ES2274514T3 - Eotaxina: citoquina quimiotactica de eosinofilos. - Google Patents
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Abstract
SE PRESENTA UNA PROTEINA QUIMIOATRAYENTE LLAMADA "EOTAXINA" QUE ES CAPAZ DE ATRAER EOSINOFILOS Y DE INDUCIR LA ACUMULACION DE EOSINOFILOS Y/O LA ACTIVACION IN VITRO E IN VIVO. DIFERENTES TIPOS DE AGENTES QUE INHIBEN O DE OTRA FORMA ESTORBAN LA PRODUCCION, LIBERACION O ACTIVIDAD DE LA EOTAXINA PUEDEN UTILIZARSE TERAPEUTICAMENTE EN EL TRATAMIENTO DEL ASMA Y OTRAS ENFERMEDADES INFLAMATORIAS.
Description
Eotaxina: citocina quiniotáctica de
eosinófilos.
La presente invención se refiere a una citocina
quimiotáctica.
La acumulación de leucocitos eosinófilos es una
propiedad característica de las reacciones alérgicas mediadas por
IgE tales como el asma alérgica, la rinitis y el eccema. La
acumulación eosinófila también se produce en el asma no alérgica.
La broncoconstricción inmediata en respuesta a un estímulo de
provocación en el asmático implica la activación de los mastocitos
y la liberación de mediadores constrictores. Esto va acompañado
después de varias horas en algunos individuos por una respuesta
broncoconstrictora tardía asociada a una entrada masiva de
eosinófilos (1). La provocación repetida produce la inflamación
crónica en las vías respiratorias y una hipersensibilidad notable a
los mediadores constrictores. La magnitud tanto de la respuesta
tardía como de la hipersensibilidad crónica se correlaciona con el
número de eosinófilos presentes en los pulmones (2, 3).
La presente invención proporciona una proteína
quimioatrayente susceptible de atraer a los eosinófilos y de
provocar la acumulación eosinófila y/o la activación in vitro
e in vivo. La proteína quimioatrayente de la presente
invención se denomina "eotaxina".
Con mayor detalle, según un aspecto de la
presente invención, se proporciona una proteína quimioatrayente
aislada capaz de atraer los eosinófilos y de producir acumulación
eosinófila y/o activación in vitro e in vivo y que no
presenta sustancialmente ningún efecto atractivo para los
neutrófilos in vivo, que está constituida por una secuencia
de aminoácidos o que comprende la misma que presenta por lo menos el
40% de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la
SEC. ID nº: 1, o un fragmento de dicha proteína quimiatrayente que
conserva sus actividades biológicas.
Las eotaxinas son proteínas del ramal
C-C de la superfamilia del factor 4 de plaquetas de
citocinas quimiotácticas. Dentro del ramal C-C de
la superfamilia del factor 4 de plaquetas de las citocinas
quimiotácticas o quimiocinas, algunos miembros tienen la propiedad
de atraer los eosinófilos in vitro y algunos pueden producir
la acumulación eosinófila in vivo. Por ejemplo, las
quimiocinas RANTES y MIP-1\alpha atraen a los
eosinófilos in vitro mientras que MCP-1 y
MIP-1\beta no. ("RANTES" significa Reguladas
en la Activación en linfocitos T Normales Expresados y Segregados,
"MIP" significa Proteína Inflamatoria del Macrófago y
"MCP" significa Proteína Quimioatrayente de Monocitos).
Las citocinas naturales en la superfamilia del
factor 4 de plaquetas de las citocinas quimiotácticas pueden
presentar variaciones interespecies notables en la longitud de la
molécula de la proteína, en la secuencia de aminoácidos de la
proteína, y en las modificaciones del carbohidrato de la proteína,
mientras que se conservan las mismas propiedades funcionales
características. Similares variaciones en la estructura pueden
producirse en las citocinas obtenidas a partir de diferentes
individuos dentro de la misma especie. Muchas quimiocinas dentro
del ramal C-C de la superfamilia del factor 4 de
plaquetas presentan promiscuidad de la fijación del receptor, y la
capacidad de las diferentes quimiocinas para fijarse al mismo
receptor no depende necesariamente del alto grado de homología a
nivel de aminoácidos. Por consiguiente, tanto las variaciones
interespecie como intraespecie en la longitud de las proteínas, la
secuencia de aminoácidos y en las modificaciones del carbohidrato
son de esperar generalmente en las eotaxinas.
La aptitud para atraer eosinófilos y para
producir la acumulación eosinófila y/o la activación in vitro
e in vivo es una propiedad característica de las eotaxinas.
Además, las eotaxinas generalmente no presentan sustancialmente
ningún efecto atractivo para los neutrófilos in vivo. El
efecto quimioatrayente eosinófilo puede ser un efecto entre las
especies, por ejemplo, la eotaxina del cobaya parece ser potente
para producir quimiotaxia de los eosinófilos humanos in
vitro.
Una eotaxina puede obtenerse a partir de un
fluido corporal apropiado, por ejemplo, del fluido del lavado
broncoalveolar obtenido de un ser humano o de un individuo no
humano, particularmente un individuo alérgico después de una prueba
de provocación con alergeno, ya sea provocada experimentalmente o
contraída de forma natural. Otras fuentes de eotaxinas son, por
ejemplo, los fluidos del exudado inflamatorio y los cultivos in
vitro de macrófagos, linfocitos, neutrófilos, mastocitos,
células epiteliales de las vías respiratorias, células de tejido
conectivo, células endoteliales vasculares y los propios
eosinófilos.
Por ejemplo, una eotaxina puede obtenerse a
partir de un cobaya sensibilizado tras la prueba de provocación con
alérgeno. Los modelos de cobaya son útiles ya que comparten muchas
propiedades comunes con la respuesta asmática en el hombre. La
eotaxina que puede obtenerse del fluido del lavado broncoalveolar de
un cobaya sensibilizado mediante purificación sucesiva por HPLC
presenta generalmente un peso molecular comprendido en el intervalo
entre 6 y 16 kDa. (Como se indicó anteriormente, las variaciones del
peso molecular intraespecie de este orden de magnitud se observan
en los miembros de la superfamilia del factor 4 de plaquetas).
Por lo tanto, según otro aspecto de la presente
invención se proporciona un procedimiento para la producción de una
proteína quimioatrayente de la presente invención que comprende el
aislamiento de una fracción procedente del fluido de lavado
broncoalveolar o de un exudado inflamatorio obtenido de un ser
humano o de un animal no humano sometido a la prueba de provocación
con un estímulo provocador, en el que dicha fracción demuestra la
actividad quimioatrayente eosinófila in vitro e in
vivo y que no muestra sustancialmente ningún efecto atractivo
de neutrófilos in vivo.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona un procedimiento para la producción de una proteína
quimioatrayente de la presente invención, que comprende el cultivo
in vitro de macrófagos, linfocitos, neutrófilos, mastocitos,
células epiteliales de las vías respiratorias, células de tejido
conectivo, células endoteliales vasculares o eosinófilos obtenidos
a partir de un ser humano o de un animal no humano, y el aislamiento
de las células o del fluido del cultivo celular de una fracción que
demuestra la actividad quimiotáctica eosinófila in vitro e
in vivo y que no presenta sustancialmente ningún efecto
atractivo para los neutrófilos in vivo.
La secuencia de aminoácidos de la eotaxina del
cobaya esta expuesta en la SEC. ID nº: 1, SEC. ID nº: 2 y en las
Figuras 7 y 8 de los dibujos adjuntos. Otras eotaxinas de cobaya
generalmente tendrán por lo menos el 40 o el 50% de homología total
con el listado de secuencias presentado en la SEC. ID nº: 1 (Figura
7) a nivel de aminoácidos. La homología puede ser por lo menos del
60%, por ejemplo por lo menos del 70%, por ejemplo por lo menos del
80% con la secuencia expuesta en la SEC. ID nº: 1 y en la Figura
7.
El porcentaje de homología en el presente caso
se calcula sobre la base de los aminoácidos que son idénticos en
las posiciones correspondientes en las dos secuencias en
investigación. Las sustituciones conservadoras no se tienen en
cuenta. En el cálculo del porcentaje de homología de una supuesta
molécula de eotaxina en investigación con la secuencia mostrada en
la SEC. ID nº: 1 (Figura 7) o con la SEC. ID nº: 2 (Figura 8) si la
molécula en investigación presenta una longitud diferente de la
eotaxina expuesta en la SEC. ID nº: 1 o en la SEC. ID nº: 2 (Figura
7 o Figura 8), entonces el cálculo se basa en los aminoácidos en la
parte de la molécula en investigación que se solapan con la
secuencia mostrada en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7) o en la SEC. ID
nº: 2 (Figura 8). Los paquetes del programa informático para la
alineación de las secuencias de aminoácidos y el cálculo de la
homología están disponibles en el mercado, por ejemplo, el programa
"Bestfit" disponible en Genetics Computer Group Sequence
Analysis Software, Madison, Wisconsin, U.S.A.
A menos que se especifique de otro modo, los
valores específicos del porcentaje de homología entre la eotaxina y
otras citocinas quimiotácticas dadas en la presente memoria se han
calculado basándose en la eotaxina expuesta en la SEC. ID nº: 1
(Figura 7).
Como se indicó anteriormente, las eotaxinas que
pueden obtenerse de otras especies aparte de los cobayas, por
ejemplo de seres humanos, presentarán diferencias interespecie del
tipo demostrado por otros miembros del ramal C-C de
la superfamilia del factor 4 de plaquetas de quimiocinas, por
ejemplo, diferencias en la longitud de la proteína, secuencia de
aminoácidos y modificaciones de carbohidrato. Pueden, por ejemplo,
existir variaciones en los restos de los terminales en C y/o N. Por
ejemplo, es de esperar que el peso molecular de una eotaxina
procedente de una especie distinta de cobaya esté comprendida en el
intervalo entre 6 kDa y 16 kDa, pero en algunos casos una eotaxina
puede tener un peso molecular inferior a 6 kDa o superior a 16
kDa.
Asimismo, es de esperar que en general una
eotaxina de otra especie distinta del cobaya, presente por lo menos
40% de homología total con la secuencia expuesta en la SEC. ID nº: 1
y en la Figura 7. La homología puede ser de por lo menos 50%, por
ejemplo de por lo menos 60%, por ejemplo de por lo menos 70%, por
ejemplo de por lo menos 80% con la secuencia expuesta en la SEC. ID
nº: 1 y en la Figura 7. Sin embargo, pueden existir eotaxinas
procedentes de otras especies aparte de los cobayas que presenten
menos de 40% de homología con la SEC. ID nº: 1
(Figura 7).
(Figura 7).
Las eotaxinas pueden ser identificadas por una
cualquiera o más de las características expuestas anteriormente, en
particular por su capacidad para atraer y/o activar eosinófilos
in vitro y dar lugar a su acumulación y/o activación in
vivo. Una característica que ayuda a la identificación de una
molécula como una eotaxina es la falta de efecto atractivo sobre
los eosinófilos.
La presente invención proporciona un método de
determinación de la capacidad de una sustancia para producir la
acumulación eosinófila y/o la activación in vivo, es decir,
un método para la experimentación de supuestas eotaxinas, que
comprende la administración de la sustancia, generalmente por vía
intradérmica, a un animal de ensayo tratado previamente con
eosinófilos marcados, por ejemplo marcados con ^{111}In y
posteriormente la determinación del número de eosinófilos marcados
en un punto de la piel.
Un método in vitro que puede utilizarse
para ensayar la susceptibilidad de una supuesta eotaxina para atraer
y/o activar eosinófilos in vitro es la susceptibilidad de la
sustancia para aumentar las concentraciones en el eosinófilo del
calcio intracelular. Otros métodos generales de determinación de la
actividad quimiotáctica in vitro pueden utilizarse para
ensayar las supuestas eotaxinas in vitro.
La confirmación de que un eosinófilo táctico es
una eotaxina puede hacerse también considerando la homología de
secuencia de esta proteína con la secuencia expuesta en la SEC. ID
nº: 1 (Figura 7) y/o con la secuencia expuesta en SEC. ID nº: 2
(Figura 8) y/o considerando la relación estructural entre la
proteína y la eotaxina de cobaya.
Como se mencionó anteriormente, tanto RANTES
como MIP-1\alpha son activadores eosinófilos. La
eotaxina presenta similitudes funcionales pero baja homología
estructural con RANTES y MIP-1\alpha (31% de
homología con MIP-1\alpha a nivel de aminoácido
calculada basándose en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7); 32% de homología
cuando se calcula sobre la base de las secuencias de solapamiento y
26% de homología con RANTES a nivel de aminoácido calculada sobre
la base de la SEC. ID nº: 1 (Figura 7); 27% de homología cuando se
calcula sobre la base de las secuencias de solapamiento). Una
eotaxina puede distinguirse de RANTES y de
MIP-1\alpha no sólo por el grado de homología
sino también por diferencias generales en la secuencia y en la
estructura.
Además de las moléculas completas de eotaxina,
la presente invención proporciona asimismo moléculas que comprenden
menos de una secuencia completa de eotaxina. Dichas moléculas
(denominadas "fragmentos" en la presente memoria) pueden ser
polipéptidos o péptidos. Para su utilización como sustituto de
eotaxina, un fragmento debería conservar una o más de las
actividades biológicas de la molécula precursora.
Los eosinófilos contienen un arsenal de
productos químicos necesarios para destruir los parásitos. Estos
productos químicos han estado implicados en el daño al epitelio de
las vías respiratorias que produce asma y puede relacionarse con
los cambios observados en la función de las vías respiratorias (26,
27). Para los estudios de los inventores se sugiere que las
eotaxinas deberían considerarse como importantes mediadores de la
acumulación eosinófila in vivo. Los propios macrófagos,
linfocitos, neutrófilos, mastocitos, células epiteliales de las vías
respiratorias, células del tejido conectivo, células endoteliales
vasculares y eosinófilos son asimismo candidatos como fuente de
actividad quimiotáctica de eosinófilos generada en los pulmones. Las
plaquetas pueden desempeñar también una función ya que se ha
demostrado que pueden liberar quimiocinas del C-C
(22). Además, una deposición de plaquetas inicial puede estar
implicada en la acumulación posterior de eosinófilos in vivo
(28, 29) y existen pruebas de que el factor activador de plaquetas
produce la síntesis de un eosinófilo quimioatrayente no identificado
in vivo (30). A este respecto, es de interés que el factor
de crecimiento derivado de plaquetas pueda provocar la expresión
génica de las quimiocinas del C-C en fibroblastos
(31). Además, las quimiocinas del C-C han estado
implicadas en la cicatrización de la herida (18). Esto puede ser
importante en la fibrosis subepitelial de la membrana basal que es
una característica destacada del pulmón asmático. Por lo tanto, las
eotaxinas pueden estar implicadas tanto en la acumulación de
eosinófilos como en los cambios estructurales crónicos en los
pulmones.
Las eotaxinas pueden desempeñar una función
importante en el asma y en otras enfermedades con un componente
inflamatorio en las que la acumulación de eosinófilos y/o la
activación es una característica destacada, por ejemplo, rinitis y
eccema, especialmente el eccema alérgico. Por consiguiente, los
agentes que inhiben o si no ocultan la producción, liberación o
acción de eotaxinas tienen potencial como agentes terapéuticos
selectivos. Dichos agentes y su utilización terapéutica se
describen en la presente memoria.
Dichos agentes incluyen los inhibidores que
afectan la interacción de una eotaxina con los receptores de
eotaxina, por ejemplo, uniéndose a una eotaxina o a un receptor de
eotaxina. Un ejemplo de dicho inhibidor son los propios receptores
que, en la administración, pueden unirse a una eotaxina e impedir su
interacción con los receptores naturales. Dichos receptores
inhibidores pueden ser solubles o insolubles. Los receptores que no
están implicados en la activación en la activación celular pueden
unirse a células o producirse en ellas. Dichos receptores pueden
utilizarse también para eliminar la eotaxina endógena.
Más ejemplos de agentes que afectan la
interacción de las eotaxinas con los receptores de eotaxina son los
antagonistas del receptor, y anticuerpos, ambos anticuerpos
dirigidos contra (susceptibles de unirse a) una eotaxina y los
anticuerpos dirigidos contra un receptor de eotaxina, especialmente
los anticuerpos monoclonales. Cualquier otro agente que inhiba o si
no oculte la unión de una eotaxina a un receptor de eotaxina
presenta también potencial terapéutico, por ejemplo, cualquier otro
agente que se una a una eotaxina o a un receptor de eotaxina. Más
agentes que presentan potencial terapéutico son los que impiden o
reducen la activación de los receptores de eotaxina.
Por lo tanto, según otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente
a la proteína quimiotáctica como se reivindica en la invención.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona la utilización de un anticuerpo reivindicado en la
invención para la preparación de un medicamento destinado al
tratamiento del asma o de otra enfermedad inflamatoria.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona una preparación farmacéutica que comprende, como
ingrediente activo, un anticuerpo reivindicado en la invención
mezclado con un portador farmacéuticamente adecuado o junto con el
mismo.
Más agentes que inhiben o si no ocultan la
acción de las eotaxinas son los que cambian la estructura de una
eotaxina de modo que ya no es capaz de unirse a un receptor de
eotaxina, por ejemplo, una enzima u otro agente que degrade
especificadamente eotaxina.
La promiscuidad del receptor es frecuente entre
las quimiocinas, de modo que aunque es esencial que un receptor sea
capaz de unirse a una eotaxina, el receptor no necesita
necesariamente ser específico para la eotaxina. Por ejemplo, un
receptor puede unirse a MIP-1\alpha, RANTES y/o
otras quimiocinas atrayentes de eosinófilo así como una
eotaxina.
Como se indicó anteriormente, las posibilidades
para la intervención terapéutica incluyen la utilización de un
receptor al que se une una eotaxina, especialmente un receptor
soluble. Puede presentar ventajas el utilizar un receptor
específico para eotaxina. Otras posibilidades de intervención
terapéutica incluyen los antagonistas del receptor, por ejemplo,
basados en las estructuras tridimensionales o en las secuencias de
aminoácidos de las eotaxinas y/o de los receptores de eotaxina, y
los agentes descubiertos para inhibir la eotaxina u otros agonistas
que se unen a receptores de eotaxina o los activan. Por ejemplo, un
antagonista del receptor o un inhibidor del agonista puede ser un
polipéptido en el que se ha modificado la secuencia completa de una
eotaxina natural, por ejemplo, mediante sustitución de aminoácidos,
o puede ser un fragmento de una eotaxina (es decir, un polipéptido
o péptido pequeño que comprenda parte de la secuencia de aminoácidos
de una eotaxina natural) o un fragmento modificado de una eotaxina,
por ejemplo, modificado por sustitución de aminoácidos.
Además, el conocimiento de la secuencia y/o de
la estructura de las eotaxinas ya sea solo o en combinación con el
conocimiento de la secuencia y/o estructura de otras quimiocinas que
se unen a el/los mismo(s) receptor(es) como
eotaxinas, proporciona información útil para el diseño de agentes
terapéuticos.
Pueden utilizarse agentes que impiden o inhiben
la síntesis o liberación de eotaxina también terapéuticamente.
Dichos agentes y su utilización se describen también en la presente
memoria.
Todos los inhibidores de actividad de, síntesis
y liberación de eotaxina, incluyendo los receptores solubles,
anticuerpos, antagonistas e inhibidores de la unión del agonista y
su utilización se describen en la presente memoria.
Los inventores describen por consiguiente un
agente que inhibe o si no oculta la producción, liberación o acción
de una eotaxina, especialmente un agente descrito anteriormente,
para su utilización como medicamento. La invención proporciona
también la utilización de un agente que inhibe u oculta la
producción, liberación o acción de una eotaxina, especialmente un
agente descrito anteriormente, para la preparación de un medicamento
destinado al tratamiento del asma o de otra enfermedad que tenga un
componente inflamatorio, particularmente con acumulación de
eosinófilos, por ejemplo, rinitis o eccema, especialmente eccema
alérgico.
La utilización de la información estructural y
de la secuencia en relación con las eotaxinas en el diseño de
agentes terapéuticos y de diagnóstico útiles, por ejemplo, en un
diseño por ordenador basado en la estructura tridimensional de las
eotaxinas forma parte de la presente invención.
Los supuestos inhibidores de actividad de
eotaxina pueden identificarse utilizando ensayos in vivo e
in vitro basados en la inhibición de la acción quimiotáctica
y/o acumulación y/o activación de los eosinófilos por las
eotaxinas. Se conocen algunos métodos generales para la
determinación de la actividad de un compuesto para un efecto
inhibidor en la actividad de una citocina quimioatrayente in
vitro. Dichos ensayos pueden utilizarse para determinar la
acción inhibidora de un supuesto inhibidor o de los efecto in
vitro producidos en los eosinófilos por las eotaxinas.
Los análisis que son adecuados para identificar
supuestos inhibidores de eotaxina incluyen, por ejemplo, la
inhibición in vitro de la elevación de las concentraciones de
calcio intracelular producidas en las células por la eotaxina. El
método de la presente invención para determinar la capacidad de una
sustancia para producir acumulación y/o activación de eosinófilos
in vivo, es decir, un método para analizar las supuestas
eotaxinas, puede utilizarse también para determinar la capacidad de
una sustancia para inhibir la acumulación y/o activación de
eosinófilos producida in vivo por una eotaxina: se pretrata
un animal con eosinófilos marcados, se administra una eotaxina y un
supuesto inhibidor, y se determinan posteriormente el número de
eosinófilos marcados en una zona de la piel. La eotaxina se
administra generalmente por vía intradérmica, y el supuesto
inhibidor puede administrarse por la misma vía o por una vía
diferente, por ejemplo de forma general.
En la presente memoria se describen ejemplos de
análisis in vitro e in vivo para la determinación de
la actividad de la eotaxina y para la determinación de la actividad
inhibidora de la eotaxina. Por ejemplo, el Ejemplo 1 proporciona un
protocolo detallado para el análisis in vivo de la presente
invención, y el Ejemplo 4 proporciona protocolos detallados de
varios análisis. Los análisis descritos en la presente memoria
pueden utilizarse como tal, o pueden modificarse según se requiera.
Los análisis pueden utilizarse solos o en combinación para
demostrar la actividad de eotaxina e inhibidora de eotaxina. Los
supuestos inhibidores pueden ser cualquiera de los tipos de las
moléculas descritas anteriormente, incluyendo receptores, por
ejemplo, receptores solubles, anticuerpos y antagonistas e
inhibidores de la unión del agonista. Los métodos para el análisis
de supuestos inhibidores de eotaxinas forman parte también de la
presente invención.
Con mayor detalle según la presente invención se
proporciona un método de análisis del efecto inhibidor de un
compuesto sobre la actividad de una citocina quimioatrayente in
vitro, caracterizado porque la citocina quimioatrayente es una
proteína quimioatrayente reivindicada en la invención.
La presente memoria describe asimismo una
preparación farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, un
agente que inhibe o si no oculta la producción, liberación o acción
de una eotaxina, mezclada o junto con un portador farmacéuticamente
adecuado. Dichos agentes están descritos anteriormente e incluyen,
por ejemplo, un inhibidor de la síntesis o liberación de eotaxina,
un receptor de eotaxina soluble, un antagonista receptor de
eotaxina o un inhibidor de un agonista receptor de eotaxina, un
anticuerpo contra eotaxina o un anticuerpo contra un receptor de
eotaxina.
La presente memoria describe asimismo un método
para el tratamiento del asma y de otras enfermedades inflamatorias,
que comprende la administración de una cantidad eficaz de un agente
que inhibe o si no oculta la producción, liberación o actuación de
una eotaxina. El agente puede ser tal como el descrito
anteriormente, por ejemplo, un inhibidor de la síntesis o
liberación de eotaxina, un receptor de eotaxina soluble, un
antagonista receptor de eotaxina o un inhibidor de un agonista
receptor de eotaxina o un anticuerpo contra eotaxina o contra un
receptor de eotaxina.
La presente memoria describe asimismo análisis
de eotaxinas y de anticuerpos antieotaxina, especialmente
inmunoanálisis y en particular los ELISA (ensayo inmunosorbente con
enzima ligada). La invención proporciona, por ejemplo, un
inmunoanálisis de un antígeno, caracterizado porque el antígeno es
una eotaxina, y también proporciona un inmunoanálisis de un
anticuerpo, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo
antieotaxina.
La presente memoria describe asimismo análisis
de eotaxinas que son análogos a los inmunoanálisis de eotaxinas
pero que utilizan un socio de enlace específico distinto de un
anticuerpo. En dicho análisis del socio de enlace específico puede
utilizarse un receptor de eotaxina en lugar de un anticuerpo
antieotaxina.
En un inmunoanálisis, un anticuerpo antieotaxina
puede, por ejemplo, recubrir una superficie sólida que permita la
captura y por consiguiente la detección de eotaxina. Un anticuerpo
antieotaxina puede utilizarse en un análisis para la detección de
anticuerpos contra eotaxina, por ejemplo, en un análisis de
anticuerpos competitivo. Una eotaxina marcada o un derivado de la
misma, por ejemplo, una eotaxina recombinante o un péptido sintético
que comprende parte de la secuencia de aminoácidos de una eotaxina
puede utilizarse en un análisis de eotaxina con antígeno
competitivo o puede utilizarse para recubrir una superficie sólida
en un análisis de captura de anticuerpos contra eotaxina. Muchos
tipos diferentes de formato de análisis están bien descritos en la
bibliografía de la técnica tal como, véase por ejemplo "ELISA and
Other Solid Phase Immunoassays, Theoretical and Practical
Aspects", eds. Kemeny D. M. y Challacombe S. J., John Wiley,
1988. (36). Los análisis que utilizan un receptor de eotaxina en
lugar de un anticuerpo antieotaxina pueden realizarse de manera
análoga.
Como se mencionó anteriormente, la presente
invención proporciona un procedimiento para la producción de una
eotaxina, que comprende la obtención de fluido de lavado
bronqueoalveolar obtenido de un animal humano o no humano sometido
a la prueba de provocación con un estímulo provocador, por ejemplo,
de un ser humano que padece de asma alérgica o no alérgica, u otra
enfermedad pulmonar, o un cobaya sensibilizado con una proteína
extraña, y el aislamiento de una fracción que presenta actividad
quimiotáctica de eosinófilo. Un método de aislamiento de una
fracción que contiene eotaxina de fluido de lavado bronqueoalveolar
es el intercambio catiónico sucesivo, la exclusión por tamaño y los
sistemas de HPLC en fase inversa. La fracción deseada contiene
generalmente un polipéptido que tiene un peso molecular comprendido
en el intervalo entre 6 y 16 kDa. La pureza puede verificarse por
SDS-PAGE. Si se desea, la autenticidad de la
sustancia obtenida puede determinarse por comparación de su
secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en
la SEC. ID nº: 1 o en la SEC. ID nº: 2 (Figura 7 o Figura 8).
Las eotaxinas pueden obtenerse según el
procedimiento anterior de otras fuentes, por ejemplo, de los fluidos
del lavado broncoalveolar o de cultivos in vitro de
macrófagos, linfocitos, neutrófilos, mastocitos, células
epiteliales de las vías respiratorias, células de tejido conectivo,
células endoteliales vasculares y de los propios eosinófilos.
Alternativamente, una eotaxina completa, o una
parte (fragmento) de una eotaxina, por ejemplo, un polipéptido o
fragmento de péptido, pueden producirse por síntesis química, por
ejemplo, según la técnica de Merryfield. Otro método para producir
una eotaxina completa o una parte de la misma es mediante la
tecnología del ADN recombinante. Todos los métodos de producción de
eotaxina forman parte de la presente invención.
Para producir un polipéptido o un fragmento de
polipéptido (o péptido) de eotaxina completa por la tecnología del
ADN recombinante, se inserta una secuencia de ácido nucleico que
codifica el polipéptido en un vector de expresión bajo el control
de las secuencias de control asociadas. Un polipéptido recombinante
puede expresarse a continuación utilizando un sistema de expresión
procariótico, por ejemplo en E. coli, o utilizando un sistema
de células eucarióticas, en cuyo caso el polipéptido resultante
puede estar glucosilado. Dichas técnicas son normalizadas véase,
por ejemplo Sambrook, J., Fritisch, E. F. y Maniatis T.,
Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989 (37).
Un ácido nucleico que codifica la totalidad o
parte de un polipéptido de eotaxina puede obtenerse cribando un
banco preparado a partir de células apropiadas, por ejemplo, células
de cobaya o de pulmón humano sometidas a la prueba de provocación
con alergeno. El cribado puede realizarse utilizando una sonda que
comprende secuencias características de una eotaxina, en especial,
las secuencias que distinguen la eotaxina de otras citocinas
relacionadas, por ejemplo, RANTES y MIP-1\alpha.
Puede ser preferible utilizar una sonda larga, por ejemplo, una
sonda que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica
un polipéptido de eotaxina completo.
Alternativamente, puede utilizarse la secuencia
polipeptídica de una eotaxina para diseñar cebadores de
oligonucleótido, por ejemplo, cebadores degenerados. Los cebadores
pueden comprender, por ejemplo, bases menos específicas en su
interacción que las bases naturales, por ejemplo, puede utilizarse
inosina. Ejemplos de cebadores son la secuencia transcrita
| 5' TGC TGT TTC CGI GTI ACI AAC AAA | (SEC. ID nº: 3) |
basada en la secuencia CCFRVTNK de aminoácidos y
la secuencia antitranscrita
| 5' CAT CTT GTC IGG CTT IAT TTC | (SEC. ID nº: 4) |
basada en la secuencia de
aminoácidos EIKPDKM. Dichos cebadores pueden utilizarse para la
ampliación del ARNm transcrito complementario mediante la reacción
en cadena de polimerasa. Esto proporciona sondas de ADNc para el
cribado de bancos, por ejemplo, como se describió anteriormente,
para aislar clones de eotaxina completa. Los cebadores pueden
incluir codones seleccionados basándose en la preferencia por
especies
conocidas.
Como se indicó anteriormente, los derivados de
eotaxinas naturales forman parte también de la presente invención.
Dichos derivados incluyen polipéptidos que presentan una o más de
las modificaciones siguientes en relación con una eotaxina
natural:
- (i)
- alargamiento o acortamiento del terminal C;
- (ii)
- alargamiento o acortamiento del terminal N;
- (iii)
- deleción y/o inserción de secuencias internas;
- (iv)
- sustituciones de aminoácidos, por ejemplo en el terminal C y/o N; y
- (v)
- un modelo diferente de glucosilación. (Existe, por ejemplo, un punto potencial de O-glucosilación en el resto 70).
Dichos derivados pueden operar como agonistas en
estudios de la relación estructura/actividad o como antagonistas
del receptor.
Los anticuerpos antieotaxina y los anticuerpos
del receptor antieotaxina tanto policlonales como monoclonales,
puede producirse según técnicas normalizadas, por ejemplo, Kohler y
Milstein (38). Puede utilizarse una eotaxina completa como
antígeno, o puede preferirse utilizar un fragmento de una eotaxina
para producir un anticuerpo contra un determinante antigénico
específico. Puede utilizarse una eotaxina natural como antígeno.
Alternativamente, puede utilizarse una eotaxina recombinante o
sintética o un polipéptido o péptido de eotaxina. Por lo tanto,
según otro aspecto aún de la presente invención, se proporciona un
procedimiento para la preparación de un anticuerpo según la
invención que comprende la utilización de una proteína quimiotáctica
según la invención.
Las Figuras 1 a 18 de los dibujos adjuntos
ilustran la presente invención. A continuación proporciona una
breve descripción de las Figuras. Una descripción más detallada de
las Figuras se proporciona a continuación y en el apartado Ejemplos
de la presente memoria.
Figura 1: Protocolo para la generación y ensayo
de actividad quimioatrayente de eosinófilos in vivo.
Figura 2: Generación de actividad
quimioatrayente de eosinófilos en los pulmones de cobayas
sensibilizados tras la prueba de provocación con antígeno a lo
largo del tiempo.
Las Figuras 3, 4 y 5 se refieren todas a la
purificación de la eotaxina procedente de los fluidos del lavado
brocoalveolar (BAL):
Figura 3: Perfil de HPLC en fase inversa final
que presenta la absorbancia a 214 nm y el gradiente de
acetonitrilo.
Figura 4: Medición de la actividad
quimioatrayente de ^{111}In-eosinófilo de las
fracciones obtenidas en la cromatografía HPLC.
Figura 5: Medición de la actividad
quimioatrayente con ^{111}In-neutrófilo; falta de
actividad significativa observada.
Figura 6: Análisis SDS-PAGE de
las fracciones 50 a 56 por HPLC en fase inversa con C18.
Figuras 7 y 8: Secuencias de aminoácidos de una
eotaxina aislada de cobaya.
Figura 9: Comparación de la secuencia de
eotaxina de la Figura 7 con MCP-1,
MCP-2, MCP-3 humano (21),
MCP-1 de cobaya (24),
MIP-1\alpha, MIP-1\beta y RANTES
(18) humanas que presentan restos conservados (sombreadas).
Figura 10: Comparación de la acumulación de
eosinófilos con ^{111}In in vivo utilizando eotaxina de
cobaya y proteínas RANTES, MIP-1\alpha y
MCP-1 recombinantes humanas.
Figura 11 (recuadro): Inhibición de la fijación
de ^{125}I-RANTES a eosinófilos de cobaya
producidos in vitro por eotaxina y RANTES pero no por un miembro
IL-8 del ramal C-X-C
de quimiocinas.
Las Figuras 12, 13 y 14 ilustran el potencial de
bloqueo de la respuesta a la eotaxina de cobaya. Éstas hacen uso
del hecho de que RANTES humano, mientras compite con eotaxina por
las zonas de fijación, no activa los eosinófilos de cobaya.
Figura 12: Elevación de las concentraciones de
calcio intracelular en eosinófilos humanos in vitro producida
por eotaxina, RANTES y a alta concentración solamente,
MCP-1.
Figura 13: Elevación de las concentraciones de
calcio intracelular en eosinófilos de cobaya in vitro
producida por eotaxina, pero no por RANTES ni por
MCP-1 humanas.
Figura 14: Vestigios representativos que
muestran la inhibición de la elevación producida por eotaxina de
cobaya de las concentraciones de calcio intracelular en eosinófilos
de cobaya in vitro por la exposición previa de las mismas
células a RANTES humana.
Figura 15 (recuadro): Valores (media\pmSEM)
para cuatro preparaciones de eosinófilos por separado.
Figura 16: Curva de respuesta a la dosis que
muestra la inhibición de la elevación producida por eotaxina de
cobaya de las concentraciones de calcio intracelular en eosinófilos
de cobaya in vitro por la exposición previa de las mismas
células a RANTES humana.
Figura 17: Histograma que presenta la
comparación de la respuesta in vivo de eosinófilos de cobaya
a la eotaxina, RANTES y RANTES más eotaxina inyectada conjuntamente
por vía intradérmica.
Figura 18: Histograma que presenta el número de
eosinófilos y de neutrófilos en el fluido de lavado broncoalveolar
(BAL) después de la administración de eotaxina de cobaya como
aerosol a las vías respiratorias del cobaya.
Como en los pacientes asmáticos alérgicos, la
exposición de cobayas sensibilizados a antígeno aerosolizado
produce una fase inmediata de broncoconstricción con desgranulación
de mastocitos asociada seguida, en algunos individuos, de una fase
tardía de broncoconstricción e hipersensibilidad en las vías
respiratorias (4-7). Aunque de manera clara ningún
modelo simula todas las propiedades de la enfermedad humana, el
modelo de cobaya comparte características comunes con la respuesta
asmática en el hombre que se ha utilizado ampliamente para
investigar los posibles mecanismos (7). En especial, tanto en el
cobaya como en el hombre, la respuesta inmediata al alérgeno activa
la acumulación posterior en los pulmones de gran número de
eosinófilos. Se diseñaron experimentos para detectar el aspecto en
el pulmón de quimioatrayentes que pueden ser responsables de la
acumulación de eosinófilos. Se empleó una estrategia que se había
aplicado anteriormente a la identificación de quimioatrayentes
neutrófilos en exudados inflamatorios (8-10).
Se sensibilizaron cobayas con ovoalbúmina
intraperitoneal el día 1 seguido de una corta exposición de sus
pulmones a la ovoalbúmina aerosolizada el día 8. Los días 15 a 21
los animales se sometieron a la prueba de provocación con
ovoalbúmina aerosolizada y se sacrificaron a diferentes intervalos
utilizando una sobredosis de barbitúrico. Inmediatamente después de
la muerte se lavaron las vías respiratorias con solución salina. El
fluido de lavado broncoalveolar (BAL) se centrifugó para separar las
células, y los sobrenadantes se almacenaron a -20ºC para análisis o
se sometieron a purificación. La actividad quimioatrayente de
eosinófilos en muestras de fluido BAL o fracciones de HPLC se
ensayó inyectándoles por vía intradérmica en el ensayo de cobayas
administrados previamente con inyecciones intravenosas de
eosinófilos con ^{111}In (11, 12). Después de un intervalo de 2 ó
4 h, los animales de ensayo se sacrificaron y se punzaron las zonas
de la piel donde se hizo el recuento con un contador gamma (Figura
1).
La Figura 2 presenta el aspecto de la actividad
quimioatrayente de eosinófilos en el fluido BAL a lo largo del
tiempo. Se observó actividad significativa 30 min después de la
prueba de provocación con antígeno. La actividad aumentó hasta 3 h,
permaneció elevada a las 6 h, pero no fue significativa en las
muestras de 24 h. Las muestras de referencia (fluido BAL de cobayas
pseudosensibilizados o sometidos a prueba de provocación o
sensibilizados o pseudosometidos a prueba de provocación) tomadas a
las 3 h no presentaban actividad significativa.
La actividad quimioatrayente de eosinófilos, que
se denominó eotaxina, se purificó a partir de fluido BAL de 3 h por
intercambio catiónico sucesivo, exclusión por tamaño y HPLC en fase
inversa utilizando el ensayo de acumulación de eosinófilos con
^{111}In in vivo para medir la actividad de las fracciones
completamente. La eotaxina eluyó como un pico discreto aislado de
bioactividad tanto del intercambio catiónico como en las etapas de
exclusión por tamaño, lo que indica una proteína fuertemente
catiónica de 7 a 14 kDa. La cromatografía en fase inversa separó la
actividad quimioatrayente de eosinófilos en dos picos (fracciones
51+52 y fracción 54), que estaban asociados a picos discretos de
absorbancia de proteínas (Figuras 3 y 4). La selectividad por los
eosinófilos se mostró por la falta de actividad quimioatrayente
neutrófila significativa en estas fracciones medida por la
acumulación de neutrófilos con ^{111}In en el ensayo de la piel
(Figura 5). El examen histológico de la piel inyectada con eotaxina
(2 pmoles) demostró la acumulación de eosinófilos a las 4 y 24 h,
especialmente alrededor de los vasos sanguíneos pequeños (cepas de
hematoxilina y eosina).
El análisis SDS-PAGE puso de
manifiesto una sola banda de proteína en cada una de las fracciones
51, 52 y 54 (Figura 6). La proteína en las fracciones 51 y 52 fue
ligeramente mayor que la de la fracción 54. Esto se confirmó por
análisis de masas en los que las señales principales fueron
aproximadamente 8,81 y 8,38 kDa respectivamente (véase el Ejemplo
3). El secuenciado N-terminal de las fracciones 51,
52 y 54 puso de manifiesto secuencias idénticas de aminoácidos
(véase la Figura 7). La secuencia del resto 37
N-terminal de eotaxina expuesta en la SEC. ID nº: 1
y la Figura 7 presenta el 57% de homología con la proteína
quimiotáctica de monocitos humanos (MCP-1 (13),
conocida de otro modo como MCAF (14) y JE (15)). Los péptidos
trípticos de la fracción 54 se secuenciaron también y se alinearon
fácilmente por comparación con la MCP-1 humana para
proporcionar la secuencia prácticamente completa de eotaxina con
una homología global del 53%, véase la Figura 7. Es probable que
las variaciones en la masa molecular reflejen la glucosilación
diferencial ya que las cuatro señales de masa obtenidas (dos
mayores y dos menores, véase el Ejemplo 3) son todas diferentes
entre sí por múltiplos de aproximadamente 220 unidades de masa. La
secuencia no contiene puntos de N-glucosilación,
pero se ha identificado un punto potencial de
O-glucosilación en la posición 70 (véase el Ejemplo
3). MCP-1 humana también presenta homogeneidad en
SDS-PAGE debido a las diferencias en la modificación
del carbohidrato ligado al O (16).
La superfamilia del factor 4 de plaquetas de las
citocinas quimioatrayente, o quimiocinas, se caracteriza por cuatro
cisteínas conservadas. La posición relativas de las dos cisteínas
N-terminales permite la subdivisión de esta
superfamilia en las quimiocinas de
C-X-C (p. ej. IL-8
(17)) que son predominantemente quimioatrayente neutrófilos y las
quimiocinas con C-C (p. ej. MCP-1,
RANTES, MIP-1\alpha y MIP-1\beta
(18)) que son quimiotácticas para otros leucocitos aparte de los
neutrófilos. Eotaxina es un miembro del ramal C-C de
las quimiocinas. La mayor homología (53%) es con
MCP-1 humana que, en los estudios limitados in
vitro hasta la fecha, se ha descrito que es inactiva en
eosinófilos humanos (19, 20) y con la MCP-2 humana
descrita recientemente (54%) y MCP-3 (51% de
homología calculada sobre la base de la SEC. ID nº: 1 (Figura 7);
54% de homología cuando se calcula basándose en las secuencias de
solapamiento) (21). La homología con otras quimiocinas humanas con
C-C (Figura 9) es: MIP-1\beta (37%
calculado basándose en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7); 39% cuando se
calcula basándose en las secuencias de solapamiento),
MIP-1\alpha (31% calculado basándose en la SEC. ID
nº: 1 (Figura 7); 32% cuando se calcula basándose en las secuencias
de solapamiento) y RANTES (26% calculado basándose en la SEC. ID
nº: 1 (Figura 7); 27% cuando se calcula basándose en la secuencia de
solapamiento). Se ha demostrado recientemente que las dos proteínas
últimas son potentes activadores eosinófilos in vitro (20,
22) mientras que MIP-1\beta activa los linfocitos
in vitro (23) pero aparentemente no los eosinófilos (20). La
eotaxina presenta la homología estructural mayor con
MCP-1, MCP-2 y MCP-3
humanas. La eotaxina presenta similitudes funcionales, pero
relativamente poca homología, cuando se compara con RANTES y
MIP-1\alpha. La eotaxina es claramente una
molécula distinta de MCP-1 de cobaya; esta última se
ha clonado recientemente (24) y presenta solamente un 43% de
homología con la secuencia de eotaxina, véase la Figura 9.
MCP-1 de cobaya se demostró que era quimiotáctica
para los monocitos pero no se demostró en eosinófilos (24). Es
interesante que la eotaxina tiene un 41% de homología con una
proteína con C-C cuyo gen se expresa en mastocitos
de ratón y se regula por incremento 2 h después de la interacción
entre IgE y el antígeno (25). No se ha descrito ninguna actividad
funcional para esta proteína pero es distinta (51% de homología) de
la MCP-1/JE de ratón (25).
La eotaxina del cobaya fue muy potente para
producir la acumulación de eosinófilos in vivo:
1-2 pmoles/punto de piel proporcionando una
respuesta de 730\pm140% (media \pm s.e.m., n=18 animales) en
comparación con los puntos inyectados con solución salina. Además,
la acumulación notable de eosinófilos se observó a los 30 minutos
de inyección intradérmica (Figura 10). Esto está apoyado en
experimentos in vitro. El efecto de la eotaxina en los
eosinófilos in vitro se observó por (i) inhibición de la
fijación de ^{125}I-RANTES a células de cobaya
(Figura 11), (ii) elevación del calcio citoplasmático en células
humanas y de cobaya (Figuras 12 y 13) y (iii) quimiotaxia de
eosinófilos humanos en un sistema con cámara Boyden: las respuestas
quimiotácticas a la eotaxina y RANTES fueron de magnitud similar en
todo el intervalo entre 0,1 y 3,0 nm. A diferencia de la eotaxina,
MCP-1 recombinante humana y RANTES no produjeron
respuestas de eosinófilos de cobaya in vitro o in
vivo (Figuras 10 y 13). Esto puede reflejar una diferencia de la
especie aunque RANTES no se unió a los eosinófilos de cobaya sin
producir activación (Figura 11, recuadro en Figura 10). La eotaxina
tiene una potencia similar a RANTES en los eosinófilos humanos
mientras que MCP-1 es inactiva (20) o activa
solamente a grandes dosis (Figura 12). Por lo tanto, la eotaxina
tiene un potente efecto directo tanto en eosinófilos humanos como
de cobaya.
RANTES humana puede inhibir in vitro e
in vivo las respuestas de los eosinófilos de cobaya a la
eotaxina de cobaya. Las Figuras 14, 15 y 16 presentan la respuesta
de eosinófilos de cobaya cargados con FURA-2 a la
eotaxina de cobaya antes y después de la adición de RANTES humana.
El aumento producido por la eotaxina en la concentración del calcio
intracelular se reduce en un grado sustancial cuando las células se
exponen en primer lugar a RANTES humana, que no puede producir una
respuesta. La Figura 17 demuestra que RANTES humana, cuando se
inyecta conjuntamente con la eotaxina, reduce la acumulación de
eosinófilos de cobaya producidos por la eotaxina en la piel de
cobaya in vivo. Los resultados apoyan las observaciones de
los inventores de que la eotaxina presenta unión competitiva con
RANTES humana radiomarcada en eosinófilos de cobaya y que la
eotaxina es un potente estimulante operativo mientras que RANTES no
lo es. Por consiguiente, RANTES parece actuar como antagonista
receptor para eotaxina en eosinófilos de cobaya.
La Figura 18 demuestra que los eosinófilos se
acumulan en la vías respiratorias del cobaya in vivo dentro
de las 24 horas de la administración de la eotaxina aerosolizada de
cobaya, mientras que sustancialmente no se observa acumulación de
neutrófilos.
Los Ejemplos siguientes ilustran la presente
invención.
Métodos: Se sensibilizaron cobayas Dunkin
Hartley macho (300 a 400 g) con ovoalbúmina intraperitoneal (OA, 1
mg) el día 1 seguido de exposición a antígeno aerosolizado (OA al 2%
durante 5 min utilizando un nebulizador ultrasónico) el día 8 (6).
Los días 15 al 21, se pretrataron los animales con una antihistamina
para impedir la muerte aguda por accidente (pirilamina, 10 mg
kg^{-1}, i.p.) y se sometieron a la prueba de provocación por
exposición a antígeno aerosolizado (OA al 1% durante 20 min). En
diferentes momentos después de la prueba de provocación con
antígeno se trataron los animales con atropina (0,06 mg kg^{-1},
i.p.) para impedir la broncoconstricción y se sacrificaron con una
sobredosis de barbitúrico. Se realizó el lavado broncoalveolar con
4 ml de solución salina. Las muestras se centrifugaron para separar
las células y el sobrenadante se almacenó a -20ºC antes del
análisis. Las muestras de BAL se analizaron mediante inyección
intradérmica (0,1 ml) en cobayas a los que se administraron
previamente inyecciones intravenosas de 5\times10^{6}
eosinófilos con ^{111}In (producidos en animales donantes
mediante inyecciones intraperitoneales repetidas de suero de caballo
y purificados en gradientes de Percoll discontinuos, >94% de
pureza) (11, 12). Después de 4 horas, los animales del ensayo se
sacrificaron y se punzaron puntos de la piel para el recuento gamma.
Los datos se presentan como media \pm s. e. m. y se analizaron
mediante análisis de varianza de una vía. Un valor p de <0,05 se
consideró estadísticamente significativo.
Resultados: La Figura 1 presenta,
esquemáticamente procedimientos para la generación y medición de la
actividad quimioatrayente de eosinófilos in vivo. La Figura
2 ilustra la generación de actividad quimioatrayente de eosinófilos
a lo largo del tiempo en pulmones de cobayas sensibilizados después
de la prueba de provocación con antígeno (cuadrados negros,
n=4-10). Se midió la actividad en un ensayo in
vivo en la piel de la acumulación de eosinófilos con ^{111}In
en cobayas no sensibilizados (3 animales de ensayo por muestra de
BAL). Se observó actividad significativa en las muestras de lavado
broncoalveolar tomadas 0,5, 1,5, 3 y 6 h después de la prueba de
provocación con antígeno (comparadas con las respuestas a la
solución salina intradérmica, mostradas como línea de puntos). No
se observó actividad significativa en las muestras de 24 h. No se
observó actividad en las muestras de lavado obtenidas 3 h después
de la pseudoprueba de provocación (solución salina) de animales
sensibilizados (círculos negros, n=5) o de la prueba de provocación
con antígeno de pseudoanimales sensibilizados (solución salina)
(rombos negros, n=5).
Métodos: Se recogió fluido de lavado
broncoalveolar (BAL) de 25 cobayas sensibilizados (cada lavado con 4
ml, seguido de 2\times10 ml de solución salina) 3 h después de la
prueba de provocación con antígeno (OA al 1%, exposición de 5 min)
se aplicó a una columna HPLC de intercambio catiónico (Ultropac
TSK535CM, 7,5\times150 mm). Se eluyó la actividad en acetato
amónico aprox. 1,4 M, pH 5,5, y se liofilizó para HPLC por exclusión
de tamaño (columnas SWP Ultropac TSK, 7,5\times75 mm, G4000SW,
7,5\times600 mm y G2000SW, 7,5\times600 mm en serie,
equilibrada en TFA al 0,08%). Se eluyó la actividad a aprox. 7 a 14
kDa. Esto se aplicó a una columna HPLC (4\times250 mm) en fase
inversa Vydac C18 de poro amplio (300 \ring{A}) en TFA al 0,08%,
se eluyó con un gradiente lineal de acetonitrilo (ACN del 0 al 80%
en TFA al 0,08%, durante 80 min, en fracciones de 1 ml min^{-1})
y se recogieron fracciones de 0,5 min. Se liofilizaron alícuotas
(4%) de cada fracción en presencia de proteína portadora (BSA,
<0,1 ng de endotoxina mg^{-1}) y se redisolvieron en 0,8 ml de
solución salina para experimentación en los bioanálisis en piel de
acumulación de ^{111}In-eosinófilos y de
^{111}In-neutrófilos durante 2 horas (n=4). Se
produjeron eosinófilos (99%, 0,5% de neutrófilos) con inyecciones
intraperitoneales repetidas de suero de caballo (11, 12) y
neutrófilos (99,4%, 0,6% de eosinófilos) se produjeron con una sola
inyección intraperitoneal de caseína (5% p/v, 15 ml) 17 h antes de
la purificación en gradientes discontinuos de Percoll y marcado con
^{111}In.
Resultados: Los resultados se presentan
en las Figuras 3, 4 y 5. La Figura 3 presenta el perfil de HPLC en
fase inversa final mostrando la absorbancia a 214 nm y el gradiente
de acetonitrilo. La Figura 4 demuestra que se observó actividad
quimioatrayente eosinófila en 2 picos, que corresponden a las
fracciones 51+52 y la fracción 54, que corresponde a picos
discretos de absorbancia. La Figura 5 demuestra que no se detectó
actividad quimioatrayente de neutrófilos significativa en estas
fracciones. En cambio, C5a de cobaya des Arg (plasma activado con
zymosan al 30% (11), aprox. 10 pmoles/punto) produjo la acumulación
tanto de ^{111}In-eosinófilos (5.211\pm893)
como de ^{111}In-neutrófilos (9.872\pm473). Las
fracciones 50, 53, 55 y 56 proporcionaron poca o ninguna actividad
continuamente en los bioanálisis de acumulación de leucocitos en la
piel del cobaya. No se detectó absorbancia de proteína
significativa en el gradiente restante (hasta el 80% de
acetonitrilo).
Métodos: Se liofilizaron 2% de alícuotas
de cada fracción, se redisolvieron en 10 \mul de tampón SDS, se
calentaron (95ºC, 5 min.) y se introdujeron 0,3 \mul en gles de
gradiente de 8 a 25% en un Pharmacia Phast System. Se observaron
los geles con tinción de plata. Se realizó el análisis de masas en
las fracciones 51, 52 y 54 utilizando un Finningan MAT Lasermat con
matrices de ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinnámico
y ácido sinapínico. Se calibraron las mediciones de masas
internamente utilizando patrones de proteína. Se aplicaron 5% de
alícuotas de cada fracción bioactiva (51, 52 y 54) directamente al
análisis de la secuencia N-terminal automática
utilizando ciclos rápidos en un Applied Biosystems 477A que
contenían un microcartucho esencialmente como se describe (32). Se
obtuvieron los residuos aminoterminales 37, 35 y 29 para las
fracciones 51, 52 y 54 respectivamente. No se encontraron
diferencias entre las posiciones correspondientes. Los campos
iniciales visibles de estos tres análisis fueron todos
aproximadamente de 7 a 8 pmoles. Por lo tanto las fracciones 51, 52
y 54 contenían aprox. 200 pmoles cada una, suponiendo el 70 al 80%
de campos de secuenciado. Se observaron huecos en las posiciones 8,
9 y 33, correspondientes a la presencia de restos de cisteína en
estas posiciones. Se redujeron aproximadamente 30 pmoles de la
fracción 54 y se alquilaron por tratamiento sucesivo con
ditiotreitol 1 mM durante 5 min a 50ºC y a continuación acrilamida
10 mM durante 30 min a 37ºC antes de la digestión con tripsina
alquilada (Promega) en Tris/HCl 20 mM, pH 8,8, que contenía 0,5% de
Thesit. Se separaron los péptidos utilizando una columna Reliasil
C18 (300 \ring{A}, 5 \mum) (1\times150 mm) desarrollada con un
gradiente lineal de concentración de acetonitrilo en ácido
trifluoroacético al 0,08% en 50 \mul/min o un sistema HPLC de
Microm. Se sometieron los péptidos purificados a análisis de la
secuencia N-terminal como anteriormente, pero los
cuatro restos de cisteína se identificaron positivamente como
derivado
PTH-cys-S-\beta-propionamida
(33). La posición 70 no dio derivado de PTH en los péptidos T6 y T7
y es una posición probable de O-glucosilación.
Resultados: En las Figuras 6, 7, 8 y 9 se
presentan los resultados. La Figura 6 es una fotografía del gel de
SDS-PAGE. Como referencia, se introdujo
IL-8 humana (72 aminoácidos, aprox. 8 kDa) en las
bandas A, B y C (12, 2,4 y 0,5 ng/0,3 \mul/banda
respectivamente). La duración de la desorción con láser del análisis
de masas por tramos proporcionó señales a 8,81 kDa (mayor) y a 9,03
kDa (menor) para cada una de las fracciones 51 y 52. La fracción 54
proporcionó señales a 8,38 kDa (mayor) y a 8,15 kDa (menor).
Las Figuras 7 y la SEC. ID nº: 1 presentan la
secuencia de aminoácidos de eotaxina, que se determinó secuenciando
la molécula íntegra así como los péptidos procedentes de la
digestión con tripsina (T). El análisis N-terminal
presentó la homología mayor con MCP-1 humana (57%) y
los péptidos trípticos se alinearon fácilmente por comparación con
la secuencia de MCP-1 humana. La Figura 8 presenta
la secuencia de aminoácidos confirmada por secuenciado del ácido
nucleico. La Figura 9 es una comparación de la secuencia de eotaxina
con MCP-1, MCP-2,
MCP-3 humanas (21), MCP-1 de cobaya
(24), MIP-1\alpha, MIP-1\beta y
RANTES humanas (18) que presentan restos conservados
(sombreados).
- (i)
- Eotaxina era un grupo de ambos picos de bioactividad (fracciones 51+52 y fracción 54) de la separación por HPLC en fase inversa final descrita en el Ejemplo 2 (véase Figuras 3, 4 y 5). La acumulación de ^{111}In-eosinófilos en la piel de cobaya se midió durante 4 h como se describe en el Ejemplo 1 (véase Figuras 1 y 2). En los mismos animales (n=4) se inyectó eotaxina en puntos adicionales 30 minutos antes del sacrificio.
- (ii)
- Durante los estudios de fijación, se incubaron 4\times10^{5} eosinófilos con ^{125}I-RANTES 0,1 nM y varias concentraciones de ligando frío (50 \mul a 0ºC durante 2 h). La solución salina tamponada de Hank contenía HEPES 30 mM, EDTA 10 mM; azida sódica al 0,1% y BSA al 1% a pH 7,5. Los resultados son la media de dos análisis cada uno realizado por triplicado.
- (iii)
- Para la medición de las concentraciones de calcio intracelular se cargaron eosinófilos humanos y de cobaya (10^{7} células/ml en PBS exento de Ca^{2+}/Mg^{2+}+BSA al 0,1%) con éster fura-2-acetoximetílico (2,5 \mul, 30 min a 37ºC). Después de dos lavados las células se volvieron a poner en suspensión a razón de 10^{6} células/ml en PBS exento de Ca^{2+}/Mg^{2+} que contenía HEPES 10 mM, BSA al 0,25% y glucosa 10 mM (pH 7,4). Las alícuotas se dispensaron en cubetas de cuarzo y se ajustó el [Ca^{2+}] externo a 1 mM con CaCl_{2}. Se controlaron los cambios de fluorescencia a 37ºC utilizando un espectrofotómetro Perkin Elmer LS50 a longitudes de onda de excitación de 340 nm en 380 nm y longitud de onda de emisión de 510 nm. Se calcularon las concentraciones de [Ca^{2+}]_{i} tal como se describió anteriormente (34) utilizando la relación de las dos lecturas de fluorescencia y una Kd para la fijación de Ca^{2+} a 37ºC de 224 nM. Se prepararon eosinófilos periféricos humanos tal como se describió anteriormente (35) por centrifugación por densidad en Percoll seguido de eliminación inmunomagnética de neutrófilos CD16^{+} utilizando el sistema MACS. Se prepararon eosinófilos de cobaya tal como se describió en el Ejemplo 1 (11, 12).
- (iv)
- Para probar la supresión de la acumulación eosinófila in vivo utilizando RANTES humana, se midió la acumulación de eosinófilos de cobaya marcados con ^{111}I en los puntos de la piel tal como se describió anteriormente. Se inyectaron cobayas con 1,8 pmoles de eotaxina (n=2), 100 pmoles de RANTES (n=1) o con 1,8 pmoles de eotaxina de 100 pmoles de RANTES (n=2). Se utilizó como referencia solución salina intradérmica.
- (v)
- Para probar la actividad antagonista del receptor, se estimularon eosinófilos de cobaya cargados con éster fura-2-acetoximetílico con eotaxina 3 nM con o sin pretratamiento con RANTES humana.
- (vi)
- Para investigar el efecto de la exposición al aerosol de cobayas a la eotaxina, se expusieron cobayas naturales a un aerosol de eotaxina o un medio de referencia (n=8 por grupo). Se realizó la exposición colocando dos animales en una cámara aislada y nebulizando 24 pmoles de eotaxina disuelta en 100 ml de PBS que contenía proteína portadora BSA a razón de 80 \mug/m durante un periodo de 35 a 40 minutos. Los animales de referencia recibieron PBS/BSA aerosolizado de la misma manera. Se sacrificaron los animales 20 horas después de la exposición a eotaxina o al medio de referencia. Se recuperó el fluido BAL (5\times10 ml de HBSS, EDTA 10 mM, pH 7,35) y se centrifugó (300 g, 20 min, 4ºC). El recuento de células BAL totales se determinó con hemocitómetro y se realizaron recuentos de células diferenciadas en preparaciones coloreadas con citospina (DiffQuick) (3 por animal, 400 recuentos de células por portaobjetos).
Resultados: Los resultados se presentan
en las Figuras 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
La Figura 10 demuestra que la eotaxina de cobaya
(1,6 pmoles) produce acumulación significativa de
^{111}In-eosinófilos in vivo 30 min
(cuadros blancos, p<0,01) y 4 h (cuadros negros, p<0,01) tras
la inyección intradérmica. En cambio, las proteínas recombinantes
humanas, RANTES, MIP-1\alpha y
MCP-1 a dosis hasta de 100 pmoles, no tuvieron
efecto durante 4 horas. El recuadro de la Figura 11 demuestra que
eotaxina y RANTES, pero no la IL-8 de la quimiocina
IL-8 C-X-C, inhiben
la fijación de ^{125}I-RANTES (B_{0}=14,4%) en
eosinófilos de cobaya in vitro. La Figura 17 demuestra que
(a) RANTES humano no produce acumulación significativa de
eosinófilos y (b) que RANTES humana inhibe hasta un grado
sustancial la acumulación eosinófila producida por eotaxina, lo que
sugiere que RANTES actúa como antagonista receptor para la eotaxina
in vivo.
La Figura 12 demuestra que eotaxina, RANTES y, a
concentración elevada solamente, MCP-1 producen la
elevación de concentraciones de calcio intracelular en eosinófilos
humanos in vitro. Existen vestigios con eosinófilos
procedentes de un donante. En otros dos donantes eotaxina 2 nM
produjo una elevación de calcio media de 61 nM. En los tres
donantes (97,3\pm1,2% de eosinófilos) las respuestas a RANTES 10
nM fueron [Ca^{2+}]_{i} 194\pm74 nM y las respuestas a
MCP-1 100 nM fueron [Ca^{2+}]_{i}
93\pm38 nM.
La Figura 13 demuestra que eotaxina de cobaya,
pero no RANTES o MCP-1 humanas, eleva las
concentraciones de calcio intracelular en eosinófilos de cobaya
in vitro. Existen vestigios con células procedentes de un
donante. En tres donantes (97,5\pm0,8% de eosinófilos) las
respuestas fueron: eotaxina 2 nM, [Ca^{2+}]_{i} 90\pm13
nM; RANTES 100 nM, [Ca^{2+}]_{i} 2,0\pm1,7 nM;
MCP-1 100 nM, [Ca^{2+}]_{i} 3,3\pm0,7
nM.
La Figura 14 y el recuadro de la Figura 15
demuestran que el tratamiento anterior de eosinófilos de cobaya con
RANTES (100 nM) inhibe el aumento de las concentraciones de calcio
libre intracelular observadas cuando se tratan eosinófilos con
eotaxina (3 nM) sola. RANTES parece ser que actúa como antagonista
receptor en eosinófilos de cobaya. La Figura 16 es una curva de
respuesta a la dosis utilizando eotaxina 3 nM y aumentado las
cantidades de RANTES.
La Figura 18 demuestra que la eotaxina de
cobaya, administrada en forma de aerosol, produce acumulación
eosinófila en las vías respiratorias del cobaya in vivo,
mientras que no se observa sustancialmente acumulación de
neutrófilos.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DENOMINACIÓN: Nacional Hert & Lung Institute
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Dovehouse Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Londres
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Inglaterra
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): SW3 6LY
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 071 352 8121
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- Telefax: 071 376 3442
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DENOMINACIÓN: Ludwig Institute for Cancer Research
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Hedges House, 153-155 Regent Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Londres
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Inglaterra
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): W1R 7FD
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 071 494 0025
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- Telefax: 071 494 1404
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CITOCINA QUIMIOTÁCTICA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9318984
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 14-SEP-1993
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9408602
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 29-ABR-1994
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 73 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Cavia porcellus
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ETAPA DE DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Fluido de lavado broncoalveolar
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN RELATIVAS A LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 73 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Cavia cobaya
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Fluido de lavado broncoalveolar
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN RELATIVAS A LA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- CADENA COMPLEMENTARIA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DENOMINACIÓN/CLAVE: base_modificada: N es inosina
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DENOMINACIÓN/CLAVE: base_modificada: N es inosina
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 15
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DENOMINACIÓN/CLAVE: base_modificada: N es inosina
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- POSICIÓN: 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCTGTTTCC GNGTNACNAA CAAA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN RELATIVAS A LA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DENOMINACIÓN/CLAVE: base_modificada: N es inosina
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DENOMINACIÓN/CLAVE: base_modificada: N es inopina
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 16
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCTTGTCN GGCTTNATTT C
\hfill21
Claims (16)
1. Proteína quimioatrayente aislada capaz de
atraer eosinófilos y de inducir acumulación eosinófila y/o
activación in vitro e in vivo y que no presenta
sustancialmente ningún efecto atractivo para los neutrófilos in
vivo, que está constituida por o comprende una secuencia de
aminoácidos que presenta por lo menos 40% de identidad con la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. ID nº: 1, o un
fragmento de dicha proteína quimioatrayente que conserva sus
actividades biológicas.
2. Proteína quimioatrayente según la
reivindicación 1, que presenta por lo menos 50% de identidad con la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. ID nº: 1.
3. Proteína quimiotáctica según la
reivindicación 1, que presenta por lo menos 60% de identidad con la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. ID nº: 1.
4. Proteína quimioatrayente según la
reivindicación 1, que está constituida por o comprende una secuencia
de aminoácidos como se ha expuesto en la SEC. ID nº: 1 o en la SEC.
ID. nº: 2.
5. Procedimiento para la producción de una
proteína quimioatrayente según cualquiera de las reivindicaciones
1, 2 ó 4, que comprende el aislamiento de una fracción a partir del
fluido de lavado broncoalveolar o de un exudado inflamatorio
obtenido de un ser humano o de un animal no humano sometido a una
prueba con un estímulo provocador, en el que dicha fracción
demuestra actividad quimioatrayente de eosinófilos in vitro e
in vivo y que no presenta sustancialmente ningún efecto
atractivo de neutrófilos in vivo.
6. Procedimiento para la producción de una
proteína quimioatrayente según cualquiera de las reivindicaciones
1, 2 ó 4, que comprende el cultivo in vitro de macrófagos,
linfocitos, neutrófilos, mastocitos, células epiteliales de las
vías respiratorias, células de tejido conectivo, células
endoteliales vasculares o eosinófilos obtenidos a partir de un ser
humano o de un animal no humano, y el aislamiento de las células o
del fluido del cultivo celular de una fracción que demuestra
actividad quimioatrayente de eosinófilos in vitro e in
vivo y que no presenta sustancialmente ningún efecto atractivo
para los neutrófilos in vivo.
7. Anticuerpo que se une específicamente a la
proteína quimioatrayente según cualquiera de las reivindicaciones
1, 2 ó 4.
8. Anticuerpo según la reivindicación 7, en
el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
9. Anticuerpo según la reivindicación 7 u 8,
para su utilización como medicamento o en diagnóstico.
10. Utilización de un anticuerpo según la
reivindicación 7 u 8, para la preparación de un medicamento
destinado al tratamiento del asma o de otra enfermedad
inflamatoria.
11. Utilización según la reivindicación 10,
para el tratamiento de la rinitis o del eccema.
12. Preparación farmacéutica que comprende,
como ingrediente activo, un anticuerpo según la reivindicación 7 u
8, mezclado o junto con un vehículo farmacéuticamente adecuado.
13. Inmunoanálisis para un antígeno,
caracterizado porque el antígeno es una proteína
quimioatrayente según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó
4.
14. Inmunoanálisis para un anticuerpo,
caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo que forma
un complejo con una proteína quimioatrayente según cualquiera de
las reivindicaciones 1, 2 ó 4.
15. Método de ensayo de un compuesto para un
efecto inhibidor sobre la actividad de una citocina quimioatrayente
in vitro, caracterizado porque la citosina
quimioatrayente es una proteína quimioatrayente según cualquiera de
las reivindicaciones 1, 2 ó 4.
16. Procedimiento para la preparación de un
anticuerpo según la reivindicación 7 u 8, que comprende la
utilización de una proteína quimioatrayente según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 ó 4.
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