aclimatan a las condiciones del invernadero. Después, los cilindros que presentan las plantas de girasol que han desarrollado unas raíces y unas hojas se colocan en unos tiestos que contienen la turba regada con una solución de tipo COIC y LESAINT (1971-Hortic. Fr., 8:11).

Las plantas no enraizadas se injertan sobre unos tallos de porta-injertos (girasol no transformado estadio 4 a 6 hojas después del nacimiento). La base del tallo de la planta transformado se recorta en bisel y se colocan en una escisión realizada sobre el tallo del porta-injerto. El injerto se fija al porta-injerto mediante una unión de rafia y se envuelve con una bolsa de plástico. Después de que prenda el injerto, las hojas y el tallo se desarrollan y se quita la bolsa de plástico. A continuación, los porta-injertos y los injertos se ponen en el invernadero con un riego con la solución del tipo COIC y LESAINT (1971-Hortic. Fr., 8:11).

Las plantas de girasol crecen, florecen y se autofecundan. Las semillas de cada planta transformada se recogen para el análisis de la segregación del gen de resistencia a la kanamicina y del gen GUS (ver, por ejemplo 8).

Ejemplo 4 Influencia de la cepa bacteriana y del plásmido binario sobre la eficacia de transformación genética de las hojas obtenidas de los semi-meristemos

Las hojas obtenidas de los semi-meristemos se bombardean y cocultivan con diferentes cepas:

-

LBA 4404 que contienen el plásmido binario PGA 492-GI (descrito en el ejemplo 1, parte 1.3)

-

GV 2260 que contiene el plásmido binario p35S GUS intrón (VANCANNEYT et al., 1990-Mol. Gen. Genet., 220:245-260)

-

C58'3 (MULLINEAU et al., 1989-Plant Sci, 63: 237-245) que contiene el plásmido pGA 492-GI (Ref. ejemplo 1, parte 1.3)

Después de 6 semanas de cultivo de las hojas (según el protocolo descrito en el ejemplo 3) en un medio selectivo que contiene 100 mg/l o 200 mg/l de kanamicina, los brotes verdes resistentes a la kanamicina se someten a un ensayo de expresión de la actividad glucuronidasa. Cuando las células expresan la actividad glucuronidasa, dicha actividad se denomina como actividad GUS+. El protocolo para ensayar la actividad glucuronidasa se describe en el ejemplo 1, parte 1.5.

Los resultados se presentan en la tabla 3.

2

Solo los brotes regenerados que preceden de los cocultivos con GV 2260 (pGUS intrón) y LBA 4404 (pGA 492- GI) muestran una expresión de la glucuronidasa (actividad GUS+). Con la cepa C58'3 no se ha detectado ninguna actividad GUS+. El porcentaje de explantes bombardeados y cocultivados que muestran por lo menos un brote con unas grandes zonas que expresan una actividad GUS+ es 4 veces más elevado cuando los explantes se cocultivan con la cepa LBA 4404 (pGA 492-GI) que cuando se cocultivan con la cepa GV 2260 (pGUS intrón). Solo la cepa LBA 4404 permite obtener unos brotes o unos meristemos secundarios que presentan una actividad GUS+ en todas las células.

Ejemplo 5 Influencia de la cepa bacteriana y del plásmido binario sobre la eficacia de transformación genética de los semi-meristemos

Los semi-meristemos se bombardean y cocultivan con las cepas LBA 4404 (pGA 492- GI), C58'3 (pGA 492- GI) y GV 2260 (p35S GUS intrón) descritas en el ejemplo 4.

Después de 6 semanas de cultivo según el protocolo descrito en el ejemplo 3, se ha contabilizado el número de semi-meristemos capaces de desarrollar unos brotes en presencia de kanamicina (100 mg/l) (Tabla 4).

Los resultados son los siguientes:

Se ha definido la eficacia de transformación como el porcentaje de semi-meristemos bombardeados y cocultivados que proporcionan por lo menos un brote resistente a la kanamicina.

3

El cocultivo de los semi-meristemos con la cepa LBA 4404 (pGA 492- GI) permite obtener un porcentaje de 4,5% de semi-meristemos que inician unos brotes transformados resistentes a la kanamicina después de 6 semanas en el medio M2 que contiene 100 mg/l de kanamicina. Este porcentaje es 4 veces superior al porcentaje obtenido con la cepa GV 2260 (p35S GUS intrón). Con la cepa C58'3 no se ha obtenido ningún brote resistente a la kanamicina.

Se ha seleccionado la cepa LBA 4404 (pGA 492- GI) para el protocolo estándar (descrito en la figura 3) porque permite obtener de forma rutinaria unos brotes completamente transformados en un número elevado.

Ejemplo 6 Influencia de la concentración de kanamicina sobre la transformación genética de los semi-meristemos

Los semi-meristemos bombardeados y cocultivados con la cepa LBA 4404 (pGA 492- GI) se cultivan durante 6 semanas en presencia de diferentes concentraciones de kanamicina 50, 100, 200 y 400 mg/l en el medio M2 (según el protocolo descrito en el ejemplo 3). Después de 6 semanas de cultivo, los brotes verdes resistentes a la kanamicina se someten a un ensayo de la expresión de la glucuronidasa (protocolo descrito en el ejemplo 1, parte 1.5).

Los resultados son los siguientes (Tabla 5).

4

La Tabla 5 muestra los efectos de la kanamicina sobre el porcentaje de los semi-meristemos que presentan una expresión de la glucuronidasa. Del 25 al 30% de los semi-meristemos bombardeados y cocultivados proporcionan por lo menos un brote que expresa la glucuronidasa en forma de focos sea cual sea la concentración de kanamicina utilizada. Una selección sobre una concentración elevada de kanamicina (200 mg/l ó 400 mg/l) disminuye ligeramente el porcentaje de los semi-meristemos que proporcionan unos brotes con unos focos GUS+ pero reduce sensiblemente el porcentaje de semi-meristemos que proporcionan unos brotes con amplias zonas GUS. Solo las concentraciones de 50 mg/l y 100 mg/l permiten obtener después de la selección 3,3% de brotes completamente transformados. Se ha seleccionado la concentración de 50 mg/l de kanamicina para el protocolo (descrito en las figuras 3 y 4); a dicha concentración de los brotes resistentes y que expresan la glucuronidasa se pueden obtener de forma rutinaria y en número elevado.

Ejemplo 7 Eficacia de transformación de diferentes genotipos de girasol 7.1- Capacidad para la multiplicación vegetativa de los semi-meristemos y para la neoformación de meristemos foliares neoformados

En un experimento preliminar se han seleccionado 50 líneas de girasol por su capacidad para inducir unos brotes axilares a partir de los semi-meristemos y de los meristemos foliares neoformados sobre las hojas de los brotes. Todas las líneas ensayadas regeneran unos brotes axilares a partir de los semi-meristemos con unos porcentajes que varían de 20 a 90%. Todas las líneas ensayadas proporcionan de 7 a 44% de los semi-meristemos que forman unos brotes axilares que presentan unos meristemos foliares neoformados en la superficie superior de las hojas. Más del 60% de las líneas ensayadas proporcionan por lo menos 20% de los semi-meristemos que regeneran unos brotes axilares con uno meristemos foliares neoformados sobre las hojas.

7.2 Capacidad para la transformación de los semi-meristemos

De entre las 50 líneas, se han seleccionado 10 que presentan la capacidad más fuerte para la multiplicación vegetativa de los brotes y la iniciación de los meristemos para evaluar la eficacia de la transformación genética de los semi-meristemos.

Se bombardearon y cocultivaron aproximadamente 200 semi-meristemos para cada una de las 16 líneas con la cepa LBA 4404 (pGA 492-GI), después se pone en cultivo en el medio M2 que contiene 400 mg/l de augmentin y 50 mg/l de kanamicina durante 6 semanas (según el protocolo descrito en el ejemplo 3).

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Después de 6 semanas de selección de los brotes resistentes a la kanamicina (50 mg/l), todas las líneas ensayadas proporcionan por lo menos un semi-meristemo que forma unos brotes axilares resistentes a la kanamicina, lo que muestra que el procedimiento descrito permite obtener unas plantas de girasol completamente transformados para un 100% de las líneas de girasol ensayados (tabla 6).

La eficacia de transformación varía de 0,5 a 6% según las líneas. Las líneas que proporcionan las eficacias de transformación más elevadas (LG15, LG60 y LG61) también tenían las capacidades más fuertes para la multiplicación vegetativa a partir de los semi-meristemos lo que sugiere una correlación positiva entre la capacidad para la transformación mediante el procedimiento descrito en la invención y la capacidad para la regeneración a partir de los semi-meristemos.

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Ejemplo 8 Análisis de las plantas transformadas regeneradas a partir de los semi-meristemos y de su descendencia

Los brotes resistentes a la kanamicina, transferidos en un sistema SORBAROD y aclimatados en un invernadero (ejemplo 3) se cultivan en un invernadero. Sobre dichas plantas, se han desarrollado varias ramificaciones cada una con un capítulo.

Se han realizado unos análisis de la actividad glucuronidasa sobre cada planta y cada ramificación. Para cada ramificación, se ha realizado un ensayo de actividad glucuronidasa sobre una hoja, sobre una flor ligulada (flor situada alrededor de cada capítulo que presenta un pétalo) y sobre un florón (flor interna del capítulo sin pétalo). Los análisis de la actividad GUS tienen como objetivo determinar el porcentaje de plantas completamente transformadas que proporcionarán una descendencia cuyos genes insertados (gen NPT II y gen GUS) se segregarán de forma Mendeliana. Tales plantas deben estar compuestas de células transformadas en todos los tejidos y órganos y principalmente en los órganos florales que contienen los óvulos y el polen que proporcionarán después de la fecundación el embrión zigótico contenido en la semilla. Se considera una planta completamente transformada si presenta una actividad GUS en todas las ramificaciones y para cada una de las ramificaciones, en las hojas, en los florones y en sus flores liguladas.

La tabla 7 muestra que el 92% de las plantas transformadas cultivadas en un invernadero mediante la técnica descrita en dicha invención están completamente transformados: para dichas plantas todas las ramificaciones presentan unas hojas, unas flores liguladas, unos florones que expresan una actividad glucuronidasa.

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Por el contrario, el 8% de las plantas transformadas presentan unas características de plantas quiméricas:

-

1,5% de las plantas presentan determinadas ramificaciones en las hojas y los capítulos muestran una actividad GUS+ y otras ramificaciones cuyas hojas y capítulos no muestran actividad glucuronidasa.

Dichas plantas quiméricas se obtienen de brotes en los que determinados yemas axilares se habían transformado y otros brotes axilares no se habían transformado.

-

6,5% de las plantas presentan unas ramificaciones cuyas hojas presentan una actividad glucuronidasa y en el que los fleurons o las flores liguladas no expresan la glucuronidasa.

Dichas plantas quiméricas se han obtenido de brotes cuyas yemas axilares están compuestas de células transformadas a nivel del anillo meristemático vegetativo origen de las partes vegetativas (hojas, tallos y pecíolos) y de las células no transformadas a nivel de la parte medular del meristemo origen de los órganos florales y reproductores.

El porcentaje de plantas quiméricas obtenida es bajo (8%). En la técnica descrita en la presente invención, las plantas que presentan una flor ligulada o un florón que no expresan actividad glucuronidasa, se consideran como quiméricas y se eliminan.

Las plantas completamente transformadas se autofecundan mediante varios pases sucesivos para extender el polen sobre cada capítulo. Las semillas se recogen a continuación de uno a dos meses después de la fecundación. Las semillas se tratan durante 5 horas de empapado en ethrel (solución al 0,1% en agua), después se descortican y se esterilizan (según el protocolo descrito en el ejemplo 1). A continuación, las semillas estériles se ponen a germinar en el medio MO que contiene 100 mg/l de kanamicina en las placas de cultivo Phytatray (SIGMA Ref P1552). Después de 15 días de germinación, las plántulas transformadas resistentes a la kanamicina son verdes y desarrollan unas hojas verdes. Las plántulas no transformadas sensibles a la kanamicina son blancas y no desarrollan ni raíz, ni hoja verde.

Se ha realizado un ensayo de actividad glucuronidasa sobre las hojas verdes de las plántulas resistentes a la kanamicina.

Se determina el porcentaje de plántulas resistentes a la kanamicina y el porcentaje de plantas que expresan el gen GUS (Tabla 8).

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Las segregaciones de los genes GUS y NPT II en las descendencias de las plantas completamente transformadas siguen una segregación de tipo mendeliano ya que, en casi todos los casos, por lo menos ¾ de las plantas expresan el gen NPTII o el Gen GUS y ¼ de las plantas no están transformadas. Dichos resultados confirman que las plantas producidas están completamente transformadas y no son quiméricas.

Se han realizado unos análisis moleculares de dichas plantas transgénicas para identificar el número de locus de inserciones, el número de copias de ADNt y para cartografiar los extremos del inserto.

Claims (16)

1. Procedimiento de producción de plantas transgénicas, completamente transformadas en generación T_{0}, que comprende:

a.

una etapa de transformación genética de un explante meristemático,

b.

el cultivo, en un medio selectivo del explante meristemático que ha sufrido la etapa de transformación;

c.

la extracción de las yemas axilares transformadas y eventualmente de las yemas foliares neoformadas transformadas, obtenidas a lo largo de la etapa b.;

d.

el cultivo en un medio selectivo de las yemas transformadas obtenidas según la etapa c.;

e.

la repetición por lo menos una vez de las etapas c. y d. de forma que se obtienen unos meristemos secundarios completamente transformados y eventualmente unos meristemos foliares neoformados, completamente transformados;

f.

la regeneración, a partir del material celular obtenido en la etapa e. de plantas transgénicas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque, antes de la etapa de transformación, el explante meristemático se somete a una etapa de precultivo de una duración de 5 a 30 días, preferentemente entre 5 y 8 días, en un medio de cultivo que contiene una citoquinina.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el explante meristemático consiste en un meristemo primario o una yema foliar neoformada o incluso una hoja joven despegada regenerada a partir de un meristemo primario o secundario y que contiene unas células capaces de dar lugar a unos meristemos foliares neoformados.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la etapa de transformación comprende el bombardeo de por lo menos una parte del explante con unas micropartículas, seguido por la puesta en contacto del explante bombardeado con Agrobacterium que contiene por lo menos una secuencia de ácido nucleico destinada a ser introducida en las células meristemáticas.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la etapa de transformación comprende el bombardeo de por lo menos una parte del explante con unas micropartículas recubiertas de ADN destinado a ser introducido en las células meristemáticas.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la etapa de transformación comprende la puesta en contacto del explante con una suspensión de Agrobacterium.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico destinada a ser introducida en las células vegetales presenta un gen de resistencia a los insectos, a los herbicidas, a las enfermedades fúngicas, por ejemplo Sclerotinia sclerotorium o Botrytis cinerea, uno o varios genes de las proteínas de reserva en semillas, o que mejoran la calidad de las proteínas de reserva, unas secuencias que modifican la maduración del fruto, unas secuencias que confieren una resistencia a los virus, uno o varios genes implicados en el metabolismo de los ácidos grasos o de los aminoácidos o un gen implicado en la esterilidad masculina.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 4 a 7, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico destinada a ser introducida en las células vegetales comprende una secuencia que codifica para un agente que permite la selección de los transformantes, por ejemplo un agente que confiere una resistencia a un antibiótico tal como la kanamicina.

9. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque el Agrobacterium es Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo la cepa LBA 4404, que contiene un vector binario, por ejemplo pGA492-GI.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el medio de cultivo empleado durante las etapas de precultivo, de cocultivo y de selección es el medio MS al que se ha añadido de 0,05 a 2,0 mg/l BAP aproximadamente, preferentemente 0,1 mg/l BAP y, cuando se trata del medio de selección, por lo menos un agente selectivo, por ejemplo la kanamicina, y eventualmente unos agentes bacteriológicos.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque se añaden asimismo al medio, durante las etapas de precultivo y de cocultivo un compuesto fenólico, por ejemplo acetosiringona, capaz de activar los genes vir de Agrobacterium.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la planta transgénica producida es el girasol transgénico.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el explante meristemático procede del algodón, de una especie vegetal oleaginosa, por ejemplo el girasol (Helianthus annuus), una especie que pertenece a la familia de las leguminosas, por ejemplo el guisante (Pisum sativum), la judía (Phaseolus vulgaris), una especie que pertenece a la familia de las Cucurbitáceas, por ejemplo el calabacín (Cucurbita pepo).

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el explante procede del girasol.

15. Procedimiento de producción de meristemos secundarios completamente transformados, o de meristemos foliares neoformados completamente transformados, caracterizado porque

i)

se realiza una etapa de transformación genética de explantes meristemáticos;

ii)

se cultiva en un medio selectivo los explantes que han sufrido la etapa de transformación;

iii)

se extraen las yemas axilares transformadas y eventualmente las yemas foliares neoformadas transformadas obtenidas a lo largo de la etapa ii);

iv)

se cultiva, en un medio selectivo, las yemas transformadas obtenidas según iii);

v)

se repite, por lo menos una vez, las etapas iii) y iv).

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque los meristemos proceden del girasol.