ES2359297T3 - Activador del receptor de nf-kappa b, el receptor es miembro de la superfamilia del receptor tnf. - Google Patents

Abstract

RECEPTORES AISLADOS, ADNS QUE CODIFICAN ESTOS RECEPTORES Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS PREPARADAS A PARTIR DE ESTOS RECEPTORES. SE PUEDEN UTILIZAR ESTOS RECEPTORES AISLADOS PARA REGULAR UNA REACCION INMUNE. ESTOS RECEPTORES SIRVEN TAMBIEN PARA BUSCAR SUS INHIBIDORES MEDIANTE CRIBADO.

Description

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere, en general, al campo de los receptores de citocinas y, más específicamente, a pares de receptor de citocinas/ligando que tienen actividad inmunorreguladora.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] El funcionamiento eficaz del sistema inmune requiere un buen equilibrio entre la proliferación y diferenciación celular y la muerte celular, para asegurar que el sistema inmune es capaz de reaccionar con antígenos extraños pero no con autoantígenos. Son esenciales para el procedimiento de regulación de la respuesta inmune e inflamatoria diversos miembros de la superfamilia del Receptor del Factor de Necrosis Tumoral (TNF)/Receptor del Factor de Crecimiento Nervioso (Smith et al., Science 248: 1019; 1990). Esta familia de receptores incluye dos receptores de TNF diferentes (Tipo I y Tipo II; Smith et al., mencionado anteriormente; y Schall et al., Cell 61: 361, 1990), receptor del factor de crecimiento nervioso (Johnson et al., Cell 47:545, 1986), antígeno CD40 de células B (Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989), CD27 (Camerini et al., J. Immunol. 147: 3165, 1991), CD30 (Durkop et al., Cell 68: 421, 1992), antígeno OX40 de células T (Mallett et al., EMBO J. 9: 1063, 1990), antígeno Fas humano (Itoh et al., Cell 66: 233, 1991), receptor 4-1BB murino (Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1963, 1989) y un receptor denominado Receptor de Inducción de Apoptosis (AIR; documento USSN 08/720.864, presentado el 4 de octubre de 1996).

[0003] CD40 es un receptor presente en los linfocitos B, células epiteliales y algunas líneas celulares de carcinoma, que interacciona con un ligando que se encuentra en células T activadas, CD40L (documento USSN 08/249.189, presentado el 24 de mayo de 1994). La interacción de este par de ligando/receptor es esencial para la respuesta inmune tanto celular como humoral. La transducción de señales a través de CD40 está mediada por la asociación del dominio citoplásmico de esta molécula con miembros de los factores asociados al receptor de TNF (TRAFs; Baker y Reddy, Oncogene 12: 1, 1996). Recientemente se ha descubierto que ratones que son defectuosos en la expresión de TRAF3 debido a una alteración dirigida en el gen que codifica TRAF3, parecen normales en el nacimiento, pero desarrollan hipoglucemia progresiva y reducción de glóbulos blancos periféricos, y mueren aproximadamente a los diez días de edad (Xu et al., Immunity 5: 407, 1996). Las respuestas inmunes de ratones quiméricos reconstituidos con células de hígado fetal TRAF3-/- se parecen a las de los ratones deficientes en CD40, aunque las células B TRAF3-/- parecen ser funcionalmente normales.

[0004] El papel crítico de TRAF3 en la transducción de señales puede estar en su interacción con uno de los otros miembros de la superfamilia de receptores de TNF, por ejemplo, CD30 o CD27, que están presentes en células T. Como alternativa, puede haber otros miembros, aunque aún no identificados, de esta familia de receptores que interaccionan con TRAF3 y juegan un papel importante en el desarrollo postnatal así como en el desarrollo de un sistema inmune competente. La identificación de miembros adicionales de la superfamilia de receptores de TNF proporcionaría un medio adicional para regular la respuesta inmune e inflamatoria, y además podría proporcionar una perspectiva adicional del desarrollo postnatal en mamíferos.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCION

[0005] La presente invención proporciona un nuevo receptor, denominado RANK (activador del receptor de NF-B, por sus siglas en inglés), que es un miembro de la superfamilia del receptor de TNF. RANK es una proteína transmembrana de Tipo I que tiene 616 restos aminoacídicos, que interacciona con TRAF3. La inducción de RANK por sobre-expresión, co-expresión de RANK y ligando de RANK unido a la membrana (RANKL), y por la adición de RANKL soluble o anticuerpos agonistas a RANK, tiene como resultado la regulación positiva del factor de transcripción NF-B, un factor de transcripción ubicuo que se utiliza mucho en células del sistema inmune.

[0006] Pueden prepararse formas solubles del receptor y usarse para interferir con la transducción de señales a través de RANK unido a la membrana, y por lo tanto la regulación positiva de NF-B; por consiguiente, también se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden formas solubles del nuevo receptor. La inhibición de NF-B por antagonistas de RANK puede ser útil para mejorar los efectos negativos de una respuesta inflamatoria que resulta de la inducción de RANK, por ejemplo en el tratamiento del choque tóxico o septicemia, reacciones de injerto contra hospedador o reacciones inflamatorias agudas. Las formas solubles del receptor también serán útiles in vitro para seleccionar agonistas o antagonistas de la actividad de RANK.

[0007] El dominio citoplásmico de RANK será útil para desarrollar ensayos para inhibidores de la transducción de señales, por ejemplo, para seleccionar moléculas que inhiban la interacción de RANK con TRAF2 o TRAF3. También se describen formas delecionadas y proteínas de fusión que comprenden el nuevo receptor.

[0008] La presente invención también identifica una contraestructura, o ligando, para RANK, denominada RANKL. RANKL es una proteína transmembrana de Tipo 2 con un dominio intracelular de menos de aproximadamente 50 aminoácidos, un domino transmembrana y un domino extracelular de aproximadamente 240 a 250 aminoácidos. De forma similar a otros miembros de la familia del TNF a la que pertenece, RANKL tiene una región “espaciadora” entre el dominio transmembrana y el domino de unión al receptor que no es necesaria para la unión al receptor. Por consiguiente, las formas solubles de RANKL pueden comprender el domino extracelular entero o fragmentos del mismo que incluyen la región de unión al receptor.

[0009] Estos y otros aspectos de la presente invención se harán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0010] La Figura 1 demuestra la influencia de RANK.Fc y hRANKL sobre el crecimiento de células T activadas. Se cultivaron células T de sangre periférica humana como se describe en el Ejemplo 12; la recuperación de las células T viables se determinó por recuentos por triplicado con azul tripan.

La Figura 2 ilustra la capacidad de RANKL de inducir la formación de agrupamientos de DC humanas. Se generaron células dendríticas (DC) funcionalmente maduras in vitro a partir de progenitores de médula ósea (BM) CD34+ y se cultivaron como se describe en el Ejemplo 13. Se cultivaron DC CD1a+ en un cóctel de citocinas solo (Figura 2A), en cóctel más CD40L (Figura 2B), RANKL (Figura 2C) o RANKL inactivado con calor (H) (Figura 2D), y después se fotografiaron usando un microscopio de inversión.

La Figura 3 demuestra que RANKL potencia la capacidad alo-estimuladora de DC. Se incubaron células T alogénicas con números variables de DC irradiadas cultivadas como se describe en el Ejemplo 13. Los cultivos se sometieron a pulsos con [3H]-timidina y las células se recogieron en láminas de fibra de vidrio para el recuento. Los valores representan la media  desviación típica (SD) de cultivos por triplicado.

La Figura 4 presenta un alineamiento de RANK humano con otros miembros de la familia del TNFR en la región de seudo-repeticiones ricas en cisteína extracelulares conservadas estructuralmente. Se indican los enlaces disulfuro previstos (DS1-DS3). RANK y CD40 contienen sustituciones de aminoácidos idénticas (C^H, C^G) que eliminan DS2 en la segunda seudo-repetición.

La Figura 5 representa un alineamiento de RANKL humano con otros miembros de la familia del TNF.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0011] Se identificó un nuevo inserto de ADNc parcial con una fase de lectura abierta prevista que tenía alguna similitud con CD40 en una base de datos que contenía información de secuencia de ADNc generados a partir de células dendríticas (DC) derivadas de médula ósea humana. El inserto se usó para hibridar con manchas de transferencia de colonias generadas a partir de una biblioteca de ADNc de DC que contenía ADNc de longitud completa. Se realizaron varias hibridaciones de colonias y se aislaron dos clones (SEC ID Nº: 1 y 3). La SEC ID Nº: 5 muestra la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de una proteína de longitud completa prevista basándose en el alineamiento de las secuencias solapantes de las SEC ID Nº: 1 y 3.

[0012] RANK es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF; se parece mucho a CD40 en la región extracelular. De forma similar a CD40, RANK se asocia con TRAF2 y TRAF3 (como se determina por ensayos de coinmunoprecipitación sustancialmente como se describe por Rothe et al., Cell 83: 1243, 1995). Los TRAF son críticamente importantes en la regulación de la respuesta inmune e inflamatoria. Mediante su asociación con diversos miembros de la superfamilia de receptores de TNF, una señal se transduce a una célula. Esta señal da como resultado la proliferación, diferenciación o apoptosis de la célula, dependiendo del receptor que se induzca y del TRAF que se asocie con el receptor o receptores; pueden transducirse diferentes señales a una célula mediante la coordinación de diversos acontecimientos de señalización. De esta manera, una señal transducida a través de un miembro de esta familia puede ser proliferativa, de diferenciación o apoptótica, dependiendo de otras señales que se transducen a la célula, y/o del estado de diferenciación de la célula. Esta exquisita regulación de esta ruta proliferativa/apoptótica es necesaria para desarrollar y mantener protección contra patógenos; los desequilibrios pueden dar como resultado una enfermedad autoinmune.

[0013] RANK se expresa en células epiteliales, algunas líneas de células B y en células T activadas. Sin embargo, su expresión en células T activadas es tardía, aproximadamente cuatro días después de la activación. Este transcurso de tiempo de la expresión coincide con la expresión de Fas, un agente conocido de apoptosis. RANK puede actuar como una señal anti-apoptótica, rescatando a las células que expresan RANK de la apoptosis como se sabe que hace CD40. Como alternativa, RANK puede confirmar una señal apoptótica en las circunstancias apropiadas, de nuevo de forma similar a CD40. RANK y su ligando probablemente juegan un papel esencial en la regulación de la respuesta inmune e inflamatoria.

[0014] Además, la letalidad postnatal de ratones que tienen una alteración dirigida del gen TRAF3 demuestra la importancia de esta molécula no sólo en la respuesta inmune, sino también en el desarrollo. El aislamiento de RANK, como una proteína que se asocia con TRAF3, y de su ligando permitirá una definición adicional de esta ruta de señalización y el desarrollo de modalidades de diagnóstico y terapéuticas para uso en el área de enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias.

ADN, Proteínas y Análogos

[0015] La presente invención proporciona polipéptidos de RANK humano aislados y análogos (o muteínas) de los mismos que tienen una actividad mostrada por la molécula nativa (es decir, muteínas de RANK que se unen específicamente a un ligando de RANK expresado en células o inmovilizado en una superficie o a anticuerpos específicos para RANK; formas solubles de los mismos que inhiben la señalización inducida por el ligando de RANK a través de RANK). Dichas proteínas carecen sustancialmente de materiales endógenos contaminantes y, opcionalmente, no tienen glicosilación de patrón nativo asociada. Los derivados de RANK dentro del alcance de la invención también incluyen diversas formas estructurales de las proteínas primarias que retienen actividad biológica. Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, una proteína RANK puede estar en forma de sales ácidas o básicas, o puede estar en forma neutra. También pueden modificarse restos aminoacídicos individuales por oxidación o reducción. La estructura primaria del aminoácido puede modificarse formando conjugados covalentes o agregativos con otros restos químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares, o creando mutantes de la secuencia de aminoácidos. Los derivados covalentes se preparan uniendo grupos funcionales particulares a cadenas laterales de aminoácidos o al extremo N o C.

[0016] También pueden obtenerse derivados de RANK por la acción de agentes de entrecruzamiento tales como éster de M-maleimidobenzoil succinimida y N-hidroxisuccinimida, en los restos de cisteína y lisina. Las proteínas de la invención también pueden unirse covalentemente a través de grupos laterales reactivos a diversos sustratos insolubles, tales como estructuras de agarosa activadas con bromuro de cianógeno, activadas con bisoxirano, activadas con carbonildiimidazol o activadas con tosilo, o por adsorción en superficies de poliolefina (con o sin entrecruzamiento con glutaraldehído). Una vez unidas a un sustrato, las proteínas pueden usarse para unirse selectivamente (con fines de ensayo o purificación) a anticuerpos inducidos contra las proteínas o contra otras proteínas que son similares a RANK o RANKL, así como otras proteínas que se unen a RANK o RANKL u homólogos de las mismas.

[0017] También están dentro del alcance de la invención formas solubles de RANK. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos prevista de RANK se muestran en las SEC ID Nº 1 a 6. El análisis informático indicó que la proteína tiene un péptido señal N-terminal; el sitio de escisión previsto sigue al resto 24. Los expertos en la materia reconocerán que el sitio de escisión real puede ser diferente del previsto por análisis informático. De esta manera, es de esperar que el aminoácido N-terminal del péptido escindido esté dentro de aproximadamente los cinco aminoácidos de cualquier lado del sitio de escisión previsto preferido después del resto 24. Además, se preparó una forma soluble que empezaba con el aminoácido 33; esta forma soluble se unía a RANKL. El péptido señal, según se predice, va seguido de un dominio extracelular de 188 aminoácidos, un dominio transmembrana de 21 aminoácidos y una cola citoplásmica de 383 aminoácidos.

[0018] RANK soluble comprende el péptido señal y el dominio extracelular (restos 1 a 213 de la SEC ID Nº: 6) o un fragmento del mismo. Como alternativa, el líder nativo puede sustituirse por un péptido señal diferente, empezando con el resto 1 y continuando hasta un resto seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 24 a 33 (inclusive) de la SEC ID Nº: 6. Además, los fragmentos del dominio extracelular también proporcionarán formas solubles de RANK. Pueden prepararse fragmentos usando técnicas conocidas para aislar una parte deseada de la región extracelular, y pueden prepararse, por ejemplo, comparando la región extracelular con las de otros miembros de la familia de TNFR y seleccionando formas similares a las preparadas para otros miembros de la familia. Como alternativa, pueden usarse sitios de restricción únicos o técnicas de PCR que se conocen en este campo para preparar numerosas formas truncadas que pueden expresarse y analizarse con respecto a la actividad.

[0019] Pueden prepararse fragmentos usando técnicas conocidas para aislar una parte deseada de la región extracelular, y pueden prepararse, por ejemplo, comparando la región extracelular con las de otros miembros de la familia de TNFR (de la que RANK es un miembro) y seleccionando formas similares a las preparadas para otros miembros de la familia. Como alternativa, pueden usarse sitios de restricción únicos o técnicas de PCR que se conocen en este campo para preparar numerosas formas truncadas que pueden expresarse y analizarse con respecto a la actividad.

[0020] Otros derivados de las proteínas RANK dentro del alcance de esta invención incluyen conjugados covalentes o agregativos de las proteínas o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tales como los obtenidos por síntesis en cultivo recombinante como fusiones N-terminales o C terminales. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser una secuencia de polipéptido señal (o líder) en la región N-terminal de la proteína, que dirige de forma cotraduccional o postraduccional la transferencia de la proteína desde su sitio de síntesis a su sitio de función dentro o fuera de la membrana o pared celular (por ejemplo, el líder del factor  de levadura).

[0021] Las fusiones de proteínas pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación de proteínas RANK y homólogos (por ejemplo poli-His). La secuencia de aminoácidos de las proteínas de la invención también puede unirse a un péptido de identificación tal como el descrito por Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204 (1988). Dicho péptido altamente antigénico proporciona un epítopo unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico, que permite un rápido ensayo y una purificación fácil de la proteína recombinante expresada. La secuencia de Hopp et al. también se escinde específicamente por la enteroquinasa de la mucosa bovina, permitiendo la separación del péptido de la proteína purificada. Las proteínas de fusión protegidas con dichos péptidos también pueden ser resistentes a la degradación intracelular en E. coli.

[0022] Las proteínas de fusión comprenden además la secuencia de aminoácidos de un RANK unido a una región Fc de inmunoglobulina. Una región Fc ejemplar es una IgG1 humana que tiene una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 8. También pueden usarse fragmentos de una región Fc, así como muteínas de Fc. Por ejemplo, ciertos restos dentro de la región de bisagra de una región Fc son críticos para la unión de alta afinidad a FcRI. Canfield y Morrison (J. Exp. Med. 173:1483; 1991) notificaron que la Leu(234) y la Leu(235) eran críticas para la unión de alta afinidad de IgG3 a FcRI presente en células U937. Se obtuvieron resultados similares por Lund et al. (J. Immunol. 147: 2657, 1991; Molecular Immunol. 29:53, 1991). Estas mutaciones, solas o en combinación, pueden realizarse en una región Fc de IgG1 para reducir la afinidad de IgG1 por FcR. Dependiendo de la parte de la región Fc usada, una proteína de fusión puede expresarse como un dímero, mediante la formación de enlaces disulfuro intercatenarios. Si las proteínas de fusión se realizan con cadenas tanto pesadas como ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero de proteína con hasta cuatro regiones RANK.

[0023] En otra realización, las proteínas RANK comprenden además un péptido de oligomerización tal como un domino de cremallera de leucina. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas de unión al ADN (Landschulz et al., Science 240: 1759, 1988). El domino de cremallera de leucina es un término usado para hacer referencia a un dominio de péptido conservado presente en estas (y otras) proteínas, que es responsable de la dimerización de las proteínas. El domino de cremallera de leucina (también denominado en el presente documento dominio de oligomerización o de formación de oligómeros) comprende una héptada repetitiva, con cuatro o cinco restos de leucina intercalados con otros aminoácidos. Son ejemplos de dominios de cremallera de leucina los encontrados en el factor de transcripción de levadura GCN4 y en una proteína de unión al ADN termoestable encontrada en hígado de rata (C/EBP; Landschulz et al., Science 243: 1681, 1989). Dos proteínas de transformación nuclear, fos y jun, también presentan dominios de cremallera de leucina, así como el producto génico del proto-oncogén murino c-myc (Landschulz et al., Science 240: 1759, 1988). Los productos de los oncogenes nucleares fos y jun comprenden dominios de cremallera de leucina preferentemente de un heterodímero (O’Shea et al., Science 245:646, 1989; Turner y Tjian, Science 243:1689, 1989). El dominio de cremallera de leucina es necesario para la actividad biológica (unión al ADN) de estas proteínas.

[0024] Las proteínas fusogénicas de varios virus diferentes, incluyendo paramixovirus, coronavirus, virus del sarampión y muchos retrovirus, también poseen dominios de cremallera de leucina (Buckland y Wild, Nature 338: 547,1989; Britton, Nature 353: 394, 1991; Delwart y Mosialos, AIDS Research and Human Retroviruses 6:703, 1990). Los dominios de cremallera de leucina en estas proteínas virales fusogénicas están cerca de la región transmembrana de las proteínas; se ha sugerido que los dominios de cremallera de leucina podrían contribuir a la estructura oligomérica de las proteínas fusogénicas. La oligomerización de proteínas virales fusogénicas está implicada en la formación de poros de fusión (Spruce et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 3523, 1991). Recientemente también se ha notificado que los dominios de cremallera de leucina juegan un papel en la oligomerización de factores de transcripción del golpe de calor (Rabindran et al., Science 259: 230, 1993).

[0025] Los dominios de cremallera de leucina se pliegan como empaquetamientos de hélices alfa paralelos cortos (O'Shea et al., Science 254: 539; 1991). La arquitectura general del empaquetamiento de hélices alfa paralelo está bien caracterizada, con un empaquetamiento de “botón en ojal" ("knobs-into-holes") como se propuso por Crick en 1953 (Acta Crystallogr. 6: 689). El dímero formado por un dominio de cremallera de leucina se estabiliza por la héptada repetida, denominada (abcdefg)n de acuerdo con la notación de McLachlan y Stewart (J. Mol. Biol. 98: 293; 1975), en la que los restos a y d son generalmente restos hidrófobos, siendo d una leucina, que están alineados en la misma cara de una hélice. Los restos cargados de forma opuesta comúnmente aparecen en las posiciones g y e. De esta manera, en un empaquetamiento de hélices alfa paralelo formado a partir de dos dominios de cremallera de leucina helicoidales, los “botones” formados por las cadenas laterales hidrófobas de la primera hélice se empaquetan en los “ojales” formados entra las cadenas laterales de la segunda hélice.

[0026] Los restos de leucina en la posición d aportan grandes energías de estabilización hidrófoba y son importantes para la formación de dímeros (Krystek et al., Int. J. Peptide Res. 38: 229, 1991). Lovejoy et al. notificaron recientemente la síntesis de un haz -helicoidal de triple cadena en el que las hélices van arriba-arriba-abajo (Science 259: 1288, 1993). Sus estudios confirmaron que la energía de estabilización hidrófoba proporciona la fuerza motriz principal para la formación de empaquetamientos de hélices alfa a partir de monómeros helicoidales. Estos estudios también indican que las interacciones electrostáticas contribuyen a la estequiometría y geometría de los empaquetamientos de hélices alfa.

[0027] Varios estudios han indicado que restos de leucina individuales pueden sustituirse por aminoácidos conservativos con una reducción mínima en la capacidad de dimerizar; sin embargo, múltiples cambios normalmente dan como resultado una pérdida de esta capacidad (Landschulz et al., Science 243:1681, 1989; Turner y Tjian, Science 243:1689, 1989; Hu et al., Science 250:1400, 1990). Van Heekeren et al. notificaron que varios aminoácidos diferentes pueden sustituir a los restos de leucina en el dominio de cremallera de leucina de GCN4, y además descubrieron que algunas proteínas GCN4 que contenían dos sustituciones de leucina eran débilmente activas (Nucl. Acids Res. 20:3721, 1992). La mutación de la primera y la segunda leucinas heptádicas del dominio de cremallera de leucina de la proteína de fusión del virus del sarampión (MVF) no afectó a la formación del sincitio (una medida de la fusión celular inducida viralmente); sin embargo, la mutación de los cuatro restos de leucina impidió totalmente la fusión (Buckland et al., J. Gen. Virol. 73:1703 1992). Ninguna de las mutaciones afectó a la capacidad de MVF de formar un tetrámero.

[0028] Se ha descubierto que las sustituciones de aminoácidos en los restos a y d de un péptido sintético que representa el dominio de cremallera de leucina de GCN4 cambia las propiedades se oligomerización del dominio de cremallera de leucina (Alber, Sixth Symposium of the Protein Society, San Diego CA). Cuando todos los restos en la posición a se cambian por isoleucina, la cremallera de leucina sigue formando un dímero paralelo. Cuando, además de este cambio, todos los restos de leucina en la posición d también se cambian por isoleucina, el péptido resultante forma espontáneamente un empaquetamiento de hélices alfa paralelo trimérico en solución. La sustitución de todos los aminoácidos en la posición d con isoleucina y en la posición a con leucina da como resultado un péptido que tetrameriza. Los péptidos que contienen estas sustituciones aún se denominan dominios de cremallera de leucina.

[0029] También se incluyen dentro del alcance de la invención fragmentos o derivados del dominio intracelular de RANK. Dichos fragmentos se preparan por cualquiera de las técnicas mencionadas en el presente documento e incluyen péptidos que son idénticos al dominio citoplásmico de RANK como se muestra en la SEC ID Nº: 6, y los que comprenden una parte de la región citoplásmica. Todas las técnicas usadas en la preparación de formas solubles también pueden usarse en la preparación de fragmentos o análogos del dominio citoplásmico (es decir, técnicas RTPCR o uso de enzimas de restricción seleccionadas para preparar truncamientos). Los ADN que codifican todo o un fragmento del dominio intracitoplásmico serán útiles para identificar otras proteínas que están asociadas con la señalización de RANK, por ejemplo, usando las técnicas de inmunoprecipitación descritas en el presente documento u otra técnica tal como un sistema doble híbrido de levadura (Rothe et al., mencionado anteriormente).

[0030] La presente invención también incluye RANK con o sin glicosilación de patrón nativo asociada. Las proteínas expresadas en sistemas de expresión de levadura o mamífero, por ejemplo, células COS-7, pueden ser similares o ligeramente diferentes en peso molecular y patrón de glicosilación que las moléculas nativas, dependiendo del sistema de expresión. La expresión de ADN que codifican las proteínas de la invención en bacterias tales como E. coli proporciona moléculas no glicosiladas. Pueden producirse análogos de mutantes funcionales de la proteína RANK que tienen sitios de N-glicosilación inactivados por síntesis y ligamiento de oligonucleótidos o por técnicas de mutagénesis con especificidad de sitio. Estas proteínas análogas pueden producirse en una forma homogénea de carbohidratos reducidos con un buen rendimiento usando sistemas de expresión de levadura. Los sitios de N-glicosilación en las proteínas eucariotas se caracterizan por el triplete de aminoácidos Asn-A1-Z, donde A1 es cualquier aminoácido excepto Pro y Z es Ser o Thr. En esta secuencia, la asparagina proporciona un grupo amino de cadena lateral para la unión covalente de un carbohidrato. Dicho sitio puede eliminarse por la sustitución de Asn o el resto Z por otro aminoácido, la deleción de Asn o Z, o la inserción de un aminoácido que no sea Z entre A1 y Z, o un aminoácido distinto de Asn entre Asn y A1.

[0031] También pueden obtenerse derivados de proteína RANK por mutaciones de la proteína RANK nativa o subunidades de la misma. Una proteína RANK mutada, como se menciona en el presente documento, es un polipéptido homólogo a una proteína RANK nativa, respectivamente, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente a la de la proteína nativa debido a una o una pluralidad de deleciones, inserciones o sustituciones. El efecto de cualquier mutación realizada en un ADN que codifica un péptido mutado puede determinarse fácilmente analizando la capacidad del péptido mutado de unirse a su contraestructura de una manera específica. Además, la actividad de análogos, muteínas o derivados de RANK puede determinarse por cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento (por ejemplo, inhibición de la capacidad de RANK de activar la transcripción).

[0032] Pueden construirse análogos de las proteínas de la invención, por ejemplo, realizando diversas sustituciones de restos o secuencias o delecionando restos terminales o internos o secuencias que no se necesitan para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden delecionarse restos de cisteína o reemplazarse con otros aminoácidos para prevenir la formación de enlaces disulfuro intramoleculares incorrectos después de la renaturalización. Otros enfoques para la mutagénesis implican la modificación de restos aminoacídicos dibásicos adyacentes para aumentar la expresión en sistemas de levadura en los que está presente la actividad proteasa de KEX2.

[0033] Cuando se adopta una estrategia de deleción o inserción, debe considerarse el efecto potencial de la deleción

o inserción sobre la actividad biológica. Pueden construirse subunidades de las proteínas de la invención por deleción de restos o secuencias terminales o internas. Pueden prepararse fácilmente formas solubles de RANK y ensayarse con respecto a su capacidad de inhibir la activación de NF-B inducida por RANK. Pueden prepararse polipéptidos correspondientes a las regiones citoplásmicas y fragmentos de los mismos (por ejemplo, un dominio de muerte) por técnicas similares. Se proporcionan pautas adicionales en cuanto a los tipos de mutaciones que pueden realizarse por una comparación de la secuencia de RANK con proteínas que tienen estructuras similares, así como realizando un análisis estructural de las proteínas RANK de la invención.

[0034] En general, las sustituciones deben realizarse conservativamente; es decir, los aminoácidos sustitutos más preferidos son los que no afectan a la actividad biológica de RANK (es decir, a la capacidad de las proteínas de la invención de unirse a anticuerpos contra la proteína nativa correspondiente de una manera sustancialmente equivalente, la capacidad de unirse a la contraestuctura sustancialmente de la misma manera que la proteína nativa, la capacidad de transducir una señal de RANK, o la capacidad de inducir la activación de NF-B tras la sobreexpresión en sistemas de transfección transitorios, por ejemplo). Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de aminoácidos fuera del dominio o dominios de unión (ligando/receptor o áreas de unión a anticuerpo para el dominio extracelular, o regiones que interaccionan con otras proteínas intracelulares para el dominio citoplásmico), y sustitución de aminoácidos que no alteran la estructura secundaria y/o terciaria de la proteína nativa. Otros ejemplos adicionales incluyen la sustitución de un resto alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala entre sí, o sustituciones de un resto polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Son bien conocidas otras de estas sustituciones conservativas, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobia similares.

[0035] Por supuesto, las mutaciones en las secuencias de nucleótidos construidas para la expresión de proteínas análogas o fragmentos de las mismas deben conservar la fase de lectura de las secuencias codificantes y, preferentemente, no crearán regiones complementarias que puedan hibridar para producir estructuras de ARNm secundarias tales como bucles u horquillas que afectarían de forma adversa a la traducción del ARNm.

[0036] No todas las mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína RANK o fragmentos de la misma se expresarán en el producto final, por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de nucleótidos para mejorar la expresión, principalmente para evitar bucles de estructura secundaria en el ARNm transcrito (véase el documento EPA 75.444A), o para proporcionar codones que se traducen más fácilmente por el hospedador seleccionado, por ejemplo, los codones de preferencia de E. coli bien conocidos para la expresión en E. coli.

[0037] Aunque un sitio de mutación puede estar predeterminado, no es necesario que esté predeterminada la naturaleza de la mutación per se. Por ejemplo, para seleccionar características óptimas de mutantes, puede realizarse mutagénesis aleatoria y puede seleccionarse la actividad deseada de las proteínas mutadas expresadas. Pueden introducirse mutaciones en loci particulares por síntesis de oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten el ligamiento a fragmentos de la secuencia nativa. Después del ligamiento, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácidos deseada.

[0038] Como alternativa, pueden emplearse procedimientos de mutagénesis con especificidad de sitio dirigidos a oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado que tenga codones particulares de acuerdo con la sustitución, deleción o inserción necesaria. Se describen métodos ejemplares para realizar las alteraciones expuestas anteriormente por Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, Enero de 1985, 12-19); Smith el al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); y las Patentes de Estados Unidos Nº

4.518.584 y 4.737.462 describen técnicas adecuadas.

[0039] Otras realizaciones de las proteínas de la invención incluyen polipéptidos RANK codificados por ADN capaces de hibridar con el ADN de la SEC ID Nº: 5 en condiciones moderadamente rigurosas (solución de prelavado de SSC 5 X, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0)) y en condiciones de hibridación de 50ºC, SSC 5 X, durante una noche, con las secuencias de ADN que codifican RANK, o más preferentemente en condiciones rigurosas (por ejemplo, hibridación en SSC 6 X a 63ºC durante una noche; lavado en SSC 3 X a 55ºC) y con otras secuencias que están degeneradas con respecto a las que codifican la proteína RANK. En una realización, los polipéptidos RANK tienen una identidad de al menos aproximadamente un 70% en la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la proteína RANK nativa expuesta en la SEC ID Nº: 6. En una realización preferida, los polipéptidos RANK tienen una identidad de al menos aproximadamente un 80% en la secuencia de aminoácidos con respecto a la forma nativa de RANK; los polipéptidos más preferidos son los que tienen una identidad de al menos aproximadamente un 90% con RANK nativa.

[0040] El porcentaje de identidad puede determinarse usando un programa informático, por ejemplo, el programa informático GAP descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible en la University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Para fragmentos derivados de la proteína RANK, la identidad se calcula basándose en la porción de la proteína RANK que está presente en el fragmento.

[0041] La actividad biológica de análogos o muteínas de RANK puede determinarse ensayando la capacidad de los análogos o muteínas de inhibir la activación de la transcripción, por ejemplo, como se describe en los ejemplos del presente documento. Como alternativa, pueden usarse ensayos adecuados, por ejemplo un inmunoensayo enzimático o una transferencia puntual (dot blot) empleando un anticuerpo que se une a RANK nativo, o a una forma soluble de RANKL, para evaluar la actividad de análogos o muteínas de RANK, así como ensayos que emplean células que expresan RANKL. Los ensayos adecuados también incluyen, por ejemplo, ensayos de transducción de señales y métodos que evalúan la capacidad de la región citoplásmica de RANK de asociarse con otras proteínas intracelulares (es decir, TRAF 2 y 3) implicadas en la transducción de señales y también serán útiles para evaluar la actividad de análogos o muteínas de RANK. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica.

[0042] También son útiles fragmentos de las secuencias de nucleótidos de RANK. En una realización, dichos fragmentos comprenden al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferentemente al menos aproximadamente 25 nucleótidos, más preferentemente al menos 30 nucleótidos consecutivos, del ADN de RANK descrito en el presente documento. En el presente documento se proporcionan complementos de ADN y ARN de dichos fragmentos, junto con formas tanto monocatenarias como bicatenarias del ADN de RANK de la SEC ID Nº: 5, y los que codifican los polipéptidos mencionados anteriormente. Un fragmento de ADN de RANK generalmente comprende al menos aproximadamente 17 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 17 a aproximadamente 30 nucleótidos. Dichos fragmentos de ácido nucleico (por ejemplo, una sonda que corresponde al dominio extracelular de RANK) se usan como sonda o como cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

[0043] Las sondas también encuentran uso en la detección de la presencia de ácidos nucleicos de RANK en ensayos in vitro y en procedimientos tales como transferencias de Northern y Southern. También pueden identificarse tipos celulares que expresan RANK. Dichos procedimientos son bien conocidos y el experto en la materia puede elegir una sonda de longitud adecuada, dependiendo de la aplicación particular deseada. Para PCR, se emplean cebadores 5’ y 3’ correspondientes al extremo de una secuencia de ADN de RANK deseada para amplificar esa secuencia, usando técnicas convencionales.

[0044] Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de RANK son oligonucleótidos antisentido o con sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico monocatenaria (ARN o ADN) capaz de unirse a secuencias diana de ARNm de RANK (con sentido) o ADN de RANK (antisentido). La capacidad de crear un oligonucleótido antisentido o con sentido basándose en una secuencia de ADNc para una proteína dada se describe, por ejemplo, en Stein y Cohen, Cancer Res. 48: 2659, 1988 y van der Krol et al., BioTechniques 6: 958, 1988.

Usos de ADN, Proteínas y Análogos

[0045] Los ADN, proteínas y análogos de RANK descritos en el presente documento tendrán numerosos usos, incluyendo la preparación de composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, las formas solubles de RANK serán útiles como antagonistas de la activación de NF-B mediada por RANK, así como para inhibir la transducción de una señal a través de RANK. Las composiciones de RANK (tanto proteínas como ADN) también serán útiles en el desarrollo de anticuerpos tanto agonistas como antagonistas contra RANK. Los ADN de la invención son útiles para la expresión de proteínas recombinantes y como sondas para el análisis (cuantitativo o cualitativo) de la presencia o distribución de transcritos de RANK.

[0046] Las proteínas de la invención también serán útiles en la preparación de kits que se usan para detectar RANK soluble o RANKL, o supervisar la actividad relacionada con RANK, por ejemplo, en muestras de pacientes. Las proteínas RANK también encontrarán utilidad en el control de la actividad relacionada con RANK en otras muestras o composiciones, como es necesario cuando se seleccionan antagonistas o miméticos de esta actividad (por ejemplo, péptidos o moléculas pequeñas que inhiben o imitan, respectivamente, la interacción). En dichos kits son útiles una diversidad de formatos de ensayo incluyendo (pero sin limitación) ELISA, transferencia puntual, ensayos de unión en fase sólida (tales como los que usan un biosensor), ensayos de formato rápido y bioensayos.

[0047] La RANK purificada de acuerdo con la invención facilitará el descubrimiento de inhibidores de RANK y, por lo tanto, inhibidores de una respuesta inflamatoria (mediante la inhibición de la activación de NF-B). El uso de un polipéptido RANK purificado en la selección de inhibidores potenciales es importante y prácticamente puede eliminar la posibilidad de reacciones de interferencia con contaminantes. Dicho ensayo de selección puede utilizar el domino extracelular de RANK, el dominio intracelular o un fragmento de cualquiera de estos polipéptidos. La detección de la actividad inhibidora de una molécula típicamente implicaría el uso de una forma soluble de RANK procedente del dominio extracelular en un ensayo de selección para detectar moléculas capaces de unirse a RANK y de inhibir la unión, por ejemplo, de un anticuerpo agonista o RANKL, o el uso de un polipéptido derivado del dominio intracelular en un ensayo para detectar la inhibición de la interacción de RANK y otras proteínas intracelulares implicadas en la transducción de señales.

[0048] Además, pueden usarse sistemas in vitro para determinar la capacidad de moléculas de antagonizar o agonizar la actividad de RANK. En dichos métodos se incluyen usos de quimeras de RANK, por ejemplo, una quimera del dominio intracelular de RANK y un dominio extracelular derivado de una proteína que tiene un ligando conocido. Después pueden controlarse los efectos sobre la transducción de señales de diversas moléculas utilizando el ligando conocido para transducir una señal.

[0049] Además, también pueden usarse polipéptidos RANK para el diseño basado en la estructura de inhibidores de RANK. Dicho diseño basado en la estructura también se conoce como “diseño racional de fármacos”. Los polipéptidos RANK pueden analizarse tridimensionalmente, por ejemplo, por cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear

o modelado por homología, siendo todos ellos métodos bien conocidos. También se incluye en la invención el uso de la información estructural de RANK en sistemas de software de modelado molecular para ayudar al diseño del inhibidor. Dicho modelado asistido por ordenador y diseño de fármaco puede utilizar información tal como análisis conformacional químico, el potencial electrostático de las moléculas, el plegamiento de proteínas, etc. Un procedimiento particular de la invención comprende analizar la estructura tridimensional de RANK con respecto a probables sitios de unión de sustratos, sintetizar una nueva molécula que incorpore un sitio reactivo predictivo, y ensayar la nueva molécula como se ha descrito anteriormente.

Expresión de RANK Recombinante

[0050] Las proteínas de la presente invención preferentemente se producen por procedimientos de ADN recombinante por inserción de una secuencia de ADN que codifica una proteína RANK o un análogo de la misma en un vector de expresión recombinante y por expresión de la secuencia de ADN en un sistema de expresión recombinante en condiciones que promuevan la expresión. Las secuencias de ADN que codifican las proteínas proporcionadas por esta invención pueden ensamblarse a partir de fragmentos de ADNc y enlazadores oligonucleotídicos cortos, o a partir de una serie de oligonucleótidos, para proporcionar un gen sintético que es capaz de insertarse en un vector de expresión recombinante y expresarse en una unidad transcripcional recombinante.

[0051] Los vectores de expresión recombinantes incluyen fragmentos de ADN derivados de ADNc o sintéticos que codifican RANK, u homólogos, muteínas o análogos bioequivalentes de los mismos, unidos operativamente a elementos reguladores de la transcripción o traducción adecuados derivados de genes de mamífero, microbianos, virales o insectos. Dichos elementos reguladores incluyen un promotor transcripcional, una secuencia de operador opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión a ribosomas de ARNm adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción, como se describe con detalle más adelante. Pueden incorporarse adicionalmente la capacidad de replicación en un hospedador, normalmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes.

[0052] Las regiones de ADN están unidas operativamente cuando están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, el ADN de un péptido señal (líder secretor) está unido operativamente a un ADN para un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si está colocado de forma que produce la traducción. En general, unido operativamente significa contiguo y, en el caso de líderes secretores, contiguo y en fase de lectura. Las secuencias de ADN que codifican RANK, u homólogos o análogos de los mismos que se van a expresar en un microorganismo, preferentemente no contendrán intrones que pudieran terminar prematuramente la transcripción del ADN en ARNm.

[0053] Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador de selección y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles en el mercado que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) y pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Estas secciones de “esqueleto” de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural a expresar. E. coli típicamente se transforma usando derivados de pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977). pBR322 contiene genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina y, por lo tanto, proporciona medios sencillos para identificar células transformadas.

[0054] Los promotores usados comúnmente en vectores de expresión microbianos recombinantes incluyen el sistema promotor de -lactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; y Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4051, 1980; y documento EPA 36.776) y el promotor de tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Un sistema de expresión bacteriano particularmente útil emplea el promotor PL del fago  y el represor termolábil cI857ts. Los vectores plasmídicos disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo que incorporan derivados del promotor PL de  incluyen el plásmido pHUB2, residente en la cepa JMB9 de E. coli (ATCC 37092) y pPLc28, residente en la cepa RR1 de E. coli (ATCC 53082).

[0055] Las secuencias promotoras adecuadas en vectores de levadura incluyen los promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland et al., Biochem. 77:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Se describen adicionalmente vectores y promotores adecuados para uso en la expresión en levaduras en R. Hitzeman et al., documento EPA 73.657.

[0056] Los vectores de levadura preferidos pueden ensamblarse usando secuencias de ADN de pBR322 para la selección y replicación en E. coli (gen y origen de replicación de Ampr) y secuencias de ADN de levadura incluyendo un promotor de ADH2 reprimible por glucosa y un líder de secreción del factor . El promotor de ADH2 se ha descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300: 724, 1982). El líder del factor  de levadura, que dirige la secreción de proteínas heterólogas, puede insertarse entre el promotor y el gen estructural a expresar. Véase, por ejemplo, Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982; y Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984. La secuencia líder puede modificarse para contener, cerca de su extremo 3’, uno o más sitios de restricción útiles para facilitar la fusión de la secuencia líder a genes extraños.

[0057] Las secuencias de control de la transcripción y traducción en vectores de expresión a usar en la transformación de células de vertebrados pueden proporcionarse por fuentes virales. Por ejemplo, los promotores y potenciadores usados comúnmente proceden de Polioma, Adenovirus 2, Virus de Simio 40 (SV40) y citomegalovirus humano. Pueden usarse secuencias de ADN procedentes del genoma viral de SV40, por ejemplo, el origen de SV40, el promotor temprano y tardío, potenciador, sitio de corte y empalme y sitio de poliadenilación, para proporcionar los otros elementos genéticos necesarios para la expresión de una secuencia de ADN heteróloga. Los promotores temprano y tardío son particularmente útiles porque los dos se obtienen fácilmente a partir del virus como un fragmento que también contiene el origen de replicación viral de SV40 (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978). También pueden usarse fragmentos de SV40 más pequeños o más grandes, siempre que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio BglI localizado en el origen de replicación viral. Además, pueden utilizarse promotores genómicos virales, secuencias de control y/o secuencias señal, siempre que dichas secuencias de control sean compatibles con la célula hospedadora elegida. Los vectores ilustrativos pueden construirse como se describe por Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983).

[0058] Puede construirse un sistema útil para la expresión de alto nivel estable de ADNc del receptor de mamífero en células epiteliales mamarias murinas C127 sustancialmente como se describe por Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986). Un vector eucariota preferido para la expresión de ADN de RANK se denomina pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991) e incluye secuencias reguladoras derivadas de SV40, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el virus Epstein-Barr (EBV). Otros vectores preferidos incluyen pDC409 y pDC410, que proceden de pDC406. pDC410 se obtuvo a partir de pDC406 sustituyendo el origen de replicación de EBV con secuencias codificantes del antígeno T grande de SV40. pDC409 difiere de pDC406 en que se ha delecionado un sitio de restricción de Bgl II fuera del sitio de clonación múltiple, haciendo único el sitio de Bgl II dentro del sitio de clonación múltiple.

[0059] Una línea celular útil que permite la replicación episomal de vectores de expresión, tales como pDC406 y pDC409, que contiene el origen de replicación de EBV, es CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). La línea celular CV-1/EBNA se obtuvo por transfección de la línea celular CV-1 con un gen que codifica el antígeno 1 nuclear del virus de Epstein-Barr (EBNA-1) y expresa constitutivamente EBNA-1 dirigido por el promotor/potenciador temprano inmediato de CMV humano.

Células Hospedadoras

[0060] Las células hospedadoras transformadas son células que se han transformado o transfectado con vectores de expresión construidos usando técnicas de ADN recombinante y que contienen secuencias que codifican las proteínas de la presente invención. Las células hospedadoras transformadas pueden expresar la proteína deseada (RANK u homólogos o análogos del mismo), pero las células hospedadoras transformadas para los fines de clonar o amplificar el ADN de la invención no necesitan expresar la proteína. Las proteínas expresadas preferentemente se secretarán en el sobrenadante de cultivo, dependiendo del ADN seleccionado, pero pueden depositarse en la membrana celular.

[0061] Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de proteínas incluyen procariotas, levaduras o células eucariotas superiores bajo el control de promotores apropiados. Los procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacillus spp. Las células eucariotas superiores incluyen líneas celulares establecidas procedentes de mamífero como se describe más adelante. También podrían emplearse sistemas de traducción sin células para producir proteínas usando ARN derivados de las construcciones de ADN descritas en el presente documento. Se describen vectores de clonación y expresión apropiados para uso con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y mamíferos por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985).

[0062] Pueden usarse hospedadores de expresión procariotas para la expresión de RANK, u homólogos o análogos de los mismos que no requieren un procesamiento proteolítico y disulfuro extensivo. Los vectores de expresión procariotas generalmente comprenden uno o más marcadores de selección fenotípicos, por ejemplo un gen que codifica proteínas que confieren resistencia a antibióticos o que suministra un requisito autotrófico, y un origen de replicación reconocido por el hospedador para asegurar la amplificación dentro del hospedador. Los hospedadores procariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros.

[0063] RANK recombinante también puede expresarse en hospedadores de levadura, preferentemente de especies de Saccharomyces tales como S. cerevisiae. También pueden emplearse levaduras de otros géneros tales como Pichia

o Kluyveromyces. Los vectores de levadura generalmente contendrán un origen de replicación del plásmido de levadura 2, o una secuencia de replicación autónoma (ARS), promotor, ADN que codifica la proteína, secuencias para la poliadenilación y terminación de la transcripción y un gen de selección. Preferentemente, los vectores de levadura incluirán un origen de replicación y un marcador de selección que permita la transformación tanto de levadura como de

E.

coli, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y el gen trp1 de S. cerevisiae, que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, y un promotor derivado de un gen de levadura de alta expresión para inducir la transcripción de una secuencia estructural cadena abajo. Entonces, la presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula hospedadora de levadura proporciona un entorno eficaz para detectar la transformación por el crecimiento en ausencia de triptófano.

[0064] Los protocolos de transformación de levadura adecuados se conocen por los expertos en la materia; se describe una técnica ejemplar por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978, selección de los transformantes Trp+ en un medio selectivo que consiste en base de nitrógeno de levadura al 0,67%, casaminoácidos al 0,5%, glucosa al 2%, adenina a 10 g/ml y 20 g/ml de uracilo. Las cepas hospedadoras transformadas por vectores que comprenden el promotor de ADH2 pueden cultivarse para la expresión en un medio rico que consiste en extracto de levadura al 1%, peptona al 2% y glucosa al 1% suplementada con adenina a 80 g/ml y uracilo a 80 g/ml. La desrepresión del promotor de ADH2 se produce después del agotamiento de la glucosa del medio. Se recogen sobrenadantes de levadura en bruto por filtración y se mantienen a 4ºC antes de la purificación adicional.

[0065] Pueden emplearse diversos sistemas de cultivo de células de mamífero o de insecto para expresar la proteína recombinante. Se revisan sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Los ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas por Gluzman (Cell 23: 175, 1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector apropiado incluyendo, por ejemplo, CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478), células L, C127, 3T3, ovario de hámster chino (CHO), líneas celulares HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero pueden comprender elementos no transcritos tales como un origen de replicación, un promotor adecuado y un potenciador unido al gen a expresar, y otras secuencias flanqueantes no transcritas 5’ o 3’, y secuencias no traducidas 5’ o 3’, tales como sitios de unión a ribosomas necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donadores y aceptores de corte y empalme, y secuencias de terminación de la transcripción.

Purificación de RANK Recombinante

[0066] Se preparan RANK purificado y homólogos y análogos del mismo cultivando sistemas de hospedador/vector adecuados para expresar los productos de traducción recombinantes de los ADN de la presente invención, que después se purifican del medio de cultivo o de los extractos celulares. Por ejemplo, primero pueden concentrarse sobrenadantes de sistemas que secretan la proteína recombinante en el medio de cultivo usando un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon.

[0067] Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender una contraestructura de proteína o lecitina o molécula de anticuerpo unida a un soporte adecuado. Como alternativa, puede emplearse una resina de intercambio aniónica, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados comúnmente en la purificación de proteínas. Como alternativa, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. La cromatografía de exclusión molecular también proporciona un medio para purificar las proteínas de la invención.

[0068] La cromatografía de afinidad es un método particularmente preferido para purificar RANK y homólogos del mismo. Por ejemplo, un RANK expresado como una proteína de fusión que comprende una región Fc de inmunoglobulina puede purificarse usando cromatografía de afinidad de Proteína A o Proteína G. Además, una proteína RANK que comprende un dominio de cremallera de oligomerización puede purificarse en una resina que comprende un anticuerpo específico para el dominio de cremallera de oligomerización. También pueden ser útiles anticuerpos monoclonales contra la proteína RANK en purificación por cromatografía de afinidad, utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica. También puede usarse un ligando para preparar una matriz de afinidad para la purificación por afinidad de RANK.

[0069] Finalmente, puede emplearse una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) empleando medios de RP-HPLC hidrófobos, por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo colgantes u otros grupos alifáticos, para purificar adicionalmente una composición de RANK. También pueden emplearse algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, para proporcionar una proteína recombinante homogénea.

[0070] La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano normalmente se aísla por extracción inicial a partir de sedimentos celulares, seguido de una o más etapas de concentración, desplazamiento salino, intercambio iónico acuoso

o cromatografía de exclusión molecular. Finalmente, puede emplearse cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas de purificación finales. Las células microbianas empleadas en la expresión de la proteína recombinante pueden romperse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o uso de algentes de lisado de células.

[0071] La fermentación de levaduras que expresan la proteína de la invención como una proteína secretada simplifica en gran medida la purificación. La proteína recombinante secretada resultante de una fermentación a gran escala puede purificarse por métodos análogos a los descritos por Urdal et al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Esta referencia describe dos etapas de HPLC de fase inversa, secuenciales, para la purificación de GM-CSF humana recombinante en una columna de HPLC preparativa.

[0072] La proteína sintetizada en el cultivo recombinante se caracteriza por la presencia de componentes celulares, incluyendo proteínas, en cantidades y de un carácter que depende de las etapas de purificación tomadas para recuperar la proteína de la invención del cultivo. Estos componentes normalmente procederán de levadura, de procariotas o de un organismo eucariota superior no humano y preferentemente están presentes en cantidades contaminantes inocuas, del orden de menos de aproximadamente un 1 por ciento en peso. Además, el cultivo de células recombinantes permite la producción de las proteínas de la invención sin otras proteínas que pueden estar normalmente asociadas con las proteínas como se encuentran en la naturaleza en la especie de origen.

Usos y Administración de Composiciones de RANK

[0073] La presente invención proporciona métodos para usar composiciones terapéuticas que comprenden una cantidad eficaz de una proteína y un diluyente y vehículo adecuado, y métodos para regular una respuesta inmune o inflamatoria. También se contempla el uso de RANK junto con receptores de citocinas o citocinas solubles, u otras moléculas inmunorreguladoras.

[0074] Para uso terapéutico, la proteína purificada se administra a un paciente, preferentemente un ser humano, para el tratamiento en una manera apropiada para la indicación. De esta manera, por ejemplo, las composiciones de proteínas RANK administradas para regular la función inmune pueden administrarse por inyección en embolada, infusión continua, liberación sostenida desde implantes u otra técnica adecuada. Típicamente, un agente terapéutico se administrará en forma de una composición que comprende RANK purificado, junto con vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. Dichos vehículos no serán tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas.

[0075] Normalmente, la preparación de dichas composiciones de proteína implica combinar la proteína de la invención con tampones, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutatión y otros estabilizantes y excipientes. Son diluyentes apropiados ejemplares solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina de suero no específica. Preferentemente, el producto se formula como un liofilizado usando soluciones de excipiente apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse en ensayos. La cantidad y frecuencia de administración dependerá, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y gravedad de la indicación a tratar, la respuesta deseada, el estado del paciente y similares.

[0076] Las formas solubles de RANK y otros antagonistas de RANK tales como anticuerpos monoclonales antagonistas pueden administrarse para inhibir la inducción inducida por RANK de la actividad de NF-B. NF-B es un factor de transcripción que se utiliza considerablemente por las células del sistema inmune, y juega un papel en la respuesta inflamatoria. De esta manera, los inhibidores de la señalización de RANK serán útiles en el tratamiento de afecciones en las que la señalización a través de RANK ha dado lugar a consecuencias negativas, por ejemplo, choque tóxico o séptico, o reacciones de injerto contra hospedador. También pueden ser útiles para interferir con el papel de NF-B en la transformación celular. Las células tumorales responden más a la radiación cuando su NF-B está bloqueado; de esta manera, el RANK soluble (u otros antagonistas de la señalización de RANK) será útil como terapia auxiliar para enfermedades caracterizadas por células neoplásicas que expresan RANK.

[0077] Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

EJEMPLO 1

[0078] El ejemplo describe la identificación y aislamiento de un ADN que codifica un nuevo miembro de la superfamilia de receptores del TNF. Se identificó un inserto de ADNc parcial con una fase de lectura abierta prevista que tenía alguna similitud con CD40 (un antígeno de la superficie celular presente en la superficie de células B humanas tanto normales como neoplásicas que, según se ha demostrado, juega un papel importante en la proliferación y diferenciación de células B; Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989), en una base de datos que contenía información de secuencia de ADNc generados a partir de células dendríticas (DC) derivadas de médula ósea humana. El inserto se escindió del vector por digestión con endonucleasas de restricción, se purificó en gel, se marcó con 32P y se usó para hibridar con manchas de transferencia de colonias generadas a partir de una biblioteca de ADNc de DC que contenía insertos de ADNc de mayor tamaño usando técnicas de hibridación y lavado de alta rigurosidad (hibridación en SSC 5x, formamida al 50% a 42ºC durante una noche, lavado en SSC 0,5x a 63ºC); se describen otras condiciones de alta rigurosidad adecuadas en Sambrook et al. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; 1989), 9.52-9.55. Los experimentos iniciales produjeron un clon denominado 9D-8A (SEC ID Nº: 1); el análisis posterior indicó que este clon contenía todo excepto el extremo 5’ de un nuevo ADNc, con una secuencia de intrones prevista en el extremo 5’ (nucleótidos 1-92 de la SEC ID Nº: 1). Se realizaron hibridaciones de colonias adicionales y se aisló un segundo clon. El segundo clon, denominado 9D-15C (SEC ID Nº: 3), contenía el extremo 5’ sin interrupción de intrones pero no el extremo 3’ completo. La SEC ID Nº: 5 muestra la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de una proteína de longitud completa prevista basada en el alineamiento de las secuencias solapantes de las SEC ID Nº: 1 y 3.

[0079] La proteína codificada se denominó RANK, por las siglas en inglés de activador del receptor de NF-B. El ADNc codifica una proteína transmembrana de Tipo 1 prevista que tiene 616 restos aminoacídicos, con una secuencia señal prevista de 24 aminoácidos (el ordenador predijo que el sitio de escisión está después de la Leu24), un dominio extracelular de 188 aminoácidos, un domino transmembrana de 21 aminoácidos y una cola citoplásmica de 383 aminoácidos. La región extracelular de RANK presentó una homología de aminoácidos significativa (38,5% de identidad, 52,3% de similitud) con CD40. Un vector de clonación (pBluescriptSK-) que contenía la secuencia de RANK humano, denominado pBluescript:huRANK (en E. coli DH10B) se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD (ATCC) el 20 de diciembre de 1996, según los términos del Tratado de Budapest, y recibió el número de acceso 98285.

EJEMPLO 2

[0080] Este ejemplo describe la construcción de una construcción de ADN de RANK para expresar una proteína de fusión RANK/Fc. Se construyó una forma soluble de RANK fusionada a la región Fc de IgG1 humana en el vector de expresión de mamífero pDC409 (documento USSN 08/571.579). Este vector de expresión codifica la secuencia líder de la fase de lectura abierta de Citomegalovirus (CMV) R27080 (SEC ID Nº: 9), seguida de los aminoácidos 33-213 de RANK, seguido de una forma mutada del dominio constante de IgG1 humana que presenta afinidad reducida por receptores de Fc (SEC ID Nº: 8; para la proteína de fusión, la parte Fc de la construcción consistía en Arg3 a Lys232). También se preparó un vector de expresión alternativo que incluía los aminoácidos 1-213 de RANK (usando la secuencia líder nativa) seguidos de la muteína de IgG1. Se descubrió que los dos vectores de expresión inducían altos niveles de expresión de la proteína de fusión RANK/Fc en células transfectadas.

[0081] Para obtener la proteína RANK/Fc, un plásmido de expresión RANK/Fc se introduce por transfección en células CV-1/EBNA y se recogen los sobrenadantes durante aproximadamente una semana. La proteína de fusión RANK/Fc se purifica por medios bien conocidos en la técnica para la purificación de proteínas de fusión de Fc, por ejemplo, por cromatografía en columna de proteína A sepharose de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (es decir, Pharmacia, Uppsala, Sweden). El análisis de SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida indicó que la proteína RANK/Fc purificada migraba con un peso molecular de 55 kDa en presencia de un agente reductor, y a un peso molecular de 110 kDa en ausencia de un agente reductor.

[0082] La secuenciación de aminoácidos N-terminales de la proteína purificada obtenida usando el líder R27080 de CMV mostró una escisión del 60% después de Ala20, una escisión del 20% después de Pro22 y una escisión del 20% después de Arg 28 (que es el sitio de escisión de Furina; los restos aminoacídicos son relativos a la SEC ID Nº: 9); el análisis de aminoácidos N-terminales de la proteína de fusión expresada con el líder nativo mostró escisión predominantemente después de Gln25 (un 80% después de Gln25 y un 20% después de Arg23; los restos aminoacídicos son relativos a la SEC ID Nº: 6, RANK de longitud completa). Las dos proteínas de fusión pudieron unirse a un ligando para RANK de una manera específica (es decir, se unieron a la superficie de diversas líneas celulares tales como la línea celular de timoma murino, EL4), indicando que la presencia de aminoácidos adicionales en el extremo N de RANK no interfiere con su capacidad de unirse a RANKL. Además, la construcción que comprendía el líder de CMV codificaba RANK empezando en el aminoácido 33; de esta manera, es de esperar que un péptido RANK que tenga un extremo N en un aminoácido entre Arg23 y Prot33, inclusive, pueda unirse a un ligando para RANK de una manera específica.

[0083] Otros miembros de la superfamilia de receptores de TNF tienen una región de aminoácidos entre el domino transmembrana y el domino de unión al ligando que se denomina región “espaciadora”, que no es necesaria para la unión al ligando. En RANK, se predice que los aminoácidos entre 196 y 213 forman dicha región espaciadora. Por consiguiente, es de esperar que una forma soluble de RANK que termina con un aminoácido en esta región retenga la capacidad de unirse a un ligando para RANK de una manera específica. Los aminoácidos C-terminales preferidos para los péptidos RANK solubles se seleccionan del grupo que consiste que los aminoácidos 213 y 196 de la SEC ID Nº: 6, aunque otros aminoácidos en la región espaciadora pueden utilizarse como extremo C.

EJEMPLO 3

[0084] Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales contra RANK. Se emplean preparaciones de RANK recombinante purificada, por ejemplo, o células transfectadas que expresan altos niveles de RANK, para generar anticuerpos monoclonales contra RANK usando técnicas convencionales, tales como las descritas en la Patente de Estados Unidos 4.411.993. También puede usarse ADN que codifica RANK como inmunógeno, por ejemplo, como se revisa por Pardoll y Beckerleg en Immunity 3: 165, 1995. Dichos anticuerpos probablemente serán útiles para interferir con la señalización inducida por RANK (anticuerpos antagonistas o de bloqueo) o en la inducción de una señal por entrecruzamiento de RANK (anticuerpos agonistas), como componentes de ensayos de diagnóstico o de investigación para RANK o la actividad de RANK, o en purificación por afinidad de RANK.

[0085] Para inmunizar roedores, se emulsiona inmunógeno de RANK en un adyuvante (tal como adyuvante completo

o incompleto de Freund, alumbre u otro adyuvante, tal como adyuvante R700 de Ribi (Ribi, Hamilton, MT) y se inyecta en cantidades que varían de 10 a 100 g por vía subcutánea en un roedor seleccionado, por ejemplo, ratones BALB/c o ratas de Lewis. El ADN puede administrarse por vía intradérmica (Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9519, 1994)

o intramuscular (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4156, 1993); se ha descubierto que la solución salina es un diluyente adecuado para antígenos basados en ADN. De diez días a tres semanas después, los animales inmunizados se refuerzan con más inmunógeno y después se refuerzan periódicamente en un programa de inmunización semanal, bisemanal o cada tres semanas.

[0086] Se extraen periódicamente muestras de suero por extracción de sangre retro-orbital o escisión de la punta de la cola para ensayar mediante el ensayo de transferencia puntual (dot-blot) (sándwich de anticuerpo), ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), inmunoprecipitación u otros ensayos adecuados, incluyendo análisis FACS. Después de la detección de un título de anticuerpos apropiado, a los animales positivos se les administra una inyección intravenosa de antígeno en solución salina. De tres a cuatro días después, los animales se sacrifican, se recogen los esplenocitos y se fusionan a una línea de células de mieloma murino (por ejemplo, NS1 o preferentemente Ag 8.653 [ATCC CRL 1580]). Las líneas de células de hibridoma generadas por este procedimiento se cultivan en múltiples placas de microtitulación en un medio selectivo (por ejemplo, uno que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina o HAT) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, híbridos de mieloma-mieloma e híbridos de esplenocitoesplenocito.

[0087] Los clones de hibridoma generados de esta manera pueden explorarse por ELISA con respecto a la reactividad con RANK, por ejemplo, por adaptaciones de las técnicas descritas por Engvall et al., Immunochem. 8: 871 (1971) y en la Patente de Estados Unidos Nº: 4.703.004. Una técnica de exploración preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita por Beckman et al., J. Immunol. 144: 4212 (1990). Los clones positivos después se inyectan en las cavidades peritoneales de roedores singénicos para producir líquido ascítico que contiene altas concentraciones (>1 mg/ml) de anticuerpo monoclonal anti-RANK. El anticuerpo monoclonal resultante puede purificarse por precipitación con sulfato amónico seguido de cromatografía de exclusión molecular. Como alternativa, también puede usarse cromatografía de afinidad basada en la unión de un anticuerpo a proteína A o proteína G, así como cromatografía de afinidad basada en la unión a la proteína RANK.

[0088] Se generaron anticuerpos monoclonales usando la proteína de fusión RANK/Fc como inmunógeno. Estos reactivos se exploraron para confirmar la reactividad contra la proteína RANK. Usando los métodos descritos en el presente documento para controlar la actividad de los mAb, se aislaron tanto bloqueantes (es decir, anticuerpos que se unen a RANK e inhiben la unión de un ligando a RANK) como no bloqueantes (es decir, anticuerpos que se unen a RANK y no inhiben la unión al ligando).

EJEMPLO 4

[0089] Este ejemplo ilustra la inducción de la actividad NF-B por RANK en células 293/EBNA (la línea celular se obtuvo por transfección de la línea celular 293 con un gen que codifica el antígeno nuclear-1 del virus de Epstein-Barr (EBNA-1) que expresa constitutivamente EBNA-1 dirigido por el promotor/potenciador temprano inmediato de CMV humano). La activación de la actividad de NF-B se midió en células 293/EBNA esencialmente como se describe por Yao et al. (Immunity 3: 811, 1995). Se prepararon extractos nucleares y se analizaron con respecto a la actividad de NFB por un ensayo de retraso en gel usando un oligonucleótido de 25 pares de bases que incluía los sitios de unión a NFB. Se sembraron dos millones de células en placas de 10 cm dos días antes de la transfección con el ADN y se cultivaron en medio DMEM-F12 que contenía un 2,5% de FBS (suero bovino fetal). Las transfecciones con ADN se realizaron como se describe en el presente documento para los ensayos de promotor/indicador de IL-8.

[0090] Se prepararon extractos nucleares por solubilización de núcleos aislados con NaCl 400 mM (Yao et al., mencionado anteriormente). Se hibridaron oligonucleótidos que contenían un sitio de unión a NF-B y se marcaron terminalmente con 32P usando la ADN polinucleótido quinasa de T4. Las reacciones de cambio de movilidad contenían 10 g de extracto nuclear, 4 g de poli(dI-dC) y 15.000 cpm de oligonucleótido bicatenario marcado y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Los complejos de proteína-ADN resultantes se resolvieron en un gel de poliacrilamida nativo al 6% en tampón Tris-borato-EDTA 0,25 X.

[0091] La sobreexpresión de RANK tuvo como resultado la inducción de la actividad de NF-B como se muestra por un cambio apropiado en la movilidad de la sonda radiactiva en el gel. Se observaron resultados similares cuando RANK se indujo por un ligando que se une a RANK y transduce una señal a las células que expresan el receptor (es decir, por co-transfección de las células con RANK humano y ADN de RANKL murino; véase el Ejemplo 7 presentado más adelante), y sería de esperar que esto se produjera cuando la inducción se hace con anticuerpos agonistas.

EJEMPLO 5

[0092] Este ejemplo describe un sistema promotor/indicador de genes basado en el promotor de Interleucina-8 (IL-8) humana usado para analizar la activación de la transcripción génica in vivo. Se sabe que la inducción de la transcripción del gen de IL-8 humano por las citocinas Interleucina-1 (IL-1) o el factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-) es dependiente de los sitios de unión al factor de transcripción NF-IL-6 y NF-B intacto. La fusión del promotor de IL-8 que responde a citocinas con un ADNc que codifica el receptor murino de IL-4 (mIL-4R) permite medir la activación del promotor por detección de la proteína indicadora heteróloga (mIL-4R) en la superficie celular de células transfectadas.

[0093] Se transfectan células epiteliales de riñón humano (293/EBNA) (a través del método de DEAE/DEXTRANO) con plásmidos que codifican: 1). la construcción indicador/promotor (denominada pIL-8rep) y 2). el o los ADNc de interés. Las concentraciones de ADN siempre se mantienen constantes por la adición de ADN de vector vacío. Las células 293/EBNA se cultivan a una densidad de 2,5 x 104 células/ml (3 ml/pocillo) en una placa de 6 pocillos y se incuban durante dos días antes de la transfección. Dos días después de la transfección, se detecta el receptor de mIL-4 por un radioinmunoensayo (RIA) como se describe más adelante.

[0094] En uno de estos experimentos, las células 293/EBNA se co-transfectaron con ADN que codificaba RANK y con ADN que codificaba RANKL (véase el Ejemplo 7 presentado más adelante). La co-expresión de este receptor y su contraestructura por las células da como resultado la activación del proceso de señalización de RANK. Para estos estudios de co-transfección, la concentración de ADN/pocillo para la transfección de DEAE fue la siguiente: 40 ng de pIL-8rep [pBluescriptSK – vector (Stratagene)]; 0,4 ng de CD40 (ADN que codifica CD40, un receptor de control; vector pCDM8); 0,4 ng de RANK (ADN que codifica RANK; vector pDC409) y 1-50 ng de CD40L (ADN que codifica el ligando para CD40, que actúa como control positivo cuando se co-transfecta con CD40 y como control negativo cuando se cotransfecta con RANK; en pDC304) o RANKL (ADN que codifica un ligando para RANK; en pDC406). Pueden realizarse experimentos similares usando RANKL soluble o anticuerpos agonistas para RANK para inducir células transfectadas con RANK.

[0095] Para el RIA específico de mIL-4R, un anticuerpo monoclonal reactivo con mIL-4R se marca con 125I y a través de un método de conjugación con Cloramina T; la actividad específica resultante típicamente es de 1,5 x 106 cpm/nmol. Después de 48 horas, las células transfectadas se lavan una vez con medio (DMEM/F12, FBS al 5%). Los sitios de unión no específicos se bloquean por la adición de medio de unión precalentado que contiene un 5% de leche desnatada en polvo e incubación a 37ºC/CO2 al 5% en un incubador de cultivo de tejidos durante una hora. El medio de bloqueo se decanta y se añade tampón de unión que contiene 125I anti-mIL-4R (clon M1; IgG1 de rata) a las células y se incuban con agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación de las células con el anticuerpo radiomarcado, las células se lavan considerablemente con tampón de unión (2X) y dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células se lisan en 1 ml de NaOH 0,5 M, y se mide la radiactividad total con un contador gamma.

[0096] Usando este ensayo, células 293/EBNA co-transfectadas con ADN que codificaban RANK mostraron actividad transcripcional, como se muestra por detección de muIL-4R en la superficie celular. La sobreexpresión de RANK dio como resultado la transcripción de muIL-4R, así como lo hizo la inducción de RANK por RANKL. Se observan resultados similares cuando RANK se induce por anticuerpos agonistas.

EJEMPLO 6

[0097] Este ejemplo ilustra la asociación de RANK con proteínas TRAF. La interacción de RANK con proteínas TRAF citoplásmicas se demostró por ensayos de co-inmunoprecipitación esencialmente como se describe por Hsu et al. (Cell

84: 299; 1996). En resumen, se co-transfectaron células 293/EBNA con plásmidos que dirigen la síntesis de RANK y TRAF2 o TRAF3 con el epítopo marcado (FLAG; SEC ID Nº: 7). Dos días después de la transfección, se marcaron las proteínas de la superficie con éster de biotina y las células se lisaron en un tampón que contenía NP-40 al 0,5%. RANK y las proteínas asociadas con este receptor se inmunoprecipitaron con anti-RANK, se lavaron minuciosamente, se resolvieron por separación electroforética en un gel de SDS-poliacrilamida al 6-10% y se transfirieron electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa para la transferencia de Western. La asociación de las proteínas TRAF2 y TRAF3 con RANK se visualizó por sondeo de la membrana con un anticuerpo que reconoce específicamente el epítopo FLAG. TRAF 2 y 3 no imunoprecipitaban con anti-RANK en ausencia de la expresión de RANK.

EJEMPLO 7

[0098] Este ejemplo describe el aislamiento de un ligando para RANK, denominado RANKL, por clonación de expresión directa. El ligando se clonó esencialmente como se describe en el documento USSN 08/249-189, presentado el 24 de mayo de 1994.

[0099] Para CD40L, en resumen, se preparó una biblioteca a partir de un clon de una línea celular de timoma de ratón EL-4 (ATCC TIB 39), denominada EL-40.5, obtenida por separación cinco veces con la proteína de fusión CD40/Fc biotinilada en un FACS (separador de células activadas por fluorescencia). La biblioteca de ADNc se obtuvo usando la metodología convencional; el ADN plasmídico se aisló y se introdujo por transfección en células CV1-EBNA subconfluentes usando un método de DEAE-dextrano. Los transfectantes se seleccionaron por autorradiografía en portaobjetos para la expresión de RANKL usando un método de unión de dos etapas con la proteína de fusión RANK/Fc como se preparó en el Ejemplo 2 seguido de anticuerpo de cabra anti-IgG humana radioyodado. Se aisló un clon que codificaba una proteína que se unía específicamente a RANK y se secuenció; el clon se denominó 11H. Un vector de expresión que contenía la secuencia de RANKL murina, denominado pDC406:muRANK-L (en E. coli DH10B), se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD (ATCC) el 20 de diciembre de 1996, según los términos del Tratado de Budapest, y recibió el número de acceso 98284. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos prevista de este clon se ilustran en la SEC ID Nº: 10. Este clon no contenía una metionina iniciadora; se obtuvieron clones de longitud completa adicionales a partir de una biblioteca 7B9 (preparada sustancialmente como se describe en la Patente de Estados Unidos 5.599.905, expedida el 4 de febrero de 1997); se descubrió que la región 5’ era idéntica a la de RANKL humano como se muestra en la SEC ID Nº: 12, aminoácidos 1 a 22, excepto por la sustitución de una Thr por Gly en el resto 9.

[0100] Este ligando es útil para evaluar la capacidad de RANK de unirse a RANKL por varios ensayos diferentes. Por ejemplo, pueden usarse células transfectadas que expresan RANKL en un ensayo FACS (o ensayo similar) para evaluar la capacidad de RANK soluble de unirse a RANKL. Además, pueden prepararse formas solubles de RANKL y usarse en ensayos que se conocen en la técnica (es decir, ensayos ELISA o BIAcore esencialmente como se describe en el documento USSN 08/249.189, presentado el 24 de mayo de 1994). RANKL también es útil en la purificación por afinidad de RANK, y como reactivo en métodos para medir los niveles de RANK en una muestra. RANKL soluble también es útil para inducir la activación de NF-B y de esta manera proteger a las células que expresan RANK de la apoptosis.

EJEMPLO 8

[0101] Este ejemplo describe el aislamiento de un ligando de RANK humano (RANKL) usando una técnica basada en PCR. Se usaron cebadores oligonucleotídicos específicos de ligando de RANK murino en reacciones de PCR usando ADNc de primera cadena derivado de la línea celular humana como moldes. Los cebadores correspondían a los nucleótidos 478-497 y al complemento de los nucleótidos 858-878 del ligando de RANK murino (SEC ID Nº: 10). Una banda amplificada de aproximadamente 400 pb de longitud de una reacción usando la línea celular epidermoide humana KB (ATCC CCL-17) se purificó en gel y se determinó su secuencia de nucleótidos; la secuencia era idéntica en un 85% a la región correspondiente del ligando de RANK murino, confirmando que el fragmento procedía de RANKL humano.

[0102] Para obtener ADNc de RANKL humano de longitud completa, se radiomarcaron dos oligonucleótidos específicos de RANKL humano derivados de la secuencia de nucleótidos del producto de PCR KB y se usaron como sondas de hibridación para explorar una biblioteca de ADNc de PBL humanos preparada en lambda gt10 (Stratagene, La Jolla, CA), sustancialmente como se describe en la Patente de Estados Unidos 5.599.905, expedida el 4 de febrero de 1997. Se identificaron varias placas de hibridación positivas y se purificaron, sus insertos se subclonaron en pBluescrip SK- (Stratagene, La Jolla, CA) y se determinó su secuencia de nucleótidos. Se descubrió que un aislado, PBL3, codificaba la mayor parte del RANKL humano previsto, pero parecían faltar aproximadamente 200 pb de la región codificante 5’. Se descubrió que un segundo aislado, PBL5, codificaba gran parte del RANKL humano previsto, incluyendo el extremo 5’ entero y 200 pb adicionales de la secuencia 5’ no traducida.

[0103] El extremo 5’ de PBL5 y el extremo 3’ de PBL3 se unieron entre sí para formar un ADNc de longitud completa que codifica RANKL humano. La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos prevista del ligando del RANK humano de longitud completa se muestra en la SEC ID Nº: 12. El ligando de RANK humano comparte una identidad del 83% de nucleótidos y del 84% de aminoácidos con el ligando de RANK murino. Un vector de plásmido que contiene la secuencia de RANKL, denominado pBluescript:huRANK-L (en E. coli DH10B) se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD (ATCC) el 11 de marzo de 1997 según los términos del Tratado de Budapest, y recibió el número de acceso 98354.

[0104] RANKL murino y humano son proteínas transmembrana de Tipo 2. RANKL murino contiene un dominio intracelular previsto de 48 aminoácidos, un dominio transmembrana de 21 aminoácidos y un domino extracelular de 247 aminoácidos. RANKL humano contiene un dominio intracelular de 47 aminoácidos previsto, un dominio transmembrana de 21 aminoácidos y un dominio extracelular de 249 aminoácidos.

EJEMPLO 9

[0105] Este ejemplo describe el mapeo cromosómico de RANK humano usando estrategias de mapeo basadas en PCR. Se realizaron asignaciones cromosómicas humanas iniciales usando RANK y cebadores de PCR específicos de RANKL y un kit de ADN BIOS Somatic Cell Hybrid PCRable de BIOS Laboratories (New Haven, CT), siguiendo las instrucciones del fabricante. RANK se localizó en el cromosoma humano 18; el ligando de RANK se localizó en el cromosoma 13 humano. Se realizó un mapeo más detallado usando un panel de mapeo con híbridos de radiación Genebridge 4 Radiation Hybrid Panel (Research Genetics, Huntsville, AL; descrito en Walter, MA et al., Nature Genetics

7: 22-28, 1994). Los datos de este análisis después se presentaron electrónicamente al MIT Radiation Hybrid Mapper (URL: http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) siguiendo las instrucciones contenidas en el mismo. Este análisis produjo nombres de marcadores genéticos específicos que, cuando se presentaron electrónicamente al navegador de NCBI Entrez (URL: http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?db=c&form=0), produjo las localizaciones de mapa específicas. RANK se localizó en el cromosoma 18q22.1 y RANKL se localizó en el cromosoma 13q14.

EJEMPLO 10

[0106] Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales contra RANKL. Se emplean preparaciones de RANKL recombinante purificado, por ejemplo, o células transfijadas que expresan altos niveles de RANKL, para generar anticuerpos monoclonales contra RANKL usando técnicas convencionales, tales como las descritas en la Patente de Estados Unidos 4.411.993. El ADN que codifica RANKL también puede usarse como inmunógeno, por ejemplo, como se revisa por Pardoll y Berckerleg en Immunity 3: 165, 1995. Dichos anticuerpos probablemente serán útiles para interferir con la señalización de RANKL (anticuerpos antagonistas o bloqueantes), como componentes de ensayos de diagnóstico o investigación para RANKL o la actividad de RANKL, o en la purificación por afinidad de RANKL.

[0107] Para inmunizar roedores, un inmunógeno de RANKL se emulsiona en un adyuvante (tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, alumbre u otro adyuvante, tal como adyuvante R700 de Ribi (Ribi, Hamilton, MT)) y se inyecta en cantidades que varían de 10 a 100 g por vía subcutánea en un roedor seleccionado, por ejemplo, ratones BALB/c o ratas Lewis. El ADN puede administrarse por vía intradérmica (Raz et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 9519, 1994) o por vía intramuscular (Wang et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 4156, 1993); se ha observado que la solución salina es un diluyente adecuado para antígenos basados en ADN. De diez días a tres semanas después, los animales inmunizados se refuerzan con un inmunógeno adicional y posteriormente se refuerzan periódicamente con un programa de inmunización semanal, bisemanal o cada tres semanas.

[0108] Se toman muestras de suero periódicamente por extracción retro-orbital o escisión de la punta de la cola para ensayar mediante un ensayo de transferencia puntual (sándwich de anticuerpo), ELISA (ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima), inmunoprecipitación u otros ensayos adecuados, incluyendo análisis FACS. Después de la detección de un título de anticuerpo apropiado, a los animales positivos se les administra una inyección intravenosa de antígeno en solución salina. De tres a cuatro días después, los animales se sacrifican, se recogen los esplenocitos y se fusionan a una línea celular de mieloma murino (por ejemplo, NS1 o preferentemente Ag 8.653 [ATCC CRL 1580]). Se cultivan líneas celulares de hibridoma generadas por este procedimiento en múltiples placas de microtitulación en un medio selectivo (por ejemplo, uno que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina o HAT) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma-mieloma e híbridos de esplenocito-esplenocito.

[0109] Los clones de hibridoma generados de esta manera pueden explorarse por ELISA con respecto a la reactividad con RANKL, por ejemplo, por adaptaciones de las técnicas descritas por Engvall et al., Immunochem. 8: 871 (1971) y en la Patente de Estados Unidos 4.703.004. Una técnica de exploración preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita por Beckman et al., J. Immunol. 144: 4212 (1990). Los clones positivos después se inyectan en las cavidades peritoneales de roedores singénicos para producir líquido ascítico que contiene altas concentraciones (>1 mg/ml) de anticuerpo monoclonal anti-RANK. El anticuerpo monoclonal resultante puede purificarse por precipitación con sulfato amónico seguido de cromatografía de exclusión molecular. Como alternativa, también puede usarse cromatografía de afinidad basada en la unión de anticuerpo a proteína A o proteína G, así como cromatografía de afinidad basada en la unión a proteína RANKL. Usando los métodos descritos en el presente documento para controlar la actividad de los mAb, se aíslan anticuerpos tanto bloqueantes (es decir, anticuerpos que se unen a RANKL e inhiben la unión a RANK) como anticuerpos no bloqueantes (es decir, anticuerpos que se unen a RANKL y no inhiben la unión).

EJEMPLO 11

[0110] Este ejemplo demuestra que la expresión de RANK puede regularse positivamente. Se purificaron células T de sangre periférica humana por separación por citometría de flujo o por selección negativa usando perlas recubiertas de anticuerpo, y se activaron con placas revestidas con anti-CD3 (OKT3, Dako) o fitohemaglutinina en presencia o ausencia de diversas citocinas, incluyendo Interleucina-4 (IL-4), Factor de Crecimiento de Transformación- (TGF-) y otras citocinas disponibles en el mercado (IL1-, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, IFN-, TNF-). La expresión de RANK se evaluó por FACS en un experimento a lo largo del tiempo del día 2 al día 8, usando un anticuerpo monoclonal de ratón mAb144 (preparado como se describe en el Ejemplo 3), como se muestra en la tabla presentada a continuación. Los resultados se expresan como ‘+’ a ‘++++’ haciendo referencia al aumento relativo de intensidad de tinción con anti-RANK. También se realizaron experimentos de doble marcaje usando anticuerpos anti-RANK y anti-CD8 o anti-CD4.

5

10

15

20

25

30

Tabla 1: Regulación positiva de RANK por Citocinas

Citocina (concentración)

Resultados

IL-4 (50 ng/ml) TGF- (5 ng/ml) IL-4 (50 ng/ml) + TGF- (5 ng/ml) IL1- (10 ng/ml) IL-2 (20 ng/ml) IL-3 (25 ng/ml) IL-7 (20 ng/ml) IL-8 (10 ng/ml) IL-10 (50 ng/ml) IL-12 (10 ng/ml) IL-15 (10 ng/ml) IFN- (100 U/ml) TNF- (10 ng/ml)

+ + a ++ ++++ ----------

[0111] De las citocinas ensayadas, IL-4 y TGF- aumentaron el nivel de expresión de RANK tanto en células T citotóxicas CD8+ como en células T auxiliares CD4+ del día 4 al día 8. La combinación de IL-4 y TGF- actuó sinérgicamente para regular positivamente la expresión de este receptor sobre células T activadas. Esta combinación particular de citocinas se secreta por células T supresoras, y se cree que es importante en la generación de tolerancia (revisado en Mitchison y Sieper, Z. Rheumatol. 54: 141, 1995), implicando la interacción de RANK en la regulación de una respuesta inmune hacia la tolerancia o inducción de una respuesta inmune activa.

EJEMPLO 12

[0112] Este ejemplo ilustra la influencia de RANK.Fc y hRANKL sobre el crecimiento de células T activadas. La adición de TGF a linfocitos T de sangre periférica humana activados anti-CD3 induce la detención de la proliferación y finalmente la muerte de la mayoría de los linfocitos dentro de los primeros días de cultivo. Ensayamos el efecto de las interacciones RANK:RANKL sobre células T tratadas con TGF- añadiendo RANK.Fc o RANKL humano soluble a cultivos de células T.

[0113] Se cultivaron células T de sangre periférica humana (7 x 105 PBT) durante seis días en placas de 24 pocillos revestidas con anti-CD3 (OKT3, 5 g/ml) y anti-Flag (M1, 5 g/ml) en presencia de TGF (1 ng/ml) e IL-4 (10 ng/ml), con

o sin RANK.Fc (10 g/nl) o hRANKL (1 g/ml) soluble marcado con FLAG recombinante. La recuperación de células T viables se determinó por recuentos con azul tripan por triplicado.

[0114] La adición de RANK.Fc redujo significativamente el número de células T viables recuperadas después de seis días, mientras que RANKL soluble aumentó en gran medida la recuperación de células T viables (Figura 1). De esta manera, RANKL endógeno o exógeno aumenta el número de células T viables generadas en presencia de TGF. TGF, junto con IL-4, se ha implicado en la regulación de la respuesta inmune cuando se secreta por la subserie de TH3/células T reguladoras. Se cree que estas células T median la supresión espectadora de células T efectoras. Por consiguiente, RANK y su ligando pueden actuar de una forma auto/paracrina para influir en la tolerancia de las células

T. Además, se sabe que TGF juega un papel en la evasión del sistema inmune efectuada por ciertos organismos patógenos u oportunistas. Además de jugar un papel en el desarrollo de tolerancia, RANK también puede jugar un papel en la evasión del sistema inmune por patógenos.

EJEMPLO 13

[0115] Este ejemplo ilustra la influencia de la interacción de RANK sobre células dendríticas (DC) CD1a+. Se generaron células dendríticas (DC) funcionalmente maduras in vitro a partir de progenitores de médula ósea (BM) CD34+. En resumen, se fraccionaron por densidad células BM humanas de voluntarios sanos normales usando medio de Ficoll y se aislaron por inmunoafinidad células CD34+ usando una columna de matriz anti-CD34 (Ceprate, CellPro). Las células BM CD34+ después se cultivaron en GM-CSF humano (20 ng/ml), IL-4 humana (20 ng/ml), TNF- humano (20 ng/ml), Flt3L humano derivado de CHO (FL; 100 ng/ml) en medio de Super McCoy suplementado con suero bovino fetal al 10% en un incubador completamente humidificado a 37ºC (5% de CO2) durante 14 días. Después se separaron DC CD1a+ y HLA-DR+ usando un FACStar Plus y se usaron para la evaluación biológica de RANK.

[0116] En DC CD1a+ humanas procedentes de células de médula ósea CD34+, solamente una subserie (20-30%) de las DC CD1a+ expresaron RANK en la superficie celular, como se evalúa por análisis de citometría de flujo. Sin embargo, la adición de CD40L a los cultivos de DC dio como resultado una expresión en la superficie de RANK en la mayoría de las DC CD1a+. Se ha demostrado que CD40L activa las DC al aumentar la formación de agrupamientos in vitro, induciendo cambios morfológicos de las DC y regulando positivamente la expresión de HLA-DR, CD54, CD58, CD80 y CD86.

[0117] La adición de RANKL a cultivos de DC aumentó significativamente el grado de agregación de DC y de formación de agrupamientos con respecto a los cultivos de control, de forma similar a los efectos observados con CD40L (Figura 2). Se cultivaron Dc CD1a+ humanas separadas en un cóctel de citocinas (GM-CSF, IL-4, TNF- y FL) (panel superior izquierdo), en cóctel más CD40L (1 g/ml) (superior derecho), en cóctel más RANKL (1 g/ml) (inferior izquierdo) o en cóctel más RANKL inactivado por calor (H) (1 g/ml) (inferior derecho) en placas de cultivo de fondo plano de 24 pocillos en un medio de cultivo de 1 ml durante 48-72 horas y después se fotografiaron usando un microscopio de inversión. No fue evidente un aumento en la agregación de DC y la formación de agrupamientos con respecto a los cultivos de control cuando se usó RANKL inactivada con calor, lo que indica que este efecto era dependiente de la proteína biológicamente activa. Sin embargo, el análisis fenotípico inicial de la expresión de moléculas de adhesión indicó que el agrupamiento inducido por RANKL no se debía a los mayores niveles de CD2, CD11a, CD54 o CD58.

[0118] La adición de RANKL a DC CD1a+ aumentaba su capacidad alo-estimuladora en una reacción de linfocitos mixtos (MLR) al menos de 3 a 10 veces, de forma comparable a DC cultivadas con CD40L (Figura 3). Se incubaron células T alogénicas (1x105) con números variables de DC irradiadas (2000 rad) cultivadas como se ha indicado anteriormente para la Figura 2 en placas de cultivo de fondo redondo de 96 pocillos en 0,2 ml de medio cultivo durante cuatro días. Los cultivos se sometieron a pulsos con 0,5 mCi de [3H]-timidina durante ocho horas y las células se recogieron sobre láminas de fibra de vidrio para el recuento en un contador  en fase gaseosa. Los recuentos de fondo para células T o DC cultivadas solas fueron <100 cpm. Los valores representan la media  SD de cultivos por triplicado. RANKL inactivado por calor no tuvo ningún efecto. La actividad alo-estimuladora de DC no aumentó adicionalmente cuando se usaron RANKL y CD40L en combinación, posiblemente debido a la capacidad funcional de DC que había alcanzado un nivel máximo con cualquier citocina sola. Ni RANKL ni CD40L aumentaron el crecimiento in vitro de DC con respecto al periodo de cultivo de tres días. A diferencia de CD40L, RANKL no aumentó significativamente los niveles de expresión de HLA-DR ni la expresión de CD80 o CD86.

[0119] RANKL puede aumentar la formación de agrupamientos de DC y la capacidad funcional sin modular moléculas conocidas implicadas en la adhesión celular (CD18, CD54), la presentación de antígenos (HLA-DR) o la co-estimulación (CD86), estando todos estos procesos regulados por la señalización de CD40/CD40L. La ausencia de un efecto sobre la expresión de estas moléculas sugiere que RANKL puede regular la función de DC por una o más rutas alternativas distintas de CD40/CD40L. Dado que CD40L regula la expresión en la superficie de RANK en DC generadas in vitro y que CD40L está regulada positivamente en células T activadas durante interacciones de DC-células T, RANK y su ligando pueden formar una parte importante de la cascada de activación que se induce durante la expansión de células T mediada por DC. Además, el cultivo de DC en RANKL da como resultado menores niveles de expresión de CD1b/c, y mayores niveles de CD83. Estas dos moléculas se modulan de forma similar durante la maduración de DC por CD40L (Caux et al. J. Exp. Med. 180: 1263; 1994), lo que indica que RANKL induce la maduración de DC.

[0120] Las células dendríticas se denominan células presentadoras de antígeno “profesionales”, y tienen una alta capacidad de sensibilizar células T restringidas al MHC. Cada vez hay más interés en el uso de células dendríticas ex vivo como adyuvantes de vacunas para enfermedades infecciosas o tumores (véase, por ejemplo, Romani, et al., J. Exp. Med., 180: 83, 1994). Por lo tanto, un agente tal como RANKL que induce la maduración de DC y aumenta la capacidad de células dendríticas de estimular una respuesta inmune probablemente será útil en la inmunoterapia de diversas enfermedades.

EJEMPLO 14

[0121] Este ejemplo describe el aislamiento del homólogo murino de RANK, denominado muRANK. MuRANK se aisló por una combinación de PCR de especies cruzadas e hibridación de colonias. Se explotó la conservación de restos de Cys en las pseudorrepeticiones ricas en Cys de los dominios extracelulares de proteínas miembro de la superfamilia de TNFR para diseñar cebadores de PCR basados en RANK para usar en ADNc de primera cadena murinos de diversas fuentes. Tanto el cebador cadena arriba con sentido como el cebador cadena abajo antisentido se diseñaron de manera que sus extremos 3’ terminaran con restos Cys.

[0122] El cebador con sentido cadena arriba codificaba los nucleótidos 272-295 de la SEC ID Nº: 5 (región que codifica los aminoácidos 79-86); el cebador antisentido cadena abajo codificaba el complemento de los nucleótidos 409427 (región codificante de aminoácidos 124-130). Se prepararon y se realizaron reacciones de PCR convencionales usando estos cebadores y ADNc de primera cadena de diversas líneas celulares murinas o fuentes de tejidos. Se realizaron treinta ciclos de reacción de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 20 segundos. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis y se vieron bandas específicas en varias muestras. La banda de una muestra se purificó en gel y la secuenciación del ADN reveló que la secuencia entre los cebadores era aproximadamente un 85% idéntica a la secuencia de nucleótidos de RANK humano correspondiente.

[0123] Se exploró una biblioteca de ADNc basada en plásmidos preparada a partir de la línea de epitelio de hígado fetal murino FLE18 (una de las líneas celulares identificadas como positivas en la exploración de PCR) con respecto a los ADNc de RANK de longitud completa usando sondas oligonucleotídicas específicas para RANK murino derivadas de la secuencia de RANK murina determinada por secuenciación del producto de PCR. Se recombinaron dos ADNc, uno que codificaba el extremo 5’ y el otro que codificaba el extremo 3’ de RANK murino de longitud completa (basándose en la comparación de secuencias con el RANK humano de longitud completa) para generar un ADNc de RANK murino de longitud completa. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de muRANK se muestran en las SEC ID Nº: 14 y

15.

[0124] El ADNc codifica una proteína transmembrana de Tipo 1 prevista que tiene 625 restos aminoacídicos, con una secuencia señal prevista de 30 aminoácidos, un dominio extracelular de 184 aminoácidos, un dominio transmembrana de 21 aminoácidos y una cola citoplásmica de 390 aminoácidos. La región extracelular de muRANK presentaba una homología de aminoácidos significativa (69,7% de identidad, 80,8% de similitud) con huRANK. Los expertos en la materia reconocerán que el sitio de escisión real puede ser diferente del previsto por ordenador; por consiguiente, el extremo N de RANK puede ser desde el aminoácido 25 al aminoácido 35.

[0125] Otros miembros de la superfamilia de receptores de TNF tienen una región de aminoácidos entre el dominio transmembrana y el dominio de unión a ligando que se denomina región ‘espaciadora’, que no es necesaria para la unión del ligando. En muRANK, se predice que los aminoácidos entre 197 y 214 forman dicha región espaciadora. Por consiguiente, es de esperar que una forma soluble de RANK que termina con un aminoácido en esta región retenga la capacidad de unirse a un ligando para RANK de una manera específica. Se seleccionan aminoácidos C-terminales preferidos para péptidos RANK solubles del grupo que consiste en los aminoácidos 214 y 197 de la SEC ID Nº: 14, aunque pueden utilizarse otros aminoácidos en la región espaciadora como extremo C.

EJEMPLO 15

[0126] Este ejemplo ilustra la preparación de varias formas solubles diferentes de RANK y RANKL. Se usaron técnicas convencionales de corte con enzimas de restricción y ligamiento, en combinación con aislamiento basado en PCR de fragmentos para los cuales no existían sitios de restricción convenientes. Cuando se utilizó la PCR, los productos de PCR se secuenciaron para averiguar si se había introducido alguna mutación; no se encontraron estas mutaciones.

[0127] Además del huRANK/Fc descrito en el Ejemplo 2, se preparó otra proteína de fusión RANK/Fc por ligamiento de ADN que codificaba los aminoácidos 1-213 de la SEC ID Nº: 6 a ADN que codificaba los aminoácidos 3-232 de la muteína de Fc descrita previamente (SEC ID Nº: 8). Se preparó una construcción similar para RANK murino, ligando ADN que codificaba los aminoácidos 1-213 de RANK murino de longitud completa (SEC ID Nº: 15) a ADN que codificaba los aminoácidos 3-232 de la muteína de Fc (SEC ID Nº: 8).

[0128] Se preparó una versión poli-His, marcada, soluble de huRANKL por ligamiento de ADN que codificaba el péptido líder de la cadena kappa de inmunoglobulina (SEC ID Nº: 16) a ADN que codificaba una versión corta del marcador FLAG (SEC ID Nº: 17), seguido de codones que codificaban Gly Ser, y después un marcador poli-His (SEC ID Nº: 18), seguido de codones que codificaban Gly Thr Ser y ADN que codificaba los aminoácidos 138-317 de la SEC ID Nº: 13. Se preparó una versión marcada con poli-His soluble de RANKL murino por ligamiento de ADN que codificaba el líder de CMV (SEC ID Nº: 9) a codones que codificaban Arg Thr Ser, seguido de ADN que codificaba poli-His (SEC ID Nº: 18) y seguido de ADN que codificaba los aminoácidos 119-294 de la SEC ID Nº: 11.

[0129] Se preparó una forma oligomérica soluble de huRANKL por ligamiento de ADN que codificaba el líder de CMV (SEC ID Nº: 9) a un codón que codificaba Asp seguido de ADN que terminaba en una cremallera de “leucina” de formación de trímeros (SEC ID Nº: 19), y después por codones que codificaban Thr Arg Ser seguido de los aminoácidos 138-317 de la SEC ID Nº: 13.

[0130] Estas y otras construcciones se preparan por experimentación rutinaria. Los diversos ADN después se insertan en un vector de expresión adecuado y se expresan. Son vectores de expresión particularmente preferidos los que pueden usarse en células de mamífero. Por ejemplo, pDC409 y pDC304, descritos en el presente documento, son útiles para la expresión transitoria. Para una transfección estable, se prefiere el uso de células CHO; en el documento USSN 08/785.150, ahora admitido, se describen varios vectores útiles, por ejemplo, uno de los vectores de expresión derivados de  2A5-3 analizados en el presente documento.

EJEMPLO 16

[0131] Este ejemplo demuestra que la expresión de RANKL puede regularse positivamente en células T murinas. Se obtuvieron células de ganglios linfáticos mesentéricos de ratones C57BL/6 y se activaron con placas recubiertas de antiCD3, Concanavalina A (ConA) o acetato de miristato de forbol en combinación con ionomicina (anti-CD3: 500A2; Immunex Corporation, Seattle WA; ConA, PMA, ionomicina, Sigma, St. Louis, MO) sustancialmente como se describe en el presente documento, y se cultivaron durante aproximadamente 2 a 5 días. La expresión de RANKL se evaluó en un análisis de tres colores por FACS, usando anticuerpos contra los marcadores de células T CD4, CD8 y CD45RB y RANK/Fc, preparados como se describe en el presente documento.

[0132] RANKL no se expresó en células T murinas no estimuladas. Las células T estimuladas con anti-CD3, ConA o PMA/ionomicina, mostraron expresión diferencial de RANKL: las células CD4+/CD45RBLLo y CD4+/CD45RBHi fueron positivas para RANKL, pero las células CD8+ no. RANKL no se observó en células B, de forma similar a los resultados observados con células humanas.

EJEMPLO 17

[0133] Este ejemplo ilustra los efectos de RANKL murino sobre la proliferación y la activación celular. Se evaluaron diversas células o líneas celulares representantes de células que juegan un papel en una respuesta inmune (bazo, timo y ganglios linfáticos murinos) cultivándolas en condiciones que promovían su viabilidad, en presencia o ausencia de RANKL. RANKL no estimulaba a ninguna de las células ensayadas para que proliferaran. Una línea celular, una línea celular de macrófagos denominada RAW 264.7 (número de acceso de ATCC TIB 71) mostró algunos signos de activación.

[0134] Las células RAW producen constitutivamente pequeñas cantidades de TNF-. La incubación con RANKL humano o murino aumentaba la producción de TNF- por estas células de una manera dependiente de la dosis. Los resultados no se debían a la contaminación de las preparaciones de RANKL con endotoxina, ya que la ebullición de RANKL durante 10 minutos impedía la producción de TNF-, mientras que un tratamiento similar de endotoxina purificada (LPS) no afectaba a la capacidad del LPS de estimular la producción de TNF-. A pesar del hecho de que RANKL activaba la línea celular de macrófagos RAW T64.7 para la producción de TNF-, ni RANKL humano ni RANKL murino estimulaban la producción de óxido nítrico por estas células.

EJEMPLO 18

[0135] Este ejemplo ilustra los efectos de RANKL murino sobre el crecimiento y desarrollo del timo en ratones fetales.

5

10

15

20

25

30

35

40

Se inyectaron ratones hembra preñadas con 1 mg de RANK/Fc o proteína de control de vehículo (albúmina de suero murino; MSA) los días 13, 16 y 19 de gestación. Después del nacimiento, en los recién nacidos se continuó inyectando RANK/Fc por vía intraperitoneal (IP) en una base diaria, empezando a una dosis de 1 g y doblando la dosis aproximadamente cada cuatro días, para llegar a una dosificación final de 4 g. Se recogieron los recién nacidos en los días 1, 8 y 15 después del nacimiento, se recogieron sus timos y bazos y se examinaron con respecto al tamaño, celularidad y composición fenotípica.

[0136] Se observó una ligera reducción en el tamaño del timo el día 1 en los recién nacidos de hembras inyectadas con RANK/Fc; no se observó una reducción de tamaño similar en los recién nacidos de control. El día 8, el tamaño del timo y la celularidad se habían reducido aproximadamente un 50% en los animales tratados con RANK/Fc en comparación con los ratones tratados con MSA. El análisis fenotípico demostró que las proporciones relativas de diferentes poblaciones de células T en el timo de los ratones RANK/Fc eran iguales a las de los ratones de control, indicando que la celularidad reducida se debía a una depresión global en el número de células T tímicas en lugar de deberse a una reducción en una o más poblaciones específicas. Los recién nacidos tratados con RANK/Fc no fueron significativamente diferentes de los recién nacidos de control el día 15 con respecto a su tamaño, celularidad o fenotipo de células tímicas. No se observó ninguna diferencia significativa en el tamaño del bazo, celularidad o composición en ninguno de los puntos del tiempo evaluados. La diferencia en celularidad el día 8 y no el día 15 puede sugerir que RANK/Fc puede ejercer su efecto de forma temprana en el desarrollo tímico.

EJEMPLO 19

[0137] Este ejemplo demuestra que la región C-terminal del dominio citoplásmico de RANK es importante para la unión de varias proteínas TRAF diferentes. RANK contiene al menos dos motivos PXQX(X)T reconocibles que son probables sitios de acoplamiento de TRAF. Por consiguiente, se evaluó la importancia de diversas regiones del dominio citoplásmico de RANK para la unión de TRAF. Se preparó una proteína de fusión RANK/GST sustancialmente como se describe en Smith y Johnson, Gene 67: 31 (1988), y se usó en la preparación de diversos truncamientos como se describe más adelante.

[0138] La comparación de la secuencia de nucleótidos de RANK murino y humano indicó que había varias regiones conservadas que podían ser importantes para la unión de TRAF. Por consiguiente, se desarrolló una técnica basada en PCR para facilitar la preparación de diversos truncamientos C-terminales que retendrían las regiones conservadas. Se diseñaron cebadores de PCR para introducir un codón de terminación y un sitio de enzima de restricción en puntos seleccionados, produciendo los truncamientos descritos en la Tabla 1 mostrada a continuación. La secuenciación confirmó que no se habían introducido mutaciones indeseadas en las construcciones.

[0139] Se prepararon proteínas TRAF radiomarcadas (32S-Met, Cys) por traducción in vitro usando un kit de lisado de reticulocitos disponible en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega). Las proteínas de fusión de GST truncadas se purificaron sustancialmente como se describe en Smith y Johnson (mencionado anteriormente). En resumen, se transfectó E. coli con un vector de expresión que codificaba una proteína de fusión y se indujo para expresar la proteína. Las bacterias se lisaron, se retiró el material insoluble y la proteína de fusión se aisló por precipitación con perlas revestidas con glutatión (Sepharose 4B, Pharmacia, Uppsala Sweden).

[0140] Las perlas se lavaron y se incubaron con diversas proteínas TRAF radiomarcadas. Después de las etapas de incubación y lavado, se retiraron los complejos de proteína de fusión/TRAF de las perlas por ebullición en SDS al 0,1%

+ -mercaptoetanol, y se cargaron en geles de SDS al 12% (Novex). Los geles se sometieron a una autorradiografía y se registró la presencia y ausencia del material radiomarcado. Los resultados se muestran en la Tabla 2 proporcionada a continuación.

Tabla 2: Unión de Diversas Proteínas TRAF al Dominio Citoplásmico de RANK [0141] Estos resultados indican que TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF5 y TRAF6 se unen a la parte más distal del dominio citoplásmico de RANK (entre el aminoácido G544 y A616). TRAF6 también tiene un sitio de unión entre S339 e Y421. En este experimento, TRAF5 también se unía al dominio citoplásmico de RANK.

Truncamientos: C terminales

E206-S339 E206-Y421 E206-M476 E206-G544 Longitud Completa

TRAF 1

- - - - ++

TRAF2

- - - - ++

TRAF3

- - - - ++

TRAF4

- - - - -

TRAF5

- - - - +

TRAF6

- + + + ++

LISTA DE SECUENCIAS

[0142]

(1)

INFORMACIÓN GENERAL:

(i)

SOLICITANTE: Immunex Corporation

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Activador del receptor de NF-KappaB

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 19

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

(A)

DIRECCIÓN: Immunex Corporation, Law Department

(B)

CALLE: 51 University Street

(C)

CIUDAD: Seattle

(D)

ESTADO: WA

(E)

PAÍS: USA

(E)

CÓDIGO POSTAL: 98101

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete flexible

(B)

ORDENADOR: Apple Power Macintosh

(C)

SISTEMA OPERATIVO: Apple Operating System 7.5.5

(D)

SOFTWARE: Microsoft Word for Power Macintosh 6.0.1

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 22 DE DICIEMBRE DE 1997

(C)

CLASIFICACIÓN:

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 60/064.671

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 14 DE OCTUBRE DE 1997

(C)

CLASIFICACIÓN:

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 08/813.509 24

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 DE MARZO DE 1997

(C)

CLASIFICACIÓN:

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 08/772.330 (60/064.671)

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 23 DE DICIEMBRE DE 1996

(C)

CLASIFICACIÓN:

(viii) INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE

(A)

NOMBRE: Perkins, Patricia Anne

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 34.693

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 2851-WO

(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES

(A)

TELÉFONO: (206)587-0430

(B)

TELEFAX: (206) 233-0644

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 3115 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(A)

BIBLIOTECA: CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADA DE MÉDULA ÓSEA

(B)

CLON: 9D-8A

(ix) CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 93..1868

25

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1

imagen1

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imagen1

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2

5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 591 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3

5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1391 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

10

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NO

15 (iv) ANTISENTIDO: NO

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS

5 (vii) FUENTE INMEDIATA:

(A)

BIBLIOTECA: CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADA DE MÉDULA ÓSEA

(B)

CLON: 9D-15C

(ix) CARACTERÍSTICAS:

10 (A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B) LOCALIZACIÓN: 39..1391

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 451 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácidos

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

10

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5

5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 3136 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

10

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

5 (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(A)

BIBLIOTECA: CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADA DE MÉDULA ÓSEA

(B)

CLON: RANK DE LONGITUD COMPLETA

10

(ix) CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 39..1886

15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6

5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 616 aminoácidos

(B)

TIPO: ácido nucleico

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7

5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácidos

(C)

TIPO DE CADENA: no relevante

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

10

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: péptido FLAG

15

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8

5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 232 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

TIPO DE CADENA: no relevante

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

10

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Humano

15

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: muteína de Fc de IGg1

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9

5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

TIPO DE CADENA: no relevante

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

10

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: CMV (Líder R2780)

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

OTRA INFORMACIÓN: Met1-Arg28 es el péptido líder real; Arg29 refuerza el sitio de escisión de furina; los nucleótidos que codifican Thr30 y Ser31 añaden un sitio Spe1

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1630 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mus musculus

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(A)

BIBLIOTECA:

(B)

CLON: RANKL

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 3..884

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 294 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácidos

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

53

(A)

LONGITUD: 954 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

5

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NO

10 (iv) ANTISENTIDO: NO

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Homo sapiens

15 (vii) FUENTE INMEDIATA:

(A)

BIBLIOTECA:

(B)

CLON: huRANKL (longitud completa)

(ix) CARACTERÍSTICAS:

20 (A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B) LOCALIZACIÓN: 1..951

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12

imagen1

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13

5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 317 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácidos

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13

imagen1

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1878 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Murino

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(A)

BIBLIOTECA: Epitelio de Hígado Fetal Murino

(B)

CLON: muRANK

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1875

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 625 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácidos

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácidos

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen2

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 5 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácidos

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17

20

imagen1

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácidos

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19

25

30

imagen1

5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 33 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácidos

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:

imagen1

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patente citados en la descripción

imagen1

Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción

imagen1

imagen3

Claims (40)

1. REIVINDICACIONES

   1. ADN aislado seleccionado del grupo que consiste en:

   (a)

   un ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en SEC ID Nº: 6, donde la proteína tiene un extremo amino seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido entre el aminoácido 1 y el aminoácido 33, inclusive, de SEC ID Nº: 6, y un extremo carboxi seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido entre el aminoácido 196 y el aminoácido 616, inclusive;

   (b)

   moléculas de ADN capaces de hibridar con el ADN de (a) en condiciones rigurosas, que incluyen 63ºC, 6X SSC, durante toda la noche; lavado en 3X SSC a 55ºC, y que codifican un receptor activador biológicamente activo de NF-B; y

   (c)

   moléculas de ADN que codifican fragmentos de proteínas codificadas por el ADN de (a) o (b), donde los fragmentos son biológicamente activos y la actividad biológica se selecciona del grupo que consiste en: unión a TRAF 1, 2, 3, 5 ó 6, unión específica a un receptor soluble activador del ligando de NF-B o a un receptor activador de un ligando de NF-B expresado en células o inmovilizado en una superficie, y unión a un receptor activador de anticuerpos específicos para NF-B.

2. 2.

   ADN aislado de la reivindicación 1, que codifica un receptor activador del polipéptido NF-B que es al menos un 80% idéntico en la secuencia de aminoácidos a un polipéptido de SEC ID Nº: 6 y que tiene una actividad mostrada por dicho polipéptido.

3. 3.

   ADN aislado de la reivindicación 1 ó 2, en el que la actividad biológica se selecciona del grupo que consiste en: unión a TRAF 1, 2, 3, 5 ó 6, unión específica a un receptor soluble activador de un ligando de NF-B o a un receptor activador de un ligando de NF-B expresado en células o inmovilizado en una superficie, y unión a un receptor activador de anticuerpos específicos para NF-B.

4. 4.

   ADN aislado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que codifica un receptor soluble activador de un polipéptido NF-B.

5. 5.

   ADN aislado de la reivindicación 4, que comprende además un ADN que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un dominio Fc de inmunoglobulina, una muteína de Fc de inmunoglobulina, un marcador FLAG, un péptido que comprende al menos aproximadamente 6 residuos de His, una cremallera de leucinas y combinaciones de los mismos.

6. 6.

   Vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. 7.

   Célula hospedadora transformada o transfectada con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación

8. 6.

9. 8.

   Procedimiento para preparar un receptor activador de la proteína NF-B, que comprende cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 7 en condiciones que promueven la expresión y recuperación del receptor activo activador de NF-B.

10. 9.

    Fragmento de ADN aislado seleccionado del grupo que consiste en oligonucleótidos de al menos aproximadamente 17 nucleótidos de longitud, oligonucleótidos de al menos aproximadamente 25 nucleótidos de longitud y oligonucleótidos de al menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, donde el fragmento es un fragmento de los residuos nucleotídicos 39-1886 de SEC ID Nº: 5.

11. 10.

    Receptor activador del polipéptido NF-B aislado seleccionado del grupo que consiste en:

    (a)

    un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 33 a 196 de SEC ID Nº: 6;

    (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 213 de SEC ID Nº: 6;

    (c)

    un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 234 a 616 de SEC ID Nº: 6;

    (d)

    un receptor activador de polipéptido NF-B codificado por un ADN capaz de hibridar con un ADN que codifica la proteína de (a) a (c) en condiciones rigurosas (63ºC, 6X SSC, durante toda la noche; lavado en 3X SSC a 55ºC) y que es biológicamente activo;

    (e)

    fragmentos de los polipéptidos de (a) a (d) que son biológicamente activos y la actividad biológica se selecciona del grupo que consiste en: inducción de la actividad de NF-B, unión a TRAF 1, 2, 3, 5 ó 6, unión específica a un receptor soluble activador de un ligando de NF-B o a un receptor activador de un ligando de NF-B expresado en

    células o inmovilizado como una superficie y unión a un receptor activador de anticuerpos específicos de NF-B.

12. 11.

    Receptor activador del polipéptido NF-B aislado de la reivindicación 10, en el que la actividad biológica se selecciona del grupo que consiste en: inducción de la actividad de NF-B, unión a TRAF 1, 2, 3, 5 ó 6, unión específica a un receptor soluble activador de un ligando de NF-B o a un receptor activador de un ligando de NF-B expresado en células o inmovilizado como una superficie y unión a un receptor activador de anticuerpos específicos de NF-B.

13. 12.

    Proteína de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos aproximadamente un 70%, una identidad de al menos aproximadamente un 80% o una identidad de al menos aproximadamente un 90% con SEC ID Nº: 6.

14. 13.

    Proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que es un receptor soluble activador de NF-B.

15. 14.

    Receptor soluble activador de la proteína NF-B de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende además un péptido seleccionado del grupo que consiste en un dominio Fc de inmunoglobulina, una muteína de Fc de inmunoglobulina, un marcador FLAG, un péptido que comprende al menos aproximadamente 6 residuos de His, una cremallera de leucinas y combinaciones de los mismos.

16. 15.

    Receptor soluble activador de la proteína NF-B de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende la parte Fc de la IgG1 humana que consiste en los aminoácidos 3 a 232 de SEC ID Nº: 8.

17. 16.

    Anticuerpo inmunorreactivo con un receptor activador del polipéptido NF-B de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.

18. 17.

    Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 16, que es un anticuerpo monoclonal.

19. 18.

    Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 16 o la reivindicación 17, donde dicho anticuerpo se une a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 6.

20. 19.

    Composición que comprende un receptor purificado activador de NF-B codificado por un ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un portador, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.

21. 20.

    Composición que comprende un anticuerpo antagonista de acuerdo con la reivindicación 16, reivindicación 17

    o reivindicación 18 y un portador, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.

22. 21.

    Receptor activador del polipéptido NF-B según se define en cualquiera de las reivindicaciones 10-15, o codificado por un ADN según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o una composición según se define en la reivindicación 18 o la reivindicación 19, para su uso en medicina.

23. 22.

    Receptor soluble activador del polipéptido NF-B según se define en cualquiera de las reivindicaciones 10-15,

    o codificado por un ADN según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para su uso en la inhibición de la activación de NF-B.
24. 23. Receptor soluble activador del polipéptido NF-B según se define en cualquiera de las reivindicaciones 10-15,

    o codificado por un ADN según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para su uso en el tratamiento de una afección en la que la señalización a través de un receptor activador de NF-B ha dado lugar a consecuencias negativas, tales como choque tóxico o séptico o un rechazo de un injerto contra hospedador.
25. 24. Receptor soluble activador del polipéptido NF-B según se define en cualquiera de las reivindicaciones 10-15,

    o codificado por un ADN según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para su uso en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por células neoplásicas que expresan un receptor activador de NF-B.
26. 25. Receptor soluble activador del polipéptido NF-B según se define en cualquiera de las reivindicaciones 10-15,

    o codificado por un ADN según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para su uso en la regulación de una respuesta inmune o inflamatoria.

27. 26.

    Uso de un receptor soluble activador de NF-B de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, o codificado por un ADN según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o de un receptor activador de anticuerpos monoclonales antagonistas de NF-B en la preparación de un medicamento para inhibir la activación de NFB.

28. 27.

    Uso de un receptor soluble activador de NF-B de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, o codificado por un ADN según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o de un receptor activador de anticuerpos monoclonales antagonistas de NF-B en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una afección en la que la señalización a través del receptor activador de NF-B ha dado lugar a consecuencias negativas, tales como choque tóxico o séptico o rechazo de injerto contra hospedador.

29. 28.

    Uso de un receptor soluble activador de NF-B de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, o codificado por un ADN según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o de un receptor activador de anticuerpos monoclonales antagonistas de NF-B en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por células neoplásicas que expresan el receptor activador de NF-B.

30. 29.

    Uso de un receptor soluble activador de NF-B de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, o codificado por un ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o de un receptor activador de anticuerpos monoclonales antagonistas de NF-B en la preparación de un medicamento para interferir en el papel de NF-B en la transformación celular.

31. 30.

    Uso de un receptor soluble activador de una composición polipeptídica de NF-B, donde el receptor activador de NF-B está codificado por un ADN según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o de un receptor activador de anticuerpos monoclonales antagonistas de NF-B, en la preparación de un medicamento para regular una respuesta inmune o inflamatoria.

32. 31.

    Uso de un receptor soluble activador del polipéptido NF-B de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, para cribar un inhibidor de un receptor activador de actividad de NF-B inducida por NF-B.

33. 32.

    Uso de una forma soluble de un receptor activador del polipéptido NF-B, codificado por un ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, derivado del dominio extracelular, en un ensayo de cribado para detectar moléculas capaces de unirse a un receptor activador de NF-B.

34. 33.

    Uso de un receptor activador del polipéptido NF-B, codificado por un ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, derivado del dominio citoplásmico, en un ensayo para detectar la inhibición de la interacción del receptor activador de NF-B y otras proteínas intracelulares implicadas en la transducción de señales.

35. 34.

    Uso de acuerdo con la reivindicación 33, en el que el ensayo sirve para detectar la inhibición de la asociación del receptor activador de NF-B y TRAF 1, 2, 3, 5 ó 6.

36. 35.

    Uso de un receptor activador de la secuencia polipeptídica de NF-B, codificado por un ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el diseño basado en la estructura de un receptor activador de un inhibidor de NF-B.

37. 36.

    Uso de un receptor activador del polipéptido NF-B, codificado por un ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para averiguar la capacidad de moléculas de antagonizar o agonizar el receptor activador de NFB.

38. 37.

    Uso de un receptor activador del polipéptido NF-B, codificado por un ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el desarrollo de anticuerpos agonistas o antagonistas del receptor activador de NF-B.

39. 38.

    Uso de un receptor activador del polipéptido NF-B, codificado por un ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en un cribado de antagonistas del receptor activador de la actividad de NF-B.

40. 39.

    Kit para detectar un receptor soluble activador del polipéptido NF-B o para detectar un receptor soluble activador de un ligando de NF-B o para el seguimiento de un receptor activador de la actividad mediada por NF-B en muestras de pacientes, comprendiendo dicho kit un receptor soluble activador de NF-B de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, donde dicha detección o seguimiento emplea un ensayo seleccionado del grupo que consiste en ELISA, ensayo de transferencia puntual, ensayo de unión en fase sólida (tales como los que usan un biosensor), un ensayo de formato rápido y un bioensayo.