DK172659B1 - Fremgangsmåde til diagnosticering af myasthenia gravis og substrater og sæt til anvendelse derved - Google Patents

Description

i DK 172659 B1 ' Den foreliggende opfindelse angår fremgangsmåder til diagnosticering af myasthenia gravis og substrater og sæt til anvendelse derved.

Myasthenia gravis er en autoimmun sygdom. Hos en patient, der lider af sygdommen, dannes autoantistoffer mod epitoper på acetylcholinreceptorer ved neuromu-5 skulære forbindelsessteder. Denne autoimmunrealction svækker neuromuskulær transmission. Denne svækkelse forårsager den muskulære svaghed og udmattelse, som karakteriserer sygdommen.

I US patentskrifteme nr. 4.202.875 og RE 30.059, som begge er inkorporeret heri ved denne henvisning, beskrives biokemiske bestemmelser til diagnosticering af 10 myasthenia gravis.

De i ovennævnte patenter citerede bestemmelser omfatter immunpræcipitation, med antihuman immunoglobulin, afmærket acetylcholinreceptorprotein, der er kompleks-bundet med autoantistoffer til receptorproteinet fra en myasthenia gravis patient's serum. Acetylcholinreceptorproteinet (i det følgende "AChR"), som anvendes, er en 15 del af en råekstrakt af pattedyrsmuskel. Mærkning af AChR i disse bestemmelser gennemføres ved til proteinet i den rå ekstrakt at binde radioaktivt mærkede, curare-mimetiske neurotoksiner, såsom Naja naja siamensis toksin og a-bungarotoksin.

Disse toksiner danner kompleks med AChR ved binding i acetylcholinbindingsstedet på proteinet.

20 Selvom bestemmelserne beskrevet i de ovennævnte citerede patenter har fundet udbredt kommerciel anvendelse og for tiden er de foretrukne bestemmelser til diagnosticering af myasthenia gravis, har de en række ulemper. Den foretrukne kilde for AChR, der anvendes i disse bestemmelser, er muskel fra amputerede humane ben.

Dette væv er svært tilgængeligt og på grund af en række legale komplikationer van-25 skeligt at opnå til kommercielle anvendelser, selv når det er tilgængeligt. Yderligere er det kun muligt fra vævet at opnå meget små mængder AChR, som er egnet til bestemmelser på grund af at proteinet kun findes i meget lav koncentration i selv sundt, ikke-amputeret væv, og fordi væsentlig proteolytisk nedbrydning af proteinet uundgåeligt optræder før en råekstrakt af musklen, som indeholder proteinet kan 30 isoleres fra det amputerede væv. Andre mere righoldige pattedyrsmuskelkilder for AChR er tilgængelige, men disse andre kilder er ikke helt fri for ulemperne, af sparsomt omfang og proteolytisk nedbrydning, af den humane benmuskelkilde og, mere vigtigt, AChR fra ikke-humane kilder er mindre acceptable til de omhandlede 2 DK 172659 B1 bestemmelser, på grund af at humane autoantistoffer til human AChR krydsreagerer dårligt med AChR fra andre pattedyr (f.eks. i en udstrækning pi kun 2,1 % i tilfældet med AChR fra afnervet rottemuskel, et typisk alternativ til AChR fra human benmuskel).

5 Den begrænsede tilførsel af AChR fra human muskel, der er egnet til immunokemisk bestemmelse, har gjort det upraktisk at undersøge for myasthenia gravis-beslægtet autoantistof i humant serum ved andet end immunpræcipitationsbestemmelse under anvendelse af råekstrakter af muskel, der er beskrevet i de ovenfor citerede patenter. Den lette tilgængelighed af en mere rigelig kilde af AChR, som reagerer med 10 humane autoantistoffer til AChR fra buman muskel i alt væsentligt i samme omfang som AChR i sig selv fra human muskel, ville muliggøre andre mere følsomme immu-nobestemmelsesteknikker, såsom fastfaseteknik og enzyrabundne immunosorbent assayteknik (ELISA) til diagnosen af myasthenia gravis.

Alvorligheden af muskelsvagheden hos myasthenia gravis patienter hænger ikke tæt 15 sammen med koncentrationen af antistoffer mod AChR (anti-AChR-antistoffer) i deres sera. Dette skyldes sandsynligvis hovedsagelig de mangfoldige, komplekse mekanismer, hvormed disse antistoffer svækker transmission (reduktion af antal af receptorer ved antigenisk modulation, komplementformidlet fokal lyse, direkte svækkelse af AChR-funktion med bundet antistof) såvel som arten af neuromuskulær 20 transmission (optræder på en fuldstændig måde eller på ingen måde med en stor sikkerhedsfaktor for at sikre transmission) og kompleksadditivmekanismeme, som er tilgængelige for legemet til at kompensere for forringet neuromuskulær transmission (voksende acetylcholinfrigivelse, forøgelse af arealet af neuromuskulære forbindelsessteder).

25 I myastenia gravis patienter binder autoantistoffer til forskellige epitoper i forskellige regioner af AChR. En af disse regioner kaldes den "hovedimraunogene region".

Denne region er placeret på den ekstracellulære overflade af AChR's a-underen-heder. En anden af disse regioner er acetylcholin-(i det følgende "ACh”)bindingsste-der, som også er placeret på α-underenhedeme. I den gennemsnitlige myasthenia 30 gravis patient er ca. halvdelen af autoantistoffeme mod AChR (anti-AChR-autoanti-stoffeme) rettet mod hovedimmunogenregionen. Autoantistoffeme, som binder til hovedimmunogenregionen kan forårsage antigenisk modulation og fiksere komplement in vivo og derved reducere antallet af ACh-receptorer. Antistoffer, som er rettet mod ACh-bindingsstedeme, vil ved meget lave koncentrationer være meget effek- DK 172659 B1 3 live til direkte at forringe AChR-funktionen ved neuromuskulær transmission. Det ville være nyttigt, hvis man kunne måle ikke blot den samlede anti-AChR-antistof-koncentration i sera fra myasthenia gravis patienter, men også fraktionerne af disse antistoffer, som er rettet mod hovedimmunogenregionen og ACh-bindingsstederne 5 af AChR.

Bestemmelsen i de oven for citerede patenter afhænger af mærkningen til høj specifik aktivitet af muskel-AChR ved kompleksbinding med dets radioaktivt mærkede toksiner, som binder i proteinets ACh-bindingssted. Det har ikke været muligt at Foretage en specifik bestemmelse for autoantistoffer rettet mod ACh-bindingsstedet med be-10 stemmelsen fra de oven for citerede patenter fordi, bindingsstedet og nærliggende arealer i sådanne bestemmelser er blokeret med toksin, og derved er epitopeme i bindingsstedet og andre epitoper nærved ikke tilgængelige for binding med auto-antistof. Den heri beskrevne opfindelse, der er baseret på opdagelsen af en kilde for store mængder af let isolerbar AChR, som for praktiske formål immunologisk ikke 15 kan skelnes fra human muskel-AChR, muliggør immunobestemmelsesmetoder, som ikke kræver blokering af nogle epitoper på AChR fra binding med autoantistoffer.

Med den foreliggende opfindelse er det således muligt at måle ikke blot den samlede koncentration af anti-AChR-autoantistof i sera fra en patient, hvorved diagnosticering muliggøres, men også fraktionerne af disse antistoffer, der er rettet mod patologisk 20 signifikante steder på AChR, hvilket tillader bedre karakterisering af patientens sygdom og forbedret basis for planlægning af behandlingen af sygdommen.

McAllister et al., Int. J. Cancer 20, 206-212 (1977) rapporterede etableringen af en cellelinie, betegnet TE671, sublinie nr. 2, fra en human cerebellar medulloblastoma.

Denne og ækvivalente AChR-producerende cellelinier er i den foreliggende tekst 25 betegnet som "TE671-linien'\

Syapin et al., Brain Research 231, 365-377 (1982) har karakteriseret cellerne fra TE671-linien, som besiddende mammale neuronale nikotinylacetylcholinreceptorer (eng: nicotinic acetylcholine). Det antages indenfor området, at sådanne receptorers proteiner er immunologisk væsentligt forskellige fra (dvs. har lav immunologisk 30 krydsreaktivitet med) AChR, mod hvilket myasthenia gravis autoanti-stoffer reagerer (dvs. at antistoffer mod en blandet neuronal AChR og muskel AChR, har ringe eller ingen krydsreaktivitet med hinanden) (Patrick og Stallcup, Proc. Natl. Acad. Sci.

(U.S.A.) 74,4689 (1977); Swanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 80,4532 (1983); Smith et al., J. Neuroscience 5, 2726 (1985)).

DK 172659 B1 4

Hybridomaer, som udskiller rotteroonoklonale antistoffer, omfattende det, der er betegnet mAb 35, til muskel AChR’s hovedimmunogene region, er blevet beskrevet af Tzartos et al., J. Biol. Chem. 256, 8635-8645 (1981) og Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 79, 188 (1982). Andre hybridomaer, herunder det der er betegnet mAb 64, 5 som udskiller monoklonale antistoffer mod muskel AChR er også blevet udviklet (Tzartos et al., J. Neuroimmunology, 10 (235-253 (1986)).

Det har nu overraskende vist sig, at AChR på celler fra TE671-linien også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under deponeringsnummeret CRL 8805, til praktiske formål ved immunobestemraelser immunologisk 10 ikke kan skelnes fra human muskel AChR og fungerer i alt væsentligt på samme måde som human muskel AChR afledt fra amputeret human benmuskel i immunopræcipitationsbestemmelsen til diagnosticering af mysthenia gravis, som er beskrevet i de oven for citerede patenter.

I modsætning til AChR afledt af human benmuskel, er AChR fra cellerne fra 15 TE671 -linien også benævnt fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under deponeringsnumraeret CRL 8805, imidlertid let tilgængelig i så at sige ubegrænsede mængder i forholdsvis høje koncentrationer og i alt væsentligt fri for heterogeniteter og urenheder på grund af proteolyse og andre faktorer, som fører til forurening af AChR fra muskelkilder.

20 Denne opdagelse gør det praktisk muligt med væsentligt forbedrede immunokemiske fremgangsmåder til diagnosticering af myasthenia gravis.

KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGERNE

Fig. I belyser den praktiske ækvivalens af AChR fra human benmuskel og AChR fra celler fra TE67l-linien også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er 25 deponeret ved ATCC under deponeringsnummeret CRL 8805 ved immunpræcipitati-onsbestemmelsen for anti-AChR-autoantistoffer i serum, der er beskrevet i de oven for citerede patenter. Figuren er en logaritmisk afbildning (til basis 10) af anti-AChR-autoantistofkoncentrationer, i nM, i sera fra 45 myasthenia gravis patienter, som bestemt ved en sådan immunopræcipitationsbestemmelse med human ben-30 muskel AChR mærket med ll5I-mærket a-bungarotoksin, som en funktion af logaritmerne (til basis 10) af anti-AChR-autoantistofkoncentrationer, i nM, i de samme seTa, som bestemt ved en bestemmelsesmetode, som var den samme bortset fra erstatning DK 172659 B1 5 af human benmuskel AChR med AChR fra celler fra TE671 -linien også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under deponerings-nummeret CRL 8805.

Fig. 2 belyser dataene fra immunobestemmelseme for anti-AChR-autoantistof i 5 serum hos forskellige myasthenia gravis patienter, under anvendelse af AChR fra celler fra TE671-linien, også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under deponermgsmimmeret CRL 8805, som det fastfasebund-ne antigen og ‘^I-mærket gedeantihumant IgG til detektion af antigenbundet autoantistof.

10 DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

I ét aspekt anviser den foreliggende opfindelse fremgangsmåder af den i indledningen til krav 1 og 2 angivne art til diagnosticering af myasthenia gravis. Disse fremgangsmåder er ejendommelige ved, at AChR er afledt af celler fra TE671-linien, også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under 15 deponeringsnummeret CRL 8805.

Som anført ovenfor afhænger de i de ovennævnte patenter citerede bestemmelser og fremgangsmåder af immunpræcipitation af mærket AChR kompleksbundet med anti-AChR-autoantistof i serum fra en person, der lider af myasthenia gravis. Mærket på AChR er en radioaktiv mærkning, fortrinsvis et125I-mærket, curaremimetisk 20 neurotoksin, som binder med høj affinitet i ACh-bindingsstedet hos AChR. Curaremi-metiske toksiner, der kan anvendes til at mærke AChR, er naturligt forekommende proteiner, der findes i forskellige giftige reptiler, såsom cobraer og havslanger.

Mange sådanne toksiner er blevet isoleret og sekvensbestemt. Se f.eks. Karlsson,

Handbook of Experimental Pharmacology 52, 159-212 (1979). De foretrukne toksi-25 ner til mærkning er de såkaldte "lange neurotoksiner" som beskrevet af Karlsson, supra. Mest foretrukket er α-bungarotoksin fra Bungarus multicinctus.

AChR, som er velegnet til diagnosticering af myasthenia gravis ved immunobestem-melser af anti-AChR-autoantistoffer i humant serum, fremstilles ved dyrkning af celler fra TE671-linien, også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er 30 deponeret ved ATCC under deponeringsnummeret CRL 8805, og præparater af sådant AChR, som er egnet til anvendelse ved sådanne immunobestemmelser ud fra celler fra TE67l-liniekultureme, også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en DK 172659 B1 6 kultur er deponeret ved ATCC under deponeringsnummeret CRL 8805, tilvejebringes.

Dyrkningen af celler fra TE671-limen, også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under deponeringsnummeret CRL 8805, og opnå-5 else af præparater af AChR derfra, er beskrevet i nedenstående eksempler.

Med "celler fra TE671-linien" menes i den foreliggende beskrivelse (i) celler, som er fra en kultur af en hvilken som helst TE671 -cellelinie, herunder en kultur af undereller sublinie nr. 2 og inkluderende kulturer af nævnte sublinie, som er deponeret ved ATCC under deponeringsnummer CRL 8805 den 16. maj 1985, eller (ii) celler af 10 en subkultur af en hvilken som helst kultur, der er specificeret i (i) eller (iii) mutanter af en hvilken som helst af cellerne, der er specificeret i (i) eller (ii) forudsat, at nævnte celler (under (i), (ii) og (iii)) danner AChR, som til praktiske formål ved immunobestemmelser er immunologisk essentielt det samme som human muskel AChR. Med "subkultur" menes en kulturvækst fra celler af en kultur (kildekultur) 15 eller en hvilken som helst subkultur af kildekulturen uafhængig af antallet af subdyrk-ninger mellem subkulturen, der har interesse, og kildekulturen. Cellemutanter, der er specificeret i punkt (i) og (ii) af definitionen af "celler fra TE671-linien", omfatter mutanter som dannes spontant eller ved human intervention, f.eks. ved gentagne passager, kemisk behandling, bestråling, cellefusion, transformation, transfektion, 20 mikroinjektion af nukleinsyre i cellekerner og lignende.

I eksempel Π er der belyst en metode til etablering af, at et AChR til praktiske formål ved immunobestemmelser er immunologisk essentielt det samme som human muskel AChR. Dette kriterium etableres generelt, hvis de antistoffer mod humant muskel AChR i human sera er meget krydsreaktive (i en udstrækning på mindst 50%) med 25 det AChR, der er af interesse. Hvorvidt kriteriet opfyldes kan fastslås ved at afprøve både human muskel AChR og det AChR, der er af interesse, med et batteri af mono-klonale antistoffer, som vides at være reaktive mod antigene determinanter på et eller det andet af AChR'eme. Hvis alle eller næsten alle (dvs. mere end 9 ud af 10) af de antigene determinanter svarende til de monoklonale antistoffer findes ved under-30 søgelsen at være på begge AChR kan det konkluderes, at til praktiske formål ved immunobestemmelser kan AChR’eme immunologisk ikke skelnes fra hinanden (dvs. i alt væsentligt ens). Denne høje grad af krydsreaktivitet med monoklonale antistoffer, som karakteriserer sådanne immunologisk ikke-skelnelige AChR’er, indebærer også, at efter korrektion for eventuelle kendte ikke-immunologiske fak- DK 172659 B1 7 torer, såsom forskelle i affinitet for mærket toksin ved immunpræcipitationsbestem-melsen, der er beskrevet i de ovennævnte patenter, titeren af anti-AChR-antistof i en serumprøve, som bestemt ved en immunobestemmelse med human muskel AChR ikke vil være mere end 25 % (plus eller minus noget på grund af uundgåelig forsøgs-5 unøjagtighed) større end titeren med AChR fra celler fra TE671 -linien. Sammenhængen mellem anti-AChR-antistoftitere bestemt med to AChR'er kan let bestemmes ved at sammenligne titeme bestemt ved immunpræcipitationsbestemmelser i overensstemmelse med de oven for citerede patenter og belyst i eksempel H, med mindst 10 sera, som varierer over mindst en størrelsesorden af deres anti-AChR-antistof-titere.

10 AChR fra celler fra kulturerne fra TE671-linien, sublinie 2, deponeret ved ATCC under deponeringsnummer CRL 8805 den 16. maj 1985 kan for praktiske formål i immunoassays, immunologisk ikke skelnes fra human muskel AChR. Som belyst af de i fig. I afbildede data efter korrektionen for forskelle i affinitet for toksin (se eksempel Π) er krydsreaktiviteten af anti-AChR-autoantistoffer i human serum for 15 AChR fra celler af sådanne kulturer og AChR fra human benmuskel inden for forsøgsfejlen virkelig næsten 100%, og AChR'eme fra disse to kilder er udskiftelige ved imraunobestemmelser af sera til diagnosticering af myasthenia gravis i personer, der lider deraf.

Ifølge opfindelsen anvises endvidere en fremgangsmåde til diagnosticering af myaste-20 nia gravis ved fastfaseimmunobestemmelser for autoantistoffer i serum mod human muskel AChR, idet der som antigen anvendes AChR afledt af celler fra TE671-linien, også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under deponeringsnummeret CRL 8805. Immunobestemmelser for anti-AChR-autoantistoffer, som ikke tidligere kunne anvendes på grund af stor 25 vanskelighed og store omkostninger til opnåelse af tilstrækkelige mængder af human muskel AChR, er gjort let tilgængelige ved tilgængeligheden af AChR fra nævnte TE671-celler. Fastfaseimmunobestemmelser gennemføres med AChR fra celler fra TE671-Linien, også benævnt celler fra sublime nr. 2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under deponeringsnummeret CRL 8805, i overensstemmelse med 30 metoder, der kendes i fastfaseimmunobestemmelsesteknikken.

Den foreliggende opfindelse angår desuden et substrat af den i krav 5 og 6 angivne art.

8 DK 172659 B1

Et "substrat" for fastfaseimmunobestemraelsen fremstilles ved at binde AChR covalent eller ikke-covalent til en fast bærer ved hjælp af en af adskillige i immuno-bestemmelsesteknikken kendte metoder. Blandt de faste bærere, der kendes i teknikken, som kan anvendes, er de, der er fremstillet af polyethylen, polypropylen, 5 polybutylen, polystyren, polymethacrylat, polyacrylamid, andre syntetiske polymere materialer, hvortil AChR kan bindes, glas, nitrocellulose, cellulose og agarose. Den faste bærer kan være en "makroporøs" geltypebærer, således som den dannes af f.eks. visse agarosematerialer (f.eks. Sephacryl S-500 fra Pharmacia, Inc.,

Piscataway, N.J. U.S.A.). Den faste bærer kan have form af mikropartikler, såsom 10 mikrokugler eller perler (f.eks. "latex"-perler) eller kan være den indvendige væg af et rør, såsom et mikrofugerør eller en brønd af en mikrotiter eller Millititerplade.

Den faste bærer med AChR bundet, efter passende vask og inkubering med materialer til reduktion af baggranden ved hjælp af blokeringsteder på bæreren, der ikke er optaget af AChR, således som det forstås i teknikken og efter eventuel forinkubation 15 med et stof (såsom curaremimetisk neurotoksin, en lille cholinergisk ligand eller et antistof), som blokerer visse epitoper på AChR, inkuberes med serum eller mere almindeligt en fortynding deraf i en passende puffer, som belyst i eksempel ΠΙ og ellers forstået i teknikken. Før inkubation med det fastfasebundne AChR kan serumet (eller fortyndingen) eventuelt blandes med et stof (såsom en curaremimetisk neuro-20 toksin, en lavmolekylær cholinergisk forbindelse eller et antistof) ved koncentrationer, som er tilstrækkelige til at bekæmpe eventuel autoantistof i serumet fra binding til visse epitoper på AChR'et. Autoantistof i serumet mod epitoper på AChR, som ! ikke er blokeret med sådanne epitopblokerende stoffer, som kan anvendes, vil binde til AChR. Efter passende vask, som forstået i teknikken, påvises det autoantistof, som 25 er bundet til AChR, ved inkubation med et mærket anti-autoantistof eller mærket protein A fra Staphyloccocus aureus eller et hvilket som helst protein eller andet stof, som er mærket til detektion og vil binde til autoantistof men ikke signifikant til andre stoffer i systemet.

Mærket anti-autoantistof anvendes fortrinsvis til detektion. Det mærkede anti-auto-30 antistof vil typisk blive tilvejebragt som mærket, polyklonalt and-humant IgG.

Polyklonale subgruppespecifikke anti-immunoglobuliner, såsom anti-humant IgGl eller anti-humant IgM eller anti-humant immunoglobulin, som ikke er specifikt for en speciel klasse eller subklasse, kan også anvendes. De antisera, som anvendes til detektion, vil typisk være fra ged, kanin, rotte eller mus, selvom andre ikke-humane 35 pattedyrsarter også kan anvendes som kilden.

DK 172659 B1 9

Hvis fastfaseimmunobestemmelsen er en ELISA, vil mærket på det anti-huraane immunoglobulin, S. aureus protein A eller andet stof, der er bundet til anti-AChR-autoantistof være et enzym, såsom en syre eller alkalisk phosphatase, en peroxidase eller en β-galactosidase, og detektionen vil ske ved hjælp af et produkt, 5 der dannes ved en reaktion, der er katalyseret ved enzymmærkningen, således som det kendes i teknikken.

Hvis fastfaseimmunobestemmelsen ikke er en ELISA, og der er et mærke på anti-immunoglobulinet, S. aureus protein A eller andet stof, vil mærket sædvanligvis være forskelligt fra et enzym. Sådanne ikke-enzymmærker omfatter radioaktive atomer, 10 chromoforer eller fluoroforer og biotin; detektionsmetoder for hver af disse mærker såvel som andre mærker, der kendes i teknikken, som også kan anvendes, kendes i teknikken. 12iI-mærkning foretrækkes.

I et andet alternativ detekteres AChR med anti-AChR-autoantistof bundet og med umærket anti-autoantistof også bundet ved inkubation med mærket S. aureus protein 15 A efterfulgt af detektion af mærket på protein A. Mærket på protein A kan være et enzym eller en hvilken som helst af de andre mærker, der beskrevet ovenfor eller ellers findes i teknikken.

Anti-AChR-autoantistoffer fra en patient, der lider af myasthenia gravis karakteriseres i overensstemmelse med titere af fraktioner af sådanne autoantistoffer, som 20 binder til forskellige undersæt af epitoper på AChR. Denne metode omfatter gennemførelse af mindst to af fire fastfaseimmunobestemmelser på serumet fra en patient, hvilke immunobestemmelser er i alt væsentligt de samme, bortset fra at en er med fastfasebundet AChR alene, en med fastfasebundet AChR inkuberet med et monoklonalt antistof (f.eks. inAb 35) til den immunogene hovedregion enten før eller 25 samtidig med inkubation med en serumprøve; en med fastfasebundet AChR inkuberet før eller samtidig med inkubation med en serumprøve, med et curaremimetiskneuro-toksin og en med fastfasebundet AChR inkuberet før eller samtidigt med inkubation med en seramprøve med en lavmolekylær forbindelse (f.eks. nikotinisk cholinergisk ligand, såsom carbamoylcholin), som binder tæt ind i ACh-bindingsstedet, men ikke 30 ligesom neurotoksineme blokerer nabosteder. Undersøgelserne med AChR alene vil give information om titeren af alle autoantistoffer til epitoper på AChR. Prøven sammen med det monoklonale antistof til den immunogene hovedregion vil give information om titer af autoantistoffer til epitoper uden for den immunogene hovedregion af AChR. Prøven sammen med den curaremimetiske neurotoksin vil give DK 172659 B1 10 information om titeren af autoantistoffer til epitoper uden for ACh-bindingsstedet og nabosteder blokeret af toksinet. Endelig vil prøven sammen med den lavmolekylære forbindelse, som binder i ACh-bindingsstedet give information om titeren af autoantistoffer til ACh-bindingsstedet selv. Ved disse bestemmelser gennemføres inku-5 bationen af det epitop-blokerende sted sædvanligvis med AChR ved at kombinere det I blokerende stof med serumprøven, som inkuberes med immunobesteramelsessubstra- I tet (dvs. fast bærer med AChR bundet) ved en tilstrækkelig høj koncentration i prø ven til at udkonkurrere i binding næsten alt autoantistof i prøven, som måtte binde til den samme epitop eller de samme epitoper, som de blokerende stoffer.

10 Som angivet ovenfor er basis for fastfaseimmunobestemmelseme et substratmateriale, hvortil AChR, der er afledt af celler af TE671-linien, også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under deponeringsnummeret CRL 8805, komplekst bundet ved covalent eller ikke-covalent binding. Disse fastfase-substrater med AChR kompleksbundet er også en del af den foreliggende opfindelse.

15 Disse substrater fremstilles ved hjælp af midler, der kendes i teknikken til fastgørelse af et antigen til en fast bærer på en måde, som er egnet til fastfaseimmunobestem-melse for antistof mod antigenet.

AChR fra celler fra TE671-linien, også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under deponeringsnummeret CRL 8805, letter frem-20 stillingen af sæt til diagnose af myasthenia gravis. Sådanne sæt af den i krav 8 og 9 angivne art er også omfattet af den foreliggende opfindelse. Nævnte sæt omfatter AChR fra celler fra TE671-linien, også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under deponeringsnurnmeret CRL 8805, og en fast bærer, hvortil AChR kan fastgøres til fremstilling af et substrat ifølge opfindelsen.

25 Sættene kan eventuelt omfatte et substrat ifølge opfindelsen (dvs. en fast bærer, hvortil der allerede er fastgjort AChR fra celler af TE671 -linien, også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under deponeringsnummeret CRL 8805). Sættene ifølge opfindelsen kan også omfatte andre komponenter, som er nødvendige til en fastfaseimmunobestemmelse af en patient’s serum for 30 anti-AChR-autoantistoffer, såsom f.eks. ligander eller monoklonale antistoffer, som blokerer dele af AChR fra binding ved hjælp af anti-AChR-autoantistof (hvis sættet skal anvendes i en bestemmelse til at karakterisere stederne på AChR, hvortil auto-antistof binder), puffere, anti-human IgG-mærket til detektion og andre komponenter, som belyst i eksempel ΠΙ, og som ellers forstås i fastfaseiramunobestemmelsesteknik-35 ken.

DK 172659 B1 u

Opfindelsen beskrives nærmere i de følgende eksempler.

EKSEMPEL I

DYRKNING AF CELLER FRA TE671-LINIEN

5 En hvilken som helst teknik, som kendes til dyrkning af pattedyrsceller kan anvendes til dyrkning af celler af TE671-linien.

En foretrukket teknik til dyrkning af TE671-celler er at anvende "Iscove's modified Dulbecco's minimal essential" medium (Irvine Scientific, Santa Ana, California) indeholdende 10% føtal bovin serum i en atmosfære af 90% luft og 10% C02 ved 10 37°C.

Små volumener dyrkes i 35 mm skåle under anvendelse af et innoculum på 3 x 105 celler i 1,5 ml medium. Efter tre dage udskiftes mediet og optimalt AChR-udbytte opnås den 6. eller 7. dag.

Til store volumener anvendes plastrulleflasker (Falcon Labware, Becton Dickinson, 15 Inc., Oxnard, Californien U.S.A.). I tilfælde at 850 cm1 flasker podes 3 x 10T celler i 150 ml medium, hvorimod der til 1750 cm2 podes 6 x 107 celler i 300 ml medium.

Mediet skiftes den 5. dag, og AChR-udbyttet er optimalt den 9. til 10. dag.

EKSEMPEL Π

ISOLERING OG KARAKTERISERING AF ACETYLCHOLINRECEPTOR FRA 20 CELLER AF TE671 -LINIEN OG ANVENDELSE AF NÆVNTE RECEPTOR VED IMMUNPRÆCIPITATIONSBESTEMMELSER

ACER er typisk blevet isoleret fra kulturerne fra seks eller syv 850 cm2 rulleflasker ad gangen, selvom meget større volumener kultur let kan behandles samtidigt. Den følgende metode er blevet anvendt rutinemæssigt til isolering af AChR fra kulturer 25 af celler af TE671-linien, sublinie nr. 2, hvoraf prøver er deponeret ved ATCC under deponeringsnr. CRL 8805: 12 DK 172659 B1

Til hver 850 cm2 flaske af kultur sættes dag 9 eller 10 efter vækst, som beskrevet i eksempel I, 25 ml udvmdingspuffer (100 mM NaCl, 10 mM Na-phosphat-puffer, 10 mM NaN3, 15 mM EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre), 2 mM PMSF (phenyl-methan-sulfonylfluorid), 15 mM IAA (jodeddikesyre) og 5 mM benzamidin, pH 5 7,5). Flaskerne rystes derpå kraftigt, indtil cellerne frigøres fra plasten. Pufferen og celler opsamles i en flaske på is, og rulleflaskeme skylles fra flaske til flaske med yderligere 100 ml udvindingspuffer, som derpå forenes med resten. En Polytron homogenisator anvendes derpå til at nedbryde cellerne i 15 sekunder med en hastighed, som er netop under den hastighed, hvor der sker skumning. Membraner og 10 andre partikelformede stoffer opsamles ved centrifugering af homogenisatet i 30 minutter ved 45.000 o/m i en Beckman Ti50.2 rotor (Beckman Instruments, Inc.,

Spinco Division, Palo Alto, California, U.S.A.) (302.000 x g) ved 4°C. Der udvindes typisk ca. 1,5 g bundfald per 850 cm2 flaske. Bundfaldet anbringes i fire volumener ekstraktionspuffer (10 mM natriumphosphat, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA 15 (ethylenglycol, bis-(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraeddikesyre), 5 mM ΓΑΑ, 5 mM benzamidin, 2 mM PMSF, 2% Triton X-100, pH 7,5) og suspenderes moderat med Polytronen i 15 sekunder. Efter ekstraktion i 30 minutter med moderat omrystning ved 4°C centrifugeres præparatet som før. Det øverste lag indeholder typisk ca.

1,1 x 108 M AChR i et udbytte pa ca. 6,6 x 10 " mol per 850 cm2 flaske. Et 20 sammenligneligt råekstrakt af hakket muskelvæv indeholder kun ca. 2 x 10"10 M til ca. 2 x 10'9 M AChR og almindeligvis mindre end 1 x 10"9 M.

Immunpræcipitationsforsøg blev gennemført på sera fra 45 patienter i alt væsentligt som beskrevet i de oven for citerede patenter under anvendelse af 2 nM AChR ffa 2% Triton X-100 ekstrakter (som beskrevet ovenfor i dette eksempel) af enten 25 TE671-celler eller muskel fra amputeret menneskeben. Koncentrationen af AChR i TE671-celleekstrakten blev reduceret til 2 nM ved fortynding med assaypuffer (l OO mM NaCl, 10 nM natriumphosphatpuffer, lOmMNaNj, 0,5% Triton X-100, pH ! 7,5). Den anvendte muskelekstrakt var en sjælden ekstrakt, hvori koncentrationen af AChR nåede ca. 2 nM og blev anvendt uden fortynding. Mere typisk ville koncen-30 trationen af AChR i muskelekstrakteme have været signifikant lavere og ville være blevet forøget ved en standardteknik (f.eks. under anvendelse af en Amicon-koncen-trator (Amicon, Danvers, Massachusetts, U.S.A.) indtil AChR-koncentrationen nåede 2 nM.

Disse AChR blev mærket ved at kombinere AChR-opløsningeme med en mængde af 35 en 2-mikromolær opløsning af ,23I-mærket α-bungarotoksin i natriumphosphatpuffer, DK 172659 B1 13 pH 7-7,5, for at bringe den ,25I-mærkede α-bungarotoxinkoncentration op på 4 nM og derpå inkubere den resulterende opløsning i 4 timer ved 4° C.

Analyser blev gennemført i triplikat på forskellige fortyndinger, idet man undersøgte assaypuffere af hver serum. Supplementær normal human serum blev sat til hver 5 prøve, således at der var i alt 5 mikroliter serum i den endelige reaktionsblanding.

Formålet med fortyndingerne er at bringe koncentrationen af anti-AChR-autoantistof fra en serum, der undersøges, inden for det målelige område for bestemmelsen og fortrinsvis inden for et sådant område, at 10-20% af det mærkede AChR i en bestemmelses-opløsning er kompleksbundet med anti-AChR-autoantistof. De anvendte 10 fortyndinger kan variere meget, men vil blive bestemt ved at tage højde for koncentrationen af mærket AChR i bestemmelsesopløsningen, hvormed serumprøver kombineres og den kendsgerning, at anti-AChR-autoantistoffer i sera fra personer, der lider af myasthenia gravis kan være så høj som ca. 1500 nM. Den supplementære normale serum tilsættes således at den samlede mængde immunoglobulin i hver prøve 15 er omtrent den samme.

Hver af de tre prøver af hver fortynding af hvert testserum blev kombineret med 100 mikroliter af den mærkede AChR-opløsning (2 nM), og kombinationen blev inkuberet natten over ved 4°C. Derpå blev 100 mikroliter gede-anti-human-IgG (ved en koncentration, der er tilstrækkelig til at præcipitere alt IgG i 5 mikroliter serum) 20 tilsat, og den resulterende opløsning inkuberet i 30 minutter ved 4°C til præcipi-tering af alt det humane serum-IgG. Efter tilsætning af 1 ml bestemmelses-puffer blev opløsningen centrifugeret i 2 minutter ved 10.000 X g ved 20° C. Supematanten blev afsuget, og bundfaldet vasket to gange, hver gang med l ml bestemmelses-puffer ved behandling i en vortexmaskine efterfulgt af 2 minutters centrifugering ved 10.000 25 Xgog20°C og afsugning af supernatant. Til slut blev,2SI i bundfaldet bestemt ved γ-tælling ved hjælp af en standardteknik.

En blindprøve opnået under anvendelse af 5 mikroliter normalt serum blev trukket fra mængden, der blev bestemt for hver prøve.

Resultaterne af dette forsøg er belyst i fig. I. I figuren er logaritmen af serurokoncen-30 trationen af anti-AChR-antistof, der kan udskilles ved hjælp af anti-IgG, bestemt med human benmuskel AChR, afbilledet som en funktion af logaritmen af den samme koncentration bestemt med det TE671-celle-afledte AChR. Forskellen mellem ligheden af disse to koncentrationer for hver prøve er der gjort rede for ved forsøgs- DK 172659 B1 14 fejl i besteramelsesprocedureme, og anførte forskelle mellem dissociationskonstanten af α-bungarotoksin, der er kompleksbundet med AChR fra human muskel (1,8 x 10'10 M, Luky og Morgan-Hughes, Ann. N.Y., Acad. Sci. 377, 61 (1981)) og af α-bungarotoksm, der er kompleksbundet med AChR fra celler af ΊΓΕ671 -linien, 5 sublime nr. 2 (1,4 x ΙΟ'9 M, Syapin et al., supra). Resultaterne af forsøget viste, at semmautoantistoffer mod AChR fra human muskel er mere end 70% kryds-reaktiv med AChR, som blev afledt af TE671-celler, og at dl praktiske formål i iramuno-bestemmelser kan disse AChR fra de to kilder anvendes vekselvis.

Som yderligere underbygning og konklusionen, at disse AChR fra de to kilder er 10 immunologisk ens, i det mindste i forbindelse med immunobestemmelser, har sammenligninger mellem AChR fra human benmuskel med AChR fra celler fra TE671 -linien under anvendelse af rnonoklonale andstoffer ikke identificeret nogen antigenisk determinant på det benrauskelafledte AChR, som ikke også er på det ΤΈ671-celle-afledte AChR.

15 EKSEMPEL ΠΙ

ANVENDELSE AF ACETYLCHOLINRECEPTOR FRA CELLER AF TE671-LINIEN VED FASTFASE1MMUNOBESTEMMELSER FOR AUTOANTISTOFFER I SERUM MOD HUMAN MUSKELACETYLCHOLINRECEPTOR

(A) Fremstilling af fastfase med AChR fastgjort dertil.

20 Ved at følge fremgangsmåden, der er beskrevet i eksempel Π, men anvende otte volumener i stedet for fire volumener ekstraktionspuffer i forhold til volumenet af bundfald, blev der opnået 75 ml Triton X-100 ekstrakt af AChR fra kulturer af celler af TE671-linien, sublinie nr. 2, af hvilket prøver er deponeret ved ATCC under deponeringsnr. CRL 8805 den 16. maj 1985. AChR af ekstrakten blev derpå 25 affinitets-renset på toksin-agarose efterfulgt af proceduren ifølge Lindstrom et al.,

Methods in Enzymology 74C, 432-459 (1981) som følger:

Triton X-100-ekstrakten indeholdende ca. 5,9 x 10'9 M AChR blev natten over recirkuleret ved 4°C gennem en 3 ml søjle af toksin-agarose (0,5 mg Naja naja siamensis toxin ΙΠ per ml Sepharose C14B (Pharmacia, Inc., Piscataway, New 30 Jersey, U.S.A.)) med en hastighed på 42 ml per time. (Forbedret binding af TE671 AChR med dets tilsyneladende lave affinitet for toksinet kunne sandsynligvis være DK 172659 B1 15 blevet opnået ved anvendelse af en affmitetskolonne indeholdende 5-10 mg/ml toksin). Kolonnen blev derpå vasket med 10 ml 0,1% Triton Χ-Ι00 i 10 nM natriumphosphatpuffer, pH 7,5. Eluering af AChR blev opnået ved anvendelse af 1 M carbamylcholin i elueringspuffer (0,1% Triton X-100, 100 mM NaCl, 10 mM 5 NaNj, 10 ml natriumphosphat, pH 7,5) recirkuleret i særskilte 3 ml prøver ved 4°C i 8 timer, derpå 18 timer og til slut 36 timer. De tre eluater blev derpå forenet og dialyseret ved 4°C mod elueringspuffer til fjernelse af carbamylcholin. Under disse betingelser blev 0,226 nmol AChR af de tilførte 0,44 nmol bundet, og i alt 0,01 nraol blev elueret i 8,1 ml af en 13,8 nM opløsning, 10 AChR-koncentrationen bestemmes ved iramunprædpitation af AChR mærket med li5I-mærket-a-bungarotoksra (Lindstrometal., supra). Bestemmelsen kan gennemføres med et polyklonalt anti-AChR-antiserum, f.eks. fra kanin, mus eller rotte med serum fra en myasthenia gravis patient med en høj serumtiter af anti-AChR-autoantistof eller med et anti-AChR-monoklonalt antistof, såsom mAb 35 eller mAb 15 64!

Det rensede AChR blev bundet til brønde af en Millipore Millititer-HA 96 brønd-Filtreringsplade (Millipore, Bedford, Massachusetts, U.S.A., Cat. No. STHA096NS) ved at tilføre 30 mikroliter aliquoter natten over ved 4° C (mere end 400 fmol AChR kan bindes per brønd). Yderligere binding blev derpå stoppet ved tilsætning af 50 20 mikroliter stoppuffer (eng: quench buffer) (3% bovin seram albumin (BSA), 0,2%

Tween-20, 100 mM NaCl, 10 mM NaN„ 10 mM natriumphosphat, pH 7,5) og henstillet i 2 timer ved 4eC. Hele væsken blev derpå fjernet under anvendelse af en Millipore Millititer Vacuum Holder (Millipore Cat. No. XX 28096 00). Derpå blev en prøve af et testseram (fortyndet passende til 30 mikroliter med stoppuffer) sat til 25 hver brønd og henstillet i 4 timer ved 4°C. Efter fjernelse af væsken som før, blev brøndene vasket to gange med 300 mikroliter af stoppuffer. Derpå blev iaI-mærket affinitetrenset gede-anti-humant IgG (30 mikroliter af en 1 x 10 * M opløsning i stoppuffer) sat til brøndene og henstillet i 2 timer ved 4eC. Efter fjernelse af denne væske og vask to gange med 300 mikroliter stoppuffer blev filtrene skåret ud af 30 brøndene (under anvendelse af en Millipore filterskærer, Millipore Cat. No. XX 28096 20) og anbragt i en γ-tæller til γ-tælling ved hjælp af en standardteknik.

Normal human serum fortyndet i stoppuffer blev anvendt som kontrol, og værdier for γ-emission, der reflekterer binding af anti-AChR-autoantistof til AChR i testprøver blev opnået ved at subtrahere de passende normale seramværdier fra værdierne, der 35 blev opnået for testprøveme. De data, som blev opnået under anvendelse af dette DK 172659 B1 16 assay, er vist i fig. 2, hvori ordinaten er i enheder af værdier per minut (cpm) fra γ-emission og abscissen er i enheder af mikroliter af undersøgt testserum.

På basis af standarder, hvori normal human IgG tilføres til brøndene i stedet for AChR og γ-emissionen fra 12iI-mærket anti-human IgG bundet til normal human IgG 5 måles, kan koncentrationen af myasthenia gravis patientserum-autoantistoffer mod AChR beregnes udtrykt i gram eller mol af autoimmun IgG/1 patientserum fra γ-emissionsdataene, opnået som beskrevet ovenfor. Resultaterne kan også blive normaliseret til værdier opnået under anvendelse af immunopræcipitationsbesteramel-sen, der er belyst i eksempel Π. I stedet for udelukkende at anvende anti-IgG til 10 påvisning af autoantistof bundet til AChR kunne anvendes mærket subklasse-specifik antisera og derved bestemmes subklassefordelingen af autoantistoffeme.

Tilsyneladende bevarer ca, halvdelen disse AChR, som binder til tnillititerpladebrøn-dene, deres evne til at binde ,25I-mærket α-bungarotoksin. Fraktionen af autoantistoffer i en patients serum, som er rettet mod eller nær ACh-bindingsstedet kan 15 således blive bestemt ved at gennemføre to aminobestemmelser på serumet: en, som beskrevet ovenfor, og en, hvori AChR, der er bundet til brønde, inkuberes med serumprøver, som omfatter et overskud af α-bungarotoksin (eller lignende toksin) eller en lille cholinergisk ligand, såsom carbamylcholin, dl bekæmpelse af binding ved toksin eller cholinergisk ligand bindingssteder af i alt væsentligt hele 20 mængden af eventuelt autoantistof i serumet, som binder til sådanne steder. Fra resultaterne af de to bestemmelser kan fraktionen af autoantistoffer, som inhiberes fra binding til AChR ved hjælp af toksinet eller den cholinergiske ligand bestemmes.

Denne fraktion er eller er nærved fraktionen af autoantistoffer, der er rettet mod eller nær ACh-bindingsstedet. På lignende måde kan fraktionen af autoantistoffeme, der 25 er rettet mod den immunogene hovedregion af AChR bestemmes ved bestemmelse af fraktionen, som inhiberes mod fra binding til AChR ved inkubation af det AChR, der er bundet til brøndene med serum, der er kombineret med et overskud af et . monoklonalt antistof til en immunogenisk hovedregion af AChR, såsom rottemono- ' klonalt antistof mAb 35.

30 DEPONERINGER AF CELLELINIER

Kulturer af TE671-cellelimen (sublimen nr. 2) og hybridomalinieme mAb 35 (som danner monoklonalt antistof mAb 35) og mAb 64 (som danner monoklonalt antistof mAb 64) blev før 6. januar 1986 deponeret ved American Type Culture Collection,

Claims (9)

10 Selvom den foreliggende opfindelse er blevet beskrevet heri med nogen nøjagtighed, vil fagfolk genkende adskillige modifikationer og variationer, som hører inden for opfindelsens omfang. Disse modifikationer og variationer falder inden for opfindelsens omfang, som beskrevet og gjort til genstand for krav heri. 15 ---------------------------

1. Fremgangsmåde til diagnosticering af myasthenia gravis, hvor der som en komponent anvendes et kompleks af AChR med toksin, der er mærket med en radioaktiv isotop, kendetegnet ved, at AChR er afledt af celler fra TE671-linien, også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under 20 deponeringsnummeret CRL 8805.

2. Fremgangsmåde til diagnosticering af myasthenia gravis, hvor man fremstiller et kompleks af AChR, toksin og en radioaktiv isotop, hvilket kompleks inkuberes med en serumprøve fra en patient, således at antistoffer fremkaldt i forbindelse med myasthenia gravis forenes med komplekset, udfælder det med antistoffet forenede 25 kompleks med anti-immunoglobulin og måler udfældningens radioaktivitet, kendetegnet ved, at AChR er afledt af celler fra TE67l-linien, også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under deponerings-nummeret CRL 8805.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, k e n d e t e g n e t ved, at det radio-30 aktivt mærkede toksin er et curaremimetisk neurotoksin mærket med ,25I. DK 172659 B1 18

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at toksinet er a-bun-garotoksin.

5. Substrat til anvendelse til imraunobestemmelse i fast fase af serum for myasthenia gravis-forbundne anti-AchR-autoantistoffer, kendetegnet ved, at 5 substratet er kompleksbundet med AChR fra celler af TE671-linien, også benævnt celler fra sublinie nr.2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under deponerings-nummeret CRL 8805.

6. Substrat ifølge krav 5, k e n d e t e g n e t ved, at det er en del af indervæg-gen i et rør eller en brønd af en millititer eller en mikrotiterplade.

7. Fremgangsmåde til diagnosticering af myasthenia gravis, omfattende en immuno- bestemmelse i fast fase af antistoffer i en persons serum mod AChR, kendetegnet ved, at AChR anvendt ved immunobestemmelse er afledt af celler fra TE671 -linien, også benævnt celler fra sublinie nr. 2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under deponeringsnurameret CRL 8805. 15 8. Sæt til diagnosticering af myasthenia gravis ved hjælp af immunobestemmelse i fast fase af serum af myasthenia gravis-associerede anti-AChR-autoantistoffer, kendetegnet ved, at sættet omfatter AChR afledt fra celler af TE671 -linien, I også benævnt celler fra sublinie nr.2, hvoraf en kultur er deponeret ved ATCC under deponeringsnummeret CRL 8805, og en fast bærer, til hvilken nævnte AChR kan 20 fæstnes til fremstilling af et substrat til immunobestemmelsen i fast fase.

9. Sæt ifølge krav 8, kendetegnet ved, at AChR er fastgjort til den faste bærer.