ES2276179T3

ES2276179T3 - Procedimiento para la determinacion del efecto hormonal de sustancias mediante la interacion entre el receptor de androgenos y la proteina del sarcoma de ewing.

Info

Publication number: ES2276179T3
Application number: ES04003422T
Authority: ES
Inventors: Maik Dr. Obendorf; Siegmund Dr. Wolf
Original assignee: Bayer Schering Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2003-03-04
Filing date: 2004-02-16
Publication date: 2007-06-16
Anticipated expiration: 2024-02-16
Also published as: EP1455190B1; JP3862703B2; US20040197827A1; ATE343795T1; JP2004271524A; DE502004001834D1; DK1455190T3; US7208283B2; PT1455190E; EP1455190A1

Abstract

Procedimiento para la determinación del efecto hormonal de sustancias, con las etapas de a. puesta en contacto de la proteína EWS o un derivado que tiene los aminoácidos 319 a 656 de la secuencia descrita en Seq. ID No. 1 con el receptor de andrógenos en una sustancia de ensayo, b. determinación de la influencia de la sustancia de ensayo sobre la fijación de la proteína EWS o del derivado de ésta y el receptor de andrógenos, o c. determinación de la influencia de la sustancia de ensayo sobre la actividad del receptor de andrógenos, no siendo llevado a cabo el procedimiento en el cuerpo humano o animal.

Description

Procedimiento para la determinación del efecto hormonal de sustancias mediante la interacción entre el receptor de andrógenos y la proteína del sarcoma de Ewing.

El invento se refiere a un procedimiento para la determinación del efecto hormonal de sustancias, así como a un procedimiento para la determinación de trastornos en el mecanismo de co-modulación del receptor nuclear de andrógenos. Además de esto, el invento se refiere a la utilización de la proteína del sarcoma de Ewing (EWS) o de derivados de EWS, que tienen los aminoácidos 319 a 656 de la secuencia descrita en Secuencia ID No. 1, así como de ácidos nucleicos que codifican a ésta/éstos.

En el caso de la evaluación de sustancias para una posible aplicación farmacéutica, es generalmente usual comprobar estas sustancias en cuanto a la existencia de un eventual efecto hormonal, en particular en cuanto a una actividad andrógena o antiandrógena posiblemente presente. En el caso de la administración de sustancias farmacológicamente eficaces son importantes los conocimientos acerca de sus efectos hormonales, en particular sus efectos andrógenos o antiandrógenos, para la evaluación de los eventuales efectos colaterales. Para la comprobación del efecto hormonal de sustancias, pasan a emplearse, por ejemplo, unos procedimientos en los que se mide la capacidad de las sustancias para fijarse a los receptores de hormonas y activar su actividad de transcripción.

Los conocimientos acerca de los efectos hormonales de sustancias, sin embargo, son interesantes no sólo en el caso de fármacos potenciales, sino también en el caso de sustancias no farmacéuticas, puesto que de muchas sustancias, presentes en el medio ambiente, se supone que ellas pueden tener en ciertas partes de la población una actividad andrógena o antiandrógena o respectivamente estrógena o antiestrógena. Posiblemente, se provoca de esta manera un indeseado efecto dañino.

Una dificultad especial se encuentra en la identificación y la caracterización de efectos sobre los efectos mediados por hormonas esteroides, puesto que las cascadas y redes de señales, que a fin de cuentas controlan la regulación de la transcripción mediada por las hormonas, están estructuradas en este caso de una manera especialmente compleja. La razón de esto se encuentra en la estructura muy similar de las secuencias dianas de ADN, a las que se fijan los diferentes receptores de hormonas esteroides después de una activación por un ligando. Esta da lugar a que los receptores nucleares, para la provocación de una respuesta deliberada, no pueden prescindir de la interacción con co-factores especiales, que entre otras cosas refuerzan la especificidad de la activación de la transcripción mediada por los receptores.

Para la identificación de sustancias, que actúan sobre determinadas vías de señales inducidas por hormonas, se necesitan por lo tanto sistemas y procedimientos de ensayo, que puedan averiguar deliberadamente la función de componentes individuales de la red celular de señales, para la mediación de efectos esteroidales.

Subsiste por consiguiente una necesidad de un procedimiento, con el que, de una manera confiable, sensible, sencilla, barata y rápida, se pueda realizar una declaración acerca del efecto hormonal de ciertas sustancias. Los procedimientos conocidos hasta ahora no la satisfacen.

El presente invento se basa por consiguiente en la misión de poner a disposición un procedimiento con el que, de una manera confiable, sensible, sencilla, barata y rápida, se pueda realizar una declaración acerca del efecto hormonal de las sustancias que se han de ensayar.

El problema planteado por esta misión se resuelve conforme al invento por medio de un procedimiento para la determinación del efecto hormonal de ciertas sustancias, que comprende las etapas de poner en contacto la proteína del sarcoma de Ewing (EWS) o un derivado que tiene los aminoácidos 319 a 656 de la secuencia descrita en Seq. ID No. 1, con el receptor de andrógenos y con una sustancia de ensayo, y de

a.: determinación de la influencia de la sustancia de ensayo sobre la fijación de la EWS o de su derivado y del receptor de andrógenos, o

b.: determinación de la influencia de la sustancia de ensayo sobre la actividad, inducida por un ligando, del receptor de andrógenos.

Como derivado de una proteína o respectivamente de un polipéptido se entiende, dentro del marco del presente invento, cualquier variante de la proteína o respectivamente del polipéptido, que se ha obtenido por deleción, sustitución, inserción, inversión, adición o intercambio de aminoácidos. En este contexto se prefieren los derivados que han mantenido la capacidad de la proteína o del polipéptido inalterada/o, p.ej. para influir sobre la actividad de otras proteínas o por lo menos para fijar a éstas (derivados funcionales).

El invento se basa en el sorprendente reconocimiento de que la proteína del sarcoma de Ewing así como los derivados que se derivan de ella, que abarcan los aminoácidos 319 a 656 de la secuencia descrita en Seq. ID No. 1 (en lo sucesivo designada como EWS), tienen la capacidad de interactuar con el receptor de andrógenos y modular la actividad de éste. Araya y colaboradores (JBC, 2003, volumen 278, 5427-5432) divulgan la interacción entre la EWS y el receptor nuclear HNF4 alfa.

La superfamilia de los receptores nucleares (NR's), a la que pertenecen más de 50 diferentes proteínas, es un conjunto de factores de transcripción afines, que regulan la transcripción del respectivo gen diana como reacción a ligandos específicos, p.ej. hormonas. La familia se puede subdividir, de acuerdo con determinadas características, tales como p.ej. el estado de dimerización, el tipo del ligando o la estructura del elemento de reacción a un ADN, en varias subfamilias (Beato y colaboradores, 2000, Human Reproduct. Update, 6, 225-236). Una particularidad característica de los NR's es la estructura coincidente de los dominios funcionales (con las denominaciones A hasta F) con una región terminal de N fuertemente variable, conservada sólo débilmente, que tienen una función autónoma de activación constitutiva (AF-1) con un dominio de fijación a ADN (DBD) fuertemente conservado, que es responsable del reconocimiento de elementos especiales de reacción a ADN, y se compone de dos motivos de dedo de zinc, de un dominio de bisagra variable y de un dominio de fijación a ligandos (LBD) terminal de C, multifuncional y conservado, con una función de transactivación (AF-2) dependiente de la dimerización y del ligando. A continuación de ésta, sigue la región situada más lejos en el extremo terminal de C, cuya función no es conocida, y que falta en el caso de receptores, tales como p.ej. el PR (receptor de progesterona), el PPAR (receptor activado por el proliferador de peroxisomas) y el RXR (receptor de retinoides X) (Mangelsdorf & Evans, 1995; Cell, 83, 841-850; Robyr y colaboradores, 2000, Mol. Endocrinol., 14, 329-347). Para algunos NR's (p.ej. el receptor de andrógenos (AR)) se comprobó que la región terminal de N está en situación de interactuar con la región terminal de C (Brinkmann y colaboradores, 1999, J. Steroid Biochem. and Mol. Biol., 69, 307-313). Los receptores de hormonas esteroides tales como p.ej. los receptores de estrógenos (ER), de progesterona (PR), de glucocorticoides (GR), de mineralocorticoides (MR) y de andrógenos (AR) fijan a ligandos esteroidales, que se derivan de la pregnenolona, tales como las progestinas, los estrógenos, los glucocorticoides y los mineralocorticoides, así como los andrógenos. La fijación a ligandos activa al receptor y regula la expresión de correspondientes genes dianas.

La EWS es conocida como proto-oncogén del sarcoma de Ewing y de otras neoplasias, tales como p.ej. de los sarcomas de células claras de tendones y aponeurosis, de los tumores intraabdominales desmoplásicos de células pequeñas y redondas, así como de los condrosarcomas extraesqueléticos (Delattre, O., Zucman, J., Plougastel, B., Desmaze, C., Melot, T., Peter, M., Kovar, H., Joubert, 1., de Jong, P., Rouleau, G., Aurias, A., y Thomas, G., 1992, Nature 359: 162-165, Zucman, J., Delattre, O., Desmaze, C., Epstein, A.L., Stenman, F., Speleman, F., Fletchers, C.D., Aurias, A., y Thomas, G.; 1993, Nature Genet, 4: 341-345, Gerald, W.L., Rosai, J. y Ladanyi, M., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1028-1032, Laballe, Y., Zucman, J., Stenman, G., Kindblom, L.G., Knight, J., Turc-Carel, C., Dockhom-Dwomiszak, B., Mandahl, N., Desmaze, C., Peter, M., Aurias, A., Delattre, O., y Thomas, G., 1995, Hum. Mol. Genet. 4: 2219-2226). En el caso de todos estos tumores, el locus (lugar) del gen de EWS es cambiado de disposición, de manera tal que el extremo de aminoácidos (terminal de N) de la proteína se fusiona con un dominio de fijación a ADN de FLI1, ERG1, ATF1 o WT1. Este extremo terminal de N de la proteína que se fusiona, contiene los exones 1-7 ó 1-8 ó 1-9 de EWS. Si el sitio de rotura se presenta entre el exón 7 y el exón 8, la porción de EWS de la proteína, que ha resultado mediante la fusión, no presenta coincidencias algunas con el dominio de fijación a receptores de andrógenos que aquí se ha definido. Por el contrario, si el sitio de rotura está situado entre los exones 8 y 9 ó 9 y 10, solamente 5 o respectivamente 20 aminoácidos de las dos proteínas de fusión de EWS oncogénicas coinciden con la porción de EWS, que contiene el dominio de fijación a receptores de andrógenos. A partir de esto hay que sacar la conclusión de que las proteínas de fusión de EWS cambiadas de disposición han perdido la capacidad para la fijación a receptores de andrógenos.

Al realizar el análisis de un ARN de timo mediante una RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa) se encontró una variante de EWS (EWS1-c), en la que faltaban 17 aminoácidos (Figura 3). Manifiestamente, en este caso se trata de una variante por empalme (splice), puesto que estaban presentes todas las necesarias secuencias de consenso junto a los sitios de costura entre intrones y exones. El resultado fue un acortamiento del exón 15 (exón 15b). En el estado de la técnica se conocen, además de esto, otras variantes por empalme. Una de ellas (Ohno, T., Ouchida, M., Lee, L., Gatalica, Z., Rao, V.N., y Reddy, E.S., 1994, Oncogene 9: 3087-3097) constituye un transcrito de EWS, acortado en 200 pb (pares de bases) (EWS1-b), y fue encontrada en linfocitos en reposo o estimulados por fitohemaglutinina (PHA). A la EWS1-b le faltan los exones 8 y 9. Otra variante distinta (Melot, T., Dauphinot, L., Sevenet, N., Radvanyi, F., Delattre, O., (2001), Eur. J. Biochem. 268, 3483-3489), contiene un exón 4' adicional entre los exones 4 y 5, y es designada como isoforma específica para el cerebro.

La EWS pertenece a un conjunto de proteínas que se fijan a ARN, a las que se les atribuye en el estado de la técnica una implicación en procesos de la síntesis o respectivamente del tratamiento de un ARN, junto a esto se conocía hasta ahora solamente poco acerca de la función fisiológica de la EWS de tipo salvaje somática. En particular, no se conocía en el estado de la técnica que la EWS posee la capacidad de fijarse a receptores nucleares y modular actividad de éstos, con lo que ella se ha de asociar a la clase de los co-moduladores de NR.

Una cepa de E. coli con la denominación Escherichia coli EWS-10 CMX fue depositada bajo el Nº DSM 15417 el 24 de Enero de 2003 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares S.A.) (DSMZ). La Escherichia coli EWS-10 CMX contiene el ADNc de la EWS de plena longitud, que se puede emplear en el procedimiento conforme al invento.

Los denominados co-moduladores son una clase de proteínas, que sirven, en el caso de la activación (co-activadores) o respectivamente de la represión (co-represores) de la transcripción de genes, como una molécula de puente entre el complejo de iniciación de la transcripción y los NR's (McKenna y colaboradores, 1999, Endocr. Rev., 20, 321-347). Un co-activador debe ser capaz de reforzar la función de los receptores e interactuar directamente en presencia de un agonista con el dominio de activación de los NR's. Él debe también interactuar con el aparato basal de transcripción, y finalmente él no debe reforzar por sí mismo la actividad basal de transcripción. La mayor parte de los co-moduladores interactúan con ayuda con ayuda de uno o varios motivo(s) LXXLL (cajas (boxes) de NR) con el dominio AF-2 de NR's, pero se describieron también algunos co-moduladores, que interactúan con otras regiones de NR (Ding y colaboradores, 1998, Mol. Endocrinol., 12, 302-313). Además, se identificaron muchos co-moduladores, que interactúan de una manera similar con varios diferentes NR's.

El procedimiento conforme al invento puede transcurrir tanto in vitro (es decir p.ej. como ensayo puramente bioquímico o biofísico, en solución o dentro de apropiadas matrices sólidas, etc.), como también parcial o totalmente en el sistema celular. Para un experto en la especialidad son sobradamente conocidos tales diferentes sistemas de ensayo.

Preferiblemente, por lo menos una de las etapas del procedimiento transcurre en el sistema celular, puesto que los efectos de la activación de la transcripción mediada por esteroides son especialmente bien representables en el contexto fisiológico de la célula. Como consecuencia de esto, son apropiadas para el invento en particular células eucarióticas, pudiendo pasar a emplearse tanto células primarias como también linajes celulares establecidos. La utilización de linajes celulares establecidos permite una reproducibilidad y una baratura especialmente buenas, y, por el contrario, la utilización de células primarias evita ampliamente los artefactos (aberraciones) de cultivos celulares, condicionados por mutación y selección clonales. Son especialmente apropiadas células de próstata, células nerviosas, células de la glía, fibroblastos, células sanguíneas, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos, células epiteliales o células musculares.

El efecto hormonal aquí determinado (es decir identificado, cuantificado o caracterizado) puede ser de naturaleza tanto activadora como también inhibidora, y, junto a la acción sobre la fijación a co-moduladores de receptores, puede referirse también a cualquier otra etapa de la acción de los NR's, p.ej. la transactivación inducida por ligandos pero también la localización en el núcleo del NR.

De acuerdo con una forma preferida de realización, el procedimiento conforme al invento abarca las siguientes etapas:

a.: En primer lugar, células, que expresan la EWS o un derivado de ésta, que tiene los aminoácidos 319 a 656 de la secuencia descrita en Seq. ID No. 1 y que expresan el receptor de andrógeno, se someten a la sustancia que se ha de ensayar.

b.: Sigue luego la determinación de la influencia de la sustancia sobre la interacción entre el receptor y la EWS o uno de sus derivados antes mencionados, mediante medición de la interacción de proteína con proteína o de la interacción de proteína con proteína y ADN.

La expresión de uno o ambos de los componentes que interactúan unos con otros (EWS o derivado, por una parte, y NR o derivado, por otra parte) puede efectuarse en la célula de un modo natural o como consecuencia de una transfección transitoria o estable con apropiados vectores de expresión. La elección de apropiados tipos de células y de eventuales de sistemas de vectores, constituye una medida que es habitual para el experto competente. Para la expresión en el sistema eucariótico son apropiados como vectores, por ejemplo, pCMX o pSG5.

La medición de la interacción de proteína con proteína entre un receptor o respectivamente un derivado y la EWS o respectivamente un derivado, o de la interacción de proteína con proteína y ADN de los componentes antes mencionados con la secuencia diana de ADN, se efectúa mediante medidas que son conocidas para el experto en la especialidad. Para esto son apropiadas, por ejemplo, técnicas tales como el sistema de dos híbridos, la co-precipitación inmunitaria, los ensayos de unión de GST (GST-Pull-down), los análisis FRET y los ensayos ABCD o respectivamente los ensayos de retardación en geles para el análisis de interacciones de proteína con proteína y ADN.

Una forma preferida de realización del procedimiento conforme al invento abarca las etapas siguientes:

a.: Células, que expresan la EWS o un derivado de ésta que tiene los aminoácidos 319 a 656 de la secuencia descrita en Seq. ID No. 1 y el receptor de andrógenos y que han sido transfectadas con una construcción artificial de gen reportero, son sometidas al ligando del receptor de andrógenos y a la sustancia que se ha de ensayar,

b.: determinación de la actividad de transcripción del receptor de andrógenos por medición de la actividad del gen reportero, y

c.: comparación con la actividad de transcripción en el caso de la realización de las etapas a y b en ausencia de la sustancia que se ha de ensayar.

Los genes reporteros son genes, o fragmentos de genes, que codifican productos génicos detectables de la manera más sencilla que sea posible, p.ej. fotométricamente mediante reacciones cromáticas. Genes reporteros frecuentemente utilizados son el gen para la \beta-galactosidasa, el gen para la fosfatasa alcalina, el gen para la acetil-transferasa de cloramfenicol, el gen para la catecol-dioxigenasa, el gen para la "proteína fluorescente verde o azul" [en inglés "green or blue fluorescent protein"] así como un gen de luciferasa que tiene diferentes secuencias, que pueden hacer que las células emitan luz. Mediante anteposición de un elemento de control apropiado, p.ej. de una secuencia promotora -intensificadora [promotor-enhancer], que está situada bajo el control de un determinado factor de transcripción o de una determinada cascada de transducción de señales, se puede determinar, con ayuda del producto génico expresado, por ejemplo la actividad del factor de transcripción o respectivamente de la cascada.

Habitualmente, tales genes reporteros se incorporan en apropiados vectores, mediando anteposición de la secuencia promotora - intensificadora que interesa, dentro de las células. Para el análisis de la actividad esteroidal de sustancias, son apropiadas - dependiendo del NR que se haya de analizar - todas las secuencias dianas de NR conocidas. Un ejemplo de un tal vector es el vector de MMTV-luciferasa, que se emplea para la medición del efecto andrógeno de sustancias.

Las sustancias con un efecto hormonal, preferiblemente con un efecto andrógeno/antiandrógeno, son reconocibles entonces en la expresión aumentada o respectivamente disminuida del gen reportero, en comparación con tandas de ensayo sin adición de la sustancia que se ha de ensayar.

Para la utilización en el marco del presente invento son adecuados, junto a la EWS de tipo salvaje, derivados de EWS que tienen los aminoácidos 319 a 656 de la secuencia descrita en Secuencia ID No. 1, y entre éstos especialmente derivados de EWS funcionales que tienen los aminoácidos 319 a 656 de la secuencia descrita en Secuencia ID No. 1, que han mantenido la capacidad de modular la actividad de por lo menos un receptor nuclear, en particular la de receptores de andrógenos, o por lo menos de fijar a éstos (de un modo detectable mediante apropiados métodos y que no se puede despreciar - p.ej. en ensayos de interacción de proteína con proteína, tales como el EMSA -; el experto competente en la especialidad puede diferenciar aquí entre ellos).

Se conocen ya en el estado de la técnica la EWS y ácidos nucleicos que codifican la EWS (véase con anterioridad). Para la utilización dentro del marco del presente invento es apropiada preferiblemente una EWS codificada por el ácido nucleico según Seq. ID No. 1 o respectivamente un derivado que se deriva de ella (en particular un derivado funcional), que tiene los aminoácidos 319 a 656 de la secuencia descrita en Secuencia ID No. 1. Es especialmente preferido un derivado de EWS que tiene los aminoácidos 319 a 656 de la secuencia descrita en Seq. ID No. 1, en particular un fragmento, que consiste en estos aminoácidos.

El invento se refiere, por consiguiente, también a la utilización de la EWS o de sus derivados, que tienen los aminoácidos 319 a 656 de la secuencia descrita en Secuencia ID No. 1, para la identificación y la caracterización de sustancias, que influyen sobre la actividad del receptor de andrógenos.

El procedimiento conforme al invento, o respectivamente la utilización conforme al invento de las proteínas o respectivamente ácidos nucleicos que se han mencionado, es apropiado en particular para el análisis del efecto hormonal de sustancias sobre receptores de andrógenos. A causa del efecto especialmente bien caracterizado de la EWS o respectivamente de los antes mencionados derivados de EWS sobre el receptor de andrógenos, ésta pasa a emplearse en formas de realización especialmente preferidas del invento.

Además de esto, la EWS puede encontrar utilización como indicador clínico de enfermedades debidas a andrógenos. Enfermedades relevantes debidas a andrógenos son p.ej. cáncer de próstata, formación de calvas, acné o hipogonadismo, así como síndromes de resistencia a andrógenos, tales como p.ej. la feminización testicular. Éstas se basan presumiblemente en defectos en el mecanismo de co-modulación entre el receptor de andrógenos (AR) y la EWS. Una posibilidad plausible de diagnóstico en el caso de pacientes con tales trastornos, consistiría por consiguiente en la medición de las tasas relativas de AR y de EWS. Esto es posible mediante aplicación de procedimientos cuantitativos para la medición de la cantidad relativa de ambas moléculas en el tejido diana en el caso del respectivo paciente.

El invento se explica seguidamente con mayor detalle con ayuda de un Ejemplo haciendo referencia a las Figuras.

Representan:

la Figura 1 una representación esquemática del gen para al receptor de andrógenos (AR) y el fragmento AR2,

la Figura 2 una representación esquemática del gen para la proteína del sarcoma de Ewing (EWS),

la Figura 3 las secuencias de exones y proteínas de la EWS,

la Figura 4 la co-activación de la señal de AR en células SH-SY5Y,

la Figura 5 muestra la distribución en tejidos del transcrito de EWS (Figura 5a) y del transcrito de AR (Figura 5b).

Ejemplo 1 Oligonucleótidos utilizados

Cebadores para la amplificación por PCR de los insertos de biblioteca:

	Act2c5050Eco:	gattacgctagcttgggtgg	(SEQ. ID No. 3)
	Act2-4939Xho:	gttgaagtgaacttggcgggg	(SEQ. ID No. 4)

Cebadores para la amplificación de ADNc de EWS en su plena longitud:

	EWS-8-Sal:	gggtcgacggacgttgagagaacgagg	(SEQ. ID No. 5)
	cESW-c2032-Eco:	gggaattctgcgggtctctgcatctagtaggg	(SEQ. ID. No. 6)

Cebador de secuenciación

XII-139a1:

gcttgggtggtcatatgg

(SEQ. ID. No. 7)

Vectores utilizados

: pACT2 (número de acceso al banco de genes U29899) para la biblioteca;

: Derivados de pGDT9 para las sondas: pGBT9rev y PGBT(+1)rev (Roder, K.H.; Wolf, S.S.; Schweizer, M., 1996, Analytical Biochemistry 241, 260-62);

: Vector pCR2.1Topo (de la entidad Invitrogen) para la clonación de fragmentos de PCR;

: Vector CMX para la expresión en células de mamíferos;

: pAHIuc para el ensayo de un gen reportero (que contiene el promotor de MMTV y un gen reportero de luciferasa; de la entidad A. Cato);

: pSGSAR (pSG5 con el gen humano para el receptor de andrógenos; número de acceso al banco de genes AAA51775).

Organismos utilizados

Cepas de levadura:: Y187 y PJ69-2A

Cepa de E. coli:: DH5\alpha

Células de mamíferos:: SH-SYSY (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ): DSM ACC209);

\quad: PC3 (American type Culture Collection (ATCC): CREL-1435);

\quad: PC3AR: PC3 transfectado de manera estable con pSGSAR (de la entidad A. Cato, Karlsruhe, Alemania).

Para la identificación de nuevos co-moduladores del receptor de andrógenos, se escrutó con ayuda del sistema de dos híbridos de levadura una biblioteca de ADNc humano ("Matchmaker" de la entidad Clontech; Nº HY4028AH) procedente de un cerebro fetal con tres diferentes fragmentos del receptor de andrógenos (AR) como sonda.

Para esto, el vector pSG5AR, que contiene el ADNc para el AR humano (banco de genes AAA51775), fue disociado, con ayuda de la endonucleasa PstI, de tal manera que resultaron tres diferentes fragmentos de ADN del AR. El más corto de estos fragmentos (AR4) codifica el extremo terminal de N del receptor (AS 1-56), el mediano (AR3) codifica la parte central con los dominios de activación (AS 57-324) y el más largo (AR2) codifica el extremo terminal de C (AS 325-918) con el dominio de fijación a ADN y a ligandos (DBD y LBD; compárese la recopilación en la Figura 1). El AR2 fue clonado en el vector pGBT9(+1)rev, después de que éste previamente había sido linearizado con ayuda de PstI.

A continuación, se efectuó la transformación del vector pGBT, que contenía el fragmento AR, en la cepa de levadura PJ69-2A. Los transformantes positivos (Trp+) fueron incubados, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Clontech), con una biblioteca de ADNc obtenida a partir de un cerebro fetal (ADNc de tejido múltiple (MTC) humano, Panel II de la entidad Clontech, Nº de catálogo K1421-1). En coincidencia con las instrucciones del fabricante (Clontech) se escrutaron 3x10^{6} clones. Los clones positivos fueron seleccionados y ensayados de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Clontech) en cuanto a su actividad de \beta-galactosidasa. Los insertos de colonias azules, que procedían de la biblioteca, fueron amplificados mediante una PCR y mediando utilización de los cebadores Act2c5050Eco y Act 2-4939Xho directamente a partir de las células de levadura.

Los productos de la PCR fueron separados mediante electroforesis en gel según sus longitudes y fueron analizados adicionalmente mediante Mspl. Por lo menos un ejemplar de cada uno de los modelos de fragmentos de restricción se secuenció mediando utilización de XII-139a1 como cebador de secuencia. Las secuencias fueron comparadas con el banco de genes o con el banco de datos Incyte.

Uno de los insertos múltiples veces identificados tenía una longitud de 1.500 pb y pudo ser identificado por secuenciación y comparación entre secuencias con el banco de datos NCBJ como que codifica la porción terminal de C de la EWS humana (aminoácidos AS319-656) (vista de conjunto en la Figura 2; secuencia de aminoácidos en la Figura 3).

La Figura 3 muestra la secuencia de un ADNc de la EWS humana en común con la secuencia de aminoácidos derivada. Se representan los exones 1 a 17. Las letras impresas en negrita designan el fragmento, que puede encontrarse en sistemas de dos híbridos de levaduras y que se fija al segmento de AR desde AS 325 hasta AS 919. Se han subrayado las zonas de secuencias que faltan en las variantes por empalme EWS1-b (subrayada con línea continua) o respectivamente EWS1-c (subrayada por línea de puntos).

Mediante una PCR y mediando utilización de los cebadores EWS-8-Sal y cEWS-c2032-Eco así como de un ADNc de timo o de bazo de la entidad Clontech, se amplificó la EWS en su plena longitud, siendo aislada a partir del bazo la región codificadora total del transcrito y a partir del timo la variante con el exón 15 B en lugar del exón 15. El ADNc amplificado fue clonado luego con EcoRI y Sal I en el casete de expresión del vector de expresión de mamífero CMX.

Como se desprende del diagrama de columnas representado en la Figura 4, la EWS, después de una transfección transitoria en células SH-SY5Y, es capaz de realizar una co-activación fuerte de la actividad de señales de AR, en particular en el caso de bajas concentraciones de andrógenos de 10^{-12}-10^{-10} moles. Para esto, sobre placas de reacción cada una con seis pocillos de reacción se co-transfectaron células SH-SY5Y con 0,75 \mug de un vector, que contenía el ADNc para el receptor de andrógenos humano (pSG5AR), 1,5 \mug de la construcción artificial de gen reportero pAHIuc, que contiene, delante del gen de luciferasa, el promotor MMTV, y 1 \mug del vector EWS-CMX. La transfección se efectuó mediando utilización de lipofectina de la entidad Gibco BRC, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se incubaron durante una noche con diferentes cantidades de andrógenos. Las células fueron lisadas con un habitual tampón de lisis, y la actividad de luciferasa se midió en el luminómetro Lumistar de BMG Lab Technologies. Las actividades de luciferasa de EWS-CMX fueron comparadas con las actividades testigos (vector CMX vacío). La mezcla que había en cada pocillo se midió en cuatro pocillos de una placa de microtitulación. Los valores testigos de la sustancia sin DHT fueron restados. La desviación típica está dibujada mediante columnas en la Figura 4.

La distribución en tejidos de la EWS humana en un tejido humano normal se puede ver en la Figura 5a con ayuda de las autorradiografías representadas. Para esto, un fragmento de ADNc de EWS, que codifica los aminoácidos 244-656 de EWS, se marcó según el sistema de marcación de ADN Megaprime7 (de Amersham Lufe Science) con \alpha-^{32}PdATP y con el fragmento de Klenow. El fragmento marcado fue purificado sobre una columna Nick (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y fue hibridado con borrones de transferencia humanos; Northern Blot humanos (MTN) de la entidad Clontech (N^{os} 7760-1 y 7759-1) de la entidad Clontech. Como se desprende de la Figura 5a, el AR de EWS es expresado predominantemente en los testículos. Además de esto, son detectables diferentes cantidades de EWS en la mayor parte de los órganos investigados.

La Figura 5b muestra la distribución en tejidos del AR humano en un tejido humano normal.

A partir de las Figuras 5a y 5b se pueden determinar las expresiones normales de estas dos proteínas en el tejido.

La Figura 4 muestra la co-activación de la señal del AR en células SH-SY5Y. En una placa de reacción con seis pocillos de reacción se añadieron por cada pocillo 1 \mug de co-activador, 1,5 \mug de luciferasa MMTV y 0,75 \mug del plásmido pSG5AR. Las seis mezclas fueron transferidas en cada caso a cuatro cavidades de una placa de microtitulación y allí fueron medidas. La desviación típica del error se indica como SD. En todas las señales, se restaron los valores de los correspondientes testigos sin DHT.

La Figura 5a muestra la distribución en tejidos del transcrito de EWS (Northern Blot MTN de la entidad Clontech). De acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham) se efectuaron una cebadura aleatoria del fragmento de ADNc de EWS, que codifica los aminoácidos 244 a 656, y una marcación con \alpha-^{32}PdATP y el fragmento de Klenow. Los borrones de transferencia se hibridaron con la sonda, se lavaron, se transfirieron a una película y se revelaron.

<110> JENAPHARM GmbH & Co. KG

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<120> Procedimiento para la determinación del efecto hormonal de sustancias

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<130> Pat 3684/11

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<140>

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<141>

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<160> 7

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 2390

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220> EWS

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<221> CDS

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<222> (44)..(2011)

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<400> 1

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1

2

3

4

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<210> 2

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<211> 656

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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6

7

8

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<210> 3

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> sintético

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<220> Cebador

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

gattacgcta gcttgggtgg

\hfill

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<210> 4

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> sintético

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<220> Cebador

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

gttgaagtga acttggcggg g

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> sintético

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<220> Cebador

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

gggtcgacgg acgttgagag aacgagg

\hfill

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<210> 6

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<211> 33

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<212> ADN

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<213> sintético

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<220> Cebador

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

gggaattctg cggggtctct gcatctagta ggg

\hfill

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> sintético

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<220> Cebador

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcttgggtgg tcatatgg

\hfill

Claims

1. Procedimiento para la determinación del efecto hormonal de sustancias, con las etapas de

a.: puesta en contacto de la proteína EWS o un derivado que tiene los aminoácidos 319 a 656 de la secuencia descrita en Seq. ID No. 1 con el receptor de andrógenos en una sustancia de ensayo,

b.: determinación de la influencia de la sustancia de ensayo sobre la fijación de la proteína EWS o del derivado de ésta y el receptor de andrógenos, o

c.: determinación de la influencia de la sustancia de ensayo sobre la actividad del receptor de andrógenos,

no siendo llevado a cabo el procedimiento en el cuerpo humano o animal.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que por lo menos una de las etapas transcurre en el sistema celular, con las siguientes etapas:

a.: células, que expresan la proteína EWS o el derivado de ésta y el receptor de andrógenos, se someten a la sustancia que se ha de ensayar,

b.: determinación de la influencia de la sustancia sobre la interacción entre el receptor de andrógenos y la proteína EWS o el derivado de ésta, por medición de la interacción de proteína con proteína o de la interacción de proteína con proteína y ADN.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que por lo menos una etapa transcurre en el sistema celular, con las siguientes etapas:

a.: células, que expresan la proteína EWS o el derivado de ésta y el receptor de andrógenos, y que están transfectadas con una construcción artificial de gen reportero, se someten al ligando del receptor de andrógenos y a la sustancia que se ha de ensayar,

b.: determinación de la actividad de transcripción del receptor de andrógenos mediante medición de la actividad del gen reportero, y

c.: comparación con la actividad de transcripción en el caso de realización de las etapas a y b en ausencia de la sustancia que se ha de ensayar.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque las células son células eucarióticas, preferiblemente células de próstata, células nerviosas, células de la glía, fibroblastos, células sanguíneas, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos, células epiteliales o células musculares.