ES2767728T3

ES2767728T3 - Célula eucariota con elevada producción de producto de fermentación

Info

Publication number: ES2767728T3
Application number: ES16778760T
Authority: ES
Inventors: Ioannis Papapetridis; Jacobus Pronk; Maris Antonius Van; Paul Klaassen
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2015-10-06
Filing date: 2016-10-03
Publication date: 2020-06-18
Anticipated expiration: 2036-10-03
Also published as: BR112018004548A2; EP3359655A1; PL3359655T3; CA2998981A1; EP3620516A1; US11136600B2; WO2017060195A1; DK3359655T3; US20180291404A1; MY186400A; CN108603179A; CA2998981C; CN108603179B; EP3359655B1

Abstract

Una célula eucariota que es naturalmente capaz de fermentación alcohólica que se modifica genéticamente, que comprende uno o más genes heterólogos que codifican: a) D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o b) 6-fosfogluconato deshidrogenasa; y/o c) glucosa deshidrogenasa, gluconolactonasa y gluconato cinasa, en donde a), b) y glucosa deshidrogenasa en c) son dependientes de NAD+.

Description

DESCRIPCIÓN

Célula eucariota con elevada producción de producto de fermentación

Campo

La presente invención se refiere a una célula eucariota con elevada producción de producto de fermentación. En particular, la invención se refiere a células eucariotas convertidoras de ácido acético, pentosa y glucosa con mejorada conversión de acetato. La invención se refiere además a los procesos en donde las células producen productos de fermentación tales como etanol.

Antecedentes

El bioetanol de segunda generación se produce a partir de, por ejemplo, fracciones lignocelulósicas de biomasa vegetal que se hidroliza en azúcares monoméricos libres, tales como hexosas y pentosas, para la fermentación en etanol. Aparte de la liberación de azúcar durante el pretratamiento y la hidrólisis de la biomasa, se forman algunos subproductos tóxicos. Por ejemplo, furfural y HMF son dos de estos productos. Las cantidades en las que se forman dependen de varios parámetros de pretratamiento, tales como temperatura, presión y tiempo de pretratamiento. Los hidrolizados lignocelulósicos también contienen altas cantidades de ácido acético, que es un potente inhibidor de la capacidad fermentativa de los microorganismos, tales como las células eucariotas.

Se ha informado de varios enfoques diferentes que podrían ayudar a reducir el efecto inhibidor de ácido acético sobre la fermentación de los azúcares en hidrolizados, así como a resolver (parcialmente) los problemas del equilibrio de oxidación-reducción tras la deleción de los genes implicados en la producción de glicerol, por ejemplo, por ingeniería genética de células eucariotas. El ácido acético, junto con otros inhibidores, se pueden retirar de los hidrolizados mediante procedimientos de desintoxicación química o biológica. Las etapas de desintoxicación adicionales después del pretratamiento son, sin embargo, caras y/o provocan una pérdida de sustrato fermentable. En condiciones anaerobias, Saccharomyces cerevisiae no puede consumir naturalmente ácido acético. Además, la tolerancia al ácido acético parece variar considerablemente entre diferentes cepas. La investigación anterior se ha centrado principalmente en la identificación de posibles candidatos a genes asociados a la elevada tolerancia y en la generación de cepas con elevada robustez mediante el uso de enfoques metabólicos/de ingeniería evolutiva. Sin embargo, no se ha explorado suficientemente el concepto de generación de cepas desintoxicantes mediante la expresión de enzimas heterólogas.

Medina et al. 2010 describen que la expresión de mhpFde E. coli, que codifica una acetaldehído deshidrogenasa acetilante dependiente de NAD+, permitió el crecimiento anaerobio de una cepa gpdlA gpd2ñ acoplando la reducción de acetato a acetaldehído con regeneración de NAD+. Este enfoque suprimió completamente la formación de glicerol y produjo un aumento de 13 % del rendimiento de etanol en azúcar, causado principalmente por la minimización de las pérdidas de carbono para la producción de glicerol y la reducción de ácido acético en etanol. Un beneficio adicional importante de esta estrategia es que permite la desintoxicación in situ de ácido acético por la levadura. Sin embargo, la cantidad de ácido acético que se puede reducir de esta forma está limitada por la cantidad de NADH que se genera durante el anabolismo, que se acopla a la formación de biomasa.

El documento de patente US 2005/153411 describe un método de preparación de una cepa productora de etanol, que utiliza xilosa, de Saccharomyces cerevisiae que comprende genes para la expresión en exceso de xilosa reductasa, xilitol deshidrogenasa y xilulocinasa, en donde además de dichos genes, se introducen y opcionalmente expresan en exceso los genes para la producción de fosfoacetiltransferasa y acetaldehído deshidrogenasa.

El documento de patente EP 2 277 989 describe una célula de levadura que carece de la actividad enzimática necesaria para la síntesis de glicerol dependiente de NADH o la célula que tiene una actividad enzimática reducida con respecto a la síntesis de glicerol dependiente de NADH en comparación con su célula de levadura no mutante correspondiente, comprendiendo la célula una o más secuencias de ácidos nucleicos heterólogas que codifican una actividad de acetaldehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.10) acetilante dependiente de NAD+.

El documento de patente WO2015/148272 describe una célula de levadura recombinante que incluye al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica uno o más polipéptidos que tienen actividad de fosfocetolasa; actividad de fosfotransacetilasa; y/o actividad de acetaldehído deshidrogenasa acetilante, en donde la célula no incluye un gen de xilosa reductasa modificado heterólogo, y en donde la célula es capaz de elevada producción de productos finales bioquímicos en un proceso de fermentación cuando se compara con una célula de levadura parental.

Pickl et al. 2015 describen la purificación y caracterización de un novedoso tipo de Glc6PDH en Haloferax volcanii. Por tanto, aún existe la necesidad de mejorar la conversión de acetato, pentosa y/o hexosa en producto de fermentación.

Sumario

Es, por tanto, un objeto de la presente invención proporcionar células eucariotas que sean capaces de producir etanol a partir de ácido acético o acetato mientras que retienen sus capacidades de fermentación de hexosas (glucosa, fructosa, galactosa, etc.), así como pentosas como xilosa, así como procesos en donde estas cepas se usan para la producción de etanol y/u otros productos de fermentación.

Es otro objeto proporcionar células, por ejemplo células eucariotas que son capaces de producir etanol a partir de glicerol y/o glicerol y ácido acético mientras que retienen sus capacidades de fermentación de hexosas (glucosa, fructosa, galactosa, etc.), así como pentosas como xilosa. Otro objeto es aumentar la producción de producto de fermentación (rendimiento, velocidad de producción, o ambos). En una realización de la misma, la célula eucariota produce menos glicerol.

Además, es un objeto de la invención proporcionar una cepa de células eucariotas que pueda co-fermentar anaeróbicamente acetato, pentosa y glucosa.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método rentable de producción de etanol por fermentación de pentosa y/o acetato.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar una célula eucariota que sea capaz de fermentar pentosa a una velocidad más alta que la que se puede lograr usando las cepas actualmente conocidos en la técnica.

Es otro objeto reducir el tiempo de fermentación.

Es otro objeto aumentar el rendimiento de la fermentación.

Otros objetos, características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la revisión de la memoria descriptiva y las reivindicaciones.

Se obtienen uno o más de estos objetos según la invención que proporciona una célula eucariota que está genéticamente modificada que comprende uno o más genes heterólogos que codifican:

a) D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa;

b) 6-fosfogluconato deshidrogenasa y/o

c) glucosa deshidrogenasa, gluconolactonasa y gluconato cinasa,

en donde a), b) y la glucosa deshidrogenasa en c) son dependientes de NAD+.

Según la invención, se puede aumentar el nivel de NADH citosólico en la célula eucariota. Esto puede conducir en una realización a un rendimiento de glicerol mejorado, que es ventajoso en la industria vitivinícola. En una segunda realización, puede dar como resultado elevada reducción del nivel de acetato y/o elevado rendimiento de producto de fermentación, por ejemplo etanol, que es ventajoso en la industria de los biocombustibles. En una tercera realización, en particular cuando tanto a) y b) son dependientes de NAD+, la NADH generada se puede usar en la producción de cualquier producto de fermentación en la célula eucariota, en donde NADH en el citosol actúa de cofactor reductor. En una tercera realización, la NADH generada se puede usar en la producción de cualquier producto de fermentación en la célula eucariota, en donde la NADH en el citosol actúa de cofactor reductor. Estas ventajas se detallan a continuación en el presente documento.

En una realización de la invención, la célula eucariota comprende un gen que codifica D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+ a) (en esa realización la 6-fosfogluconato deshidrogenasa aún puede ser dependiente de NADP+). En otra realización de la invención, la célula eucariota comprende un gen que codifica 6-fosfogluconato deshidrogenasa dependiente de NAD+ (b) (en esa realización la D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa aún puede ser dependiente de NADP+). En una realización, la célula eucariota comprende genes que codifican tanto (a) como (b), es decir, tanto D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+ (a) como 6-fosfogluconato deshidrogenasa dependiente de NAD+ (b). Las realizaciones a) y b) generan NADH citosólica. En una realización, la célula comprende c) glucosa deshidrogenasa, gluconolactonasa y gluconato cinasa. Estas tres enzimas forman otra vía de la glucosa a 6-fosfato-gluconato distinta de en la que participa (a) o (b), pero que también genera NADH, puesto que la glucosa deshidrogenasa en (c) es dependiente de NAD+. La realización (c) se puede combinar con las realizaciones (a) y/o (b).

Así, en una realización, la célula eucariota tiene una alteración de uno o más genes nativos que codifican D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o genes nativos que codifican 6-fosfogluconato deshidrogenasa, en donde nativo es nativo en la célula eucariota.

En una realización, la D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa nativa en la célula eucariota se sustituye por la D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+ y/o la 6-fosfogluconato deshidrogenasa nativa en la célula eucariota se sustituye por la 6-fosfogluconato deshidrogenasa dependiente de NAD+. De esa forma, el cofactor de estas enzimas se modifica ventajosamente. Un cambio de la dependencia/especificidad de cofactor se puede denominar en el presente documento "ingeniería de cofactores".

Las células eucariotas según la invención, con gen(es) heterólogo(s) que codifica(n):

a) D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa;

b) 6-fosfogluconato deshidrogenasa; y/o

c) glucosa deshidrogenasa, gluconolactonasa y gluconato cinasa,

en donde a) y b) y glucosa deshidrogenasa en c) son dependientes de NAD+, produce más glicerol que la cepa nativa (que tiene tanto D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP+ como 6-fosfogluconato deshidrogenasa dependiente de NADP+). Las cepas producidas de esa forma son ventajosas para la aplicación en la industria vitivinícola, puesto que más glicerol puede mejorar el sabor del vino y al mismo tiempo se puede reducir la cantidad de etanol, que también se desea en la industria vitivinícola. Estas sorpresas se obtienen según la invención con efecto mínimo sobre la fermentación de la levadura del vino y el proceso de producción del vino. Alternativamente, las cepas según la invención se usan ventajosamente en la industria de los biocombustibles, por ejemplo la industria de los combustibles de bioetanol.

En una realización, la NADH generada se puede usar en la producción de cualquier producto de fermentación, en donde NADH en el citosol actúa de cofactor reductor. Esto permite la producción de productos de fermentación que de otro modo no se producirían por las células eucariotas debido a la ausencia de NADH en el citosol, o mejora el rendimiento en caso de que la producción de dicho producto de fermentación se limite por el nivel de NADH en el citosol. En esta realización es ventajoso que tanto (a) D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa como (b) 6-fosfogluconato deshidrogenasa sean dependientes de NAD+, o incluso (a), (b) y (c1) glucosa deshidrogenasa sean dependientes de NAD+. Estas realizaciones permiten que los niveles de NADH en el citosol sean más altos. Así (a), (b) y (c1) crean flexibilidad: Es posible que el experto, para cada producto de fermentación y sustrato, convierta una parte flexible del sustrato en CO²y NADH en el citosol, que se adapta a la necesidad de producir el producto de fermentación con un alto rendimiento. En una realización, el producto de fermentación es un producto que está más reducido que el sustrato del que derivó, por ejemplo glucosa. Los ejemplos de productos de fermentación adecuados que están más reducidos que la glucosa es el glicerol. El experto puede determinar los productos de fermentación que pueden ser fermentados de esa forma. Dicha fermentación puede ser aerobia o anaerobia.

En una realización, la célula eucariota es genéticamente modificada, que comprende uno o más genes heterólogos que codifican:

a) D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o

b) 6-fosfogluconato deshidrogenasa;

en donde a) y b) son dependientes de NAD+.

En una realización de la invención, en donde la célula eucariota comprende:

d) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una acetaldehído deshidrogenasa acetilante dependiente de NAD+ (E.C. 1.2.1.10) heteróloga;

e) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una acetil-CoA sintetasa (E.C. 6.2.1.1) homóloga o heteróloga; y opcionalmente

g) una modificación que conduce a la reducción de la actividad de glicerol-3-fosfato fosfohidrolasa (E.C.

3.1.3.21) y/o glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.8 o E.C. 1.1.5.3), nativa en la célula eucariota, las ventajas de dichas cepas según la invención son elevado consumo de acetato y elevada producción de producto de fermentación, por ejemplo etanol.

Por tanto la invención se refiere además a un proceso para la fermentación de un sustrato para producir un producto de fermentación con la célula eucariota anterior, en donde se reduce el tiempo de fermentación y/o se aumenta el rendimiento, con elevada salida de producto de fermentación simultánea, con respecto a la fermentación correspondiente con célula eucariota no mutante (como se define en el presente documento).

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra actividades enzimáticas específicas in vitro de extractos libres de células de cultivos de crecimiento exponencial en matraz oscilante, recogidas a DO (la densidad óptica se mide en el presente documento a 660 nm, y se abrevia "DO") = 4 a 5. Se cultivaron los cultivos en medio sintético complementado con 20 g L-1 de glucosa, pH 6, 30 °C, 200 rpm. Se indican: se da la actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, actividad de 6-fosfogluconato deshidrogenasa dependiente de NADP+, actividad de 6-fosfogluconato deshidrogenasa dependiente de NAD+ para cuatro cepas: IMX585 (barras blancas, izquierda), IMX705 (barras gris claro), IMX706 (barras gris medio) y IMX707 (barras gris oscuro, derecha). Los datos de las barras de error de experimentos duplicados independientes significan desviaciones de los duplicados. FIG. 2. Perfiles de fermentación de IMX585 (Fig. 2a, arriba), IMX705 (Fig. 2b, arriba), IMX899 (Fig. 2a, centro), IMX756 (Fig. 2b, centro). Glucosa = círculos rellenos, biomasa = cuadrados rellenos, glicerol = cuadrados abiertos, etanol = círculos abiertos. Las fermentaciones se realizaron en medio sintético complementado con 20 g L-1 de glucosa. Los lotes se realizaron a pH 5, burbujeo de 500 mL min-1 de N², 30 °C. La biomasa se calculó convirtiendo los valores de DO a través de la fermentación hasta biomasa basándose en una fórmula entre DO y conversión de biomasa derivada de la representación de muestras de biomasa reales frente a DO durante la fase exponencial media.

Rendimiento de glicerol en glucosa de las fermentaciones de lotes anaerobios realizados con IMX585, IMX705, IMX899, IMX756 (Fig. 2a, abajo). Rendimientos de etanol en glucosa a partir de las mismas fermentaciones (Fig. 2b, abajo). El cálculo de los rendimientos de etanol se basó en datos corregidos para la evaporación. Los datos se presentan como promedios de experimentos duplicados independientes.

FIG. 3: Perfiles de fermentación de IMX585 (Fig. 3a, arriba), IMX888 (Fig. 3b, arriba) y IMX860 (Fig. 3a, centro). Glucosa = círculos rellenos, biomasa = cuadrados rellenos, glicerol = cuadrados abiertos, etanol = círculos abiertos, acetato = triángulos. Las fermentaciones se realizaron en medio sintético complementado con 20 g L'1 de glucosa y 3 g L'1 de ácido acético. Los lotes se realizaron a pH 5, burbujeo de 500 mL min-1 de N², 30 °C. La biomasa se calculó convirtiendo los valores de DO a través de la fermentación en biomasa basándose en una fórmula de conversión entre DO y biomasa basada derivada de la representación de muestras de biomasa reales frente a DO durante la fase exponencial media.

Relación entre el acetato consumido por la glucosa consumida en fermentaciones discontinuas anaerobias realizadas con IMX585, IMX888 y IMX860 (Fig. 3a, abajo). Relación de acetato consumido por biomasa formada a partir de las mismas fermentaciones (Fig. 3b, abajo). Los datos se presentan como promedios de experimentos duplicados independientes.

La FIG. 4 muestra el ciclo de tipo transhidrogenasa accionado por ATP catalizado por Acs1p/Acs2p, EutEp y Ald6p.

Breve descripción del listado de secuencias

SEQ ID NO: 1 Casete de expresión sintético gndA de codones optimizados;

SEQ ID NO: 2 Proteína GndA (Methylobacillus flagellates);

SEQ ID NO: 3 Casete de expresión sintético gox1705 de codones optimizados

SEQ ID NO: 4 Proteína Gox1705 (Gluconobacter oxidans 621H)

SEQ ID NO: 5 Casete de expresión sintético de 6pgdh de codones optimizados

SEQ ID NO: 6 Proteína 6pgdh WP_011089498.1 (múltiples especies [Bradyrhizobium])

SEQ ID NO: 7 Gen azf de codones optimizados

SEQ ID NO: 8 Proteína azf (ADEE03728.1, Haloferax volcanii)

SEQ ID NO: 9 Casete de expresión eutE

SEQ ID NO: 10 Confirmación de cebador de deleción de GPD2 (Código de cebador: 2015)

SEQ ID NO: 11 Confirmación de cebador de deleción de GPD2 (Código de cebador: 2112)

SEQ ID NO: 12 Confirmación de cebador de deleción de GND1 (Código de cebador: 2123)

SEQ ID NO: 13 Confirmación de cebador de deleción de GND1 (Código de cebador: 2124)

SEQ ID NO: 14 Confirmación de cebador de deleción de ALD6 (Código de cebador: 2164)

SEQ ID NO: 15 Confirmación de cebador de deleción de ALD6 (Código de cebador: 2171)

SEQ ID NO: 16 Confirmación de cebador de deleción de GPD1 (Código de cebador: 4397)

SEQ ID NO: 17 Confirmación de cebador de deleción de GPD1 (Código de cebador: 4401)

SEQ ID NO: 18 Cebador para la amplificación del esqueleto de pMEL11 (Código de cebador: 5792)

SEQ ID NO: 19 Cebador para la amplificación del esqueleto de pROS11 (Código de cebador: 5793)

SEQ ID NO: 20 Cebador para la amplificación de la secuencia de inserción de pMEL11 (Código de cebador: 5979)

SEQ ID NO: 21 Cebador para la amplificación del esqueleto de pMEL11 (Código de cebador: 5980)

SEQ ID NO: 22 Cebador para la amplificación de la secuencia de inserción de pROS11 (que se dirige a GPD1) (Código de cebador: 6965)

SEQ ID NO: 23 Cebador para la amplificación de la secuencia de inserción de pROS11 (que se dirige a GPD2) (Código de cebador: 6966)

SEQ ID NO: 24 Cebador para el oligonucleótido de reparación (inactivado en GPD1) (Código de cebador: 6967)

SEQ ID NO: 25 Cebador para el oligonucleótido de reparación (inactivado en GPD1) (Código de cebador: 6968)

SEQ ID NO: 26 Cebador para la amplificación del inserto de pMEL11 (que se dirige a GND2) (Código de cebador: 7231)

SEQ ID NO: 27 Cebador para la confirmación de la deleción de GND2 (Código de cebador: 7258)

SEQ ID NO: 28 Cebador para la confirmación de la deleción de GND2 (Código de cebador: 7259)

SEQ ID NO: 29 Cebador para el oligonucleótido de reparación (inactivado en GND2) (Código de cebador: 7299)

SEQ ID NO: 30 Cebador para el oligonucleótido de reparación (inactivado en GND2) (Código de cebador: 7300)

SEQ ID NO: 31 Cebador para la amplificación del inserto de pMEL11 (que se dirige a GND1) (Código de cebador: 7365)

SEQ ID NO: 32 Cebador para la amplificación del casete de integración (gndA, 6pgdh, gox1705) (Código de cebador: 7380)

SEQ ID NO: 33 Cebador para la amplificación del casete de integración (gndA, 6pgdh, gox1705) (Código de cebador: 7381)

SEQ ID NO: 34 Cebador para la confirmación de la integración de gndA (Código de cebador: 7441)

SEQ ID NO: 35 Cebador para la confirmación de la integración de gndA (Código de cebador: 7442)

SEQ ID NO: 36 Cebador para la confirmación de la integración de 6pgdh (Código de cebador: 7443)

SEQ ID NO: 37 Cebador para la confirmación de la integración de 6pgdh (Código de cebador: 7444)

SEQ ID NO: 38 Cebador para la confirmación de la integración de gox1705 (Código de cebador: 7445) SEQ ID NO: 39 Cebador para la confirmación de la integración de gox1705 (Código de cebador: 7446) SEQ ID NO: 40 Cebador para el oligonucleótido de reparación (inactivado en ALD6) (Código de cebador: 7608) SEQ ID NO: 41 Oligonucleótido de reparación (inactivado en ALD6) (Código de cebador: 7609)

SEQ ID NO: 42 Cebador para la amplificación del inserto de pMEL11 (que se dirige a ALD6) (Código de cebador: 7610)

SEQ ID NO: 43 Cebador para la amplificación del casete de integración (eutE) (Código de cebador: 7991) SEQ ID NO: 44 Cebador para la amplificación del casete de integración (eutE) (Código de cebador: 7992) SEQ ID NO: 45 Cebador para la confirmación de la integración de eutE (Código de cebador: 8337)

SEQ ID NO: 46 Cebador para la confirmación de la integración de eutE (Código de cebador: 8338)

SEQ 10 NO: 47 Secuencia de aminoácidos de aldehído oxidorreductasa (EutE de Escherichia coli);

SEQ 10 NO: 48 Secuencia de aminoácidos de glicerol deshidrogenasa de E. coli (gldA de Escherichia coli).

SEQ ID NO: 49 Secuencia de nucleótidos de gndA de codones optimizados (6-fosfogluconato deshidrogenasa) (Methylobacillus flagellatus)

SEQ ID NO: 50 Secuencia de nucleótidos de gox1705 de codones optimizados (6-fosfogluconato deshidrogenasa) (Gluconobacter oxidans)

SEQ ID NO: 51 Secuencia de nucleótidos de 6pgdh de codones optimizados (6-fosfogluconato deshidrogenasa) (Bradyrhizobium sp.)

SEQ ID NO: 52 Secuencia de nucleótidos de azf de codones optimizados (glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) (Haloferax volcanii)

SEQ ID NO: 53 Secuencia de nucleótidos de eutE de codones optimizados (acetaldehído deshidrogenasa acetilante) (E. coli)

Descripción detallada

En toda la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprenden" e "incluyen" y variaciones tales como "comprende", "que comprende", "incluye" y "que incluye" se deben interpretar inclusivamente. Es decir, estas palabras pretenden expresar la posible inclusión de otros elementos o números enteros no específicamente citados, donde lo permita el contexto.

Los artículos "un" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o más de uno (es decir, a uno o al menos uno) del sujeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento. A modo de ejemplo, la célula puede ser en el presente documento una célula, pero también se refiere a una población de células o una cepa.

"Célula eucariota" se define en el presente documento como cualquier microorganismo eucariota. Los eucariotas pertenecen al taxón Eukarya o Eucariota. La característica definitoria que diferencia las células eucariotas de las células procariotas (Bacteria y Archaea) es que tienen orgánulos unidos a la membrana, especialmente el núcleo, que contiene el material genético, y está rodeado por la envoltura nuclear. La presencia de un núcleo da a los eucariotas su nombre, que procede del griego su (eu, "bien") y Kápuov (carion, "nuez" o "fruto"). Las células eucariotas también contienen otros orgánulos unidos a la membrana, tales como mitocondrias y el aparato de Golgi. Muchos organismos unicelulares son eucariotas, tales como protozoos y hongos. Todos los organismos multicelulares son eucariotas. Los eucariotas unicelulares consisten en una única célula durante todo su ciclo vital. Los eucariotas microbianos pueden ser o haploides o diploides. Preferentemente, la célula eucariota es capaz de fermentación anaerobia, más preferentemente fermentación alcohólica anaerobia.

"Dependiente de NAD+" es en el presente documento una proteína específica de característica descrita por la fórmula:

1 < KmNADP+ / KmNAD+ < ~ (infinito)

Dependiente de NAD+ es equivalente en el presente documento a específico de NAD+, la dependencia de NAD+ es en el presente documento equivalente a la especificidad por NAD+. En una realización, KmNADP+ / KmNADP+ es entre 1 y 1000, entre 1 y 500, entre 1 y 200, entre 1 y 100, entre 1 y 50, entre 1 y 10, entre 5 y 100, entre 5 y 50, entre 5 y 20 o entre 5 y 10.

La Km es para las proteínas (por ejemplo, proteínas a), b) y c1) en las reivindicaciones) y se determina en el presente documento como específico de proteína, para NAD+ y NADP+ respectivamente, usando técnicas de análisis, cálculos y protocolos conocidos. Estos se describen en el presente documento y, por ejemplo, en Lodish et al., Molecular Cell Biology 6a Edición, Ed. Freeman, páginas 80 y 81, por ejemplo la Figura 3-22.

"Identidad de secuencia"

Se dice que las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos son homólogas cuando presentan un cierto nivel de similitud. Dos secuencias que son homólogas indican un origen evolutivo común. Si dos secuencias homólogas están estrechamente relacionadas o más distantemente relacionadas, se indica por "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", que es alto o bajo, respectivamente. Aunque se debate, para indicar "porcentaje de identidad" o "porcentaje similitud", se usan frecuentemente indistintamente "nivel de homología" o "porcentaje de homología". Una comparación de secuencias y determinación de porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden llevar a cabo usando un algoritmo matemático. El experto conocerá el hecho de que están disponibles varios programas informáticos diferentes para alinear dos secuencias y determinar la homología entre dos secuencias. Una visión general de la comparación de secuencias en D. Sankoff y J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch para el alineamiento de dos secuencias. (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). El algoritmo alinea secuencias de aminoácidos, así como secuencias de nucleótidos. El algoritmo de NeedlemanWunsch se ha implementado en el programa informático NEEDLE. Con el fin de la presente invención, se usó el programa NEEDLE del paquete EMBOSS (versión 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. y Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Para secuencias de proteínas, se usa EBLOSUM62 para la matriz de sustitución. Para secuencias de nucleótidos, se usa EDNAFULL. Se pueden especificar otras matrices. Los parámetros opcionales usados para el alineamiento de secuencias de aminoácidos son una penalización por abertura de hueco de 10 y una penalización por extensión de hueco de 0,5. El experto apreciará que todos estos parámetros diferentes darán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje global de identidad de dos secuencias no se altera significativamente cuando se usan diferentes algoritmos.

Definición de homología global

La homología o identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias completas con respecto a la región alineada total que incluye cualquier hueco o extensión. La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula del siguiente modo: Número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestra un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido entre la longitud total del alineamiento que incluye los huecos. La identidad definida como en el presente documento se puede obtener de NEEDLE y se marca en la salida del programa como "IDENTIDAD".

Definición de identidad más larga

La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula del siguiente modo: Número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestra un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido entre la longitud total del alineamiento después de la resta del número total de huecos en el alineamiento. La identidad definida como en el presente documento se puede obtener de NEEDLE usando la opción NOBRIEF y se marca en la salida del programa como "identidad más larga".

Una variante de una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos desvelada en el presente documento también se puede definir como una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos específicamente desvelada en el presente documento (por ejemplo, en el listado de secuencias).

Opcionalmente, en la determinación del grado de similitud de aminoácidos, el experto también puede tener en cuenta las denominadas sustituciones "conservativos" de aminoácidos, como será evidente para el experto. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de restos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales de hidroxilo alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina. Se desvelan variantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos en el presente documento son aquellas en las que se ha retirado al menos un resto en las secuencias desveladas y se ha insertado un resto diferente en su lugar. Preferentemente, el cambio de aminoácidos es conservativo. Las sustituciones conservativas preferidas para cada uno de los aminoácidos que existen de forma natural son las siguientes: Ala a ser; Arg a lys; Asn a gln o his; Asp a glu; Cys a ser o ala; Gln a asn; Glu a asp; Gly a pro; His a asn o gln; Ile a leu o val; Leu a ile o val; Lys a arg; gln o glu; Met a leu o ile; Phe a Met, leu o tyr; Ser a thr; Thr a ser; Trp a tyr; Tyr a trp o phe; y, Val a ile o leu.

También se pueden definir secuencias de nucleótidos de la invención por su capacidad para hibridarse con partes de las secuencias de nucleótidos específicas desveladas en el presente documento, respectivamente, en condiciones de hibridación moderadas, o preferentemente en rigurosas. Las condiciones de hibridación rigurosas se definen en el presente documento como condiciones que permiten que una secuencia de ácidos nucleicos de al menos aproximadamente 25, preferentemente aproximadamente 50 nucleótidos, 75 o 100, y lo más preferentemente de aproximadamente 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de aproximadamente 65 °C en una disolución que comprende sal aproximadamente 1 M, preferentemente 6 x SSC, o cualquier otra disolución que tiene una fuerza iónica comparable, y lavando a 65 °C en una disolución que comprende sal aproximadamente 0,1 M, o menos, preferentemente 0,2 x SSC, o cualquier otra disolución que tiene una fuerza iónica comparable. Preferentemente, la hibridación se realiza durante la noche, es decir, al menos durante 10 horas y el lavado se realiza preferentemente durante al menos una hora con al menos dos cambios de la disolución de lavado. Estas condiciones permitirán normalmente la hibridación de secuencias específicas que tienen aproximadamente 90 % o más identidad de secuencia.

Condiciones moderadas se definen en el presente documento como condiciones que permiten que una secuencia de ácidos nucleicos de al menos 50 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de aproximadamente 45 °C en una disolución que comprende sal aproximadamente 1 M, preferentemente 6 x SSC o cualquier otra disolución que tiene una fuerza iónica comparable, y lavado a temperatura ambiente en una disolución que comprende sal aproximadamente 1 M, preferentemente 6 x SSC, o cualquier otra disolución que tiene una fuerza iónica comparable. Preferentemente, la hibridación se realiza durante la noche, es decir, al menos durante 10 horas, y preferentemente el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la disolución de lavado. Estas condiciones normalmente permitirán la hibridación específica de secuencias que tienen hasta 50 % de identidad de secuencia. El experto en la materia será capaz de modificar estas condiciones de hibridación con el fin de identificar específicamente secuencias que varían en identidad entre 50 % y 90 %.

Una "construcción de ácidos nucleicos" o "vector de ácido nucleico" se entiende en el presente documento que significa una molécula de ácidos nucleicos diseñada por el hombre resultante del uso de tecnología de ADN recombinante. El término "construcción de ácidos nucleicos", por tanto, no incluye moléculas de ácidos nucleicos que existen de forma natural, aunque una construcción de ácidos nucleicos puede comprender (partes de) moléculas de ácidos nucleicos que existen de forma natural. Los términos "vector de expresión" o "construcción de expresión" se refieren a secuencias de nucleótidos que son capaces de afectar la expresión de un gen en células hospedadoras u organismos hospedadores compatibles con tales secuencias. Estos vectores de expresión normalmente incluyen al menos secuencias reguladoras de la transcripción adecuadas y opcionalmente señales de terminación de la transcripción de 3'. También puede estar presentes factores necesarios adicionales o útiles en efectuar la expresión, tales como elementos potenciadores de la expresión. El vector de expresión se introducirá en una célula hospedadora adecuada y será capaz de efectuar la expresión de la secuencia codificante en un cultivo celular in vitro de la célula hospedadora. El vector de expresión será adecuado para la replicación en la célula hospedadora u organismo de la invención.

Como se usa en el presente documento, el término "promotor" o "secuencia reguladora de la transcripción" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona controlando la transcripción de una o más secuencias codificantes, y se localiza en la dirección 5' con respecto a la dirección de transcripción del sitio de iniciación de la transcripción de la secuencia codificante, y es estructuralmente identificado por la presencia de un sitio de unión para ARN polimerasa dependiente de ADN, sitios de iniciación de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN, que incluye, pero no se limita a, sitios de unión al factor de transcripción, sitios de unión a la proteína represora y activadora, y cualquier otra secuencia de nucleótidos conocida para un experto en la materia por actuar directamente o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es continuamente activo en la mayoría de las condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está regulado desde el punto de vista fisiológico o del desarrollo, por ejemplo, por la aplicación de un inductor químico.

El término "marcador de selección" es un término familiar para un experto habitual en la materia y se usa en el presente documento para describir cualquier entidad genética que, cuando se expresa, se puede usar para seleccionar una célula o células que contienen el marcador de selección. El término "indicador" se puede usar indistintamente con marcador, aunque principalmente se usa para referirse a marcadores visibles, tales como proteína verde fluorescente (GFP). Los marcadores de selección pueden ser dominantes o recesivos o bidireccionales.

Como se usa en el presente documento, el término "operativamente unido" se refiere a un enlace de elementos de polinucleótido en una relación funcional. Un ácido nucleico está "operativamente unido" cuando se pone en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, una secuencia reguladora de la transcripción está operativamente unida a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia codificante. Operativamente unido significa que las secuencias de ADN que se unen normalmente son contiguas y, donde sea necesario unir dos regiones codificantes de proteína, contiguas y en marco de lectura.

Los términos "proteína" o "polipéptido" se usan indistintamente y se refieren a moléculas que consisten en una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo específico de acción, tamaño, estructura tridimensional u origen.

Las levaduras se definen en el presente documento como microorganismos eucariotas e incluyen todas las especies de la subdivisión Eumycotina que crecen predominantemente en forma unicelular. Las levaduras pueden o bien crecer por gemación de un talo unicelular o bien crecer por fisión del organismo. Las células de levadura preferidas para su uso en la presente invención pertenecen a los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces y Yarrowia. Preferentemente, la levadura es capaz de fermentación anaerobia, más preferentemente fermentación alcohólica anaerobia.

"Hongos" (singular hongo) se entienden en el presente documento como microorganismos eucariotas heterotróficos que digieren su alimento externamente, absorbiendo moléculas nutrientes en sus células. Los hongos son un reino separado de organismos eucariotas e incluyen levaduras, mohos y setas. Los términos hongos, hongo y fúngico, como se usan en el presente documento, incluyen así expresamente levaduras, además de hongos filamentosos.

El término "gen" significa un fragmento de ADN que comprende una región (región transcrita), que se transcribe en una molécula de ARN (por ejemplo, un ARNm) en una célula, operativamente unida a regiones reguladoras adecuadas (por ejemplo, un promotor). Un gen normalmente comprenderá varios fragmentos operativamente unidos, tales como un promotor, una secuencia conductora de 5', una región codificante y una secuencia no traducida de 3' (extremo 3') que comprende un sitio de poliadenilación. "Expresión de un gen" se refiere al proceso en el que una región de ADN que está operativamente unida a regiones reguladoras apropiadas, particularmente un promotor, se transcribe en un ARN, que es biológicamente activo, es decir, que es capaz de ser traducido en una proteína o péptido biológicamente activo.

El término "homólogo", cuando se usa para indicar la relación entre una molécula de ácido nucleico (recombinante) dada o de polipéptido y un organismo hospedador dado o célula hospedadora, se entiende que significa que en la naturaleza el ácido nucleico o molécula de polipéptido se produce por una célula hospedadora u organismos de la misma especie, preferentemente de la misma variedad o cepa. Si es homóloga a una célula hospedadora, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido normalmente se unirá operativamente (pero no necesariamente) a otra secuencia promotora (heteróloga) y, si es aplicable, otra secuencia señal secretora (heteróloga) y/o secuencia terminadora distinta de en su entorno natural. Se entiende que las secuencias reguladoras, secuencias señal, secuencias terminadoras, etc., también pueden ser homólogas a la célula hospedadora. En este contexto, el uso de solo elementos de secuencia "homólogos" permite la construcción de organismos genéticamente modificados (OGM) "auto-clonados" (la auto-clonación se define en el presente documento como en la Directiva europea 98/81/CE, Anexo II). Cuando se usa para indicar la vinculación de dos secuencias de ácidos nucleicos, el término "homólogo" significa que una secuencia de ácidos nucleicos monocatenaria se puede hibridar con una secuencia de ácidos nucleicos monocatenaria complementaria. El grado de hibridación puede depender de varios factores, que incluyen la cantidad de identidad entre las secuencias y las condiciones de hibridación, tales como la temperatura y concentración de sales como se trata después.

Los términos "heterólogo" y "exógeno", cuando se usan con respecto a un ácido nucleico (ADN o ARN) o proteína, se refieren a un ácido nucleico o proteína que no se produce naturalmente como parte del organismo, célula, genoma o secuencia de ADN o ARN en la que está presente, o que se encuentra en una célula o localización o localizaciones en el genoma o secuencia de ADN o ARN que se diferencian de aquella en la que se encuentra en la naturaleza. Los ácidos nucleicos heterólogos y exógenos o proteínas no son endógenos a la célula en la que se introducen, pero han sido obtenidos de otra célula o producidos sintéticamente o recombinantemente. En una realización, un gen heterólogo puede sustituir un gen homólogo, en particular un gen homólogo correspondiente (enzima de expresión con la misma función, pero en el presente documento con un cofactor diferente, es decir, dependiente de NAD+). Alternativamente, el gen homólogo se puede modificar en la célula para llegar a ser dependiente de NAD+, por ejemplo por una o más mutaciones puntuales en el genoma, por ejemplo con tecnología CRISPR CAS. En general, aunque no necesariamente, tales ácidos nucleicos codifican proteínas, es decir, proteínas exógenas, que normalmente no son producidas por la célula en la que el ADN se transcribe o expresa. Similarmente, el ARN exógeno codifica proteínas que normalmente no se expresan en la célula en la que está presente el ARN exógeno. Los ácidos nucleicos heterólogos/exógenos y proteínas también se pueden denominar ácidos nucleicos o proteínas extraños. Cualquier ácido nucleico o proteína que un experto en la materia reconocería como extraño a la célula en la que se expresa está englobado en el presente documento por el término ácido nucleico heterólogo o exógeno o proteína. Los términos heterólogo y exógeno también se aplican a combinaciones no naturales de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos, es decir, combinaciones donde al menos dos de las secuencias combinadas son extrañas la una con respecto a la otra.

Se entiende en el presente documento que la "actividad específica" de una enzima significa la cantidad de actividad de una enzima particular por la cantidad de proteína de célula hospedadora total, normalmente expresada en unidades de actividad enzimática por mg de proteína de célula hospedadora total. En el contexto de la presente invención, la actividad específica de una enzima particular puede aumentar o disminuir en comparación con la actividad específica de esa enzima en una célula hospedadora no mutada (por lo demás idéntica).

"Condiciones anaerobias" o un proceso de fermentación anaerobia se define en el presente documento como condiciones o un proceso de fermentación realizado en ausencia de oxígeno o en el que sustancialmente no se consume oxígeno, preferentemente menos de 5, 2,5 o 1 mmol/L/h, más preferentemente se consumen 0 mmol/L/h (es decir, el consumo de oxígeno no es detectable), y en el que las moléculas orgánicas sirven de tanto donante de electrones como aceptores de electrones.

"Alteración" se entiende en el presente documento que significa cualquier alteración de la actividad, e incluye, pero no se limita a, deleción, mutación, reducción de la afinidad del gen alterado y expresión de ARN antisentido complementario a ARNm correspondiente. Nativo en célula eucariota en el presente documento se entiende como que el gen está presente en la célula eucariota antes de la alteración. Incluye la situación en la que el gen nativo en célula eucariota está presente en una célula eucariota no mutante, una célula eucariota de laboratorio o una célula eucariota industrial. La célula eucariota también se puede designar en el presente documento cepa de célula eucariota o parte de la cepa de célula eucariota.

Por célula eucariota "no mutante" se indica una cepa de células eucariotas fermentadoras de pentosa con niveles normales de genes funcionales dependientes de NADP+ de los que se obtiene la célula eucariota de la presente invención. En ciertos casos, la "célula eucariota no mutante", como se define en la presente solicitud de patente, puede incluir célula eucariota mutagenizada.

Las ecuaciones de reacción en el presente documento son no estequiométricas.

Se describen ahora ciertas realizaciones de la invención:

En una realización, la célula eucariota tiene una alteración de uno o más genes nativos que codifican D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o genes nativos que codifican 6-fosfogluconato deshidrogenasa, en donde nativo es nativo en la célula eucariota. En una realización, en la célula eucariota, la D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa nativa en la célula eucariota se sustituye por la D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa heteróloga y/o en donde la 6-fosfogluconato deshidrogenasa nativa en la célula eucariota se sustituye por la 6-fosfogluconato deshidrogenasa heteróloga. En una realización, en la célula eucariota, los genes nativos que son parte de la vía de la pentosa-fosfato que son dependientes de NADP+ se alteran o delecionan. Los ejemplos de genes a alterar o delecionar son GND1, GND2 y ZWF1. Los genes heterólogos D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+ y 6-fosfogluconato deshidrogenasa pueden ser genes procariotas o genes sintéticos que codifican enzimas procariotas. En una realización, la célula eucariota que tiene genes heterólogos son genes procariotas que se originan a partir de Methylobacillus, Gluconobacter, Bradyrhizobium y Haloferax, por ejemplo, Methylobacillus flagellatus, Gluconobacter oxydans, Bradyrhizobium o Haloferax volcanii.

En una realización, la célula eucariota es una célula de levadura, por ejemplo, una célula de Saccharomyces, por ejemplo célula de Saccharomyces cerevisiae. En una realización, en la célula eucariota, se altera una acetaldehído deshidrogenasa-6 (ALD6). En una realización, la célula eucariota comprende una alteración de uno o más de los genes gpp1, gpp2, gpd1 y gpd2 nativos en la célula eucariota.

La célula eucariota puede comprender: h) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una xilosa isomerasa (E.C. 5.3.1.5) heteróloga y/o i) genes de la vía de la arabinosa, j) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una glicerol deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.6) heteróloga; y k) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una dihidroxiacetona cinasa (E.C. 2.7.1.28 o E.C. 2.7.1.29) homóloga o heteróloga. En una realización, la célula eucariota es una célula eucatriota fermentadora de pentosa y glucosa que es capaz de consumo simultáneo anaerobio de pentosa y glucosa. En una realización, el sustrato es un hidrolizado de material lignocelulósico. Por ejemplo, un hidrolizado enzimático de material lignocelulósico en donde el hidrolizado comprende acetato. El acetato puede estar en la concentración de acetato de 0,3 % (p/p) o más en el hidrolizado.

Las diversas realizaciones de la invención descritas en el presente documento pueden ser combinadas de forma cruzada.

En una realización, la invención proporciona una célula eucariota que está genéticamente modificada que comprende:

a) D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o

b) 6-fosfogluconato deshidrogenasa;

c) glucosa deshidrogenasa, gluconolactonasa y gluconato cinasa, en donde a) y b) y glucosa deshidrogenasa en c) son dependientes de NAD+;

e) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una acetil-CoA sintetasa (E.C. 6.2.1.1) homóloga o heteróloga;

f) una alteración de una o más aldehído deshidrogenasas (E.C. 1.2.1.4) nativas en la célula eucariota g) una modificación que conduce a la reducción de la actividad de glicerol-3-fosfato fosfohidrolasa y/o glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, en comparación con la célula eucariota sin dicha modificación;

h) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una xilosa isomerasa (E.C. 5.3.1.5) heteróloga; i) genes de la vía de la arabinosa

j) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una glicerol deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.6) heteróloga; y/o

k) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una dihidroxiacetona cinasa (E.C. 2.7.1.28 o E.C. 2.7.1.29) homóloga o heteróloga.

Estas características y otras realizaciones de la invención se describen más adelante con más detalle.

a) D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que es dependiente de NAD+

La enzima D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa nativa (abreviada en el presente documento G6PDH o ZWF1) es una enzima que es parte de la parte oxidativa de la vía de la pentosa-fosfato (vía PPP). En células eucariotas, esta enzima es dependiente de NADP+: La reacción catalizada por la enzima nativa es:

D-glucosa-6-fosfato NADP+ <..... ZWF1...... > D-6-glucosa-glucono-lactona NADPH H+

(ecuación 1)

La D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que es dependiente de NAD+ que se usa según la invención usa NAD+ como cofactor. La reacción de la enzima G6PDH dependiente de NAD+ es:

D-glucosa-6-fosfato NAD+ <..... azf.......> D-6-glucosa-glucono-lactona NADH H+

(ecuación 2)

En una realización, la G6PDH dependiente de NAD+ (enzima o gen) se origina a partir de un organismo procariota. "Origina" se entiende en el presente documento que incluye a) aislado de un organismo o b) gen o proteína sintetizado basándose en la información derivada de una secuencia o proteína de gen.

En una realización, G6PDH es un gen heterólogo que codifica una D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que tiene al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 7. En una realización, el gen codifica una enzima que es una D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que tiene al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 8. Los ejemplos adecuados de las enzimas G6PDH anteriores se dan en la Tabla 1.

Tabla 1: Enzimas G6PDH adecuadas e identidad con G6PDH WP 004044412.1

b) 6-fosfogluconato deshidrogenasa

La enzima nativa 6-fosfogluconato deshidrogenasa (abreviada en el presente documento 6PGDH o GND1 o GND2) es una enzima que es parte de la parte oxidativa de la vía de la pentosa-fosfato (vía PPP). En células eucariotas, esta enzima es dependiente de NADP+: La reacción catalizada por la enzima nativa es:

6-fosfogluconato NADP+ <......GND1 o GND2...... >

Ribulosa-5-fosfato NADPH H+ CO²

(ecuación 3)

La 6-fosfogluconato deshidrogenasa que es dependiente de NAD+ que se usa según la invención usa NAD+ como cofactor. La reacción catalizada por la enzima 6PGDH dependiente de NAD+ es:

6-fosfogluconato NAD+ <..... GND1 o GND2 (GndA).......>

Ribulosa-5-fosfato NADH H+ CO²

(ecuación 4)

En una realización, la 6PGDH dependiente de NAD+ (enzima o gen) se origina a partir de un organismo procariota. "Origina" se entiende en el presente documento que incluye a) aislado de un organismo o b) sintetizado basándose en la información derivada de una enzima o gen.

En una realización, 6PGDH es un gen heterólogo que codifica una D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que tiene 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 1. En una realización, el gen codifica una enzima que es una D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que tiene 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 2. Los ejemplos adecuados de las enzimas 6PGDH anteriores se dan en la Tabla 2. En una realización, 6PGDH es un gen heterólogo que codifica una D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que tiene 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 3. En una realización, el gen codifica una enzima que es una D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que tiene 6050, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 4. Los ejemplos adecuados de las enzimas 6PGDH anteriores se dan en la Tabla 3. En una realización, 6PGDH es un gen heterólogo que codifica una D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que tiene 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 5. En una realización, el gen codifica una enzima que es una D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que tiene 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 6. Los ejemplos adecuados de las enzimas 6PGDH anteriores se dan en la Tabla 4. En una realización, las enzimas o genes 6PGDH heterólogos son genes procariotas que se originan de un organismo elegido de la lista de géneros: Methylobacillus, Gluconobacter, Bradyrhizobium y Haloferax. En una realización, las enzimas o genes 6PGDH son genes procariotas que se originan a partir de un organismo elegido de la lista de especies: Methylobacillus flagellatus, Gluconobacter oxydans, Bradyrhizobium y Haloferax volcanii. Los ejemplos de proteínas 6PGDH adecuadas se dan en las Tablas 2, 3 y 4.

Tabla 2: Enzimas 6PGDH adecuadas e identidad con AAF34407.1; 6-fosfogluconato deshidrogenasa (Methylobacillus flagellates 6PGDH)

Tabla 3: Proteínas 6PGDH adecuadas e identidad con WP 011253227.1; 6-fosfogluconato deshidrogenasa (Gluconobacter oxydans 6PGDH]

Tabla 4: Proteínas 6PGDH adecuadas e identidad con WP 011089498.1; 6-fosfogluconato deshidrogenasa (Bradyrhizobium 6PGDH1

c) glucosa deshidrogenasa, gluconolactonasa y gluconato cinasa

En una realización, la célula comprende glucosa deshidrogenasa, gluconolactonasa y gluconato cinasa. La introducción de estos genes y la expresión de las enzimas correspondientes conducen a las siguientes reacciones en la célula:

Glucosa NAD+ <.....glucosa deshidrogenasa...... > gluconolactona NADH

(ecuación 5), seguido por:

Gluconolactona H²O <..... gluconolactonasa...... > gluconato

(ecuación 6), seguido por:

Gluconato ATP <..... gluconato cinasa...... > 6-P-gluconato ADP+ Pi

(ecuación 7) que completa la vía de la glucosa a 6-P-gluconato.

Estas enzimas (designadas c1), c2) y c3), respectivamente, se describen ahora con más detalle.

c1) glucosa deshidrogenasa (EC 1.1.1.118) dependiente de NAD+ es una enzima que cataliza la reacción química

D-glucosa NAD+ ^ D-glucono-1,5-lactona NADH

(ecuación 8)

Así, los dos sustratos de esta enzima son D-glucosa y aceptor, mientras que sus dos productos son D-glucono-1,5-lactona y aceptor reducido. Esta enzima pertenece a la familia de las oxidorreductasas, específicamente las que actúan sobre el grupo de donante CH-OH con otros aceptores. El nombre sistemático de esta clase de enzimas es D-glucosa:aceptor 1-oxidorreductasa. Otros nombres en uso común incluyen glucosa deshidrogenasa (Aspergillus), glucosa deshidrogenasa (descarboxilante) y D-glucosa:(aceptor) 1-oxidorreductasa. Esta enzima participa en la vía de la pentosa-fosfato. Emplea un cofactor, FAD.

c2) Gluconolactonasa (EC 3.1.1.17) es una enzima que cataliza la reacción química

glucono-1,5-lactona H²O ^ D-gluconato

(ecuación 9)

Así, los dos sustratos de esta enzima son D-glucono-1,5-lactona y H²O, mientras que su producto es D-gluconato. Esta enzima pertenece a la familia de las hidrolasas, específicamente las que actúan sobre enlaces éster carboxílico. El nombre sistemático de esta clase de enzimas es D-glucono-1,5-lactona lactonohidrolasa. Otros nombres en uso común incluyen lactonasa, aldonolactonasa, glucono-delta-lactonasa y gulonolactonasa. Esta enzima participa en la vía de la pentosa-fosfato.

c3) Gluconato cinasa o gluconocinasa (EC 2.7.1.12) es una enzima que cataliza la reacción química:

ATP D-gluconato ^ ADP 6-fosfo-D-gluconato

(ecuación 10)

Así, los dos sustratos de esta enzima son ATP y D-gluconato, mientras que sus dos productos son ADP y 6-fosfo-D-gluconato.

Esta enzima pertenece a la familia de las transferasas, específicamente los grupos que contienen fósforo de transferencia (fosfotransferasas) con un grupo alcohol como aceptor. El nombre sistemático de esta clase de enzimas es ATP:D-gluconato 6-fosfotransferasa. Otros nombres en uso común incluyen gluconocinasa (fosforilante) y gluconato cinasa. Esta enzima participa en la vía de la pentosa-fosfato.

d) acetaldehído deshidrogenasa (acetilante) (EC 1.2.1.10)

La célula de la invención puede comprender además un gen exógeno que codifica una enzima con la capacidad para reducir acetil-CoA en acetaldehído, gen que confiere a la célula la capacidad de convertir acetil-CoA (y/o ácido acético) en etanol. Una enzima con la capacidad para reducir acetil-CoA en acetaldehído se entiende en el presente documento como una enzima que cataliza la reacción (ACDH; EC 1.2.1.10):

acetaldehído NAD+ coenzima A ^ acetil-coenzima A NADH H+ (Ecuación 11)

Así, la enzima cataliza la conversión de acetil-CoA en acetaldehído (y viceversa) y también se denomina una acetaldehído deshidrogenasa (acetilante dependiente de NAD) o una acetil-CoA reductasa. La enzima puede ser una enzima bifuncional que cataliza además la conversión de acetaldehído en etanol (y viceversa; véase más adelante). Por comodidad, los presentes inventores se deben referir en el presente documento a una enzima que tiene al menos la capacidad de reducir acetil-CoA en o acetaldehído o etanol como una "acetaldehído deshidrogenasa". Se entiende además en el presente documento que la célula tiene actividades de alcohol deshidrogenasa endógena que permiten a la célula, que se proporciona con actividad de acetaldehído deshidrogenasa, completar la conversión de acetil-CoA en etanol. Además, la célula tiene acetil-CoA sintetasa endógena o exógena, que permite que la célula, que se proporciona con actividad de acetaldehído deshidrogenasa, complete la conversión de ácido acético (mediante acetil-CoA) en etanol.

El gen exógeno puede codificar una enzima monofuncional que tiene solo actividad de acetaldehído deshidrogenasa (es decir, una enzima que solo tiene la capacidad de reducir acetil-CoA en acetaldehído) tal como, por ejemplo, la acetaldehído deshidrogenasa codificada por el gen mhpF de E.coli o el gen EutE de E. coli (la parte que codifica actividad de acetaldehído deshidrogenasa).

Los ejemplos adecuados de procariotas que comprenden enzimas monofuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa se proporcionan en la Tabla 5. Las secuencias de aminoácidos de estas enzimas monofuncionales están disponibles en bases de datos públicas y se pueden usar por el experto para diseñar secuencias de nucleótidos de codones optimizados que codifican la enzima monofuncional correspondiente.

Tabla 5: Enzimas adecuadas con actividad de acetaldehído deshidrogenasa e identidad con mhpF de E.coli

En una realización, la célula comprende un gen exógeno que codifica una enzima bifuncional con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa, gen que confiere a la célula la capacidad de convertir acetil-CoA en etanol. La ventaja de uso de una enzima bifuncional con actividades de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa, en lugar de separar enzimas para cada una de las actividades de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa, es que permite que la canalización directa del producto intermedio entre enzimas que catalizan reacciones consecutivas en una vía ofrezca la posibilidad de un medio eficiente, exclusivo y protegido del suministro de metabolitos. La canalización de sustratos disminuye así el tiempo de tránsito de los productos intermedios, previene la pérdida de productos intermedios por difusión, protege productos intermedios lábiles de disolvente, e impide la entrada de productos intermedios en vías metabólicas que compiten. La enzima bifuncional, por tanto, permite una conversión más eficiente de acetil-CoA en etanol en comparación con las enzimas acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa separadas. Una ventaja adicional de uso de la enzima bifuncional es que también se puede usar en células que tienen poca o ninguna actividad de alcohol deshidrogenasa en la condición usada, tales como, por ejemplo, condiciones anaerobias y/o condiciones de represión de catabolitos.

Se conocen en la técnica enzimas bifuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa. Pueden estar presentes en procariotas y protozoos, que incluyen, por ejemplo, las enzimas bifuncionales codificadas por los genes adhE de Escherichia coli y ADH2 de Entamoeba histolytica (véanse, por ejemplo, Bruchaus y Tannich, 1994, J. Biochem., 303: 743-748; Burdette y Zeikus, 1994, J. Biochem. 302: 163-170; Koo et al., 2005, Biotechnol. Lett. 27: 505-510; Yong et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93: 6464-6469). Las enzimas bifuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa son proteínas más grandes que consisten en aproximadamente 900 aminoácidos y son bifuncionales por que presentan tanto actividad de acetaldehído deshidrogenasa (ACDH; EC 1.2.1.10) como alcohol deshidrogenasa (ADH; EC 1.1.1.1). adhE de E. coli y ADH2 de Entamoeba histolytica muestran 45 % de identidad de aminoácidos. Los ejemplos adecuados de enzimas bifuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa e identidad con adhE de E.coli se dan en la Tabla 6. Los ejemplos adecuados de enzimas bifuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa e identidad con ADH2 de Entamoeba histolytica se dan en la Tabla 7.

Tabla 6: Enzimas bifuncionales adecuadas con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa e identidad con adhE de E. coli

Tabla 7: Enzimas bifuncionales adecuadas con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa e identidad con ADH2 de Entamoeba histolytica

Tabla 8: Enzimas adecuadas con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa e identidad con EutE de E. coli

Para la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima bifuncional que tiene actividades de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa, o la enzima que tiene actividad de acetaldehído deshidrogenasa, la secuencia de nucleótidos (a expresar) se pone en una construcción de expresión en donde se une operativamente a regiones de expresión/secuencias reguladoras adecuadas para garantizar la expresión de la enzima tras la transformación de la construcción de expresión en la célula de la invención (véase anteriormente). Promotores adecuados para la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que tiene la enzima bifuncional que tiene actividades de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa, o la enzima que tiene actividad de acetaldehído deshidrogenasa, incluyen promotores que son preferentemente insensibles a la represión de catabolitos (glucosa), que son activos en condiciones anaerobias y/o que preferentemente no requieren xilosa o arabinosa para la inducción. Los ejemplos de dichos promotores se dan anteriormente.

Preferentemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima bifuncional que tiene actividades de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa, o la enzima que tiene actividad de acetaldehído deshidrogenasa, se adapta para optimizar su uso de codones al de la célula en cuestión (como se ha descrito anteriormente).

e) acetil-CoA sintetasa (EC 6.2.1.1);

La célula de la invención puede comprender un gen que codifica una enzima que tiene la actividad específica de acetil-CoA sintetasa. La acetil-CoA sintetasa o acetato-CoA ligasa es una enzima (EC 6.2.1.1) implicada en el metabolismo de los azúcares de carbono. Está en la clase de ligasas de las enzimas, que significa que cataliza la formación de un nuevo enlace químico entre dos moléculas grandes.

Las dos moléculas unidas por acetil-CoA sintetasa son acetato y coenzima A (CoA). La reacción con los sustratos y productos incluidos es:

Acetato CoA ^ Pirofosfato acetil-CoA (Ecuación 12)

La forma Acs1 y la forma Acs2 de acetil-CoA sintetasa están codificadas por los genes ACS1 y ACS2, respectivamente.

Los ejemplos adecuados de enzimas con actividad de acetil-CoA sintetasa se proporcionan en la Tabla 9.

Tabla 9: ACS adecuadas con identidad con proteína ACS2 de Saccharomyces cerevisiae.

f) Alteración de una o más aldehído deshidrogenasas (E.C. 1.2.1.4) nativas en la célula eucariota.

La enzima que se puede alterar según la invención es una aldehído deshidrogenasa aldehído deshidrogenasa (E.C: 1.2.1.4) nativa en la célula eucariota.

En una realización, la aldehído deshidrogenasa nativa en la célula eucariota es acetaldehído deshidrogenasa-6 (ALD6).

ALD6 es en el presente documento cualquier enzima activada por Mg2+ que catalice la deshidrogenación de acetaldehído en acetato, y viceversa.

La reacción que se cataliza por ALD6 es:

Acetaldehído NAD+/NADP+ H²O <.....ALD6...... > acetato NAD/NADPH

(Ecuación 13)

La enzima ALD6 en la Ecuación 13 genera NADPH y acetato. Por ese motivo, en el contexto de la presente invención, la alteración o deleción de ALD6 es una realización preferida.

Una ventaja adicional de la deleción de ALD6 es evidente si la cepa según la invención comprende una acetaldehído deshidrogenasa acetilante (por ejemplo, adhE o acdH) (véase d) y los documentos de patente WO2015028583 y WO2015028582)). La combinación de acetaldehído deshidrogenasa acetilante y ALD6 en una célula eucariota según la invención puede conducir a un ciclo inútil que consume ATP. La deleción de ALD6 rompe el ciclo inútil, de manera que se evita el consumo de ATP por el ciclo inútil. En una realización de la invención, se deleciona la célula eucariota, una ALD6 de Saccharomyces cerevisiae. Esto se ilustra en la Figura 4.

Las secuencias de nucleótidos de ALD6 adecuadas para alteración con identidad con la secuencia de nucleótidos de ALD6 de Saccharomyces cerevisiae en otras células eucariotas se dan en la Tabla 10.

Tabla 10: Secuencias de nucleótidos ALD6 adecuadas para alteración que ocurren en diferentes tipos de célula eucariota

g) una modificación que conduce a la reducción de la actividad de glicerol-3-fosfato fosfohidrolasa y/o glicerol-3-fosfato deshidrogenasa

La célula eucariota adicional puede comprender además una modificación que conduce a la reducción de la actividad de glicerol-3-fosfato fosfohidrolasa y/o glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, en comparación con la célula eucariota sin dicha modificación.

En esa realización, la célula puede comprender una alteración de una o más secuencia de nucleótidos endógenas que codifican un gen de glicerol-3-fosfato fosfohidrolasa y/o que codifican un gen de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa.

En dicha realización, la actividad enzimática necesaria para la síntesis de glicerol dependiente de NADH se reduce o deleciona. La reducción o deleción de esta actividad enzimática se puede lograr modificando uno o más genes que codifican una actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD) dependiente de NAD, o uno o más genes que codifican una actividad de glicerol fosfato fosfatasa (GPP), de forma que la enzima se expresa considerablemente menos en el no mutante o de forma que el gen codifique un polipéptido con actividad reducida.

Dichas modificaciones se pueden llevar a cabo usando técnicas biotecnológicas comúnmente conocidas, y pueden en particular incluir una o más mutaciones inactivantes o mutagénesis dirigida al sitio de regiones promotoras o regiones codificantes de los genes estructurales que codifican GPD y/o GPP. Alternativamente, las cepas de células eucariotas que son defectuosas en la producción de glicerol se pueden obtener por mutagénesis aleatoria seguida por selección de cepas con actividad reducida o ausente de GPD y/o GPP. Los genes GPD1, GPD2, GPP1 y GPP2 de S. cerevisiae se muestran en el documento de patente WO2011010923, y se desvelan en SEQ ID NO: 24-27 de esa solicitud.

Así, en las células de la invención, se pueden reducir la glicerol-3-fosfato fosfohidrolasa específica y/o que codifica un gen glicerol 3-fosfato deshidrogenasa. En las células de la invención, la actividad de glicerolfosfato deshidrogenasa específica se reduce preferentemente en al menos un factor de 0,8, 0,5, 0,3, 0,1, 0,05 o 0,01 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que causa la reducción en la actividad específica, preferentemente en condiciones anaerobias. La actividad de glicerolfosfato deshidrogenasa se puede determinar como se describe por Overkamp et al. (2002, Eukaryotic cell 19:509-520).

Un gen preferido que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa cuya actividad se va a reducir o inactivar en la célula de la invención es GPD1 de S. cerevisiae como se describe por van den Berg y Steensma (1997, Eukaryotic cell 13:551 -559), que codifica la secuencia de aminoácidos GPD1 y ortólogos de los mismos en otras especies. Los ejemplos adecuados de una enzima con actividad de glicerolfosfato deshidrogenasa que pertenece al género Saccharomyces, Naumovozyna, Candida, Vanderwaltozyma y Zygosaccharomyces se proporcionan en la Tabla 11.

Tabla 11: Enzimas adecuadas con actividad de glicerolfosfato deshidrogenasa (GPD1) caracterizadas por fuente de organismo e identidad de aminoácidos con glicerolfosfato deshidrogenasa de S. cerevisiae (GPD1)

Sin embargo, en algunas cepas, por ejemplo de Saccharomyces, Candida y Zygosaccharomyces, un segundo gen que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa es activo, es decir, GPD2. Otro gen preferido que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa cuya actividad se va a reducir o inactivar en la célula de la invención es, por tanto, GPD2 de S. cerevisiae, que codifica la secuencia de aminoácidos de GPD2 y ortólogos del mismo de otras especies. Los ejemplos adecuados de organismos (hospedadores) que comprenden una enzima con actividad de glicerolfosfato deshidrogenasa que pertenece al género (Zygo)Saccharomyces y Candida se proporcionan en la Tabla 12.

Tabla 12: Enzimas adecuadas con actividad de glicerolfosfato deshidrogenasa (GPD2) caracterizadas por fuente de organismo e identidad de aminoácidos con glicerofosfato deshidrogenasa (GPD2) de S. cerevisiae

En una realización, la célula es una célula eucariota en donde el genoma de la célula eucariota comprende una mutación en al menos un gen seleccionado del grupo de GPD1, GPD2, GPP1 y GPP2, mutación que puede ser una mutación inactivante, mutación inactivante que puede ser una deleción completa de al menos uno de dicho genes en comparación con el gen de células eucariotas no mutantes correspondientes a la célula eucariota.

h) Xilosa isomerasa (E.C. 5.3.1.5).

En una realización, la célula eucariota puede comprender una xilosa isomerasa ((E.C. 5.3.1.5); xylA).

Una "xilosa isomerasa" (E.C. 5.3.1.5) se define en el presente documento como una enzima que cataliza la isomerización directa de D-xilosa en D-xilulosa y/o viceversa. La enzima también se conoce como una D-xilosa cetoisomerasa. Una xilosa isomerasa en el presente documento también puede ser capaz de catalizar la conversión entre D-glucosa y D-fructosa (y, por consiguiente, se puede denominar, por tanto, una glucosa isomerasa). En general, una xilosa isomerasa requiere un catión bivalente, tal como magnesio, manganeso o cobalto como cofactor. i) Enzimas de la vía de la arabinosa (L-arabinosa isomerasa (araA), L-ribulocinasa (araB) y L-ribulosa-5-fosfato 4-epimerasa (araD))

En una realización, la célula comprende genes que expresan enzimas de una vía de fermentación de la L-arabinosa. El documento de patente EP 1499 708 desvela la construcción de una cepa fermentadora de L-arabinosa por expresión en exceso de la vía de la L-arabinosa. En la vía, las enzimas L-arabinosa isomerasa (araA), L-ribulocinasa (araB) y L-ribulosa-5-fosfato 4-epimerasa (araD) participan convirtiendo L-arabinosa en L-ribulosa, L-ribulosa-5-P y D-xilulosa-5-P, respectivamente.

j) Glicerol deshidrogenasa (EC 1.1.1.6)

Una glicerol deshidrogenasa se entiende en el presente documento como una enzima que cataliza la reacción química (EC 1.1.1.6):

glicerol NAD+ ^ glicerona NADH H+ (Ecuación 14)

Otros nombres en uso común incluyen glicerina deshidrogenasa, glicerol deshidrogenasa unida a NAD+ y glicerol:NAD+ 2-oxidorreductasa. Preferentemente, la modificación genética provoca la expresión en exceso de una glicerol deshidrogenasa, por ejemplo, por expresión en exceso de una secuencia de nucleótidos que codifica una glicerol deshidrogenasa. La secuencia de nucleótidos que codifica la glicerol deshidrogenasa puede ser endógena para la célula o puede ser una glicerol deshidrogenasa que es heteróloga para la célula. Las secuencias de nucleótidos que se pueden usar para la expresión en exceso de glicerol deshidrogenasa en las células de la invención son, por ejemplo, el gen glicerol deshidrogenasa de S. cerevisiae (GCY1) como se describe, por ejemplo, por Oechsner et al. (1988, FeBS Lett. 238: 123-128) o Voss et al. (1997, Eukaryotic cell 13: 655-672).

k) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una dihidroxiacetona cinasa (E.C. 2.7.1.28 o E.C. 2.7.1.29) homóloga o heteróloga

Una dihidroxiacetona cinasa se entiende en el presente documento como una enzima que cataliza una de las reacciones químicas:

EC 2.7.1.28 ATP D-gliceraldehído <=> ADP D-gliceraldehído 3-fosfato

EC 2.7.1.29 ATP glicerona <=> ADP glicerona fosfato

o

hcl A ,oh

(Ecuación 15)

Glicerona = dihidroxiacetona.

Otros nombres en uso común incluyen glicerona cinasa, ATP:glicerona fosfotransferasa y acetol cinasa (fosforilante). Se entiende que la glicerona y la dihidroxiacetona son la misma molécula. Preferentemente, la modificación genética provoca la expresión en exceso de una dihidroxiacetona cinasa, por ejemplo, por expresión en exceso de una secuencia de nucleótidos que codifica una dihidroxiacetona cinasa. La secuencia de nucleótidos que codifica la dihidroxiacetona cinasa puede ser endógena para la célula o puede ser una dihidroxiacetona cinasa que es heteróloga para la célula. Las secuencias de nucleótidos que se pueden usar para la expresión en exceso de dihidroxiacetona cinasa en las células de la invención son, por ejemplo, los genes de dihidroxiacetona cinasa de S. cerevisiae (DAK1) y (DAK2) como se describe, por ejemplo, por Molin et al. (2003, J. Biol. Chem. 278:1415-1423). Los ejemplos adecuados de enzimas con actividad de glicerol deshidrogenasa se proporcionan en la Tabla 13.

Tabla 13: GCY adecuadas con identidad con proteína GCY1 de GCY1 de Saccharomyces cerevisiae.

Los ejemplos adecuados de enzimas con actividad de dihidroxi acetona cinasa se proporcionan en la Tabla 14. Tabla 14: DAK adecuadas con identidad con DAK1 proteína de Saccharomyces cerevisiae.

Otras realizaciones de la invención se describen ahora con más detalle.

La invención se refiere además a una célula eucariota como se describe en el presente documento en la fermentación en la industria vitivinícola.

En otra realización, la invención se refiere al uso de la célula eucariota como se describe en el presente documento en la fermentación en la industria de los bicombustibles.

Además, la invención se refiere a un proceso para la fermentación de un sustrato para producir un producto de fermentación con un eucariota como se describe en el presente documento, en la industria de los biocombustibles del vino, en donde el consumo de acetato es elevado al menos 10 %, al menos 20 %, o al menos 25 %, con respecto a la fermentación correspondiente con célula eucariota no mutante. En una realización de la misma, el rendimiento del etanol es al menos aproximadamente 0,5 %, o al menos 1 % superior al de un proceso con la célula eucariota no mutante correspondiente. En dicho proceso, se cofermentan preferentemente pentosa y glucosa. En dicho proceso, se puede fermentar un hidrolizado de material lignocelulósico. El hidrolizado puede ser un hidrolizado enzimático de material lignocelulósico. Dicho hidrolizado puede comprender acetato. El hidrolizado que comprende acetato puede tener una concentración de acetato de 0,3 % (p/p) o más.

La célula eucariota puede contener genes de una vía metabólica de la pentosa no nativa para la célula eucariota y/o que permite que la célula eucariota convierta pentosa(s). En una realización, la célula eucariota puede comprender una o dos o más copias de una o más xilosa isomerasas y/o una o dos o más copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, que permiten que la célula eucariota convierta xilosa. En una realización de la misma, estos genes se pueden integrar en el genoma de la célula eucariota. En otra realización, la célula eucariota comprende los genes araA, araB y araD. Entonces es capaz de fermentar arabinosa. En una realización de la invención, la célula eucariota comprende el gen xylA, gen XYL1 y gen XYL2 y/o gen XKS1, para permitir que la célula eucariota fermente xilosa; deleción del gen aldosa reductasa (GRE3); expresión en exceso de genes PPP, TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1 para permitir el aumento de flujo a través de la vía de la pentosa fosfato en la célula, y/o expresión en exceso de GAL2 y/o deleción de GAL80. Así, mediante la inclusión de los genes anteriores, se pueden introducir pentosa adecuada u otra(s) vía(s) metabólica(s) en la célula eucariota que fueron no nativas en la célula eucariota (no mutante). Según una realización, se pueden introducir los siguientes genes en la célula eucariota por introducción en una célula hospedadora:

1) un conjunto que consiste en los genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1, opcionalmente bajo el control de promotor constitutivo fuerte;

2) un conjunto que consiste en un gen xylA bajo el control de promotor constitutivo fuerte;

3) un conjunto que comprende un gen XKS1 bajo el control de promotor constitutivo fuerte,

4) un conjunto que consiste en los genes araA, araB y araD bajo el control de un promotor constitutivo fuerte

5) deleción de un gen de aldosa reductasa

Las células anteriores se pueden construir usando técnicas de expresión recombinante conocidas. La modificación del cofactor se puede efectuar antes, simultáneamente o después de cualquiera de las modificaciones 1 )-5).

La célula eucariota según la invención se puede someter a ingeniería evolutiva para mejorar sus propiedades. Los procesos de ingeniería evolutiva son procesos conocidos. La ingeniería evolutiva es un proceso en donde fenotipos industrialmente relevantes de un microorganismo, en el presente documento la célula eucariota, se pueden acoplar a la velocidad de crecimiento específica y/o la afinidad por un nutriente, por un proceso de selección natural racionalmente establecida. La ingeniería evolutiva se describe con detalle, por ejemplo, en Kuijper, M, et al, FEMS Eukaryotic cell Research 5(2005) 925-934, documentos de patente WO2008041840 y WO2009112472. Después de la ingeniería evolutiva, se aísla la célula eucariota que fermenta la pentosa resultante. El aislamiento puede ser realizado de cualquier modo conocido, por ejemplo por separación de células de un caldo de células eucariotas usado en la ingeniería evolutiva, por ejemplo, tomando una muestra de células o por filtración o centrifugación. En una realización, la célula eucariota está libre de marcador. Como se usa en el presente documento, el término "marcador" se refiere a un gen que codifica un rasgo o un fenotipo que permite la selección, o el cribado, de una célula hospedadora que contiene el marcador. Libre de marcador significa que los marcadores están esencialmente ausentes en la célula eucariota. El estar libre de marcador es particularmente ventajoso cuando se han usado marcadores antibióticos en la construcción de la célula eucariota y se retiran de aquí. La retirada de marcadores se puede hacer usando cualquier técnica adecuada del estado de la técnica, por ejemplo recombinación intramolecular. En una realización, la célula eucariota industrial se construye basándose en una célula hospedadora tolerante a inhibidor, en donde la construcción se realiza como se describe en lo sucesivo. Las células hospedadoras tolerantes a inhibidor se pueden seleccionar cribando cepas para el crecimiento sobre materiales que contienen inhibidores, tal como se ilustra en Kadar et al, Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847-858, en donde se seleccionó una cepa ATCC 26602 de S. cerevisiae tolerante a inhibidor.

La célula eucariota adicional puede comprender las actividades enzimáticas requeridas para la conversión de piruvato en un producto de fermentación deseado, tal como etanol, butanol (por ejemplo, n-butanol, 2-butanol e isobutanol), ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacónico, un aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, un antibiótico p-lactámico o una cefalosporina.

En una realización, la célula eucariota deriva de una célula eucariota industrial. Una célula industrial y célula eucariota industrial se pueden definir del siguiente modo. Los entornos vivos de células (células eucariotas) en procesos industriales son significativamente diferentes de aquellos en el laboratorio. Las células eucariotas industriales deben ser capaces de rendir bien en múltiples condiciones medioambientales que pueden variar durante el proceso. Dichas variaciones incluyen cambio en las fuentes de nutrientes, pH, concentración de etanol, temperatura, concentración de oxígeno, etc., que juntos tienen un posible impacto sobre el crecimiento celular y la producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae. En condiciones industriales adversas, las cepas tolerantes medioambientales deben permitir el robusto crecimiento y producción. Las cepas de células eucariotas industriales son, en general, más robustas hacia estos cambios en las condiciones medioambientales que pueden ocurrir en las aplicaciones en las que se usan, tales como en la industria panificadora, industria cervecera, fabricación de vino y la industria de biocombustible de etanol. En una realización, la célula eucariota industrial se construye basándose en una célula hospedadora industrial, en donde la construcción se realiza como se describe en lo sucesivo. Los ejemplos de célula eucariota industrial (S. cerevisiae) son Ethanol Red® (Fermentis), Fermiol® (DSM) y Thermosacc® (Lallemand).

Las células eucariotas según la invención son preferentemente tolerantes a inhibidor, es decir, pueden resistir a inhibidores comunes al nivel que normalmente tienen con condiciones comunes de pretratamiento e hidrólisis, de manera que las células eucariotas pueden encontrar una amplia aplicación, es decir, tienen alta aplicabilidad para diferente materia prima, diferentes métodos de pretratamiento y diferentes condiciones de hidrólisis. En una realización, la célula eucariota es tolerante a inhibidor. La tolerancia a inhibidor es resistencia a compuestos inhibidores. La presencia y el nivel de compuestos inhibidores en lignocelulosa pueden variar ampliamente con la variación de materia prima, método de pretratamiento, proceso de hidrólisis. Los ejemplos de categorías de inhibidores son ácidos carboxílicos, furanos y/o compuestos fenólicos. Los ejemplos de ácidos carboxílicos son ácido láctico, ácido acético o ácido fórmico. Los ejemplos de furanos son furfural e hidroxi-metilfurfural. Los ejemplos o compuestos fenólicos son vainillina, ácido siríngico, ácido ferúlico y ácido cumárico. Las cantidades típicas de inhibidores son, para ácidos carboxílicos: varios gramos por litro, hasta 20 gramos por litro o más, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de hidrólisis. Para furanos: varios cientos de miligramos por litro hasta varios gramos por litro, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de hidrólisis. Para fenólicos: varias decenas de miligramos por litro, hasta un gramo por litro, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de hidrólisis.

En una realización, la célula eucariota es una célula que es naturalmente capaz de fermentación alcohólica, preferentemente, fermentación alcohólica anaerobia. Una célula eucariota tiene preferentemente una alta tolerancia a etanol, una alta tolerancia a pH bajo (es decir, capaz de crecimiento a un pH más bajo que aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, o aproximadamente 2,5) y hacia orgánicos y/o una alta tolerancia a temperaturas elevadas.

Además, la invención se refiere a un proceso para la fermentación de un sustrato para producir un producto de fermentación con una célula eucariota como se describe en el presente documento, en la industria vitivinícola, en donde el rendimiento del glicerol es al menos 5 %, al menos 10 % o al menos 10 %, al menos 20 % o al menos 30 % superior al de un proceso con la célula eucariota no mutante correspondiente. En una realización de dicho proceso, el rendimiento del etanol no es elevado o reducido, en comparación con el de un proceso con la célula eucariota no mutante correspondiente.

Cualquiera de las características anteriores o actividades de una célula eucariota pueden estar naturalmente presentes en la célula, o se pueden introducir o modificar por modificación genética.

Expresión recombinante

La célula eucariota es una célula recombinante. Es decir, una célula eucariota comprende, o se transforma con, o se modifica genéticamente con, una secuencia de nucleótidos que no ocurre naturalmente en la célula en cuestión.

Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas para la expresión recombinante de enzimas en una célula, así como para las modificaciones genéticas adicionales de una célula eucariota. Normalmente, dichas técnicas implican la transformación de una célula con construcción de ácidos nucleicos que comprende la secuencia relevante. Dichos métodos se conocen, por ejemplo, de los libros de texto estándar, tales como Sambrook y Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, o

F. Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Los métodos de transformación y modificación genética de células hospedadoras fúngicas se conocen de, por ejemplo, los documentos de patente EP-A-0635574, WO 98/46772, WO 99/60102, WO 00/37671, WO90/14423,

EP-A-0481008, EP-A-0635574 y US 6.265.186.

Producción de bioproductos

A lo largo de los años se han hecho sugerencias para la introducción de diversos organismos para la producción de bioetanol a partir de azúcares de cultivos. En la práctica, sin embargo, todos los procesos de producción de bioetanol importantes han continuado usando células eucariotas del género Saccharomyces como productor de etanol. Esto es debido a las muchas características atractivas de las especies de Saccharomyces para procesos industriales, es decir, una alta tolerancia a ácidos, etanol y osmotolerancia, capacidad de crecimiento anaerobio y, por supuesto, su alta capacidad fermentativa alcohólica. Las especies preferidas de células eucariotas como células hospedadoras incluyen S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, marxianus o K. fragilis.

Una célula eucariota puede ser una célula adecuada para la producción de etanol. Una célula eucariota puede ser, sin embargo, adecuada para la producción de productos de fermentación distintos de etanol

Dichos productos de fermentación no etanólica incluyen en principio cualquier producto químico a granel o fino que sea producible por un microorganismo eucariota, tal como una célula eucariota o un hongo filamentoso.

Una célula eucariota preferida para la producción de productos de fermentación no etanólicos es una célula hospedadora que contiene una modificación genética que da como resultado la reducida actividad de alcohol deshidrogenasa.

Lignocelulosa

La lignocelulosa, que se puede considerar una posible materia prima renovable, comprende, en general, los polisacáridos celulosa (glucanos) y hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos). Además, algunas hemicelulosa pueden estar presentes como glucomananos, por ejemplo en materias primas derivadas de la madera.

La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos en azúcares solubles, que incluyen tanto monómeros como multímeros, por ejemplo glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, manosa, ramnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico y otras hexosas y pentosas, ocurre bajo la acción de diferentes enzimas que actúan en concierto.

Además, las pectinas y otras sustancias pécticas, tales como los arabinanos, pueden constituir una proporción considerable de la masa seca de paredes normalmente celulares de tejidos vegetales no leñosos (aproximadamente de un cuarto a la mitad de la masa seca pueden ser pectinas).

Pretratamiento

Antes del tratamiento enzimático, se puede pretratar el material lignocelulósico. El pretratamiento puede comprender exponer el material lignocelulósico a un ácido, una base, un disolvente, calor, un peróxido, ozono, trituración mecánica, pulverización, molienda o despresurización rápida, o una combinación de cualquiera dos o más de los mismos. Este pretratamiento químico se combina frecuentemente con pretratamiento térmico, por ejemplo entre 150 220 °C durante 1 a 30 minutos.

Hidrólisis enzimática

El material pretratado se somete comúnmente a hidrólisis enzimática para liberar azúcares que pueden ser fermentados según la invención. Esto se puede ejecutar con métodos convencionales, por ejemplo poniendo en contacto con celulasas, por ejemplo celobiohidrolasa(s), endoglucanasa(s), beta-glucosidasa(s) y opcionalmente otras enzimas. La conversión con las celulasas se puede realizar a temperatura ambiente o a temperaturas más altas, en un tiempo de reacción para liberar cantidades suficientes de azúcar(es). El resultado de las hidrólisis enzimáticas es el producto de hidrólisis que comprende azúcares C5/C6, designados en el presente documento la composición de azúcar.

La composición de azúcar

La composición de azúcar usada según la invención comprende glucosa y una o más pentosas, por ejemplo arabinosa y/o xilosa. Se puede usar cualquier composición de azúcar en la invención que cumpla los criterios. Los azúcares opcionales en la composición de azúcar son galactosa y manosa. En una realización preferida, la composición de azúcar es un hidrolizado de uno o más materiales lignocelulósicos. La lignocelulosa en el presente documento incluye hemicelulosa y partes de hemicelulosa de biomasa. La lignocelulosa también incluye fracciones lignocelulósicas de biomasa. Los materiales lignocelulósicos adecuados se pueden encontrar en la siguiente lista: pisos foliares de huertos frutales, chaparral, desechos de molienda, desechos urbanos de madera, desechos municipales, desechos de explotaciones forestales, aclareos de bosques, cultivos leñosos de rotación corta, desechos industriales, paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, cáscaras de soja, cáscaras de arroz, paja de arroz, alimentos de gluten de maíz, cáscaras de avena, caña de azúcar, hojas y tallos de maíz, tallos de maíz, mazorcas de maíz, cascarillas de maíz, pasto varilla, miscanto, sorgo dulce, tallos de colza, tallos de soja, pasto de praderas, gamagrass, cola de zorro; pulpa de remolacha azucarera, pulpa de frutas cítricas, cáscaras de semillas, desechos animales celulósicos, recortes de césped, algodón, algas, árboles, madera blanda, madera dura, chopo, pino, arbustos, pastos, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, cascarillas de maíz, mazorcas de maíz, grano de maíz, fibra de granos, productos y subproductos de la molienda en húmedo o en seco de granos, residuos sólidos municipales, residuos de papel, restos de jardín, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos de silvicultura, residuos sólidos municipales, residuos de papel, pulpa, residuos de molienda del papel, ramas, arbustos, cañas de azúcar, maíz, cascarillas de maíz, un cultivo de energía, bosque, un fruto, una flor, un grano, un pasto, un cultivo herbáceo, una hoja, corteza, una aguja, un tronco, una raíz, un árbol joven, un matorral, pasto varilla, un árbol, una verdura, cáscara de fruta, una vid, pulpa de remolacha azucarera, harinillas de trigo, cáscaras de avena, madera dura o blanda, material de desechos orgánicos generados a partir de un proceso agrícola, restos de madera de silvicultura, o una combinación de cualesquiera dos o más de los mismos.

Una visión general de algunas composiciones de azúcar adecuadas derivadas de lignocelulosa y la composición de azúcar de sus hidrolizados se da en la Tabla 15. Las lignocelulosas enumeradas incluyen: mazorcas de maíz, fibra de maíz, cáscaras de arroz, cáscaras de melón, pulpa de remolacha azucarera, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, madera, pasto y prensados de aceitunas.

Tabla 15: Visión general de las composiciones de azúcar de materiales lignocelulósicos. Gal=galactosa, Xil=xilosa, Ara=arabinosa, Man=manosa, Glu=glutamato, Ram=ramnosa. Se da el porcentaje de galactosa (% de Gal) y la fuente bibliográfica.

Es evidente de la Tabla 15 que en estas lignocelulosas está presente una alta cantidad de azúcar en forma de glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa. La conversión de glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa en el producto de fermentación es así de gran importancia económica. También está presente manosa en algunos materiales de lignocelulosa, aunque normalmente está en cantidades menores que los azúcares previamente mencionados. Ventajosamente, por tanto, la manosa también se convierte por la célula eucariota.

Se espera que las células eucariotas de la presente invención puedan ser adicionalmente manipuladas para lograr otras características deseables, o incluso mayores rendimientos globales de etanol.

La selección de células eucariotas mejoradas sometiendo a pases las células eucariotas sobre medio que contiene hidrolizado ha producido célula eucariota mejorada con tasas de fermentación potenciadas. Usando las enseñanzas de la presente invención, se podrían fácilmente dichas cepas mejoradas.

Por material que contiene pentosa se indica cualquier medio que comprenda pentosa, tanto líquida como sólida. Los materiales que contienen pentosa adecuados incluyen hidrolizados de polisacárido o biomasa lignocelulósica, tales como cascarillas de maíz, madera, papel, subproductos agrícolas, y similares.

Por un "hidrolizado", como se usa en el presente documento, se indica un polisacárido que se ha despolimerizado mediante la adición de agua para formar azúcares de mono y oligosacárido. Los hidrolizados se pueden producir por hidrólisis enzimática o ácida del material que contiene polisacárido.

Preferentemente, la célula eucariota es capaz de crecer en condiciones similares a las encontradas en fuentes industriales de pentosa. El método de la presente invención sería más económico cuando el material que contiene pentosa se pudiera inocular con la variante de células eucariotas sin excesiva manipulación. A modo de ejemplo, la industria de la pulpa genera grandes cantidades de desechos celulósicas. La sacarificación de la celulosa por hidrólisis ácida da hexosas y pentosas que se pueden usar en reacciones de fermentación. Sin embargo, el hidrolizado o líquido de sulfito contiene altas concentraciones de sulfito e inhibidores fenólicos naturalmente presentes en la madera que inhiben o previenen el crecimiento de la mayoría de los organismos. Los ejemplos a continuación describen la fermentación de pentosa en hidrolizados ácidos (o licor residual de sulfito) de maderas duras y maderas blandas por las células eucariotas de la presente invención. Se espera razonablemente que las cepas de células eucariotas capaces de crecer en líquido residual de sulfito puedan crecer en prácticamente cualquier otro hidrolizado de biomasa.

Propagación

La invención se refiere además a un proceso para la propagación aerobia de la célula eucariota consumidora de acetato, en particular la propagación aerobia de la cepa de células eucariotas.

La propagación es en el presente documento cualquier proceso de crecimiento celular eucariota que conduce al aumento de una población de células eucariotas inicial. El principal fin de la propagación es aumentar una población de células eucariotas usando las capacidades de reproducción natural de las células eucariotas como organismos vivos. Puede haber otros motivos para la propagación, por ejemplo, en caso de usar célula eucariota seca, se usa propagación para rehidratar y acondicionar la célula eucariota, antes del cultivo. La célula eucariota fresca, tanto célula eucariota secada activa como torta húmeda, se puede añadir para empezar la propagación directamente. Las condiciones de propagación son críticas para la producción óptima de células eucariotas y la posterior fermentación, tal como, por ejemplo, fermentación de hidrolizado lignocelulósico en etanol. Incluyen fuente de carbono adecuada, aireación, temperatura y adiciones de nutrientes. El tamaño del tanque para la propagación y es normalmente entre 2 por ciento y 5 por ciento del tamaño del fermentador (hidrolizado lignocelulósico a etanol). En la propagación, la célula eucariota necesita una fuente de carbono. La fuente de carbono puede comprender en el presente documento glicerol, etanol, acetato y/o azúcares (azúcares C6 y C5). También se pueden usar otras fuentes de carbono. La fuente de carbono se necesita para la biosíntesis de la pared celular y la producción de proteína y energía.

La propagación es un proceso aerobio, así el tanque de propagación debe ser apropiadamente aireado para mantener un cierto nivel de oxígeno disuelto. La aireación adecuada se logra comúnmente por inductores de aire instalados en la tubería que va al tanque de propagación que empuja el aire en la mezcla de propagación a medida que el tanque se llena y durante la recirculación. La capacidad de la mezcla de propagación para retener el oxígeno disuelto es una función de la cantidad de aire añadida y la consistencia de la mezcla, que es por lo que el agua se añade frecuentemente a una relación de entre 50:50 y 90:10 entre pulpa y agua. Las mezclas "densas" de propagación (relación 80:20 entre pulpa y agua y superior) frecuentemente requieren la adición de aire comprimido para compensar la capacidad reducida para retener el oxígeno disuelto. La cantidad de oxígeno disuelto en la mezcla de propagación también es una función del tamaño de burbujas, por lo que algunas plantas de etanol añaden aire a través de burbujeadores que producen burbujas más pequeñas en comparación con inductores de aire. Junto con menor glucosa, la aireación adecuada es importante para promover la respiración aerobia, que se diferencia del entorno de fermentación comparablemente anaerobio. Un signo de aireación inadecuada o altas concentraciones de glucosa es la elevada producción de etanol en el tanque de propagación.

En general, durante la propagación, la célula eucariota requiere una cómoda temperatura para el crecimiento y el metabolismo, por ejemplo la temperatura en el reactor de propagación es entre 25-40 grados Celsius. En general, menores temperaturas dan como resultado metabolismo más lento y reproducción reducida, mientras que temperaturas más altas pueden provocar la producción de compuestos de estrés y reproducción reducida. En una realización, los tanques de propagación están en el interior y protegidos del ataque de las altas temperaturas en verano o las bajas en invierno, de manera que el mantenimiento de las temperaturas óptimas de entre dentro del intervalo de 30-35 °C no es normalmente un problema.

Se puede realizar propagación adicional como normalmente se realiza la propagación de célula eucariota.

Fermentación

La invención se refiere a un proceso para la fermentación de una célula eucariota según la invención, en donde existe un rendimiento mejorado de glicerol, que es ventajoso en la industria vitivinícola. También puede dar como resultado la elevada reducción del nivel de acetato y/o el elevado rendimiento del producto de fermentación, por ejemplo etanol, que es ventajoso en la industria de los bicombustibles.

En una realización, la célula eucariota según la invención puede ser una célula eucariota fermentadora de pentosa y glucosa, que incluye, pero no se limita a, dichas células que son capaces de consumo simultáneo anaerobio de pentosa y glucosa. En una realización del proceso, el material que contiene pentosa comprende un hidrolizado de material lignocelulósico. El hidrolizado puede ser un hidrolizado enzimático de material lignocelulósico.

El proceso de fermentación puede ser un proceso de fermentación aerobio o anaerobio. Un proceso de fermentación anaerobio se define en el presente documento como un proceso de fermentación realizado en ausencia de oxígeno o en el que sustancialmente no se consume oxígeno, preferentemente se consume menos de aproximadamente 5, aproximadamente 2,5 o aproximadamente 1 mmol/L/h, más preferentemente 0 mmol/L/h (es decir, el consumo de oxígeno no es detectable), y en donde las moléculas orgánicas sirven tanto de donante de electrones como de aceptores de electrones. En ausencia de oxígeno, la NADH producida en la glicólisis y la formación de biomasa no se puede oxidar por fosforilación oxidativa. Para resolver este problema, muchos microorganismos usan piruvato o uno de sus derivados como aceptor de electrones e hidrógeno, regenerando así NAD+.

Así, en un proceso de fermentación anaerobio preferido, se usa piruvato como electrón (y aceptor de hidrógeno) y se reduce a productos de fermentación tales como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido málico, ácido fumárico, un aminoácido y etileno.

El proceso de fermentación se realiza preferentemente a una temperatura que es óptima para la célula. Así, para la mayoría de las células eucariotas o células hospedadoras fúngicas, el proceso de fermentación se realiza a una temperatura que es inferior a aproximadamente 50 °C, inferior a aproximadamente 42 °C, o inferior a aproximadamente 38 °C. Para célula eucariota o células hospedadoras fúngicas filamentosas, el proceso de fermentación se realiza preferentemente a una temperatura que es inferior a aproximadamente 35, aproximadamente 33, aproximadamente 30 o aproximadamente 28 °C y a una temperatura que es superior a aproximadamente 20, aproximadamente 22, o aproximadamente 25 °C.

El rendimiento del etanol sobre xilosa y/o glucosa en el proceso es preferentemente al menos aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 95 o aproximadamente 98 %. El rendimiento del etanol se define en el presente documento como un porcentaje del rendimiento máximo teórico.

La invención también se refiere a un proceso de producción de un producto de fermentación.

El proceso de fermentación según la presente invención se puede realizar en condiciones aerobias y anaerobias. En una realización, el proceso se lleva a cabo en condiciones micro-aerófilas o de oxígeno limitado.

Un proceso de fermentación anaerobio se define en el presente documento como un proceso de fermentación realizado en ausencia de oxígeno o en el que sustancialmente no se consume oxígeno, preferentemente inferior a aproximadamente 5, aproximadamente 2,5 o aproximadamente 1 mmol/L/h, y en donde las moléculas orgánicas sirven tanto de donante de electrón como de aceptores de electrones.

Un proceso de fermentación limitado en oxígeno es un proceso en el que el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno desde el gas hasta el líquido. La limitación del grado de oxígeno se determina por la cantidad y la composición del flujo de gas de entrada, así como las actuales propiedades de mezcla/transferencia de masa del equipo de fermentación usado. Preferentemente, en un proceso en condiciones de oxígeno limitado, la tasa de consumo de oxígeno es al menos aproximadamente 5,5, más preferentemente al menos aproximadamente 6, tal como al menos 7 mmol/L/h. Un proceso de la invención puede comprender la recuperación del producto de fermentación.

En un proceso preferido, la célula fermenta tanto la xilosa como la glucosa, preferentemente simultáneamente, en cuyo caso se usa preferentemente una célula que es insensible a la represión de glucosa para prevenir el crecimiento diaúxico. Además de una fuente de xilosa (y glucosa) como fuente de carbono, el medio de fermentación comprenderá además el componente apropiado requerido para el crecimiento de la célula. Se conocen bien en la técnica las composiciones de medios de fermentación para el crecimiento de microorganismos, tales como células eucariotas.

Los procesos de fermentación se pueden llevar a cabo en modo discontinuo, de lotes alimentados, o continuo. Se puede aplicar un proceso separado de hidrólisis y fermentación (SHF) o también un proceso simultáneo de sacarificación y fermentación (SSF). También puede ser posible una combinación de estos procesos de fermentación para productividad óptima. Estos procesos se describen en lo sucesivo con más detalle.

Modo SSF

Para el modo proceso simultáneo de sacarificación y fermentación (SSF), el tiempo de reacción para la etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación depende del tiempo para realizar un rendimiento deseado, es decir, rendimiento de la conversión de celulosa en glucosa. Dicho rendimiento es preferentemente tan alto como sea posible, preferentemente 60 % o más, 65 % o más, 70 % o más, 75 % o más 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 96 % o más, 97 % o más, 98 % o más, 99 % o más, incluso 99,5 % o más o 99,9 % o más.

Según la invención, se realizan concentraciones de azúcar muy altas en el modo SHF y concentraciones muy altas de producto (por ejemplo, etanol) en el modo SSF. En la operación de SHF, la concentración de glucosa es 25 g/L o más, 30 g/L o más, 35 g/L o más, 40 g/L o más, 45 g/L o más, 50 g/L o más, 55 g/L o más, 60 g/L o más, 65 g/L o más, 70 g/L o más, 75 g/L o más, 80 g/L o más, 85 g/L o más, 90 g/L o más, 95 g/L o más, 100 g/L o más, 110 g/L o más, 120 g/L o más, o puede ser, por ejemplo, 25 g/L-250 g/L, 30 g/L-200 g/L, 40 g/L-200 g/L, 50 g/L-200 g/L, 60 g/L-200 g/L, 70 g/L-200 g/L, 80 g/L-200 g/L, 90 g/L-200 g/L.

Concentración de producto en modo SSF

En la operación SSF, la concentración de producto (g/L) depende de la cantidad de glucosa producida, pero ésta no es visible puesto que los azúcares se convierten en producto en SSF, y se pueden relacionar concentraciones de producto con la concentración de glucosa subyacente por multiplicación con el rendimiento máximo teórico (Yps máx en g de producto por gramo de glucosa)

El rendimiento máximo teórico (Yps máx en g de producto por gramo de glucosa) de un producto de fermentación se puede derivar de la bioquímica de libros de texto. Para etanol, 1 mol de glucosa (180 gr) da según la vía de fermentación de glicólisis normal en la célula eucariota 2 moles de etanol (=2x46 = 92 g de etanol). El rendimiento máximo teórico de etanol en glucosa es, por tanto, 92/180 = 0,511 g de etanol/g de glucosa.

Para butanol (MW 74 g/mol) o isobutanol, el rendimiento máximo teórico es 1 mol de butanol por mol de glucosa. Así, Yps máx para (iso)butanol = 74/180 = 0,411 g de (iso)butanol/g de glucosa.

Para ácido láctico, el rendimiento de fermentación para la fermentación homoláctica es 2 moles de ácido láctico (MW = 90 g/mol) por mol de glucosa. Según esta estequiometría, Yps máx = 1 g de ácido láctico/g de glucosa. Se puede un cálculo similar para fermentaciones de C5/C6, en las que además de glucosa también se incluyen pentosas, por ejemplo, xilosa y/o arabinosa.

Para otros productos de fermentación se puede hacer un cálculo similar.

Modo SSF

En la operación SSF, la concentración de producto es 25 g * Yps g/L /L o más, 30 * Yps g/L o más, 35 g * Yps /L o más, 40 * Yps g/L o más, 45 * Yps g/L o más, 50 * Yps g/L o más, 55 * Yps g/L o más, 60 * Yps g/L o más, 65 * Yps g/L o más, 70 * Yps g/L o más, 75 * Yps g/L o más, 80 * Yps g/L o más, 85 * Yps g/L o más, 90 * Yps g/L o más, 95 * Yps g/L o más, 100 * Yps g/L o más, 110 * Yps g/L o más, 120 g/L * Yps o más, o puede ser, por ejemplo, 25 * Yps g/L-250 * Yps g/L, 30 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 40 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 50 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 60 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 70 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 80 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 90 * Yps g/L , 80 * Yps g/L-200 * Yps g/L

Por consiguiente, la invención proporciona un método de preparación de un producto de fermentación, método que comprende:

a. degradar lignocelulosa usando un método como se describe en el presente documento; y

b. fermentar el material resultante,

así para preparar un producto de fermentación.

Producto de fermentación

El producto de fermentación de la invención puede ser cualquier producto útil. En una realización, es un producto seleccionado del grupo que consiste en etanol, n-butanol, 2-butanol, isobutanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacónico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido adípico, un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptófano, treonina y ácido aspártico, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, un antibiótico p-lactámico y una cefalosporina, vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos para piensos animales, productos químicos de especialidad, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles, que incluyen biocombustibles y biogás o polímeros orgánicos, y una enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasa, una transferasa o una xilanasa.

Recuperación del producto de fermentación

Para la recuperación del producto de fermentación se usan tecnologías existentes. Para diferentes productos de fermentación, son apropiados diferentes procesos de recuperación. Los métodos de recuperación existentes de etanol de mezclas acuosas usan comúnmente técnicas de fraccionamiento y adsorción. Por ejemplo, aún se puede usar una cerveza para procesar un producto fermentado, que contiene etanol en una mezcla acuosa, para producir una mezcla enriquecida que contiene etanol que luego se somete a fraccionamiento (por ejemplo, destilación fraccionada u otras técnicas similares). A continuación, las fracciones que contienen las concentraciones de etanol más altas se pueden pasar a través de un adsorbente para retirar casi todo, si no todo, el agua restante del etanol. En una realización, además de la recuperación del producto de fermentación, se puede recircular la levadura.

Los siguientes ejemplos no limitantes pretenden ser puramente ilustrativos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

1. Materiales y métodos

1.1. Cepas y mantenimiento

Todas las cepas de S. cerevisiae usadas en esta solicitud (Tabla 16) se basan en el linaje CEN.PK (van Dijken et al.

2000). Se propagaron cultivos madre de S. cerevisiae en medio sintético (Verduyn et al. 1992), o medio YP (10 g de L-1 de extracto de levadura Bacto, 20 g L-1 de peptona Bacto). Se complementaron 20 g L-1 de glucosa como fuente de carbono en el medio anteriormente. Se propagaron cultivos madre de DH5a de E.coli en medio LB (10 g L-1 de triptona Bacto, 5 g L-1 de extracto de levadura Bacto, 5 g L-1 de NaCl), complementado con 100 gg mL-1 de ampicilina o 50 pg mL-1 de kanamicina. Se almacenaron disoluciones madre congeladas de cepas a -80 °C, después de la adición de 30 % v/v de glicerol a cultivos de fase estacionaria.

Tabla 16. Cepas de S. cerevisiae usadas en este estudio.

1.2. Construcción de plásmidos y casetes

Se realizaron modificaciones genéticas de levadura usando el sistema editor del genoma quimérico CRISPR/Cas9 (DiCarlo et al. 2013). Se usó el plásmido pMEL11 (Mans et al. 2015) para deleciones individuales de GND1, GND2y ALD6. Se usó el plásmido pROS11 (Mans et al. 2015) para deleciones individuales de GPD1 y GPD2. Se identificaron secuencias diana de CRISPR/Cas9 únicas en cada gen basándose en la lista de secuencias proporcionada por (DiCarlo et al. 2013). Los cebadores que se usan en el presente documento son SEQ ID NO: 10 46, con sus N° de cebador dados. Se amplificaron por PCR el esqueleto de plásmido de pMEL11 y pROS11 usando las combinaciones de cebadores 5792-5980 y 5793-5793, respectivamente (Sigma-Aldrich). Se obtuvieron por PCR secuencias de inserción de plásmidos, que expresan la secuencia de direccionamiento de ARNg de 20 pb, con las combinaciones de cebadores 5979-7365 para GND1, 5979-7231 para GND2 y 5979-7610 para ALD6 usando pMEL11 como molde. Se obtuvieron por PCR secuencias de inserción que expresan las secuencias de ARNg que se dirigen a GPD1 y GPD2 usando las combinaciones de cebadores 6965-6965 y 6966-6966, respectivamente, con pROS11 como molde. Se realizaron las amplificaciones por PCR para la construcción de todos los plásmidos y casetes usando ADN polimerasa Phusion® Hot Start II High Fidelity (Thermo Scientific, Waltham, MA), según las pautas del fabricante. En los casos en los que los plásmidos se ensamblaron previamente, se usó el kit de clonación Gibson Assembly® (New England Biolabs, MA); las reacciones se realizaron según el protocolo del proveedor (disminución de escala a 10 pL). Se permitió el ensamblaje por secuencias homólogas en los extremos 5' y 3' de los fragmentos de PCR generados. El ensamblaje del esqueleto de pMEL11 y las secuencias de inserción que codifican los ARNg que se dirigen a GND1 y GND2 dieron los plásmidos pUDR122 y pUDR123, respectivamente. En cada caso, se usó 1 pL de la mezcla de Gibson Assembly para la electroporación de células DH5a de E. coli en un sistema de electroporación Gene PulserXcell (Biorad). Los plásmidos se volvieron a aislar de cultivos de E. coli usando un kit de plásmidos Sigma GenElute (Sigma-Aldrich). La validación de los plásmidos se realizó por PCR de diagnóstico (Dreamtaq®, Thermo Scientific) o análisis de restricción. Se puede encontrar una lista completa de todos los plásmidos en la Tabla 17. No se ensamblaron previamente los plásmidos que expresan ARNg de ALD6, GPD1 y GPD2; el esqueleto y los fragmentos de inserción se transformaron directamente en levadura y los plásmidos se ensamblaron in vivo en cada caso.

Se optimizaron en los codones las secuencias de Methylobacillus flagellatus KT gndA (AF167580_1), Gluconobacter oxidans 621H gox1705 (AAW61445.1) y Bradyrhizobium japonicum USDA 1106pgdh basándose en la composición de codones de genes glicolíticos altamente expresados. En el caso de B. japonicum, la secuencia de 6pgdh se obtuvo alineando su secuencia genómica traducida (NC_004463.1) con las otras dos proteínas (45 % y 57 % de similitud, respectivamente). Se flanquearon los casetes de integración de levadura de los genes anteriores por el promotor de TPI1 y el terminador de CYC1. Se sintetizaron los casetes completos, que incluyen promotor, gen y secuencias terminadoras, por GeneArt GmbH (Regensburg, Alemania) y se suministraron en vectores pMK-RQ (GeneArt). Después de la clonación en E. coli, los plásmidos se volvieron a aislar y se usaron como moldes para la amplificación por PCR de los casetes de integración. Los casetes de integración TPI1p-gndA-CYC1t, TPI1p-6pgdH-CYC1t y TPI1p-gox1705-CYC1t se obtuvieron por PCR usando la combinación de cebadores 7380-7381 y los plásmidos pMK-RQ-gndA, pMK-RQ-6pgdH y pMK-RQ-gox1705, respectivamente, como moldes. Para la proteína gox1705, Km NADP+ es 440 pM y Km NAD+ es 64 pM, de manera que la relación Km NADP+ / Km NAD+ = 6,88. La proteína gox1705 es dependiente de NAD+.

Se obtuvo eutE optimizado en el par de codones de S. cerevisiae a partir de pBOL199 por corte con restricción XhoI/SpeI y se ligó en pAG426GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA), dando el plásmido de múltiples copias pUDE197. Para la preparación de casetes de integración se usó un pRS406 cortado con SacI/EagI (Addgene, Cambridge, MA) como esqueleto de plásmido y se ligó con el casete de TDH3p-eutE-CYC1t obtenido por el mismo patrón de restricción de pUDE197, dando el plásmido pUDI076.

El casete de integración TDH3p-eutE-CYC1t se obtuvo usando la combinación de cebadores 7991-7992 y el plásmido pUDI076 como molde. Los cebadores anteriores se diseñaron para añadir 60 pb de secuencia de ADN en los extremos 5' y 3' de los productos de PCR, correspondientes a las secuencias directamente en la dirección 5' y en la dirección 3' del marco de lectura abierto de los loci dirigidos en el genoma de S. cerevisiae. Se dirigieron los casetes que expresan TPI1p-gndA-CYC1t, TPI1p-6pgdH-CYC1t y TPI1p-gox1705-CYC1t al locus de GND1 y se dirigió el casete TDH3p-eutE-CYC1t al locus de GPD2.

Tabla 17. Plásmidos usados en este estudio.

1.3. Construcción de cepas

Se realizaron transformaciones de levadura usando el método de acetato de litio (Gietz y Woods, 2002). La selección de mutantes se realizó sobre placas de medio agar sintético (2 % de Agar Bacto, Difco) (Verduyn et al.

1992) complementado con 20 g L-1 de glucosa y con acetamida como la única fuente de nitrógeno, como se describe en (Solis-Escalante et al. 2013). En cada caso, se realizó la confirmación de integraciones satisfactorias por PCR de diagnóstico usando combinaciones de cebadores que se unen fuera de los loci dirigidos, así como dentro de los ORFs de los casetes integrados. Se ejecutó el reciclado de plásmidos después de la transformación como se describe en (Solis-Escalante et al. 2013).

Se obtuvo la cepa IMK643 por inactivación de GND2 basada en CRISPR/Cas9 sin marcadores por cotransformación del ARNg que expresa el plásmido pUDR123 y los oligonucleótidos de reparación 7299-7300. Los casetes de integración TPI1p-gndA-CYC1t, TPI1p-6pgdH-CYC1t y TPI1p-gox1705-CYC1t se transformaron en IMK643, junto con el ARNg que expresa el plásmido pUDR122, dando las cepas IMX705, IMX706 e IMX707, respectivamente. La co-transformación del esqueleto de pMEL11, el ARNg que se dirige a ALD6 que expresa la inserción de plásmido y los oligonucleótidos de reparación 7608-7609 en las cepas IMX705 e IMX585 dio las cepas IMX756 e IMX899, respectivamente, en las que ALD6 se delecionó sin integración de un marcador. La cotransformación del esqueleto de pROS11, el ARNg que se dirige a GPD2 que expresa la inserción de plásmido y el casete de integración TDH3p-eutE-CYC1t en cepas IMX756 e IMX585 dio las cepas IMX817 e IMX883, respectivamente. La deleción sin marcador de GPD1 en cepas IMX817 e IMX883 se realizó por co-transformación del esqueleto de pROS11, el ARNg que se dirige a GPD1 que expresa la inserción de plásmido y los oligonucleótidos de reparación 6967-6968, dando las cepas IMX860 e IMX888, respectivamente.

1.4. Cultivo y medios

Se realizaron cultivos aerobios en matraz oscilante en matraces de 500 mL que contenían 100 mL de medio mínimo sintético (Verduyn et al. 1992), complementado con 20 g L-1 de glucosa. El valor de pH se ajustó a 6 mediante la adición de KOH 2 M antes de la esterilización por autoclave a 120 °C durante 20 min. Se esterilizaron en autoclave por separado a 110 °C durante 20 min disoluciones de glucosa y se añadieron a los matraces estériles. Se esterilizaron por filtración disoluciones de vitamina y se añadieron a los matraces estériles por separado. Los cultivos se cultivaron a 30 °C y 200 rpm. Se inocularon matraces oscilantes de pre-cultivo iniciales de disoluciones madre congeladas en cada caso. Después de 8-12 h, se inocularon matraces de pre-cultivo nuevos a partir de los matraces iniciales. Los cultivos preparados de esta forma se usaron en experimentos de matraz oscilante aerobio o como inóculo para fermentaciones anaerobias. Los biorreactores se inocularon hasta un valor de DO de 0,2-0,3 a partir de matraces de pre-cultivo exponencialmente en crecimiento. Las fermentaciones de lotes anaerobios se realizaron en el biorreactor Applikon de 2 L (Applikon, Schiedam, NL), con un volumen de trabajo de 1 L. Todas las fermentaciones discontinuas anaerobias se realizaron en medio mínimo sintético (20 g L-1 de glucosa), preparado de la misma forma que los medios de matraz. Los medios de crecimiento anaerobios se complementaron adicionalmente con 0,2 g L-1 de antiespumante C estéril (Sigma-Aldrich), ergosterol (10 mg L-1) y Tween 80 (420 mg L-1), añadidos por separado. Las fermentaciones se realizaron a 30 °C y se agitaron a 800 rpm. Se usó gas nitrógeno (<10 ppm de oxígeno) para el burbujeo (0,5 L min-1). El pH de fermentación se mantuvo a 5 por adición automática de KOH 2 M. Los biorreactores se equiparon con tuberías Nonprene y juntas tóricas Viton para minimizar la difusión de oxígeno en el medio. Todas las fermentaciones se realizaron por duplicado.

1.5. Métodos analíticos

Se hizo la determinación de la densidad óptica a 660 nm usando un espectrofotómetro Libra S11 (Biochrom, Cambridge, R. U.). El análisis de los gases de salida, mediciones de peso seco y análisis de HPLC de sobrenadante de cultivo, que incluyen correcciones para la evaporación de etanol, se realizaron como se describe en (Medina et al.2010).

1.6. Determinación de la actividad enzimática

Se realizó la preparación de extractos sin células para la determinación in vitro de actividades enzimáticas como se describió previamente (Kozak et al. 2014). Los ensayos se realizaron a 30 °C; la actividad enzimática se midió monitorizando la reducción de NAD+/NADP+ (para 6PGDH) u oxidación de NADH a 340 nm (para EutE). La mezcla del ensayo de actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa unida a NADP+ contuvo Tris-HCI 50 mM (pH 8,0), 5 mM de MgCl², 0,4 mM de NADP+ y 50 o 100 pL de extracto de células en un volumen total de 1 mL. La reacción se empezó mediante la adición de 5 mM de glucosa-6-fosfato. La mezcla del ensayo de actividad de 6-fosfogluconato deshidrogenasa unida a NAD+ / NADP+ contuvo Tris-HCI 50 mM (pH 8,0), 5 mM de MgCl², 0,4 mM de NAD+ / NADP+, respectivamente, y 50 o 100 pL de extracto de células en un volumen total de 1 mL. Las reacciones empezaron mediante la adición de 5 mM de 6-fosfogluconato. Todos los ensayos se realizaron por duplicado y las velocidades de reacción fueron proporcionales a la cantidad de extracto de células añadidas.

1.7 Expresión de una 6-fosfogluconato deshidrogenasa dependiente de NAD+ heteróloga

Para cambiar la especificidad del cofactor de 6-fosfogluconato deshidrogenasa de NADP+ a NAD+, se delecionaron GND1 y GND2, que codifican la isoforma principal y la secundaria de la enzima en S. cerevisiae, respectivamente. Se optimizaron en los codones genes heterólogos que codifican enzimas dependientes de NAD+ (M. flagellatus y B. japonicum) o preferentes de NAD+ (G. oxidans) para la expresión en S. cerevisiae y se integraron en el sitio de GND1, con el control del promotor constitutivo fuerte de TPI1. Los experimentos de crecimiento realizados en matraces oscilantes de medio sintético aerobio (20 g L-1 de glucosa) con las capas manipuladas no indicaron un efecto significativo de la expresión en exceso de los genes heterólogos sobre la máxima velocidad de crecimiento en comparación con la cepa parental IMX585 (la velocidad de crecimiento fue aproximadamente 95 % de la cepa parental), con la excepción de IMX706, que expresa la enzima de B. japonicum (Tabla 18).

Tabla 18. Velocidades de crecimiento específicas promedio (p) obtenidas en matraces oscilantes de medio sintético aerobio (pH 6) que contienen 20 g L-1 de glucosa (los experimentos se realizaron por duplicado, se indican las desviaciones medias de duplicados), 30 °C, 200 rpm.

Para investigar la expresión funcional de las enzimas 6-fosfogluconato deshidrogenasa heteróloga en S. cerevisiae, se realizaron ensayos enzimáticos en extractos sin células, preparados a partir de cultivos aerobios de crecimiento exponencial en matraz oscilante de las cepas manipuladas (recogidas a DO 4-5). Los ensayos se realizaron para la cuantificación de actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, así como actividades de 6-fosfogluconato deshidrogenasas dependientes de NAD+ y NADP+. Se realizó la determinación de actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa como una comprobación de calidad de los extractos sin células, las determinaciones de actividad enzimática demostraron glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y 6-fosfogluconato deshidrogenasa funcional en todas las cepas generadas (Figura 1). Todas las cepas manipuladas mostraron actividades de 6PGDH dependiente de NAD+ altas y de NADP+ residuales bajas, en línea con la expresión funcional esperada de las enzimas heterólogas y la deleción de GND1 y GND2. La cepa IMX705, que expresa gndA de Methylobacillus flagellatus, mostró la actividad de 6-fosfogluconato deshidrogenasa dependiente de NAD+ más alta in vitro (0,49 ± 0,1 gmol mg de biomasa-1 min-1).

Además, todas las cepas manipuladas mostraron un aumento significativo en la relación de actividades de 6-fosfogluconato deshidrogenasa unida a NAD+/NADP+ cuando se comparó con la cepa de control IMX585 (Tabla 18). Además de la actividad de 6-fosfogluconato deshidrogenasa dependiente de NAD+ in vitro más alta, la cepa IMX705 también mostró la relación más alta de todas las cepas manipuladas (46 ± 10).

Tabla 18A. Relaciones de actividades de 6-fosfogluconato deshidrogenasa específica unida a NAD+/NADP+ de extractos sin células de cultivos de crecimiento exponencial en matraz oscilante, recogidas a DO = 4 a 5. Los cultivos se cultivaron en medio sintético complementado con 20 g L-1 de glucosa, pH 6, 30 °C, 200 rpm. Datos de experimentos duplicados independientes, las barras de error indican desviaciones medias de los duplicados.

Los resultados del ensayo enzimático indicaron hacia la cepa que expresa gndA que es la cepa que rinde mejor; por este motivo, se caracterizó adicionalmente IMX705.

1.8 Experimentos discontinuos anaerobios

Los resultados de los ensayos enzimáticos indicaron hacia un cambio de especificidad de cofactor satisfactorio de 6-fosfogluconato deshidrogenasa de NADP+ a NAD+.

Para investigar el efecto del cambio de especificidad de cofactor de 6-fosfogluconato deshidrogenasa sobre la fisiología anaerobia de S. cerevisiae, se realizaron experimentos discontinuos anaerobios en biorreactores. Se cultivaron cepas IMX585 (GND1 GND2) y IMX705 (gnd2A gnd1::gndA) en medio sintético complementado con 20 g L-1 de glucosa. La velocidad de crecimiento de la cepa manipulada IMX705 fue similar a la cepa de referencia (aproximadamente 95 % de IMX585 (Tabla 19)). Además, fueron comparables los perfiles de consumo de azúcar, siendo la glucosa agotada después de aproximadamente 12 horas (Figura 2). El lote anaerobio con la cepa IMX705 produjo un elevado rendimiento de glicerol del 19,8 % en glucosa en comparación con IMX585 (Tabla 19). Además, la cantidad de glicerol formada por biomasa en la fermentación con la cepa IMX705 fue 24,1 % superior a aquella con la cepa IMX585.

En las fermentaciones anaerobias de la cepa IMX705, se observó un aumento de aproximadamente 9 % en la producción de acetato extracelular por biomasa formada, en comparación con la cepa de referencia IMX585 (Tabla 19). El aumento en acetato extracelular podría haber sido un resultado de la regulación por incremento de la aldehido deshidrogenasa dependiente de NADP+ citosólica que cataliza la reacción acetaldehído NADP+ ^ acetato NADPH H+, codificada por ALD6. Junto con la rama oxidativa de la vía de la pentosa-fosfato, Ald6p proporciona otra vía importante para la regeneración de NADPH en el citosol de las células. Se ha demostrado que la expresión en exceso de ALD6 en una cepa zwf1A da como resultado elevadas velocidades de crecimiento en glucosa; además, no son viables los mutantes dobles zwf1A ald6A. Además, en un escenario donde la vía de formación de glicerol en la cepa IMX705 se ha sustituido por la reducción de acetato, Ald6p puede interferir con la generación de NADH adicional en el citosol, participando en un ciclo de tipo transhidrogenasa conducido por ATP en el citosol (Figura 3). En este ciclo, 1 mol de acetato se convierte en 1 mol de acetil-CoA mediante la reacción catalizada por Acs1p y Acs2p, al coste neto de 2 moles de ATP. El 1 mol de acetil-CoA se reduce entonces en 1 mol de acetaldehído mediante la reacción catalizada por acetaldehído deshidrogenasa acetilante, con una oxidación concomitante de 1 mol de NADH a NAD+. El 1 mol de acetaldehído se puede entonces oxidar de nuevo en 1 mol de acetato mediante Ald6p, con una reducción concomitante de 1 mol de NADP+ a NADPH. De esta forma, ambos cofactores se pueden regenerar a costa de ATP. La retirada de la reacción catalizada por Ald6p previene que este posible ciclo tenga lugar.

En las cepas no mutantes, la reacción catalizada por Ald6p es importante para la generación de NADPH, así como la formación de acetato, que es un precursor de acetil-CoA. En la cepa de ald6A IMX756, se puede formar posiblemente acetato mediante las reacciones catalizadas por Ald2p y Ald3p citosólicos por las isoformas Ald4p y Ald5p mitocondriales. Ald2p y Ald3p son dependientes de NAD+ y la formación de acetato requerida para el crecimiento mediante las reacciones catalizadas por estas enzimas resultará probablemente en la formación adicional de NADH citosólico. Ald4p puede utilizar tanto NAD+ como NADP+ como cofactores. Los cofactores de nicotinamida no pueden, en general, cruzar la membrana mitocondrial interna. En cultivos anaeróbicamente cultivados de S. cerevisiae, la re-oxidación de NADH producida por la formación de acetato catalizada por Ald4p requeriría la transferencia de reducir equivalentes a través de la membrana mitocondrial. Esto se podría llevar a cabo, por ejemplo, mediante sistemas lanzadera mitocondriales, tales como la lanzadera de acetaldehído-etanol, cuya transferencia reduce los equivalentes a NAD+ citosólico. El exceso de NADH citosólico se puede re-oxidar entonces mediante la elevada formación de glicerol.

Para retirar la vía de regeneración alternativa de NADPH catalizada por Ald6p, se delecionó ALD6 en la cepa IMX705 dando la cepa IMX756. Los presentes inventores han encontrado una deleción de ALD6 que es posiblemente beneficiosa para la generación de una cepa que consume acetato, ya que puede retirar una posible reacción de tipo transhidrogenasa conducida por ATP en el citoplasma de las células, creada por Acs1p / Acs2p, EutEp y Ald6p (Figura 4). Para investigar el efecto de Ald6p sobre la fisiología anaerobia de S. cerevisiae no mutante, ALD6 también se delecionó en la cepa IMX585 dando la cepa IMX899.

Las cepas IMX899 e IMX756 se caracterizaron en experimentos discontinuos anaerobios, en las mismas condiciones que los lotes realizados con las cepas IMX585 e IMX705. Las velocidades de crecimiento de IMX899 e IMX756 fueron aproximadamente 90 % y 81 % de la velocidad de crecimiento de la cepa de referencia IMX585. La formación de acetato extracelular fue gravemente afectada en las fases tempranas de las fermentaciones, y su concentración disminuyó hasta por debajo de los niveles de detección en las etapas posteriores (datos no mostrados) en fermentaciones con ambas cepas. El lote anaerobio con la cepa IMX899 produjo un aumento de 1 % en el rendimiento de glicerol en glucosa y de 5,3 % en el glicerol formado por la biomasa en comparación con la cepa de referencia IMX585 (Tabla 19A), que indica un efecto menor de la deleción en la generación de NADH citosólico adicional. Sin embargo, la fermentación con la cepa IMX756, en la que la deleción de ALD6 se combinó con la expresión en exceso de gndA y las deleciones de GND1 y GND2, produjo un aumento de 39 % en el rendimiento de glicerol en glucosa y de 55 % en el glicerol formado por la biomasa formada en comparación con la cepa de referencia IMX585 (Tabla 19A).

Este estudio proporciona prueba del principio de que diferentes 6-fosfogluconato deshidrogenasas dependientes de NAD+ heterólogas pueden ser funcionalmente expresadas en S. cerevisiae. Además, la expresión en exceso de gndA en una cepa gndIA gnd2A produjo un aumento en la formación de glicerol por biomasa formada, que indica un aumento en la formación de NADH citosólica por biomasa formada. La deleción adicional de ALD6 en la cepa IMX705 mostró un marcado aumento en el rendimiento de glicerol en glucosa, así como la formación de glicerol por biomasa formada en cultivos anaerobios de la cepa mutante en comparación con el control. Las estrategias de manipulación causaron solo una disminución menor en las máximas velocidades de crecimiento específicas de las cepas mutantes. Esto indica que esta estrategia podría ser directamente aplicada a cepas industriales y ser usada posiblemente para aumentar el consumo de ácido acético en hidrolizados.

Tabla 19. Máximas velocidades de crecimiento específicas (p), rendimientos de productos principales y relaciones entre la formación de glicerol y acetato por biomasa formada. Datos obtenidos a partir de las fermentaciones discontinuas anaerobias realizadas en birreactores, con las cepas IMX585, IMX705, IMX899 e IMX756. Las fermentaciones se realizaron en medio sintético complementado con 20 g L-1 de glucosa. Los lotes se realizaron a pH 5, burbujeo de 500 mL min-1 de N2, 30 °C. Los rendimientos y las relaciones se calcularon a partir de los datos recogidos en la fase de crecimiento exponencial, como las pendientes de los gráficos de los valores medidos. El cálculo de los rendimientos de etanol se basó en datos corregidos para la evaporación. Los datos se presentan como promedios de experimentos duplicados independientes.

Considerando en el cálculo la evaporación del etanol, con mmoles en lugar de g para los cálculos de relación, y los datos de adición para IMX899, los datos se dan en la Tabla 19A:

Tabla 19A

Ejemplo 2

2.1 Cambio de especificidad del cofactor de 6PGDH en combinación con la vía reductora de acetato

El cambio combinado de la especificidad del cofactor de 6-fosfogluconato deshidrogenasa de NADP+ a NAD+ y la deleción de ALD6 en la cepa IMX756 produjo un aumento de 37,7 % en el rendimiento de glicerol en glucosa en comparación con la cepa de control IMX585 en fermentaciones discontinuas anaerobias. Este resultado estuvo en línea con el aumento de 40,5 % estimado en el rendimiento de glicerol en glucosa, en el escenario donde se genera NADH en exceso en el citosol basándose en la estrategia propuesta y la vía de formación de glicerol está todavía intacta. Como la siguiente etapa, se investiga el efecto de la sustitución de la vía de formación de glicerol por la reductora de acetato sobre la cantidad de acetato que se puede consumir por una cepa con IMX756 como parental. Para sustituir la vía de formación de glicerol por la de reducción de acetato, se delecionaron GPD1 y GPD2 (que codifican glicerol-3-fosfato deshidrogenasas) y se expresó en exceso eutE (codificado por acetaldehído deshidrogenasa acetilante de E. coli) en la cepa IMX756, dando la cepa IMX860. Además, la deleción de GPD1 y GPD2 y la expresión en exceso de eutE en IMX585 dio la cepa de control reductora de acetato IMX888.

En la cepa reductora de acetato IMX888, la 6-fosfogluconato deshidrogenasa es dependiente de NADP+. Basándose en los análisis teóricos realizados en el presente documento, se espera un consumo de 5,51 mmoles de acetato por gramo de biomasa formada para esta cepa, en fermentaciones anaerobias con glucosa como fuente de carbono. En la cepa IMX860, en la que cambia la especificidad del cofactor, se espera un consumo de 8,75 mmoles de acetato por gramo de biomasa formada.

En este experimento, se investiga el efecto de la estrategia de manipulación propuesta en este escenario en el consumo de acetato anaerobio. Se cultivaron las cepas IMX860 e IMX888 en fermentaciones anaerobias en birreactores, complementados con 20 g L-1 de glucosa y 3 g L-1 de ácido acético. El burbujeo, control del pH, así como temperatura, fueron idénticos a los lotes realizados con las cepas IMX585, IMX705 e IMX756. Basándose en el análisis teórico, se espera un aumento de 59 % en acetato consumido por biomasa formada en la cepa IMX860 en comparación con IMX888. Además, la estrategia de manipulación en la cepa IMX860 debe dar como resultado un aumento teórico de 3 % en el rendimiento del etanol en glucosa en comparación con la cepa IMX888 y 22,4 % en comparación con el escenario no mutante. Los resultados se dan en las Tablas 20, 20A y 21. Para la Tabla 20A, cálculo del incremento de consumo de acetato sobre glucosa y por biomasa formada entre las cepas IMX888 (que usa la estrategia de Medina et al. 2010) y la cepa IMX860 (que usa la estrategia en este ejemplo), se restó el consumo aparente de la cepa de control IMX585 (que no contiene eutE) de los valores calculados.

Tabla 20. Máximas velocidades de crecimiento específicas, rendimientos de productos principales y relaciones entre acetato consumido sobre glucosa consumida y biomasa formada. Datos obtenidos a partir de las fermentaciones discontinuas anaerobias realizadas en birreactores, con las cepas IMX585, IMX888 e IMX860. Las fermentaciones se realizaron en medio sintético complementado con 20 g L-1 de glucosa y 3 g L-1 de ácido acético. Los lotes se realizaron a pH 5, burbujeo de 500 mL min-1 de N2, 30 °C. Los rendimientos y las relaciones se calcularon a partir de los datos recogidos en la fase de crecimiento exponencial. El cálculo de los rendimientos de etanol se basó en datos corregidos para la evaporación. Los datos se presentan como promedios de experimentos duplicados independientes.

Considerando en el cálculo la evaporación del etanol, y con mmoles en lugar de g para los cálculos de relación y los datos de adición de glicerol/glucosa (g g-1) para IMX888 e IMX860, los datos se dan en la Tabla 20A.

Tabla 20A

2.2. Cambio de especificidad del cofactor de G6PDH en la generación de NADH citosólico adicional y la vía reductora de acetato

Recientemente se ha caracterizado una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+, designada azf, en la arquea Haloferax volcanii (Pickl y Schonheit, 2015). En este ejemplo, el efecto de un cambio de cofactor de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de NADP+ a NAD+ sobre la generación de NADH citosólico adicional por biomasa formada, azf se expresa en exceso en un contexto de zwf1A de S. cerevisiae. Basándose en el análisis teórico y los experimentos realizados en la presente solicitud, se espera un impacto teórico idéntico del cambio de cofactor de 6-fosfogluconato deshidrogenasa.

Se usa la secuencia de proteínas de Azfp (ADE03728.1) de Haloferax volcanii DS2 para generar una versión de codones optimizados de levadura de azf, basándose en la composición de genes glicolíticos altamente expresados (Wiedemann y Boles, 2008). Se sintetiza un casete de expresión en exceso, bajo el control de un promotor glicolítico constitutivo fuerte, y se clona en un plásmido. El plásmido se usa como molde para generar un producto de PCR en el que el casete de expresión en exceso está flanqueado por secuencias de 60 pb homólogas a las regiones directas en la dirección 5' y en la dirección 3' de ZWF1. El locus de ZWF1 se deleciona entonces usando el sistema CRISPR/Cas9 con el producto de PCR como el fragmento de reparación, dando como resultado una cepa zwfVv.azf. La determinación de la actividad enzimática de Azfp en la cepa zwflv.azf se realiza como se describió previamente (Pickl y Schonheit, 2015). Además, se investiga el efecto de la sustitución de ZWF1 por azf sobre la velocidad de crecimiento específica máxima aerobia de la cepa manipulada en un modo idéntico a la forma que se determinó para las cepas IMX705, IMX706 e IMX707 en la presente solicitud.

La cepa zwflv.azf generada se caracteriza en fermentaciones anaerobias en birreactores con 20 g L-1 de glucosa como fuente de carbono y en comparación con su cepa parental, así como la cepa IMX705. Se espera que la cepa rinda similarmente a la cepa IMX705 en términos de rendimiento de glicerol sobre glucosa y la formación de glicerol en biomasa formada y tenga un aumento de al menos 22,6 % en el rendimiento de glicerol sobre glucosa en comparación con su cepa no mutante parental.

La cepa zwflv.azf se manipula adicionalmente por deleción de GPD1 y GPD2 e introducción de eutE en el locus GPD2, usando las mismas etapas que el caso de la construcción de la cepa IMX888. El genotipo relevante de la cepa resultante es gpd1A gpd2.:eutEzwfVv.azf.

En los experimentos de seguimiento, se investiga el efecto de la estrategia de ingeniería propuesta en este escenario en el consumo anaerobio de acetato. La cepa gpd1A gpd2::eutE zwfVv.azf se cultiva en fermentaciones anaerobias en biorreactores, complementada con 20 g L-1 de glucosa y 3 g L-1 de ácido acético. El burbujeo, control de pH, así como la temperatura, son idénticos a los lotes realizados con las cepas IMX585, IMX705 e IMX756. Basándose en el análisis teórico y similarmente a la cepa IMX888, se espera un aumento de 59 % en el acetato consumido por biomasa formado en esta cepa en comparación con la cepa reductora de acetato IMX860, en la que no se ha hecho cambio de cofactor de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o 6-fosfogluconato deshidrogenasa.

2.2 Cambio simultáneo de la especificidad del cofactor de G6PDH y 6PGDH en la generación de NADH citosólico adicional y la vía reductora de acetato

Para investigar el efecto de un cambio simultáneo del cofactor de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y 6-fosfogluconato deshidrogenasa de NADP+ a NAD+ en la generación de NADH citosólico adicional por biomasa formada, se expresan en exceso azf y gndA en una cepa zwf1A gnd1A gnd2A.

La generación de un casete de expresión en exceso de azf se realiza como se describió previamente en la presente solicitud. La construcción de cepas se realiza idénticamente a la descrita para la cepa zwf1::azf. En este caso, se usa la cepa IMX705 como parental. El genotipo relevante resultante de la cepa generada es gnd2A gnd1::gndA zwf1::azf.

La determinación de la actividad enzimática de Azfp en la cepa zwf1::azf se realiza como se describió previamente (Pickl y Schonheit, 2015). La determinación de la actividad enzimática de GndAp se realiza como se describió en la presente solicitud.

La cepa gnd2A gnd1::gndA zwf1::azf generada se caracteriza en fermentaciones anaerobias en biorreactores con 20 g L-1 de glucosa como fuente de carbono y en comparación con su cepa IMX705 parental, así como la cepa IMX585 (sin cambio de especificidad del cofactor). En este escenario, NADPH se genera principalmente mediante la reacción catalizada por Ald6p. La cantidad de NADH adicional que se genera por biomasa formada se determina por el flujo de glucosa a través de la parte oxidativa de la vía de la pentosa-fosfato. En este escenario, suponiendo 100 % de especificidad por NAD+, el flujo a través de la parte oxidativa de la pentosa-fosfato ya no se acopla a la generación de NADPH. En un escenario donde las enzimas usan preferentemente NAD+, pero también muestran actividad hacia NADP+, el flujo a través de esta vía se puede correlacionar todavía a la provisión de NADPH. Se espera que el cambio de los cofactores de tanto glucosa-6-fosfato deshidrogenasa como 6-fosfogluconato deshidrogenasa dé como resultado un aumento adicional de la formación de NADH citosólico por biomasa formada, cuando se compara con el cambio de cualquier cofactor solo.

La cepa gnd2A gnd1::gndA zwf1::azf se manipula adicionalmente por deleción de GPD1 y GPD2 e introducción de eutE en el locus GPD2, usando las mismas etapas que el caso de la construcción de la cepa IMX888. El genotipo relevante de la cepa resultante es gpd1A gpd2::eutEgnd2A gnd1::gndA zwf1::azf.

En los experimentos de seguimiento, se investiga el efecto de la estrategia de manipulación propuesta en este escenario en el consumo de acetato anaerobio. La cepa gpd1A gpd2::eutEgnd2A gnd1::gndA zwf1::azf se cultiva en fermentaciones anaerobias en biorreactores, complementada con 20 g L-1 de glucosa y 3 g L-1 de ácido acético. El burbujeo, control de pH, así como la temperatura, son idénticos a los lotes realizados con las cepas IMX585, IMX705 e IMX756. Se espera en este caso un aumento del consumo de acetato por biomasa formada en comparación con la cepa IMX860 y gpd1A gpd2::eutEzwf1::azf.

Las ventajas de las cepas según la invención, como se muestran en los ejemplos, se resumen en la Tabla 21, Tabla 21 Aumento del rendimiento para etanol y glicerol y acetato consumido con valores teóricamente calculados (entre paréntesis), en comparación con cepa no mutante y para el escenario de acetato (biocombustible) y el escenario de glicerol (vino).

A partir de la Tabla 21 es evidente que se pueden obtener ventajas sustanciales:

Para aplicación en la industria de los biocombustibles, es ventajoso 28 % de aumento de consumo de acetato y 1,3 % de aumento en el rendimiento de etanol.

Para la aplicación en la industria vitivinícola, es ventajoso hasta 38 % de aumento de rendimiento de glicerol y la misma producción de etanol o más baja.

Basándose en los datos y cálculos de las Tablas 19A y 20A, como la Tabla resumen 21, está a continuación la Tabla resumen 21A:

Tabla 21A

De la Tabla 21A es evidente que se pueden obtener ventajas sustanciales:

Para aplicación en la industria de los biocombustibles, es ventajoso 44 % de aumento de consumo de acetato por gramo de biomasa formada y 3 % de aumento en el rendimiento de etanol en glucosa.

Para la aplicación en la industria vitivinícola, es ventajoso hasta 39 % de aumento de rendimiento de glicerol y la misma producción de etanol o más baja.

Referencias

Medina VG, Almering MJH, Van Maris AJA, Pronk JT. 2010. Elimination of glycerol production in anaerobic cultures of a Saccharomyces cerevisiae strain engineered to use acetic acid as an electron acceptor. Applied and Environmental Microbiology 76:190-195. (Medina et al. 2010);

van Dijken JP, Bauer J, Brambilla L, Duboc P, Francois JM, Gancedo C, Giuseppin MLF, Heijnen JJ, Hoare M, Lange HC, Madden EA, Niederberger P, Nielsen J, Parrou JL, Petit T, Porro D, Reuss M, van Riel N, Rizzi M, Steensma HY, Verrips CT, Vindelov J, Pronk JT. 2000. An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains. Enzyme and Microbial Technology 26:706-714. (van Dijken et al. 2000);

Verduyn C, Postma E, Scheffers WA, Van Dijken JP. 1992. Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts: A continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation. Yeast 8:501-517. (Verduyn et al. 1992);

Müller UM, Wu L, Raamsdonk LM, Winkler AA. Acetyl-coa producing enzymes in yeast. (Wiedemann and Boles, 2008);

Documento de patente US 20100248233 A1. Prioridad 30-9-2010. (Müller et al. 2010);

Gietz RD, Woods RA. 2002. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology 350:87-96. (Gietz and Woods, 2002);

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula eucariota que es naturalmente capaz de fermentación alcohólica que se modifica genéticamente, que comprende uno o más genes heterólogos que codifican:

a) D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o

b) 6-fosfogluconato deshidrogenasa; y/o

c) glucosa deshidrogenasa, gluconolactonasa y gluconato cinasa,

en donde a), b) y glucosa deshidrogenasa en c) son dependientes de NAD+.

2. Una célula eucariota según la reivindicación 1 que está genéticamente modificada, que comprende uno o más genes heterólogos que codifican:

a) D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o

b) 6-fosfogluconato deshidrogenasa;

en donde a) y b) son dependientes de NAD+.

3. La célula eucariota según la reivindicación 1 o 2, que comprende:

d) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una acetaldehído deshidrogenasa acetilante dependiente de NAD+ (E.C. 1.2.1.10) heteróloga y

e) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una acetil-CoA sintetasa (E.C. 6.2.1.1) homóloga o heteróloga; y opcionalmente,

3.1.3.21) y/o h) de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.8 o E.C. 1.1.5.3), nativa en la célula eucariota.

4. La célula eucariota según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde

f) se altera una acetaldehído deshidrogenasa-6 (ALD6).

5. La célula eucariota según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa nativa en la célula eucariota se sustituye por la D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa NAD+ heteróloga y/o en donde la 6-fosfogluconato deshidrogenasa nativa en la célula eucariota se sustituye por la 6-fosfogluconato deshidrogenasa NAD+ heteróloga.

6. La célula eucariota según la reivindicación 5, en donde los genes nativos son parte de la vía de la pentosa-fosfato que son dependientes de NADP+ y se eligen del grupo: GND1, GND2 y ZWF1.

7. La célula eucariota según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el uno o más genes heterólogos codifican una D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que tiene al menos 60 %, al menos 70 %, o al menos 80 % de identidad con SEQ ID NO: 8.

8. La célula eucariota según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde los genes heterólogos codifican 6-fosfogluconato deshidrogenasa que tiene al menos 60 %, al menos 70 %, o al menos 80 % de identidad con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.

9. La célula eucariota según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la célula eucariota es una célula de levadura, preferentemente una célula de Saccharomyces o célula de Saccharomyces cerevisiae.

10. La célula eucariota según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la célula eucariota comprende una alteración de uno o más de los genes gpp1, gpp2, gpd1 y gpd2 nativos en la célula eucariota.

11. La célula eucariota según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la célula eucariota comprende: i) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una xilosa isomerasa (E.C. 5.3.1.5) heteróloga.

12. La célula eucariota según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la célula eucariota comprende además:

j) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una glicerol deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.6) heteróloga.

13. La célula eucariota según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la célula eucariota es una célula eucatriota fermentadora de pentosa y glucosa que es capaz de consumo simultáneo anaerobio de pentosa y glucosa.

14. Uso de la célula eucariota según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13 en la fermentación en la industria de los bicombustibles.

15. Proceso para la fermentación de un sustrato para producir un producto de fermentación con una célula eucariota según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, en la industria de los bicombustibles, en donde el consumo de acetato se eleva al menos 10 %, al menos 20 %, o al menos 25 % con respecto a la fermentación correspondiente con célula eucariota no mutante.

16. Proceso según la reivindicación 15, en donde el producto de fermentación es etanol y el rendimiento del etanol es al menos aproximadamente 0,5 %, o al menos 1 % superior al de un proceso con la célula eucariota no mutante correspondiente.

17. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16, en donde se cofermentan pentosa y glucosa.

18. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde se fermenta un hidrolizado de material lignocelulósico, preferentemente un hidrolizado enzimático de material lignocelulósico.

19. Proceso según la reivindicación 18, en donde el hidrolizado comprende acetato.