ES2276481T3 - Peptido apoep1.b novedoso, composiciones y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Un uso de un péptido apoEp1.B o un ácido nucleico que codifica un péptido apoEp1.B para la fabricación de un medicamento para la inducción de la diferenciación celular, en el que el péptido apo Ep1.B tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nº 1); AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2); TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3); TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4); TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5); TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6); QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7) y QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
Description
Péptido apoEp1.B novedoso, composiciones y sus
usos.
La presente invención se refiere a
procedimientos y composiciones para modulación inmune.
El sistema inmune es un sistema de defensa
complejo, multifactorial que protege el cuerpo de un amplio
intervalo de enfermedades infecciosas que incluyen virus,
bacterias, parásitos y hongos. Aunque crítico para nuestra
supervivencia, en ciertos casos, tal como enfermedad autoinmune,
rechazo de transplante, alergias e inflamación, el sistema inmune
puede ser la causa de enfermedad. En tales casos es deseable
suprimir o tolerar la respuesta inmune.
El sistema inmune está constituido por una gran
diversidad de células derivadas de células del tronco hematopoyético
e incluye fagotitos (tales como polimorfos neutrófilos, monocitos,
macrófagos y células dendríticas) y linfocitos tales como células T
y células B y células destructoras naturales.
Las células dendríticas son células inmunes
interesantes ya que, dependiendo de las circunstancias, pueden o
bien activar o suprimir una respuesta inmune. Con relación a la
activación inmune, las células dendríticas (DC) son potentes
estimuladores de linfocitos y extremadamente células presentadoras
de antígeno eficaces. Recientemente, se ha generado considerable
interés en el uso potencial de células dendríticas para la terapia
de cáncer y enfermedades infecciosas. Las DC pulsadas con péptidos
tumorales generan inmunidad protectora y antitumoral en ratones
(Mayordama y col., 1995). Los pacientes con linfomas de células B se
han vacunado con éxito con DC pulsadas por antígeno antólogas
aisladas a partir de la sangre (Hsu y col., 1996). El ligando Flt3,
que induce la maduración de DC, da como resultado la regresión de
tumores y respuesta inmune antitumoral en ratones (Lynch y col.,
1997). Desafortunadamente, los avances en el tratamiento de tumores
con DC se han limitado a su nivel de pequeña cantidad in
vivo. Los esfuerzos en esta área se dirigen a incrementar
números de DC y nivel de activación. Con relación a la tolerancia,
las células dendríticas se han mostrado recientemente que están
implicadas en la inducción de tolerancia central así como periférica
y pueden ser útiles en el tratamiento de autoinmunidad, alergias y
rechazo de transplante.
Hunt y col (Science (1992) 256 (50650,
1817-20) describen un procedimiento de secuenciación
de diversos fragmentos de péptidos que están asociados con la
molécula I - A^{d} de Clase II MHC. Las secuencias de los
péptidos se determinaron mediante HPLC de fase inversa y la
combinación de HPLC microcapilaridad - ionización por
electropulverización - espectrometría de masas de tándem.
Los presentes inventores han preparado un
péptido derivado de apolipoproteína E denominado apoEp1.B que
incluye los aminoácidos 239-252 de la
apolipoproteína E. Los inventores han encontrado que
sorprendentemente, ApoEp1.B es un modulador inmune potente que
actúa sobre una diversidad de células inmunes. De manera
interesante, la apoEp1.B es un modulador dual, capaz de tanto
inducir como suprimir una respuesta inmune. En particular, el
apoEp1.B se ha mostrado que induce la diferenciación de células
inmaduras en células dendríticas, para inducir diferenciación y
activación de células tumorales, para inhibir la inflamación y para
inhibir enfermedad autoinmune.
De acuerdo con lo anterior, la presente
invención proporciona un péptido apoEp1.B que comprende los
aminoácidos 239-252 de la proteína apolipoproteína
E. En una realización preferida, la presente invención proporciona
un péptido apoEp1.B aislado que tiene la secuencia de aminoácidos
TQQIRLQAEIFQAR (murino) o AQQIRLQAEAFQAR (humano). La invención
también incluye análogos, fragmentos, alargamientos y derivados de
un péptido de la invención. Los análogos y derivados de los
péptidos incluyen péptidos que tienen las siguientes secuencias:
TAQIRLQAEIF
QAR; TQAIRLQAEIFQAR; TQQARLQAEIFQAR y TQQIALQAEIFQAR. Los fragmentos y alargamientos de los péptidos incluyen péptidos que tienen las siguientes secuencias: QTQQIRLQAEIFQAR y QQIRLQAEIFQAR. La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido apoEp1.B, o un análogo, fragmento o derivado del mismo.
QAR; TQAIRLQAEIFQAR; TQQARLQAEIFQAR y TQQIALQAEIFQAR. Los fragmentos y alargamientos de los péptidos incluyen péptidos que tienen las siguientes secuencias: QTQQIRLQAEIFQAR y QQIRLQAEIFQAR. La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido apoEp1.B, o un análogo, fragmento o derivado del mismo.
La presente invención además proporciona un
procedimiento de modulación inmune que comprende la administración
de una cantidad eficaz de un péptido apoEp1.B o un ácido nucleico
que codifica un péptido apoEp1.B a una célula o animal en necesidad
del mismo.
De acuerdo con una realización, el péptido puede
inducir tolerancia inmune. En particular, los presentes inventores
han demostrado que el péptido apoEp1.B puede activar monocitos para
diferenciarse en células dendríticas tolerogénicas. La inducción de
células dendríticas tolerogénicas pueden tener una amplia diversidad
de aplicaciones terapéuticas que incluyen inflamación, enfermedad
autoinmune y transplante.
En otra realización, el péptido apoEp1.B es útil
en la inhibición de inflamación. En una realización preferida, el
péptido puede inhibir la formación de palca aterosclerótica in
vivo.
En una realización adicional, el péptido
apoEp1.B se puede usar para prevenir o tratar una reacción o
enfermedad autoinmune. Los presentes inventores también han
demostrado que el péptido apoEp1.B puede proteger a los ratones NOD
de desarrollar diabetes. En una realización preferida, la enfermedad
autoinmune es diabetes.
En un aspecto adicional, el péptido apoEp1.B se
puede usar para inducir una respuesta inmune activando las células
inmunes. En una realización, el péptido, en combinación con otras
citoquinas tales como IL-4, GM-CSF,
TNF\alpha y ligando Flt3 pueden inducir que las células
dendríticas inmaduras se diferencien en células dendríticas
inmunogénicas maduras. Las células dendríticas maduras se pueden
usar en una amplia variedad de aplicaciones incluyendo
inmunoterapia tumoral.
En otro aspecto, el apoEp1.B se puede usar para
tratar tumores de origen inmune induciendo su diferenciación. En
particular, los presentes inventores han demostrado que el péptido
apoEp1.B puede inducir la diferenciación y activación de de
leucemia monocítica, monoblástica y células tumorales de
linfoma.
Otras características y ventajas de la presente
invención se hará aparente a partir de la siguiente descripción
detallada. Se debe entender, sin embargo, que la descripción
detallada y los ejemplos específicos aunque indicando las
realizaciones preferidas de la invención se proporcionan a modo de
ilustración solamente, ya que diversos cambios y modificaciones
dentro del espíritu y alcance de la presente invención serán
evidentes para los expertos en al técnica a partir de esta
descripción detallada.
La invención se describirá ahora en relación a
los dibujos en los que:
La figura 1A y B son fotografías de células del
bazo incubadas con apoEp1.B (B) o un péptido de control (A) durante
48 horas.
La figura 1C y D son fotografías de células
PU5-1.8 incubadas con apoEp1.B (D) o un péptido de
control © durante 48 horas.
La figura 2 (A-D) es un análisis
FACS de células J77A incubadas con apoEp1.B (B y D) o con un péptido
de control (A y C) durante 48 horas.
La figura 3 es un análisis FACS de células
PU5-1.8 inducidas con apoEp1.B o apoEp.1D y teñidas
con diversos marcadores.
La figura 4 muestra un análisis FACS o
esplenocitos Balb/c incubados con apoEp1.B o apoEp.1D.
La figura 5 muestra un análisis FACS que ilustra
que la expresión de la molécula de superficie de DC de apoEp1.B o
apoEp.1D depende de la dosis.
La figura 6 muestra un análisis FACS que
demuestra que apoEp1.B no es específico de la especie.
La Figura 7 son gráficos de barras que
demuestran la producción de quimioquina a partir de las células
PU5-1.8 incubadas con apoEp1.B, apoep1 y
control.
La figura 8A muestra un análisis FACS que
muestra los perfiles de SCC y FSC de células PEC cebadas con
apoEp1.D y apoEp1.B.
La figura 8B muestra la expresión del marcador
de superficie de células PEC cebados con apoEp1.D (pico no marcado)
y apoEp1.B (pico marcado).
La figura 9 es un gráfico de barras que muestra
la activación de células esplénicas en la presencia de apoEp1.B y/o
ConA.
La figura 10 muestra una sección de arterias
iliofemorales: (A) no tratadas, sin cirugía; (B) no tratadas,
cirugía y (C) tratadas con apoEp1.B y cirugía (mostrada la sección
arterial).
La figura 11 muestra histogramas que ilustran la
inducción de las células Th2 mediante inmunización con
apoEp1.B.
apoEp1.B.
La figura 12 muestra un histograma que ilustra
las capacidades aloestimulatorias de las células apoEp1.B.
La figura 13A es un gráfico que ilustra la
protección de apoEp1.B de ratones NOD a partir de diabetes
espontánea.
La figura 13B es un gráfico que ilustra la
protección de apoEp1.D de ratones NOD a partir de diabetes
adoptivamente transferida.
\newpage
La figura 14 es un gráfico que muestra el
porcentaje de ratones protegidos de diabetes contra tiempo, en
presencia y ausencia de apoEp1.B.
La figura 15A - D ilustran el efecto de
diferentes concentraciones de apoEp1.B sobre la proliferación de
células U-937.
La figura 16 muestra un análisis FACS que
ilustra que las supresiones o alargamientos de aminoácidos
individuales disminuyen la actividad de apoEp1.B.
Como se ha mencionado anteriormente en esta
memoria descriptiva, los presentes inventores han preparado un
péptido a partir de tanto la apolipoproteína E humana y murina
denominada apoEp1.B (239-252) que es un potente
modulador inmune y se puede usar en una amplia diversidad de
aplicaciones.
Como se ha establecido de manera amplia, la
presente invención proporciona un péptido apoEp1.B que comprende
los aminoácidos 239-252 de una proteína
alolipoproteína E o un análogo, fragmento, alargamiento o derivado
de la misma.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un péptido apoEp1.B aislado que tiene la secuencia de aminoácidos
TQQIRLQAEIFQAR (murino) (SEQ ID Nº 1) o AQQIRLQAEAFQAR (humano) (SEQ
ID Nº 2) o un análogo, fragmento o derivado del mismo. La invención
también incluye una molécula de ácido nucleico que codifica el
péptido apoEp1.B, o un análogo, fragmento, alargamiento o derivado
del mismo.
El término "análogo" incluye cualquier
péptido que tiene una secuencia de restos de aminoácidos
sustancialmente idéntica a la secuencia de apoEp1.B humano o de
ratón mostrada específicamente en esta memoria descriptiva en la
que uno o más restos se han sustituido de manera conservadora con un
resto funcionalmente similar y que muestra la capacidad de imitar
apoEp1.B como se describe en esta memoria descriptiva. Los ejemplos
de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un resto
no polar (hidrófobo) por otro tal como entre arginina y lisina,
entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina, la sustitución
de un resto básico tal como lisina, arginina p histidina por otro,
o la sustitución de un resto ácido, tal como ácido aspártico o
ácido glutámico por otro. La frase "sustitución conservadora"
también incluye el uso de un resto derivatizado en lugar de un
resto no derivatizado con tal que tal polipéptido muestre la
actividad requerida.
Los análogos de los péptidos incluyen los
péptidos que tienen las siguientes secuencias: TAQIRLQAEIFQAR (SEQ
ID. Nº 3); TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4); TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID.
Nº 5); y TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6).
"Derivado" se refiere a un péptido que
tiene uno o m´s residuos químicamente derivatizados mediante
reacción de un grupo secundario funcional. Tales moléculas
derivatizadas incluyen, por ejemplo, las moléculas en las que los
grupos amino libres se han derivatizado para formar clorhidratos de
amina, grupos p-tolueno sulfonilos, grupos
carbobenzoxi, grupos carbobenzoxi, grupos
t-butiloxicarbonil, grupos cloroacetilo o grupos
formilo. Los grupos carboxi libres se pueden derivatizar para
formar sales, metil y etil ésteres u otros tipos de ésteres de
hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres se pueden derivatizar para
formar derivados O-acilo u
O-alquilo. El nitrógeno imidazol de histidina se
puede derivatizar para formar
N-im-bencilhistidina. También
incluidos como derivados son aquellos péptidos que contienen uno o
más derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte
aminoácidos convencionales. Por ejemplo:
4-hidroxiprolina puede estar sustituido por prolina;
5-hidroxilisina puede estar sustituido por lisina;
3-metilhistidina puede estar sustituido por
histidina; homorserina puede estar sustituido por serina; y
ornitina puede estar sustituida por serina; y ornitina puede estar
sustituida por lisina. Los polipéptidos de la presente invención
también incluyen cualquier polipéptido que tiene uno o más
adiciones y uno o más supresiones o residuos relacionados con la
secuencia de un polipéptido cuya secuencia se conoce en esta
memoria descriptiva, mientras que la actividad requerida se
mantiene.
mantiene.
El término "fragmento" se refiere a
cualquier péptido sujeto que tiene una secuencia de aminoácidos más
corta que la de un péptido cuya secuencia de resto de aminoácido se
muestra en esta memoria descriptiva.
El término "alargamiento" se refiere a
cualquier péptido sujeto que tiene una secuencia de aminoácidos más
larga que uno o dos aminoácidos (o bien en el extremo carboxi o
amino) que la de un péptido de la presente invención.
Preferiblemente, el alargamiento se produce en el extremo terminal
amino.
Los fragmentos y alargamientos de los péptidos
incluyen los que tienen las siguientes secuencias: QTQQIRLQAE
IFQAR (SEQ ID. Nº 7) y QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
IFQAR (SEQ ID. Nº 7) y QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
El término "apoEp1.B" o "péptido de la
invención" como se usa en esta memoria descriptiva incluye un
péptido que comprende los residuos de aminoácidos 239 a 252 de una
proteína apolipoproteina E e incluye todos los análogos,
fragmentos, alargamientos o derivados del péptido apoEp1.B que
incluye las secuencias proporcionadas anteriormente en las SEQ ID
números 1-8. Preferiblemente, la apoEp1.B es al
secuencia de apoEp1.B murina TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nº 1) o la
secuencia de apoEp1.B AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2).
El péptido apoEp1.B se puede modificar para
hacerlo más terapéuticamente eficaz o adecuado. Por ejemplo, puede
estar ciclado ya que la ciclación permite que el péptido asuma una
conformación más favorable. la ciclación del péptido apoEp1.B se
puede lograr usando técnicas conocidas en la técnica. En particular,
se pueden formar enlaces disulfuro entre dos componentes espaciados
apropiadamente que tienen tres grupos sulfidrilo. Los enlaces se
pueden formar entre cadenas laterales de aminoácido, componentes no
aminoácidos o una combinación de los dos. Además, el péptido
apoEp1.B de la presente invención se puede convertir en sales
farmacéuticamente aceptables haciendo reaccionar con ácidos
inorgánicos que incluyen ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido
bromhídrico, ácido fosfórico, etc., los ácidos orgánicos que
incluyen ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido
glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido succínico, ácido
málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido
salicílico, ácido bencenosulfónico y ácidos tolueno sulfónico.
Las proteínas apoEp1.B de la invención también
se pueden preparar mediante técnicas convencionales. Por ejemplo,
los péptidos se pueden sisntetizar mediante síntesis química que
usan técnicas bien conocidas en la química de proteínas tales como
síntesis de fase sólida o en solución (véase por ejemplo J. M.
Stewart, y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2º edición
Ed., Pierce Chemical Co., Rockford III. (1984 y G. Barany y R. B.
Merrifield, The Peptides: Análisis Synthesis, Biology editors E.
Gross y J. Meienhofer Vol. 2 Academic Press, Nueva York, 1980, p.
3-254 para las técnicas de síntesis de fase sólida;
y M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer - Verlag,
Berlin 1984, y E. Gross y J. Meienhofer, Eds., The Peptides:
Análisis, Synthesis, Biology, antes, Vol 1, para síntesis de
solución clásica, y Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85:
2149-2154) o síntesis en solución homogénea
(Houbenwey, 1987, Methods of Organic Chemistry, ed E. Wansch, Vol
15 I I y II, Thieme, Stuttgart).
Los péptidos apoEp1.B de la invención también se
pueden producir mediante tecnología de ADN recombinante. Para
preparar los péptidos de la invención mediante técnicas de ADN
recombinante, se debe preparar una secuencia de ADN que codifica el
péptido apoEp1.B. Por consiguiente, la presente invención también
proporciona ácido nucleico purificado y aislado que tiene una
secuencia de nucleótidos que codifica un péptido apoEp1.B que
comprende una secuencia de aminoácidos TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nº 1)
o una secuencia de aminoácidos AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2).
La presente invención también proporciona un
vector de expresión que comprende una molécula de ADN que codifica
un péptido apoEp1.B adaptado para la transfección o transformación
de una célula hospedadora.
De acuerdo con lo anterior, las moléculas de
ácido nucleico de la presente invención se pueden incorporar de una
manera conocida en un vector de expresión apropiado que asegura la
expresión de la proteína. Los vectores de expresión posibles
incluyen pero no se limitan a, plásmidos, o virus modificados (por
ejemplo, retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus
asociados a adeno). El vector debe ser compatible con la célula
hospedadora usada. Los vectores de expresión son "adecuados para
transformación de una célula hospedadora", que significa que los
vectores de expresión contienen una molécula de ácido nucleico de la
invención y secuencias reguladoras seleccionadas entre las bases de
las células hospedadoras a usar para expresión, que se une de
manera operativa a la molécula de ácido nucleico. Unido de manera
operativa pretende significar que el ácido nucleico está unido para
regular las secuencias de una manera que permite la expresión de
ácido nucleico.
Por lo tanto la invención contempla un vector de
expresión recombinante de la invención que contiene una molécula de
ácido nucleico de la invención, o un fragmento del mismo, y las
secuencias reguladoras necesarias para la transcripción y
traducción de la secuencia de proteína insertada.
Las secuencias reguladoras adecuadas se pueden
derivar de una diversidad de fuentes, incluyendo genes bacterianos,
fúngicos, virales, de mamífero, o de insecto (por ejemplo, véase
las secuencias reguladoras descritas en Goeddel, Gene Expresión
Technology; Methods in Enzymology 185, Academia Press, San Diego, CA
(1990). La selección de secuencias reguladoras apropiadas depende
de la célula hospedadora elegida como se describe más adelante, y
se puede llevara a cabo fácilmente por los expertos en la técnica.
Los ejemplos de tales secuencias reguladoras incluyen: un promotor
y potenciador de transcripción o secuencia de unión a polimerasa,
una secuencia de unión a ribosomas, incluyendo una señal de inicio
de la traducción. De manera adicional, dependiendo de la célula
hospedadora elegida y el vector empleado, otras secuencias, tales
como un origen de la replicación, sitios adicionales de restricción
de ADN, potenciadotes, y secuencias que confieren la inducibilidad
de transcripción se puede incorporar en el vector de expresión.
Los vectores de expresión recombinantes de la
invención también pueden contener un gen marcador seleccionable que
facilita la selección de células hospedadoras transformadas o
transfectadas con una molécula recombinante de la invención. Los
ejemplos de genes marcadores seleccionables que codifican una
proteína tal como G418 e higromicina que confieren resistencia a
ciertos fármacos, \beta-galactosidasa,
cloranfenicol acetiltransferasa, luciferasa de luciérnaga, o una
inmunoglobulina o porción del mismo tal como la porción Fc de una
inmunoglobulina IgG.
Los vectores de expresión recombinantes se
pueden introducir en las células hospedadoras para producir una
célula hospedadora transformante. El término "célula hospedadora
transformante" pretende incluir células procarióticas y
eucarióticas que se han transformado o transfectado con un vector de
expresión recombinante de la invención. Los términos
"transformado con", "transfectado con",
"transformación" y "transfección" pretenden abarcar la
introducción de ácido nucleico (por ejemplo, un vector) en una
célula mediante una de las posibles técnicas conocidas en la
técnica. Las células procarióticas se pueden transformar con ácido
nucleico mediante, por ejemplo, electroporación o transformación
mediada por cloruro cálcico. El ácido nucleico se puede introducir
en las células de mamífero mediante técnicas convencionales tal como
coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio,
transfección mediada por DEAE - dextrano, lipofectina,
electroporación o microinyección. Los procedimientos adecuados para
transformar y transfectar células hospedadoras se pueden encontrar
en Sambrook y col., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), y otros
libros de texto de laboratorio.
Las células hospedadoras adecuadas incluyen una
amplia diversidad de células procarióticas o eucarióticas. Por
ejemplo, las proteínas de la invención se pueden expresar en células
bacterianas tales como E. coli, células de insecto (usando
baculovirus), células de levaduras de células de mamíferos: Las
células hospedadoras de levaduras y hongos adecuados para llevar a
cabo la presente invención incluyen, pero no se limitan a
Saccharomyces cerevisae, el género Pichia o Kluyveromyces y
varias especies del género Aspergillus. Las células de mamífero
adecuadas para llevar a cabo la presente invención incluyen, entre
otras: células COS (por ejemplo, ATCC Nº CRL 1650 ó 1651), BHK (por
ejemplo, ATCC Nº CRL 61), HeLa (por ejemplo, ATCC Nº CCL 2), 293
(ATCC Nº 1573) y NS-1. Otras células hospedadoras
adecuadas se pueden encontrar en Goeddel, Gene Experssion
Technology: Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego,
CA (1991).
Otro aspecto de la invención proporciona una
secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones de alta
rigurosidad a una secuencia de ácido nucleico que codifica un
péptido apoEp1.B de la invención. Las condiciones de rigurosidad
apropiadas que promueven la hibridación de ADN son conocidas por los
expertos en la técnica, o se pueden encontrar en Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1
6.3.6. Por ejemplo, se puede emplear 6,0 x cloruro sódico/citrato
de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido de lavado de 2,0 x
SSC a 50ºC. La rigurosidad se puede seleccionar en base a las
condiciones usadas en la etapa de lavado. A modo de ejemplo, la
concentración de sal en la etapa de lavado se puede seleccionar
entre una alta rigurosidad de aproximadamente 0,2 x SSC a 50ºC.
Además, la temperatura en la etapa de lavado puede ser en
condiciones de lata rigurosidad, aproximadamente 65ºC.
Los inventores se han encontrado
sorprendentemente que el péptido apoEp1.B de la invención es un
potente modulador inmune que actúa sobre una diversidad de células
inmunes. De manera interesante, el apoEp1.B es un modulador dual,
capaz de tanto inducir y suprimir una respuesta inmune. Como se ha
mencionado anteriormente, el péptido apoEp1.B comprende los
aminoácidos 239-252 de longitud apropiada de
apolipoproteína E (apoE) que incluye fragmentos, alargamientos,
análogos y derivados del péptido. Los inventores han mostrado que el
apoEp1.B pero no apoE o un péptido que comprende los aminoácidos
237-250 de apoE puede inducir la activación y
diferenciación de células inmunes.
De acuerdo con lo anterior, la presente
invención proporciona un procedimiento de modulación inmune que
comprende la administración de una cantidad eficaz del un péptido
apoEp1.B o un ácido nucleico que codifica un péptido apoEp1.B a una
célula o animal en necesidad del mismo.
El péptido apoEp1.B se puede usar para inducir
la tolerancia inmune. En particular, los presentes inventores han
demostrado que el péptido apoEp1.B puede activar células inmaduras
en células dendríticas tolerogénicos. De acuerdo con lo anterior,
la presente invención proporciona un procedimiento de inducción de
tolerancia inmune que comprende la administración de una cantidad
eficaz de un péptido apoEp1.B o un ácido nucleico que codifica un
péptido apoEp1.B a una célula o animal en necesidad del mismo. La
inducción de células dendríticas tolerogénicas pueden tener una
amplia diversidad de aplicaciones terapéuticas que incluyen
inflamación, enfermedad autoinmune y transplante. Las células
dendríticas tolerogénicas se pueden inducir in vitro y
después transferirse a un receptor que requiere las células. Como
alternativa, las células tolerofénicas se pueden inducir
directamente in vivo.
Los inventores han mostrado que el péptido
apoEp1.B es útil en la inhibición de inflamación. De acuerdo con lo
anterior, la presente invención proporciona un procedimiento para
inhibir la inflamación que comprende la administración de una
cantidad eficaz de un péptido apoEp1.B o un ácido nucleico que
codifica un péptido apoEp1.B a una célula o un animal en necesidad
del mismo. En una realización preferida, el péptido puede inhibir
la formación de la placa aterótica in vivo. Otras
enfermedades inflamatorias que se pueden tratar usando el péptido
apoEp1.B o ácido nucleico que codifica el péptido apoEp1.B incluye,
artritis, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), síndrome de
Sjogren, aterosclerosis, reestenosis, rechazo de transplante,
vasculopatía de transplante, asma, síndrome de insuficiencia
respiratoria, alergia, psoriasis, esclerosis múltiple, lupus
sistémico, glomerulonefritis aguda, trauma de la médula espinal, y
otros.
En una realización adicional, el péptido
apoEp1.B se puede usar para prevenir una reacción o enfermedad
autoinmune. Los presentes inventores han demostrado que el péptido
apoEp1.B pueden proteger a los ratones NOD de desarrollar diabetes.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un
procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad autoinmune que
comprende la administración de una cantidad eficaz de un péptido
apoEp1.B o un ácido nucleico que codifica un péptido apoEp1.B a un
animal en necesidad del mismo. En una realización preferida, la
enfermedad autoinmune es diabetes. Otras enfermedades autoinmunes
que se pueden tratar usando el péptido apoEp1.B o ácido nucleico
que codifica el péptido apoEp1.B incluyen esclerosis múltiple, EAE
que es el modelo de ratón de esclerosis múltiple, artritis
reumatoide, síndrome de Sjogren, lupus (SLE), enfermedad de
tiroides autoinmune y otras.
En un aspecto adicional, el péptido apoEp1.B se
puede usar para inducir una respuesta inmune mediante activación de
células inmunes. De acuerdo con lo anterior, la presente invención
proporciona un procedimiento de inducción de respuesta inmune que
comprende la administración de una cantidad eficaz de un péptido
apoEp1.B o un ácido nucleico que codifica un péptido apoEp1.B a un
animal en necesidad del mismo. En una realización el péptido, en
combinación con otras citoquinas tales como IL-4,
GM-CSF, TNA\alpha y ligando Flt3 inducen células
dendríticas inmaduras para diferenciarse en células inmunogénicas
maduras. Las células dendríticas maduras se pueden usar en una
amplia diversidad de aplicaciones incluyendo inmunoterapia
tumoral.
En otro aspecto, el péptido apoEp1.B se puede
usar para tratar tumores de origen inmune induciendo su
diferenciación. En particular, los presentes inventores han
demostrado que el péptido apoEp1.B puede inducir la diferenciación
y activación de leucemia monocítica, monoblástica y células
tumorales de linfoma. De acuerdo con lo anterior, la presente
invención proporciona un procedimiento de tratamiento de un tumor
que comprende la administración de una cantidad eficaz de un
péptido apoEp1.B o un ácido nucleico que codifica un péptido
apoEp1.B a un animal en necesidad del mismo.
El péptido apoEp1.B o el ácido nucleico que
codifica un péptido apoEp1.B también se puede usar para tratar o
provenir otras enfermedades o afecciones que requieren activación
inmune (que incluye enfermedades infecciosas tales como infecciones
virales) y tolerancia inmune (incluyendo transplante de órganos de
tejidos, alergias y las enfermedades inflamatorias y autoinmunes
indicadas anteriormente).
La administración de una "cantidad eficaz"
del péptido apoEp1.B o ácido nucleico de la presente invención se
define como una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante períodos
de tiempo necesarios para lograr el resultado deseado. La cantidad
eficaz de un compuesto de la invención puede variar de acuerdo con
factores tales como el estado patológico, edad, sexo, y peso del
animal. El régimen de dosificaciones se puede ajustar para
proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden
administrar varias dosis divididas diariamente o la dosis se puede
reducir proporcionalmente como se indica por las exigencias de la
situación terapéutica. El término "animal" como se usa en esta
memoria descriptiva todos los miembros del reino animal incluyendo
seres humanos.
En todos los procedimientos descritos
anteriormente, el péptido apoEp1.B se puede administrar in
vivo o ex vivo. En las aplicaciones ex vivo, el
péptido apoEp1.B se puede administrar a las células que se han
retirado del paciente en un cultivo in vitro. Después de
incubar las células y péptidos durante un período de tiempo
suficiente para el efecto deseado, las células se pueden volver a
introducir en el cuerpo del paciente. En un ejemplo, los monocitos
se pueden retirar de un paciente y cultivarse con apoEp1.B para
permitirles que maduren. Además, los antígenos tumorales o
autoantígenos se pueden añadir cuando se trata cáncer o enfermedades
autoinmunes, respectivamente. Los monocitos maduros que expresan
antígeno se pueden volver a introducir en el paciente e inducirá
una respuesta inmune al tumor o autoantígeno.
La presente invención incluye composiciones
farmacéuticas que contienen el péptido apoEp1.B o ácido nucleico o
sustancias que modulan los efectos de APOEp1.B para uso en los
procedimientos descritos para modular la respuesta inmune.
Tales composiciones farmacéuticas pueden ser
para uso intralesional, intravenosa, tópica, parenteral, local,
inhaladora o subcutánea, intradérmica, intramuscular, intratecal,
transperitoneal, oral, e intracerebral. La composición puede estar
en forma líquida, sólida o semisólida, por ejemplo, píldoras,
compilidos, cremas, cápsulas de gelatina, cápsulas, supositorios,
cápsulas de gelatina blandas, membranas, comprimidos, soluciones o
suspensiones. El péptido apoEp1.B se inyecta preferiblemente en una
solución salina o bien por vía intravenosa, intraperitoneal o
subcutánea.
Están disponibles varios modos de administración
cuando se usa una composición que contiene una molécula de ácido
nucleico que codifica una proteína apoEp1.B. Se pueden introducir
directamente en las células o tejidos in vivo moléculas
recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico que
codifica una proteína apoEp1.B, o fragmento de la misma usando
vehículos de administración tales como vectores retrovirales,
vectores de adenovirus y vectores de virus de ADN. También se
pueden introducir en células in vivo o in vitro usando
técnicas físicas tales como microinyección y electroporación o
procedimientos químicos tales como co-precipitación
e incorporación de ADN en los liposomas. Las moléculas
recombinantes también se pueden distribuirán la forma de un aerosol
o mediante lavado. Las moléculas de ácido nucleico de la invención
también se pueden aplicar extracelularmente tal como mediante
inyección directa en las células.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
se pretenden para administración a seres humanos o animales. Las
dosificaciones a administrar dependen de las necesidades
individuales, sobre el efecto deseado y sobre la vía elegida de
administración.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
preparar mediante procedimientos conocidos per se para la
preparación de composiciones farmacéuticamente aceptables que se
pueden administrar a pacientes, y de tal modo que una cantidad
eficaz de la sustancia activa se combina en una mezcla con un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados se
describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences
(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company,
Easton, Pa., Estados Unidos 1985).
En base esto, las composiciones farmacéuticas
incluyen, aunque no exclusivamente, el compuesto o sustancia activo
junto con uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente
aceptables, y contenidos en soluciones tamponadas con un pH
adecuado e isotónico con los fluidos fisiológicos. Las composiciones
farmacéuticas pueden de manera adicional contener otros agentes que
potencian la eficacia del péptido apoEp1.B o ácido nucleico.
La presente invención también incluyen miméticos
de péptidos o los péptidos apoEp1.B de la invención. Por ejemplo,
un derivado de péptido a partir de un dominio de unión de apoEp1.B
interactuará directamente o indirectamente con una molécula
asociada de tal manera que imite el dominio de unión nativo. Tales
péptidos pueden incluir inhibidores competitivos, potenciadotes,
miméticos de péptido, y similares. Todos estos péptidos así como
moléculas sustancialmente homólogas, complementarios o de otra
manera funcionalmente o estructuralmente equivalentes a estos
péptidos se pueden usar para propósitos de la presente
invención.
"Miméticos de péptidos" son estructuras que
sirven como sustitutos para péptidos en interacciones entre
moléculas (Véase Morgan y col., (1989), Ann. Reports Med. Chem. 24:
243 - 252 para una revisión). Los miméticos de péptidos incluyen
estructuras sintéticas que pueden o no pueden contener aminoácidos
y/o enlaces peptídicos pero mantienen la estructura y
características funcionales de un péptido, o potenciador o inhibidor
de la invención. Los miméticos de péptidos también incluyen
peptoides, oligopeptoides (Simon y col., (1972) Proc. Natl. Acad,
Sci Estados Unidos 89: 9367); y bibliotecas de péptidos que
contienen péptidos de una longitud diseñada que representan todas
las secuencias posibles de aminoácidos que corresponden a un péptido
de la invención. Los miméticos de péptidos se pueden diseñar
basándose en la información obtenida mediante reemplazo sistemático
de aminoácidos L por aminoácidos D, reemplazo de cadenas laterales
con grupos que tienen diferentes propiedades electrónicas, y
mediante reemplazo sistemático de enlaces de péptidos con reemplazos
de enlaces amida. Las restricciones de configuración locales
también se pueden introducir para determinar los requerimientos de
configuración para actividad de un mimético de péptido candidato.
Los miméticos pueden incluir enlaces amida isostéricos o
aminoácidos D para estabilizar o promover conformaciones a su vez
inversas y ayudar a estabilizar la molécula. Los análogos de
aminoácidos cíclicos se pueden usar para limitar los residuos de
aminoácidos a estados de configuración particulares. Los miméticos
también pueden incluir miméticos de estructuras secundarias de
péptidos inhibidoras. Estas estructuras pueden modelar la
orientación en tres dimensiones de restos de aminoácidos en
conformaciones secundarias conocidas de proteínas. Los peptoides que
también se pueden usar son oligómeros de aminoácidos
N-sustituidos y se pueden usar como motivos para la
generación de bibliotecas químicamente diversas de moléculas
novedosas.
Los péptidos de la invención también se pueden
usar para identificar compuestos de plomo para el desarrollo de
fármacos. La estructura de los péptidos descritos en esta memoria
descriptiva se pueden determinar fácilmente mediante un número de
procedimientos tales como RMN o cristalografía de Rayos X. Una
comparación de las estructuras de péptidos similares en secuencia,
pero que difieren en las actividades biológicas que inducen en
moléculas diana porque pueden proporcionar información sobre la
relación de la relación de actividad de la estructura de la diana.
La información obtenida a partir del examen de relaciones estructura
- actividad se puede usar para diseñar o bien péptidos modificados,
u otras pequeñas moléculas o compuestos de plomo que se pueden
ensayar para las propiedades predichas según se relaciona con la
molécula diana. La actividad de los compuestos de plomo se pueden
evaluar usando ensayos similares a los descritos en esta memoria
descriptiva.
La información sobre las relaciones estructura -
actividad también se puede obtener a partir de estudios de
co-cristalización. En estos estudios, un péptido con
una actividad deseada se cristaliza en asociación con una molécula
diana, y se determina la estructura de rayos X de los complejos.
Después la estructura se puede comparar con la estructura de la
molécula diana en su estado nativo, y la información a partir de tal
comparación se puede usar para diseñar los compuestos esperados que
posean las actividades deseadas.
Los siguientes ejemplos no limitantes son
ilustrativos de la presente invención:
Se disolvió forbol,
12-miristato, 13-acetato (PMA)
(Calbiochem, La Jolla, CA) en etanol y se almacenó a -80ºC.
Los ratones C57BL/6J (B6) (H2b), inactivación de
apo E (H2b), y BALB/c (H2d) entre 8 y 18 semanas usados en este
estudio se compraron a Jackson laboratorios, Bar Harbor, ME. Los
ratones se alimentaron con pienso (n1 5012), bajo en grasa (4,5%
p/p) y colesterol (0,022% p/p) (Ralston, Purina, San Luis, MO).
Líneas celulares transformadas
PU5-1.8 y J77A1.4 monocíticas murinas, células
THP-1 y U-937 de leucemia
monoblástica humanas y linfoma A20 de células B murinas se
cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco Laboratorios, Grand Island,
NY) que contienen 5 x 105 M 2ME, HEPES 10 mM, glutamina 2 mM, 5,0
IU/ml de penicilina estreptomicina (Gibco) y suero bovino fetal al
10% inactivado con calor (FBS) (Hyclone Laboratorios Inc., Logan,
UT) (cRPMI).
Los péptidos se sintetizaron en un sintetizador
de péptidos Beckman 990C como se ha descrito previamente (macNeil y
col., 1993). Después los péptidos se purificaron mediante HPLC en
una columna de fase inversa C18 con gradiente de agua acetonitrilo.
Los péptidos se disolvieron a 2 mg/ml en agua destilada y se filtró
de manera estéril a través de un filtro de 0,22 \mum y se diluyó
adicionalmente o bien en cRPMI 1640 antes de uso en ensayos de
proliferación, o se emulsionaron en CFA o IFA para inmunización de
ratones. Se usó apoE (Calbiochem) purificado por VLDL de plasma
humano como apoE nativo.
Se sacrificaron ratones en una cámara de
CO_{2} y o bien bazos o ganglios linfáticos se retiraron de manera
aséptica y se sumergieron en PBS enfriado con hielo. Las células se
separaron troceando los tejidos a través de un malla fina. Después
las células se sedimentaron mediante centrifugación a 1500 rpm
durante 5 minutos y se desecho el sobrenadante. Los eritrocitos en
las preparaciones de bazo se lisaron usando tampón de lisis ACK
(NH_{4}Cl 0,15 M, KHCO_{3} 1,0 M, Na_{2}EDTA 0,1 mM, pH 7,3)
durante 2 minutos a temperatura ambiente y después se volvieron a
suspender en PBS y se sedimentaron otra vez dos veces para lavar las
células.
Ratones BALB/c se inyectaron bajo anestesia con
volúmenes de 50 \mul que contienen 0, 1, 10 ó 100 \mug/ml de
péptido ApoE emulsionado en IFA o CFA en la almohadilla de la pata
posterior. Después de 10 días de drenaje (se retiraron ganglios
linfáticos (popliteal) y las células T se purificaron mediante pase
a través de lana de nylon. 5 x 10^{5} de células T purificadas y
2 x 10^{5} de de APC de bazo antólogo irradiado con gamma
^{60}Co, 2500 rads (Atomic Energy, Canadá) se incubaron con 0, 1,
10 ó 100 \mug/ml de péptido ApoE en placas de microvaloración de
fondo plano de 96 pocillos en CO_{2} al 5%, 37ºC durante 3 días.
PPD (20 \mug/ml) servía como control positivo en el que CFA
[^{3}H]-TdR (0,5 \muCi/pocillo) se añadió
durante 18 horas adicionales y las células se recogieron después
(Tomtec, Orange, CONN). La incorporación de
[^{3}H]-TdR se midió en un contador de centelleo
Líquido Microbeta (Wallac, Turku,
Finlandia).
Finlandia).
Células de exudado de bazo o peritoneal no
cebadas (PCE) se incubaron con 0, 1, 10 o 100 \mug/ml de apoEp1.B
o control negativo en placas de microvaloración de fondo plano de 96
pocillos en CO_{2} al 5%, 37ºC durante 2 días. Se añadieron 50
\mul de [^{3}H]-TdR (0,5 \muCi/pocillo) se
añadió durante 18 horas adicionales y las células se recogieron
después (Tomtec, Orange, CONN). La incorporación de
[^{3}H]-TdR se midió en un contador de centelleo
Líquido Microbeta (Wallac, Turku, Finlandia). Las líneas celulares
PU5-1.8, J77A1.4, A20, y U-937 se
trataron de manera similar, pero se incubaron con péptido durante 12
horas antes de la adición de [^{3}H]-TdR durante
18 horas adicionales. Los resultados de las líneas celulares
U-937 se presentan en la figura 15. Los
sobrenadantes de las células se recogieron a partir de la mayoría de
los cultivos de células antes de la adición de radiosótopos y se
ensayaron para evaluar el contenido de citoquina.
MLR alogénico primario se estableció con
esplenocitos NOD como estimuladores y células T vírgenes de BALB/c
enriquecidas en lana de nylon. Las células estimuladoras se
preincubaron durante 3 días con diferentes combinaciones de
apoEp.1B, GM - CSF, y sobrenadante de PU5-1.8 que
contiene TNF. Las células estimuladoras se trataron después con
mitomicina C (50 \mug/ml, 20 min a 37ºC; Sigma) y se
co-cultivó con 4 x 10^{4} de respondedor durante
3 días tiempo en el que las células se pulsaron con 50 \mul de
[^{3}H]-TdR (0,5 \muCi/pocillo) durante 24
horas. Las células se recogieron (Tomtec) y la incorporación de
[^{3}H]-TdR se midió en un contador de centelleo
Líquido Microbeta (Wallac). Cada barra representa la media de cpm a
partir de cultivos por triplicado.
Se ensayaron sobrenadantes de cultivos para
determinar la concentración de IL-2,
IL-4 e IFN\gamma usando ensayos de ELISA de
sándwich. Se siguieron los protocolos del fabricante (Pharmingen).
Se revistieron las placas ELISA de microvaloración de 96 pocillos
con 50 \mul, 1 \mug/ml de
\alpha-IL-2,
\alpha-IL-4 o
\alpha-IFN\gamma mAB en tampón de revestimiento
(0,1 M de NaHCO3, pH 8,2) durante toda una noche a 4ºC. Las placas
se lavaron dos veces con PBS-T (PBS,
Tween-20 (Sigma, San Luis, MO) y las placas se
bloquearon durante dos horas a temperatura ambiente con 100 \mul
de tampón de bloqueo (PBS, BSA al 5%). Las placas se lavaron dos
veces y se añadieron muestras de 50 \mul por triplicado durante
toda una noche., 4ºC de incubación. Las placas se lavaron después 5
veces y después de 2 horas a temperatura ambiente de período de
incubación con 50 \mul, 1 \mug/ml de
\alpha-IL-2,
\alpha-IL-4 o
\alpha-INF\gamma de mAB (Pharmingen), las
placas se lavaron 8 veces. 50 \mul, 1 \mug/ml de estreptavidina
- fosfatasa alcalina (Phamingen) se añadió durante 1 hora a
temperatura ambiente. Después de 8 lavados, se añadieron 50 \mul
de sustrato de p-nitrofenil fosfato (pNPP) (Sigma))
y se determinó la absorbancia a D. O. de 405 nm usando un lector de
microplacas (Biorad, Hercules, CA) después de desarrollar el
color.
Se lavaron 1 x 10^{6} células con PBS enfriado
con hielo y se volvieron a suspender en 25 \mul de PBS y se
incubaron con 10 \mul anticuerpos monoclonales de suero de ratón
normal y CD11a, CD11b, CD14, MHC de clase II, CD95, CD62L, CD62E,
B7-1, B7-2 e ICAM
anti-ratón conjugado con fluorocromo (Phamingen,
Mississauga, Canadá) (mAb's) durante 45 minutos sobre hielo. Se
trataron de manera similar los marcadores de células dendríticas
anticuerpos no conjugados (DEC-205, 33D11, CD11c
(N418), sin embargo, después de la incubación del anticuerpo
primario las células se lavaron 3 veces y se añadió después un
anticuerpo conjugado a fluorocromo anti- rata de cabra secundario
durante 45 minutos sobre hielo. Después las células se lavaron tres
veces. Todas las muestras se volvieron a suspender en 300 \mul de
PBS y se analizó la fluorescencia de las células teñidas en un
citómetro de flujo FACSscan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) y
los datos recogidos se analizaron usando software Lysis
(Becton-Dickinson).
Se lavaron 1 x 10^{6} células y se volvieron a
suspender en solución de tinción de yoduro de propidio hipotónico
(PI) (0,1% [p/v] de citrato de sodio, 0,1 [v/v] de triton
X-100, 0,05 \mug/ml de yoduro de propidio) y se
dejó teñir en la oscuridad durante toda una noche a 4ºC. Las células
se analizaron en un citómetro de flujo FACScan y el porcentaje de
células en cada fase del ciclo se cuantificó usando el software
ModFit (Becton Dickinson). Se excluyeron los agregados del análisis
con el uso del módulo de discriminación de doblete y posteriormente
controlando sobre el área de fluorescencia roja lineal (FL2) y
parámetros de anchura.
Se inyectaron ratones BALB/c i. p. con 300
\mug de péptido apoE y 48 horas después se recogieron
post-mortem mediante lavado peritoneal usando
solución salina enfriada con hielo.
Esplenocitos diabetogénicos agotados de RBC de
ratones NOD hembras de 17-20 semanas de edad se
volvieron a suspender en solución salina. Se inyectaron ratones
NOD.SCID de 8 a 10 semanas de edad i. p. con 0,2 \mul de solución
salina que contenía 10^{7} de los esplenocitos diabetogénicos.
Estos mismos ratones después se inmunizaron con o bien 200
\mug/ml de apoEp.1B o 200 \mug/ml de apoEp2 mediante la
almohadilla de la pata. Se controlaron los niveles de glucosa
bisemanalmente usando tiras de ensayo enzimático de glucosa (Eli
Lilly, Toronto, Ont). Una vez la orina ensayada positiva, se
ensayaron los niveles de glucosa en sangre (BGL) usando
Glucometrter Encore (Miles/Bayer). Los ratones que muestran BLG >
11,1 mmoles/l (200 mg/dl) durante dos semanas consecutivas se
consideraron diabéticos.
Esplenocitos no cebados, monocitos de bazo
enriquecidos y líneas celulares PU5-1 y J77A4.1
monocíticas de ratones BALB/c se incubaron con 0, 1, 10, ó 100
\mug/ml de apoEp1.B (239-252) o péptido apoEp1.D
(236-249) de control negativo para determinar la
actividad. Después de 2 horas, células incubadas de apoEp1.B, pero
no apEp1.D comenzaron a desprenderse de las placas de plástico y se
agregaron en suspensión de manera óptima a 100 gg/ml. Después de 24
horas, morfológicamente estas células parecían menos redondas, más
granulares. Se tomaron fotografías después de 24 horas, los
resultados se muestran en la figura 1 (magnificación 400 x). A las
48 horas mostraban procedimientos de tipo dendrítico. El análisis de
FACS confirmó un incremento en el tamaño celular y
granulación
(Figura 2).
(Figura 2).
Células tratadas con apoEp1.B morfológicamente
parecían similares a DC. Esto se confirmó por análisis de FACS.
Esplenocitos de BALB/c no cebados y células PU5-1.8
se incubaron durante 24 horas con 100 \mug/ml de péptido apoEp1.B
o control apoEp1.D y se tiñeron para análisis de FACS. La expresión
de superficie de CD14, CD11a, CD11b, CD11c, B7-1,
B7-2, DEC-205, 33D1, MHc clase II,
fas, CD40, CD62L (selección L) y CD43 (leucosialina) se
incrementaron por encima del fondo sobre células
PU-1.8 incubadas con apoEp1.B después de 24 horas de
incubación (las figuras 3 y 4). Con experimentación repetida, la
expresión de Mac-3 y CD54 (ICAM-1)
se encontró que eran relativamente variables.
Para determinar si apoEp1.B si los cambios
fenotípicos inducidos por apoEp1.B son dependientes de las dosis,
10^{5} células PU-5 se incubaron durante 20 horas
con 0 (medio) 1, 10 ó 100 \mug/ml de apoEp1.B en placas de 24
pocillos y se tiñeron para análisis de FACS. Se recogieron 10.000
casos. Se muestra el marcador B7. Los resultados, mostrados en la
figura 5 ilustran que 100 \mug/ml de apoEp1.B se encontró que era
óptima, 1 \mug/ml dio como resultado ligeros cambios
fenotípicos.
La superficie de expresión de
B7-1, B7-2, MHC Clase II, CD28,
CD11a, CD11c, y 33D1 se incrementaron por encima del fondo sobre
los esplenocitos incubados de apoEp1.B después de 24 horas de
incubación (véase la figura 4). También existía un incremento en
CD40 y una disminución de la selectina L (datos no mostrados) sobre
esplenocitos tratados con apoepl. No existía ningún cambio en la
expresión de CD 16/32 en ningún momento.
Esplenocitos no cebados de B6 y NOD se incubaron
con 100 \mug/ml de apoEp1.B o apoEp1.D para determinar si
apoEp1.B era específico de la cepa. Después de 48 horas en cultivo,
las células se tiñeron para análisis de FACS. Los esplenocitos B6 y
NOD respondían a apoEp1.B con un incremento de expresión de
marcados similar al de esplenocitos de BALB/c (datos no mostrados).
Células debazo vírgenes de ratones deficientes en (apo E K. O.)
también se ensayaron para determinar si la producción in vivo
de apoE tenía una influencia en este efecto. Los esplenocitos Apo E
K. O. también respondían con un incremento de expresión marcadora
similar al de BALB/c (datos no mostrados). Ya que el péptido
apoEp.1B humano (HapoEp1.B) (239-252) tiene un alto
grado de homología a apoEp1.B murino (^{239}T a ^{239_{a}} y
^{248}I a ^{248_{a}}), se ensayó la reactividad cruzada de
especie. La línea celular humana monocítica humana
U-937 respondía dentro de 24 horas a 100 \mug/ml
de apoEp1.B con similar, pero menos cambios morfológicos y
fenotípicos profucndos al de las células PU5-1.8
(figura 5). Para determinar si HapoEp1.B tenía un efecto similar
sobre las células murinas 10^{5} células PU5-1 se
incubaron con 100 \mug/ml de HapoEp1.B o apoEp1.B murino durante
24 horas. Después las células se tiñeron para análisis de de FACS.
HapoEp1.B inducía la formación de racimos de células y un incremento
en marcadores similares al de apoEp1.B murino, pero hasta un grado
menor (expresión del marcador B7-1 mostrado en la
figura 6).
Para determinar si apoEp1.B podría inducir
células de tipo DC in vivo, ratones BALB/c se inyectaron i.
p. con 300 \mug/ml de apoEp1.B o apoEp1.D. Después de 48 horas
las PEC se tiñeron para análisis de FACS. ApoEp1.B inducía un
incremento en el tamaño celular y granulación (Figura 8A) y un
incremento en la expresión de superficie de
DEC-205, 33D1, CD11c, B7-1 y
B7-2 (Figura 8B). Losa picos no marcados
corresponden a apoEp1.D. La intensidad fluorescente media se
muestra en paréntesis. Los resultados demuestran que apoEp1.B induce
la diferenciación y activación de PCE in vivo similar al
sistema in vitro.
Para determinar la activación funcional de
células tratadas apoEp1.B, esplenocitos de ratones BALB/c se
incubaron con o sin apoEp1.B (100 \mug/ml) in vitro
durante 24 horas. Las células (lavadas y no lavadas) se estimularon
con ConA durante 12 horas y se añadió 3H durante 12 horas
adicionales. Después las células se recogieron y se contó la
radiactividad captada. Los resultados se presentan como la media de
los pocillos por triplicado (cpm+/- SEM. Como se muestra en la
figura 9, células tratadas con apoEp1.B responden a mitógeno 3 veces
más que las células no tratadas.
Células de ganglios linfáticos de NOD
inmunizados con apoEp1.B o apoEp1.D se cultivaron durante 48 horas
en ausencia de antígeno de exposición o citoquina exógena. Se
recogieron los sobrenadantes celulares y se ensayaron para evaluar
contenido en citoquinas y determinar si apoEp1.B inducía una
respuesta Th1 o Th2. Células cebadas con apoEp1.B secretaban
niveles más altos de IL-4 y niveles inferiores de
IL-2 que las células cebadas con apoEp1.D (Figura
11). No había cambio en IFN\gamma.
Para medir la aloestimualción de células T o
capacidad inhibidora de estas DC, 4 x 10^{4} células T vírgenes
de BALB/c enriquecidas se co-cultivaron con 40, 400,
4000 y 40.000 esplenocitos de NOD tratados con mitomicina C que se
han incubado con diversos estimulantes durante 3 días. La
proliferación de células T se midió después de 3 días de
co-cultivo mediante incorporación de
[^{3}H]-TdR. Los resultados se muestran en la
figura 12. Las barras representan el significado de pocillos por
triplicado (cpm +/- S. D.). "Y" representa p < 0,05 y p
< 0,001, respectivamente en ANOVA de 2 colas comparado con
controles del medio solo (nil). La aloestimulación de APS apoEp1.B
era similar a la de las APC no tratadas a 4 x 10^{3} y 4 x
10^{2} APC. Existía un notable incremento en la aloestimulación
cuando las APC se preincubaron con GM-CSF,
particularmente a 4 x 10^{3} APC por pocillo. Este incremento
estaba ligeramente, pero significativamente reducido cuando las APC
se preincubaron con GM-CSF más apoEp1.B. Las APC (4
x 10^{3}) en todas las varras (excepto "T sola") se han no
tratado (nil) o preincubado con 100 \mug/ml de apoEp1.B, apoEp1.B
+ GM-CSF solos durante 3 días antes de
co-cultivar. Tras combinar células T respondedoras
con APC, se añadieron diversos factores exógenos, incluyendo 20
\mug/ml de Con A y 5 \mug/ml de apoEp1.B. Se ha detectado muy
poca proliferación en pocillos que contienen células T solas. Las
células T proliferaban bien en respuesta a Con A, sin embargo,
cuando se añadió apoEp1.B, la aloestimulación de células T estaba
completamente revocada.
Se sabe que las células monocíticas se pueden
diferenciar en DC, sin embargo, GM-CSF se ha pensado
durante mucho tiempo que es esencial para este efecto (Scheicher y
col., 1992). Se ha mostrado que un auto péptido novedosos,
apoEp1.B, solo induce las DC in vitro a partir de tanto
células vírgenes como línea celular murina. Estas DC poseen la
morfología y marcadores de superficie celular de DC clásicas. El
apoEp1.B también induce DC in vivo tras la inmunización con
apoEp1.B. Estas DC pueden favorecer una respuesta de Th2 como se
muestra por un incremento en Il-4 y una disminución
en la producción de IL-2, y pueden por lo tanto,
estar implicadas en la tolerancia de división.
El apoEp1.B inducía la morfología de DC de
esplenocitos de BALB/c vírgenes. monocitos de bazo enriquecidos
(datos no mostrados), las líneas celulares monocíticas
PU5-1.8 (Figura 1) y J77A4 in vitro (datos no
mostrados). Después de solamente 2 horas de incubación, células
tratadas con apoEp1.B comenzaron a desprenderse de las placas de
plástico y se agregaron en suspensión, un procedimiento
característico de DC. Ya que existía incremento en la muerte
celular, los ensayos de proliferación no mostraron un incremento
global en el número de células (datos no mostrados). Esto es
consistente con la pérdida de proliferación característica de
diferenciación celular.
El tratamiento con apoEp1.B de células
PUC-1.8 inducía un incremento de los marcadores
específicos de DC, DEC-205, 33D1 y CD11c. Otros
marcadores que incrementaban de manera consistente eran CD11a,
B7-1, MHC clase II, fas, CD40 y
L-selectina.
La estimulación de apoEp1.B de esplenocitos
inducía un incremento en la expresión de CD40, CD11a, CD11c, 33D1,
B7-1, B7-2, MHC clase II, fas y fas
L a las 24 horas. Se registró un perfil similar después de 72 horas
después de tratamiento con apoEp1.B (datos no mostrados). Estos
cambios no eran tan espectaculares como cambios en el marcador de
superficie de PU5-1.8 inducidos por apoEp1.B. Esto
no resta me´rito de los resultados obtenidos con
PU5-1.8 ya que estas células se transforman y son
capaces de un crecimiento rápido, división celular y síntesis de
proteínas.
Los cambios en las moléculas coestimuladoras de
B7 inevitablemente alterarían las respuestas de células T. Además
un incremento en MHC clase II permite a las DC presentar péptidos a
una densidad más alta que les hace más eficaces a o bien activación
o tolerancia de células T. Un incremento en la expresión de
moléculas de adhesión tal como LFA-1 puede permitir
la migración de DC desde diversos tejidos a órganos linfoides cuando
presentan Ag capturado.
Al contrario que los esplenocitos, la expresión
de L-selectina en células PUC-1.8 se
incrementa con la incubación de apoEp1.B (datos no mostrados). La
L-selectina rápidamente se regula hacia abajo sobre
células activadas y de esta manera los datos celulares sugieren que
el apoEp1.B activa estas células. Estos resultados opuestos no son
extraordinarios cuando se considera que PUC-1.8 se
transforman también como una población homogénea. Las interacciones
célula - célula heterogéneas así como factores estimuladores e
inhibidores de paracrina que afectan a las respuestas inmunes
pueden explicar algo de las diferencias entre células de bazo y
PU5-1.8. Además, células PU5-1.8
transformadas pueden carecer de los mecanismos necesarios para la
regulación hacia debajo de L-selectina, tal como
proteasas específicas para la escisión de
L-selectina. La expresión de CD28 sobre los
esplenocitos también se incrementa ligeramente con el tratamiento de
apoEp1.B.
Un ligero incremento en marcadores de
diferenciación de macrófagos CD14 y Mac-3, indica
que la maduración de macrófagos también se puede producir en
cultivos tratados con apoEp1.B. Si después estas células se pueden
desarrollar en las DC, apoptosis o permanecen como macrófagos no se
conoce.
Después de la inyección i. p., apoEp1.B inducía
un incremento en el tamaño de PEC y la granulación y un incremento
en los marcadores específicos de DC, DEC-205, 33D1 y
CD11 así como B-7 y B7-2. Por lo
tanto, la inyección de apoEp1.B i. p. induce que las PEC expresen
un fenotipo de tipo Dc similar comparado con los experimentos in
vitro. El incremento en la expresión de marcador DC no se
pronuncia tanto como lo era in vitro, probablemente debido a
la dilución y/o eliminación del péptido apoEp1.B in vivo. Sin
embargo, ya que las DC son eficaces en la estimulación de células
T, incluso un modesto incremento en el número puede tener un
profundo efecto en una respuesta
inmune.
inmune.
El tratamiento de ratones NOD con apoEp1.B
estimulaba un incremento en la secreción de IL-4,
presumiblemente por las células de tipo Th2 y una disminución en la
IL-2. La inmunización de ratones con apoEp1.B
también inducía un incremento en Dc.
Si el apoEp1.B es un producto escindid
naturalmente de apoE no está claro sino ambiguo. El apoEp1.B se une
a I-A^{d} con una afinidad similar a la del
péptido apoEp1.B original (que no induce las DC), incluso no se
eluía en experimentos de elución, es por lo tanto probable que no se
escinda de manera natural a altos niveles.
En este documento los inventores muestran que
apoEp1.B estimula la activación mo/ma. además, apoEp1.B induce DC
que puede favorecer una respuesta de tipo Th2, Estas DC pueden estar
parcialmente activadas o no completamente maduras, totalmente
activadas o inducidas hasta la total madurez mediante señales
inflamatorias.
Para investigar el papel del péptido apoEp1.B en
la inflamación, particularmente en respuesta a lesión arterial, se
usó un modelo de lesión de angioplastia de globo que se ha
caracterizado bien por el Dr. Alex Lucas (Lucas y col., 1996 Circ.
94: 2898-900). 300 \mug/ml de péptido apoEp1 o
apoEp1.B se infundieron intra-arterialmente
inmediatamente antes de angioplastia en el sitio de la lesión en la
arteria iliofemoral de la rata. El SERP-1 de
control positivo y solución salina de control negativo solo también
se usaron. Las ratas se controlaron cuidadosamente y se
sacrificaron 6 semanas después del tratamiento y las arterias
iliofemorales se evaluaron para el desarrollo de placa mediante
histoquímica. La medición cuidadosa del espesor arterial y el tamaño
de lumen mostró que el péptido apoEp1.B (500 \mug) reducía el
tamaño de la lesión en este modelo. De hecho, en muchas de las
ratas tratadas con apoEp1.B, no se detectó ninguna placa. No se
observaron ningún efecto adverso en ratas tratadas con apoEp1.B.
Los resultados se presentan en la tabla e y figura 10.
Ratones NOD, hembras de 8 semanas de edad se
inmunizaron con 250 \mug de péptido apoEp1.B emulsionado en IFA
en una almohadilla de la pata. 6 ratones control negativo se
inmunizaron con solución salina en IFA. Los ratones se controlaron
durante un período posterior de 4 meses y se ensayó su glucosa en
orina para determinar el desarrollo de la diabetes. En la fecha
final de 8 meses, los 8 ratones inmunizados con apoEp1.B permanecen
todavía sin diabetes. 4 de los 6 ratones tratados con solución
salina en IFA mueren debido a diabetes. Los resultados, mostrados
en la figura 14, muestran que la inmunización por apoEp1.B protege a
los ratones propensos a diabetes.
Ratones NOD se inmunizaron mediante la
almohadilla de la pata con \mug/ml de péptido apoEp1.B o apoEp1.D
en IFA. El drenaje de ganglios linfáticos se retiró después de 7
días y las células se cultivaron en placas de microvaloración de 96
pocillos en ausencia de estimulación adicional. Los sobrenadantes
del cultivo celular se recogieron 48 horas después y se ensayaron
para contenido en citoquina. Los resultados, mostrados en la figura
11, demostraron que la inmunización por apoEp1.B induce células de
tipo Th2. (Los resultados de IL-2,
IL-4 e IFN\gamma se presentan como la media de los
pocillos por triplicado (D. O. +/- SEM). * representa p < 0,001
en ANOVA de dos colas comparado con controles tratados con
apoEp1.D.)
Para determinar si la respuesta de Th2 inducida
por una inmunización de apoEp1.B influenciaba la incidencia de
IDDM, 10 ratones NOD de 8 semanas de edad se inmunizaron con 200
\mug/ml de apoEp1.B y 10 ratones con apoEp2 de control negativo
emulsionado en IFA en una almohadilla de la pata. Los ratones se
controlaron durante los siguientes 8 meses y su glucosa en orina y
sangre se ensayó para evaluar la aparición de la enfermedad. A los
10 meses, 7 de 10 ratones inmunizados con apoEp1.B permanece sin
diabetes, mientras que 1 de 10 ratones tratados con apoEp2
permanece sin diabetes. (Figura 13A).
Para determinar el efecto protector de apoEp1.B
en un modelo alternativo de IDDM, 10^{7} esplenocitos
diabetogénicos se transfirieron de manera adoptiva a 20 ratones
NOD.SCID. 10 de estos ratones se inmunizaron con 200 \mug/ml de
apoEp1.B, los otros con 200 \mug/ml de apoEp2, los otros con 200
\mug/ml de apoE2. Los 10 controles negativos han sucumbido a la
muerte después de 5 semanas. 5 de los 10 ratones apoEp1.B
permanecen sin diabetes a las 9 semanas (Figura 13B).
Ya que una respuesta de Th2 puede ser protectora
en el modelo NOD de IDDM y ya que la inmunización con apoEp1.B de
ratones NOD favorece una respuesta de tipo Th2 (véase la figura 11),
el apoEp1.B se ensayó para protección de la enfermedad en estos
ratones. La inmunización con apoEp1.B/IFA retrasava de manera
significativamente la aparición de la enfermedad en ratones NOD y
en ratones NOD.Scid transferidos de manera adoptiva. Los ratones
protegidos por apoEp1.B tenían ligeramente menos infiltración de
islotes cuando se compara con ratones no protegidos (datos no
mostrados), indicando que la protección por apoEp1.B puede
implicar la inducción de células reguladoras en lugar de la
supresión de células efectoras destructoras.
Las APC de ratones NOD se cree que tienen
defectos funcionales y/o de diferenciación (Serreze y col., 1988),
Ya que las células de Th2 de NOD son más dependientes son más
dependientes de de la coestimación de B7 que las células Th1
(Rulifson y col., 1997), una respuesta Th1 proinflamatoria puede
predominar en estos ratones por defecto. Consistentes con esto son
los estudios que demuestran que la hiposensibilidad de las células
Th2 intrínseca a los ratones NOD (Zipris 1991a y 1991b) es
reversible o bien mediante la administración de
IL-4 (Rapoport y col., 1993, Mueller y col., 1996,
Cameron y col., 1997) o CD28 (Arreaza y col., 1997) in vivo.
El tratamiento con anti-CD28 se cree que promueve la
supervivencia y expansión de Th2. Además, los ratones deficientes
en coestimulación (CED28 -/-) muestran IDDM más severa (Rulifson y
col., 1997).
No está claro qué papel de las DC juegue en
IDDM, sin embargo, la importancia de las DC en la enfermedad se
resalta por el ratón DC K.O (Rel. -/-). Estos ratones juegan
infiltración e inflamación de órganos múltiples agresiva. Otro
grupo reseño que las Dc pancreáticas pueden inducir la protección
contra la enfermedad tras la transferencia
(Clare-Salzler y col., 1992). Estos hallazgos
sugieren que las DC pueden jugar un papel protector en IDDM.
Además, Voorbj y col., (1999) mostraron que las DC eran las primeras
células que se acumulan alrededor de los islotes pancreáticos en el
modelo de rata BB diabético espontáneamente, seguido de
linfocitos.
Si la inducción de las DC tras la inyección de
apoEp1.B tiene un efecto directo en la protección de enfermedad
no se conoce, sin embargo, la respuesta de Th2 resultante puede ser
una protección intermedia. Se propone que la inmunización por
apoEp1.B estimula la diferenciación DC con un incremento en las
moléculas coestimuladoras de B7. Estas APC más eficaces, capaces de
una coestimulación más fuerte, rescata la sensibilidad de células
Th2 que producen IL-4 en ratones propensos a
diabetes. Esto a su vez reduce la incidencia de la enfermedad. Como
alternativa o de manera adicional, el apoEp1.B puede actuar
directamente sobre las células T, incrementando la expresión de
CD28 y/o reduciendo el umbral de la estimulación. Ya que las células
Th1 están ya estimuladas en los ratones NOD, la estimulación de
células Th2 o Th3 protectora se puede reestablecer preferentemente.
Consistente con este establecimiento son los datos que no muestran
ningún cambio en la producción de IFN, incluso un incremento en
IL-4.
Ya que la carencia de la insensibilidad de las
células Th2 intrínseca a ratones NOD (Zipris 1991a y 1991b) es
reversible, se propone que la inmunización por apoEp1.B rescate la
sensibilidad de Th2 en ratones propensos a diabetes, que a su vez
reduce la incidebncia de la enfermedad. Ya que las células T
requieren las APC para estimulación, los inventores especulan que
apoEp1.B estimula una APC que induce Th2, posible del fenotipo
DC. Independientemente del mecanismo, apoEp1.B puede ofrecer una
terapia potencial auto péptido para diabetes así como otras
enfermedades autoinmunes mediadas por Th1.
Se realizaron diversas sustituciones y
alargamientos de aminoácidos al péptido apoEp1.B como se ilustra
en las tablas 1 y 2. Los péptidos modificados se incubaron a 100
\mug/ml con 10^{5} células PU5-1.8 durante 20
horas. Las células se tiñeron con B7-1 para análisis
de FACS. Los resultados demuestran que alguno, pero no todas, las
sustituciones alargamientos o supresiones de a. a. pueden disminuir
o revocar los efectos de apoEp1.B (véase la tabla 1 y 2 y la
figura 16. Esto apoya la idea de que exista un receptor para el que
apoEp1.B se une y ciertos cambios de a. a. disminuyen la afinidad
de receptores de péptidos. La supresión de 239^{T} da como
resultado un efecto reducido en gran medida sobre cambios de
marcador de superficie. Sin embargo, la sustitución de este mismo
a. a. con una alanina (como en la secuencia de HapoEp1.B) tiene
solamente un efecto ligeramente reducido comparado con apoEp1.B. Por
lo tanto, la longitud de es probablemente importante en la unión de
receptor. También el péptido es probablemente importante en la unión
de receptor. También parece que la integridad estructural reside en
la región terminal carboxi del péptido apoEp1.B como incluso los
cambios ligeros en esa región disminuyen o suprimen la actividad del
péptido.
Aunque la presente invención se ha descrito con
referencia a la que actualmente se considera que es los ejemplos
preferidos, se ha de entender que la invención no se limita a la
descripción de los ejemplos. Por el contrario, la invención
pretende cubrir diversas modificaciones y las disposiciones
equivalentes incluidas dentro del espíritu y alcance de las
reivindicaciones anexas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Arreaza, G.A., Cameron, J.J.,
Jaramillo, A., Gill, B.M., Hardy, D.,
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\hskip1cmSingh, Bhagirath
\vskip1.000000\baselineskip
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<120> Procedimientos de modulación
inmune
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 9611-007
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Murine
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ile Phe
Gln Ala Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala Phe
Gln Ala Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ala Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ile Phe
Gln Ala Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Gln Ala Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ile Phe
Gln Ala Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Gln Gln Ala Arg Leu Gln Ala Glu Ile Phe
Gln Ala Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Gln Gln Ile Ala Leu Gln Ala Glu Ile Phe
Gln Ala Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Thr Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ile
Phe Gln Ala Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ile Phe Gln
Ala Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (39)
1. Un uso de un péptido apoEp1.B o un ácido
nucleico que codifica un péptido apoEp1.B para la fabricación de un
medicamento para la inducción de la diferenciación celular, en el
que el péptido apo Ep1.B tiene una secuencia de aminoácidos
seleccionada entre el grupo constituido por: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID
Nº 1); AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2); TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3);
TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4); TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5);
TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6); QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7) y
QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
2. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que la diferenciación es la diferenciación de un monocito a una
célula dendrítica.
3. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que la célula es una célula tumoral y el medicamento es para el
tratamiento del tumor.
4. Un uso de un péptido apoEp1.B o un ácido
nucleico que codifica un péptido apoEp1.B para la fabricación de un
medicamento para inducción de una tolerancia inmune, en la que el
péptido apoEp1.B tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada
entre el grupo constituido por: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nº 1);
AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2); TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3);
TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4); TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5);
TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6); QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7) y
QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
5. Un uso de un péptido apoEp1.B o un ácido
nucleico que codifica un péptido apoEp1.B para la fabricación de un
medicamento para la inhibición o prevención de inflamación, en la
que el péptido apoEp1.B tiene una secuencia de aminoácidos
seleccionada entre el grupo constituido por: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID
Nº 1); AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2); TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3);
TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4); TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5);
TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6); QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7) y
QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
6. Un uso de un péptido apoEp1.B o un ácido
nucleico que codifica un péptido apoEp1.B para la fabricación de un
medicamento para la inhibición del desarrollo de placa
aterosclerótica, en la que el péptido apoEp1.B tiene una secuencia
de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por:
TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nº 1); AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2);
TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3); TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4);
TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5); TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6);
QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7) y QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
7. Un uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
el que el medicamento es para inhibir la formación de placa
aterosclerótica.
8. Un uso de un péptido apoEp1.B o un ácido
nucleico que codifica un péptido apoEp1.B para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento o prevención de una respuesta
autoinmune, en la que el péptido apoEp1.B tiene una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por:
TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nº 1); AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2);
TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3); TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4);
TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5); TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6);
QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7) y QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
9. Un uso de acuerdo con la reivindicación 8 en
el que la enfermedad autoinmune es diabetes.
10. Un uso de un péptido apoEp1.B o un ácido
nucleico que codifica un péptido apoEp1.B para la fabricación de un
medicamento para la inducción de células dendríticas tolerogénicas,
en la que el péptido apoEp1.B tiene una secuencia de aminoácidos
seleccionada entre el grupo constituido por: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID
Nº 1); AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2); TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3);
TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4); TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5);
TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6); QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7) y
QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
11. Un uso de un péptido apoEp1.B o un ácido
nucleico que codifica un péptido apoEp1.B para la fabricación de un
medicamento para tratar un tumor, en la que el péptido apoEp1.B
tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo
constituido por: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nº 1); AQQIRLQAEAFQAR (SEQ
ID Nº 2); TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3); TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº
4); TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5); TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6);
QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7) y QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
12. Un uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 en el que el péptido apoEp1.B tiene la
secuencia de aminoácidos TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nº 1).
13. Un uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 en el que el péptido apoEp1.B tiene la
secuencia de aminoácidos AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2).
14. Un uso de acuerdo con cualesquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 en el que el péptido apoEp1.B tiene la
secuencia de aminoácidos TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3).
15. Un uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 en el que el péptido apoEp1.B tiene la
secuencia de aminoácidos TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4).
16. Un uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 en el que el péptido apoEp1.B tiene la
secuencia de aminoácidos TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5).
17. Un uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 en el que el péptido apoEp1.B tiene la
secuencia de aminoácidos TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6).
18. Un uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 en el que el péptido apoEp1.B tiene la
secuencia de aminoácidos QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7).
19. Un uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 en el que el péptido apoEp1.B tiene la
secuencia de aminoácidos QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
20. Una composición farmacéutica para uso como
un compuesto farmacéutico que comprende un péptido apoEp1.B o un
ácido nucleico que codifica un péptido apoEp1.B en mezcla con un
diluyente o vehículo adecuado, en la que el péptido apoEp1.B tiene
una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido
por: TQQIRLQAEIF
QAR (SEQ ID Nº 1); AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2); TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3); TQAIRLQAEIFQ
AR (SEQ ID. Nº 4); TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5); TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6); QTQQIRLQAEIF
QAR (SEQ ID. Nº 7) y QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
QAR (SEQ ID Nº 1); AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2); TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3); TQAIRLQAEIFQ
AR (SEQ ID. Nº 4); TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5); TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6); QTQQIRLQAEIF
QAR (SEQ ID. Nº 7) y QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
21. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 20, en la que la composición farmacéutica es para
el tratamiento de enfermedad autoinmune.
22. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 21, en la que la enfermedad autoinmune es
diabetes.
23. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 20, en la que la composición farmacéutica es para
el tratamiento de inflamación.
24. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 20, en la que la composición farmacéutica es para
el tratamiento de aterosclerosis.
25. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 20, en la que la composición farmacéutica es para
el tratamiento de un tumor.
26. Un péptido apoEp1.B que tiene la secuencia
de aminoácidos AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2)
27. Un péptido apoEp1.B tiene la secuencia de
aminoácidos TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3).
28. Un péptido apoEp1.B tiene la secuencia de
aminoácidos TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4).
29. Un péptido apoEp1.B tiene la secuencia de
aminoácidos TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5).
30. Un péptido apoEp1.B tiene la secuencia de
aminoácidos TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6).
31. Un péptido apoEp1.B tiene la secuencia de
aminoácidos QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7).
32. Un péptido apoEp1.B tiene la secuencia de
aminoácidos QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
33. Un péptido apoEp1.B o un ácido nucleico que
codifica un péptido apoEp1.B para uso como un compuesto
farmacéutico, en el que el péptido apo Ep1.B tiene una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por:
TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nº 1); AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2);
TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3); TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4);
TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5); TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6);
QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7) y QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
34. Un procedimiento para fabricar un
medicamento para la inducción de diferenciación celular, que
comprende la formulación de un péptido apoEp1.B en tal medicamento
en el que el péptido apoEp1.B tiene una secuencia de aminoácidos
seleccionada entre el grupo constituido por: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID
Nº 1); AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2); TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3);
TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4); TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5);
TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6); QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7) y
QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
\newpage
35. Un procedimiento para fabricar un
medicamento para la inducción de tolerancia inmune, que comprende la
formulación de un péptido apoEp1.B en tal medicamento en el que el
péptido apoEp1.B tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada
entre el grupo constituido por: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nº 1);
AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2); TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3);
TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4); TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5);
TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6); QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7) y
QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
36. Un procedimiento para fabricar un
medicamento para la inhibición o prevención de inflamación que
comprende la formulación de un péptido apoEp1.B en tal medicamento
en el que el péptido apoEp1.B tiene una secuencia de aminoácidos
seleccionada entre el grupo constituido por: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID
Nº 1); AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2); TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3);
TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4); TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5);
TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6); QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7) y
QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
37. Un procedimiento para fabricar un
medicamento para la inhibición del desarrollo de la placa
aterosclerótica que comprende la formulación de un péptido apoEp1.B
en tal medicamento en el que el péptido apoEp1.B tiene una secuencia
de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por:
TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nº 1); AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2);
TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3); TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4);
TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5); TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6);
QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7) y QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
38. Un procedimiento para fabricar un
medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad
autoinmune que comprende la formulación de un péptido apoEp1.B en
tal medicamento en el que el péptido apoEp1.B tiene una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por:
TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nº 1); AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nº 2);
TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 3); TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 4);
TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 5); TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 6);
QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 7) y QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID. Nº 8).
39. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 38, en el que la enfermedad autoinmune es
diabetes.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US6953197P | 1997-12-12 | 1997-12-12 | |
| US69531P | 1997-12-12 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2276481T3 true ES2276481T3 (es) | 2007-06-16 |
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ID=22089612
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98959681T Expired - Lifetime ES2276481T3 (es) | 1997-12-12 | 1998-12-11 | Peptido apoep1.b novedoso, composiciones y sus usos. |
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