ES2276713T3 - Compuesto de diamidina unidos a surcos estrechos del adn. - Google Patents

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Abstract

Compuesto de Fórmula I: en la que: X se selecciona del grupo que consiste en O, S, y NH; Y es CH o N; A es CH o N; B se selecciona del grupo que consiste en NH, O, o S; R1 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiarilo y oxiarilalquilo; R2 y R9 se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, hidroxilo, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, hidroxicicloalquilo, alcoxicicloalcoxi, hidroxialquilo, aminoalquilo y alquilaminoalquilo; y R3, R4, R13 y R14 se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo inferior, alcoxialquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, y alquilaminoalquilo, o R3 y R4 juntos o R13 y R14 juntos representan un alquilo, hidroxialquilo o alquileno C2 a C10, o R3 y R4 juntos o R13 y R14 juntos son: en el que n es un número de 1 a 3, y R10 es H o -CONHR11NR15R16, en el que R11 es un alquilo inferior y R15 y R16 se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo inferior; L se selecciona del grupo que consiste en: en el que R5, R6, R7 y R8 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo, halógeno, arilo, arilalquilo, aminoalquilo, aminoarilo, oxoalquilo, oxoarilo, y oxoarilalquilo; y en el que dicho compuesto de Fórmula I se une al surco estrecho del ADN como dímero.

Description

Compuesto de diamidina unidos a surcos estrechos del ADN.
Declaración de apoyo federal 
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La presente invención se realizó con el apoyo del Gobierno de los Estados Unidos bajo la subvención con número AI-33363 del Instituto Nacional de Salud. El Gobierno de Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre la presente invención.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a compuestos novedosos que reconocen secuencias mixtas (es decir, pares de bases GC así como AT), y específicamente se unen al surco estrecho ("minor groove") del ADN a través de la formación de un dímero.
Antecedentes de la invención
El diseño y descubrimiento de moléculas que pueden regular la expresión génica en células de una manera deseable y predecible es un objetivo central de investigación en la frontera entre la química y la biología. Ver, por ejemplo, Schreiber, S.L., Bioorg. Med. Chem. 6, 1127-1152 (1998); C. Denison y T. Kodadek, Chem. Biol. 5, R129-R145 (1998); A.G. Papavassiliou, Molecular Medicine Today 358-366 (1998); R.E. Bremer, et al., Chem. Biol. 5, 119-133 (1998): J. Gottesfeld et al., Nature 387, 202-205 (1997); H. Iida, Current Opinion Biotechnology 10, 29-33 (1999). El campo en desarrollo de la "genética química" requiere moléculas que tienen la selectividad necesaria para reconocer genes diana. Ver, por ejemplo, S. Schreiber, supra. y Schreiber, S. FASEB J. 11, p.M1 (1997).
Se ha observado que un conjunto de diamidinas aromáticas se unen al surco estrecho del ADN, y muestran una actividad microbiana útil. Se han propuesto varias hipótesis del modo de la acción antimicrobiana de las aril amidinas. Sin embargo, crece la evidencia de que estos compuestos funcionan mediante la formación de un complejo con ADN y la posterior inhibición selectiva de ADN dependiente de las enzimas microbianas. Se ha demostrado la intervención en el control de la transcripción y parece ser un modo plausible de acción para enlazadores al surco estrecho estructuralmente diversos. B.P. Das, et al., J. Med. Chem. 20, 531-536 (1977); D.W. Boykin, et al. J. Med. Chem. 36, 912-916 (1995); A. Kumar, et al., Eur. J. Med. Chem. 31, 767-773 (1996); R.J. Lombardy, et al., J. Med. Chem. 31, 912-916 (1996); R.R. Tidwell, et al. Antimicrob. Agents Chemother. 37, 1713-1716 (1993); R.R. Tidwell, y C.A. Bell, "Pentamidine and Related Compounds in Treatment of Pneumocystis carinii Infection," en Pneumocystis carinii, (Marcel Decker; Nueva York, 561-583 (1993)); D. Henderson, y L.H. Hurley, Nature Med. 1, 525-527 (1995); J. Mote, Jr., et al., J. Mol. Biol. 226, 725-737 (1994); y D.W. Boykin, et al., J. Med. Chem. 41, 124-129 (1998).
Los cationes orgánicos que se unen al surco estrecho del ADN también tienen actividades biológicas que varían desde infección anti-oportunística hasta propiedades anticancerígenas. Ver, por ejemplo, C. Baillo, en Advances in DNA Sequence-Specific Agents, Vol. 3, pp. 97-156 (L.H. Hurley, Ed. JAI Press Inc., Londres, UK, 1998); J.A.
Mountzouris y L.H. Hurley, en Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids, pp. 288-323, (S. M. Hecht, Ed. Oxford Univ. Press, Nueva York, 1996); E. Hildebrant, et al., J. Euk. Microbiol. 45, 112 (1998); y K. Hopkins et al., J. Med. Chem. 41, 3872 (1998). Dichos compuestos han proporcionado una riqueza de información fundamental sobre las propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos, y continúan siendo modelos importantes en el estudio de complejos de ácidos nucleicos.
El surco estrecho del ADN y las propiedades de reconocimiento de la secuencia de AT de moléculas de esta serie se han demostrado extensamente durante más de 30 años. Ver, por ejemplo, C. Zimmer y U. Wahnert, Prog. Biophys. Mol. Biol. 47, 31 (1986); B.H. Geierstanger y D.E. Wemmer, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24, 463 (1995); W.D. Wilson, en Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Capítulo 8 (G.M. Blackburn y M.J. Gait, Eds., IRL Press, Oxford, U.K., 1996). El compuesto netropsina (ver figura 1) fue el primer compuesto de enlace al surco estrecho cristalizado con un ADN en forma B, y la estructura del complejo proporcionó sugerencias claras sobre la base molecular para el reconocimiento específico de la secuencia de pares de bases AT. M.L. Kopka, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 1376 (1985). La estructura de la netropsina también condujo al desarrollo de los análogos de netropsina que se unen al surco estrecho, las lexitropsinas, que podían reconocer específicamente pares de bases GC y, de este modo, podían extender la capacidad de reconocimiento de secuencias. Ver, J.W. Lown et al., Biochemistry 25, 7408 (1986); M.L. Kopka y T. A. Larsen, en Nucleic Acid Targeted Drug Design, pp. 303-374C (L. Probst y T.J. Perun Eds., Marcel Dekker Inc., Nueva York, 1992); y M.L. Kopka et al., Structure 5, 1033 (1997). Los esfuerzos iniciales en el diseño de dichos análogos proporcionaron compuestos con un mejor reconocimiento de pares de bases GC, pero desafortunadamente, la especificidad obtenida no era significativa. En este área hubo un gran avance con el descubrimiento de que el compuesto monocatiónico distamicina (figura 1) podía unirse al surco estrecho de algunas secuencias AT de ADN como un dímero antiparalelo apilado. Ver, J.G. Pelton y D.E. Wemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 5723 (1989), y J.G. Pelton y D.E. Wemmer, J. Am. Chem. Soc. 112, 1393 (1990).
Uno de los principios de reconocimiento iniciales para las secuencias AT era el hecho de que el surco estrecho es más estrecho en regiones AT que en regiones GC, y es quizás la característica más sorprendente del complejo de dímero que el surco estrecho en la forma B del ADN puede expandirse fácilmente a la anchura requerida para la unión del dímero. La expansión del surco no sólo permite que el dímero se una, sino que también proporciona el reconocimiento de ambas cadenas en el dúplex a través del reconocimiento de la cadena complementaria mediante las dos moléculas del dímero. La sustitución del grupo pirrol en la distamicina por imidazol proporcionó una mejor especificidad en el reconocimiento de GC con los complejos de dímero y los esfuerzos de diseño actuales en este sistema han alcanzado un nivel de éxito elevado. Ver, por ejemplo, C.L. Kielkopf, et al., Nature Struct. Biol. 5, 104 (1998); S. White et al., Nature 391, 468 (1998); C.L. kielkopf et al., Science 282, 111 (1998); S.E. Swalley et al., J. Am. Chem. Soc. 121, 1113 (1999); y D.M. Herman et al., J. Am. Chem. Soc. 121, 1121 (1999). Con la incorporación reciente de grupos hidroxipropilo como unidad de reconocimiento, AT y TA así como las pares de bases GC y CG se pueden distinguir actualmente de forma eficaz en las secuencias de ADN mediante poliamidas de pirrol-imidazol relacionadas con distamicina.
El sistema de poliamidas de pirrol-imidazol es el único de los motivos de unión al surco estrecho bien conocidos que se ha observado que forma la unidad de reconocimiento del dímero apilado. Incluso la netropsina, el primer agente de unión al surco estrecho en caracterizarse estructuralmente con detalle y un "pariente" dicatiónico de la distamicina monocatiónica (figura 1), no forman una unidad de reconocimiento del dímero. En una estructura cristalina reciente de un complejo 2:1 de netrospina-ADN se observó que las dos moléculas de netropsina en el complejo se unieron al surco estrecho como unidades de monómeros en tándem en lugar de los dímeros side-by-side observados con distamicina. Ver, por ejemplo, X. Chen, et al., J. Mol. Biol. 267, 1157 (1997); X. Chen, et al., Nucleic Acids Res. 26, 5464 (1998); y X. Chen, et al. Nature Struct. Biol. 1, 169 (1994). Se ha postulado que las dos cargas de netropsina así como otros agentes de surco estrecho, tales como los derivados de furano mostrados en la figura 1, previenen la formación de dímeros apilados.
Las evidencias recientes sugieren que algunos colorantes de cianina monocatiónica pueden formar un conjunto de dímeros apilados en el surco estrecho de ADN. Ver J.L. Seifort, et al., J. Am. Chem. Soc. (publicado en 1999). Sin embargo, existen otros agentes de surco estrecho monocatiónicos, tales como Hoechst 33258 (ver figura 1 y análogos), que aparentemente no forman motivos de reconocimiento de ADN en dímeros. Estos resultados indican que las necesidades electrostáticas y estereoquímicas para el reconocimiento del surco estrecho del ADN mediante dímeros son muy restrictivas, y además sugieren que la formación de dímeros apilados mediante dicationes es improbable.
Los grupos catiónicos de fenilamidina unidos mediante un anillo furano(furamidina) y compuestos relacionados se unen como monómeros a secuencias de AT de ADN. Se ha observado que un derivado asimétrico (DB293) con uno de los anillos fenilo de furamidina sustituido por un bencimidazol se une a sitios que contienen GC en ADN más fuertemente que a secuencias de AT puras. DB293 se une en el surco estrecho a secuencias específicas que contienen GC de ADN en una manera altamente cooperativa como dímero apilado. (L. Wang et al., Proceedings of the Nacional Academy of Sciences, vol. 97, 12 (2000)).
Descripción resumida de la invención
La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente de los inventores de una nueva clase de dicationes orgánicos, basados en sistemas aromáticos no fusionados, que reconocen selectivamente secuencias de ADN mixtas (es decir, pares de bases AT así como GC) de manera que son muy sensibles a la estructura del compuesto. Éstos son los primeros compuestos no peptídicos que tienen la capacidad de reconocimiento de secuencias mixtas y el resultado es particularmente prometedor, ya que compuestos similares entran fácilmente en las células y tienen generalmente una toxicidad baja. Ver, K. Hopkins et al., J. Med. Chem. 41, 3872-3878 (1998). Una característica sorprendente de este descubrimiento es que el reconocimiento tiene lugar mediante la formación altamente cooperativa de dímeros en el sitio de unión a ADN, un proceso que se había predicho que no tendría lugar para dicationes. La serie de compuestos proporciona un nuevo motivo sintéticamente accesible para el reconocimiento específico de ADN y el control de la expresión génica. Por consiguiente, dichos compuestos son útiles en numerosas terapias y tratamientos, incluyendo el tratamiento y la prevención de infecciones oportunas, cáncer y otras enfermedades de la proliferación celular, y trastornos de origen genético (es decir, enfermedades causadas por mutaciones de ADN y similares). Adicionalmente, ciertos compuestos de la presente invención son fluorescentes y, de este modo, son útiles para la detección de ciertas secuencias específicas reconocidas por los compuestos de la presente invención.
Por consiguiente, un primer aspecto de la presente invención es un compuesto de Fórmula I:
1
en la que:
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X se selecciona del grupo que consiste en O, S, y NH;
Y es CH o N;
A es CH o N;
B se selecciona del grupo que consiste en NH, O, o S;
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiarilo y oxiarilalquilo;
R_{2} y R_{9} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, H_{2}, hidroxilo, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, hidroxicicloalquilo, alcoxicicloalcoxi, hidroxialquilo, aminoalquilo y alquilaminoalquilo; y
R_{3}, R_{4}, R_{13} y R_{14} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo inferior, alcoxialquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, y alquilaminoalquilo, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos representan un alquilo, hidroxialquilo o alquileno C_{2} a C_{10}, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13}
y R_{14} juntos son:
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2
en el que n es un número de 1 a 3, y R_{10} es H o -CONHR_{11}NR_{15} R_{16}, en el que R_{11} es un alquilo inferior y R_{15} y R_{16} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo inferior;
L se selecciona del grupo que consiste en:
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en el que R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo, halógeno, arilo, arilalquilo, aminoalquilo, aminoarilo, oxoalquilo, oxoarilo, y oxoarilalquilo; y en el que dicho compuesto de Fórmula I se une a ADN de secuencia mixta en el surco estrecho en la formación de un dímero.
En una realización preferida de la invención, el compuesto tiene la Fórmula I, en la que L es
10
A es N, B es NH, X es O, Y es CH, R_{1}, R_{2}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{14}, son cada uno H, y R_{3} y R_{13} son cada uno H.
Un segundo aspecto de la invención es un procedimiento de unión selectiva de ADN de secuencia mixta que comprende poner en contacto una muestra de ADN con un compuesto de Fórmula
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11
en la que:
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, y NH;
Y es CH o N;
A es CH o N;
B se selecciona del grupo que consiste en NH, O, o S;
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiarilo y oxiarilalquilo;
R_{2} y R_{9} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, H_{2}, hidroxilo, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, hidroxicicloalquilo, alcoxicicloalcoxi, hidroxialquilo, aminoalquilo y alquilaminoalquilo; y
R_{3}, R_{4}, R_{13} y R_{14} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo inferior, alcoxialquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, y alquilaminoalquilo, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos representan un alquilo, hidroxialquilo o alquileno C_{2} a C_{10}, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos son:
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12
en el que n es un número de 1 a 3, y R_{10} es H o -CONHR_{11}NR_{15} R_{16}, en el que R_{11} es un alquilo inferior y R_{15} y R_{16} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo inferior;
L se selecciona del grupo que consiste en:
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en el que R_{5} es H; y R_{6}, R_{7} y R_{8} se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo, halógeno, arilo, arilalquilo, aminoalquilo, aminoarilo, oxoalquilo, oxoarilo, y oxoarilalquilo.
En una realización preferida del segundo aspecto, L es:
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20
A es N, B es NH, X es O, Y es CH, R_{1}, R_{2}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{14}, son cada uno H, y R_{3} y R_{13} son cada uno H.
En otra realización preferida del segundo aspecto, L es:
21
A es N, B es NH, X es O, Y es CH, R_{1}, R_{2}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{14}, son cada uno H, y R_{3} y R_{13} son cada uno H.
Un tercer aspecto de la presente invención es un procedimiento de detección de secuencias de ADN mixtas que comprenden poner en contacto una muestra de ADN con un compuesto fluorescente de Fórmula:
22
en la que:
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, y NH;
Y es CH o N;
A es CH o N;
B se selecciona del grupo que consiste en NH, O, o S;
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiarilo y oxiarilalquilo;
R_{2} y R_{9} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, H_{2}, hidroxilo, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, hidroxicicloalquilo, alcoxicicloalcoxi, hidroxialquilo, aminoalquilo y alquilaminoalquilo; y
R_{3}, R_{4}, R_{13} y R_{14} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo inferior, alcoxialquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, y alquilaminoalquilo, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos representan un alquilo, hidroxialquilo o alquileno C_{2} a C_{10}, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos son:
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en el que n es un número de 1 a 3, y R_{10} es H o -CONHR_{11}NR_{15} R_{16}, en el que R_{11} es un alquilo inferior y R_{15} y R_{16} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo inferior;
L se selecciona del grupo que consiste en:
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29 
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30
en el que R_{5} es H; y R_{6}, R_{7} y R_{8} se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo, halógeno, arilo, arilalquilo, aminoalquilo, aminoarilo, oxoalquilo, oxoarilo, y oxoarilalquilo; y a continuación, observar la fluorescencia en la muestra, indicando la observación de la fluorescencia que las secuencias de ADN mixtas se han unido.
En una realización preferida del tercer aspecto, L es:
31
A es N, B es NH, X es O, Y es CH, R_{1}, R_{2}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{14}, son cada uno H, y R_{3} y R_{13} son cada uno H.
Un cuarto aspecto de la presente invención es una formulación farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula:
32 
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en la que:
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, y NH;
Y es CH o N;
A es CH o N;
B se selecciona del grupo que consiste en NH, O, o S;
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiarilo y oxiarilalquilo;
R_{2} y R_{9} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, H_{2}, hidroxilo, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, hidroxicicloalquilo, alcoxicicloalcoxi, hidroxialquilo, aminoalquilo y alquilaminoalquilo; y
R_{3}, R_{4}, R_{13} y R_{14} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo inferior, alcoxialquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, y alquilaminoalquilo, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos representan un alquilo, hidroxialquilo o alquileno C_{2} a C_{10}, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos son:
33
en el que n es un número de 1 a 3, y R_{10} es H o -CONHR_{11}NR_{15} R_{16}, en el que R_{11} es un alquilo inferior y R_{15} y R_{16} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo inferior;
L se selecciona del grupo que consiste en:
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40
en el que R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo, halógeno, arilo, arilalquilo, aminoalquilo, aminoarilo, oxoalquilo, oxoarilo, y oxoarilalquilo; en un portador farmacéuticamente aceptable.
En una realización preferida del tercer aspecto, L es:
41
A es N, B es NH, X es O, Y es CH, R_{1}, R_{2}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{14}, son cada uno H, y R_{3} y R_{13} son cada uno H.
Un quinto aspecto de la presente invención incluye procedimientos de control de la expresión génica, procedimientos de tratamiento del cáncer y otros trastornos de proliferación de células, y procedimientos de tratamiento de trastornos de origen genético (es decir, cuando el estado de la enfermedad está causado por una mutación o mutaciones génicas) que comprenden la utilización de un compuesto de Fórmula:
42
en la que:
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, y NH;
Y es CH o N;
A es CH o N;
B se selecciona del grupo que consiste en NH, O, o S;
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiarilo y oxiarilalquilo;
R_{2} y R_{9} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, hidroxilo, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, hidroxicicloalquilo, alcoxicicloalcoxi, hidroxialquilo, aminoalquilo y alquilaminoalquilo; y
R_{3}, R_{4}, R_{13} y R_{14} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo inferior, alcoxialquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, y alquilaminoalquilo, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos representan un alquilo, hidroxialquilo o alquileno C_{2} a C_{10}, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos son:
43
en el que n es un número de 1 a 3, y R_{10} es H o -CONHR_{11}NR_{15} R_{16}, en el que R_{11} es un alquilo inferior y R_{15} y R_{16} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo inferior;
L se selecciona del grupo que consiste en:
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50
en el que R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo, halógeno, arilo, arilalquilo, aminoalquilo, aminoarilo, oxoalquilo, oxoarilo, y oxoarilalquilo.
\newpage
Un sexto aspecto de la presente invención es la utilización de un compuesto de Fórmula:
51
en la que:
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, y NH;
Y es CH o N;
A es CH o N;
B se selecciona del grupo que consiste en NH, O, o S;
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiarilo y oxiarilalquilo;
R_{2} y R_{9} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, hidroxilo, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, hidroxicicloalquilo, alcoxicicloalcoxi, hidroxialquilo, aminoalquilo y alquilaminoalquilo; y
R_{3}, R_{4}, R_{13} y R_{14} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo inferior, alcoxialquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, y alquilaminoalquilo, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos representan un alquilo, hidroxialquilo o alquileno C_{2} a C_{10}, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos son:
52
en el que n es un número de 1 a 3, y R_{10} es H o -CONHR_{11}NR_{15} R_{16}, en el que R_{11} es un alquilo inferior y R_{15} y R_{16} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo inferior;
L se selecciona del grupo que consiste en:
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en el que R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo, halógeno, arilo, arilalquilo, aminoalquilo, aminoarilo, oxoalquilo, oxoarilo, y oxoarilalquilo; para unirse selectivamente a ADN de secuencia mixta.
Un último aspecto de la presente invención es la utilización de un compuesto de Fórmula:
60
en la que:
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, y NH;
Y es CH o N;
A es CH o N;
B se selecciona del grupo que consiste en NH, O, o S;
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiarilo y oxiarilalquilo;
R_{2} y R_{9} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, hidroxialquilo, y aminoalquilo; y
R_{3}, R_{4}, R_{13} y R_{14} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en alcoxialquilo, arilo, alquilarilo, hidroxialquilo, y aminoalquilo, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos representan un alquilo, hidroxialquilo o alquileno C_{2} a C_{10}, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos son:
61
en el que n es un número de 1 a 3, y R_{10} es H o -CONHR_{11}NR_{15} R_{16}, en el que R_{11} es un alquilo inferior y R_{15} y R_{16} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo inferior;
L se selecciona del grupo que consiste en:
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en el que R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo, halógeno, arilo, arilalquilo, aminoalquilo, aminoarilo, oxoalquilo, oxoarilo, y oxoarilalquilo; para la preparación de un medicamento destinado a tratar una infección microbiana en un sujeto con necesidad de dicho tratamiento.
Los aspectos anteriores y otros de la presente invención se explican con detalle a continuación en el documento.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra las estructuras químicas para los compuestos de unión al surco estrecho, netropsina, distamicina, Hoechst 33258, furamidina (DB75), DB270, y DB293. La figura 1 también muestra las secuencias de ADN para oligo1, oligo2, oligo2-1 y oligo 2-2, tal y como se describen en la presente invención.
La figura 2 muestra los resultados de un experimento de valoración cuantitativa de obtención de huellas de ADNasa I con el compuesto DB293 en el fragmento de 265 pb de ADN tal y como se describe en la presente. El fragmento de restricción EcoRI-PvuII del plásmido pBS estaba marcado en el extremo 3' en el sitio EcoRI con [\alpha-^{32}P]dATP en presencia de transcriptasa inversa AMV. Tal y como se muestra en la figura 2A, los productos de digestión de la ADNasaI se resolvieron en un gel de poliacrilamida al 8% que contenía urea 8 M. Las concentraciones del fármaco fueron (bandas 1-11) 0, 0,3, 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,1, 2,4, 2,7, 3,0 \muM para DB293 y (bandas 12-15) 0, 1, 2 y 5 \muM para DB270. Las bandas marcadas con "G" representan marcadores de dimetilsulfato-piperidina específicos para guaninas. La banda marcada con ADN no contenía ni fármaco ni enzima. Los números en la parte derecha del gel se refieren al esquema numérico del fragmento. Los rectángulos en la parte izquierda se refieren a las posiciones de sitios de unión ricos en AT (rectángulos en blanco) y sitios de unión ricos en GC (rectángulos rellenos) para DB293. La figura 2B es una ilustración gráfica de representaciones de la obtención de huellas para la unión de DB293 al sitio 5’-AATAA en AT (círculos blancos) y al sitio 5’-ACCATG rico en GC (cuadrados rellenos). La intensidad relativa de la banda R corresponde a la relación I_{c}/I_{o}, donde I_{c} es la intensidad de la banda a la concentración de ligando c e I_{o} es la intensidad de la misma banda en ausencia de DB293. Las representaciones de división diferencial mostradas en las figuras 2C comparan la susceptibilidad del ADN a ser cortado por ADNasaI en presencia de DB270 5 \muM (círculos rellenos) o DB293 1,5 \muM (cuadrados blancos). La desviación de los puntos con respecto a la secuencia indicada con letras (valores negativos) corresponde a un sitio protegido por ligando y la desviación (valores positivos) representa la división mejorada. La escala vertical está en unidades de ln(f_{a}) - ln(f_{c}), donde f_{a} es la división fraccional en cualquier enlace en presencia del fármaco y f_{c} es la división fraccional del mismo enlace en el control. Los resultados se muestran en una escala logarítmica por conveniencia. Los rectángulos por debajo de la secuencia muestran las posiciones del sitio de unión a AT (rectángulos vacíos) y sitios ricos en GC (rectángulos rellenos).
La figura 3 muestra representaciones de Scatchard de los resultados de unión de DB293 y DB270 a oligo 1 y oligo 2-1 junto con las curvas de unión mejor ajustadas: los triángulos rellenos y los triángulos vacíos son para DB293 y DB270, respectivamente, que se unen a oligo 1. Los círculos rellenos y los círculos vacíos son para la unión de DB293 y DB270 a oligo 2-1, respectivamente. Debido a la unión débil de DB270 a oligo 2-1, los resultados se ajustaron con la suposición de una unión de DB270 único al dúplex. En la figura 6 se muestran los sensogramas con los datos para esta representación.
La figura 4 es un espectro COSY bidimensional de la región espectral TH6-TCH3 mostrado para ADN libre (arriba, A); una muestra con proporción 1:1 de DB293 con respecto a oligo 2-1 (centro, B): y (abajo, C) una proporción 2:1. Las señales para el ADN libre y para el complejo 2:1 en la muestra con proporción 1:1 se indican conectando las líneas a la parte superior e inferior del espectro.
La figura 5 muestra curvas de Pf en función de la proporción para complejos de DB270 y DB293 con oligo 2-1. Los círculos rellenos indican ADN libre; los triángulos rellenos y los triángulos vacíos indican DB293 en las proporciones 1:1 y 2:1, respectivamente, y los cuadrados rellenos y los cuadrados vacíos indican DB270 en las proporciones 1:1 y 2:1, respectivamente.
La figura 6 muestra sensogramas para la unión de DB270 y DB293 a oligo 2-1 (arriba, A) y a oligo 1 (abajo, B). Las concentraciones de fármaco varían desde 1 nM a 1 \muM.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La presente invención se describirá a continuación en detalle con referencias a los dibujos adjuntos, en los que se muestran las realizaciones preferidas de la invención. Sin embargo, la presente invención se puede realizar en diferentes formas y no debería interpretarse como limitada a las realizaciones expuestas en la presente. En cambio, estas realizaciones se proporcionan de manera que esta descripción será profunda y completa y proporcionará completamente el alcance de la presente invención para los expertos en la materia.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención tienen el mismo significado según se entiende habitualmente por un técnico en la materia a la que pertenece la presente invención. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas en la presente invención se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.
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Las secuencias de nucleótidos se presentan en la presente invención mediante una única cadena, en la dirección de 5'a 3', de izquierda a derecha. Los nucleótidos se representan en la presente invención de la forma recomendada por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Comission según 37 CFR \NAK 1.8222 y el uso establecido. Ver, por ejemplo PatentIn User Manual, 99-102 (Nov. 1990) (Oficina de Patentes y Marcas de Estados Unidos).
En la siguiente descripción se mostrarán ciertos objetivos, ventajas y características novedosas de la presente invención, y serán evidentes para los expertos en la materia tras el examen de la misma o se puede aprender con la práctica de la invención.
Tal y como se utiliza en la presente invención "alquilo" se refiere a cadenas de hidrocarburos lineales, ramificadas o cíclicas, saturadas o insaturadas (es decir, alquenilo y alquinilo) de C_{1-10} inclusive, que incluyen por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, tert-butilo, pentilo, hexilo, octilo, etenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo, octenilo, butadienilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo, heptinilo, y grupos alenilo. Tal y como se utiliza en la presente invención, el término "acilo" se refiere a un grupo ácido orgánico en el que el -OH del grupo carboxilo ha sido sustituido por otro sustituyente (es decir, como se representa por RCO-, en el que R es un alquilo o un grupo arilo). Como tal, el término "acilo" incluye específicamente grupos arilacilo. Entre los ejemplos específicos de grupos acilo se incluyen acetilo y benzoílo. Tal y como se utiliza en la presente invención, "arilo" se refiere a anillos aromáticos de hidrocarburos y heterocíclicos de 5 y 6 miembros. Entre los ejemplos específicos de grupos arilo se incluyen pero no se limitan a ciclopentadienilo, fenilo, furano, tiofeno, pirrol, pirano, piridina, imidazol, isotiazol, isoxazol, pirazol, piracina, pirimidina, y similares. El término "alcoxilo", tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a cadenas de oxo-hidrocarburos lineales, ramificadas, o cíclicas, saturadas o insaturadas, de C_{1-10} inclusive, que incluyen por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, t-butoxi y pentoxi. El término "ariloxi", tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a feniloxilo o hexiloxilo, y feniloxilo o hexiloxilo sustituidos con alquilo, halógeno o alcoxilo. Tal y como se utiliza en la presente invención, los términos "alquilo sustituido" y "arilo sustituido" incluyen grupos alquilo y arilo, tal y como se definen en la presente invención, en que uno o más átomos o grupos funcionales del grupo arilo o alquilo se sustituyen por otro átomo o grupo funcional, incluyendo, por ejemplo, halógeno, arilo, alquilo, alcoxi, hidroxilo, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, sulfato y mercapto. Los términos "halógeno" o "haluro", tal y como se utilizan en la presente, se refieren a grupos fluoro, cloro, bromo y yodo.
Tal y como se utiliza en la presente invención, el término "ADN de secuencia mixta" se refiere a una secuencia de ADN que comprende pares de bases GC y pares de bases AT.
Los compuestos de Fórmula I de la presente invención (de aquí en adelante referido como los "compuestos activos") son útiles en la unión de secuencias mixtas de ADN, es decir, pares de bases GC así como AT. Sorprendentemente, los compuestos activos se unen en el surco estrecho del ADN en secuencias específicas que contienen GC de forma altamente cooperativa como dímeros apilados. Debido a la capacidad de los compuestos de la presente invención de unirse a secuencias mixtas y específicas de ADN, son útiles en el control de la expresión génica mediante, por ejemplo, la intervención en la transcripción génica. Por consiguiente, los compuestos activos pueden ser útiles farmacéuticamente en el tratamiento de infecciones oportunas, tales como Pneumocystis carinii, en el tratamiento de cánceres y otros trastornos de proliferación, y en el tratamiento de trastornos genéticos causados por, por ejemplo, mutaciones en genes concretos (por ejemplo, fibrosis quística, enfermedad poliquística adulta, enfermedad de Huntington, distrofia miotónica, neurofibromatosis, etc.). Además, dado que ciertos compuestos de la presente invención son fluorescentes (es decir, DB293, mostrado en la figura 1), son útiles en la detección de secuencias de ADN concretas unidas por los compuestos mediante procedimientos de detección por fluorescencia conocidas en la técnica.
Los compuestos activos de la presente invención se pueden preparar mediante los procedimientos expuestos en K. Hopkins et al., J. Med. Chem. 41, 3872-3878 (1998). Los compuestos activos de la presente invención se pueden preparar mediante los procedimientos expuestos en R. Kada et al., Collect. Czech. Chem. Comm. 38, 1700-1704 (1973), modificados tal y como se describe a continuación, la descripción de los cuales también se incorpora en la presente invención en su totalidad. Adicionalmente, los compuestos activos se pueden administrar como sales farmacéuticamente aceptables. Entre dichas sales se incluyen las sales de gluconato, lactato, acetato, tartarato, citrato, fosfato, borato, nitrato, sulfato y clorhidrato. Las sales de la presente invención se pueden preparar, en general, mediante la reacción de dos equivalentes del compuesto base con el ácido deseado, en solución. Después de completar la reacción, las sales se cristalizan a partir de la solución mediante la adición de una cantidad apropiada de disolvente en la que la sal es insoluble.
Tal y como se ha indicado anteriormente, los procedimientos de la presente invención son útiles para tratar infeccionas microbianas oportunas, tales como, por ejemplo, P. carinii y Giardia lamblia. Los compuestos también puede ser útiles en el tratamiento de infecciones fúngicas, tales como Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Fusarium solani y combinaciones de los mismos. Los procedimientos de la presente invención son útiles para el tratamiento de estas condiciones en las que se inhibe el inicio, crecimiento o extensión de la condición, provocan la regresión de la condición, curan la condición, o en cualquier caso, mejorar el bienestar general de un sujeto afectado por la misma o con el riesgo de contraerla.
Los compuestos de la presente invención son útiles no sólo en procedimientos pata tratar infecciones y otros trastornos, sino también en procedimientos de inhibición de enzimas, tales como topoisomerasa.
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Los sujetos a tratar mediante los procedimientos de la presente invención son habitualmente sujetos humanos, aunque los procedimientos de la presente invención pueden ser útiles con cualquier sujeto conocido para un experto en la materia.
Tal y como se ha indicado anteriormente, la presente invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden los compuestos activos mencionados anteriormente, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en portadores farmacéuticamente aceptables para la administración oral, intravenosa o por aerosol tal y como se describirá con detalle a continuación. Además, la presente invención da a conocer dichos compuestos o sales de los mismos que han sido liofilizados y que se pueden reconstituir para formar formulaciones farmacéuticamente aceptables para la administración, como por inyección intravenosa o intramuscular.
La dosis terapéuticamente eficaz de cualquier compuesto específico, la utilización de la cual está dentro del alcance de la presente invención, variará algo entre compuestos, y entre pacientes, y dependerá de la condición del paciente y de la vía de suministro. Como propuesta general, una dosis de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg tendrá una eficacia terapéutica, calculando todos los pesos en base al peso del compuesto activo, incluyendo los casos en los que se utiliza una sal. La toxicidad que se refiere al nivel superior puede restringir las dosis intravenosas a un nivel inferior, tal como hasta aproximadamente 10 mg/kg, calculando todos los pesos en base al peso del compuesto activo, incluyendo los casos en los que se utiliza una sal. Se pueden utilizar una dosis de aproximadamente 10 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg para la administración oral. Habitualmente, se puede utilizar una dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg a 5 mg/kg para la inyección intramuscular. Las dosis preferidas son de 1 \mumol/kg a 50 \mumol/kg, y más preferiblemente 22 \mumol/kg y 33 \mumol/kg del compuesto para la administración intravenosa u oral. La duración del tratamiento es habitualmente de una vez por día durante un periodo de dos o tres semanas o hasta que la condición esté esencialmente controlada. Se pueden utilizar profilácticamente dosis inferiores administradas menos frecuentemente para evitar o reducir la incidencia o recurrencia de la infección.
Según el presente procedimiento, los compuestos farmacéuticamente activos, tal y como se describen en la presente invención, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, se pueden administrar de forma oral como un sólido o un líquido, o se pueden administrar intramuscularmente o intravenosamente como una solución, suspensión o emulsión. Alternativamente, los compuestos o sales también se pueden administrar por inhalación, intravenosamente o intramuscularmente como una suspensión liposomal. Cuando se administra mediante la inhalación, el compuesto activo o la sal debería estar en forma de un conjunto de partículas sólidas o gotas que tienen un tamaño de partícula de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 micras, y preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 micras.
La presente invención también da a conocer una composición farmacéutica adecuada para la inyección intravenosa o intramuscular. La composición farmacéutica comprende un compuesto de Fórmula (I) descrito en la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en cualquier portador farmacéuticamente aceptable. Si se desea una solución, el agua es el portador de elección con respecto a los compuestos o sales solubles en agua. Con respecto a compuestos o sales insolubles en agua, pueden ser adecuados un vehículo orgánico, tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, o mezclas de los mismos. En el último caso, el vehículo orgánico puede contener una cantidad sustancial de agua. La solución en cualquiera de los casos se puede esterilizar de forma adecuada conocida por los expertos en la materia, y habitualmente mediante filtración a través de un filtro de 0,22 micras. Posteriormente a la esterilización, la solución se puede dispensar en recipientes apropiados, tales como viales de vidrio despirogenados. Naturalmente, la dispensación se realiza preferiblemente mediante un procedimiento aséptico. A continuación, los cierres esterilizados se pueden colocar en los viales y, si se desea, se pueden liofilizar el contenido de los viales.
Además de los compuestos de la Fórmula (I) o sus sales, las composiciones farmacéuticas pueden contener otros aditivos, tales como aditivos para ajustar el pH. En particular, entre los agentes para ajustar el pH útiles se incluyen ácidos, tales como ácido clorhídrico, bases o soluciones tampón, tales como lactato sódico, acetato sódico, fosfato sódico, citrato sódico, borato sódico, o gluconato sódico. Además, las composiciones pueden contener conservantes microbianas. Entre los conservantes microbianos útiles se incluyen, metilparaben, propilparaben, y alcohol bencílico. El conservante microbiano se utiliza habitualmente cuando la formulación se coloca en un vial diseñado para un uso de dosis múltiples. Naturalmente, tal y como se ha indicado, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden liofilizar utilizando técnicas bien conocidas en la técnica.
En aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición inyectable, estable, estéril que comprende un compuesto de Fórmula (I), o una sal del mismo, en forma de dosis unidad en un recipiente sellado. El compuesto o sal se proporcionan en forma de una liofilizado que es capaz de reconstituirse con un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para forma una composición líquida adecuada para la inyección de los mismos a un sujeto. La forma de dosis unidad comprende habitualmente desde aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 10 gramos del compuesto o sal. Cuando el compuesto o la sal son sustancialmente insolubles en agua, se puede utilizar una cantidad suficiente de agente emulsionante que es fisiológicamente aceptable en una cantidad suficiente para emulsionar el compuesto o sal en un portador acuoso. Uno de dichos agentes emulsionantes útiles es fosfatidil
colina.
Se pueden preparar otras composiciones farmacéuticas a partir de compuestos insolubles en agua descritos en la presente invención, o sales de los mismos, tales como emulsiones de base acuosa. En dicho caso, la composición contendrá una cantidad suficiente de agente emulsionante farmacéuticamente aceptable para emulsionar la cantidad deseada del compuesto o sal del mismo. Particularmente, entre los agentes emulsionantes útiles se incluyen fosfatidil colinas y lecitina.
Además, la presente invención da a conocer formulaciones liposomales de los compuestos descritos en la presente y sales de los mismos. La tecnología para formar suspensiones liposomales es bien conocida en la técnica. Cuando el compuesto o una sal del mismo es una sal soluble en agua, utilizando tecnología de liposomas convencional, la misma se puede incorporar en vesículas de lípidos. En dicho caso, debido a la solubilidad en agua del compuesto o sal, el compuesto o sal se introducirán sustancialmente en el centro hidrofílico o núcleo de los liposomas. La capa lipídica utilizada puede ser de cualquier composición convencional y puede contener colesterol o puede estar libre de colesterol. Cuando el compuesto o sal de interés es insoluble en agua, se puede utilizar de nuevo la tecnología de formación de liposomas convencional, la sal se puede introducir sustancialmente en el interior de la bicapa lipídica hidrofóbica que forma la estructura del liposoma. En cualquier caso, los liposomas que se producen se pueden reducir en tamaño, a través de la utilización de técnicas de sonicación y homogenización estándar.
Naturalmente, las formulaciones liposomales que contienen los compuestos descritos en la presente invención o sales de los mismos, se pueden liofilizar para producir un liofilizado que se puede reconstituir con un portador farmacéuticamente aceptable, tal como agua, para regenerar la suspensión liposomal.
También se proporcionan formulaciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración como aerosol, mediante inhalación. Estas formulaciones comprenden una solución o suspensión de un compuesto deseado descrito en la presente invención o una sal del mismo, o un conjunto de partículas sólidas del compuesto o la sal. La formulación deseada se puede colocar en pequeña cámara y se nebuliza. La nebulización se puede realizar mediante aire comprimido o mediante energía ultrasónica para formar un conjunto de gotas de líquido o partículas sólidas que comprenden los compuestos o sales. Las gotas líquidas o las partículas sólidas deberían tener un tamaño de partícula en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 micras, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 micras. Las partículas sólidas se pueden obtener procesando el compuesto sólido o una sal del mismo, en cualquier forma adecuada conocida en la técnica, tal como micronización. Más preferiblemente, el tamaño de las partículas sólidas o gotas será de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 micras. En este sentido, los nebulizadores comerciales están disponibles para conseguir este objetivo. Los compuestos se pueden administrar a través de una suspensión en aerosol de partículas respirables en la manera establecida de la Patente USA No. 5.628.984, la descripción de la cual se incorpora en la presente invención en su totalidad.
Preferiblemente, cuando la formulación farmacéutica adecuada para la administración como aerosol está en forma líquida, la formulación comprenderá un compuesto o sal del mismo solubles en agua, en un portador que comprende agua. Un tensoactivo puede estar presente y disminuye la tensión superficial de la formulación suficientemente para dar lugar a la formación de gotas dentro del intervalo de tamaños deseado cuando se somete a la nebulización.
Tal y como se ha indicado, la presente invención da a conocer compuestos y sales del mismo solubles e insolubles en agua. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "soluble en agua" se define como cualquier composición que es soluble en agua en una cantidad de aproximadamente 50 mg/ml, o superior. Además, tal y como se utiliza en el presente documento, el término "insoluble en agua" se define como cualquier composición que tiene una solubilidad en agua inferior a aproximadamente 20 mg/ml. Para ciertas aplicaciones, pueden ser deseables compuestos o sales solubles en agua mientras que para otras aplicaciones pueden ser deseables igualmente compuestos o sales insolubles en agua.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la presente invención, y no deberían interpretarse como limitantes de la misma.
Ejemplo 1 Síntesis de compuestos de Fórmula I
Se preparó 2-[5(6)-nitro-2-bencimidazoil]-5-(4-nitrofenil)furano según un procedimiento de la literatura modificado (R. Kada et al., Collect. Czech. Chem. Comm. 38, 1700-1704 (1973)) mediante la reacción de 5-(4-nitrofenil)furfural (10 mmol) con 4-nitro-1,2-fenilendiamina (10 mmol) en una mezcla de DMF (25 ml) y nitrobenceno (5 ml) a 150ºC durante 22 horas (en nitrógeno). Tras enfriar hasta temperatura ambiente se obtuvo un sólido suspendido que se diluyó con MeOH (30 ml), se recogió, y finalmente se lavó bien con éter. Rendimiento: 2,56 g, 73%; pf 350-351ºC; pf lit. 348-350ºC. ^{1}HRMN (DMSO-d_{6}): 7,51 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 7,57 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 7,78 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H), 8,14 (dd, J = 8,9, 2,2 Hz, 1H), 8,17 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 8,36 (d, J = 9,1 Hz, 2H), 8,47 (d, J = 1,7 Hz, 1H) (NH de bencimidazol no observado).
2-[5(6)-amino-2-bencimidazoil]-5-(4-aminofenil) furano. A una suspensión de 2-[5(6)-nitro-2-bencimidazoil]-5-(4-nitrofenil)furano (2,63 g, 7,5 mmol) en EtOH (100 ml) se añadió cloruro estanoso dihidratado (16,0 g, 71 mmol) y la mezcla se puso a reflujo bajo nitrógeno con agitación vigorosa durante 3 horas para obtener una solución. Después de agitar a temperatura ambiente durante toda la noche, la solución se basificó mediante la adición de NaOH acuoso y los sólidos se extrajeron con EtOAc. Después del secado (Na_{2}SO_{4}) y el filtrado, se extrajo el disolvente al vacío y el residuo se disolvió en EtOH. A continuación, esta solución se diluyó con agua para obtener un sólido amarillo verdoso que se recogió y se secó en el desecador (P_{2}O_{5}). Rendimiento: 0,95 g, 44%; pf 161-165ºC. A diferencia del derivado bis-nitro, el ^{1}HRMN de esta bis-amina era bastante complejo indicando que existe como una mezcla de los dos tautómeros posibles. El ^{1}HRMN de la sal clorhidratada, preparada mediante la disolución de una muestra de la base libre en HCl/EtOH seguido de concentración, era menos complejo (DMSO-d_{6}, D_{2}O): 7,17 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,21 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 7,30 (dd, J = 8,7, 1,9 Hz, 1H), 7,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,74 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,78 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 7,94 (d, J = 8,6 Hz, 2H).
2-[5(6)-guanidino-2-bencimidazoil]-5-(4-guanidino fenil) furano. A una solución refrigerada de 2-[5(6)-amino-2-bencimidazoil]-5-(4-aminofenil)furano (0,363 g, 1,25 mmol) y 1,3-bis(tert-butoxicarbonil)-2-metil-2-tiopseudourea (0,755 g, 1,60 mmol) en DMF seco (25 ml) se añadió trietilamina (0,78 g, 7,71 mmol) seguido de cloruro de mercurio (II) (0,78 g, 2,87 mmol) y la suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. Después de diluir con CH_{2}Cl_{2} y filtrar sobre Celita, la solución oscurecida se lavó bien con una solución saturada de Na_{2}CO_{3}, con agua (3 veces), y finalmente con una solución saturada de cloruro sódico. Después del secado (Na_{2}SO_{4}), el disolvente se extrajo al vacío y el aceite restante se diluyó con MeOH para obtener bis-guanidina protegida con BOC como un sólido verde pálido en dos recogidas (0,58 g). El producto se purificó mediante reprecipitación a partir de CH_{2}Cl_{2}/MeOH para obtener, después de la concentración parcial, un sólido verde pálido en forma de pelusas (0,42 g, 43%), pf > 400ºC, con oscurecimiento > 300ºC.
Para la desprotección, se saturó una solución de la bis-guanidina protegida en CHCl_{3} (12 ml) y EtOH (10 ml) con HCl seco a 0-5ºC y se dejó agitando durante 2 días a temperatura ambiente para obtener una suspensión de color naranja. Después de extraer los disolventes al vacío, el sólido se extrajo en EtOH caliente (60 ml), se filtró una pequeña cantidad de material insoluble, y se extrajo de nuevo el disolvente. Después de la trituración con éter, se recogió el sólido amarillo y se secó al vacío durante 3 días a 50-60ºC. Rendimiento: 0,24 g, 92% (40% del total a partir de bis-amina). ^{1}HRMN (DMSO-d_{6}): 7,24 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,33 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,51 (br s, 3H), 7,57 (s, 1H), 7,64 (br s, 3H), 7,68 (s aparente, 1H), 7,74 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 10,05 (br s, 1H), 10,19 (br s, 1H). FABMS (tioglicerol): m/z 375 (100). FABHRMS. Calculada para C_{19}H_{18}N_{8}O (MH^{+}): 375,1682. Observada: 375,1670. Anal. Calculado para C_{19}H_{18}N_{8}O \cdot 3HCl \cdot 2H_{2}O: C, 43,90; H, 4,85; N, 21,56; Cl, 20,46. Observado: C, 43,68; H, 4,47; N, 20,68; Cl, 20,46.
Clorhidrato de 1-[(5-bromobenzo[b]furan-2-il]-3-dimetilaminopropano. Una mezcla de 2-acetil-5-bromobenzo[b]furano (23,9 g, 0,1 mol), clorhidrato de dimetilamina (8,15 g, 0,1 mol), paraformaldehído (3,6 g) y 2 ml de ácido clorhídrico al 35% en 150 ml de etanol se calentó a reflujo durante 20 horas (seguido de TLC). El volumen del disolvente se redujo a presión reducida hasta 50 ml y se añadió una mezcla de acetona:éter (1:2) y se filtró el sólido resultante, se lavó con éter y se secó a 45ºC en un horno de vacío durante 24 horas para obtener 23,0 g (69%), pf 185-187ºC. ^{1}HRMN (DMSO-d_{6}): 8,07 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,70 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,66 (dd, J = 2,0 Hz, J = 8,8 Hz, 1H), 3,58 (t, J = 7,2, 2H), 3,41 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,78 (s, 6H). ^{13}CRMN (DMSO-d_{6}): 186,7, 153,7, 152,2, 131,2, 128,8, 126,0, 116,2, 114,3, 113,5, 51,0, 42,2, 33,3. La presencia de pequeñas cantidades (aproximadamente un 5%) del correspondiente producto de eliminación (vinil cetona) era clara a partir del ^{1}HRMN; el producto se utilizó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.
1-[(5-bromobenzo[b]furan-2-il]-4-(4-bromofenil) butano-1,4-diona. Una mezcla de la base de Mannich anterior (16,6 g, 0,05 mol), catalizador de cloruro de3-bencil-5(2-hidroxietil)-4-metil tiazolio (0,68 g, 0,0025 mol), trietilamina (15,15 g, 0,15 mol) y 4-bromo benzaldehído (9,25 g, 0,05 mol) en 180 ml de dioxano se calentó a reflujo durante 12 horas (en nitrógeno). El disolvente se extrajo a presión reducida y el residuo se trató con agua. El material pegajoso resultante se extrajo con 150 ml de cloroformo. La fase orgánica se secó sobre MgSO_{4} y el disolvente se extrajo a presión reducida. El residuo se trató con EtOH:éter (1:1), el sólido restante se filtró, se lavó con éter y se secó para obtener 7,4 g (34%); pf 176-177ºC). ^{1}HRMN (DMSO-d_{6}): 8,03 (dd, J = 0,4 y 1,5 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,82 (dd, J = 0,4 Hz, 1H), 7,72 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,68 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,64 (dd, J = 1,5 y 8,8 Hz, 1H), 3,40-3,45 (m, 2H), 3,37-3,33 (m, 2H). ^{13}CRMN (DMSO-d_{6}): 197,3, 188,9, 153,5, 152,7, 135,2, 131,5, 130,7, 129,6, 128,8, 127,0, 125,7, 115,9, 114,1, 112,4, 32,3, 32,0. MS m/e 436 (M^{+}). Anal. Calculado para C_{18}H_{12}Br_{2}O_{3} C, 49,57; H, 2,77. Observado: C, 49,49; H, 2,74.
2-[(5-bromobenzo[b]furan-2-il]-5-(4-bromofenil) furano. Una solución de la dicetona anterior (8,72 g, 0,02 mol) en 150 ml CHCl_{3}:MeOH (1:1) se saturó con HCl gas, se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas (seguido de TLC). El disolvente se extrajo a presión reducida y el residuo se agitó con 200 ml de una solución acuosa de NaHCO_{3} al 10%, se filtró, se lavó con agua, se secó y se recristalizó a partir de éter:CH_{2}Cl_{2} (4:1) para obtener 7,1 g (85%) de un sólido blanco, pf 204-206ºC. ^{1}HRMN (DMSO-d_{6}): 7,86 (d, J = 2,0, 1H), 7,76 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,65 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,58 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,45 (dd, J = 2,0 y 8,4 Hz, 1H), 7,23 (s, 1H), 7,17 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 7,11 (d, J = 4,0 Hz, 1H). ^{13}CRMN (DMSO-d_{6}): 152,9, 152,7, 148,0, 144,1, 131,6, 130,4, 128,4, 127,0, 125,5, 123,3, 120,9, 115,5, 112,7, 111,2, 108,6, 101,1. MS m/e 436 (M^{+}). Anal. Calculado para C_{18}H_{12}Br_{2}O_{3} C, 49,57; H, 2,77. Observado: C, 49,49; H, 2,74.
2-[(5-cianobenzo[b]furan-2-il]-5-(4-cianofenil) furano. Una mezcla del compuesto de dibromo anterior (8,36 g, 0,02 mol) y CuCN (5,34 g, 0,06 mol) en 60 ml de N-metil-2-pirolidinona se calentó a reflujo durante 4 horas (bajo nitrógeno), se enfrió, se diluyó con agua y se agitó con 200 ml de una solución acuosa de NaCN al 10% durante 3 horas. El sólido se filtró, se lavó con agua y se secó. El producto crudo se disolvió en CHCl_{3}:MeOH (1:1) y se cromatografió sobre alúmina neutra para obtener 4,35 g (70%) de un sólido amarillo pálido, pf 247-248ºC. ^{1}HRMN (DMSO-d_{6}): 8,18 (d, J = 1,6, 1H), 7,98 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,88 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,73 (dd, J = 1,6 y 8,4 Hz, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,38 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 7,21 (d, J = 3,6 Hz, 1H). ^{13}CRMN (DMSO-d_{6}): 155,6, 152,4, 148,4, 144,7, 132,9, 132,6, 128,8, 128,3, 126,1, 124,1, 118,6, 118,3, 112,3, 111,9, 111,2, 106,4, 101,9. MS m/e 310 (M^{+}). Anal. Calculado para C_{20}H_{10}N_{2}O_{2} C, 77,41; H, 3,25; N, 9,02. Observado: C, 77,41; H, 3,26; N, 8,95.
Diclorhidrato de 2-[(5-amidinobenzo[b]furan-2-il]-5-(4-amidinofenil) furano. El compuesto diciano anterior (3,1 g, 0,01 mol) en 70 ml de etanol se saturó con gas HCl seco a 0-5ºC y, a continuación, se agitó a temperatura ambiente durante 8 días (seguimiento por IR y TLC). Se añadió éter a la mezcla y el diclorhidrato de imidato éster amarillo se filtró y se lavó con éter. El sólido se secó a 50ºC al vacío durante 24 horas para obtener 4,3 g (93%). El sólido se utilizó directamente en la siguiente etapa con purificación adicional.
Una suspensión de diclorhidrato de imidato éster (1,43 g, 0,003 mol) en 20 ml de etanol se saturó con gas amoniaco, se agitó durante 24 horas y se extrajo el disolvente a presión reducida. El sólido se suspendió en agua y se ajustó el pH a 9 el sólido blanquecino se filtró. El sólido se agitó en etanol saturado de HCl y la sal amarilla se filtró y secó en un horno de vacío a 75ºC durante 24 horas para obtener 0,7 g (68%), pf 320ºC. ^{1}HRMN (DMSO-d_{6}/D_{2}O): 8,20 (d, J = 1,2, 1H), 8,01 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,74 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,82 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,78 (dd, J = 1,2 y 8,4 Hz, 1H), 7,47 (s, 1H), 7,37 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 7,20 (d, J = 3,6 Hz, 1H). ^{13}CRMN (DMSO-d_{6}): 165,7, 164,8, 156,7, 152,8, 148,6, 145,0, 134,0, 128,9, 128,7, 126,4, 124,9, 123,9, 123,3, 122,0, 112,1, 111,8, 111,2, 102,5. FABMS m/e 345 (M^{+}). Anal. Calculado para C_{20}H_{16}N_{4}O_{2} \cdot 2H_{2}O \cdot 0,5H_{2}O: C, 56,36; H, 4,49; N, 13,14. Observado: C, 56,73; H, 4,71; N, 12,71.
Ejemplo 2 Estudios de obtención de huellas de ADN
Para caracterizar las propiedades de reconocimiento del ADN de una serie de análogos de furamidina (mostrada en la figura 1), se realizaron estudios cuantitavos de obtención de huellas de ADNasaI utilizando un número de derivados con varias secuencias de ADN diferentes. Se prepararon fragmentos de restricción de ADN plásmido y se realizaron experimentos de obtención de huellas de ADNasaI tal y como se describe en C. Baillo, et al., Biochemistry 35, 1150 (1996) y C. Baillo et al., Anti Cancer Drug Design (publicado en 1999).
La figura 2 muestra los resultados de un experimento de valoración cuantitativa de obtención de huellas de ADNasa I con el compuesto DB293 en un fragmento de 265 pb de ADN tal y como se describe en la presente. El fragmento de restricción EcoRI-PvuII del plásmido pBS estaba marcado en el extremo 3' en el sitio EcoRI con [\alpha-^{32}P]dATP en presencia de transcriptasa inversa AMV. Tal y como se muestra en la figura 2A, los productos de digestión de la ADNasaI se resolvieron en un gel de poliacrilamida al 8% que contenía urea 8 M. Las concentraciones del fármaco fueron (bandas 1-11) 0, 0,3, 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,1, 2,4, 2,7, 3,0 \muM para DB293 y (bandas 12-15) 0, 1, 2 y 5 \muM para DB270. Las bandas marcadas con "G" representan marcadores de dimetilsulfato-piperidina específicos para guaninas. La banda marcada con ADN no contenía ni fármaco ni enzima. Los números en la parte derecha del gel se refieren al esquema numérico del fragmento. Los rectángulos en la parte izquierda se refieren a las posiciones de sitios de unión ricos en AT (rectángulos en blanco) y sitios de unión ricos en GC (rectángulos rellenos) para DB293. La figura 2B es una ilustración gráfica de representaciones de huellas para la unión de DB293 al sitio 5’-AATAA en AT (círculos blancos) y al sitio 5'-ACCATG rico en GC (cuadrados rellenos). La intensidad relativa de la banda R corresponde a la relación I_{c}/I_{o}, donde I_{c} es la intensidad de la banda a la concentración de ligando c e I_{o} es la intensidad de la misma banda en ausencia de DB293. Las representaciones de división diferencial mostradas en las figuras 2C comparan la susceptibilidad del ADN a ser cortado por ADNasaI en presencia de DB270 5 \muM (círculos rellenos) o DB293 1,5 \muM (cuadrados blancos). La desviación de los puntos con respecto a la secuencia indicada con letras (valores negativos) corresponde a un sitio protegido por ligando y la desviación (valores positivos) representa la división mejorada. La escala vertical está en unidades de ln(f_{a}) - ln(f_{c}), donde f_{a} es la división fraccional en cualquier enlace en presencia del fármaco y f_{c} es la división fraccional del mismo enlace en el control. Los resultados se muestran en una escala logarítmica por conveniencia. Los rectángulos por debajo de la secuencia muestran las posiciones del sitio de unión a AT (rectángulos vacíos) y sitios ricos en GC (rectángulos rellenos).
Los resultados con los compuestos simétricos furamidina y el DB270 de bisbencimidazol son tal y como se esperan para los agentes de unión de minor-groove específicos de AT y están de acuerdo con las observaciones sobre otros derivados de furano y compuestos relacionados. Sin embargo, con el compuesto asimétrico DB293 (figura 1) los resultados de las huellas presentan un número de sorpresas en forma de huellas intensas en regiones ricas en GC inesperadas, tal y como se muestra en la figura 2. En la región de las bases 90-100 del fragmento de pBS de 265 mer de la figura 2, por ejemplo, DB293 produjo una huella muy intensa mientras que DB270 y furamidina dan huellas negligibles. La característica más sorprendente de la huella en esta región de secuencias es su contenido de GC con respecto a secuencias ricas en AT, donde las huellas se observan habitualmente con agentes de surco estrecho.
El análisis cuantitativo de los datos de las huellas revela que el valor C_{50}, la concentración de fármaco requería para la huella media máxima, en el sitio ATGA es significativamente inferior en el sitio ATTA próximo, indicando que DB293 prefiere el sitio que incluye un par de bases de GC sobre el sitio que contiene sólo pares de bases de AT. Las representaciones de división diferencial muestran que tanto DB270 y DB293 se unen de forma similar a sitios compuestos exclusivamente de pares de bases de AT (figura 2). Los estudios de huellas con varios fragmentos de restricción mostraron que DB293, pero no DB270, se unía fuertemente a sitios que contenían pares de bases de GC, tales como ATGA, ACGA y ATGT.
Ejemplo 3 Experimentos de fusión térmica
Para investigar los complejos de estos compuestos detalladamente con secuencias ricas en GC, se sintetizó un modelo dúplex de horquilla que contenía la región de secuencias de las bases 93-104 del fragmento de restricción de pBS de 265 mer y se muestra como oligo 2 en la figura 1. Oligo 1 (también mostrado en la figura 1) con la secuencia AATT que se ha utilizado en el análisis de un gran número de agentes del surco estrecho, proporciona una referencia.
Los experimentos de fusión térmica se realizaron con un espectrofotómetro Cary 4 interconectado a un microordenador. Se utilizó un termistor fijado a una cubeta de referencia para controlar la temperatura. Los oligómeros se añadieron a 1 ml de solución tampón (0,01 M MES y 0,001 EDTA) en celdas de cuarzo de longitud de paso de 1 cm, y la concentración se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm. Los experimentos se realizaron generalmente a una concentración de 2 x 10^{-6} M para el oligo 2 en horquilla, y 3 x 10^{-6} M para el oligo 2-1 en horquilla. Los experimentos de Pf para los complejos se realizaron en función de la proporción.
Las determinaciones de Pf de oligo2 en la valoración con DB293 produjeron hasta un incremento de 30ºC en el Pf y no se estabilizó hasta alcanzar una proporción de 4:1 de DB293: dúplex en horquilla. La proporción elevada de DB293 con respecto al dúplex de oligómero fue sorprendente para un dúplex de sólo 13 pares de bases. Con el fin de entender mejor la naturaleza del complejo, el oligo2 dividido se dividió en dos dúplex en horquilla similares, oligo 2-1 y oligo 2-2 (figura 1). Como ilustración de los resultados obtenidos, las curvas de Pf derivadas de los complejos de DB270 y DB293 con oligo 2-1 se muestran en la figura 5. El complejo de DB293 tiene una curva de fusión bifásica en una proporción 1:1 con una fase de temperatura elevada y una fase de temperatura baja próximas al Pf del dúplex en horquilla libre. A una proporción de 2:1, la fase de temperatura baja desaparece y sólo la transición de temperatura elevada está presente. Las curvas de fusión de los complejos de DB270 y furamidina con oligo 2-1 tienen transiciones únicas en las proporciones 1:1 y 2:1 con temperaturas de fusión por debajo del valor de DB293. Como en los experimentos de obtención de huellas, estos resultados muestran las grandes diferencias en las interacciones del ADN entre los compuestos simétricos en relación con el DB293 asimétrico. Además, los resultados de la proporción de Pf sugieren que las propiedades inusuales de reconocimiento de ADN del DB293 son debidas a la formación de complejos 2:1 con oligo2-1 y 2-2, y un complejo 4:1 con oligo2. Dichos complejos dímeros también podrían explicar el compor-
tamiento de huella inesperado de DB293, aunque, en base a la carga +2 de DB293, no se esperan complejos dímeros.
Ejemplo 4 Experimentos de resonancia de plasmones de superficie
Para seguir el análisis comparativo cuantitativo de estos compuestos con ADN con más detalle utilizando resonancia de plasmones de superficie, se inmovilizaron análogos de oligo2-1 y 2-2 marcados con 5'-biotina sobre un chip sensor recubierto de streptavidina de cuatro canales BIAcore: Inmovilización de ADN y estudios de unión por resonancia de plasmones de superficie (SPR): se adquirieron horquillas marcadas con 5'-biotina con purificación por HPLC (Midland Co). Se aplicaron muestras del ADN en solución tampón MES10 (MES 0,01 M y EDTA 0,001 M, con NaCl 0,1 M) a una concentración de 50 nM a un chip de SA (streptavidina) BIAcore mediante flujo directo a 5 \mul/min en un instrumento BIAcore 2000 SPR. Aproximadamente las mismas cantidades de oligo1, oligo2-1 y oligo2-2 se inmovilizaron sobre la superficie del chip de SA. Se realizó un análisis en estado estacionario con múltiples inyecciones de diferentes concentraciones de cada compuesto sobre la superficie de SA a una velocidad de flujo de 20 \mul/min, a 25ºC.
El oligo1 se inmovilizó como secuencia de control y se dejó una célula de flujo como referencia no modificada. Los resultados de unión de los experimentos de SPR se ajustaron con un modelo de sitio único (K_{2} = 0) o con un modelo de dos sitios: r = (K_{1}*C_{libre} + 2*K_{1}*K_{2}*C_{libre}^{2})/(1 + K_{1}*C_{libre} + 2*K_{1}*K_{2}*C_{libre}^{2}), donde r representa los moles de compuesto unidos por mol de dúplex en horquilla de ADN, K_{1} y K_{2} son constantes de unión macroscópicas, y C_{libre} es la concentración de compuesto libre en equilibrio con el complejo. El compuesto libre está fijado por la concentración en la solución de flujo. La unión de todos los derivados de furano a oligo1 se ajusta mejor mediante el modelo de sitio único, mientras que la unión de DB293 a oligo2-1 y 2-2 requiere el modelo de dos sitios y se observa que K_{2} es mucho mayor que K_{1} según se esperaba por las interacciones con una cooperatividad ampliamente positiva. En la figura 3 se muestran los oligos 1 y 2-1 para mostrar las diferencias.
La unión de todos los compuestos de furano a oligo1 es similar y la saturación de alcanza en una proporción de 1:1, según se esperaba a partir de los resultados con un número de cationes de unión al surco estrecho con dúplex de ADN que contienen una secuencia AATT. Los resultados para la unión de DB293 a oligo2-1 y 2-2 son sin embargo drásticamente diferentes de los resultados con los compuestos simétricos, y son drásticamente diferentes de los resultados obtenidos con oligo1 y DB293. Las representaciones de Scatchard para la unión de DB293 y DB270 se muestran en la figura 3.
Como en los experimentos de obtención de huellas con sitios AT (figura 2), DB270 y DB293 se unen de forma muy similar a oligo1 con representaciones de Scatchard lineales indicando un tipo de sitio de unión fuerte que une una única molécula de DB270 o DB293 con constantes de unión de 2,3-2,6 x 10^{7}. La unión de DB270 a oligo2-1 es por lo menos un factor de diez veces más débil que su unión a oligo1 y probablemente representa su interacción en la secuencia TAT en el oligómero que es demasiado corto para formar un complejo con el surco estrecho muy fuerte. Tal y como se muestra en la figura 3, sin embargo, la unión de DB293 con oligo2-1 es altamente cooperativa y se satura en dos moléculas de DB293 por dúplex en horquilla de oligo2-1. El ajuste de los resultados de unión a un modelo de dos sitios para determinar las constantes de unión macroscópica produjo una constante de unión (K_{1}) de 2,8x10^{6} para la unión inicial y una constante K_{2} de 7,3 x 10^{7} para unirse al segundo sitio después de rellenar el primer sitio. Se obtienen resultados similares para la unión de DB293 a oligo2-2. La similitud de las constantes de unión para DB270 y la unión de la primera molécula de DB293 a oligo 2-1 y 2-2 sugiere que son procesos similares. La drástica diferencia tiene lugar cuando la segunda molécula de DB293 se une cooperativamente con una K_{2} que es 25 veces más grande que para la unión de DB270 y la primera molécula de DB293 (K_{1}) a los oligómeros. Estos resultados sugieren firmemente que el patrón de huellas inusual observado con DB293 es debido a la formación de un complejo 2:1 altamente cooperativo en secuencias de ADN específicas. Los análogos cercanos, furamidina y DB270, no se unen fuertemente o dejan huella en estas secuencias de ADN. Dado que los compuestos de furano son dicationes, es claramente la estructura, y no la carga, los que evitan que los derivados simétricos formen el complejo dímero.
Ejemplo 5 Estudios estructurales de derivados de furano
Los estudios estructurales de un grupo de derivados de furano con oligómeros que contienen la secuencia AATT de oligo1, incluyendo estructuras por rayos X de furamidina y derivados alquílicos, han mostrado claramente un complejo clásico 1:1 de unión al surco estrecho en el que los grupos amidina interaccionan con los extremos de las bases A y T en la base del surco en el sitio AATT. Véase, C.A. Laughton, Biochemistry 35, 5655 (1996) y S. Neidle, Biopolymers 44, 105 (1997). Este es el tipo de complejo esperado a partir de los resultados experimentales de los furanos de figura 1 con oligo1. Con el fin de caracterizar el complejo 2:1 de DB293, se iniciaron los estudios de RMN del complejo DB293-oligo2-1. Todos los espectros de RMN se obtuvieron con un espectrómetro Varian Unity Plus de 600 MHz. Las condiciones habituales para la recopilación de espectros en D_{2}O: retraso de relajación de 2 s, muestra de 0,6 ml en un tubo para RMN de 5 mm, y una amplitud de línea de 1,0 Hz antes de la transformación de Fourier. Los experimentos bidimensionales se obtuvieron con una anchura de espectro de 6000 Hz en ambas dimensiones con 2048 puntos de datos del complejo en la dimensión t2 y 512 puntos en la dimensión t1, mientras que el espectro de una dimensión se recogió con una anchura espectral de 6000 Hz y 32000 puntos de datos.
En las valoraciones de RMN de protón del dúplex de oligómero con DB293 sólo dos especies de ADN se detectan a una proporción molar 1:1. Las dos especies se muestran claramente con un espectro COSY bidimensional en la figura 4 para la región espectral de aromático a metil timina. El ADN libre tiene seis picos de correlación cruzada TH6-TCH_{3} bien resueltos tal y como se esperaba para los seis residuos de T en el oligómero. En el complejo de proporción 1:1 existen 12 picos de correlación cruzada tal y como se esperaba para dos especies en intercambio lento, y una especie tiene los mismos desplazamientos químicos que el ADN libre. En la proporción 2:1, las señales de ADN libre desaparecen y las señales para el complejo 2:1 se doblan en intensidad. El complejo 2:1 y el ADN libre son las únicas especies observadas en el espectro COSY de proporción 1:1 (figura 4) en concordancia con la elevada cooperatividad observada en los experimentos de unión. No se pueden detectar señales de intermedios para un complejo 1:1 en cualquiera de los experimentos mediante la valoración de oligo2-1 con DB293, y las dos especies que se observan en la proporción 1:1 son el oligómero libre y el complejo 2:1. En un análisis NOESY bidimensional, se obtienen señales intensas para las interacciones C H5-H6, y una vez más, sólo las señales para ADN libre y el complejo 2:1 se detectan (no mostrado). En cambio, se detectan dos grupos de picos de correlación cruzada para DB293 en el complejo de oligo2-1 tal y como se esperaba para dos moléculas distintas unidas en intercambio lento. Los picos de correlación cruzada entre las dos moléculas de DB293 y los protones de DB293 al surco estrecho de ADN muestran claramente que el compuesto se une en el surco estrecho como un dímero antiparalelo y está en contacto con ambas cadenas de ADN. Se observan los picos de correlación cruzada intensos de las moléculas de DB293 unidas a los pares de bases de ADN desde T4 \cdot A15 a C7 \cdot G12 y estas interacciones colocan el dímero en la secuencia ATGA que es común a oligo2-1 y 2-2.
A partir de estos resultados es claro que los tres derivados de furano de la figura 1 se unen a la secuencia AATT en el oligo 1 como complejos clásicos de monómeros de surco estrecho. Los compuestos simétricos, tales como DB270 y furamidina, no forman las especies de dímeros en un complejo de ADN y, por lo tanto, no se unen a secuencias de ADN que no tienen los sitios de unión clásicos de surcos estrechos en AT. DB293 forma un dímero apilado antiparalelo en un complejo con sitios de ADN que contienen la secuencia ATGA y probablemente otras secuencias. El complejo dímero proporciona un nuevo motivo para entender y diseñar compuestos que pueden reconocer las secuencias de ADN que contienen los pares de bases AT y GC. Los resultados presentados en la presente invención muestran que la unión de dicationes aromáticos a secuencias de ADN mixtas es extremadamente sensible a la estructura del compuesto y la secuencia del ADN. A pesar de que los Solicitantes no desean estar unidos por ninguna teoría de la invención, parece ser que las razones para la formación cooperativa del complejo dímero de DB293 está codificada en las interacciones entre una secuencia de ADN específica y la orientación de los grupos químicos en el dímero. El apilamiento favorable de DB293 para obtener un dímero en el contexto del surco estrecho aniónico de ADN puede contribuir también al complejo 2:1.
Lo descrito anteriormente es ilustrativo de la presente invención y no debe interpretarse como limitante de la misma. La presente invención se define mediante las siguientes reivindicaciones, con equivalentes de las reivindicaciones a incluir en la misma.

Claims (13)

1. Compuesto de Fórmula I:
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69 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que:
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, y NH;
Y es CH o N;
A es CH o N;
B se selecciona del grupo que consiste en NH, O, o S;
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiarilo y oxiarilalquilo;
R_{2} y R_{9} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, hidroxilo, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, hidroxicicloalquilo, alcoxicicloalcoxi, hidroxialquilo, aminoalquilo y alquilaminoalquilo; y
R_{3}, R_{4}, R_{13} y R_{14} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo inferior, alcoxialquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, y alquilaminoalquilo, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos representan un alquilo, hidroxialquilo o alquileno C_{2} a C_{10}, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos son:
70
en el que n es un número de 1 a 3, y R_{10} es H o -CONHR_{11}NR_{15} R_{16}, en el que R_{11} es un alquilo inferior y R_{15} y R_{16} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo inferior;
L se selecciona del grupo que consiste en:
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77
en el que R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo, halógeno, arilo, arilalquilo, aminoalquilo, aminoarilo, oxoalquilo, oxoarilo, y oxoarilalquilo; y en el que dicho compuesto de Fórmula I se une al surco estrecho del ADN como dímero.
2. Compuesto de Fórmula I, en la que L es:
78
A es N, B es NH, X es O, Y es CH, R_{1}, R_{2}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{14}, son cada uno H, y R_{3} y R_{13} son cada uno H.
3. Procedimiento de unión de secuencia de ADN mixta que comprende poner en contacto una muestra de ADN con un compuesto de Fórmula (I):
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79 
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en la que:
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, y NH;
Y es CH o N;
A es CH o N;
B se selecciona del grupo que consiste en NH, O, o S;
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiarilo y oxiarilalquilo;
R_{2} y R_{9} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, hidroxilo, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, hidroxicicloalquilo, alcoxicicloalcoxi, hidroxialquilo, aminoalquilo y alquilaminoalquilo; y
R_{3}, R_{4}, R_{13} y R_{14} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo inferior, alcoxialquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, y alquilaminoalquilo, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos representan un alquilo, hidroxialquilo o alquileno C_{2} a C_{10}, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos son:
80
en el que n es un número de 1 a 3, y R_{10} es H o -CONHR_{11}NR_{15} R_{16}, en el que R_{11} es un alquilo inferior y R_{15} y R_{16} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo inferior;
L se selecciona del grupo que consiste en:
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81
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87
en el que R_{5} es H; y R_{6}, R_{7} y R_{8} se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo, halógeno, arilo, arilalquilo, aminoalquilo, aminoarilo, oxoalquilo, oxoarilo, y oxoarilalquilo; en el que dicho compuesto de Fórmula I se une al surco estrecho del ADN como dímero.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que L es:
88
A es N, B es NH, X es O, Y es CH, R_{1}, R_{2}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{14}, son cada uno H, y R_{3} y R_{13} son cada uno H.
5. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que L es:
89
A es N, B es NH, X es O, Y es CH, R_{1}, R_{2}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{14}, son cada uno H, y R_{3} y R_{13} son cada uno H.
6. Procedimiento de detección de secuencias de ADN mixtas que comprenden poner en contacto una muestra de ADN con un compuesto fluorescente de Fórmula (I):
90
en la que:
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, y NH;
Y es CH o N;
A es CH o N;
B se selecciona del grupo que consiste en NH, O, o S;
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiarilo y oxiarilalquilo;
R_{2} y R_{9} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, hidroxilo, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, hidroxicicloalquilo, alcoxicicloalcoxi, hidroxialquilo, aminoalquilo y alquilaminoalquilo; y
R_{3}, R_{4}, R_{13} y R_{14} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo inferior, alcoxialquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, y alquilaminoalquilo, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos representan un alquilo, hidroxialquilo o alquileno C_{2} a C_{10}, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos son:
91
en el que n es un número de 1 a 3, y R_{10} es H o -CONHR_{11}NR_{15} R_{16}, en el que R_{11} es un alquilo inferior y R_{15} y R_{16} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo inferior;
L se selecciona del grupo que consiste en:
92
93
94
95
96
97
98
en el que R_{5} es H; y R_{6}, R_{7} y R_{8} se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo, halógeno, arilo, arilalquilo, aminoalquilo, aminoarilo, oxoalquilo, oxoarilo, y oxoarilalquilo; y en el que dicho compuesto de Fórmula I se une al surco estrecho del ADN como dímero;
y a continuación, observar la fluorescencia en la muestra, indicando la observación de la fluorescencia que el compuesto de Fórmula I se ha unido a una secuencia de ADN.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que L es:
99
A es N, B es NH, X es O, Y es CH, R_{1}, R_{2}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{14}, son cada uno H, y R_{3} y R_{13} son cada uno H.
8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que L es:
100
A es N, B es NH, X es O, Y es CH, R_{1}, R_{2}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{14}, son cada uno H, y R_{3} y R_{13} son cada uno H.
9. Formulación farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula (I):
101
en la que:
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, y NH;
Y es CH o N;
A es CH o N;
B se selecciona del grupo que consiste en NH, O, o S;
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiarilo y oxiarilalquilo;
R_{2} y R_{9} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, hidroxilo, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, hidroxicicloalquilo, alcoxicicloalcoxi, hidroxialquilo, aminoalquilo y alquilaminoalquilo; y
R_{3}, R_{4}, R_{13} y R_{14} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo inferior, alcoxialquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, y alquilaminoalquilo, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos representan un alquilo, hidroxialquilo o alquileno C_{2} a C_{10}, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos son:
\vskip1.000000\baselineskip
102
en el que n es un número de 1 a 3, y R_{10} es H o -CONHR_{11}NR_{15} R_{16}, en el que R_{11} es un alquilo inferior y R_{15} y R_{16} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo inferior;
L se selecciona del grupo que consiste en:
103 
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104 
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105 
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106
107
108
109
en el que R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo, halógeno, arilo, arilalquilo, aminoalquilo, aminoarilo, oxoalquilo, oxoarilo, y oxoarilalquilo;
en un portador farmacéuticamente aceptable.
10. Formulación farmacéutica según la reivindicación 9, en la que L es:
110
A es N, B es NH, X es O, Y es CH, R_{1}, R_{2}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{14}, son cada uno H, y R_{3} y R_{13} son cada uno H.
11. Utilización de un compuesto de Fórmula (I):
111
en la que:
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, y NH;
Y es CH o N;
A es CH o N;
B se selecciona del grupo que consiste en NH, O, o S;
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiarilo y oxiarilalquilo;
R_{2} y R_{9} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, hidroxilo, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, hidroxicicloalquilo, alcoxicicloalcoxi, hidroxialquilo, aminoalquilo y alquilaminoalquilo; y
R_{3}, R_{4}, R_{13} y R_{14} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo inferior, alcoxialquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, y alquilaminoalquilo, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos representan un alquilo, hidroxialquilo o alquileno C_{2} a C_{10}, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos son:
112
en el que n es un número de 1 a 3, y R_{10} es H o -CONHR_{11}NR_{15} R_{16}, en el que R_{11} es un alquilo inferior y R_{15} y R_{16} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo inferior;
L se selecciona del grupo que consiste en:
113
114
115
116
117
118
119
en el que R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo, halógeno, arilo, arilalquilo, aminoalquilo, aminoarilo, oxoalquilo, oxoarilo, y oxoarilalquilo; y en el que dicho compuesto de Fórmula I se une al surco estrecho del ADN como dímero, para la fabricación de un medicamento para controlar la expresión génica, tratar el cáncer y otros trastornos de proliferación celular y tratar trastornos de origen genético.
12. Utilización de un compuesto de Fórmula (I):
120
en la que:
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, y NH;
Y es CH o N;
A es CH o N;
B se selecciona del grupo que consiste en NH, O, o S;
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiarilo y oxiarilalquilo;
R_{2} y R_{9} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, hidroxilo, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, hidroxicicloalquilo, alcoxicicloalcoxi, hidroxialquilo, aminoalquilo y alquilaminoalquilo; y
R_{3}, R_{4}, R_{13} y R_{14} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo inferior, alcoxialquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, y alquilaminoalquilo, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos representan un alquilo, hidroxialquilo o alquileno C_{2} a C_{10}, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos son:
121
en el que n es un número de 1 a 3, y R_{10} es H o -CONHR_{11}NR_{15} R_{16}, en el que R_{11} es un alquilo inferior y R_{15} y R_{16} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo inferior;
L se selecciona del grupo que consiste en:
122
123 
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124 
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125
126
127
128
en el que R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo, halógeno, arilo, arilalquilo, aminoalquilo, aminoarilo, oxoalquilo, oxoarilo, y oxoarilalquilo; para unirse selectivamente a ADN de secuencia mixta.
13. Utilización de un compuesto de Fórmula (I):
129
en la que:
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, y NH;
Y es CH o N;
A es CH o N;
B se selecciona del grupo que consiste en NH, O, o S;
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiarilo y oxiarilalquilo;
R_{2} y R_{9} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, hidroxialquilo, y aminoalquilo; y
R_{3}, R_{4}, R_{13} y R_{14} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en alcoxialquilo, arilo, alquilarilo, hidroxialquilo y aminoalquilo, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos representan un alquilo, hidroxialquilo o alquileno C_{2} a C_{10}, o R_{3} y R_{4} juntos o R_{13} y R_{14} juntos son:
130
en el que n es un número de 1 a 3, y R_{10} es H o -CONHR_{11}NR_{15} R_{16}, en el que R_{11} es un alquilo inferior y R_{15} y R_{16} se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo inferior;
L se selecciona del grupo que consiste en:
131
132
133
134
135
136
137
138
en el que R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo, halógeno, arilo, arilalquilo, aminoalquilo, aminoarilo, oxoalquilo, oxoarilo, y oxoarilalquilo; para la preparación de un medicamento destinado a tratar una infección microbiana en un sujeto con necesidad de dicho tratamiento.
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