ES2275268T3 - Uso de un receptor de la interleuquina 11 humana. - Google Patents
Uso de un receptor de la interleuquina 11 humana. Download PDFInfo
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Abstract
SE REVELAN LOS POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN EL RECEPTOR DE IL11 HUMANA Y SUS FRAGMENTOS. TAMBIEN SE REVELAN LAS PROTEINAS DEL RECEPTOR DE IL-11, LOS METODOS PARA SU PRODUCCION, LOS INHIBIDORES DE UNION DE LA IL-11 Y DE SU RECEPTOR Y LOS METODOS PARA SU IDENTIFICACION.
Description
Uso de un receptor de la interleuquina 11
humana.
La presente invención está relacionada con el
uso de una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos
seleccionada de entre el grupo que consiste en (a) la secuencia de
aminoácidos de ID de SEC Nº:2; y (b) la secuencia de aminoácidos de
ID de SEC Nº:2 de los aminoácidos 24 a 422; o producida por una
célula huésped transformada con las secuencias de polinucleótidos
que codifican dichas proteínas, y un transportador farmacéuticamente
aceptable, para la preparación de una composición farmacéutica para
tratar o prevenir la pérdida de masa ósea en un sujeto mamífero.
Se han identificado varias moléculas
reguladoras, conocidas como citoquinas, lo que incluye la
interleuquina-11 (IL-11). Las
diferentes formas de la proteína IL-11 y los DNA que
codifican las diferentes formas de actividad de la
IL-11 se describen en Bennett et al., USPN
5.215.895 (1 de junio de 1993); McCoy et al., USPN 5.270.181
(14 de diciembre de 1993); y McCoy et al., USPN 5.292.646 (8
de marzo de 1994), todos incorporados aquí como referencia. Así, el
término "IL-11" incluye las proteínas con la
actividad biológica descrita en estas patentes, tanto si se han
obtenido mediante técnicas de ingeniería genética recombinante:
purificadas a partir de células que producen el factor naturalmente
o tras la inducción con otros factores, como si se han sintetizo
mediante técnicas químicas; o una combinación de lo anterior.
La IL-11 es una citoquina
pleyotrópica que se ha implicado en la producción de varias
actividades biológicas, lo que incluye: la inducción de la
proliferación de las células progenitoras hematopoyéticas
multipotenciales (Musashi et al. (1991) Blood. 78.
1448-1451); la potenciación de la formación de
megacariocitos y plaquetas (Burstein et al. (1992) J. Cell.
Physiol., 153, 305-312); la estimulación de la
síntesis de proteínas de fase aguda (Baumann et al. (1991)
J. Biol. Chem., 266, 20424-20427); la inhibición de
la actividad lipoproteína lipasa de los adipocitos (Kawashima et
al. (1991) FEBS Lett., 283, 199-202); y efectos
sobre el fenotipo neurotransmisor (Fann et al. (1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 91, 43-47).
La IL-11 puede utilizarse en una
preparación o formulación farmacéutica para tratar deficiencias
inmunes, específicamente deficiencias en las células progenitoras
hematopoyéticas, o trastornos relacionados con las mismas. También
puede utilizarse IL-11 en el tratamiento de otros
trastornos o en la estimulación del sistema inmune en las células
de los mismos. La IL-11 también puede utilizarse en
los métodos para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades.
Tales estados patológicos pueden resultar de una enfermedad,
exposición a radiación o drogas, y incluyen, por ejemplo,
leucopenia, infecciones bacterianas y víricas, anemia, deficiencias
de células B o células T como en la deficiencia de células inmunes o
de células hematopoyéticas tras un transplante de médula ósea. La
IL-11 también puede utilizarse para potenciar la
respuesta inmune a una serie de vacunas, dando lugar a una
inmunidad más duradera y más efectiva. El tratamiento terapéutico
del cáncer y otras enfermedades con IL-11 puede
evitar efectos colaterales no deseados causados por el tratamiento
con los fármacos disponibles en la actualidad.
Como la mayoría de las citoquinas, la
IL-11 muestra ciertas actividades biológicas a
través de su interacción con un receptor de IL-11
(IL-11R) en la superficie de las células diana.
Sería interesante la identificación y clonación de la secuencia del
receptor humano, de forma que las proteínas IL-11R
pudieran producirse para varios usos, lo que incluye la producción
de terapéuticos y el cribado de inhibidores de la unión de
IL-11 al receptor y de la señalización del
receptor.
La especificación describe los polinucleótidos
que codifican el receptor de la interleuquina-11
humana. La especificación también describe un polinucleótido
aislado que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de
entre el grupo que consiste en:
(a) la secuencia nucleotídica con ID de SEC Nº:1
del nucleótido 803 al nucleótido 1999;
(b) una secuencia nucleotídica que es diferente
de la secuencia de la secuencia nucleotídica especificada en (a)
como resultado de la degeneración del código genético; y
(c) una variante alélica de la secuencia
nucleotídica especificada en (a). La secuencia nucleotídica descrita
codifica una proteína con una actividad biológica del receptor de
IL-11 humana. La secuencia nucleotídica puede estar
ligada operativamente a una secuencia de control de la expresión. El
polinucleótido descrito comprende la secuencia nucleotídica de ID
de SEC Nº:1 del nucleótido 803 al nucleótido 1999 o un fragmento de
la misma; la secuencia nucleotídica de ID de SEC Nº:1 del
nucleótido 803 al nucleótido 1828 o un fragmento de la misma; la
secuencia nucleotídica de ID de SEC Nº:1 del nucleótido 1904 al
nucleótido 1999 o un fragmento de la misma; la secuencia
nucleotídica de ID de SEC Nº:1 del nucleótido 734 al nucleótido 1999
o un fragmento de la misma; la secuencia nucleotídica de ID de SEC
Nº:1 del nucleótido 1067 al nucleótido 1828 o un fragmento de la
misma; o la secuencia nucleotídica de ID de SEC Nº:1 del nucleótido
1067 al nucleótido 1999 o un fragmento de la misma. El
polinucleótido descrito comprende una secuencia nucleotídica capaz
de hibridar con la secuencia nucleotídica de ID de SEC Nº:1 bajo
condiciones altamente astringentes.
La especificación también describe
polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia nucleotídica
que codifica un péptido o proteína que comprenden una secuencia
aminoacídica seleccionada de entre el grupo que consiste en:
(a) la secuencia aminoacídica con ID de SEC
Nº:2;
(b) la secuencia aminoacídica con ID de SEC Nº:2
del aminoácido 24 al 422;
(c) la secuencia aminoacídica con ID de SEC Nº:2
del aminoácido 24 al 365;
(d) la secuencia aminoacídica con ID de SEC Nº:2
del aminoácido 391 al 422;
(e) la secuencia aminoacídica con ID de SEC Nº:2
del aminoácido 112 al 422;
(f) la secuencia aminoacídica con ID de SEC Nº:2
del aminoácido 112 al 365; y
(g) fragmento de (a)-(f) con una actividad
biológica del receptor de la IL-11 humana.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describen las células huésped,
preferiblemente células de mamífero, transformadas con los
polinucleótidos.
La especificación describe un proceso para
producir una proteína IL-11R humana. El proceso
comprende:
(a) el crecimiento de un cultivo de la célula
huésped de la presente invención en un medio de cultivo adecuado;
y
(b) la purificación de la proteína
IL-11R humana del cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describen proteínas obtenidas de
acuerdo con estos métodos.
La especificación también describe una proteína
IL-11R humana aislada que comprende una secuencia
aminoacídica seleccionada de entre el grupo que consiste en:
(a) la secuencia aminoacídica con ID de SEC
Nº:2;
(b) la secuencia aminoacídica con ID de SEC Nº:2
del aminoácido 24 al 422;
(c) la secuencia aminoacídica con ID de SEC Nº:2
del aminoácido 24 al 365;
(d) la secuencia aminoacídica con ID de SEC Nº:2
del aminoácido 391 al 422;
(e) la secuencia aminoacídica con ID de SEC Nº:2
del aminoácido 112 al 422;
(f) la secuencia aminoacídica con ID de SEC Nº:2
del aminoácido 112 al 365; y
(g) fragmentos de (a)-(f) con una actividad
biológica del receptor de la IL-11 humana. La
proteína puede comprender la secuencia aminoacídica con ID de SEC
Nº:2; la secuencia del aminoácido 24 al 422 del ID de SEC Nº:2; la
secuencia del aminoácido 24 al 365 del ID de SEC Nº:2; o la
secuencia del aminoácido 391 al 422 del ID de SEC Nº:2. También se
describen las composiciones farmacéuticas que comprenden una
proteína de la presente especificación y un transportador
farmacéuticamente aceptable.
La especificación describe composiciones que
comprenden un anticuerpo que reacciona específicamente con una
proteína descrita en la presente especificación.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describen los métodos para la
identificación de un inhibidor de la unión de la
IL-11 al receptor de la IL-11
humana. Estos métodos comprenden:
(a) combinar una proteína IL-11R
humana o un fragmento de la misma con la IL-11 o un
fragmento de la misma, formando dicha combinación una primera
mezcla de unión;
(b) medir la cantidad de unión entre la proteína
y la IL-11 o fragmento en esta primera mezcla de
unión;
(c) combinar un compuesto con la proteína y la
IL-11 o fragmento para formar una segunda mezcla de
unión;
(d) medir la cantidad de unión en la segunda
mezcla de unión; y
(e) comparar la cantidad de unión en la primera
mezcla de unión con la cantidad de unión en la segunda mezcla de
unión;
en la que el compuesto es capaz de inhibir la
unión de IL-11 al receptor de la
IL-11 humana si aparece una reducción de la
cantidad de unión en la segunda mezcla de unión. Opcionalmente, la
primera y/o segunda mezcla de unión puede además comprender la
gp130 o un fragmento de la misma capaz de unirse a la proteína de la
reivindicación 11 o la IL-11 o fragmento utilizado
en la misma. Los inhibidores del IL-11R
identificados mediante estos métodos y las composiciones
farmacéuticas que los contienen también se describen.
También se describen los métodos para inhibir la
unión de la IL-11 al receptor de
IL-11 humana en un sujeto mamífero, lo que
comprende la administración de una cantidad terapéuticamente
efectiva de una composición que contienen una proteína
IL-11R humana, un inhibidor del
IL-11R o un anticuerpo contra una proteína
IL-11R humana.
La presente invención está relacionada con el
uso de una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos
seleccionada de entre el grupo que consiste en (a) la secuencia de
aminoácidos con ID de SEC Nº:2; y (b) la secuencia de aminoácidos
con ID de SEC Nº:2 del aminoácido 24 al 422; o producida por una
célula huésped transformada con las secuencias de polinucleótidos
que codifican dichas proteínas, y un transportador farmacéuticamente
aceptable, para la preparación de una composición farmacéutica para
tratar o prevenir la pérdida de masa ósea en un sujeto
mamífero.
La Figura 1 muestra una representación
esquemática de las estructuras del receptor de la
IL-11 humana y la gp130.
La Figura 2 presenta los datos que demuestran la
actividad biológica de una forma soluble de la proteína
IL-11R recombinante humana.
La presente especificación describe un
polinucleótido que codifica el receptor de la IL-11
humana (IL-11R humano).
El ID de SEC Nº:1 proporciona la secuencia
nucleotídica de un cDNA que codifica el IL-11R
humano. El ID de SEC Nº:2 proporciona la secuencia aminoacídica del
receptor, incluyendo una secuencia señal putativa de los
aminoácidos 1-23. El IL-11R
procesado humano se cree tiene la secuencia de los aminoácidos
24-422 del ID de SEC Nº:2.
El receptor procesado muestra al menos tres
dominios distintos: un dominio extracelular (que comprende
aproximadamente los aminoácidos 24-365 del ID de
SEC Nº:2), un dominio transmembrana (que comprende aproximadamente
los aminoácidos 366-390 del ID de SEC Nº:2) y un
dominio intracelular (que comprende aproximadamente los aminoácidos
391-422 del ID de SEC Nº:2). El dominio
extracelular está dividido además en un dominio tipo inmunoglobulina
(que comprende aproximadamente los aminoácidos
24-111 del ID de SEC Nº:2) y un dominio citoquina
tipo I (que comprende aproximadamente los aminoácidos
112-365 del ID de SEC Nº:2).
También pueden producirse formas solubles de la
proteína IL-11R humana. Tales formas solubles
incluyen sin limitación a proteínas que comprenden los aminoácidos
1-365 y 24-365 del ID de SEC Nº:2.
Las formas solubles del IL-11R humano se
caracterizan también por ser solubles en solución acuosa;
preferiblemente a temperatura ambiente. También pueden producirse
proteínas IL-11R humanas que comprenden solo el
dominio intracelular o una porción del mismo. Cualquier forma del
IL-11R humano de longitud menor a la total está
incluida en la presente invención y colectivamente éstas se
denominan aquí "IL-11R humano" o "proteínas
IL-11R humanas". Las proteínas
IL-11R humanas de longitud menor a la total pueden
producirse expresando un fragmento correspondiente del
polinucleótido que codifica la proteína IL-11R
humana completa (ID de SEC Nº:1). Estos fragmentos de polinucleótido
correspondientes también forman parte de la presente
especificación. Pueden obtenerse polinucleótidos modificados como
los descritos anteriormente mediante técnicas de biología molecular
estándar, lo que incluye la construcción de los mutantes apropiados
con la deleción deseada, métodos de mutagénesis dirigida o mediante
la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores
oligonucleótidos adecuados.
En base a la similitud con la estructura del
receptor de la IL-6, se puede predecir que las
proteínas IL-11R que contienen solo el dominio
citoquina tipo I de la región extracelular del receptor completo
serán capaces de unirse a la IL-11 e inducir la
señalización del receptor. Como resultado, las proteínas
IL-11R que comprenden los aminoácidos del 112 al
365 del ID de SEC Nº:2, las proteínas IL-11R que
comprenden los aminoácidos del 112 al 390 del ID de SEC Nº:2 y las
proteínas IL-11R que comprenden los aminoácidos del
112 al 422 del ID de SEC Nº:2 se describen en la presente
especificación. Los polinucleótidos que codifican tales proteínas
(como por ejemplo un polinucleótido que comprende la secuencia de
nucleótidos del ID de SEC Nº:1 del nucleótido 1067 al nucleótido
1828, un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos
del ID de SEC Nº:1 del nucleótido 1067 al nucleótido 1906 y, un
polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos del ID de
SEC Nº:1 del nucleótido 1067 al nucleótido 1999, respectivamente)
también se describen en la especificación.
Para los propósitos de la presente invención,
una proteína tiene "una actividad biológica del receptor
IL-11 humano" si posee una o más de las
siguientes características: (1) la capacidad de unirse a
IL-11 o a un fragmento de la misma (preferiblemente
un fragmento biológicamente activo de la misma); (2) la capacidad de
unirse a proteínas o moléculas citosólicas, involucradas en la vía
de señalización desencadenada por la unión de IL-11
al IL-11R humano; (3) la capacidad de producir una
señal característica de la unión de la IL-11 al
IL-11R humano (en la que la proteína en cuestión
contiene una porción capaz de unirse a IL-11 o en la
que la proteína en cuestión produciría tal señal junto a otra
proteína que es capaz de unirse a IL-11); (4) la
capacidad de unirse a gp130 o a un fragmento de la misma (en
presencia o ausencia de IL-11); (5) la capacidad de
inducir la fosforilación de tirosina en la gp130; (6) la capacidad
de inducir la fosforilación de tirosina de las quinasas JAK; o (7)
la capacidad de inducir la fosforilación de tirosina de las
proteínas de unión a DNA de la familia STAT (Zhong et al.
(1994) Science 264, 95-98). Preferiblemente, la
actividad biológica que posee la proteína es la capacidad de unirse
a IL-11 o a un fragmento de la misma, más
preferiblemente con una K_{D} de alrededor de 0,1 a alrededor de
100 nM, aún más preferiblemente con una K_{D} de alrededor de 1 a
alrededor de 10 nM.
El IL-11R humano o fragmentos
activos del mismo (proteínas IL-11R humanas) pueden
fusionarse a moléculas transportadoras como las inmunoglobulinas;
Por ejemplo, las formas solubles del IL-11R humano
pueden fusionarse a través de secuencias "enlazantes" a la
porción Fc de una inmunoglobulina. Pueden utilizarse otras proteínas
de fusión, como aquellas con GST, Lex-A o MBP.
La especificación también incluye variaciones
alélicas de la secuencia nucleotídica expuesta en el ID de SEC
Nº:1, es decir, formas alternativas que aparecen naturalmente del
polinucleótido aislado del ID de SEC Nº:1 que también codifican
proteínas IL-11R humanas, preferiblemente aquellas
proteínas con una actividad biológica del IL-11R
humano. También se incluyen en la especificación los polinucleótidos
aislados que hibridan con la secuencia de nucleótidos que muestra
el ID de SEC Nº:1 bajo condiciones altamente astringentes (por
ejemplo, 0,1xSSC a 65ºC). Los polinucleótidos aislados que
codifican proteínas IL-11R humanas pero que son
diferentes de la secuencia nucleotídica que muestra el ID de SEC
Nº:1 a causa de la degeneración del código genético también están
incluidos en la presente invención. Las variaciones en la secuencia
nucleotídica expuesta en el ID de SEC Nº:1 que son causadas por
mutaciones puntuales o y por modificaciones inducidas también se
incluyen en la especificación.
Los polinucleótidos aislados de la invención
pueden estar ligados operativamente a una secuencia de control de
la expresión como los vectores de expresión pMT2 o pED, descritos en
Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19,
4485-4490 (1991), para producir la proteína
IL-11R humana de forma recombinante. En la materia
se conocen varias secuencias de control de la expresión adecuadas.
Los métodos generales de expresión de proteínas recombinantes
también son conocidos y se ejemplifican en R. Kaufman, Methods in
Enzymology 185, 537-566 (1990). Como se
define aquí, "ligado operativamente" significa ligado
enzimáticamente o químicamente para formar un enlace covalente
entre el polinucleótido aislado de la invención y la secuencia de
control de la expresión, de tal forma que la proteína
IL-11R humana se exprese en una célula huésped que
ha sido transformada (transfectada) con la ligación del
polinucleótido y la secuencia de control de la expresión.
Un número de tipos celulares pueden actuar como
células huésped adecuadas para la expresión de la proteína
IL-11R humana. Puede utilizarse cualquier tipo
celular capaz de expresar proteína IL-11R humana
funcional. Las células huésped de mamífero adecuadas incluyen, por
ejemplo, las células COS de mono, células de ovario de hámster
chino (CHO), células de riñón humanas 293, células epidérmicas
humanas A431, células Colo205 humanas, células 3T3, células
CV-1, otras líneas celulares transformadas de
primate, células diploides normales, cepas de células derivadas a
partir de cultivos in vitro de tejido primario, explantes
primarios, células HeLa, células L de ratón, células BHK,
HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D,
FDCP-1, PC12, M1x o C2C12.
La proteína IL-11R humana
también puede obtenerse ligando operativamente el polinucleótido
aislado de la invención a secuencias de control adecuadas en uno o
más vectores de expresión de insecto, y utilizando un sistema de
expresión de insecto. Los materiales y métodos para los sistemas de
expresión de baculovirus/ células de insecto están disponibles
comercialmente en forma de equipos de, por ejemplo, Invitrogen, San
Diego, California, USA (el equipo MaxBac®), y tales métodos son
bien conocidos en la materia, como se describe en Summers y Smith,
Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555
(1987), incorporado aquí como referencia. Las formas solubles
de la proteína IL-11R humana también pueden
producirse en células de insecto utilizando los polinucleótidos
aislados apropiados como se ha descrito anteriormente.
Alternativamente, la proteína
IL-11R humana puede obtenerse en eucariotas
inferiores como las levaduras o en procariotas como las bacterias.
Las cepas de levadura adecuadas incluyen Saccharomyces
cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas de
Kluyveromyces, Candida, o cualquier cepa de levadura capaz de
expresar proteínas heterólogas. Las cepas bacterianas adecuadas
incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella
typhimurium, o cualquier cepa bacteriana capaz de expresar
proteínas heterólogas.
La expresión en las bacterias puede resultar en
la formación de cuerpos de inclusión que incorporan la proteína
recombinante. Así, puede ser necesario un nuevo plegamiento de la
proteína recombinante para producir material activo o más
activo.
En la materia son conocidos varios métodos para
la obtención de proteínas heterólogas correctamente plegadas a
partir de cuerpos de inclusión bacterianos. Estos métodos
generalmente involucran la solubilización de la proteína a partir
de los cuerpos de inclusión, luego una desnaturalización completa de
la proteína utilizando un agente caotrópico. Cuando están presentes
residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos primaria de la
proteína, es a menudo necesario realizar el replegamiento en un
ambiente que permita la correcta formación de puentes disulfuro (un
sistema rédox). Los métodos generales de replegamiento se describen
en Kohno, Meth. Enzym., 185:187-195 (1990).
La PE 0433225 y la solicitud copendiente USSN 08/163,877 describen
otros métodos adecuados.
La proteína IL-11R humana de la
invención también puede expresarse como un producto en animales
transgénicos, por ejemplo como un componente de la leche de vacas,
cabras, cerdos u ovejas transgénicas que se caracterizan por tener
células somáticas o germinales que contienen una secuencia
polinucleotídica que codifica la proteína IL-11R
humana.
La proteína IL-11R humana de la
invención puede obtenerse mediante el crecimiento de un cultivo de
células huésped transformadas bajos las condiciones de cultivo
necesarias para expresar la proteína deseada. La proteína expresada
resultante puede entonces purificarse a partir del medio de cultivo
o los extractos celulares. Las formas solubles de la proteína
IL-11R humana de la invención pueden purificarse a
partir de medios condicionados. Las formas unidas a la membrana de
la proteína IL-11R humana de la invención pueden
purificarse mediante la preparación de una fracción total de
membrana de las células que las expresan y extrayendo las membranas
con un detergente no iónico como el Triton
X-100.
La proteína IL-11R humana puede
purificarse utilizando métodos conocidos para los expertos versados
en la materia. Por ejemplo, la proteína IL-11R
humana de la invención puede concentrarse utilizando un filtro de
concentrado de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una
unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Tras el paso
de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de
purificación como un medio de gel filtración. Alternativamente,
puede utilizarse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo,
una matriz o sustrato con grupos dietilaminoetil(DEAE) o
polietilenimina (PEI) fijados. Las matrices pueden ser acrilamida,
agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos normalmente utilizados en
la purificación de proteínas. Alternativamente, puede utilizarse un
paso de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos
adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos
sulfopropilo o carboximetilo. Son preferibles los grupos
sulfopropilo (por ejemplo, columnas de
S-Sepharose®). La purificación de la proteína
IL-11R humana a partir de sobrenadantes de cultivo
puede también incluir uno o más pasos a través de columnas con tales
resinas de afinidad como la agarosa-concanavalina
A, toyopearl®-heparina o Sepharose® 3GA Cibacrom blue; o mediante
cromatografía de interacción hidrofóbica utilizando tales resinas
como el fenil éter, butil éter, o propil éter; o mediante
cromatografía de inmunoafinidad. Finalmente, pueden utilizarse uno o
más pasos de cromatografía líquida de alta resolución de fase
reversa (RP-HPLC) utilizando medios de
RP-HPLC hidrofóbicos, por ejemplo, gel de sílice
con grupos metilo u otros grupos alifáticos fijados, para purificar
más la proteína IL-11R humana. También pueden
utilizarse columnas de afinidad que contienen la
IL-11 o fragmentos de la misma, o que contienen
anticuerpos contra la proteína IL-11R en la
purificación de acuerdo con los métodos conocidos. También pueden
utilizarse algunos de los pasos de purificación anteriores, en
diferentes combinaciones o con otros métodos conocidos, para
proporcionar una proteína recombinante aislada sustancialmente
purificada. Preferiblemente, la proteína IL-11R
humana aislada se purifica de modo que esté sustancialmente libre de
otras proteínas de mamífero.
Las proteínas IL-11R humanas de
la especificación también pueden utilizarse para buscar agentes
capaces de unirse a la IL-11R humana o interferir
en la unión de IL-11 con el IL-11R
humano (bien el dominio extracelular o intracelular) y por lo tanto
puedan actuar como inhibidores de la unión y acción normales de la
citoquina (inhibidores de IL-11R). Los ensayos de
unión que utilizan una proteína de unión deseada, inmovilizada o no,
son bien conocidos en la materia y pueden utilizarse para este
propósito utilizando la proteína IL-11R humana
descrita en la especificación. Los ensayos de cribaje basados en
células purificadas o basados en proteínas (libres de células)
pueden utilizarse para identificar tales agentes. Por ejemplo, la
proteína IL-11R humana puede inmovilizarse en forma
purificada sobre un transportador y la unión a la proteína
IL-11R humana purificada puede medirse en presencia
y en ausencia de los agentes potencialmente inhibidores. Un ensayo
de unión adecuado puede utilizar alternativamente una forma soluble
del IL-11R humano de la invención.
En tal ensayo de cribaje, una primera mezcla de
unión se obtiene al combinar IL-11 o un fragmento de
la misma y proteína IL-11R humana, y se mide la
cantidad de unión en la primera mezcla de unión (B_{0}). Una
segunda mezcla de unión se obtiene también al combinar
IL-11 o un fragmento de la misma, proteína
IL-11R humana y el compuesto o agente a evaluar, y
se mide la cantidad de unión en la segunda mezcla de unión (B). Las
cantidades de unión en la primera y segunda mezclas de unión se
comparan, por ejemplo realizando un cálculo de la proporción
B/B_{0}. Un compuesto o agente se considera que es capaz de
inhibir la unión si se observa una reducción en la unión en la
segunda mezcla de unión comparado con la primera mezcla de
unión.
Opcionalmente, puede añadirse gp130 a una o
ambas mezclas de unión. La formulación y optimización de las mezclas
de unión está al alcance de los expertos en la materia, dichas
mezclas de unión también pueden contener los tampones y sales
necesarias para potenciar u optimizar la unión, y pueden incluirse
ensayos de control adicionales en el ensayo de cribaje descrito en
la especificación.
Los compuestos que se encontraron reducían la
actividad de unión de la proteína IL-11R humana a la
IL-11 o un fragmento de ésta en cualquier grado,
preferiblemente en al menos alrededor de un 10%, más preferiblemente
superior a alrededor de un 50% o más, pueden identificarse de este
modo y luego evaluarse de forma secundaria en otros ensayos de
unión y ensayos in vivo. Mediante estos métodos pueden
identificarse compuestos con actividad inhibitoria de la unión a
IL-11R que pueden resultar adecuados como agentes
terapéuticos.
Las proteínas IL-11R humanas, y
los polinucleótidos que codifican para ellas, también pueden
utilizarse como agentes diagnósticos para la detección de la
expresión o presencia de IL-11R,
IL-11 o de células que expresan
IL-11R o IL-11. Las proteínas o
polinucleótidos pueden utilizarse para este propósito en
procedimientos estándar para ensayos diagnósticos que utilizan este
tipo de materiales. Los métodos adecuados son bien conocidos para
los expertos en la materia.
El IL-11R humano actúa como
mediador de las actividades biológicas conocidas de
IL-11. Como resultado, la proteína
IL-11R humana aislada y los inhibidores de
IL-11R pueden ser útiles en el tratamiento o
modulación de varias condiciones médicas en las que está implicada
la IL-11 o que están causadas por la actividad (o
falta de la misma) de IL-11 (colectivamente
denominadas "condiciones relacionadas con
IL-11"). Las condiciones relacionadas con
IL-11 incluyen sin limitación las
inmunodeficiencias, específicamente las deficiencias en las células
progenitoras hematopoyéticas, o los trastornos relacionados con
éstas, el cáncer y otras enfermedades. Tales estados patológicos
pueden resultar de una enfermedad, exposición a radiación o a
drogas, e incluyen por ejemplo, la leucopenia, infecciones
bacterianas y víricas, anemia, deficiencias de células B o células
T como la deficiencia de células inmunes o deficiencia de células
hematopoyéticas tras un transplante de médula ósea.
También se cree IL-11 y
IL-11R pueden estar involucrados en la regulación de
la maduración y reparación ósea (Girasole et al. (1994) J.
Clin. Invest., 93, 1516-1524; Passeri et al.
(1992) J. Bone Miner. Res., 7(S1), S110 Abst.; Passeri et
al. (1993) J. Bone Miner. Res., 8(S1), S162 Abst.). Como
resultado, la proteína IL-11R humana y los
inhibidores de IL-11R pueden ser útiles en el
tratamiento de la pérdida ósea (lo que incluye la asociada con la
osteoporosis, osteoporosis post-menopáusica,
osteoporosis senil, osteoporosis idiopática, enfermedad de Pagets,
mieloma múltiple y condiciones de hipogonadismo).
La proteína IL-11R humana,
purificada a partir de células o producida de forma recombinante,
puede utilizarse como una composición farmacéutica si se combina
con un transportador farmacéuticamente aceptable. Tal composición
puede contener, además de la IL-11R humana o ligando
y el transportador, diluyentes, materiales de relleno, sales,
tampones, estabilizantes, solubilizantes y otros materiales bien
conocidos en la materia. El término "farmacéuticamente
aceptable" significa un material no tóxico que no interfiera con
la efectividad de la actividad biológica del(de los)
ingrediente(s) activo(s). Las características del transportador dependerán de la vía de administración.
ingrediente(s) activo(s). Las características del transportador dependerán de la vía de administración.
La composición farmacéutica de la invención
puede contener también citoquinas, linfoquinas u otros factores
hematopoyéticos como el M-CSF,
GM-CSF, IL-1, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9, IL-10, IL-11,
IL-12, IL-15, G-CSF,
factor de células madre y eritropoyetina. La composición
farmacéutica puede contener factores trombolíticos o
antitrombóticos como el activador de plasminógeno y el factor VIII.
La composición farmacéutica puede contener además otros agentes
antiinflamatorios. Tales factores y/o agentes adicionales pueden
incluirse en la composición farmacéutica para producir un efecto
sinérgico con la proteína IL-11R humana aislada o
para minimizar los efectos colaterales causados por la proteína
IL-11R humana aislada. De forma inversa, puede
incluirse la proteína IL-11R humana aislada en
formulaciones de la citoquina, linfoquina, otro factor
hematopoyético, factor trombolítico o antitrombótico o agente
antiinflamatorio particular para minimizar los efectos colaterales
de la citoquina, linfoquina, otro factor hematopoyético, factor
trombolítico o antitrombótico o agente antiinflamatorio.
La composición farmacéutica de la invención
puede estar en forma de liposoma en el que se combina proteína
IL-11R humana aislada, además de otros
transportadores farmacéuticamente aceptables, con agentes
anfipáticos como los lípidos que existen en forma agregada como
micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos o capas lamelares
en solución acuosa. Los lípidos adecuados para la formulación
liposomal incluyen, sin limitación, los monoglicéridos,
diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina,
ácidos biliares y similares. La preparación de dichas formulaciones
liposomales, que está al alcance de los expertos en la materia, se
describe por ejemplo en la Patente U.S. Nº 4.235.871; Patente U.S.
Nº 4.501.728; Patente U.S. Nº 4.837.028; y·Patente U.S. Nº
4.737.323, todas ellas incorporadas aquí como referencia.
Como se usa aquí, el término "cantidad
terapéuticamente efectiva" significa la cantidad total de cada
componente activo de la composición farmacéutica o método que es
suficiente para dar lugar a un beneficio significativo en el
paciente, por ejemplo una mejora de los síntomas, una curación, o un
aumento en la tasa de curación de tales condiciones. Cuando se
aplica a un ingrediente activo individual, que se administra solo,
el término se refiere a ese único ingrediente. Cuando se aplica a
una combinación, el término se refiere a las cantidades combinadas
de los ingredientes activos que resultan en el efecto terapéutico,
tanto si se administran en combinación, de forma seriada o de forma
simultanea.
En la práctica del método de tratamiento o la
utilización de la presente invención, se administra una cantidad
terapéuticamente efectiva de proteína IL-11R humana
aislada a un mamífero. La proteína IL-11R humana
aislada puede administrarse, de acuerdo con el método de la
invención, sola o en combinación con otras terapias como los
tratamientos que utilizan citoquinas, linfoquinas u otros factores
hematopoyéticos. Cuando se coadministra con una o más citoquinas,
linfoquinas u otros factores hematopoyéticos, la proteína
IL-11R humana puede administrarse simultaneamente
con la(s) citoquina(s), linfoquina(s),
otro(s) factores hematopoyético(s), factores
trombolíticos o antitrombóticos, o secuencialmente. Si se
administran secuencialmente, el médico asistente decidirá la
secuencia apropiada de administración de la proteína
IL-11R humana en combinación con la(s)
citoquina(s), linfoquina(s), otro(s) factores
hematopoyético(s), factores trombolíticos o
antitrombóticos.
La administración de proteína
IL-11R humana utilizada en la composición
farmacéutica o para poner en práctica el método de la presente
invención puede llevarse a cabo de varias formas convencionales,
como la ingestión oral, inhalación, o la inyección cutánea,
subcutánea, o intravenosa. Es preferible la administración
intravenosa al paciente.
Si se administra por vía oral una cantidad
terapéuticamente efectiva de proteína IL-11R humana,
la proteína IL-11R humana estará en forma de un
comprimido, cápsula, polvo, solución o elixir. Si se administra en
forma de comprimido, la composición farmacéutica de la invención
puede contener de forma adicional un transportador sólido como la
gelatina o un adyuvante. El comprimido, cápsula y polvo, contienen
entre alrededor del 5 y el 95% de proteína IL-11R
humana y preferiblemente entre alrededor del 25 y el 90%de proteína
IL-11R humana. Si se administra en forma líquida,
puede añadirse un transportador líquido como agua, petróleo, aceites
de origen animal o vegetal como el aceite de cacahuete, aceite
mineral, aceite de semilla de soja o aceite de sésamo, o aceites
sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede
contener además solución salina fisiológica, dextrosa u otra
solución de sacáridos, o glicoles como el etilenglicol,
propilenglicol o polietilenglicol. Si se administra en forma
líquida, la composición farmacéutica contiene entre alrededor del
0,5 y el 90% en peso de proteína IL-11R humana y
preferiblemente entre alrededor del 1 y el 50% de proteína
IL-11R humana.
Si se administra mediante inyección intravenosa,
cutánea o subcutánea una cantidad terapéuticamente efectiva de
proteína IL-11R humana, la proteína
IL-11R humana estará en forma de una solución acuosa
libre de pirógenos y aceptable por vía parenteral. La preparación
de tales soluciones de proteína aceptables por vía parenteral, con
la debida consideración del pH, isotonicidad, estabilidad y
similares, está al alcance del experto en la materia. Una
composición farmacéutica preferible para la inyección intravenosa,
cutánea o subcutánea debería contener, además de la proteína
IL-11R humana, un vehículo isotónico, como el
inyectable de cloruro sódico, inyectable de Ringer, inyectable de
dextrosa, inyectable de cloruro sódico y dextrosa, inyectable de de
Ringer con lactato u otro vehículo conocido en la materia. La
composición farmacéutica de la presente invención también puede
contener estabilizantes, conservantes, tampones, antioxidantes o
otros aditivos conocidos para los expertos en la materia.
La cantidad de proteína IL-11R
humana en la composición farmacéutica de la presente invención
dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que se está
tratando, y de la naturaleza de los tratamiento a los previamente
se haya sometido al paciente. En último término, el médico asistente
decidirá la cantidad de proteína IL-11R humana con
la que tratar a cada paciente individual. Inicialmente, el médico
asistente administrará dosis bajas de proteína
IL-11R humana y observará la respuesta de paciente.
Pueden administrarse dosis mayores de proteína
IL-11R humana hasta que se obtenga el efecto
terapéutico óptimo para el paciente, y generalmente en ese punto la
dosisno se aumenta más. Está contemplado que las diferentes
composiciones farmacéuticas utilizadas para poner en práctica el
método de la presente invención debe contener entre alrededor de 0,1
mg y alrededor de 100 mg de proteína IL-11R humana
por kg de peso corporal.
La duración de la terapia intravenosa utilizando
la composición farmacéutica de la presente invención variará en
función de la severidad de la enfermedad que se está tratando, y la
condición y potencial respuesta idiosincrática de cada paciente
individual. Está contemplado que la duración de cada aplicación de
proteína IL-11R humana estará en el rango de entre
12 y 24 horas de administración intravenosa continua. En último
término, el médico asistente decidirá la duración apropiada de la
terapia intravenosa utilizando la composición farmacéutica de la
presente invención.
Las proteínas IL-11R humanas de
la invención también pueden utilizarse para inmunizar animales para
obtener anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionen
específicamente con la proteína IL-11R humana y que
puedan inhibir la unión de la IL-11 o de fragmentos
de la misma al receptor. Tales anticuerpos pueden obtenerse
utilizando el IL-11R humano completo como inmunógeno
o utilizando fragmentos del IL-11R humano, como el
IL-11R humano procesado soluble. Fragmentos menores
del IL-11R humano también pueden utilizarse para
inmunizar animales. Los inmunógenos peptídicos pueden contener de
forma adicional un residuo cisteína en el extremo carboxilo, y
estar conjugados con un hapteno como la hemocianina de lapa
californiana (KLH). Pueden obtenerse otros inmunógenos peptídicos
substituyendo los residuos tirosina por residuos tirosina
sulfatados. Los métodos para sintetizar tales péptidos son
conocidos en la materia, por ejemplo, como los de R.P. Merrifield,
J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963);
J.L. Krstenansky et al., FEBS Lett. 211, 10
(1987).
Los anticuerpos neutralizantes o no
neutralizantes (preferiblemente anticuerpos monoclonales) que se
unen a la proteína IL-11R humana también pueden ser
terapéuticos útiles para ciertos tumores y también en el tratamiento
de las condiciones descritas anteriormente. Estos anticuerpos
monoclonales neutralizantes pueden ser capaces de bloquear la unión
de IL-11 con el IL-11R humano.
\newpage
Las sondas de DNA derivadas a partir de la
secuencia Etl-2 murina (ID de SEC Nº:3) se
obtuvieron mediante una PCR de cDNA de placenta murina. La sonda
amino-terminal corresponde a los pares de bases
418-570 y la sonda carboxi-terminal
a los pares de bases 847-1038 de la secuencia
Etl-2 murina. Las sondas de DNA se purificaron en
gel y se marcaron radiactivamente utilizando
\alpha32P-dATP y
\alpha32P-dCTP.
Se generó cDNA a partir de PBMC humanas
activadas utilizando el sistema Superscript Choice y se clonó el la
diana EcoR1 del ZAP II (Stratagene). Los fagos resultantes se
utilizaron para infectar la cepa de E. coli BB4. Se
sembraron un millón de fagos en placas NZCYM de 150 mm a una
densidad de 15000 ufp/placa. Las placas se transfirieron a filtros
duplicados de nitrocelulosa Duralose·(Stratagene). Tras una
desnaturalización alcalina y fijación con calor los filtros se
prehibridaron en 5xSSC, 5xDenhardts, SDS al 0,1% y tRNA de levadura
50 \mug/ml durante 2 horas a 65ºC. Un juego de filtros se hibridó
con la sonda amino-terminal y el otro juego con la
sonda carboxi-terminal (5 x 10^{5} cpm/ml) durante
48 horas a 55ºC en tampón de prehibridación. Los filtros se lavaron
con 4xSSC, SDS al 0,1% una vez a 25ºC y dos veces a 55ºC. Las placas
que hibridaron con ambas sondas se identificaron mediante
autoradiografía.
Del millón de placas analizadas, dos placas
hibridaron con ambas sondas. Estas placas se picaron y los fagos se
eluyeron en medio SM que contenía cloroformo. Los fagos resultantes
se utilizaron para reinfectar la cepa de E. coli BB4 y se
plaquearon en placas NZCYM a una densidad de 100-300
ufp/placa para un cribaje secundario.
Tras el cribaje secundario se aisló DNA
plasmídico de las placas ZAP II por escisión utilizando un fago
ayudante (Stratagene). La secuencia de DNA de los insertos se
determinó en un secuenciador de DNA Applied Biosystems.
El clon phIL11R14-2 que contenía
el polinucleótido con la secuencia con ID de SEC Nº:1 se depositó en
la ATCC con el número de acceso ________ el 22 de Diciembre de
1994.
\vskip1.000000\baselineskip
Una forma soluble de la proteína
IL-11R humana se expresó en células de mamífero. La
proteína recombinante expresada era capaz de transducir una señal
en células BAF130-9.
Una porción de la secuencia completa del
IL-11R humano (nuc1eótidos 734-1828
del ID de SEC Nº:1 que codifica los aminoácidos
1-365 del ID de SEC Nº:2) que corresponde a una
forma soluble se clonó en el vector de expresión de mamífero pED y
se utilizó para transfectar células COSM6. 40 horas después de la
transfección se separó el medio condicionante, se concentró 5 veces
y se utilizó para ensayos de proliferación con la línea celular
murina BAF130-9 (Hibi M. et al. (1990) Cell
63, 1149-57), un derivado de la línea celular BAFB03
que expresa el transductor de señales gp130 humano. Las células
BAF130-9 no proliferan en respuesta a la
IL-11 o IL-6 sola, pero proliferan
en respuesta a una combinación de IL-6 e
IL-6R soluble (Hibi et al., supra). Las
células BAF130-9 (1x10^{4} células en 0,l ml) se
cultivaron en medio RPMI 1640/FCS al 10% con concentraciones
crecientes de IL-11 recombinante humana en presencia
o ausencia de 10 \mul de medio condicionante de células
transfectadas control o de células transfectadas con la secuencia
del IL-11R humano soluble. Tras cuarenta horas las
células marcaron en pulsos con ^{3}H-timidina (0,5
\muCi/pocillo) durante ocho horas y se determinó el nucleótido
incorporado. Como se muestra en la figura 2, las células
BAF130-9 no proliferan en respuesta a la
IL-11 o el IL-11R soluble solos,
pero proliferan en presencia de ambos IL-11 y
IL-11R soluble.
Otras proteínas IL-11R humanas
pueden testarse en este modelo para determinar si muestran una
"actividad biológica" de IL-11R humano como se
ha definido aquí.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden utilizarse otros sistemas para determinar
si una proteína IL-11R humana específica muestra una
"actividad biológica" de IL-11R humano como se
ha definido aquí. A continuación se exponen ejemplos de tales
sistemas.
La capacidad de una proteína
IL-11R humana de unirse a IL-11 o a
un fragmento de la misma puede determinarse mediante cualquiera de
los ensayos adecuados que pueden detectar tal unión. algunos
ejemplos adecuados se muestran a continuación.
La unión de la a la región extracelular de la
proteína IL-11R humana causará específicamente una
rápida inducción de la fosfotirosina en la proteína receptor. Los
ensayos de la actividad de unión del ligando en base a la medida de
la inducción de la fosforilación se describen a continuación.
Alternativamente, se produce una proteína
IL-11R humana (como por ejemplo una forma soluble
del dominio extracelular) y se utiliza para detectar la unión de
IL-11.
Por ejemplo, se prepara una construcción de DNA
en la que el dominio extracelular (truncado previamente,
preferiblemente inmediatamente antes, del dominio transmembrana
previsto) se liga en el marco de lectura a un cDNA que codifica los
dominios bisagra C_{H}2 y C_{H}3 de una inmunoglobulina (Ig)
\gamma1 humana. Esta construcción se genera en un vector de
expresión adecuado para células COS, como el pED\DeltaC o pMT2. El
plásmido se transfectó de forma transitoria en las células COS. La
proteína de fusión IL-11R-Ig
secretada se recogió en el medio condicionante y se purificó
mediante una cromatografía de proteína A.
La proteína de fusión
IL-11R-Ig purificada
IL-11R-Ig se utiliza para demostrar
la unión de IL-11 en una serie de aplicaciones.
Puede utilizarse IL-11 para recubrir la superficie
de una placa de ensayo inmunosorbente acoplado a enzima (ELISA), y
entonces se bloquean los sitios de unión adicionales con albúmina
sérica bovina o caseína utilizando los tampones de ELISA estándar.
La proteína de fusión IL-11R-Ig se
une entonces a la IL-11 de la fase sólida, y la
unión se detecta con un secundario de cabra anti-Ig
humana conjugado con peroxidasa de rábano picante. La actividad del
enzima específicamente unido puede medirse con un sustrato
colorimétrico, como la tetrametilbenzidina y la lectura de la
absorbancia.
La IL-11 puede expresarse
también en la superficie de la células, por ejemplo aportando la
unión de un dominio transmembrana o glucosil fosfatidil inositol
(GPI). Las células que expresan la IL-11 unida a la
membrana pueden identificarse utilizando la proteína de fusión
IL-11R-Ig. La fusión
IL-11R-Ig soluble se une a la
superficie de estas células y se detecta con un anticuerpo de cabra
anti-Ig humana conjugado con un fluorocromo, como
el isotiocianato de fluoresceína y citometría de flujo.
Un método de selección genética en levaduras, la
"trampa de interacción" [Gyuris et al., Cell
75:791-803, 1993], puede utilizarse para determinar
si una proteína IL-11R humana tiene una actividad
biológica del IL-11R humano como se ha definido
aquí. En este sistema, la expresión de los genes marcador a partir
de LexAop-Leu2 y LexAop-LacZ
depende de la interacción entre la proteína cebo, por ejemplo en
este caso una especie que interacciona con el
IL-11R humano, y la presa, por ejemplo en este caso
una proteína IL-11R humana. Así, se puede medir la
fuerza de la interacción por el nivel de expresión de Leu2 o LacZ.
El método más simple es la medida de la actividad de la proteína
codificada por LacZ, la \beta-galactosidasa. Esta
actividad puede evaluarse por la intensidad de color azul en el
medio o filtro que contiene X-Gal. Para la medida
cuantitativa de la actividad \beta-galactosidasa,
pueden encontrarse ensayos estándar en "Methods in Yeast
Genetics", Cold Spring Harbor, New York, 1990 (por Rose, M.D.,
Winston, F. y
Hieter, P.).
Hieter, P.).
En tales métodos, si se desea determinar si la
proteína IL-11R humana interacciona con una especie
particular (como por ejemplo, una proteína citosólica que se une al
dominio intracelular del IL-11R humano in
vivo), puede utilizarse esa especie como un "cebo" en la
trampa de interacción con la proteína IL-11R humana
a testar actuando como "presa", o viceversa.
La transcripción de los genes de las proteínas
plasmáticas de fase aguda, como el gen del
\beta-fibrinógeno de rata, es activada por
IL-11 en una serie de líneas celulares. En un
sistema de ejemplo, se cotransfectan células COSM6 con plásmidos
que codifican la proteína IL-11R humana (como la del
IL-11R humano completo o una forma soluble del
mismo), el transductor de señal gp130 humano y un gen marcador que
contiene la región promotora de 350 pares de bases del gen del
\beta-fibrinógeno de rata fusionado a un gen
marcador, CAT (Baumann et al., (1991) J. Biol. Chem. 266,
20424-27). Las células se estimulan con
concentraciones crecientes de IL-11 recombinante
humana y se monitoriza la transcripción del gen marcador mediante un
ensayo para la presencia de actividad CAT.
La actividad también puede determinarse
examinando la capacidad de IL-11 de inducir la
fosforilación de tirosinas de la gp130 en células transfectadas con
una secuencia que codifica la proteína IL-11R humana
(como la del IL-11R humano completo o una forma
soluble del mismo) (Luttcken et al. (1994) Science 263,
89-92).
La actividad también puede determinarse
examinando la capacidad de IL-11 de inducir la
fosforilación de tirosinas de las STAT (transductores de señal y
activadores de la transcripción, una familia de proteínas de unión
al DNA) en células transfectadas con una secuencia que codifica la
proteína IL-11R humana (como la del
IL-11R humano completo o una forma soluble del
mismo) (Zhong et al., (1994) Science 264,
95-98).
La actividad también puede determinarse
examinando la capacidad de IL-11 de inducir la
fosforilación de tirosinas de las quinasa JAK en células
transfectadas con una secuencia que codifica la proteína
IL-11R humana (como la del IL-11R
humano completo o una forma soluble del mismo) (Yin et al.,
(1993) J. Immunol. 151:2555-61).
Todas las referencias a patentes y literatura
citadas aquí se incorporan como referencia como si se expusieran
completas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Tobin, James
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: RECEPTOR DE LA INTERLEUQUINA-11 HUMANA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Genetics Institute, inC.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 87, CambridgePark Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Cambridge
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 02140
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA DEL COMPUTADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (O)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE DEPÓSITO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Brown, Scott A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32.724
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/SUMARIO: GI5252
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (617) 498-8224
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (617) 876-5851
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID de SEC Nº:1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2456 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 734 .. 1999
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº:1:
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID de SEC Nº:2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 422 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID de SEC Nº:3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1714 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 34 .. 1359
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº:3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID de SEC Nº:4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 441 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (1)
1. La utilización de una proteína que consiste
en una secuencia aminoacídica seleccionada de entre el grupo que
consiste en:
- (a)
- la secuencia aminoacídica del ID de SEC Nº:2;
- (b)
- la secuencia aminoacídica del ID de SEC Nº:2 de los aminoácidos 24 a 422;
o producida por una célula huésped
transformada con una secuencia nucleotídica que codifica dicha
proteína, y un transportador farmacéuticamente aceptable, para la
preparación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir
la pérdida de masa ósea en un sujeto
mamífero.
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