ES2276785T3

ES2276785T3 - Aislamiento y caracterizacion del operon csa (pili cs4 de etec) y metodos para usar el mismo.

Info

Publication number: ES2276785T3
Application number: ES01928715T
Authority: ES
Inventors: Zeev Altboum; Myron M. Levine; Eileen M. Barry
Original assignee: University of Maryland Baltimore; University of Maryland College Park
Current assignee: University of Maryland Baltimore; University of Maryland College Park
Priority date: 2000-04-20
Filing date: 2001-04-20
Publication date: 2007-07-01
Anticipated expiration: 2021-04-20
Also published as: HUP0300297A3; ATE349531T1; NO20025146D0; AU5554301A; EP1280912B1; CA2407523A1; NZ522272A; US20050136070A1; US7399474B2; WO2001081582A2; AU2001255543B2; DE60125528D1; DE60125528T2; US6902736B2; PL359293A1; CZ20023795A3; NO20025146L; EP1280912A2; HUP0300297A2; US20020176868A1

Abstract

Polipéptido purificado codificado por el operón csa, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 27, en el que dicho polipéptido purificado se selecciona del grupo que consiste en: (a) CsaA que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2, (b) CsaC que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 6, (c) CsaD que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 8, (d) CsaE que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 10, (e) un fragmento de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaD, y (f) un fragmento de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaE, o un polipéptido purificado que tiene al menos el 98% de identidad con cualquiera de (a) a (f).

Description

Aislamiento y caracterización del operón csa (pili CS4 de ETEC) y métodos para usar el mismo.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La invención descrita se refiere al aislamiento y caracterización del operón csa, que codifica para pili CS4 y su uso como agente inmunogénico con utilidad en la prevención de la colonización por ETEC de un sujeto.

Descripción de la técnica relacionada

Las cepas de ETEC humanas son una causa principal de diarrea en lactantes y niños jóvenes en los países en desarrollo (Black et al., Lancet, I: 141-143 (1981); Levine, J. Infect. Dis., 155:377-389 (1987); Qadri, et al., J. Clin. Microbiol., 38:27-31(2000)), que representa una alta tasa de morbimortalidad infantil. Las cepas de ETEC humanas también son una causa principal de diarrea del viajero. (Black, Rev. Infect. Dis, 8S:S131-S135 (1986); DuPont et al., N. Engl. J. Med, 285:1520-1521(1976); Hyams et al., N. Engl. J. Med, 325:1423-1428 (1991); Merson, et al., N. Engl. J. Med, 294:1299-1305 (1976)). La infección por ETEC se caracteriza por diarrea acuosa a menudo acompañada por fiebre de grado bajo, calambres abdominales, malestar y vómitos.

Las cepas de ETEC colonizan la luz del intestino delgado por medio de pili superficiales denominados antígenos del factor de colonización (CFA), y antígenos de superficie de coli (CS), y provocan la diarrea mediante la acción de enterotoxinas termolábiles (LT) y/o termoestables (ST). Las fimbrias de ETEC son filamentos proteínicos que muestran diferentes morfologías tales como formas similares a bastones rígidos de 2-7 nm de diámetro, estructuras enjutas y fuertes, flexibles, delgadas y fibrilares, o haces. (Gaastra et al., Trends. Microbiol., 4:444-452 (1996)).

Las cepas de ETEC humanas presentan una variedad de más de 20 pili serológicamente distintos sobre sus superficies celulares. Las cepas de ETEC humanas más comunes expresan CFA/I, CFA/II y CFA/IV (Levine, et al., "Fimbrial vaccines," En P. Klemm (ed.), Fimbriae: adhesion, biogenics, genetics and vaccines, Boca Raton: CRC Press, 1994; McConnell, et al., Epidemiol. Infect., 106: 477-484 (1991)). CFA/I produce un único tipo de fimbria, mientras que las cepas CFA/II y CFA/IV producen varios tipos de antígenos de superficie de coli. Las cepas CFA/II expresan CS1, CS2 y CS3; y las cepas CFA/IV (originariamente denominadas PCF8775) expresan el antígeno no pili CS6 o bien solo o bien junto con fimbria CS4 o CS5. (McConnell, et al., Infect. Immun., 56:1974-1980 (1988); McConnell, et al., FEMS Microbiol. Lett., 52:105-108 (1989); Svennerholm, et al., Infect. Immun., 56:523-528 (1988); Thomas, et al., J. Gen. Microbiol., 131:2319-2326 (1985)). La aparición de cepas que producen CS4^{+}CS6^{+} se restringe al serotipo 025:H42. (McConnell, et al., Infect. Immun., 56:1974-1980 (1988); Willshaw, et al., FEMS Microbiol. Lett., 49:473-478 (1988); Willshaw, et al., FEMS Microbiol. Lett., 56:255-260 (1990); Willshaw, et al., FEMS Microbiol. Lett., 66:125-129 (1991)).

Los pili CS4 son rígidos, de 7 nm de diámetro, y están compuestos por subunidades con una masa molecular de 17,0 kDa. (Knutton, et al., Infect. Immun., 57:3364-3371 (1989); McConnell, et al., Infect. Immun., 56:1974-1980 (1988); Wolf, et al., Infect. Immun., 57:164-173 (1989)). Debido a su importancia epidemiológica y debido al hecho de que no se produce protección cruzada entre cepas de ETEC que expresan diferentes fimbrias, deben incluirse al menos estos tipos fimbriales CFA/I y CS1-CS6 en una vacuna contra ETEC de amplio espectro, (Gaastra et al., Trends. Microbiol., 4:444-452 (1996); Levine, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., In Press (2000); Levine, et al., "Fimbrial vaccines," In P. Klemm (ed.), Fimbriae: adhesion, biogenics, genetics and vaccines, Boca Raton: CRC Press, 1994). De estas siete fimbrias importantes, sólo los genes que codifican para CS4 no se han clonado y secuenciado.

Los genes que se requieren para la expresión de pili funcionales están unidos característicamente en agrupaciones de genes (Sakellaris y Scott, Mol. Microbiol., 30:681-687 (1998)), y consisten en los genes estructurales, genes de casete de ensamblaje y genes reguladores. Los genes de casete de ensamblaje incluyen genes chaperona y usher. Se cree que la proteína chaperona se une a proteínas de subunidad fimbrial en el espacio periplasmático y previene la degradación y plegamiento prematuro. Las proteínas usher son proteínas de membrana exterior que sirven como poros para el transporte y montaje de las fimbrias. El gen estructural codifica para la proteína pilina que forma las fimbrias que están compuestas por subunidades repetidas de la proteína pilina. Algunas fimbrias, tales como CFA/I, CS1 y CS2, contienen una proteína pilina minoritaria que está asociada con las puntas de los pili, que está probablemente implicada en la unión de la bacteria a los receptores celulares. (Sakellaris, et al., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A., 96:12828-12832 (1999)). La expresión de fimbrias está controlada por genes tales como rns y cfaD que son similares a la familia araC de reguladores transcripcionales que regulan positivamente la transcripción. (Grewal et al., Vaccine, 11:221-226 (1993); de Haan et al., FEMS Microbiol Lett., 67:341-346 (1991); 19, 21, Savelkoul, et al., Microb. Pathog., 8:91-99 (1990)).

Se han localizado genes que codifican para fimbrias de ETEC sobre plásmidos grandes [CFA/I, (Hamers et al., Microb. Pathog., 6:297-309 (1989); 20); CS1, (Froehlich et al., Mol. Microbiol, 12:387-401 (1994)); CS3, (Jalajakumari, et al., Mol. Microbiol., 3:1685-1695 (1989), Manning, et al., Mol Gen. Genet., 200:322-327 (1985)); CS5, (Duthy, et al., J. Bacteriol, 181:5847-5851 (1999)) y CS6, (Wolf, et al., FEMS Microbiol. Lett., 148:35-42 (1997))], o en el cromosoma [CS2, (Froehlich et al., Mol. Microbiol., 12:387-401 (1994), Froehlich et al., Infect. Immun., 63:4849-4856 (1995))]. Experimentos tempranos para localizar los genes que codifican para CS4 han revelado resultados dispares sin una ubicación concluyente, (Sommerfelt, et al., Miciob. Pathog., 11:297-304 (1991); Sommerfelt, et al., Infect. Immun., 60:3799-3806 (1992); Sommerfelt, et al., J. Clin. Microbiol., 30:1823-1828 (1992); Willshaw, et al., FEMS Microbiol. Lett., 56:255-260 (1990); Wolf, et al., Infect. Immun., 57:164-173 (1989)).

Debido a que la unión de las cepas de ETEC a las células intestinales es crucial para el establecimiento de la infección, la prevención de la enfermedad se basa principalmente en respuestas inmunitarias contra los pili que interfieren con el proceso de unión. Estudios realizados con 14 voluntarios humanos sanos que ingirieron 5x10^{8} E. coli E24377A (0139:H28), una cepa que produce CS1 y CS3, mostraron que los 14 resultaron colonizados, 9 desarrollaron un síndrome diarreico típico, y 6 de estas personas enfermas manifestaron un aumento significativo de anticuerpo IgG en suero frente a antígenos CS1 y CS3 purificados. Levine, M. M., et al., Infect. Immun., 44:409-420 (1984). Estos resultados sugieren que las fimbrias desempeñan un papel en la patogénesis, y estimulan una respuesta inmunitaria.

La protección pasiva contra la infección por ETEC se demostró en un ensayo clínico realizado en la Universidad de Maryland, que demostró que la profilaxis oral con inmunoglobulina anti-CFA/I hiperinmunitaria proporcionó un 90% de protección frente a la diarrea provocada por una exposición oral con 10^{9} ufc de cepa H10407 de ETEC, una cepa que produce CFA/I. Tacket, et al., N. Eng. J. Med., 318: 1240 (1988). En otro estudio, se usó la inmunización oral con antígenos CS1 y CS3 purificados encapsulados en microesferas de polímero biodegradable para inducir el desarrollo de ASC (células secretoras de anticuerpos) de IgA anti-CS y IgA anti-CS secretora de fluido yeyunal en el 50% de los vacunados. Levine, et al., Fimbriae (pili) adhesions as vaccines, in Protein-Carbohydrate Interactions in Biological Systems. The molecular Biology of Microbial Pathogenicity, Lark, et al., Eds., Academic Press, Londres, pág 154, 1986. Esta exposición también protegió al 30% de los vacunados de diarrea tras la exposición con la cepa E24377A (CS1^{+}C53^{+}LT^{+}ST^{+}) de ETEC virulenta. Se demostró una eficacia protectora del 75% mediante inmunización con la cepa de ETEC atenuada. Alimentar a los voluntarios con 5x10^{10} E. coli E1392-75-2A (06:H16) vivas, una cepa CS1^{+} CS3^{+} LT ST, indujo un aumento significativo de anticuerpos IgA secretores de fluido intestinal frente a fimbrias CS1 y CS3 fimbria, y confirió protección a 9/12 voluntarios que se expusieron con una cepa de serotipo heterólogo virulenta de ETEC E24377A(0139:H28).

Otro enfoque para desarrollar una vacuna frente a ETEC es inmunizar con cepas de ETEC mixtas muertas. Este tipo de vacuna se basa en el hecho de que la infección anterior con una cepa de ETEC logra una inmunidad protectora frente a enfermedades clínicas que puedan causarse a partir de una exposición posterior a la cepa homóloga. La inmunización oral de voluntarios niños y adultos con una vacuna de este tipo dio como resultado respuestas de IgA intestinales significativas frente a los componentes CFA y CS de diversas cepas. La vacuna indujo un alto nivel de anticuerpo IgA intestinal, ASC de anticuerpo IgA en la sangre, y anticuerpos séricos frente a los antígenos del factor de colonización. Jertbom, et al., Vaccine 16:255 (1997). Esos resultados indican que los anticuerpos frente a pilis de ETEC proporcionan protección frente a la diarrea provocada por cepas de ETEC.

Se ha propuesto una vacuna combinada contra la enfermedad diarreica provocada por Shigella, Salmonella y ETEC. Estas vacunas están compuestas por cepas de Shigella o Salmonella vivas atenuadas que expresan las fimbrias de ETEC. Las bacterias recombinantes colonizan el intestino e inducen la respuesta inmunitaria sistémica y mucosa frente a las bacterias y los pili. Noriega et al., (Infect. Immun., 64:23-27 (1996)) expresaron conjuntamente CFA/I y CS3 en Shigella CVD1203, ratones y cobayas inmunizadas, y mostraron que los animales inmunizados desarrollaron títulos elevados de IgA secretada en lágrimas (similar al sigA mucoso), y anticuerpos IgG séricos, frente a LPS de Shigella y los antígenos fimbriales. Se expresó el gen LT (K63) recombinante humano de ETEC en Shigella CVD1204, una cepa que depende de guanina, y mostró producción de slgA e IgG sérico frente a LPS de Shigella así como frente a las subunidades LT-A y LT-B de la enterotoxina LT, tras la inmunización de cobayas. Koprowski, et al., (Infect. Immun., 68:4884-92 (2000)) expresaron conjuntamente en CVD1204 los antígenos CFA/I y LT (K63), y demostraron la producción de anticuerpos del slgA e IgG sérico frente a LPS de Shigella, los antígenos de pili CFAII y los antígenos LT. Altboum et al, (Attenuated Shigella flexneri 2a \DeltaguaBA strain CVD 1204 expressing ETEC CS2 y CS3 fimbriae as a five mucosal vaccine against Shigella and enterotoxigeenterotoxigenic Escherichia coli infection, In press) inmunizaron cobayas con una mezcla de cepas CVD1204 que expresaban las fimbrias CS2 y CS3 de ETEC. Todos los animales inmunizados desarrollaron anticuerpos IgG séricos y slgA en lágrimas frente a antígenos LPS, CS2 y CS3 de Shigella, anticuerpos aglutinantes frente a Shigella y cepas CS2 y CS3 de ETEC, y se protegieron frente a queratoconjuntivitis provocada mediante exposición del ojo con la cepa 2a 2457T de S. flexneri virulenta. Esos resultados indican que una inmunización combinada con cepas de Shigella atenuadas que expresan fimbrias de ETEC podría inducir la protección frente a infección por ETEC y shigelosis.

Sommerfelt et al (Infection and Immunity, 60, 3799-3806) describen un posible factor de colonización 0166, cuya secuencia de aminoácidos N-terminal es similar a la de CS4 y CFA/I. Los autores proponen una relación genética entre los operones que codifican para estos polipéptidos. El ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos derivada del gen CsfA de E. coli se han identificado y tienen un número de registro X97493.

El documento WO 96/38171 (Department of the Army, US Government - Departamento del Ejercito, Gobierno de los EE.UU.) describe dos péptidos "consenso" de 36 aminoácidos, que se proponen como inmunógenos para preparar anticuerpos frente a miembros de CS4-CFA/I de la familia de E. coli.

Hamers et al (Microbial Pathogenesis, 6:297-309) describe una secuencia parcial de un péptido inmunogénico de la subunidad principal (csaB) de fimbrias CS4.

Sin embargo, Sommerfelt et al no describe la secuencia de ácido nucleico de longitud completa o secuencia de aminoácidos correspondiente de cualquiera de los cinco genes abarcados en el operón csa. De manera similar, X97493 y Hamers et al no describen la secuencia de longitud completa del polipéptido o ácido nucleico de CsaB.

Por tanto, según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido purificado codificado por el operón csa, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 27, en la que dicho polipéptido purificado se selecciona del grupo que consiste en (a) CsaA que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2; (b) CsaC que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 6; (c) CsaD que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 8; (d) CsaE que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 10, (e) un fragmento de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaD; y (f) un fragmento de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaE; o un polipéptido purificado que tiene al menos el 98% de identidad con cualquiera de (a) a (f).

Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un vector de expresión que comprende uno o más de (i) un operón csa que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 27 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 98% de identidad con un operón csa de ese tipo, o (ii) un fragmento de un operón csa, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 27, en el que el fragmento se selecciona del grupo que consiste en (a) un fragmento que codifica para un marco de lectura abierto de longitud completa de CsaA que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2; (b) un fragmento que codifica para un marco de lectura abierto de longitud completa de CsaB que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4; (c) un fragmento que codifica para un marco de lectura abierto de longitud completa de CsaC que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 6; (d) un fragmento que codifica para un marco de lectura abierto de longitud completa de CsaD que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 8; (e) un fragmento que codifica para un marco de lectura abierto de longitud completa de CsaE que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 10; (f) un fragmento que codifica para un polipéptido de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaC; (g) un fragmento que codifica para un polipéptido de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaD; (h) un fragmento que codifica para un polipéptido de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaE, y (i) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 98% de identidad con cualquiera de (a) a (h).

La invención proporciona además un método para producir un vector de expresión que comprende insertar uno o más de un operón csa o un fragmento de un operón csa tal como se definió en el segundo aspecto dentro de la región codificante del vector bajo el control de un promotor.

La presente invención también proporciona una célula huésped que comprende un vector de expresión de este tipo.

También se proporciona un método para producir uno o más productos recombinantes codificados por el operón csa, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 27, que comprende (a) introducir dentro de una célula huésped un vector de expresión que comprende al menos una parte de una región codificante del operón csa de modo que se produce una célula huésped recombinante, y (b) cultivar la célula huésped recombinante en condiciones tales que se expresan uno o más productos recombinantes codificados por la parte de región codificante, en el que producto recombinante se selecciona del grupo que consiste en: un antígeno CS4 codificado por un operón csa, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 27, los polipéptidos según el primer aspecto de la invención, y CsaB que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4.

Se proporciona adicionalmente una composición inmunogénica que comprende:

(i) más de un polipéptido recombinante purificado codificado por un operón csa, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 27, en el que dicho polipéptido purificado se selecciona del grupo que consiste en:

(a): CsaA que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2,

(b): CsaB que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4,

(c): CsaC que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 6,

(d): CsaD que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 8,

(e): CsaE que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 10,

(f): un fragmento de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaD,

(g): un fragmento de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaE, y

(h): un polipéptido purificado que tiene al menos el 98% de identidad con cualquiera de (a) a (g), o

(ii) un microorganismo recombinante que comprende el vector de expresión según el segundo aspecto de la invención, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan tales vectores de expresión, composiciones inmunogénicas o un polipéptido purificado seleccionado del grupo que consiste en:

(a): CsaA que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2,

(b): CsaB que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4,

(c): CsaC que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 6,

(d): CsaD que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 8,

(e): CsaE que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 10,

(f): un fragmento de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaD, y

(g): un fragmento de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaE, o un polipéptido purificado que tiene al menos el 98% de identidad con cualquiera de (a) a (g), para su uso en un método para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto.

Se proporciona un vector de expresión, composición inmunogénica o péptido purificado tal como se expone en el párrafo anterior para su uso en un método para generar una respuesta inmunitaria protectora en un vertebrado frente a E. coli enterotoxigénica (ETEC).

La invención descrita se refiere a composiciones y métodos para usar productos de operón csa y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos codificadas por el mismo. Una realización se refiere a una composición inmunogénica que comprende más de un producto recombinante de un operón csa y un excipiente. Varios aspectos de esta realización se refieren a composiciones en las que los productos recombinantes del operón csa se seleccionan de CsaA, CsaB, CsaC, CsaD y CsaE, fragmentos de al menos 30 aminoácidos contiguos de Csa D o E, y polipéptidos recombinantes que tienen al menos el 98% de identidad con esos productos. Alternativamente, la composición inmunogénica puede comprender un microorganismo recombinante tal como se definió anteriormente en el presente documento.

También se describe una secuencia de nucleótidos aislada que comprende un operón csa o un fragmento funcional del mismo, así como una secuencia de polipéptido purificado expresada a partir de un operón csa recombinante.

También se describen diversos métodos para usar el operón csa, productos, y fragmentos del mismo. Se describe un método para generar una respuesta inmunitaria, que comprende proporcionar una composición inmunogénica a un sujeto, en el que la composición inmunogénica comprende un operón csa, un fragmento funcional del mismo, o producto del mismo, y poner en contacto el sujeto con la composición inmunogénica, mediante lo cual se genera una respuesta inmunitaria en el sujeto.

Una realización adicional se refiere a un método para producir un producto de polipéptido a partir de un operón csa, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 27, que comprende:

(a) introducir dentro de una célula huésped un vector de expresión que comprende al menos a parte de una región codificante del operón csa de modo que se produce una célula huésped recombinante, y

(b) cultivar la célula huésped recombinante en condiciones tales que se expresan uno o más productos recombinantes codificados por la parte de región codificante, en el que el producto recombinante se selecciona del grupo que consiste en: un antígeno CS4 codificado por un operón csa, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 27, CsaA, CsaB, CsaC, CsaD, CsaE y fragmentos de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaD o E.

También se describen células que contienen el operón csa recombinante o fragmentos del mismo y vectores que comprenden el operón csa o fragmentos del mismo.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Constructos de plásmidos que contienen el operón csa entero. El plásmido pKS-CSA-1 contiene los genes csaB, csaC, csaE, csaD, y el elemento IS1, (1A). El plásmido pKS-CSA-11 contiene los genes csaA y secuencias en sentido 5' flanqueadas con elemento IS21, (1B). Representación esquemática del operón csa, (1C).

Figura 2. El plásmido de expresión de fimbrias CS4. Descripción esquemática del plásmido pGA2 estabilizado, (figura 2A), que se mantiene con 15 copias por célula, y contiene el sistema de destrucción post-segregacional hok-sok, el sistema de partición de plásmido parA y parM; el alelo aph para la resistencia frente a la kanamicina, y múltiples sitios de clonación. La figura 2B, el plásmido pGA2-CS4 que contiene la fimbria CS4 clonada que codifica para los genes csaA, csaB, csaC y csaE.

Figura 3. Alineación de la secuencia de aminoácidos de CsaE con otras proteínas homólogas. Se usó la secuencia de aminoácidos prevista de CsaE (SEQ ID No. 28) basada en la secuencia génica en una búsqueda en BLAST de otras proteínas homólogas. CfaE (SEQ ID No. 29) es el resto de adhesión de punta de CS2; CooD (SEQ ID No. 30) es el resto de adhesión de punta de CS 1; y TsaD (SEQ ID No. 31) es la proteína de adhesión de Salmonella typhi. CotD (SEQ ID No. 32) es la proteína de recubrimiento de esporas de Bacillus subtilis.

Figura 4. Alineación de la secuencia de aminoácidos de CsaB con otras proteínas de subunidad fimbrial de ETEC. Se usó la secuencia de aminoácidos prevista de CsaB (SEQ ID NO:33) basándose en una secuencia de ADN en una búsqueda en BLAST para identificar proteínas homólogas. Las otras subunidades fimbriales eran CfaA (SEQ ID NO:34), CooA (SEQ ID NO:35), CotA (SEQID NO:36), CsuA1 (SEQ ID NO:37), CsuA2 (SEQ ID NO:38), CsdA (SEQ ID NO:39), y CsbA (SEQ ID NO:40).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La siguiente descripción se refiere al operón csa, que codifica para las proteínas requeridas para la producción de antígeno CS4, y la generación de composiciones inmunogénicas que contienen productos o fragmentos del operón csa. También se describen métodos para preparar y usar las composiciones inmunogénicas descritas.

Para generar las composiciones inmunogénicas descritas, se ha secuenciado el operón csa y se ha clonado dentro de un vector de expresión. Se han expresado los genes del operón csa en Shigella CVD1204, dando como resultado la producción de CS4 en este microorganismo recombinante. Los resultados preliminares de la inmunización de cobayas con esta cepa recombinante indican el desarrollo de una respuesta inmunitaria tanto frente a Shigella como pili CS4. En consecuencia, el trabajo descrito en el presente documento referente al operón csa puede aplicarse a la formulación y administración de composiciones inmunogénicas con actividad frente a una variedad de enfermedades.

Organización del operón csa

El operón csa está ubicado en un fragmento de ADN de aproximadamente diez (10) kilobases de longitud. El operón comprende 5 genes que están flanqueados en ambos lados por elementos de inserción. Esta estructura es similar a la isla de patogenicidad descrita en la figura 1.

A partir del fragmento entero, se secuenciaron 7245 pares de bases en ambas cadenas y se presentan los datos en la figura 2. Se encontró que el tamaño del operón csa es de aproximadamente 6099 pares de bases de longitud y abarca cinco marcos de lectura abiertos.

La homología de secuencia con genes que codifican para las subunidades de otras fimbrias de ETEC para las que está disponible el análisis bioquímico, indica las siguientes funciones para cada uno de los marcos de lectura abiertos. El gen csaA codifica para la proteína CsaA, que se supone que es una proteína periplásmica similar a chaperona. El gen csaB codifica para la proteína CsaB, que se supone que es la subunidad de pilina principal. El análisis de secuencia aminoterminal de la subunidad de pilina CS4 confirma el papel de este gen. El gen csaC codifica para la proteína CsaC, que se supone que es una proteína usher de membrana. El gen csaD codifica para una CsaD truncada, que se supone que es una proteína reguladora. El gen csaE codifica para la proteína CsaE, que se supone que es una proteína de pilina asociada a la punta. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas CsaA-E se describen en la figura 3.

La ubicación de los genes individuales en el operón csa, y las propiedades de las proteínas CsaA-E, se describen en la tabla 1.

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TABLA 1

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Las secuencias de aminoácidos de las proteínas CsaA-E comparten una homología con proteínas similares de otras fimbrias de ETEC. En la tabla 2 se muestra una comparación de homologías de proteínas.

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TABLA 2

2

3

El operón csa codifica para la síntesis de fimbrias CS4 de ETEC. Este operón se clonó a partir de ETEC E11881A, una cepa productora de CS4. Se secuenció un fragmento de ácido nucleico que comprende 7239 pares de bases (en ambas direcciones). Los resultados indican que el operón csa está ubicado en un fragmento de ácido nucleico de 6095 pares de bases de longitud. (número de registro AF296132).

Se analizó la secuencia del operón csa. El análisis del operón indicó que el operón csa codifica para cinco proteínas. Estas proteínas son la proteína estructural de fimbrias (CsaB), la proteína asociada a punta (CsaE), una proteína similar a chaperona (CsaA), una proteína similar a usher (CsaC), y una proteína reguladora truncada (CsaD).

La proteína CsaB consiste en 167 aminoácidos, (23 de los cuales comprenden un péptido señal), que producen un péptido de \sim17 kDa. La secuencia de aminoácidos de la proteína CsaB comparte homología con otras proteínas de fimbrias de ETEC. Por ejemplo, CsaB es homóloga al 71% con la proteína CfaB de CFA/I, homóloga al 69% y al 62% con las dos proteínas estructurales CS14, homóloga al 63% con la proteína estructural CS1, homóloga al 62% con la proteína estructural CS2, homóloga al 56% con la proteína estructural CS19, y homóloga al 55% con la proteína estructural CS17.

Se cree que la proteína CsaE es una proteína asociada a punta basándose en su homología con proteínas de punta conocidas de otras fimbrias de ETEC. Es una proteína de 361 aminoácidos, 23 aminoácidos de los cuales se escinden para producir una proteína de \sim40 kDa globular. La secuencia de aminoácidos de la proteína CsaE comparte homología con proteínas de punta de pili CFA/I, CS 1 y CS2, del 80%, 67% y 63%, respectivamente. Las proteínas de ensamblaje CsaA y CsaC comparten homología con proteínas similares de pili CFA/I, CS1 y CS2.

Se cree que CsaD es una proteína reguladora basándose en su homología con otras proteínas reguladoras de ETEC conocidas. Se eliminaron sus 48 aminoácidos terminales como resultado de una inserción de un elemento IS1. Además, dos mutaciones por desplazamiento de marco tras 100 aminoácidos dieron como resultado un codón de terminación. La cepa E7473 de ETEC CFA/I contiene una proteína similar a CfaD' truncada (144 aminoácidos de 265), que también contiene un codón de terminación y diversas mutaciones por desplazamiento de marco. (Jordi, et al., DNA Seq., 2:257-263 (1992)). La posición de la mutación por desplazamiento de marco en cfaD' (número de registro AAC41418) es en la misma región que en csaD'.

En sentido 5' del gen csaA (aproximadamente 3,5 kb) hay un elemento IS21 adicional, que flanquea al operón csa entre dos elementos de inserción, que es característico de una estructura móvil. El tamaño de esta estructura similar a una isla de patogenicidad es de aproximadamente 10.500 pares de bases y su razón G-+-C es inferior a la de E coli (el 38,8% frente al 50,8%).

Otros operones fimbriales de ETEC se llevan en estructuras móviles similares. El operón CS1 contiene secuencias IS en ambos lados (IS 150 (número de registro: X62495), e IS2 (número de registro: X76908)(Froehlich, et al., Mol. Microbiol., 12:387-401 (1994)). El operón CS2 contiene en su sitio en sentido 5' secuencias de ADN de IS3 e IS1, (número de registro: Z47800) (Froehlich, et al., Infect. Immun., 63:4849-4856 (1995)). Los pili CS6 contienen elementos IS, en sentido 5' IS91 e IS102, y en sentido 3' IS629 e IS3, (número de registro UO4844) (Wolf, et al., FEMS Microbiol. Lett., 148:35-42 (1997)). El operón de pili CS5 contiene secuencias de IS1 en la posición en sentido 5' que son homólogas al 99% con las secuencias de IS1 del operón csa, y en su sitio en sentido 3', secuencias de IS30. (número de registro AJ224079) (Duthy, et al., J. Bacteriol., 181:5847-5851(1999)).

La proteína fimbrial principal CS4 comparte un alto grado de homología de secuencia de aminoácidos con las proteínas fimbriales CFA/I, CS1 CS2. La reacción cruzada entre anticuerpos frente a fimbrias CS4 y CFA/I, CS1, CS2, y CS17 se describió por McConnell et al 1989. (McConnell, et al., FEMS Microbiol. Lett., 52:105-108 (1989)).

La alta homología entre las proteínas estructurales de las fimbrias CS4 y CFA/I dio como resultado anticuerpos que reaccionan de manera cruzada con ambas fimbrias. Los anticuerpos monoclonales frente a CFA/I reaccionan de manera cruzada con CS4 e inhiben la unión de ambas cepas que contienen fimbrias a enterocitos yeyunales humanos y células Caco-2. Estos anticuerpos también inhibieron la hemaglutinación y confirieron protecciones pasivas frente a la acumulación de fluido en asas ileales en conejos provocadas mediante infección con ambas cepas de ETEC. (Rudin, et al., Microb. Pathog., 21:35-45 (1996)). Además, se ha lanzado la hipótesis de que la inmunización con fimbrias CFA/I y CS4 purificadas puede provocar y reforzar respuesta inmunitaria frente a las fimbrias homólogas y heterólogas. (Rudin y Svennerholm, Microb. Pathog., 16:131-139 (1994); Rudin, et al., Epidemiol. Infect., 119:391-393 (1997)).

Secuencias de nucleótidos relacionadas con el operón csa

Habiéndose identificado el operón csa y los genes codificados por el mismo, este conocimiento se ha usado para producir composiciones inmunogénicas útiles. Tal como se trata más completamente en los ejemplos a continuación, se clonaron, secuenciaron y expresaron los genes del operón csa. Las moléculas de polinucleótidos que codifican para las proteínas del operón csa y sus secuencias se proporcionan a continuación.

Moléculas de polinucleótidos representativas que codifican para las proteínas del operón csa (SEQ ID. NO.: 27) incluyen secuencias que comprenden csaA (SEQ. ID. NO.: 1), csaB (SEQ. ID. NO.: 3), csaC (SEQ. ID. NO.: 5), csaD (SEQ. ID. NO.:7), y csaE (SEQ. ID. NO.: 9). Moléculas de polinucleótidos que codifican para las proteínas del operón csa incluyen aquellas secuencias que dan como resultado polimorfismos genéticos menores, diferencias entre cepas, y aquellas que contienen sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos.

En algunos casos, pueden emplearse tales cambios en la secuencia de una proteína recombinante codificada por el operón csa para disminuir o aumentar sustancialmente la actividad biológica de una proteína particular codificada por el operón csa con respecto a la actividad de la proteína de tipo natural codificada por el operón csa correspondiente. Tales cambios también pueden dirigirse hacia una secuencia endógena codificada por el operón csa usando, por ejemplo, diversas técnicas biológicas moleculares para alterar el gen endógeno y por tanto su producto proteico.

Las secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas de operón csa pueden usarse para identificar moléculas de polinucleótidos que codifican para otras proteínas con funciones biológicas similares a las del operón csa. Pueden obtenerse moléculas de ADN complementario que codifican para proteínas similares a operón csa construyendo una biblioteca de ADNc a partir de ARNm de células eucariotas o una biblioteca de ADN de otros microorganismos procariotas. Pueden aislarse moléculas de ADN que codifican para proteínas similares a operón csa de tales bibliotecas usando las secuencias descritas en el presente documento con técnicas de hibridación habituales o mediante la amplificación de secuencias usando la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).

De una manera similar, puede obtenerse ADN genómico que codifica para homólogos de proteínas de operón csa usando sondas diseñadas a partir de las secuencias descritas en el presente documento. Pueden obtenerse sondas adecuadas para su uso en la identificación de secuencias homólogas de proteínas producidas por operón csa a partir de secuencias específicas de operón csa. Alternativamente, pueden usarse oligonucleótidos que contienen secuencias de ADN específicas a partir de una región codificante de operón csa para identificar clones de csa relacionados. Un experto en la técnica apreciará que pueden obtenerse regiones reguladoras del operón csa y operones y genes homólogos usando métodos similares.

Pueden aislarse moléculas de polinucleótidos homólogas a operón csa usando técnicas de hibridación habituales con sondas de al menos aproximadamente 7 nucleótidos de longitud y hasta, e incluyendo, la secuencia codificante completa. Pueden identificarse secuencias de operón csa homólogas usando oligonucleótidos degenerados que pueden hibridar basándose en las secuencias descritas en el presente documento para su uso para la amplificación por PCR o mediante hibridación con rigurosidad moderada o superior. El término "que puede hibridar", tal como se usa en el presente documento significa que las moléculas de ácido nucleico (ya sea ADN o ARN) se aparean con un oligonucleótido de 15 o más nucleótidos contiguos de SEQ. ID. NO: 1, 3, 5, 7, y 9.

La selección de las condiciones de hibridación será evidente para un experto en la técnica y generalmente estará guiada por el propósito de la hibridación, el tipo de hibridación (ADN-ADN o ADN-ARN), y el nivel de relación deseada entre las secuencias. Los métodos de hibridación están bien establecidos en la bibliografía. Un experto en la técnica sabe que la estabilidad de los dúplex de ácido nucleico disminuirá con el aumento del número y ubicación de bases de apareamiento erróneo; por tanto, la rigurosidad de la hibridación puede usarse para maximizar o minimizar la estabilidad de tales dúplex. La rigurosidad de hibridación puede alterarse: ajustando la temperatura de hibridación; ajustando el porcentaje de agentes desestabilizantes de hélice, tales como formamida, en la mezcla de hibridación; y ajustando la temperatura y concentración de sal de las disoluciones de lavado. En general, la rigurosidad de hibridación se ajusta durante los lavados tras la hibridación haciendo variar la concentración de sal y/o la temperatura, dando como resultado condiciones de rigurosidad progresivamente superior.

Un ejemplo de condiciones de rigurosidad progresivamente superior es tal como sigue: 2 x SSC/SDS al 0,1% a aproximadamente temperatura ambiente (condiciones de hibridación); 0,2 x SSC/SDS al 0,1% a aproximadamente temperatura ambiente (condiciones de rigurosidad baja); 0,2 x SSC/SDS al 0,1% a aproximadamente 42ºC (condiciones de rigurosidad moderada); y 0,1 x SSC a aproximadamente 68ºC (condiciones de rigurosidad alta). El lavado puede llevarse a cabo usando sólo una de estas condiciones, por ejemplo, condiciones de rigurosidad alta, o puede usarse cada una de las condiciones, por ejemplo, durante 10-15 minutos cada una, en el orden enumerado anteriormente, repitiendo cualquiera o todas las etapas enumeradas. Sin embargo, tal como se mencionó anteriormente, las condiciones óptimas variarán, dependiendo de la reacción de hibridación particular implicada, y pueden determinarse empíricamente. En general, se usan condiciones de rigurosidad alta para la hibridación de las sondas de interés.

Alternativamente, los polinucleótidos que tienen sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ. ID. NO: 1, 3, 5, 7, y 9 o fragmentos funcionales de las mismas, o secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas a SEQ. ID. NO: 1, 3, 5, 7, y 9, pueden representar elementos de un operón similar a csa. Por "sustancialmente la misma" o "sustancialmente idéntica" se refiere a un ácido nucleico o polipéptido que muestra al menos el 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de homología con un ácido nucleico de referencia. Para las secuencias de nucleótidos, la longitud de las secuencias de comparación será generalmente al menos de 10 a 500 nucleótidos de longitud. Más específicamente, la longitud de comparación será al menos de 50 nucleótidos, al menos de 60 nucleótidos, al menos de 75 nucleótidos, y al menos de 110 nucleótidos de
longitud.

Una realización de la invención proporciona moléculas de polinucleótidos aisladas y purificadas que codifican para una o más proteínas de operón csa, en las que las moléculas de polinucleótidos que pueden hibridar en condiciones de moderadas a rigurosas con un oligonucleótido de 15 o más nucleótidos contiguos de SEQ. ID. NO: 1, 3, 5, 7, y 9, incluyendo cadenas complementarias de los mismos.

Las secuencias de ADN de la invención pueden obtenerse por varios métodos. Por ejemplo, puede aislarse el ADN usando la hibridación o técnicas asistidas por ordenador que se conocen bien en la técnica. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a: 1) hibridación de bibliotecas de ADNc o genómico con sondas para detectar secuencias de nucleótidos homólogas; 2)selección de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas; 3) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) sobre ADNc o ADN genómico usando cebadores que pueden aparearse con la secuencia de ADN de interés; 4) búsquedas por ordenador de bases de datos de secuencias para detectar secuencias similares; y 5) examinación diferencial de una biblioteca de ADN sustraída.

Los procedimientos de selección que se basan en la hibridación de ácidos nucleicos hacen posible aislar cualquier secuencia de genes de cualquier microorganismo, siempre que esté disponible la sonda apropiada. Las sondas de oligonucleótidos, que corresponden a una parte de secuencias de operón csa proporcionadas en el presente documento y que codifican para una proteína Csa, pueden sintetizarse químicamente. Esta síntesis requiere que se conozcan extensiones cortas de oligopéptidos de la secuencia de aminoácidos. La secuencia de ADN que codifica para la proteína puede deducirse a partir del código genético, sin embargo, debe tenerse en cuenta la degeneración del código. Es posible realizar una reacción de adición mixta cuando la secuencia está degenerada. Esto incluye una mezcla heterogénea de ADN de doble cadena desnaturalizado. Para una selección de este tipo, la hibridación se realiza preferiblemente o bien sobre ADN de cadena sencilla o bien ADN de doble cadena desnaturalizado. La hibridación es particularmente útil en la detección de clones de ADNc derivados de fuentes en las que está presente una cantidad extremadamente baja de secuencias de ARNm referentes al polipéptido de interés. En otras palabras, usando condiciones de hibridación rigurosas dirigidas para evitar la unión no específica, es posible, por ejemplo, permitir la visualización autoradiográfica de un clon de ADN o ADNc específico mediante la hibridación del ADN diana con una única sonda en la mezcla que es su complemento completo. (Wallace, et al., Nucl. Acido Res., 9:879, 1981). Alternativamente, una biblioteca de sustracción es útil para la eliminación de clones de ADNc no específicos.

Entre los procedimientos habituales para aislar secuencias de ADN de interés está la formación de bibliotecas genómicas que llevan plásmidos o fagos que incluyen ADN total del microorganismo de interés. Cuando se usa en combinación con la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa, pueden clonarse incluso productos de expresión poco comunes. En aquellos casos en los que se conocen las partes significativas de la secuencia de aminoácidos del polipéptido, la producción de secuencias de sonda marcadas de ARN o ADN de cadena sencilla o doble cadena que duplican una secuencia posiblemente presente en el ADN diana, puede emplearse en procedimientos de hibridación de ADN/ADN que se llevan a cabo sobre copias clonadas del ADN que se ha desnaturalizado para dar una forma de cadena sencilla (Jay, et al., Nucl. Acido Res., 11:2325, 1983).

Las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento tienen una miríada de aplicaciones. Usos representativos de las secuencias de nucleótidos de la invención incluyen la construcción de sondas de ADN y oligonucleótidos útiles en ensayos de inmunotransferencia de tipo Northern, Southern, y puntual para identificar y cuantificar el nivel de expresión de proteínas codificadas por el operón csa en una célula. Las proteínas codificadas por el operón csa tienen una variedad de usos, por ejemplo, como antígenos con los que provocar una respuesta inmunitaria.

Además, considerando el importante papel que desempeña los pili CS4 en la unión y colonización de ETEC, se cree sumamente posible que las composiciones que contienen los pili CS4 o composiciones con actividad frente al mismo pueden resultar de la expresión del operón csa. En este caso, las proteínas del operón csa pueden resultar ser sumamente útiles en la generación de composiciones inmunogénicas que pueden usarse para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto.

De manera similar, las secuencias de nucleótidos del operón csa pueden emplearse para la construcción de líneas celulares recombinantes, microorganismos recombinantes, vectores de expresión, y similares. Tales constructos recombinantes pueden usarse para expresar proteínas de operón csa recombinantes. Los constructos recombinantes pueden usarse para seleccionar agentes terapéuticos candidatos que pueden alterar la patología de un microorganismo que expresa antígeno CS4. Las proteínas del operón csa también presentan un conjunto de proteínas atractivo con el que crear composiciones inmunogénicas. Por ejemplo, pueden expresarse, purificarse y usarse los pili CS4 para preparar una composición de subunidad inmunogénica. En otra realización, pueden expresarse pili CS4 recombinante en un microorganismo, y puede formularse el microorganismo completo en una composición inmunogénica.

Cuando las regiones codificantes del operón csa se usan en la construcción de varios tipos de vectores, las secuencias de csa se insertan a menudo dentro de la región codificante del vector bajo el control de un promotor. Adicionalmente, también pueden incluirse otros elementos, incluyendo elementos reguladores, que se encuentran a menudo en vectores adecuados para su uso en diversas técnicas de biología molecular.

En una realización, se proporciona un vector de expresión que comprende

(i) un operón csa, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 27 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 98% de identidad con un operón csa de ese tipo, o

(ii) un fragmento de un operón csa que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 27, en el que el fragmento se selecciona del grupo que consiste en:

(a): un fragmento que codifica para un marco de lectura abierto de longitud completa de CsaA que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2,

(b): un fragmento que codifica para un marco de lectura abierto de longitud completa de CsaB que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4,

(c): un fragmento que codifica para un marco de lectura abierto de longitud completa de CsaC que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 6,

(d): un fragmento que codifica para un marco de lectura abierto de longitud completa de CsaD que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 8,

(e): un fragmento que codifica para un marco de lectura abierto de longitud completa de CsaE que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 10,

(f): un fragmento que codifica para un polipéptido de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaC,

(g): un fragmento que codifica para un polipéptido de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaD,

(h): un fragmento que codifica para un polipéptido de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaE; y

(i): una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 98% de identidad con cualquiera de (a) a (h).

Preferiblemente se inserta una o más moléculas de ADN tal como se describieron anteriormente dentro de un vector de expresión adecuado, que a su vez se usa para transfectar o transformar una célula huésped adecuada. Vectores de expresión a modo de ejemplo incluyen un promotor que puede dirigir la transcripción de una molécula de polinucleótido de interés en una célula huésped. Vectores de expresión representativos incluyen secuencias de vectores plásmidos y/o virales. Vectores adecuados incluyen vectores retrovirales, vectores virales de vacunas, vectores virales de CMV, vectores BLUESCRIPT (Stratagene, San Diego, CA), vectores de baculovirus, y similares. En otra realización, los promotores que pueden dirigir la transcripción de un ADNc o gen clonado pueden ser promotores inducibles o constitutivos e incluyen promotores virales y celulares.

En algunas realizaciones, puede preferirse usar un marcador seleccionable para identificar células que contienen el ADN clonado. Los marcadores seleccionables generalmente se introducen en las células junto con las moléculas de ADN clonado e incluyen genes que confieren resistencia frente a fármacos, tales como ampicilina, neomicina, higromicina, y metotrexato. Los marcadores seleccionables también pueden complementar auxotrofias en la célula huésped. Otros marcadores seleccionables proporcionan señales detectables, tales como beta-galactosidasa para identificar células que contienen las moléculas de ADN clonado.

Antisentido

Pueden usarse secuencias de nucleótidos de csa antisentido para bloquear la expresión de csa. Los oligonucleótidos antisentido adecuados tienen al menos 11 nucleótidos de longitud y pueden incluir secuencias codificantes asociadas y no traducidas (en sentido 5'). Tal como resultará evidente para el experto en la técnica, la longitud óptima de un oligonucleótido antisentido depende de la fuerza y la interacción entre el oligonucleótido antisentido y el ARNm complementario, la temperatura y el entorno iónico en el que tiene lugar la traducción, la secuencia de base del oligonucleótido antisentido, y la presencia de estructura secundaria y terciaria en el ARNm y/o en el oligonucleótido antisentido. Secuencias diana adecuadas para los oligonucleótidos antisentido incluyen regiones promotoras, sitios de unión a ribosoma, y sitios que interfieren con la progresión del ribosoma.

Pueden prepararse oligonucleótidos antisentido, por ejemplo, mediante la inserción de una molécula de ADN que contiene la secuencia de ADN diana dentro de un vector de expresión adecuado tal como la molécula de ADN insertada en sentido 3' de un promotor en una orientación inversa comparado con el propio gen csa particular. Entonces puede transducirse, transformarse o transfectarse el vector de expresión dentro de una célula adecuada dando como resultado la expresión de oligonucleótidos antisentido. Alternativamente, pueden sintetizarse oligonucleótidos antisentido usando técnicas de síntesis automatizada o manual habituales. Los oligonucleótidos sintetizados se introducen dentro de células adecuadas mediante una variedad de medios incluyendo electroporación, precipitación por fosfato de calcio, o microinyección. La selección de un método adecuado de administración de oligonucleótido antisentido resultará evidente para un experto en la técnica.

Con respecto a los oligonucleótidos sintetizados, la estabilidad de híbridos de oligonucleótido antisentido-ARNm se aumenta ventajosamente mediante la adición de agentes estabilizantes al oligonucleótido. Agentes estabilizantes incluyen agentes intercalantes que se unen covalentemente a uno o ambos extremos del oligonucleótido. En realizaciones preferidas, se hace que los oligonucleótidos sean resistentes a nucleasas, por ejemplo, mediante modificaciones en el esqueleto de fosfodiéster mediante la introducción de fosfotriésteres, fosfonatos, fosforotioatos, fosforoselenoatos, fosforamidatos, fosforoditioatos, o anillos de morfolino.

Aminoácidos

Se describe la identificación del operón csa y las proteínas codificadas por el mismo. Los polipéptidos representativos producidos a partir de los genes del operón csa incluyen secuencias que comprenden CsaA (SEQ. ID. NO.: 2), CsaB (SEQ. ID. NO.: 4), CsaC (SEQ. ID. NO.: 6), CsaD (SEQ. ID. NO.: 8), y CsaE (SEQ. ID. NO.: 10). Variantes de las proteínas codificadas por el operón csa incluyen aquellas secuencias de aminoácidos que resultan de polimorfismos genéticos menores, diferencias entre cepas, y aquellas que contienen sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos.

Las proteínas codificadas por el operón csa, tal como se describe en el presente documento, abarcan todas las proteínas codificadas por el operón, así como fragmentos de proteínas de csa que son funcionalmente activos. La presente descripción también abarca proteínas codificadas por el operón csa purificadas a partir de materiales que se producen en la naturaleza y estrechamente relacionadas, proteínas funcionalmente similares recuperadas mediante antisuero específico frente a proteínas de csa, y proteínas expresadas de manera recombinante codificadas por materiales genéticos (ADN, ARN, ADNc) recuperadas basándose en su similitud con regiones en las secuencias del operón csa.

Según la presente descripción, las moléculas de polinucleótidos que codifican para proteínas codificadas por el operón csa abarcan aquellas moléculas que codifican para proteínas de csa o péptidos que comparten identidad con las secuencias mostradas en SEQ. ID. NO.: 2, 4, 6, 8, y 10. Tales moléculas comparten preferiblemente más del 30% de identidad a nivel de aminoácidos con las secuencias descritas en csa. En realizaciones preferidas, las moléculas de polinucleótidos pueden compartir una mayor identidad a nivel de aminoácidos a través de regiones sumamente conservadas.

Se describen adicionalmente secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales a las secuencias expuestas en SEQ ID No 2, 4, 6, 8 y 10, tales como polipéptidos que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que las secuencias de aminoácido expuestas en SEQ ID No 2, 4, 6, 8 y 10, o fragmentos funcionales de los mismos, o secuencias de aminoácidos que son sustancialmente idénticas a SEQ ID No 2, 4, 6, 8 y 10. Por "sustancialmente la misma" o "sustancialmente idéntica" se refiere a un polipéptido que muestra al menos el 80%, 85%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de homología con una secuencia de aminoácidos de referencia. Los polipéptidos según la invención se describen en las reivindicaciones. Para los polipéptidos, la longitud de secuencias de comparación será generalmente de al menos 16 aminoácidos, preferiblemente de al menos 20 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 25 aminoácidos, y lo más preferiblemente de 35 aminoácidos.

La homología se mide a menudo usando un software de análisis de secuencia (por ejemplo, el paquete de software Sequence Analysis del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl53705 o el programa NCBI BLAST). El software de este tipo hace corresponder secuencias similares asignando grados de homología a diversas sustituciones, deleciones, sustituciones y otras modificaciones.

El término "fragmentos funcionales" incluye aquellos fragmentos de SEQ ID Nos 2, 4, 6, 8 y 10, u otras proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos similar a la de las proteínas codificadas por el operón csa, que conservan la función o actividad de diversas proteínas de csa. Un experto en la técnica puede seleccionar la funcionalidad de un fragmento usando los ejemplos proporcionados en el presente documento, en los que se describen proteínas codificadas por el operón csa de longitud completa. También se prevé que fragmentos de diversas proteínas codificadas por el operón csa puedan identificarse de manera similar.

Mediante "sustancialmente idéntica" también se refiere a una secuencia de aminoácidos que difiere sólo en sustituciones conservativas de aminoácidos, por ejemplo, sustitución de un aminoácido por otro de la misma clase (por ejemplo, valina por glicina ,arginina por lisina, etc.) o por una o más sustituciones, deleciones o inserciones no conservativas localizadas en posiciones de la secuencia de aminoácidos que no destruyen la función de la proteína sometida a ensayo, (por ejemplo, tal como se describe en el presente documento). Preferiblemente, una secuencia de este tipo es homóloga en al menos el 85%, y más preferiblemente desde el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% hasta el 100% a nivel de aminoácidos con las SEQ ID No 2, 4, 6, 8 ó 10.

Por un "polipéptido sustancialmente puro" se refiere a una proteína codificada por el operón csa que se ha separado de los componentes que la acompañan de manera natural. Normalmente, el polipéptido es sustancialmente puro cuando está libre en al menos el 60% en peso de las proteínas y otras moléculas que se producen de manera natural con las que se asocia normalmente. Preferiblemente, la preparación tiene al menos el 75%, 80%, 90%, 95%, y lo más preferiblemente al menos el 99% en peso de proteína codificada por el operón csa. Un polipéptido codificado por el operón csa sustancialmente puro puede obtenerse, por ejemplo, mediante extracción a partir de una fuente natural; mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido codificado por el operón csa; o mediante síntesis química de la proteína. La pureza puede medirse mediante cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis sobre gel de poliacrilamida, o mediante análisis de HPLC.

Una proteína está sustancialmente libre de componentes asociados de manera natural cuando se separa de esos contaminantes que la acompañan en su estado natural. Por tanto, una proteína que se sintetiza químicamente o se produce en un sistema celular diferente del que la origina de manera natural estará sustancialmente libre de sus componentes asociados de manera natural. En consecuencia, los polipéptidos sustancialmente puros incluyen los derivados de microorganismos eucariotas pero sintetizados en E. coli u otros microorganismos procariotas.

Tal como resultará evidente para un experto en la técnica, las moléculas de polinucleótidos de la presente descripción pueden expresarse en una variedad de células procariotas y eucariotas usando secuencias reguladoras, vectores, y métodos bien establecidos en la bibliografía.

Las proteínas codificadas por el operón csa producidas según la presente descripción pueden purificarse usando varios métodos establecidos tales como cromatografía de afinidad usando anticuerpos anti-proteína Csa acoplados a un soporte sólido. Las proteínas de fusión de una etiqueta antigénica y una proteína codificada por el operón csa pueden purificarse usando anticuerpos frente a la etiqueta. Opcionalmente, se logra una purificación adicional usando medios de purificación convencionales tales como cromatografía de líquidos, centrifugación en gradiente, y electroforesis en gel, entre otros. Los métodos de purificación de proteína se conocen en la técnica y pueden aplicarse a la purificación de proteínas recombinantes codificadas por el operón csa descritas en el presente documento. La purificación de productos del operón csa se trata de manera más completa a continuación.

También se contempla la construcción de proteínas de fusión codificadas por el operón csa. Las proteínas de fusión contendrán normalmente adiciones, sustituciones o reemplazos de uno o más aminoácidos contiguos de la proteína nativa codificada por el operón csa con aminoácido(s) de una proteína compañera de fusión adecuada. Tales proteínas de fusión se obtienen usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas por un experto en la técnica. Brevemente, las moléculas de ADN que codifican para las proteínas híbridas codificadas por el operón csa de interés se preparan usando métodos generalmente disponibles tales como mutagénesis por PCR, mutagénesis dirigida al sitio, y/o ligación y digestión de restricción. Entonces se inserta el ADN híbrido dentro de vectores de expresión y se introduce en células huésped adecuadas.

Una realización de la presente invención implica el aislamiento de proteínas que interaccionan con proteínas codificadas por el operón csa o son receptores para pili CS4. Las proteínas codificadas por el operón csa pueden utilizarse en la inmunoprecipitación para aislar factores de interacción o utilizarse para la selección de interactores usando diferentes métodos de selección de dos híbridos. Los interactores aislados de proteínas codificadas por el operón csa pueden usarse para modificar o bloquear la unión mediada por CS4 a una célula huésped.

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Se proporcionan péptidos sintéticos, péptidos derivados de manera recombinante, proteínas de fusión, proteínas quirales (isómeros estereoquímicos, racematos, enantiómeros e isómeros D) y similares que incluyen una parte de una proteína codificada por el operón csa o la proteína entera. Los péptidos sujeto tienen una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un oligonucleótido de 15 o más nucleótidos contiguos de SEQ. ID. NO: 1, 3, 5, 7, y 9. Secuencias de aminoácidos representativas de los péptidos sujeto se describen en SEQ. ID. NO: 2, 4, 6, 8, y 10. Los péptidos sujeto encuentran una variedad de usos, incluyendo la preparación de anticuerpos específicos y la preparación de antagonistas de unión de CS4.

Anticuerpos

Tal como se observó anteriormente, las enseñanzas descritas proporcionan anticuerpos que se unen a proteínas codificadas por el operón csa. La producción de anticuerpos monoclonales o antisueros no humanos (por ejemplo, murinos, lagomorfos, porcinos, equinos) se conoce bien y se consigue, por ejemplo, inmunizando un animal con una proteína o péptidos codificados por el operón csa. Para la producción de anticuerpos monoclonales, se obtienen células que producen anticuerpos a partir de animales inmunizados, inmortalizados y seleccionados, o seleccionados en primer lugar para la producción del anticuerpo que se une a una proteína o péptidos particulares codificados por el operón csa y luego inmortalizados. Puede desearse transferir las regiones de unión a antígeno (por ejemplo, regiones F(ab')2 o hipervariables) de anticuerpos no humanos dentro de la estructura de un anticuerpo humano mediante técnicas de ADN recombinante para producir una molécula sustancialmente humana.

Tras la síntesis o expresión y aislamiento o purificación de una proteína codificada por el operón csa o una parte de la misma, la proteína aislada o purificada puede usarse para generar anticuerpos y herramientas para identificar agentes que interaccionan con la proteína codificada por el operón csa y fragmentos de interés. Dependiendo del contexto, el término "anticuerpos" puede abarcar policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena sencilla, fragmentos Fab y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab. Los anticuerpos que reconocen proteínas codificadas por el operón csa y fragmentos de las mismas pueden tener muchos usos incluyendo, pero sin limitarse a, aplicaciones biotecnológicas, aplicaciones terapéuticas/profilácticas, y aplicaciones de diagnóstico.

Para la producción de anticuerpos, pueden inmunizarse diversos huéspedes incluyendo cabras, conejos, ratas, ratones, etc., mediante inyección con proteínas codificadas por el operón csa o cualquier parte, fragmento u oligopéptido que conserva propiedades inmunogénicas. Dependiendo de la especie huésped, pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, toxina termolábil destoxificada de E. coli, adyuvante de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol. BCG (Bacillus Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum también son adyuvantes potencialmente útiles.

Los péptidos usados para inducir anticuerpos específicos pueden tener una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos tres aminoácidos, y preferiblemente en al menos de 10 a 15 aminoácidos. Preferiblemente, se fusionan extensiones cortas de aminoácidos que codifican para fragmentos de proteínas codificadas por el operón csa con aquellas de otras proteínas tales como hemocianina de lapa californiana de manera que se produce un anticuerpo frente a la molécula quimérica. Aunque pueden generarse anticuerpos que pueden reconocer específicamente proteínas codificadas por el operón csa inyectando a ratones péptidos sintéticos de 3 meros, 10 meros, y 15 meros que corresponden a una secuencia de proteína de la proteína o proteínas codificadas por el operón csa de interés, puede generarse un conjunto más diverso de anticuerpos usando proteínas recombinantes codificadas por el operón csa, proteínas purificadas codificadas por el operón csa, o fragmentos de proteínas codificadas por el operón
csa.

Para generar anticuerpos frente a proteínas codificadas por el operón csa y fragmentos de las mismas, se aísla una proteína sustancialmente pura codificada por el operón csa o un fragmento de la misma a partir de una célula transfectada o transformada o del microorganismo ETEC de tipo natural. La concentración del polipéptido en la preparación final se ajusta, por ejemplo, mediante concentración sobre un dispositivo de filtración Amicon, hasta el nivel de algunos microgramos/ml. Entonces puede prepararse el anticuerpo monoclonal o policlonal frente al polipéptido de interés tal como sigue:

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales frente a proteínas codificadas por el operón csa o un fragmento de las mismas usando cualquier técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Éstos incluyen, pero no se limitan a, la técnica del hibridoma descrita originalmente por Koehler y Milstein (Nature 256:495-497 (1975), la técnica del hibridoma de célula B humana (Kosbor et al. Immunol Today 4:72 (1983); Cote et al Proc Natl. Acad. Sci 80:2026-2030 (1983), y la técnica del hibridoma de EBV de Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc, New York N.Y., págs 77-96 (1985). Además, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el corte y empalme de genes de anticuerpo de ratón con genes de anticuerpo humano para obtener una molécula con actividad biológica y especificidad de antígeno apropiadas. (Morrison et al. Proc Natl. Acad. Sci 81:6851-6855 (1984); Neuberger et al. Nature 312:604-608(1984); Takeda et al. Nature 314:452-454(1985). Alternativamente, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente de los EE.UU. número 4.946.778) para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos para proteínas codificadas por el operón csa. También pueden producirse anticuerpos induciendo la producción in vivo en la población de linfocitos o examinando bibliotecas de inmunoglobulinas recombinantes o paneles de reactivos de unión sumamente específicos tal como se describe en Orlandi et al., Proc Natl. Acad. Sci 86: 3833-3837 (1989), y Winter G. y Milstein C; Nature 349:293-299 (1991).

También pueden generarse fragmentos de anticuerpos que contienen sitios de unión específicos para proteínas codificadas por el operón csa. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos F(ab')2 que pueden producirse mediante digestión de pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los puentes de disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Alternativamente, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab para permitir una identificación rápida y sencilla de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada. (Huse W. D. et al. Science 256:1275-1281 (1989)).

Mediante un enfoque, se preparan anticuerpos monoclonales frente a proteínas codificadas por el operón csa o fragmentos de las mismas tal como sigue. Brevemente, se inocula repetidamente un ratón con algunos microgramos de la proteína seleccionada o péptidos derivados de la misma, a lo largo de un periodo de algunas semanas. Entonces se sacrifica el ratón, y se aíslan las células del bazo que producen el anticuerpo. Se fusionan las células del bazo en presencia de polietilenglicol con células de mieloma de ratón, y se destruyen las células no fusionadas en exceso haciendo crecer el sistema sobre medio selectivo que comprende aminopterina (medio HAT). Se diluyen las células fusionadas satisfactoriamente y se colocan alícuotas de la dilución en pocillos de una placa de microtitulación en la que se continúa el crecimiento del cultivo. Se identifican los clones que producen anticuerpos mediante detección de anticuerpos en el fluido sobrenadante de los pocillos mediante procedimientos de inmunoensayo, tales como ELISA, tal como se describió originalmente por Engvall, E., Meth. Enzymol. 70:419 (1980), y métodos derivados del mismo. Pueden expandirse los clones positivos seleccionados y recogerse su producto de anticuerpo monoclonal para su uso. Los procedimientos detallados para la producción de anticuerpo monoclonal se describen en Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, Nueva York. Sección 21-2.

Puede prepararse antisuero policlonal que contiene anticuerpos epítopos heterógenos de una única proteína inmunizando animales adecuados con la proteína expresada o péptidos derivados de la misma descritos anteriormente, que pueden no estar modificadas o modificadas para potenciar la inmunogenicidad. La producción eficaz de anticuerpos policlonales se ve afectada por muchos factores relacionados tanto con el antígeno como con la especie huésped. Por ejemplo, las moléculas pequeñas tienden a ser menos inmunogénicas que otras y pueden requerir el uso de excipientes y adyuvantes. Además, los animales huésped varían en respuesta al sitio de las inoculaciones y dosis, con dosis tanto inadecuadas como excesivas de antígeno dando como resultado títulos bajos de antisuero. Las dosis pequeñas (nivel de ng) de antígeno administradas en múltiples sitios intradérmicos parece ser la más fiable. Un protocolo de inmunización eficaz para conejos puede encontrarse en Vaitukaitis, J. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991 (1971).

Pueden administrarse inyecciones de refuerzo a intervalos regulares, y recogerse el antisuero cuando comienza a disminuir el título de anticuerpos del mismo, según se determinan semicuantitativamente mediante, por ejemplo, inmunodifusión doble en agar frente a concentraciones conocidas de antígeno. Véase, por ejemplo, Ouchterlony, 0. et al., Chap. 19 en: Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed) Blackwell (1973). La concentración de anticuerpos de meseta está normalmente en el intervalo de 0,1 a 0,2 mg/ml de suero (aproximadamente 12 M). La afinidad del antisuero por el antígeno se determina preparando curvas de unión competitiva, tal como se describe, por ejemplo, por Fisher, D., Cap. 42 en: Manual of Clinical Immunology, 2ª Ed. (Rose and Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C. (1980). Las preparaciones de anticuerpos preparadas según cualquiera de los protocolos son útiles en inmunoensayos cuantitativos que determinan las concentraciones de sustancias que llevan antígeno en muestras biológicas; también se usan de manera semicuantitativa o cualitativa (por ejemplo, en realizaciones de diagnóstico que identifican la presencia de una proteína codificada por el operón csa en muestras biológicas). También se contempla que diversos métodos de modelación molecular y diseño racional de fármacos pueden aplicarse para identificar compuestos que se parecen a una proteína codificada por el operón csa, fragmento, o derivado de la misma, y moléculas que interaccionan con proteínas codificadas por el operón csa y, mediante ello modular su función.

Vectores de expresión

Pueden construirse vectores de expresión de genes recombinantes que comprenden el operón csa, o partes del mismo, de una variedad de formas bien conocidas en la técnica. Vectores de expresión preferidos incluyen plásmidos y cósmidos. Los vectores de expresión incluyen uno o más fragmentos del operón csa. Normalmente, un vector de expresión comprenderá uno o más genes del operón csa. En una realización, un vector de expresión comprenderá y codificará funcionalmente para las regiones codificantes csaA, csaB, csaC, csaE, y csaD. Realizaciones alternativas de los vectores de expresión descritos pueden tener diversas combinaciones de las regiones codificantes del operón csa. Por ejemplo, una expresión puede comprender las regiones codificantes csaB, la csaE, o una combinación de ambas.

Tal como se usa en el presente documento, la frase "codifica funcionalmente" se refiere a una o más regiones codificantes de proteína asociadas con las secuencias reguladoras requeridas para la expresión del polipéptido codificado por la región codificante. Ejemplos de tales regiones reguladoras incluyen sitios de unión al promotor, elementos potenciadores, sitios de unión a ribosomas, y similares. Los expertos en la técnica podrán seleccionar secuencias reguladoras e incorporarlas dentro de vectores de expresión recombinantes descritos en el presente documento sin excesiva experimentación. Por ejemplo, secuencias reguladoras adecuadas para su uso en diversos sistemas eucariotas y procariotas se describen en Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3ª ed., John Wiley & Sons, Inc, Nueva York, 1997.

Los vectores de expresión para su uso con el operón csa contendrán normalmente secuencias reguladoras derivadas de una especie compatible para la expresión en la célula huésped deseada. Por ejemplo, cuando E. coli es la célula huésped, la población de células huésped puede transformarse normalmente usando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli. (Bolivar, et al., Gene, 2:95, 1977). pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina (AMPR) y la tetraciclina y por tanto proporciona medios sencillos para identificar células transformadas.

Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen a modo ilustrativo los sistemas de promotores de beta-lactamasa y lactosa (Chang, et al., Nature, 275:615, 1978; y Goeddel, et al., Nature, 281:544, 1979), fosfatasa alcalina, sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel, Nucleic Acid Res., 8:4057, 1980) y promotores híbridos tales como el promotor tag (de Boer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25, 1983). Otros promotores bacterianos funcionales también son adecuados. Sus secuencias de nucleótidos se conocen generalmente en la técnica, permitiendo así al experto ligarlas con un polinucleótido que codifica para el péptido de interés (Siebenlist, et al., Cell, 20:269, 1980) usando ligadores y adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido.

Además de los procariotas, también pueden usarse microbios eucariotas tales como cultivos de levadura como fuente para las secuencias reguladoras. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariota comúnmente usado. Las secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levaduras incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman, et al., J.Biol. Chem., 255:2073, 1980) u otras enzimas glucolíticas (Hess, et al. J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland, Biochemistry, 17:4900, 1978) tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato desidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucocinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada mediante condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradadas asociadas con metabolismo del nitrógeno, metalotionina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables del uso de la maltosa y la galactosa. Los potenciadotes de levaduras también se usan ventajosamente con promotores de levaduras.

En otra realización, se usa un virus recombinante como vector de expresión. Virus a modo de ejemplo incluyen los adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, vaccinia, o un virus de ARN tal como un retrovirus o un alfavirus. Preferiblemente, el vector retroviral es un derivado de un retrovirus murino o aviar. Preferiblemente el vector de alfavirus se deriva del virus Sindbis o del bosque Semliki. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de manera que las células transducidas pueden identificarse y generarse.

Insertando una o más secuencias de interés dentro del vector viral, junto con otro gen que codifica para el ligando para un receptor sobre una célula diana específica, por ejemplo, el vector es ahora específico para la diana. Los vectores retrovirales pueden hacerse específicos para la diana insertando, por ejemplo, un polinucleótido que codifica para un azúcar, un glucolípido, o una proteína. La selección como diana preferida se logra usando un anticuerpo para seleccionar como diana el vector retroviral, tal como la proximidad de un sitio inductor mucoso, usando un anticuerpo específico de MALT. Los expertos en la técnica conocerán, o podrán determinar fácilmente sin excesiva experimentación, secuencias de polinucleótidos específicas que pueden insertarse dentro del genoma retroviral para permitir la administración específica de la diana del vector retroviral que contiene los polinucleótidos de interés.

Se apreciará que las mismas técnicas que se utilizan para incorporar las secuencias de nucleótidos del operón csa y opcionalmente otros polinucleótidos inmunoestimulantes dentro de los vectores de expresión de genes virales pueden usarse para incorporar las secuencias dentro de virus vivos y vivos atenuados para su uso como composiciones inmunogénicas.

La selección como diana de tejidos mucosos puede realizarse aprovechándose de propiedades biológicas inherentes del lecho linfoide que debe seleccionarse como diana. Estas incluyen la arquitectura de cripta de los pilares tonsilares que puede usarse para atrapar partículas, y también incluyen las células M de las placas de Peyer en el intestino, células M que endocitosan específicamente una amplia variedad de partículas incluyendo partículas de lípidos y otras partículas pequeñas. Por tanto, los expertos en la técnica pueden preparar una amplia variedad de preparaciones de partículas moleculares que, si se suministran al intestino, se alojarán dentro de las partes de cripta de las placas de Peyer del intestino y pueden endocitarse por las células M. Si tales partículas proporcionan la administración de un polinucleótido biológicamente activo a las células M, entonces tales partículas permitirán la estimulación o modulación de la inducción de respuesta inmunitaria mucosa por el tejido linfoide de las placas de Peyer hacia el que se dirigen las células M.

La construcción de vectores adecuados que contienen secuencias codificantes, no codificantes y de control deseadas emplea técnicas de ligación habituales. Los fragmentos de ADN o plásmidos aislados se escinden, se adaptan a medida y vuelven a ligarse en la forma deseada para construir los plásmidos requeridos.

Por ejemplo, para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, pueden usarse las mezclas de ligación para transformar una célula huésped y seleccionarse los transformantes satisfactorios mediante resistencia a antibióticos cuando sea apropiado. Se preparan plásmidos a partir de los transformantes, se analizan mediante restricción y/o se secuencian mediante, por ejemplo, el método de Messing, et al., (Nucleic Acids Res., 9:309,1981), el método de Maxam, et al., (Methods in Enzymology, 65:499, 1980), u otros métodos adecuados que conocerán los expertos en la técnica. La separación por tamaños de los fragmentos escindidos se realiza usando electroforesis en gel convencional tal como se describe, por ejemplo, por Maniatis, et al., (Molecular Cloning, págs. 133-134, 1982).

Las células huésped pueden transformarse con los vectores de expresión descritos en el presente documento y cultivarse en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y resultarán evidentes para el experto en la técnica.

Purificación

A continuación se describe la purificación de uno o más de los productos del operón csa. Las etapas implicadas en la purificación de los productos del operón csa incluyen (1) solubilización de la proteína deseada, (2) desarrollo de uno o más procedimientos de aislamiento y concentración, (3) estabilización de la proteína tras la purificación, y (4) desarrollo de un ensayo adecuado para determinar la presencia de la proteína deseada. Diversos aspectos del aislamiento y purificación de proteínas se tratan en detalle en Cooper, T. G., "The Tools of Biochemistry," John Wiley & Sons, Nueva York, 1977. Ya que las técnicas para el aislamiento y la purificación de proteínas se conocen especialmente bien en la técnica, esta descripción evitará tratarlas en detalle. No obstante, se resumen y tratan a continuación elementos de la referencia mencionada.

Se requiere la solubilización de la mayoría de las proteínas para purificarse, ya que la mayoría de los procedimientos de aislamiento comúnmente usados funcionan en disoluciones acuosas. En algunos casos, puede lograrse la solubilización simplemente lisando una célula huésped dentro de la cual se ha expresado una proteína deseada. En otras situaciones, pueden requerirse etapas adicionales tales como extraer la proteína deseada de un orgánulo subcelular. La lisis osmótica, el molido, el uso de mezcladoras, ondas de ultrasonidos, prensas y otras técnicas bien conocidas de solubilización de proteínas se contemplan para su uso con los métodos descritos en el presente documento.

Referente al aislamiento y concentración de productos del operón csa, hay una variedad de técnicas disponibles que se conocen bien en la técnica. Esas técnicas incluyen (1) solubilidad diferencial, (2) cromatografía de intercambio iónico, (3) cromatografía de absorción, (4) técnicas de tamizado molecular, (5) cromatografía de afinidad, (6) electroforesis, y (7) electrofocalización. Cada una de estas técnicas puede ser útil en la purificación de uno o más productos del operón csa. Una metodología de purificación inmunogénica de los pili CS4 se describe en Wolf, et al., "Characterization of CS4 and CS6 antigenic components of PCF8775, a putative colonization factor complex from enterotoxigenic Escherichia coli E8775," Infect Immun. 57(1):164-73 (1989). Para purificar fimbrias CS4 intactas, se usan los métodos descritos en Hall, et al., J. Bacteriol. 171:6372 (1989).

Estabilizar y mantener un producto purificado del operón csa en un estado funcional justifica la atención de varias condiciones diferentes. Estas condiciones incluyen (1) pH, (2) grado de oxidación, (3) concentración de metales pesados, (4) polaridad del medio, (5) concentración de proteasa, y (6) temperatura. Un experto en la técnica sabrá fácilmente cuál de estas técnicas usar para mantener productos purificados del operón csa en una forma activa sin excesiva experimentación.

Desarrollar uno o más ensayos con los que determinar la presencia y funcionalidad del producto purificado del operón csa dependerá de las propias proteínas individuales. Quizás el ensayo más útil para desarrollar, implica la generación de uno o más anticuerpos con los que identificar los diversos productos del operón csa. La generación de anticuerpos se trata en el presente documento. Debido a que se conocen las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de cada una de las secuencias de genes codificadas por el operón csa, resultaría trivial para un experto en la técnica generar anticuerpos adecuados para la detección de proteínas Csa, usando técnicas que se conocen especialmente
bien.

Composiciones

Las proteínas codificadas por el operón csa pueden usarse para formular composiciones inmunogénicas que facilitan una respuesta inmunitaria. Ejemplos de una respuesta inmunitaria típica incluyen una respuesta inmunitaria mucosa y una respuesta inmunitaria sistémica. Se contempla una variedad de realizaciones que utilizan las proteínas del operón csa.

Microorganismos recombinantes

En una realización, se introduce una secuencia de nucleótidos que comprende el operón csa o un fragmento funcional de la misma dentro de un microorganismo exógeno tal como se describe en las reivindicaciones usando técnicas de biología molecular habituales bien conocidas por los expertos en la técnica. Técnicas a modo de ejemplo se tratan en Ausubel, et al., "Short Protocols in Molecular Biology". Entonces puede usarse el microorganismo recombinante resultante como inmunógeno frente el cual puede generarse una respuesta inmunitaria. En una realización preferida, un microorganismo patógeno atenuado sirve como microorganismo exógeno. Se contempla que puede usarse un microorganismo recombinante entero o un fragmento funcional del mismo, tal como una fracción de membrana aislada, liposoma, o similar, para generar una composición inmunogénica.

Por ejemplo, una aplicación de los descubrimientos descritos en el presente documento se refiere al desarrollo de una vacuna híbrida multivalente para prevenir tanto disentería por Shigella como diarrea por ETEC, (Altboum, Z., et al., Attenuated Shigella flexneri 2a \DeltaguaBA strain CVD 1204 expressing ETEC CS2 and CS3 fimbriae as a live mucosal vaccine against Shigella and enterotoxigenic Escherichia coli infection, In press; Koprowski, et al., Infect. Immun., 68:4884-92 (2000); Kotloff, et al., Vaccine, 13:495-502 (1995); Levine, et al., "Fimbrial vaccines," In P. Klemm (ed.), Fimbriae: adhesion, biogenics, genetics and vaccines. Boca Raton: CRC Press, 1994; Noriega, et al., Infect. Immun., 64:23-27 (1996)). La patente de los EE.UU. número 6.190.669, concedida a Noriega, et al., titulada "Attenuated mutants of Salmonella which constitutively express the Vi antigen", contiene enseñanzas adicionales referentes a la generación de tales microorganismos quiméricos adecuados para su uso en la preparación de una composición inmunogénica que contiene los pili CS4.

Los genes que codifican para fimbrias CS4 de ETEC del operón csa pueden aislarse y usarse para construir una composición inmunogénica eficaz multivalente de Shigella-ETEC que protegerá de la diarrea provocada tanto por Shigella como por cepas de ETEC que expresan CS4. Por ejemplo, puede crearse una composición inmunogénica que puede generar una respuesta inmunitaria frente a LTh, la variante LT encontrada en cepas de ETEC humanas. Se han notificado las propiedades inmunogénicas de genes que codifican para CFA/1, CS2, CS3 y LThK63 clonados en la cepa CVD 1204 de S. flexneri 2a. Este trabajo se ha expandido incluyendo la expresión de los pili CS4 como fimbrias intactas en cepas tanto de E. coli como de Shigella.

Se contemplan otras composiciones inmunogénicas multivalentes eficaces frente a bacterias entéricas. Por ejemplo, una composición inmunogénica multivalente frente a Salmonella spp.; Clostridium spp., tales como Clostridium botulinum; Staphylococcus spp, tales como S. aureus; Campylobacter spp., tales como C. jejuni, Yersinia spp., tales como Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis; Listeria spp., tales como L monocytogenes; diversas Vibrio spp., incluyendo V. cholerae 01, V. cholerae no 01, V. parahaemolyticus, V. vulnificus; Clostridium spp., tales como C. perfringens; Bacillus spp., tales como B. cereus; Aeromonas spp., tales como A. hydrophila; Plesiomonas spp., tales como P. shigelloides; Shigella spp.; Streptococcus spp.; varias entéricas diversas tales como Klebsiella spp.; Enterobacter spp.; Proteus spp.; Citrobacter spp.; Aerobacter spp.; Providencia spp.; Serratia spp.; y miembros del grupo de Escherichia coli enterovirulenta (grupo EEC) que comprende Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC), Escherichia coli enteropatógena (EPEC), Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) tales como Escherichia coli 0157:H7, y Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC).

Vacunas de subunidades

Otra realización descrita en el presente documento se refiere a la generación de composiciones inmunogénicas que comprenden distintas proteínas inmunogénicas o fragmentos de las mismas, o fragmentos funcionales de microorganismos de interés. Tales composiciones inmunogénicas se denominan en el presente documento como composición inmunogénica de subunidades porque al menos uno de los componentes de la composición es una subunidad de un microorganismo, en vez de un microorganismo entero. Normalmente, una composición inmunogénica de subunidades descrita en el presente documento comprende uno o más componentes inmunogénicos. Las composiciones inmunogénicas reivindicadas comprenden más de un polipéptido recombinante purificado.

La composición inmunogénica de subunidades puede comprender un componente de excipiente y un componente inmunogénico. Normalmente, el componente de excipiente funcionará como resto de unión que utiliza el microorganismo que lo origina para unirse al, y ganar una entrada dentro del, microorganismo huésped. Un ejemplo de un componente de excipiente de este tipo es el antígeno CS4, que se codifica por el operón csa. El antígeno CS4 permite a cepas de ETEC que expresan este complejo de proteínas unirse a la mucosa de un huésped humano. En una realización preferida las proteínas CsaB y/o CsaE pueden funcionar como componentes de excipientes.

Aunque no se desea limitarse a ninguna teoría, se plantea la hipótesis de que la composición inmunogénica de subunidades descrita en el presente documento funciona exponiendo el componente inmunogénico de la composición inmunogénica de subunidades a la mucosa, y diversos componentes de sistema inmunitario presentes en la misma. En una teoría, la generación de una respuesta inmunitaria deseada por las composiciones inmunogénicas de subunidades descritas en el presente documento se produce aumentando la exposición de las composiciones inmunogénicas al tejido diana. Se plantea la teoría de que la presencia tanto de un componente de excipiente como de un componente inmunogénico logra este objetivo.

Cualquier proteína, péptido, o secuencia de aminoácidos que provoca una respuesta inmunitaria puede usarse como componente inmunogénico en las composiciones inmunogénicas de subunidades descritas en el presente
documento.

Los componentes de excipiente de las composiciones inmunogénicas de subunidades descritas también pueden presentar en sí mismos características inmunogénicas. Normalmente, se usan adyuvantes en composiciones inmunogénicas para potenciar la respuesta inmunitaria dirigida frente al componente inmunogénico de las composiciones inmunogénicas descritas. Pueden usarse componentes de excipiente que presentan tanto características de unión a la mucosa como características inmunogénicas. Por ejemplo, en una realización, las proteínas CsaB y/o CsaE pueden funcionar tanto como componente de excipiente como componente inmunogénico.

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Para los componentes de excipiente descritos anteriormente, puede usarse toda la molécula como componente de excipiente, puede usarse un fragmento funcionalmente activo de la molécula. También pueden usarse las formas mutagenizadas de estas moléculas como componentes de excipiente.

En una realización, se aíslan y purifican una o más proteínas Csa. La una o más proteínas Csa pueden mezclarse o acoplarse con uno o más compuestos inmunogénicos. Por ejemplo, en una realización, puede expresarse, purificarse y reticularse CsaB con una toxina, toxoide (una toxina atenuada), o algún otro compuesto inmunogénico para su uso en una composición inmunogénica de subunidades.

En otra realización, las proteínas Csa o fragmentos de las mismas, o complejos de antígeno CS4 completo expresados pueden reticularse con un componente inmunogénico. El componente inmunogénico también puede ser una proteína aislada, fragmento funcional de la misma, microorganismo completo (tal como una bacteria o un virus), o fragmento funcional del mismo, que está aislado o bien en parte o bien se usa como microorganismo patógeno completo. Las proteínas Csa pueden aislarse a partir de las propias bacterias o pueden producirse usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica.

Los fragmentos más pequeños del producto de expresión del operón csa pueden usarse para proporcionar una composición inmunogénica. Específicamente, estos fragmentos comprenderán una región inmunogénica de un producto de expresión de este tipo, normalmente de desde aproximadamente 5, 6, 8, 10 ó 12 aminoácidos hasta aproximadamente 20, 22, 24, 30 o más aminoácidos. Pueden determinarse fácilmente las regiones inmunogénicas o fragmentos adecuados usando como procedimientos de selección las técnicas expuestas en los ejemplos 1-4. Las composiciones inmunogénicas reivindicadas pueden contener fragmentos de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaD y/o CsaE. En una realización de un procedimiento de selección adecuado, se produce un gran número de fragmentos candidatos de manera más o menos aleatoria y se usan para inmunizar cobayas u otros modelos adecuados. Alternativamente, pueden truncarse polipéptidos de longitud completa que se muestra que son activos en la presente invención y seleccionarse en un procedimiento alternativo para aislar la actividad inmunogénica y protectora frente a un fragmento mínimo. Una selección de este tipo puede llevarse a cabo fácilmente sin excesiva experimentación y los fragmentos activos están dentro de lo contemplado en la presente invención.

Las proteínas Csa usadas para formar las composiciones inmunogénicas de esta realización pueden ser la proteína completa, tal como las proteínas CsaB o CsaE, un fragmento inmunogénico de una proteína Csa, una forma mutagenizada de una proteína Csa, o una proteína de fusión que comprende la proteína Csa o un fragmento de la misma y un compañero de fusión adecuado. Un compañero de fusión adecuado para una proteína de fusión Csa de este tipo o fragmento de la misma podría ser cualquier proteína, péptido o secuencia de aminoácidos que facilita la expresión y/o purificación de la proteína de fusión Csa usando técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Alternativamente, uno o más inmunógenos adicionales pueden servir como compañero de fusión en una proteína de fusión Csa.

Composiciones inmunogénicas de nucleótidos

Puede provocarse una respuesta inmunitaria usando composiciones que contienen nucleótidos. Por ejemplo, puede provocarse una respuesta inmunitaria mucosa o sistémica en un huésped administrando una preparación de polinucleótido que codifica para un antígeno, que comprende ADN o ARN, que codifica para un epítopo antigénico frente al huésped. Preferiblemente, la composición que contiene nucleótidos se administra a un sitio de inductor mucoso en el tejido mucoso del huésped.

Puede administrarse ADN desnudo directamente a la mucosa, por ejemplo, en gotas salinas, o en un vector de expresión de genes recombinante. Preferiblemente, los vectores de expresión de genes recombinantes no pueden dar replicación ni diseminación. Las composiciones inmunogénicas que contienen nucleótidos también comprenden composiciones inmunogénicas de virus vivos en las que los virus incluyen polinucleótidos inmunoestimulantes. Según un método preferido de la invención, se administra un antígeno de proteína diana mediante su expresión por un vector de expresión de genes recombinante.

La patente de los EE.UU. número 6.110.898, concedida a Malone, et al., titulada, "DNA vaccines for eliciting a mucosal immune response", proporciona enseñanzas detalladas para la generación de tales composiciones inmunogénicas.

Formulaciones y administración

Las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento pueden formularse en una variedad de formatos útiles para la administración por una variedad de vías. Las concentraciones de los componentes inmunogénicos en las formulaciones descritas serán tales que se incluya una dosis eficaz de los componentes inmunogénicos en la formulación. La determinación de tal concentración resultará fácilmente evidente para un experto en la técnica.

La administración de las composiciones inmunogénicas puede ser mediante aplicación nasal, mediante inhalación, por vía oftálmica, por vía oral, por vía rectal, por vía vaginal, o mediante cualquier otro modo que dé como resultado el contacto inmunogénico con los tejidos mucosos.

En una realización, la composición inmunogénica existe como una dispersión atomizada para su uso en la administración mediante inhalación. La dispersión atomizada de los componentes inmunogénicos contendrá normalmente excipientes para dispersiones atomizadas o en aerosol, tales como solución salina tamponada y otros compuestos bien conocidos por los expertos en la técnica. La administración de las composiciones inmunogénicas descritas mediante inhalación tiene el efecto de una rápida dispersión en una gran zona de tejidos mucosos, así como la absorción por la sangre para la circulación de los componentes inmunogénicos. Un ejemplo de un método de preparación de una dispersión atomizada se encuentra en la patente de los EE.UU. 6.187.344, titulada, "Powdered Pharmaceutical Formulations Having Improved Dispersibility."

Las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento también pueden formularse en forma de un supositorio, ya sea rectal o vaginal. Excipientes típicos para la formulación de la parte inactiva de un supositorio incluyen polietilenglicol, glicerina, manteca de cacao y otros compuestos bien conocidos por los expertos en la técnica. También se contemplan otras formulaciones de supositorio adecuadas para la administración de las composiciones inmunogénicas descritas. Se plantea la hipótesis de que la administración de las composiciones inmunogénicas descritas mediante supositorio tiene el efecto de poner en contacto una superficie mucosa con las composiciones inmunogénicas para la liberación a tejidos mucosos proximales. Los tejidos mucosos distales también reciben las composiciones inmunogénicas mediante difusión.

Adicionalmente, se contemplan que las composiciones inmunogénicas existan en forma líquida. El líquido puede ser para la dosificación oral, para la dosificación oftálmica o nasal como gotas, o para su uso como un enema o irrigación vaginal. Cuando las composiciones inmunogénicas se formulan como líquido, el líquido puede ser o bien una disolución o bien una suspensión de las composiciones inmunogénicas.

Puede usarse un sistema de dispersión coloidal para la administración dirigida de composiciones inmunogénicas que contienen ácidos nucleicos. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, perlas, y sistemas a base de lípidos incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas, y liposomas. Un sistema coloidal preferido es una preparación lipídica que incluye liposomas unilamelares y multilamelares.

Los liposomas son vesículas de membrana artificiales que son útiles como vehículos de administración in vitro e in vivo. Se ha mostrado que las vesículas unilamelares grandes (LUV), que oscilan en tamaño desde 0,2-4,0 mm, pueden encapsular un porcentaje sustancial de un tampón acuoso que contiene macromoléculas grandes. Pueden encapsularse ARN, ADN y viriones intactos en el interior acuoso y administrarse a células en una forma biológicamente activa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Además de células de mamíferos, se han usado liposomas para la administración de polinucleótidos en células vegetales, de levaduras y bacterianas. Con el fin de que un liposoma sea un vehículo de transferencia de genes eficaz, deben estar presentes las siguientes características: (1) encapsulación de los genes que codifican para los polinucleótidos con una alta eficacia mientras que no comprometen su actividad biológica; (2) unión preferente y sustancial a una célula diana comparado con células que no son diana; (3) administración del contenido acuoso de la vesícula al citoplasma de la célula diana con una alta eficacia; y (4) expresión precisa y eficaz de la información genética (Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988). Además de tales estructuras LUV, también pueden mezclarse preparaciones lipídicas multilamelares y unilamelares pequeñas que incorporan diversos anfífilos lipídicos catiónicos con polinucleótidos aniónicos para formar partículas nucleolipídicas que a menudo se denominan liposomas (Felgner, et al, Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (21): 7413 1987) y se usan para administrar los ácidos nucleicos dentro de las células.

La composición del liposoma es a menudo una combinación de fosfolípidos, particularmente fosfolípidos de alta temperatura de transición de fase, normalmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También pueden usarse otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica, y la presencia de cationes divalentes. Los expertos en la técnica conocen la composición y preparación apropiadas de las formulaciones de anfífilo lipídico catiónico:polinucleótido, y se dispone de varias referencias que proporcionan esta información (por ejemplo, Bennett, et al, J. Liposoma Res. 6(3):545).

Ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos, y gangliósidos. Son particularmente útiles los diacilfosfatidilgliceroles, en los que el resto lipídico contiene desde 14-18 átomos de carbono, particularmente desde 16-18 átomos de carbono, y está saturado. Fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina del huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina. Ejemplos de lípidos anfífilos catiónicos útiles en la formulación de partículas nucleolipídicas para la administración de polinucleótidos incluyen los lípidos monovalentes DOTAP, DOTMA, y DC-Chol, los lípidos polivalentes LipofectAMINE, DOGS, Transfectam y otras poliaminas anfífilas. Estos agentes pueden prepararse con lípidos cooperadores (tales como dioleoilfosfatidiletanolamina) o con diversas composiciones de excipientes, incluyendo diversos adyuvantes, tales como moléculas derivadas del cólera incluyendo la toxina del cólera.

La selección como diana de liposomas puede clasificarse basándose en factores anatómicos y mecanísticos. La clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por ejemplo, específica del órgano, específica de la célula, y específica del orgánulo. La selección como diana mecanística puede distinguirse basándose en si es pasiva o activa. La selección como diana pasiva utiliza la tendencia natural de los liposomas para distribuirse a las células del sistema reticuloendotelial (SRE) en órganos que contienen capilares sinusoidales. Por otra parte, la selección como diana activa, implica la alteración del liposoma acoplando el liposoma a un ligando específico tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glucolípido, o proteína, o cambiando la composición o el tamaño del liposoma con el fin de lograr una selección como diana de tipos de células y órganos distinta de los sitios de localización que se producen de manera natural.

La superficie del sistema de administración dirigida puede modificarse de una variedad de formas. En el caso de un sistema de administración dirigida liposomal, pueden incorporarse grupos lipídicos dentro de la bicapa lipídica del liposoma con el fin de mantener el ligando de selección como diana en una asociación estable con la bicapa liposomal. Pueden usarse diversos grupos de enlace para unir las cadenas lipídicas al ligando de selección como diana.

Hay una variedad de formulaciones adecuadas para la disolución o suspensión bien conocidas por los expertos en la técnica, dependiendo del uso previsto de las mismas.

La administración de las composiciones inmunogénicas descritas en forma líquida mediante dosificación oral tiene el objetivo de exponer la mucosa de los tractos gastrointestinal y genitourinario a las composiciones inmunogénicas. Una dosis adecuada, estabilizada para resistir los pH extremos del estómago, administrará las composiciones inmunogénicas a todas las partes del tracto gastrointestinal, especialmente las partes superiores del mismo. Se contemplan todos los medios para estabilizar las composiciones inmunogénicas en una dosificación oral líquida de manera que la administración eficaz de la composición se distribuye a lo largo del tracto gastrointestinal para su uso con las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento.

La administración de las composiciones inmunogénicas descritas en forma líquida mediante gotas oftálmicas tiene el objetivo de exponer la mucosa de los ojos y tejidos asociados a las composiciones inmunogénicas. Un excipiente líquido típico para colirios está tamponado y contiene otros compuestos bien conocidos por los expertos en la técnica.

La administración de las composiciones inmunogénicas descritas en forma líquida mediante gotas nasales tiene el objetivo de exponer la mucosa de la nariz y senos y tejidos asociados a las composiciones inmunogénicas. Los excipientes líquidos para gotas nasales son normalmente diversas formas de solución salina tamponada.

La administración de los compuestos tratados anteriormente puede practicarse in vitro o in vivo. Cuando se practica in vitro, puede usarse cualquier vía de administración estéril, no tóxica. Cuando se practica in vivo, la administración de los compuestos tratados anteriormente puede lograrse ventajosamente por las vías subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraocular, oral, transmucosa, o transdérmica, por ejemplo mediante inyección o por medio de un mecanismo de liberación controlada. Ejemplos de mecanismos de liberación controlada incluyen polímeros, geles, microesferas, liposomas, comprimidos, cápsulas, supositorios, bombas, jeringas, insertos oculares, formulaciones transdérmicas, lociones, cremas, pulverizadores transnasales, gomas hidrófilas, microcápsulas, inhaladores, y sistemas de administración de fármacos coloidales.

Las composiciones descritas en el presente documento se administran en una forma farmacéuticamente aceptable y en cantidades sustancialmente no tóxicas. Se contempla una variedad de formas de los compuestos administrados. Los compuestos pueden administrarse en agua con o sin un tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa. También se contemplan las dispersiones, tales como las que utilizan glicerol, polietilenglicoles líquidos, y aceites. También pueden añadirse compuestos antimicrobianos a las preparaciones. Las preparaciones inyectables pueden incluir disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos, que pueden diluirse o suspenderse en un entorno estéril antes de su uso. También pueden añadirse excipientes tales como disolventes o medios de dispersión que contienen agua, etanol, polioles, aceites vegetales y similares, a los compuestos descritos en el presente documento. Pueden usarse recubrimientos tales como lecitinas y tensioactivos para mantener la fluidez apropiada de la composición. Pueden añadirse agentes isotónicos tales como azúcares o cloruro de sodio, así como productos que se pretende que retrasen la absorción de los compuestos activos tales como monoestearato de aluminio y gelatina. Se preparan disoluciones inyectables estériles según métodos bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden filtrarse antes del almacenamiento y/o uso. Pueden liofilizarse o secarse a vacío polvos estériles a partir de una disolución o suspensión. También se contemplan formulaciones y preparaciones de liberación sostenida. Cualquier material usado en la composición descrita en el presente documento debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas.

Aunque en algunos de los experimentos que siguen, se usan los compuestos en una concentración única, debe entenderse que en la práctica clínica, los compuestos pueden administrarse en múltiples dosis a lo largo de periodos prolongados de tiempo. Normalmente, los compuestos pueden administrarse durante periodos de hasta aproximadamente una semana, e incluso durante periodos largos superiores a un mes o un año. En algunos casos, la administración de los compuestos puede interrumpirse y luego reanudarse en un momento posterior.

Todas las preparaciones de compuestos pueden proporcionarse en formas unitarias de dosificación para la dosificación uniforme y facilidad de administración. Cada forma unitaria de dosificación contiene una cantidad predeterminada de principio activo calculada para producir un efecto deseado en asociación con una cantidad de excipiente farmacéuticamente aceptable. Una dosificación de este tipo definirá, por tanto, una cantidad eficaz de un compuesto particular.

Las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento pueden administrarse en cantidades apropiadas con respecto a los compuestos individuales para producir una respuesta inmunitaria. Las dosis apropiadas para cada uno pueden determinarse fácilmente mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Una determinación de este tipo se basará, en parte, en la tolerancia y eficacia de una dosis particular usando técnicas similares a las usadas para determinar las dosis de quimioterapia apropiadas.

Puede generarse un kit que comprende los componentes necesarios de una composición inmunogénica que provoca una respuesta inmunitaria frente a un componente inmunogénico seleccionado.

Ejemplo 1 Aislamiento y caracterización del operón csa

Se aisló el operón csa que codifica para la síntesis de pili CS4 de ETEC de la cepa E11881A, se clonó y se secuenció. El operón csa consiste en 5 genes contiguos que codifican para proteínas CsaA-CsaE, que comparten homología con otras proteínas de ensamblaje de pili, y especialmente con CFA/I. Se expresó el operón csa en una cepa de Shigella atenuada, CVD1204 guaBA, construyendo la cepa CVD1204 de Shigella que expresa vacuna frente a fimbrias CS4 (pGA2-CS4). La inmunización de cobayas con CVD1204 (pGA2-CS4) provocó la producción de anticuerpos anti-CS4 que reaccionaron con cepas que producían CS4 y evitó las actividades biológicas mediadas por cepas de ETEC. Este trabajo contribuye a resultados previamente notificados referentes a la expresión de CFA/I, CS2, CS3 y LT en Shigella atenuadas, enfatizando la factibilidad de la construcción de una vacuna de ETEC oral basada en Shigella multivalente y eficaz.

Se aislaron los genes que codifican para la síntesis de fimbrias CS4 de ETEC, csaA, B, C, D, E, D', (el operón csa), de la cepa E11881A. El operón csa codifica para una subunidad fimbrial principal de 17kDa (CsaB), una proteína asociada de punta de 40 kDa (CsaE), una proteína similar a chaperona de 27 kDa (CsaA), una proteína usher de 97 kDa (CsaC), y para una proteína reguladora con deleciones (CsaD') que contiene 100 aminoácidos de 265. El operón csa está flanqueado por IS1E que se insertó en el gen csaD', y secuencias de IS21 en sentido 5' del csaA. El operón csa está ubicado en el plásmido de virulencia grande que lleva los genes LT.

Una búsqueda en BLAST de las secuencias de aminoácidos predichas indicó una alta homología de las proteínas CS4 con proteínas estructurales y de ensamblaje de CFA/I en particular, y con proteínas de fimbrias CS1 y CS2. Se clonó el operón csaA, B, C, E en un plásmido estabilizado de 15 números de copias en sentido 3' de un promotor ompC osmóticamente regulado. El plásmido pGA2-CS4 dirige en las cepas tanto DH5\alpha como Shigella flexneri 2a la producción de fimbrias CS4, según se detecta mediante análisis de inmunotransferencia tipo western y aglutinación bacteriana usando sueros inmunitarios anti-fimbrias CS4. El examen con microscopio electrónico de Shigella que expresa las fimbrias CS4 indicó la producción de muchas extensiones con forma similar a bastones. La inmunización de cobayas con S. flexneri 2a CVD1204 (pGA2-CS4) provocó la producción de anticuerpos anti-CS4 que se unen a proteínas fimbriales CS4, aglutina cepas que producen CS4, inhibe la hemaglutinación mediante cepas de ETEC y previene la adhesión de cepas de ETEC a la línea celular mucosa humana Caco-2.

Aislamiento del operón csa

Se aisló el ADN genómico de la cepa E11881A usando el protocolo GNOME DNA KIT (BIO 101, Carlsbad, CA). Se digirió parcialmente el ADN con Sau3AI, se aislaron los fragmentos de ADN con un tamaño de 5- > 20 kilopares de bases de geles de agarosa y se ligaron dentro de un vector pKS que se digirió con BamHI y se trató con fosfatasa alcalina de gambas. Se transformó la mezcla de ligación dentro de DH5\alpha. Se hicieron crecer los transformantes de DH5\alpha en LB en presencia de carbenicilina a 50 \mug/ml o kanamicina a 50 \mug/ml.

Se recogieron los transformantes resultantes en placas de microtitulación de 96 pocillos, y se sometieron a ensayo para determinar el operón csa mediante pruebas de PCR, basándose en la secuencia publicada del gen csfA, (el gen estructural de las fimbrias CS4, NCBI número de registro X97493). Basándose en esa secuencia, se construyeron dos cebadores que amplificaban un fragmento de 319 pares de bases. Los cebadores son: CS44 pb de 1 a 29: GTTGACCCTACAATTGATATTTTGCAAGC (SEQ ID NO: 11) CS45 pb de 378 a 348: CGACCCCACTATAATTCCCGCCGTTGGTGC (SEQ ID NO: 12). Se analizaron combinaciones de 1200 colonias y 2 colonias fueron positivas en la prueba de PCR. Se encontró que ambas colonias contenían el mismo plásmido, pKS-CSA-I, (figura 1 A). La secuenciación del fragmento de ADN clonado indicó que el plásmido pKS-CSA-I contiene la mayoría del operón csa, faltándole 430 pb del extremo 5' del gen csaA. La secuenciación del ADN del operón csa reveló un alto grado de homología con las secuencias de ADN del operón CFA/I (Tabla 2).

Basándose en esa homología, se diseñaron dos nuevos cebadores para la selección de la biblioteca genómica para determinar el extremo 5' mediante PCR. El cebador CS433 se basa en las secuencias de csaA en el pb 718, y el cebador CS434 se basa en las secuencias de CFA/I del pb 878. CS433: GTGATATGTTTTGTTCACTTGGTAAAGATC (SEQ ID NO: 13) CS434: CTCATGGCTCCATTTGTTGCAAATGCAAACTTTATG (SEQ ID NO: 14). Ensayos de PCR usando estos cebadores amplificaron un fragmento de ADN de 429 pb del ADN genómico de la cepa E118811A. Examinando la biblioteca de ADN, se aisló un clon positivo que contenía el gen csaA entero junto con secuencias de ADN en sentido 5'. El clon contiene el plásmido de 8000 pares de bases pKS-CSAII, (figura 1B).

Análisis de secuencias de ADN

Se determinaron las secuencias de ADN de los genes que codifican para CS4 en los plásmidos pKS-CSA-I y pKS-CSA-II en ambas cadenas. Se sintetizaron los cebadores de secuenciación en un sintetizador de ADN de Perkin Elmer modelo 3948 a escala sintética de 40 nM. Se realizó la secuenciación usando un sintetizador de ADN de Perkin Elmer 373, con los terminadores marcados con colorante ("Dye Terminators") del BIGDYE KIT, Perkin Elmer (Boston, MA). Los resultados de secuenciación identificaron al operón csa y sus genes flanqueantes, tal como se describe esquemáticamente en la figura 1C.

Construcción de pGA2

Se derivó el vector usado para la expresión de genes que codifican para CS4 en Shigella, pGA2, del plásmido pEX01 reemplazando el gen codificante gfp (ADN de 751 pb, flanqueado por las enzimas de restricción ClaI y NheI), con un ligador de 87 pb que contiene sitios de clonación múltiple (mcs), que se construyó mediante PCR, tal como se indica. pEX01 es un plásmido de expresión derivado de pGEN222. (Galen, et al., Infect. Immun., 67:6424-6433 (1999)). El plásmido pGEN222 lleva un sistema de mantenimiento de plásmido de dos componentes del sistema de destrucción post-segregacional hok-sok más el sistema de partición del plásmido parA, se ha mostrado que estos dos componentes funcionan conjuntamente para minimizar la pérdida de plásmido de una población de bacterias activamente en crecimiento y para lisar cualquier bacteria de la que se han segregado los plásmidos, diseñado por ingeniería genética que codifica para niveles reducidos de resistencia frente a la kanamicina se creó pEX01 a partir de pGEN222 sustituyendo el gen bla, que codifica para \beta-lactamasa, con un alelo aph (Blomfield, et al., Mol. Microbiol., 5:1447-1457 (1991)). Se observó que la expresión del alelo aph de tipo natural dentro de cepas de vacuna de S. typhi atenuadas conduce a inestabilidad del plásmido. Por tanto, se modificó la transcripción de este alelo aph mediante PCR de manera que la separación de las regiones -35 y -10 dentro del promotor se aumento desde 18 hasta 19 pares de bases; se introdujo este alelo, rediseñado por ingeniería genética, como fragmento Nhe I dentro de pGEN222 escindido con Xba I y Spe I para reemplazar al gen bla.

Se usó el fragmento de PCR que codifica para mcs como fragmento de restricción de Cla I - Nhe I para reemplazar al fragmento de restricción de Cla I-NheI dentro del pEX01 que codifica para el alelo gfpuv, creando pGA2. Por tanto, se espera que pGA2 esté presente en aproximadamente 15 copias por equivalente cromosómico, y que conduzca la expresión de genes que codifican para CS4 del promotor ompC osmóticamente sensible.

Se construyó el mcs mediante PCR usando los siguientes cebadores: Cebador 4a: GGGATCGATCCCGGGGCGGC
CGCGGGCCCGGTACCAGGCCTTCTAGAAAGCTTGACGTCG (SEQ ID NO: 15); cebador 4b: CCCGCTAGCGG
CGCGCCTCGCGAGGATCCGTCGACGACGTCAAGCTTTCT AGA AGGCCTGG (SEQID NO: 16); Cebador 4c: AAGCTTGACGTCGTCGACGG (SEQ ID NO: 17); Cebador 4d: CCCGCTAGCGGCGCGCCTCGCG (SEQ ID NO: 18).

Construcción del plásmido que codifica para CS4

Se construyó el plásmido pGA2-CS4 (figura 2B) en tres etapas. Se clonó el extremo 5' del gen csaA a partir del plásmido pKS-CSA-II para dar un fragmento de HpaI/XbaI de 710 pb, dentro de pKS SmaI/XbaI. El sitio HpaI está ubicado 241 pb en sentido 5' del codón ATG para el gen csaA. Entonces se clonó adicionalmente el fragmento de ADN como fragmento de KpnI/XbaI para dar pGA2 KpnI/XbaI, para construir el plásmido pGA2-\DeltacsaA. Se clonaron los genes que codifican para CS4 restantes, (el extremo 3' de csaA, csaB, csaC, y csaE) a partir de pKS-CSA-I como fragmento XbaI de 4526 pb. Los dos sitios XbaI están ubicados en el gen csaA, y en el codón de terminación del gen csaE. Se ligó el fragmento de ADN al sitio XbaI de pGA2-\DeltacsaA, para construir el plásmido pGA2-CS4.

Cebadores de ADN adicionales para ensayos de PCR

Para la ubicación de diferentes genes mediante ensayos de PCR, se construyeron los siguientes cebadores. Para el gen LT (AB011677, GI 3062900): LTA pb 162: CCGTGCTGACTCTACACCCCCAGATG (SEQ ID NO: 19) y LTB pb 895: GCACATAGAGAGGATAGTAACGCCG (SEQ ID NO: 20). Para el gen gyrA (X57174, GI 41641):
GYRA pb 347: CGGTCATTGTTGGCCGTGCGCTGCC (SEQ ID NO: 21) y GYRA pb 1147: CACGCAGCGCGCT
GATGCCTTCCACGCG (SEQ ID NO: 22). Para el gen csaD: CS4D3: del operón csa pb 5540-5564, y cfaD (Gl 145505) pb 1236-1260. CATATTTGATATCTGAGATATCTGG (SEQ ID NO: 23) CS4D2: del operón csa pb 6005-60030, y cfaD pb 771-794, TGTTGCATTCAGATTGAACGGAG (SEQ ID NO: 24). CS4D1: de cfaD pb 606-629, en una región similar a rns. Esta región de ADN carece del operón csa: TATTATGATTCATAAATACACTGT (SEQ ID NO: 25). Se espera que los ensayos de PCR usando los cebadores CS4D2/CS4D3 amplifiquen un ADN de 476 pb, y con cebadores CS4D1/CS4D3, un ADN de 646 pb.

Transformación de cepas de Shigella

Se hicieron crecer cepas de Shigella en placas de agar con agar tripticasa de soja (TSA) que contenían rojo Congo al 0,1% y 10 \mug/ml de guanina. Se prepararon células competentes de S. flexneri 2a CVD1204 haciendo crecer las células en caldo L complementado con guanina hasta una DO_{600 \ nm} de 0,6. Se precipitaron las células, se lavaron dos veces con H_{2}O fría, una vez con glicerol al 10% frío y volvieron a suspenderse en el mismo tampón a 1/100 del volumen original. Se electroporó una mezcla de 150 \mul de ADN de plásmido y células en una legra de 0,2 cm en un dispositivo Gene Pulser (BioRad Laboratories, Hercules, CA) usando 2,5 kV, 200 \Omega, 25 \muF, o 1,75 kV, 600 \Omega, 25 \muF. Se seleccionaron los transformantes sobre placas de TSA que contenían kanamicina, guanina y rojo Congo.

Detección de síntesis de pili

Se hicieron crecer cepas de ETEC sobre placas de CFA (Hamers, et al., Microb. Pathog., 6:297-309 (1989)) a 37ºC, y volvieron a suspenderse las bacterias en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se hicieron crecer las cepas de Shigella que contenían el plásmido pGA2-CS4 en caldo TS, [Trypton (Difco), al 1,5%; Soyton (Difco), al 0,5%)], que contenían NaCl 0, 50, 150 y 300 mM hasta un crecimiento en fase logarítmica. Se sometieron las bacterias a ensayos para determinar la producción de pili mediante ensayos de aglutinación bacteriana, y mediante inmunotransferencia de extractos celulares. Para la inmunotransferencia se ajustaron los cultivos bacterianos hasta DO_{600 \ nm}=10 y se sometieron a ebullición durante 10 minutos en tampón de muestra Laemmli (BioRad). Se separaron las proteínas de extractos celulares sobre SDS-PAGE (15%), se transfirieron a filtros de nitrocelulosa (MSI) y se determinaron con una sonda de suero anti-CS4. Se produjo el antisuero anti-CS4 específico en conejos mediante inmunización con cepa E11881A de ETEC (una cepa productora de CS4^{+} CS6^{+}), y la absorción de los sueros sobre EII88IC (una cepa CS4^{-}CS6^{+}).

Hemaglutinación

Para las pruebas de hemaglutinación (Willshaw, et al., FEMS Microbiol. Lett., 49:473-478 (1988)), se hicieron crecer cepas de ETEC y Shigella durante la noche sobre placas que contenían CFA o TSA/CR/guanina/kanamicina, respectivamente, y volvieron a suspenderse en PBS hasta DO_{600 \ nm} de 10. Se realizaron las pruebas de hemaglutinación en portaobjetos tal como se describe por Sakellaris, et al 1999 (Sakellaris, et al., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A., 96:12828-12832 (1999)), mezclando 20 \mul de suspensión bacteriana con 20 \mul de PBS que contiene D-manosa 0,1 M y 20 \mul de eritrocitos humanos lavados del grupo A. Para los ensayos de inhibición de la hemaglutinación, se incubaron las suspensiones bacterianas con anticuerpos diluidos cuatro veces durante 1 hora a 37ºC antes de las pruebas de hemaglutinación.

Adhesión e inhibición de la adhesión a células Caco-2

Se hicieron crecer células Caco-2 durante 15 días en portaobjetos de 8 cámaras en medio Eagels modificado por Dulbecco que contenía suero de ternero fetal (20%) y glutamina (1%). Se realizaron ensayos de adhesión incubando células lavadas con concentraciones bacterianas de 10^{7} y 10^{8}/ml, durante 2 y 3 horas en DMEM que contenía D-manosa 0,1 M, (Viboud, et al., Microb. Pathog., 21:139-147 (1996)). En los ensayos de inhibición de la adhesión, se incubaron los cultivos bacterianos con anticuerpos durante 1 hora, a 37ºC antes de su adición a las células Caco-2 lavadas. Tras la incubación, se lavaron las células Caco-2 5 veces con PBS, se fijaron con metanol y se tiñeron con Giemsa (10%).

Inmunización

Se inoculó mediante administración intranasal a cobayas, anestesiadas por vía subcutánea con ketamina HCL (40 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg), dos veces en los días 0 y 14, \sim2 x 10^{9} bacterias (0,1 ml de DO_{600 \ nm} 400) que crecieron sobre placas que contenían TSA/rojo Congo/guanina y se recogieron en PBS. Se inmunizaron dos grupos de animales: grupo I con CVD1204 (pGA2), y grupo II con CVD1204 (pGA2-CS4), una cepa que produce CS4. Se obtuvieron sueros en los días 0, 14 y 30 mediante punción en la vena cava anterior de animales anestesiados.

Resultados Clonación y secuenciación de los genes que codifican para fimbrias CS4

Se aisló el operón csa que codifica para la síntesis de las fimbrias CS4 a partir de una biblioteca de ADN genómico de la cepa E11881A, tal como se describió anteriormente. Se clonó la mayor parte del operón csa en plásmido pKS-CSA-I que contiene la parte carboxi-terminal del gen csaA, los genes csaB, csaC, csaE y un gen csaD' alterado. Se alteró el gen csaD' mediante integración de un elemento IS1, creando una deleción de los 48 aminoácidos amino-terminales, y una mutación por desplazamiento de marco que dio como resultado un codón de terminación. Los ensayos de aglutinaciones de cepas DH5\alpha (pKS-CSA-1) en suero de conejo anti E11881A (que se absorbió en la cepa E11881C) fueron positivos, lo que indica la expresión de fimbrias CS4. Las inmunotransferencias de tipo western indicaron la presencia de dos bandas fimbriales, la proteína de 17 kDa madura, y una proteína de PM superior, probablemente la forma antes de la escisión. Mediante un examen adicional de la biblioteca de CS4 se aisló el plásmido pKS-CSA-II. El plásmido contiene el sitio del promotor csa, el gen csaA y la región amino-terminal de csaB. En sentido 5' del gen csaA hay un elemento IS 21. El operón csa está ubicado en un fragmento de ADN de \sim10.500 pb que está flanqueado por
elementos de inserción, similares a una isla de patogenicidad, tal como se describe esquemáticamente en la figura 1C.

Se secuenciaron 7.239 pb de la isla de patogenicidad CS4 en ambas direcciones, indicando una región G+C del 34,88%. El operón csa está ubicado entre los pb 1 y 6.095. Contiene 5 0RF, se transcriben 4 genes, csaA, csaB, csaC, y csaE en la misma dirección en sentido 3' desde un sitio de promotor predicho, y csaD' a partir de la cadena antiparalela. La ubicación de cada gen se describe en la tabla 1, y se presenta esquemáticamente en la figura 1C. Una búsqueda en BLAST para determinar la homología de la secuencia de ADN de csa (bases 1 a 6096) con otros genes indicó una homología con genes que codifican para fimbrias de ETEC CFA/I, CS1 y CS2, con los genes estructurales de CS4 y CS14, y con genes reguladores de fimbrias cfaD, rns, csvR y aggR, tal como se presenta en la tabla 2. Los resultados de la búsqueda de BLAST indican que el operón csa tiene una alta similitud de ADN con el operón cfa1; 5.420 pb de 6.069 pb son similares en > 91%. Comparando la secuencia de ADN de cada gen con otros genes que codifican para fimbrias indica que los siguientes resultados:

csa A: el 93% de los 717 pb de las secuencias de ADN de csaA son idénticas a 716 pb de cfaA (M55661.1), y 44 pb de su extremo 5' son idénticos en un 90% a los genes de 713 pb csoA y cooB (X62879.1 y X62495.1).

csa B: 402 pb de csfA (X97493.1), la secuencia de ADN publicada del gen estructural de CS4, son idénticos en un 99% a 501 pb de las secuencias de ADN de csaB. De los 512 pb de cfaB, (M55661.1), la secuencia de 107 pb es idéntica en un 93% a csaB. 93 bases del extremo 5' de 504 pb csuA1, (X9749.1), el gen estructural para las fimbrias CS14, son idénticos en un 89% a csaB. 35 pb del extremo 5' del gen de 512 pb cotA (Z47800.1) son idénticos en un 94% a csaB.

csa C: 2601 pb del gen csaC comparten una similitud de secuencias de ADN del 96% con 2507 pb del gen cfaC (M55661. 1), el 80% de homología con 391 pb de 2618 pb del gen cooC (X76908.1), y el 85% de homología con 124 pb de 2597 pb del gen cotC (Z47800.1).

csa E: 1086 pb de las secuencias de ADN de csaE son idénticas en \geq84% a 999 pb de 1082 pb de cfaE (M55661.1), y 32 pb de 1091 pb de cooD (X76908.1) son idénticos en un 90% a csaE.

csa D': la secuencia de ADN de csaD' es similar a cfaD' (CFA/I), cfaD, rns y csvR de cepas de ETEC, y aggR de fimbrias EHEC. La similitud de secuencias de ADN entre csaD', cfaD y rns es de 751/817 pb (91%) para cfaD, y 721/787 (91%) para rns.

La comparación de las regiones de similitud en ambos genes indicó que el gen csaD' carece de 143 pb de su extremo 5' debido a una inserción de un elemento IS. La búsqueda en Blast de secuencias de ADN en sentido 3' del operón csa indicó que desde la base 6096 hasta la 6870 hay homología con las secuencias de IS1E, (NCBI X52537, identidades = 765/769, 99%), desde el pb 6892 hasta 7054, hay homología con el plásmido pB171 (GI 6009376) de la cepa EPEC, entre los pb 16240 y 16471. Y desde los pb 7062-7239 hay homología con el plásmido collb (GI 4512437) la cepa P9 de Shigella sonnei entre los pb 4895 y 5568.

Sitio del promotor

Se predijo el sitio del promotor para el operón csa usando la "Promoter Prediction By Neural Network" ("Predicción de promotores mediante redes neuronales"), y se propone que está ubicado entre los pb 145 a 194, 89 pb en sentido 5' del codón ATG para el gen csaA. La secuencia de promotor predicha es tal como sigue: TGTGGGTATTTGTTTGGACATCGCAGCATTAAATATAAAAATAGCACAGG (SEQ ID NO: 26). La "A" subrayada grande es el inicio de transcripción previsto, y los nucleótidos sombreados son las secuencias -10 y -35 posibles. Una búsqueda de BLAST indicó una homología de 28/31 pb (90%) con el operón fimbrial CFA/I, entre los pb 687 a 717, 131 pb en sentido 5' del gen cfaA.

Proteínas de ensamblaje y estructurales de pili CS4. El operón csa codifica para la síntesis de cinco proteínas: CsaA, CsaB, CsaC, CsaE y CsaD. Se describen la ubicación de los genes y el tamaño de las posibles proteínas en la tabla 1. Según la similitud de secuencia de las proteínas CsaA-E con otras proteínas de fimbrias de ETEC, las funciones predichas de las proteínas CsaA-E son tal como sigue:

La función de CsaA es una proteína similar a chaperona periplásmica. El análisis PSORT indica que la posible proteína es una proteína del espacio periplásmico bacteriano (certeza de 0,939). CsaB es la subunidad de pilina principal. CsaC es una proteína usher de membrana. Un análisis PSORT predijo una ubicación de membrana exterior (certeza de 0,926). Se supone que CsaE es la punta de fimbria. Un análisis PHDsec (para la predicción de estructuras secundarias) indicó que la proteína es una proteína compacta como un dominio globular. CsaD' es una proteína reguladora de fimbrias. La proteína CsaD' contiene 100 aminoácidos de la parte carboxi-terminal de la proteína, que carece de los primeros 48 aminoácidos (basándose en la homología con el gen cfaD del pili CFA/I), debido a una inserción de un elemento IS1E. Tras los 100 aminoácido hay una mutación por desplazamiento de marco que codifica para un codón de detención.

Homología de las proteínas CsaA-E con otras proteínas de fimbrias

Una búsqueda de BLAST con la posible secuencia de aminoácidos de las proteínas CsaA-E indicó homología con proteínas de fimbrias de cepas de ETEC y Salmonella typhi tal como se describe en la tabla 3. Las secuencia de aminoácidos de las proteínas de ensamblaje y estructurales de las fimbrias CS4 fimbria tiene similitud con proteínas de ETEC que producen las fimbrias CFA/I, CS1 y CS2, y con fimbrias de Salmonella. Además, las proteínas estructurales de CS4 tienen secuencias de aminoácidos similares a las proteínas estructurales de CS14, CS17, CS19 y B. cepacia. La proteína estructural CsaB de las fimbrias CS4 y la proteína asociada a la punta CsaE son responsables de la estructura fimbrial y de la unión bacteriana a las células del intestino. En las figuras 3 y 4 se describe una alineación de secuencias de aminoácidos de las proteínas fimbriales que son similares a CsaB y CsaE.

TABLA 3 Similitud en las secuencias de AA entre las proteínas CsaA-E de ETEC y otras proteínas fimbriales

4

5

Ubicación del operón csa en la cepa E11881A

Con el fin de identificar la ubicación del operón csa, se aisló ADN genómico total de la cepa E11881A, y se sometió a electroforesis en gel de agarosa. Los resultados de la electroforesis indicaron la presencia de 3 plásmidos: un plásmido grande ubicado por encima de la banda cromosómica, y dos plásmidos más pequeños ubicados por debajo de la banda de ADN cromosómico. Se eluyeron en gel los plásmidos y las bandas cromosómicas y se sometieron a prueba mediante ensayos de PCR para determinar la presencia del operón csa, usando cebadores CS44/CS45 para la amplificación del gen csaB. Estos resultados indicaron que el operón csa estaba ubicado en el plásmido grande. Se detectó la ubicación del gen LT mediante ensayos de PCR usando cebadores LTA162/LTB895 (para la amplificación de un ADN de 708 pb), indicando que los genes que codifican para LT están ubicados en el plásmido grande. La amplificación del gen gyrA, usando cebadores GYRA347/GYRA1147 (para la amplificación de un ADN de 748 pb) indicó una ubicación cromosómica. Con el fin de observar si la cepa E11881A contenía un gen csaD completo, se realizaron ensayos de PCR con cebadores que son homólogos al gen csaD' (CS4D2 y CS4D3), y con cebador CS4D1 que es homólogo con genes cfaD y rns (CSD41/CSD43). Los resultados indican que la cepa E11881A no contiene el gen cfaD completo. Los cebadores CS4D2/CS4D3 amplificaron el fragmento de ADN 476 esperado, mientras que los cebadores CS4D1/CS4D3 no amplificaron los 646 pb esperados. Las cepas EII881E, DS9-1 H10407, y C91f contenían el gen completo.

Expresión del pili CS4 en DH5\alpha y CVD1204

Se detectó la expresión de las fimbrias CS4 tras la clonación de 5281 pb del operón csa en el vector pGA2, para construir el plásmido pGA2\cdotCS4, (figura 2B). El operón csa clonado contenía 240 pb de la región de promotor en sentido 5' del codón ATG para el gen csaA, los genes csaA, csaB, csaC y csaE. Se clonó el operón csa en sentido 3' del promotor ompC, que se regula osmóticamente. Se transfirió el plásmido pGA2-CS4 a cepas CVD1204 de Shigella y DH5\alpha de E. coli. Se detectó la producción de fimbrias CS4 por las cepas DH5\alpha (pGA2-CS4) y cepas CVD1204 (pGA2-CS4) mediante ensayos de aglutinación usando un suero de conejo frente a las fimbrias CS4 e inmunotransferencia de tipo western de extractos celulares. Los resultados de la inmunotransferencia de tipo western indican que el agrupamiento de genes csaABCE clonados codifica para una banda de 17 kDa que corresponde a las fimbrias CS4.

Respuesta de anticuerpos de cobayas frente a CVD1204 (pGA2-CS4)

Para probar si el operón csa clonado podía inducir una respuesta inmunitaria frente a CS4 de ETEC, se inmunizaron cobayas mediante dos administraciones intranasales de 2x10^{9} cepas CVD1204 vivas (pGA2-CS4), y como control con cepa CVD1204 (pGA2). Se sometieron los animales inmunizados a pruebas para determinar la aglutinación bacteriana, inmunotransferencia, e inhibición de hemaglutinación y adherencia de cepas que expresan CS4 a células Caco-2.

Ensayos de aglutinación

Los ensayos de aglutinación bacteriana realizados con cobayas inmunes indicaron que los animales inmunizados con CVD1204 (pGA2-CS4) desarrollaron anticuerpos que aglutinan todas las cepas que producen CS4, y especialmente las cepas que producen altas fimbrias DS 9-1, DH5\alpha (pGA2-CS4) y CVD1204 (pGA2-CS4), tal como se describe en la tabla 4. El punto final de la dilución de suero que aglutina cepas DS 9-1 y DH5\alpha (pGA2-CS4) es > 1:100 y > 1:1000, respectivamente. Los sueros control de animales inmunizados con cepa CVD1204 (pGA2), aglutinan cepas CVD1204. También se realizaron ensayos de aglutinación bacteriana usando antisuero de conejo anti-CS4 y se presentan los datos de estos ensayos en la tabla 5.

TABLA 4 Ensayos de aglutinación bacteriana mediante antisuero de conejo anti-CS4

6

TABLA 5 Ensayos de aglutinación bacteriana mediante suero de cobayas inmunes

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8

Ensayos de inmunotransferencia

Se sometieron las cobayas inmunizadas a prueba en experimentos de inmunotransferencia para unirse a proteínas de fimbrias CS4. Se realizaron los ensayos detectando con sondas cepas que producían CS4 con el suero inmune de cobaya y el suero de conejo anti-CS4. Se aislaron extractos celulares de las cepas E11881A y DS 9-1 de ETEC, que crecieron sobre placas de CFA a 37ºC y 22ºC (unas condiciones que suprimen la producción de fimbrias), de cepas DH5\alpha (pGA2-CS4) y CVD1204 (pGA2-CS4) que crecieron en caldo LB en presencia de Km. Los resultados de inmunotransferencia mostraron que el suero de cobayas de animales inmunizados con CS4 reaccionaba con una proteína de banda de 17 kDa que es la proteína estructural fimbrial de CS4. Las cepas de ETEC producían una banda de 17 kDa a 37ºC pero no a 22ºC. Las cepas de E. coli y Shigella que contienen el plásmido pGA2-CS4 producían bandas de proteína de 17 kDa, que no se producían en las correspondientes células sin transformar.

Inhibición de la hemaglutinación

Las cepas de ETEC que producen las fimbrias CS4 provocan una aglutinación resistente a manosa de glóbulos rojos humanos de tipo A. Se sometió a prueba la capacidad de las cepas de ETEC-CS4, DH5\alpha, y una cepa CVD1204 que contiene los genes que codifican para CS4 clonados, para la hemaglutinación. Se presentan los resultados en la tabla 6. Los ensayos de hemaglutinación indicaron que todas las cepas que producen pili CS4 provocan la hemaglutinación. Las cepas de ETEC-CS4 demuestran una hemaglutinación más intensa que las cepas que expresan operón csa clonado. Las cepas que no producen CS4 no provocaron ninguna hemaglutinación.

TABLA 6 Eficacia de hemaglutinación inducida por bacterias

9

Se sometió a prueba el antisuero de cobayas anti-CS4 para determinar la inhibición de la hemaglutinación. Se incubaron cepas de ETEC-CS4 con diversas diluciones de anticuerpos antes de su adición a la suspensión de glóbulos rojos. Los resultados que se presentan en la tabla 7 indican que los anticuerpos de cobayas anti-CS4 inhiben la hemaglutinación, mientras que el suero inmune de control frente a Shigella no tiene ningún efecto sobre la hemaglutinación inducida por CS4 de ETEC.

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TABLA 7 Eficacia de inhibición de la hemaglutinación inducida por bacterias mediante anticuerpos de cobayas anti-CS4

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Inhibición de la adherencia de cepas de ETEC-CS4 a células Caco 2

Las cepas que producen CS4 de ETEC tienen la capacidad de adherirse a la línea celular Caco-2 de carcinoma humano. Se sometieron a prueba la adhesión de las cepas DS 9-1 de ETEC a células Caco-2, y el efecto de los anticuerpos de cobayas anti-CS4 sobre esta adhesión. Los resultados indican que \sim10-100 bacterias se adhieren a las células Caco-2. Como control, sometió a prueba la adhesión de bacterias DH5\alpha, y se encontró que sólo se adherían muy pocas bacterias. La incubación previa de DS 9-1 de ETEC con suero de cobayas anti-CS4 (diluciones de 1:10), inhibió totalmente la adherencia de las células bacterianas a las células Caco-2.

Ejemplo 2 Construcción de una cepa de S. typhi atenuada que expresa constitutivamente CS4

Con el fin de cambiar la expresión de CS4 en pGA2-CS4 de osmóticamente regulada a constitutiva, se usa un promotor fuerte, por ejemplo, P_{tac}. El promotor P_{tac} es constitutivamente activo en Salmonella spp., ya que estos microorganismos carecen de laql. En consecuencia, se construyen derivados de CVD 915 que expresan CS4 constitutivamente de la manera descrita a continuación.

En primer lugar, se retira el promotor ompC del constructo pGA2-CS4 y se reemplaza con el promotor P_{tac}, dando como resultado la creación de pGA2tac-CS4. Tras confirmar la presencia del promotor P_{tac} en pGA2tac-CS4, se introduce el constructo dentro de la cepa CVD-915 de S. typhi, usando técnicas de biología molecular habituales.

Se somete a ensayo la expresión constitutiva del antígeno CS4 mediante el ensayo de aglutinación descrito en el ejemplo 1. Usando la cepa Ty2 de S. typhi de tipo natural como control positivo, y CVD-915 sin transformar (CVD 915) como control negativo, se encuentra que la expresión del antígeno CS4 es fuerte, constitutiva, y no está regulada por cambios de osmolaridad.

Ejemplo 3 Respuesta inmunitaria frente a CS4 expresado constitutivamente

Se inmunizan grupos de 10 ratones Balb/c de 6 semanas de edad por vía intranasal con 1,0x10^{10} ufc de cepa CVD 915 con pGA2tac-CS4 (CVD 915^{+}) o CVD 915 sin pGA2tac-CS4 (CVD 915). Se sangran los ratones antes y 30 días tras su inmunización, y se almacena su suero a -20ºC hasta su uso. Se determinan los anticuerpos presentes en el suero frente a antígenos CS4, H (flagelos) y LPS de S. typhi mediante ELISA. Los resultados indican que la inmunización con la cepa CVD 915^{+} provoca niveles de anticuerpos frente al antígeno CS4 que son significativamente superiores que los obtenidos con la cepa CVD 915^{-}. Las respuestas inmunitarias frente a otros antígenos de S. typhi (LPS y H) son similares entre ambos grupos inmunizados. Los resultados demuestran que la expresión constitutiva del antígeno CS4 potencia la respuesta inmunitaria frente a este antígeno sin interferir con la respuesta inmunitaria frente a otros antígenos de S. typhi somáticos.

Ejemplo 4 Respuesta inmunitaria frente a CS4 expresado constitutivamente

Se formula la cepa de E. coli enterotóxica que expresa el antígeno CS4 (ETEC-CS4) del ejemplo 1 dentro de una composición inmunogénica para su administración nasal dentro de un sujeto humano (ETEC-CS4). Se administran por vía nasal aproximadamente 1,0 x 10^{10} ufc de la bacteria recombinante ETEC-CS4 a un sujeto humano. Se administra un recuerdo dos semanas después de la primera administración. Posteriormente se extrae sangre del sujeto y se somete a ensayo para determinar la presencia de anticuerpos anti-ETEC-CS4 y anti-CS4. Se encuentran tales anticuerpos en la muestra de sangre.

<110> UNIVERSIDAD DE MARYLAND, BALTIMORE

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ALTBOUM, Zeev

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BARRY, Eileen M.

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LEVINE, Myron M.

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<120> AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DEL OPERÓN CSA (PILI CS4 DE ETEC) Y MÉTODOS PARA USAR EL MISMO

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<130> UOFMD.006VPC

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<150> documento US 60/198.626

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<151> 20-04-2000

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<160> 40

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 717

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<212> ADN

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<213> E. coli

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(717)

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<400> 1

12

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<210> 2

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<211> 238

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<212> PRT

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<213> E. coli

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<400> 2

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13

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<210> 3

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<211> 504

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<212> ADN

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<213> E. coli

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(504)

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<400> 3

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14

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<210> 4

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<211> 167

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<212> PRT

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<213> E. coli

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<400> 4

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15

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<210> 5

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<211> 2604

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<212> ADN

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<213> E. coli

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(2604)

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<400> 5

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16

17

18

19

20

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<210> 6

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<211> 867

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<212> PRT

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<213> E. coli

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<400> 6

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21

22

23

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<210> 7

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<211> 330

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<212> ADN

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<213> E. coli

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(330)

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<400> 7

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24

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<210> 8

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> E. coli

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<400> 8

25

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<210> 9

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<211> 1086

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<212> ADN

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<213> E. coli

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(1086)

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<400> 9

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26

27

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<210> 10

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<211> 361

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<212> PRT

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<213> E. coli

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<400> 10

28

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<210> 11

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

gttgacccta caattgatat tttgcaagc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgaccccact ataattcccg ccgttggtgc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgatatgtt ttgttcactt ggtaaagatc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcatggctc catttgttgc aaatgcaaac tttatg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggatcgatc ccggggcggc cgcgggcccg gtaccaggcc ttctagaaag cttgacgtcg

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagcttgacg tcgtcgacgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgctagcg gcgcgcctcg cg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgtgctgac tctacacccc cagatg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcacatagag aggatagtaa cgccg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggtcattgt tggccgtgcg ctgcc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacgcagcgc gctgatgcct tccacgcg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catatttgat atctgagata tctgg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgttgcattc agattgaacg gag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tattatgatt cataaataca ctgt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgggtatt tgtttggaca tcgcagcatt aaatataaaa atagcacagg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. coli

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (283)...(999)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1028)...(1531)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1589) ... (4192)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4196)...(5281)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5790)...(6119)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 361

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de homología con la proteína de ETEC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 359

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de homología con la proteína de ETEC

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 364

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de homología con la proteína de ETEC

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de homología con la proteína de ETEC

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 353

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de homología con la proteína de ETEC

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

45

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de homología con la proteína de ETEC

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de homología con la proteína de ETEC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de homología con la proteína de ETEC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

49

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de homología con la proteína de ETEC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

51

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de homología con la proteína de ETEC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de homología con la proteína de ETEC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de homología con la proteína de ETEC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de homología con la proteína de ETEC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

55

Claims

1. Polipéptido purificado codificado por el operón csa, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 27, en el que dicho polipéptido purificado se selecciona del grupo que consiste en:

(a) CsaA que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2,

(b) CsaC que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 6,

(c) CsaD que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 8,

(d) CsaE que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 10,

(e) un fragmento de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaD, y

(f) un fragmento de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaE, o un polipéptido purificado que tiene al menos el 98% de identidad con cualquiera de (a) a (f).

2. Vector de expresión que comprende uno o más de

(ii) un fragmento de un operón csa, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 27, en el que fragmento se selecciona del grupo que consiste en:

3. Vector de expresión según la reivindicación 2, que comprende un promotor constitutivo o viral.

4. Método de producción de un vector de expresión que comprende insertar uno o más de un operón csa o un fragmento de un operón csa según la reivindicación 2 dentro de la región codificante del vector bajo el control de un promotor.

5. Célula huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 2 ó 3.

6. Célula huésped según la reivindicación 5, en la que dicha célula huésped es un microorganismo recombinante.

7. Método de producción de uno o más productos recombinantes codificados por el operón csa, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 27, que comprende:

(a) introducir dentro de una célula huésped un vector de expresión que comprende al menos una parte de una región codificante del operón csa de modo que se produce una célula huésped recombinante, y

(b) cultivar la célula huésped recombinante en condiciones tales que se expresan uno o más productos recombinantes codificados por la parte de región codificante, en el que el producto recombinante se selecciona del grupo que consiste en: un antígeno CS4 codificado por un operón csa que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 27, los polipéptidos tal como se exponen en (a) a (f) según la reivindicación 1, y CsaB que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4.

8. Método según la reivindicación 7, en el que el producto recombinante es el antígeno CS4.

9. Composición inmunogénica que comprende

(a) CsaA que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2,

(b) CsaB que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4,

(c) CsaC que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 6,

(d) CsaD que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 8,

(e) CsaE que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 10,

(f) un fragmento de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaD,

(g) un fragmento de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaE, y

(h) un polipéptido purificado que tiene al menos el 98% de identidad con cualquiera de (a) a (g), o

(ii) un microorganismo recombinante según la reivindicación 6, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

10. Composición inmunogénica según la reivindicación 9, en la que la composición es adecuada para su administración parenteral.

11. Composición inmunogénica según la reivindicación 9, en la que la composición es adecuada para su administración intranasal.

12. Composición inmunogénica según la reivindicación 9, en la que la composición es adecuada para su administración intramuscular.

13. Composición inmunogénica según la reivindicación 9, en la que la composición es adecuada para su administración entérica.

14. Vector de expresión según la reivindicación 2 ó 3, composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, o polipéptido purificado seleccionado del grupo que consiste en:

(a) CsaA que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2,

(b) CsaB que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4,

(c) CsaC que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 6,

(d) CsaD que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 8,

(e) CsaE que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 10,

(f) un fragmento de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaD, y

(g) un fragmento de al menos 30 aminoácidos contiguos de CsaE, o un polipéptido purificado que tiene al menos el 98% de identidad con cualquiera de (a) a (g), para su uso en un método de generación de una respuesta inmunitaria en un sujeto.

15. Polipéptido, vector de expresión o composición inmunogénica según la reivindicación 14 para su uso en un método para generar una respuesta inmunitaria protectora en un vertebrado frente a E. coli enterotoxigénica (ETEC).