ES2219601T3

ES2219601T3 - Procedimiento para comprobar los efectos hormonales de sustancias.

Info

Publication number: ES2219601T3
Application number: ES02009699T
Authority: ES
Inventors: Maik Dr. Obendorf; Jens Dr. Schroder; Siegmund Dr. Wolf
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2001-05-04
Filing date: 2002-04-29
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2022-04-29
Also published as: DE50200452D1; DK1255113T3; ATE267402T1; TR200402024T4; EP1255113A1; PT1255113E; US20030124508A1; JP4071033B2; NO20021900L; JP2003018996A; EP1255113B1; NO20021900D0

Abstract

Procedimiento para comprobar el efecto hormonal, en particular, el efecto androgénico o antiandrogénico de sustancias, en el que a) se exponen a la sustancia células que están transfectadas con dos vectores, de los que un vector contiene ADN que codifica una proteína de receptor nuclear o un fragmento de ésta, y el otro vector contiene ADN que codifica un co-modulador o un fragmento de éste, y b) se mide la actividad transcriptora que desencadena el receptor nuclear o su fragmento, en presencia del co- modulador o su fragmento, y/o la influencia de la sustancia sobre la interacción entre el receptor o su fragmento y el co-modulador o su fragmento, por interacción proteína-proteína o proteína-proteína-ADN, siendo el co-modulador ARAP11 el que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

Description

Procedimiento para comprobar los efectos hormonales de sustancias.

La invención se refiere a un procedimiento para comprobar los efectos hormonales de sustancias, un procedimiento para determinar las alteraciones en los mecanismos de co-modulación de receptores nucleares así como medios adecuados para ello, en particular el co-activador ARAP11 para el receptor de andrógenos humano y para otros receptores nucleares, así como ADN que lo codifica.

En la consideración de sustancias para una posible aplicación farmacéutica, se suelen comprobar generalmente estas sustancias respecto a un efecto hormonal eventual, particularmente respecto a la actividad andrógena o antiandrógena posiblemente existente. En la administración de sustancias farmacológicamente activas, son importantes en algunos casos los conocimientos sobre efectos hormonales, en particular efectos androgénicos o antiandrogénicos, de estas sustancias, ya que pueden ocasionar en los pacientes efectos secundarios indeseados. Para comprobar los efectos hormonales de las sustancias se emplean en particular procedimientos, en los que se mide la capacidad de las sustancias, para unirse a los receptores hormonales y activar su actividad de transcripción.

Pero los conocimientos sobre efectos hormonales de sustancias no sólo son de interés en el caso de fármacos potenciales, sino también en el caso de sustancias no farmacéuticas, ya que se supone que muchas sustancias existentes en el medio ambiente pueden presentar una actividad androgénica o antiandrogénica o estrogénica o antiestrogénica en partes de la población. Posiblemente, de este modo se genere un efecto indeseado y nocivo.

Es decir, que existe una necesidad muy considerable de un procedimiento y de un medio adecuado para llevar a cabo el procedimiento, con el cual se pueda dar una información de forma fiable, sensible, sencilla, económica y rápida, sobre el efecto hormonal de sustancias. Los procedimientos conocidos hasta ahora no son satisfactorios.

Por ello, la presente invención se basa en el objetivo de proporcionar un procedimiento y medios apropiados para éste, con los que de forma fiable, sensible, sencilla, económica y rápida puede darse una información sobre el efecto hormonal de la sustancia que se ha de analizar.

Conforme a la invención, esto se alcanza mediante un procedimiento para el análisis del efecto hormonal, en particular, del efecto androgénico o antiandrogénico de sustancias, en el que

a) se exponen a la sustancia células que están transfectadas con dos vectores, de los que uno contiene ADN que codifica una proteína de receptor nuclear o un fragmento de ésta, especialmente, una proteína de receptor nuclear humana o un fragmento de ésta, y el otro vector contiene ADN que codifica un co-modulador o un fragmento de éste, y

b) se mide la actividad transcriptora que desencadena el receptor nuclear o su fragmento en presencia de un co-modulador o su fragmento, y/o la influencia de la sustancia sobre la interacción entre el receptor o su fragmento y el co-modulador o su fragmento, mediante una interacción proteína-proteína o proteína-proteína-ADN, siendo el co-modulador ARAP11 el que presenta la secuencia de aminoácidos indicada para SEC ID Nº 1.

Sorprendentemente, se halló que mediante el procedimiento conforme a la invención puede comprobarse de forma fiable, sensible, sencilla, rápida y económica, si sustancias que, por ejemplo, pueden ser relevantes para el medio ambiente o de interés farmacológico, ejercen un efecto hormonal, en particular, un efecto androgénico o antiandrogénico.

En el procedimiento conforme a la invención se usan células transformadas con un vector, presentando los vectores un ADN que codifica una proteína de receptor nuclear o un fragmento de ésta.

La superfamilia de los receptores nucleares (NR), a la que pertenecen más de 50 proteínas diferentes, es un grupo de factores de transcripción emparentados que controlan la transcripción del respectivo gen diana como reacción con ligandos específicos, por ejemplo, hormonas. Se puede subdividir la familia en varias subfamilias clasificándose según características determinadas como, por ejemplo, estado de dimerización, tipo del ligando o estructura del elemento de reacción de ADN (Beato y col., 2000, Human Reproduct. Update, 6, 225-236). Una característica típica de los NR es la estructura coincidente del dominio funcional (con las denominaciones A a F) con una región N-terminal fuertemente variable, sólo débilmente conservada, con función constitutiva autónoma de activación (AF-1), de un dominio de enlace al ADN (DBD) fuertemente conservado, que es responsable del reconocimiento de elementos de reacción especiales del ADN y está compuesto por dos motivos de dedos de cinc, un dominio en bisagra variable y un dominio de enlace de ligandos C-terminal (LBD) multifuncional conservado, con función de transactivación(AF-2) dependiente de la dimerización y de ligandos. A continuación, sigue la región ubicada en la forma más C-terminal, cuya función no se conoce y que falta en receptores como, por ejemplo, PR (receptor de progesterona), PPAR (receptor activado mediante el proliferador de peroxisoma) y RXR (receptor de retinoide X) (Mangelsdorf & Evans, 1995; Cell, 83, 841-850; Robyr y col., 2000, Mol. Endocrinol. 14, 329-347). Para algunos NR (por ejemplo, el receptor de andrógenos (AR)) se comprobó que la región N-terminal es capaz de interactuar con la región C-terminal (Brinkmann y col., 1999, J. Steroid Biochem. and Mol. Biol., 69, 307-313). Los receptores de hormonas esteroides como, por ejemplo, de estrógenos (ER), progesterona (PR), de glucocorticoides (GR), mineralocorticoides (MR) y de andrógenos (AR) se enlazan a ligandos esteroides que se derivan de la pregnenolona, como las progestinas, los estrógenos, los glucocorticoides, y los mineralocorticoides, así como los andrógenos. El enlace de ligandos activa al receptor y controla la expresión de genes diana correspondientes.

Como se expuso anteriormente, en el paso a) del procedimiento conforme a la invención se usan células que contienen un vector que presenta un ADN que codifica al co-modulador ARAP11 o un fragmento del mismo.

Los co-moduladores son una clase de proteínas que en la activación (co-activadores) o en la represión (co-represores) de la transcripción génica sirven como moléculas puente entre el complejo de iniciación de la transcripción y los NR (McKenna y col., 1999, Endocr. Rev., 20, 321-347). Un co-activador debe ser capaz de reforzar la función del receptor y de interactuar directamente con el dominio de activación de los NR, en presencia de un agonista. También debe interactuar con el aparato basal de transcripción y finalmente, él mismo no debe reforzar la actividad basal de transcripción. La mayoría de los co-moduladores interactúan con la ayuda de una o más señales LXXLL (cajas NR) con el dominio AF-2 de los NR, sin embargo, se han descrito también algunos co-moduladores que interactúan con otras regiones de NR (Ding y col., 1998, Mol. Endocrinol., 12, 302-313). Además, se identificaron muchos co-moduladores que interactúan de manera similar con varios NR diferentes, de manera que convenientemente se debía examinar el grado de especificidad de cada co-modulador.

En el procedimiento conforme a la invención se usa el co-modulador denominado ARAP11 o el fragmento de ARAP11 que contiene los aminoácidos 813 a 1390. La secuencia de ADN complementario, o la secuencia de aminoácidos que presenta los 1390 aminoácidos del co-modulador ARAP11, está representada en SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 2. Usando estas proteínas puede llevarse a cabo el procedimiento conforme a la invención de manera especialmente fiable, sensible, sencilla, económica y rápida. Además, los fragmentos de ARAP11, en particular, el fragmento de ARAP11 que contiene los aminoácidos 813 a 1390, presentan la ventaja de que son más fácilmente manipulables y clonables, pero que todavía presentan las propiedades funcionales de ARAP11.

En el caso de ARAP11, se trata de un co-activador del receptor humano de andrógenos y otros receptores nucleares, que refuerza la interacción entre un andrógeno y el receptor. Una parte de la secuencia de ARAP11 ya está descrita como Pro2000 en el banco de genes XM 005253, aunque allí no se indica ninguna función. En comparación con la secuencia que se conoce del banco de genes ahora se descubrió que la secuencia de aminoácidos de ARAP11 es mayor que la secuencia conocida; en el ámbito N-terminal presenta aminoácidos adicionales. Además, se pudo constatar una interacción entre receptores nucleares, en particular, AR por un lado, y ARAP11, por el otro lado, así como un refuerzo de la transactivación mediada por AR. ARAP11 es una proteína que actúa como co-mediador, reforzando o reprimiendo el efecto de transcripción, después del enlace de esteroides al receptor nuclear y, además, promueve el enlace y la activación del receptor nuclear con moléculas, a las que antes no se les atribuía ningún efecto hormonal.

La proteína ARAP11 representa un co-activador para el receptor de andrógenos y otros receptores nucleares, como el receptor de estrógenos \alpha, el receptor de estrógenos \beta, el receptor de progesterona A, el receptor de progesterona B, el receptor de glucocorticoides, el receptor de mineralocorticoides, el receptor de las hormonas tiroideas, el receptor de vitamina D, el receptor activado por el proliferador de peroxisoma, el receptor de ácido retinoico, el receptor de retinoide X y receptores de orfones; en el procedimiento conforme a la invención preferentemente se usan estos receptores porque con ellos pueden lograrse de forma especialmente favorable las ventajas del procedimiento conforme a la invención, mencionadas anteriormente.

En el procedimiento conforme a la invención también pueden usarse vectores que codifican fragmentos de las proteínas citadas anteriormente. Por la expresión "fragmentos", en relación con las proteínas citadas anteriormente, se entienden tales que contienen un aminoácido o varios aminoácidos menos que las proteínas de longitud completa, y todavía presentan las propiedades funcionales de un receptor nuclear o de un co-modulador.

Como ya se expuso anteriormente, en el procedimiento conforme a la invención en el paso a) se usan células que están transfectadas con dos vectores que contienen ADN que codifican proteínas especiales. Es decir, estas células son capaces de expresar estas dos proteínas diferentes.

Preferentemente, las células son líneas celulares establecidas y/o células eucarióticas, en particular, células de próstata, células nerviosas, células gliales, fibroblastos, células sanguíneas, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos, células epiteliales o células musculares. Con las líneas celulares establecidas puede llevarse a cabo el procedimiento conforme a la invención de forma especialmente económica y rápida. Usando células eucarióticas, especialmente las células eucarióticas citadas anteriormente, con el procedimiento conforme a la invención pueden obtenerse de forma ventajosa resultados de especial valor informativo.

En una realización preferida del procedimiento conforme a la invención se usan vectores de expresión eucarióticos, por ejemplo, pCMX o pSG5. Usando estos vectores, en particular, en combinación con las líneas celulares establecidas y/o las células eucarióticas, nombradas anteriormente, puede llevarse a cabo el procedimiento conforme a la invención de forma especialmente favorable y rápida y se obtienen resultados de especial valor informativo.

El experto conoce procedimientos y los materiales necesarios, para insertar en un vector el ADN que codifica las proteínas citadas anteriormente, introducir luego el vector en las células y cultivar las células así obtenidas en condiciones apropiadas de cultivo, para que puedan expresar estas proteínas.

Conforme al paso b) del procedimiento conforme a la invención puede medirse la actividad transcriptora que desencadena el receptor nuclear o su fragmento, en presencia del co-modulador o su fragmento. Esto puede efectuarse, por ejemplo, mediante la detección de un gen informante.

Los genes informantes son genes o fragmentos de genes que son acoplados con otros genes o secuencias reguladoras para hacer detectable la actividad de estas secuencias. Los genes informantes generan productos génicos que son lo más fácilmente detectables posible, por ejemplo, de forma fotométrica por reacciones que producen coloración. Genes informantes usados con frecuencia son el gen de \beta-galactosidasa, el gen de la fosfatasa alcalina, el gen de cloranfenicol-acetiltransferasa, el gen de catecol-dioxigenasa, el gen de la "proteína de fluorescencia verde", así como diversos genes de luciferasa que pueden hacer luminosas a las células.

También pueden incluirse tales genes informantes en las células, mediante vectores, en particular, vectores de expresión eucarióticos. Un ejemplo de un vector que contiene ADN que codifica un gen informante es el vector MMTV-luciferasa, que se usa para la medición del efecto androgénico de sustancias.

Entonces, las sustancias que tienen un efecto hormonal, en particular, un efecto androgénico/antiandrogénico son reconocibles por la actividad aumentada o reducida, del gen informante.

La medición de la influencia de la sustancia que se examina sobre la interacción entre el receptor o su fragmento y el co-modulador o su fragmento también puede efectuarse por determinación de la interacción proteína-proteína, por ejemplo, por sistemas doblemente híbridos, precipitación inmune, ensayos del descenso del GST, análisis FRET y ensayos ABCD, así como por determinación de la interacción proteína-proteína-ADN, como por ensayos de retardo por gel.

Además, se halló que ARAP11 puede usarse muy bien como indicador de enfermedades condicionadas por andrógenos que en parte sólo aparecen en la edad avanzada. Enfermedades relevantes condicionadas por andrógenos como, por ejemplo, cáncer de próstata, disfunción eréctil, infertilidad, formación de calvicie, acné o hipogonadismo, así como síndromes de resistencia a andrógenos como, por ejemplo, la feminización testicular, se deben a defectos en el mecanismo de co-modulación entre AR y ARAP11. Una posibilidad en los pacientes con tales trastornos entonces consiste en la medición de las concentraciones relativas de AR y ARAP11. Esta medición convenientemente se efectúa de forma extracorporal en líquidos corporales, células corporales o tejidos corporales. Esto es posible mediante el uso de procedimientos cuantitativos para medir la cantidad relativa de ambas moléculas en el respectivo paciente, en los que, por ejemplo, pueden usarse anticuerpos tanto contra AR, como contra ARAP11 o sondas de ácido nucleico contra su ARN mensajero. Existen varios procedimientos para la medición de estas tasas comparativas, que le son conocidos al experto; también conoce materiales y dispositivos apropiados para éstos, como radioinmunoensayo, ensayo ELISA, coloración inmune, RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa), transferencia Western, transferencia Northern, fraccionamiento de ADN o fraccionamiento de proteínas. Además, es posible construir sondas de manera usual para un ensayo de PCR con ayuda del ADN complementario de ARAP11, con las que en determinados pacientes pueden detectarse mutaciones de la secuencia normal de ADN, o pueden generarse transcripciones para el ensayo de transferencia Northern o un ADN para un ensayo in situ de hibridación.

Aquí la relación medida de AR respecto a ARAP11 puede ser mayor o menor que en individuos sanos. El valor normal existente en individuos sanos puede determinarse de manera sencilla, por ejemplo, promediando la relación de AR respecto a ARAP11 de un gran número de voluntarios. Por comparación del valor normal con la relación calculada de AR respecto a ARAP11 en los pacientes que se han de examinar, puede constatarse si el valor de la relación calculada es mayor o menor que el valor normal.

Como la concentración de ARAP11 y/o de AR en el tejido puede ser diferente, por ejemplo, la concentración de ARAP11 en los testículos es muy alta, en cambio, es menor en el hígado, el corazón, el timo y en la próstata, se deben considerar las diferentes concentraciones en los tejidos para la evaluación, es decir, el valor del ensayo y el valor normal deben referirse al mismo tejido.

Otra posibilidad para determinar defectos en el mecanismo de co-modulación entre AR y ARAP11 puede consistir en medir sólo la concentración de ARAP11, partiendo de la base de que la concentración de AR sea al menos aproximadamente constante. Si aquí se midió una concentración menor que la concentración normal de ARAP11, esto significa que se ha desplazado la relación entre AR y ARAP11, lo que a su vez como indicador señala un trastorno en mecanismo co-modulador.

Es decir, es posible determinar alteraciones en la expresión de ARAP11 con una sonda específica de ARAP11 y determinarlas así en relación con AR. Tales alteraciones pueden estar involucradas en las causas de diferentes cuadros patológicos o aparecer como fenómeno consecuente.

Tales mediciones de la relación AR/ARAP11 o de ARAP11 se basan en el descubrimiento sorprendente y debido a la detección y la caracterización de ARAP11 que, por ejemplo, el síndrome de resistencia a andrógenos puede deberse a un trastorno del equilibrio entre la cantidad existente de AR y ARAP11 en las células diana. Demasiada cantidad de ARAP11 podría conducir a una hipersensibilidad del sistema de AR, de manera que reaccione frente a moléculas que normalmente no tienen efecto androgénico. Inversamente, la falta o la función deficiente de ARAP11 en todos los niveles conduce a una resistencia a los andrógenos. La comprobación de la cantidad excesiva de ARAP11 en un paciente recomendaría el uso de agentes para regular hacia abajo como, por ejemplo, medicamentos en antisentido o similares para reducir el título de ARAP11 en condiciones clínicas en el respectivo paciente. Lo mismo también puede lograrse mediante moléculas que son capaces de inhibir la interacción entre AR y ARAP11. Si un paciente tiene demasiado poco ARAP11, se le puede administrar ADN complementario, proteína o ADN de ARAP11 mediante diversos mecanismos en sí conocidos, para aumentar así el título del ARAP11 activo. También es posible un incremento de la concentración o de la actividad de ARAP11 por medicamentos de bajo peso molecular o por estímulo de la autosíntesis, con la ayuda de proteínas promotoras específicas de ARAP11.

Como se desprende de las exposiciones anteriores sobre los procedimientos conforme a la invención, la proteína ARAP11 es muy apropiada para llevar a cabo el procedimiento. Por ello, además el ARAP11, que presenta la siguiente secuencia de aminoácidos, es objeto de la presente invención.

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o el fragmento de ARAP11 que presenta los aminoácidos 813 a 1390 de esta proteína.

Además, otro objeto de la presente invención es un ADN que codifica ARAP11 o su fragmento, en particular, el fragmento que presenta los aminoácidos 813 a 1390. La expresión "ADN hibridante" señala un ADN que en las condiciones usuales, en particular, a 20ºC, por debajo del punto de fusión del ADN, se hibrida con el ADN codificador.

La invención es explicada en más detalle en referencia a las siguientes figuras, en las que

la figura 1 es una representación esquemática del receptor de andrógenos, marcando el dominio del receptor de andrógenos (AR 2), que comprende los aminoácidos 325 a 919, que es capaz de la interacción con ARAP11 en ausencia de andrógenos;

la figura 2 representa la distribución de ARAP11 en los tejidos;

la figura 3 muestra la co-activación de la señal del receptor de andrógenos en células SH-SY5Y, y

la figura 4 muestra la expresión de ARAP11 y \beta-actina en testículos de ratas.

El siguiente ejemplo ilustra más detalladamente la invención, pero sin limitarla a éste.

Ejemplo 1 Co-activación de la señal del receptor de andrógenos por ARAP11

Usando una biblioteca de ADN complementario de cerebro fetal (Clontech MATCHMAKER) y un fragmento de AR humano que codifica los aminoácidos 325 a 919, como sonda (figura 1) se efectuó una puesta en pantalla mediante un sistema usual de dos híbridos de levadura, en ausencia de andrógenos. Coincidiendo con las indicaciones del fabricante (Clontech), la cantidad de los clones en pantalla ascendió a 6 x 10^{7}. La cantidad de los clones independientes, según las indicaciones del fabricante ascendía a 3,5 x 10^{6}. De éstos se seleccionaron 350 clones positivos y se analizaron mediante un ensayo de \beta-galactosidasa, confirmándose 240 como clones lacZ-positivos. Las inserciones de estos clones fueron amplificadas mediante PCR. Mediante análisis de fragmentos de restricción y secuenciación se identificaron al menos 17 clones diferentes. Uno de ellos fue un clon con un inserto que comprendía 1169 pares de bases (par de bases 3243 a par de base 4412), que codifica un fragmento del ORF (módulo de lectura abierto). Esta secuencia también contiene casi el fragmento completo del ORF ya descrito en Pro200 (número de acceso en el banco de genes: XM005253).

Con la ayuda de un procedimiento usual de PCR se clonó entonces el ADN complementario de ARAP11 en toda su longitud, que codifica una proteína compuesta por 1390 aminoácidos (SEC ID Nº 2) y sobrepasa considerablemente la secuencia Pro 2000, conocida hasta ahora, que describe una proteína de 365 aminoácidos. Junto con los ámbitos no traducidos en 5' y 3', la secuencia aquí descrita tiene una longitud de 4412 pares de bases (SEC ID Nº 1).

La figura 2 muestra la distribución en los tejidos de ARAP11, que fue averiguada de manera en sí conocida mediante transferencia Northern. Se desintegró Poli-A + ARN (2 \mug) de diferentes tejidos en gel de agarosa que contenía formaldehído, se transfirió a una membrana de nylon y se hibridó con un fragmento de ADN complementario marcado de ARAP11. Para el experimento descrito en las figuras 2a y 2b se usó un fragmento del par de bases 3111 hasta el par de bases 4217, para el experimento en la figura 2c se usó un fragmento del par de bases 2065 hasta el par de bases 2476 de la secuencia de ADN complementario de ARAP11. Después de lavar, se colocó la membrana sobre una película y después de exponer a la luz durante 24 horas (figuras 2a y 2c) o durante 8 días (figura 2b) se reveló. Como se puede ver en la figura 2, en testículos se comprobó una expresión muy fuerte de ARAP11, en cambio, en el hígado, el corazón, el timo y la próstata se detectó una expresión más débil de ARAP11. Se descubren dos transcripciones (de 6,0 kb y de 5,2 kb).

Con la sonda del fragmento compuesto por 411 pares de bases, desde el par de bases 2065 hasta el par de bases 2476, de la secuencia de ADN complementario de ARAP11, nuevamente se detectaron dos transcripciones de igual tamaño en testículos, de manera que se puede partir de la base de que en el caso de las transcripciones detectadas se trata de las transcripciones idénticas que fueron detectadas con la sonda de 3111-4217 en 2a y 2b. Esto representa una demostración de que la secuencia de Pro2000, depositada en el banco de genes con el número XM005253, es incompleta y en el ámbito 5' es 2480 pares de bases más larga.

El ADN complementario de ARAP11, generado mediante PCR, que codifica el fragmento de ARAP11 desde el aminoácido 813 hasta el aminoácido 1390, fue clonado de manera usual en el vector CMX y transfectado también de manera usual con pSG5-AR y MMTV-luciferasa en células SH-SY5Y.

Como se desprende de la figura 3, la transfección transitoria de ADN complementario de ARAP11 en células SH-SY5Y condujo a una fuerte co-activación de la actividad productora de señales de AR, en particular, a bajas concentraciones de andrógenos, de 10-^{10} a 10-^{12} M. Para ello, en una placa de cultivo con pocillos se transfectaron 3 x 10^{5} células por pocillo con 1 \mug de co-activador (ARAP11-3 o ARAP11-1 que respectivamente codifican los aminoácidos 813 hasta 1390 de ARAP11) en CMX o 1 \mug de CMX como plásmido control, 1,5 \mug de MMTV-luciferasa y 0,75 \mug de plásmido pSG5AR y después de 24 horas se trató con dihidroxitestosterona (DHT) como andrógeno en las concentraciones indicadas. Después de otras 24 horas, se recolectaron las células transfectadas y se midió la actividad del gen informante luciferaza. Adicionalmente, se determinó la cantidad total de proteína celular para la normalización. Por preparación para transfección y concentración de sustancia se llevó a cabo un experimento y respectivamente se efectuaron cuatro mediciones. Las desviaciones por error fueron indicadas como SD. En todas las señales se restaron los valores de los correspondientes controles sin DHT. La actividad está indicada en unidades relativas.

Ejemplo 2 Determinación de ARAP11 en testículos de ratas

La figura 4 muestra la expresión de ARAP11 y \beta-actina en testículos de ratas. De tejidos de testículos de ratas se aislaron Poli-A+ARN (4 \mug), se desintegraron en un gel de agarosa que contenía formaldehído, se transfirió a una membrana de nylon y se hibridó, o bien, con un fragmento marcado de ADN complementario de ARAP11 (par de bases 2226 - par de bases 4228), o bien se hibridó con un ADN complementario marcado de \beta-actina (rata). Después de lavar, se colocó la membrana sobre una película y, después de exponer a la luz durante 5 días, se reveló. En el tejido de testículo de rata pudo detectarse una transcripción de ARN (de 6,0 kb). En la columna 1 se aplicó ARN aislado de animales de 3 semanas de edad, en la columna 2, de animales de 6 semanas de edad y en la columna 3 de animales de 2 años de edad. Se puede reconocer una notoria dependencia de la edad en la expresión del gen de ARAP11, mientras que la expresión del gen de \beta-actina no presenta modificación. 6 semanas después del nacimiento la expresión de ARAP11 está notablemente reducida (más del 50%) y en animales ancianos (2 años) ya se reconoce una expresión muy baja del gen de ARAP11. En el caso de cuadros patológicos se debe esperar un comportamiento similar en cuanto a una alteración de la expresión del gen del co-modulador ARAP11.

Claims

1. Procedimiento para comprobar el efecto hormonal, en particular, el efecto androgénico o antiandrogénico de sustancias, en el que

a) se exponen a la sustancia células que están transfectadas con dos vectores, de los que un vector contiene ADN que codifica una proteína de receptor nuclear o un fragmento de ésta, y el otro vector contiene ADN que codifica un co-modulador o un fragmento de éste, y

b) se mide la actividad transcriptora que desencadena el receptor nuclear o su fragmento, en presencia del co-modulador o su fragmento, y/o la influencia de la sustancia sobre la interacción entre el receptor o su fragmento y el co-modulador o su fragmento, por interacción proteína-proteína o proteína-proteína-ADN,

siendo el co-modulador ARAP11 el que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

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2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el fragmento del co-modulador presenta los aminoácidos 813 a 1390 de ARAP11.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el receptor nuclear está seleccionado entre receptor de andrógenos, receptor de estrógenos \alpha, receptor de estrógenos \beta, receptor de progesterona A, receptor de progesterona B, receptor de glucocorticoides, receptor de mineralocorticoides, receptor de las hormonas tiroideas, receptor de vitamina D, receptor activado por el proliferador del peroxisoma, receptor de ácido retinoico, receptor de retinoide X y receptores de orfones.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que las células son líneas celulares establecidas y/o son células eucarióticas.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que las células eucarióticas están seleccionadas entre células de próstata, células nerviosas, células gliales, fibroblastos, células sanguíneas, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos, células epiteliales o células musculares.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el vector es un vector de expresión eucariótico.

7. Procedimiento para determinar trastornos en el mecanismo de co-modulación entre receptores de andrógenos y ARAP11, en el que se miden las concentraciones de ARAP11 o de un fragmento de éste y/o del receptor de andrógenos o un fragmento de éste.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la medición de la concentración se efectúa mediante radioinmunoensayo, ensayos ELISA, coloración inmune, RT-PCR, transferencia Western, transferencia Northern, por fraccionamiento de ADN o por fraccionamiento de proteína.

9. Proteína o un fragmento de ésta, con propiedades de co-modulador para el receptor de andrógenos, en la que se presenta la secuencia de aminoácidos de ARAP11, conforme a la reivindicación 1.

10. Proteína según la reivindicación 9, en la que el fragmento presenta los aminoácidos 813 a 1390.

11. ADN que codifica la proteína según las reivindicaciones 9 ó 10, o ADN que se hibrida con ésta.