ES2275353T3 - Anticuerpos monoclonales humanos contra el antigeno ia-2 de las celulas de los islotes de langerhans. - Google Patents

Abstract

Anticuerpos monoclonales humanos que pueden obte-nerse mediante las siguientes etapas operacionales: Inmortalización de linfocitos humanos de prediabéticos o diabéticos con altos títulos de anticuerpos séricos contra el IA-2, cultivo de los linfocitos inmortalizados con factores de crecimiento con eliminación simultánea de fac-tores inhibidores, detección de los anticuerpos monoclonales humanos específicos del IA-2 en el sobrenadante del cultivo, clonación de la línea celular inmortalizada humana que produce estos anticuerpos en presencia de células alimen-tadoras que no contienen ningún linfocito T citotóxico, multiplicación de estas células inmortalizadas eventualmente con adición de factores de crecimiento y aislamiento del anticuerpo monoclonal producido por este clon.

Description

Anticuerpos monoclonales humanos contra el antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans.

Objeto de la presente invención son los anticuerpos monoclonales humanos contra el antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans, un procedimiento para su obtención, el empleo de los anticuerpos monoclonales humanos en un procedimiento para la detección de anticuerpos contra el IA-2, un procedimiento para la detección de anticuerpos contra el antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans, así como un procedimiento para la detección del IA-2.

La diabetes mellitus dependiente de la insulina, del tipo I (IDDM) se basa en una destrucción autoinmunológica de las células \beta del páncreas que producen insulina. El desarrollo de los autoanticuerpos contra los antígenos de las células \beta precede por ello al desarrollo de una diabetes clínicamente diagnosticable. Estos autoanticuerpos sirven como marcadores sensibles para la identificación de fases preclínicas de la enfermedad. También en pacientes diabéticos recién diagnosticados se encuentran a menudo anticuerpos que reaccionan con las células \beta en los islotes de Langerhans. El conjunto de autoanticuerpos recibe también el nombre de anticuerpos de las células de los islotes de Langerhans (ICA).

Los ICA son marcadores sensibles y específicos para la prognosis y diagnóstico de la IDDM humana. Entre los antígenos de las células de los islotes de Langerhans caracterizados hasta aquí, que se forman contra los autoanticuerpos, se cuentan la insulina (Palmer et al., 1983, Science 222, 1337-1339), la glutamato-descarboxilasa (GAD, Baekkeskov et al., 1990, Nature 347, 151-156), la carboxipeptidasa H (Castano et al., 1991, J. Clin. Endocrinol. Metab. 73, 1197-1201), el antígeno ICA 69 de las células de los islotes de Langerhans, (Pietropaolo et al., 1993, J. Clin. Invest. 92, 359-371), y el antígeno IA-2, el cual recibe también el nombre de ICA 512 (Solimena et al., 1996, EMBO J. 15, 2102-2114).

Hasta el momento, no se ha podido aclarar si los autoanticuerpos que están dirigidos contra los antígenos de las células \beta, contribuyen directamente al desarrollo de la enfermedad, o si la aparición de los autoanticuerpos es un fenómeno que aparece después de la destrucción de las células \beta.

Según el actual estado de conocimiento, la aparición de los autoanticuerpos es correlativa con el desarrollo de una diabetes.

Se ha observado que en particular los autoanticuerpos contra el IA-2 aparecen en la mayoría de pacientes de IDDM recién diagnosticados, y que los autoanticuerpos específicos del IA-2 están asociados con un rápido progreso de la enfermedad de diabetes. Los autoanticuerpos específicos del IA-2 parecen ser además específicos para la IDDM como autoanticuerpos GAD y además menos a menudo en otras enfermedades autoinmunológicas sin que aparezca la IDDM (Roll y Ziegler 1997, Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 105, 1-14).

En el caso del autoantígeno IA-2 se trata de una proteína transmembránica con un segmento que atraviesa la membrana y un dominio citoplasmático (IA-2ic), el cual contiene los epítopos para la unión con los anticuerpos (Solimena et al. 1996, EMBO J. 15, 2102-2114). Como vesícula secretora de proteína intrínseca de la membrana, el IA-2 se expresa en células endocrinas secretoras de péptidos así como en neuronas, las cuales contienen la vesícula secretora de las neuronas. El IA-2 tiene una homología significativa con el IA-2\beta, el cual es conocido también con el nombre de Phogrin. El IA-2\beta es como el IA-2 una proteína transmembránica pero a diferencia de la IA-2 se expresa de preferencia en células \beta. El IA-2\beta y el IA-2 son proteínas del tipo receptoras y pertenecen las dos a la clase de las proteína-tirosina-fosfatasas (Roll y Ziegler 1997, más arriba).

La determinación de los ICA (Islet Cell Antibodies) ("anticuerpos de las células de los islotes de Langerhans") para la detección de la IDDM, tiene lugar según el estado actual de la técnica mediante mediciones en cortes de tejido del páncreas con inmunofluorescencia indirecta. Con ello se detectan los autoanticuerpos en las muestras a investigar, los cuales se unen a las estructuras de las células de los islotes de Langerhans, mediante los anticuerpos específicos para la IgG humana marcados con fluorescencia. De todas maneras estas mediciones de los ICA son técnicamente muy laboriosas y difíciles de estandarizar, dado que los resultados que se obtienen con diferentes tejidos pancreáticos de diferentes donantes varían en gran manera.

En el estado actual de la técnica se determinan los autoanticuerpos contra los IA-2 y GAD también mediante sencillos ensayos de unión con radioligandos en muestras de suero. Con ello se emplean in vitro antígenos traducidos, antígenos marcados radiactivamente (Dittler, J. et al. 1998, Diabetes 47, 592-597). Para la obtención de los antígenos marcados radiactivamente, se transcribe el ADNc del correspondiente antígeno mediante un lisado de reticulocitos de conejos in vitro. El ARNm se traduce en presencia de aminoácidos radiactivamente marcados (en general con S^{35}, azufre 35). La unión de los autoanticuerpos al antígeno marcado, se detecta mediante la separación del percomplejo antigeno-anticuerpo del antígeno libre por ejemplo por filtración o unión en fase sólida mediante la señal radiactiva del antígeno marcado.

Estos métodos de detección pueden automatizarse en parte, pero tienen la gran desventaja de que deben efectuarse radiactivamente lo cual exige medidas de protección laboriosas y costosas. Las eficiencias de marcado que pueden lograrse mediante traducción in vitro para el antígeno son muy variables de lote en lote. Además los antígenos marcados son estables solamente un corto tiempo a causa de la radiolisis que aparece o respectivamente a causa del corto periodo de tiempo del valor mitad del azufre-35.

Un análisis del diagnóstico, efectuado en forma sencilla, rápida y automatizada, para la detección directa del autoanticuerpo específico del IA-2, en el estado actual de la ciencia no ha sido descrito hasta el momento. En particular se ha creído hasta ahora que no existía ningún autoanticuerpo específico estandarizado para el IA-2. Como material estándar o de contraste se han empleado hasta ahora solamente sueros de títulos altos de pacientes de IDDM. La desventaja es en este caso, que un suero de este tipo no está disponible en una cantidad ilimitada y por ello las desviaciones dependientes de las cargas o respectivamente de los pacientes consisten en el contenido de anticuerpos del correspondiente suero estándar. Una comparación de los resultados del ensayo en diferentes laboratorios no se facilita por estos motivos.

Un objetivo de la presente es el de poner a disposición anticuerpos monoclonales humanos, los cuales reconocen específicamente el antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans, así como un procedimiento de análisis de diagnóstico para poner a disposición la detección cuantitativa de los anticuerpos específicos del IA-2 mediante una curva estándar, lo cual allana en gran parte la desventaja del estado actual de la técnica.

El objetivo se alcanza mediante anticuerpos monoclonales humanos, los cuales reaccionan específicamente con el antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans. A ellos pertenecen por ejemplo los anticuerpos producidos por las líneas celulares IA-2, 96-3-1, depositadas el 13.08.1998 con el número DSM ACC2365 en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen ("Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares") GmbH, Braunschweig, Alemania).

Objeto de la invención son por lo tanto anticuerpos monoclonales humanos contra el antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans, como se define en la reivindicación 1. Los anticuerpos preferidos son del isotipo IgG, siendo particularmente preferidos los del isotipo IgG1.

En el estado actual de la técnica ya es conocido que pueden producirse autoanticuerpos humanos contra el antígeno GAD (glutamato-descarboxilasa) de las células de los islotes de Langerhans (EP-A-0 499 176). El procedimiento que allí se describe comprende los siguientes pasos:

Inmortalización de los linfocitos humanos de prediabéticos o diabéticos, tratamiento del sobrenadante del cultivo de las células inmortalizadas (mediante transformación con el EBV) con un conjugado de anticuerpos contra el Fc\gamma humano y un marcado, subsiguiente tratamiento con inmunoglobulina humana, incubación con células de los islotes de Langerhans del páncreas humano inmortalizadas ó GAD inmovilizado, identificación de un cultivo celular humano inmortalizado, el cual produce un anticuerpo contra las células de los islotes de Langerhans del páncreas, mediante la determinación del marcado unido a las células de los islotes de Langerhans inmovilizadas ó al GAD inmovilizado, aislamiento de las células inmortalizadas humanas, que producen estos anticuerpos, multiplicación de estas células inmortalizadas y aislamiento de los anticuerpos monoclonales producidos en estas células.

Con el procedimiento descrito en la patente EP-A-0 499 176 no es posible sin embargo, obtener anticuerpos monoclonales humanos contra el IA-2. La primera dificultad ya aparece en la elección de los linfocitos del donante. No pueden utilizarse cualesquiera linfocitos del donante, sino que los linfocitos deben proceder de prediabéticos o diabéticos escogidos con títulos altos de anticuerpos séricos específicos del IA-2.

Los títulos de los anticuerpos se determinan mediante un ensayo de unión con radioligandos. En este ensayo se transcribe in vitro el ADN que codifica el IA-2 mediante un lisado de reticulocitos, y se traduce en presencia de S^{35}-metionina. A continuación se incuban unos pocos microlitros (se ha visto que 2-5 \mul son adecuados) de suero de pacientes con IA-2 marcado radioactivamente, y se separan los inmuno-complejos mediante proteína-A sefarosa del antígeno libre. La determinación de la radiactividad unida a la proteína-A sefarosa tiene lugar mediante un contador de centelleo. Mediante un suero de pacientes escogidos con un alto título, se definen los cpm medidos en unidades arbitrarias. Por ejemplo, se definió en el suero de pacientes utilizado en este estudio, que 1000 cpm correspondían a 100 U. Este suero de pacientes se tomó en las determinaciones como un estándar arbitrario. Para las transformaciones se utilizan únicamente linfocitos, cuyos donantes presenten un título superior a 80 U, puesto que solamente en estos donantes se han descubierto cultivos primarios IA-2 positivos.

Además, se ha visto que es conveniente una preselección de linfocitos B productores de IgC. En la sangre periférica se encuentran aproximadamente 10 veces más linfocitos B productores de IgM que células B productoras de IgG. Por otra parte los anticuerpos importantes contra el IA-2 son del subtipo IgG (Zhang et al 1997, Diabetes 46, 40-43). Mediante aislamiento de los linfocitos B positivos IgG de membrana, la subpoblación de células B importantes puede multiplicarse por un factor 10. El aislamiento tiene lugar mediante el marcado de los linfocitos B humanos con un anticuerpo específico para la IgG humana, de ratón, y la subsiguiente unión de perlas magnéticas, las cuales están cargadas con IgG antiratón de cordero. Mediante la colocación de un imán pueden seleccionarse positivamente las células marcadas a partir de la suspensión de células.

Además, se presentan problemas en el cultivo de los linfocitos inmortalizados puesto que las células B específicas del IA-2 inmortalizadas presentan solamente una pequeña velocidad de proliferación y a menudo se recubren de células B inespecíficas, pero que crecen rápidamente. Se ha visto que mediante la adición de factores de crecimiento como la IL-6 ó la IL-10, la proliferación de líneas celulares B específicas de IA-2 inmortalizadas puede ser mejorada. Un problema adicional es que las líneas celulares B inmortalizadas segregan factores que influyen negativamente sobre el crecimiento de las líneas celulares. A estos factores pertenecen ante todo el TGF-beta, IF-gamma y TNF-alfa. La eliminación de estos factores inhibitorios mediante frecuentes cambios de medio de cultivo produce una velocidad de transformación más alta y un más rápido crecimiento de las líneas celulares B transformadoras del EBV.

Es decisivo para una clonación satisfactoria (ver más abajo) que los linfocitos B aparecidos, transformados con EBV, es decir, las cantidades limitadas desde un principio de linfocitos B, se introduzcan en los pocillos individuales (cavidades de las placas de microtitulación). En el estado actual de la técnica se recomiendan por cada pocillo varios miles de células mononucleares periféricas purificadas (Peyron, E. et al 1994, J. Immunology 153, 1333-1339; Madec, A.-M. et al 1996, J. Immunology 156, 3541-3549). Sorprendentemente, se ha visto que para la transformación primaria solamente se pueden emplear un máximo de 400 células IgG positivas/pocillo. La velocidad de transformación es aproximadamente de 1 de 80 células B, es decir, por cada pocillo crecen un máximo de 5 clones diferentes. Por este motivo aumenta la probabilidad de que en la subsiguiente clonación de células individuales en la que solamente crecen pocos clones de células B transformadas con EBV (a menudo solamente 1-2%), puedan aislarse los clones importantes. Es igualmente sorprendente que la mayor parte de pocillos primarios positivos puedan aislarse en una densidad de siembra todavía más pequeña, lo cual puede ser interpretado como tendente a que ya en 400 células B por pocillo aparecen demasiado clones y por este motivo se suprimen los clones que crecen más despacio de los que crecen más rápidamente.

Después de un período de crecimiento de aproximadamente 2 semanas, se analizan los sobrenadantes de los cultivos celulares primarios por ejemplo mediante un análisis ELISA en IA-2 inmovilizado, para determinar la producción de anticuerpos específicos de IA-2. Se ha encontrado particularmente adecuado según la invención el rastreado de anticuerpos específicos del IA-2 mediante el dominio citoplasmático del IA-2, el cual recibe también el nombre de IA-2ic.

En la subsiguiente clonación de las células individuales para la estabilización de las líneas celulares deben añadirse las llamadas células alimentadoras, puesto que las líneas de células B transformadas con EBV en pequeña densidad celular (<25 por pocillo) no son viables. Como células alimentadoras sirven los linfocitos sanguíneos periféricos irradiados con 4000 rads, autólogos (procedentes del propio donante) (o alógenos (procedentes de otro
donante).

La eficiencia de la clonación puede por este motivo aumentarse decisivamente de forma que se eliminan los linfocitos T citotóxicos (células CD8 positivas) de la población de células alimentadoras. La supresión de las células CD8 tiene lugar de preferencia mediante separación inmunomagnética. Para ello, se incuban los linfocitos sanguíneos periféricos por ejemplo con microperlas magnéticas, se acoplan a los anticuerpos monoclonales contra el antígeno humano CD8. Mediante la colocación de un imán se eliminan las células marcadas, se irradian las células restantes y se utilizan a una concentración de 20 000 - 50 000 células por pocillo.

Se ha visto también que para la obtención de los anticuerpos según la invención, es ventajoso efectuar una comprobación de la calidad de las células alimentadoras. Se pudo comprobar que la función que apoyaba el crecimiento de estas células alimentadoras era muy diferente de un donante a otro donante. Las células alimentadoras de algunos donantes tuvieron incluso un efecto inhibidor sobre el crecimiento. Por este motivo se pudo lograr un progreso importante cuando cada nueva partida de células alimentadoras se investigó primeramente sobre una línea de células B transformadas con EBV monoclonales establecidas (MICA 5) como línea de ensayo sobre su idoneidad para el procedimiento de clonación, y fueron apartadas las partidas de alimentadoras "perjudiciales". Para ello se efectuaron clonaciones de células individuales de MICA 5 sobre linfocitos sanguíneos de diferentes donantes. Después de aproximadamente 3 semanas se determinó la eficiencia de la clonación mediante la determinación microscópica del número de pocillos crecidos. Se emplearon solamente aquellas células alimentadoras con las cuales pudo lograrse una eficiencia de clonación de por lo menos un 20%.

El paso de inmortalización puede lograrse mediante la transformación con EBV (virus Epstein-Barr) ya conocida por el experto. Este método de transformación es el preferido según la invención. El método más a menudo descrito en la Literatura para la transformación con EBV (ver Ifversen, P. et al 1993, Hum. Antibod. Hybridomas ("Anticuerpos de hibridomas humanos"), 4, 115-123) consiste en incubar los linfocitos B con EBV durante 2-3 horas, para permitir el alojamiento del virus. A continuación se lavan las células y con ello se elimina el virus. Se pudo comprobar sorprendentemente sin embargo, que se puede lograr una elevada velocidad de transformación cuando el virus no se lava sino que durante todo el período de incubación hasta el primer cambio de medio (después de aproximadamente 7 días) se incuba juntamente con las células B.

La inmortalización puede efectuarse sin embargo también mediante la fusión con células de mieloma adecuadas. Puede proyectarse también la obtención según la invención de los anticuerpos monoclonales contra el IA-2 mediante el método llamado de fago-display (Nissim , A. et al 1994, EMBO J. 13,3, 692-698). Con ello se aisla el ARNm directamente de los linfocitos de los pacientes de IDDM. A partir del ADNc obtenido pueden amplificarse los genes de la inmunoglobulina (por ejemplo mediante la reacción en cadena de la polimerasa). Los genes así producidos pueden expresarse de nuevo en una librería de fagos como Fab ó Fv de cadena simple, a partir de los cuales pueden aislarse los fagos unidos al IA-2.

Solamente mediante la superación de las dificultades más arriba descritas, fue posible obtener anticuerpos monoclonales humanos contra el antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans.

Un objeto preferido de la invención son por lo tanto los anticuerpos monoclonales que se obtienen a partir de la línea de células IA-2, 96-3-1 registrada el 13.08.1998 con el número DSM ACC2365 en la DSMZ (Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellculturen GmbH) ("Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares"), Braunschweig, Alemania). La línea de células DSM ACC2365 es igualmente objeto de la invención.

Son igualmente objeto de la invención los anticuerpos que se obtienen de manera equivalente a los obtenidos a partir de la línea de células IA-2, 96-3-1 (DSM ACC2365), capaces de unirse con el IA-2. Con la expresión "capaz de unirse de manera equivalente" se comprenden aquellos anticuerpos en los cuales puede detectarse un solapado de epítopos con el anticuerpo conocido definido. Este solapado de los epítopos puede detectarse fácilmente con ayuda de un sistema de análisis competitivo. Para ello se comprueba por ejemplo con ayuda de un inmunoensayo enzimático, hasta qué punto un anticuerpo compite con el anticuerpo ya conocido para la unión a un antígeno definido o un epítopo definido (por ejemplo el IA-2ic). Para ello se incuba por ejemplo el antígeno IA-2ic inmovilizado, con el anticuerpo monoclonal conocido, el cual lleva un marcado y con un exceso del anticuerpo en cuestión. Mediante la detección del marcado unido se puede comprobar fácilmente a continuación hasta qué punto el anticuerpo en cuestión puede desalojar al anticuerpo definido de la unión con el antígeno. Si se obtiene una eliminación de por lo menos el 50% con un exceso de 10^{5} veces, entonces existe un solapado de los epitopos.

Otro objeto de la invención son además los anticuerpos monoclonales humanos contra el antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans, los cuales pueden obtenerse mediante las etapas operacionales de: inmortalización de linfocitos humanos de prediabéticos o diabéticos con altos títulos de anticuerpos séricos (> 80 U) contra IA-2, cultivo de los linfocitos inmortalizados con factores de crecimiento, con simultáneo eliminación de los factores inhibitorios mediante un cambio frecuente de los medios, detección de los anticuerpos monoclonales humanos específicos del IA-2 en el sobrenadante del cultivo, de preferencia mediante ELISA, clonación de la línea celular inmortalizada humana que produce estos anticuerpos, en presencia de células alimentadoras, las cuales no contienen ningún linfocito T citotóxico. La multiplicación de estas células inmortalizadas eventualmente con adición de factores de crecimiento y aislamiento del anticuerpo monoclonal producido por este clon.

Igualmente es un objeto de la invención un procedimiento para la obtención de anticuerpos monoclonales humanos, los cuales reaccionan específicamente con el antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans, que comprende los pasos de: inmortalización de los linfocitos humanos de prediabéticos o diabéticos con altos títulos de anticuerpos séricos (> 80 U/ml) contra IA-2, cultivo de los linfocitos inmortalizados con factores de crecimiento con simultánea eliminación de factores inhibidores mediante cambio frecuente de los medios, detección del anticuerpo monoclonal humano específico del IA-2, en el sobrenadante del cultivo, de preferencia con ELISA, clonación de la línea celular inmortalizada humana, la cual produce estos anticuerpos, en presencia de células alimentadoras, las cuales no contienen ningún linfocito T citotóxico, multiplicación de estas células inmortalizadas eventualmente con la adición de factores de crecimiento, y aislamiento de los anticuerpos monoclonales producidos por este clon.

La realización de las etapas operacionales individuales tiene lugar como se ha descrito en los párrafos precedentes.

Con la expresión "anticuerpos monoclonales" se entienden en el sentido de la invención, junto a las inmunoglobulinas intactas, también el conjunto de fragmentos de anticuerpos. A ellos pertenecen por ejemplo los fragmentos Fab, Fab' ó F(ab)'_{2}. En caso de que se emplee el concepto "anticuerpo" sin la adición de "monoclonal" ó "policlonal" se entiende siempre que se alude a las dos clase de anticuerpos así como construcciones quiméricas y todos los fragmentos más arriba mencionados.

Los anticuerpos monoclonales específicos para el IA-2 según la invención, reaccionan específicamente con el IA-2, de forma que de preferencia reaccionan con la parte citoplasmática del IA-2, llamada IA-2ic. Objeto de la invención son por ello los anticuerpos contra el IA-2 los cuales reaccionan específicamente con la parte citoplasmática del IA-2, llamada IA-2ic. Se obtienen de manera análoga a las etapas operacionales anteriormente descritas.

Para la identificación de los anticuerpos monoclonales específicos del IA-2 se efectúa de preferencia un análisis ELISA. Para la detección de las líneas de células B transformadas con el EBV, específicas del anti IA-2, deben analizarse por cada donante por lo menos 1000 pocillos primarios. Un rastreado de tal amplitud no es posible con el análisis RIA empleado en el estado de la técnica actual, el cual es muy laborioso. Una muy alta producción de muestras puede lograrse solamente efectuando un ELISA. Con este ELISA semiautomático es posible analizar cada día varios miles de sobrenadantes de cultivo y con ello descubrir un pocillo primario IA-2 positivo, el cual es un resultado muy
raro.

En el ELISA se recubren con estreptavidina placas de microtitulación recubiertas con IA-2-biotina ó IA-2ic-biotina. A continuación se incuban las placas recubiertas, con diferentes grados de dilución de sueros humanos de prediabéticos o diabéticos establecidos. Paralelamente a esto, se incuban sobre la misma placa de microtitulación cantidades definidas de un anticuerpo IA-2 específico humano purificado. A continuación, se lavan las placas y para la detección de los anticuerpos anti-IA-2 unidos, se añade un conjugado de anticuerpos específico anti Fc\gamma humano, de cordero, marcado con peroxidasa. Los anticuerpos específicos del IA-2 unidos, se detectaron mediante una reacción coloreada mediante ABTS® (azino-di-[3-etilbenztiazolin-sulfonato (6)], nº de catálogo 756 407, Boehringer Mannheim GmbH, Alemania). A partir de las extinciones de la curva estándar se puede calcular, teniendo en cuenta el factor de dilución, el contenido del anticuerpo anti-IA-2 en los sueros de los pacientes.

Para la obtención del antígeno IA-2ic que se emplea en el ELISA, se amplificó a partir de un ADNc específico de las células de los islotes de Langerhans el gen del IA-2ic mediante los siguientes cebadores publicados por Payton et al. (1995) en J. Clin. Invest. 96, 1506-1511:

5'-ATGCAGCAAGACAACGAGCGCCTG-3' y

5'-TCACTGGGGCAGGGCCTTGAG-3'

Los productos de amplificación se clonaron en un vector Pin Point y se expresaron en E. coli como proteína de fusión soluble, biotinilada. La proteína de fusión se purificó en avidin-sefarosa monómera. El IA-2ic biotinilado se unió en placas de microtitulación cargadas con estreptavidina, se incubó con los anticuerpos monoclonales específicos del IA-2 según la invención y los anticuerpos unidos se detectaron con un conjugado de IgG anti-humano, marcado con peroxidasa. Para excluir que los anticuerpos iban dirigidos contra el dominio aminoterminal biotinilado de la proteína de fusión, se expresó sólo el dominio biotinilado de la proteína de fusión (proteína Tag) y se analizó con un ELISA. Los anticuerpos específicos del IA-2 no reconocieron la proteína Tag. Además, se analizaron los anticuerpos específicos del IA-2 con un RIA. Para ello el ADN del IA-2ic se transcribió y tradujo in vitro en presencia de metionina S^{35}, se incubó con los anticuerpos específicos de IA-2, y se inmovilizaron los inmunocomplejos mediante la adición de proteína A-sefarosa. La radiactividad en los inmunoprecipitados se determinó mediante contaje de centelleo líquido.

Igualmente, un componente de la presente invención es un procedimiento para la detección de anticuerpos humanos o autoanticuerpos contra el antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans en una muestra. Como formato de análisis entran en consideración todos los formatos corrientes para el experto, de los cuales el análisis ELISA indirecto es el preferido. Se ha visto que es adecuado poner en contacto el antígeno IA-2 nativo purificado o recombinante obtenido, o bien el antígeno IA-2ic con la muestra, de manera que los anticuerpos de la muestra puedan unirse específicamente al antígeno. Si el antígeno está previsto con un grupo capaz de unirse en fase sólida, como la biotina, entonces puede lograrse a continuación la inmovilización del inmunocomplejo en una fase sólida recubierta con estreptavidina. El antígeno puede también ser unido directa o indirectamente a la fase sólida, cuando tiene lugar la incubación con la muestra. La detección de los anticuerpos de la muestra se logra después de la separación de la fase sólida de la fase líquida, de preferencia mediante la unión de un anticuerpo provisto de una marca, el cual está dirigido contra la parte Fc de los anticuerpos humanos, en general la parte Fc de la IgG humana, y subsiguiente medición del marcado. Como marcado se puede emplear cualquier marcado que sea habitual para el experto, como por ejemplo enzimas como la peroxidasa, haptenos como la digoxigenina, colorantes fluorescentes o substancias capaces de electroquimioluminiscencia o quimioluminiscencia.

Puede concebirse también un formato de análisis competitivo, en el cual el antígeno IA-2 ó IA-2ic está unido directa o indirectamente a una fase sólida y un anticuerpo monoclonal humano según la invención contra el IA-2 ó IA-2ic, el cual lleva una marca en una concentración definida, se añade como receptor y se incuba con el antígeno. Si la muestra se añade simultáneamente o se añade a continuación, los anticuerpos de la muestra y los anticuerpos receptores marcados compiten entre sí para unirse al antígeno. Después de la separación de la fase sólida de la fase líquida, se determina el marcado en una o las dos fases. Una señal pequeña del marcado en la fase sólida significa una alta concentración de anticuerpos en la muestra.

Por comparación de los valores de medición obtenidos para las muestras con valores de medición, los cuales pueden determinarse previamente mediante una serie de estándares, puede lograrse una cuantificación de los anticuerpos de las muestras. En una tal serie de estándares se emplean concentraciones definidas de los anticuerpos monoclonales según la invención, contra el IA-2 ó IA-2ic.

Como muestras para la detección de anticuerpos contra el IA-2 pueden emplearse todos los líquidos corporales habituales para el experto. A los mismos pertenecen por ejemplo, la sangre completa, el suero o el plasma, orina y saliva.

Otro objeto de la invención es el empleo de un anticuerpo monoclonal humano contra el IA-2 ó IA-2ic como estándar o como receptor en un procedimiento para la determinación de anticuerpos contra el antígeno de las células de los islotes de Langerhans, de preferencia contra el antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans.

Otro objeto de la invención es el empleo de un anticuerpo monoclonal humano contra el antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans, para la obtención del antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans. Para la obtención del antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans pueden copularse los anticuerpos según la invención a una fase sólida según un procedimiento ya conocido por el experto. A continuación se incuba la muestra que contiene el IA-2 con los anticuerpos unidos a la fase sólida, y se separan los restantes componentes. Mediante la escisión del inmunocomplejo entre anticuerpo y antígeno, por ejemplo mediante una alta concentración de sal y a continuación elución, se puede obtener el antígeno en forma pura.

Objeto de la invención son también los anticuerpos antiidiotípicos, cuya posición de unión al antígeno corresponde a la estructura del antígeno 1A-2, ó respectivamente IA-2ic. Puede obtenerse un tal anticuerpo antiidiotípico por inmunización con un anticuerpo humano según la invención contra el IA-2, inmortalización de las células del bazo de animales inmunizados, clonación de dichas células inmortalizadas, producción de los anticuerpos, los cuales se unen a la región de unión del anticuerpo específico del IA-2, y aislamiento de los anticuerpos producidos por estos clones mediante procedimientos ya conocidos.

Igualmente es un objeto de la invención un procedimiento para la detección de IA-2 en una muestra, el cual se caracteriza porque como socio de unión se emplea por lo menos un anticuerpo monoclonal según la invención. Se prefiere efectuar la detección como Sandwich-ELISA. Con ello se une como un socio de unión, un anticuerpo contra el IA-2 el cual puede ser un anticuerpo según la invención, según métodos ya conocidos por el experto (por ejemplo mediante biotina/estreptavidina), a una fase sólida. El IA-2 presente en la muestra se une al anticuerpo unido a la fase sólida. La detección del IA-2 unido tiene lugar mediante otro socio de unión, el cual contiene una marca. Se prefiere igualmente que el otro socio de unión sea un anticuerpo y se una también específicamente al IA-2, aunque reconoce sin embargo otro epítopo que el socio de unión unido a la fase sólida. El socio de unión marcado puede ser un anticuerpo monoclonal según la invención cuando el anticuerpo unido a la fase sólida reconoce otro epitopo. Como marcado pueden emplearse todos los marcados que sean habituales al experto. Entre ellos se cuentan por ejemplo enzimas como la peroxidasa, haptenos como la digoxigenina, colorantes de fluorescencia, substancias capaces de electro o quimioluminiscencia.

Los siguientes ejemplos aclaran mejor la invención.

Ejemplo 1 Selección de donantes para el aislamiento de B-linfocitos

Para elevar la probabilidad de una transformación satisfactoria de B-linfocitos específicos del anti-IA-2, de la sangre periférica, se seleccionaron donantes para el aislamiento de linfocitos, que presentaran un alto título de anticuerpos séricos contra el IA-2.

Los anticuerpos se determinaron mediante un ensayo de traducción (ver Zhang et al 1997, Diabetes 46, 40-43 así como Dittler J. et al 1998, Diabetes 47, 592-597). Se extrajo sangre a diabéticos recién diagnosticados y se separó el suero por métodos ya conocidos. Un volumen de 2-5 \mul de los sueros individuales fue incubado con rotación en 50 \mul de tampón de precipitación (20 mM Tris HCl, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1% de triton X-100, 0,1% de aprotinina) con el polipéptido IA-2ic marcado radiactivamente mediante traducción in vitro (aproximadamente 15 000 cpm), durante la noche a 4ºC. A continuación se añadieron 50 \mul de una suspensión de proteína A en sefarosa 50% y se incubó durante otra hora. A continuación se lavó tres veces con tampón de incubación y se determinó la radiactividad de las "perlas" en un aparato de centelleo en líquido. Como estándar arbitrario se empleó un suero de diabético de alto título, el cual presentaba una cantidad de suero de 5 \mul en aproximadamente 1000 cpm en el inmuno-precipitado. Este valor se definió como equivalente a 100 U. Los sueros normales tienen así aproximadamente 5 U. Para las transformaciones siguientes de los linfocitos de sangre periférica se emplearon linfocitos de pacientes cuyos sueros tenían un título mayor de 80 U.

Ejemplo 2 Separación de las células y transformaciones con EBV

Solamente aquellos donantes de linfocitos cuyos sueros presentaron por lo menos un título de 80 U fueron empleados para el aislamiento de B-linfocitos. De estos donantes se extrajeron 20-50 ml de sangre y de la misma se aislaron las células mononucleares periféricas (PBMNC) mediante una centrifugación por gradientes de densidad.

En los análisis clásicos para la detección de los anticuerpos séricos específicos del AI-2, se utilizó para la separación el inmunocomplejo proteína A - sefarosa. Por este motivo debe aceptarse que los anticuerpos del anti-IA-2 pertenecen exclusivamente a la clase de inmunoglobulina IgG (Zhang et al., Diabetes, 1997, 46,40-43 así como Ditter J. et al, Diabetes, 1998, 47, 592-597). Puesto que los linfocitos B de la sangre periférica producen preponderantemente IgM, se aislaron para el enriquecimienmto de la subpopulación, las células B de membrana relevantes IgG positivas. Para ello se ajustaron las PBMNC con IMDM enfriadas con hielo/10% de suero bovino fetal (IMDM/10% de FSK), a una concentración de 3 x 10^{6} células/ml. A continuación se añadió un anticuerpo anti IgG humano de ratón en una concentración de 10 \mug/ml. Las células se agitaron a continuación 30 minutos a 4ºC para evitar la sedimentación de las células durante la incubación. A continuación se centrifugó a 200 g durante 10 minutos a temperatura ambiente, el sobrenadante se aspiró y las células se lavaron dos veces con IMDM/10% de FKS.

A continuación se trataron las células en IMDM/10% de FKS a una concentración de 1 x 10^{7} células/ml (número total de células aproximadamente 1 x 10^{7} células) y se incubaron con perlas magnéticas (Dynal M-280), las cuales se habían cargado con IgG de cordero anti-ratón. Se añadieron aproximadamente 10 perlas por célula diana (de lo cual resultó que se expresó aproximadamente el 5% de IgG de la membrana de las PBMNC).

Las células se agitaron con las perlas durante 30 minutos a 4ºC. a continuación se colocó el recipiente de reacción durante 5 minutos en el soporte del imán, para separar las células marcadas. El sobrenadante se aspiró, las perlas se resuspendieron en 1 ml del medio y se mantuvieron todavía 5 minutos en el soporte del imán. El sobrenadante se aspiró de nuevo, se sacó el tubito del soporte del imán y se resuspendieron las células aisladas en 0,5 ml de IMDM/10% de FKS.

A continuación se añadieron 2 ml de suspensión concentrada de virus Epstein-Barr. La suspensión de virus se obtuvo del sobrenadante de un cultivo confluente de la línea celular B 95-8 Marmoset (ATCC CRL 1612). Para la adsorción del virus fueron incubadas las células B durante 2 horas en la estufa de incubación a 37ºC con el 7% de CO_{2}. El tubito se movió varias veces durante la fase de incubación para evitar que las células se sedimentaran.

A continuación se preparó una serie de diluciones con las células B separadas, de manera que estuvieran contenidas 100, 200 y 400 células B en 100 \mul de IMDM/10% de FKS. Esta suspensión de células se mezcló a continuación con PBMNC alógenas irradiadas con 4000 rads (sin células CD8-positivas) como células alimentadoras (50 000 células alimentadoras por 150 \mul de suspensión de células). A continuación tuvo lugar la adición de 100 U/ml de IL-6. Se repartieron 150 \mul de suspensión de células por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron durante 2 semanas con el 5% de CO_{2} y 37ºC. Después de 7-10 días se cambió el medio.

Ejemplo 3 Ensayo de rastreo para detectar las líneas de células B transformadas con EBV, productoras de anticuerpos del IA-2

Después de dos semanas, se analizaron los sobrenadantes de los cultivos de las líneas EBV en un ELISA para detectar la reactividad contra el IA-2 recombinante. Como antígeno, se expresó la parte intracelular del IA-2 (IA-2ic) en Escherichia coli en combinación con un péptido marcado con biotina en el termino -NH_{2}. La proteína de fusión se purificó mediante cromatografía de afinidad en una columna de estreptavidina.

Las placas de microtitulación recubiertas de estreptavinida, se recubrieron con IA-2ic-biotina en una concentración de 100 ng/ml durante una hora a temperatura ambiente. A continuación se lavaron las placas con 0,15 moles/litro de NACl/0,05% de Tween 20. En las placas se colocaron 50 \mul de RPMI/10% de FKS y a continuación se añadieron 50 \mul de sobrenadante del cultivo de las células B transformadas con EBV. Se incubó 1 hora a temperatura ambiente con agitación. A continuación se lavaron las placas y para la detección de los anticuerpos anti-IA-2 unidos se añadieron 100 \mul de un anticuerpo de cordero anti Fc\gamma humano marcado con peroxidasa (Boehringer Mannheim GmbH, nº de catálogo 1089 196,100 mU/ml en PBS/0,5% de albúmina de suero de buey). A continuación se incubó de nuevo durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. El conjugado en exceso se eliminó mediante un lavado tres veces con 0,15 moles/litro de NaCl/0,05% de Tween 20. A continuación se añadieron 100 \mul de ABTS® (1 mg/ml, Boehringer Mannheim GmbH, nº de catálogo 756407) en 40 mmoles/litro de tampón de citrato de pH 4,4, el cual contenía 3,25 mmoles/litro de perborato de sodio, y después de 45 minutos de incubación a temperatura ambiente con agitación, se midió la extinción a 405 nm.

En una preparación de transformación típica, se aislaron al principio 1x10^{7} PBMNC 2-5x10^{5} células B de membrana IgG positivas. Las mismas se distribuyeron sobre aproximadamente 1000 cubetas. El número de cubetas indentificadas como positivas en el ensayo de barrido fue en el intervalo entre 1-3 cubetas por 1000 cubetas analizadas. La extinción de las cubetas positivas fue en el intervalo de 1500-2000 mE.

Ejemplo 4 Clonación de las líneas de células B transformadas con EBV

Se clonaron aquellas líneas de células B transformadas con EBV, cuyo sobrenadante del cultivo dio una reacción positiva en el ELISA. Las células se colocaron en microplacas de titulación de 96 pocillos con ayuda de un clasificador de células activado por fluorescencia, y se mezclaron con PBMNC reducidas con CD8 irradiadas (5x10^{4} células/cavidad, 4000 rads. El medio de clonación consiste en IMDM/10% de FKS/100 U/ml de IL-6. El sobrenadante del cultivo con los clones en crecimiento se analizó mediante ELISA y los clones positivos aumentaron. El cultivo en masa para el aislamiento de los anticuerpos se efectuó en un bioreactor Tecnomaus. Los anticuerpos se aislaron del sobrenadante mediante precipitación con sulfato de amonio y cromatografía con proteína A-sefarosa o proteína G-sefarosa.

Claims (14)

1. Anticuerpos monoclonales humanos que pueden obtenerse mediante las siguientes etapas operacionales:

Inmortalización de linfocitos humanos de prediabéticos o diabéticos con altos títulos de anticuerpos séricos contra el IA-2, cultivo de los linfocitos inmortalizados con factores de crecimiento con eliminación simultánea de factores inhibidores, detección de los anticuerpos monoclonales humanos específicos del IA-2 en el sobrenadante del cultivo, clonación de la línea celular inmortalizada humana que produce estos anticuerpos en presencia de células alimentadoras que no contienen ningún linfocito T citotóxico, multiplicación de estas células inmortalizadas eventualmente con adición de factores de crecimiento y aislamiento del anticuerpo monoclonal producido por este clon.

2. Anticuerpos monoclonales humanos según la reivindicación 1, caracterizados porque reaccionan específicamente con el IA-2ic, la parte citoplasmática del IA-2.

3. Anticuerpos monoclonales humanos según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizados porque pertenecen a la clase IgG.

4. Anticuerpos monoclonales humanos según la reivindicación 3, caracterizados porque pertenecen a la subclase IgG1.

5. Anticuerpos monoclonales humanos según las reivindicaciones 1 a 4, que pueden obtenerse a partir de la línea celular IA-2, 96-3-1, con el número de depósito DSM ACC2365.

6. Anticuerpos monoclonales humanos según las reivindicaciones 1 a 5, que manifiestan una aptitud a la unión con IA-2 de manera equivalente a los anticuerpos que se obtienen de la línea celular IA-2, 96-3-1, número de depósito DSM ACC2365.

7. Línea celular IA-2, 96-3-1 con el número de depósito DSM ACC2365.

8. Procedimiento para la obtención de anticuerpos monoclonales humanos según una de las reivindicaciones 1 a 6, el cual comprende los pasos de inmortalización de linfocitos de prediabéticos o diabéticos con altos títulos de anticuerpos séricos contra el IA-2, cultivo de los linfocitos inmortalizados con factores de crecimiento con simultánea eliminación de los factores inhibidores, detección de los anticuerpos monoclonales humanos específicos del IA-2 en el sobrenadante del cultivo, clonación de la línea celular inmortalizada humana que produce estos anticuerpos en presencia de células alimentadoras que no contienen ningún linfocito T citotóxico, multiplicación de estas células inmortalizadas eventualmente con adición de factores de crecimiento, y aislamiento de los anticuerpos monoclonales producidos por este clon.

9. Empleo de un anticuerpo monoclonal humano según una de las reivindicaciones 1 a 6 como estándar en un procedimiento para la determinación de anticuerpos contra un antígeno de las células de los islotes de Langerhans.

10. Empleo de un anticuerpo monoclonal humano según una de las reivindicaciones 1 a 6, como receptor en un procedimiento para la determinación de anticuerpos contra un antígeno de las células de los islotes de Langerhans.

11. Empleo de un anticuerpo monoclonal humano según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la obtención del antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans.

12. Procedimiento para la detección de anticuerpos contra el antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans en una muestra, caracterizado porque se emplea como estándar un anticuerpo monoclonal según una de las reivindicaciones 1 a 6.

13. Anticuerpo anti-idiotipo, que está dirigido contra los anticuerpos que reaccionan con el antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans, el cual se obtiene mediante la inmunización con un anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 a 6, inmortalización de las células esplénicas de los animales inmunizados, clonación de dichas células inmortalizadas, que producen los anticuerpos que se unen a los anticuerpos contra el IA-2, y aislamiento de los anticuerpos producidos por estos clones conforme a procedimientos ya conocidos.

14. Procedimiento para la detección del antígeno IA-2 de las células de los islotes de Langerhans en una muestra, caracterizado porque se emplea como socio de unión, por lo menos un anticuerpo monoclonal según las reivindicaciones 1 a 6.