ES2244182T3 - Bacterias atenuadas por una mutacion no reversible en cada uno de los genes aroc, ampf y ompc, utiles como vacunas. - Google Patents
Bacterias atenuadas por una mutacion no reversible en cada uno de los genes aroc, ampf y ompc, utiles como vacunas.Info
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Abstract
Una bacteria atenuada por medio de una mutación knock- out no reversible en cada uno de los genes aroC, los genes ompF y los genes ompC, donde la bacteria es del género Escherichia, Salmonella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella o Brucella.
Description
Bacterias atenuadas por una mutación no
reversible en cada uno de los genes aroC, ompF y ompC,
útiles como vacunas.
La presente invención se refiere a bacterias
atenuadas útiles en vacunas.
El principio de apoyo de la vacunación es inducir
una respuesta inmune en el huésped, proporcionando así protección
contra la estimulación subsiguiente con un patógeno. Esto puede ser
logrado por la inoculación con una cepa atenuada viva del patógeno,
es decir una cepa que tiene virulencia reducida de tal modo que la
misma no provoque la enfermedad provocada por el patógeno
virulento.
Clásicamente, las cepas de vacunas atenuadas
vivas de las bacterias y los virus han sido seleccionadas
utilizando una de dos metodologías diferentes. Los mutantes han
sido creados ya sea por el tratamiento del organismo utilizando
compuestos químicos mutagénicos o por el paso repetido del organismo
in vitro. Sin embargo, el uso de cualquier método ocasiona
cepas atenuadas en las cuales el modo de atenuación es poco claro.
Estas cepas son particularmente difíciles de caracterizar en
términos de la inversión posible a la cepa del tipo silvestre
porque la atenuación puede reflejar eventos de mutación únicos
(reversible fácilmente) o múltiples. Además, es difícil obtener
tales cepas que tienen propiedades inmunogénicas a causa de los
eventos de mutación múltiple, y las cepas múltiples puede ser
necesario que se utilicen para proporcionar protección contra el
patógeno.
Utilizando técnicas genéticas modernas, ahora es
posible construir genéticamente cepas bacterianas atenuadas
definidas en las cuales se pueden crear deleciones de atenuación
estable. Un número de mutantes dirigidos al sitio de la Salmonella
han sido creados utilizando este tipo de tecnología (2, 4, 5, 9, 12,
16, 17, 18). Las mutaciones en un gran número de genes se ha
reportado que van a ser atenuantes, incluyendo los genes aro (por
ejemplo aroA, aroC, aroD y aroE), pur, htrA, ompR, ompF,
ompC, galE, cya, crp y phoP.
Los mutantes de aroA de la Salmonella
ahora han sido bien caracterizados y se ha mostrado que van a ser
vacunas vivas excelentes contra la salmonelosis en varias especies
de animales. Además, para reducir las probabilidades de una
inversión de la virulencia por un evento recombinante, se han
introducido mutaciones en dos genes independientes tales
aroA/purA y aroA/aroC. Las mutaciones idénticas en
las cepas adaptadas del huésped de Salmonella tales como S.
typhi (hombre) y S. dublin (ganado vacuno) también han
conducido a la creación de un número de vacunas de dosificación
única candidatas, las cuales han tenido un éxito probado en los
ensayos clínicos (8, 11) y los ensayos en el campo (10).
Una cepa de Salmonella typhimurium que
colecta mutaciones estables tanto en ompC como opmF
se describe en Chatfield y colaboradores (1991, ref. 21). Cuando se
administra oralmente a los ratones de BALB/c la cepa fue atenuada,
con la dosis letal al 50% (LD50) reducida en aproximadamente 1,000
veces. Sin embargo, la LD50 intravenosa se redujo solamente en
aproximadamente 10 veces, demostrando la importancia de las porinas
que confieren a las bacterias la capacidad de infección por la ruta
oral.
La expresión de los genes de ompC y
ompF es regulada por ompR. Pickard y colaboradores
(1994, ref. 13) describe la clonación del operón de ompB, que
comprende los genes de ompR y envZ, de un banco de
cósmidos Ty2 de Salmonella typhi y la caracterización por el
análisis de la secuencia del ADN. Los datos de la secuencia del ADN
se utilizaron para identificar los sitios de restricción apropiados
para la generación de una deleción definida de 517 pb dentro del
marco de lectura abierta del gen de ompR. Esta deleción se
introdujo por la recombinación homologa en los cromosomas de las dos
cepas de S. typhi las cuales ya colectaron las deleciones
definidas en los genes tanto de aroC como de aroD.
Los limitantes de opmR de S. typhi exhibieron una
reducción marcada en la expresión de la porina de ompC y
ompF como se demostró por el examen de las preparaciones de
la membrana externa. También se mostró que el sistema regulador de
dos componentes de opmR-envZ desempeña un
papel importante en la regulación de la síntesis de los
polisacáridos de Vi en S. typhi.
En los estudios de animales, el S.
typhimurium atenuado ha sido utilizado como un vehículo para el
suministro de los antígenos heterólogos al sistema inmune (3, 6,
15). Esto eleva el potencial de desarrollo de las vacunas
multivalentes para su uso en el ser humano (7).
La invención proporciona una bacteria atenuada
por una mutación no reversible en cada uno del gen de aroC,
el gen de ompF y el gen de ompC, en donde la bacteria
es del género Escherichia, Salmonella, Vibrio, Haemophilus,
Neisseria, Yersinia, Bordetella o Brucella. La invención
también proporciona una vacuna que contiene la bacteria.
Se cree que la combinación de
aroC/ompF/ompC de las mutaciones da una vacuna que tiene
propiedades superiores. Por ejemplo, se cree que la combinación de
aroC/ompF/ompC puede ser superior a una combinación de
aroC/ompR por dos razones:
1. La mutación de ompR puede provocar
niveles más elevados de atenuación que la combinación de
ompF/ompC de las de mutaciones a causa de que el ompR
puede regular un número genes diferentes del ompF y el
ompC los cuales son importantes para la supervivencia de la
bacteria in vivo. Por consiguiente, la combinación de
ompF/ompC puede permitir que las bacterias sobrevivan en
el huésped vacunado durante un intervalo de tiempo más prolongado
y a niveles más elevados, conduciendo a una mejor
protección.
2. La mutación de opmR puede provocar una
inmunogenicidad reducida comparado con la combinación de
ompF/ opmC de las mutaciones a causa de que el
ompR puede regular la expresión de los antígenos
importantes para la inmunogenicidad.
Las bacterias que son utilizadas para fabricar
las vacunas de la invención son generalmente aquellas que provocan
la infección por la vía oral. Las bacterias pueden ser aquellas que
invaden y crecen dentro de las células eucarióticas y/o colonizan
las superficies mucosas. Las bacterias son generalmente
Gram-negativas.
Las bacterias pueden ser del género de
Escherichia, Salmonella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria,
Yersinia, Bordetella o Brucella. Los ejemplos de tales
bacterias son Escherichia coli - una causa de diarrea en los
seres humanos; Salmonella typhimurium - la causa de la
salmonelosis en varias especies de animales; Salmonella
typhi - la causa de la fiebre tifoidea humana; Salmonella
enteritidis - una causa del envenenamiento por los alimentos en
los seres humanos, Salmonella choleraesuis - una causa de la
salmonelosis en los cerdos; Salmonella dublin - una causa de
la enfermedad tanto sistémica cono diarréica en el ganado vacuno,
especialmente de los terneros recién nacidos; Haemophilus
influenza - una causa de meningitis; Neisserie
gonorrhoeae - una causa de la gonorrea; Yersinia
enterocolitica - la causa de un espectro de enfermedades en los
seres humanos que varía desde la gastroenteritis hasta la
enfermedad septicémica fatal; Bordetella pertussis - la causa
de la tos ferina; y Brucella abortus - una causa del aborto
y la infertilidad en el ganado vacuno y una condición conocida como
fiebre de Malta en los seres
humanos.
humanos.
Las cepas de E. coli y Salmonella
son particularmente útiles en la invención. Así como son vacunas
por derecho propio contra la infección por Salmonella, la
Salmonella atenuada puede ser utilizada como un portador de
antígenos heterólogos desde otros organismos hasta el sistema
inmunológico por medio de la ruta oral. La Salmonella es un
inmunógeno potente y es capaz de estimular las respuestas celulares
y de los anticuerpos tanto locales como sistémicas. Los sistemas
para impulsar la expresión de los antígenos heterólogos en la
Salmonella in vivo ya son conocidos; por ejemplo los
promotores de nirB y htrA se sabe que van a ser
impulsores efectivos de la expresión de los antígenos in
vivo.
La invención puede ser aplicada al E.coli
enterotoxigenico ("ETEC"). El ETEC es una
clase de E.coli que provoca la diarrea. Las mismas colonizan
el intestino delgado próximo. Una cepa de ETEC estándar es ATCC
H10407.
Las infecciones del ETEC son la causa única más
frecuente de la diarrea de los viajeros, provocando
3-9 millones de casos por año entre los visitantes a
los países en desarrollo. En las áreas endémicas, las infecciones
por ETEC son una causa importante de diarrea deshidratante en
infantes y niños pequeños, conduciendo a 800,000 muertes en un año
en los cinco continentes. En los países en desarrollo, la
incidencia de infecciones por ETEC que conducen a enfermedades
clínicas se reduce con la edad, indicando que la inmunidad a la
infección por ETEC puede ser adquirida. En contraste, los adultos
nativos de los países industrializados que visitan las áreas
endémicas son altamente susceptibles a las infecciones provocadas
por ETEC. Sin embargo, con las visitas prolongadas o repetidas a
las áreas endémicas, la susceptibilidad a las infecciones provocadas
por ETEC disminuye, sugiriendo que un enfoque atenuado viviente
para la vacunación contra ETEC puede ser un éxito.
Los inventores eligieron trabajar sobre una cepa
no toxigénica del ETEC llamada E1392/75/2A. La E1392/75/2A surgió
espontáneamente de un imitante tóxico por deleción de los genes de
toxina. En los estudios humanos, la vacunación oral con la
E1392/75/2A viva dio 75% de protección contra la estimulación con la
ETEC que expresa la toxina de un serotipo diferente. Sin embargo,
aproximadamente 15% de los vacunados experimentaron diarrea como un
efecto lateral de la vacuna. La cepa necesita atenuación adicional
para reducir los efectos laterales antes de que la misma pueda ser
considerada como una vacuna potencial y la invención proporciona un
medio de lograr tal atenuación. La Sec. Id No. 1 muestra la
secuencia del gen aroC de E. coli, la Sec. Id No. 3
muestra la secuencia del gen de ompC de E. coli y la
Sec. Id. No. 5 muestra la secuencia del gen omp de E.
coli.
Una o más mutaciones adicionales pueden ser
introducidas en las bacterias de la invención para generar cepas que
contienen mutaciones además de aquellas en aroC, ompC y
ompF. Tal mutación adicional puede ser (i) una mutación de
atenuación en un gen diferente de aroC, ompC y ompF,
(ii) una mutación para proporcionar la selección in vivo
para las células que mantienen un plásmido (por ejemplo un plásmido
que expresa un antígeno heterólogo), o (iii) una mutación para
prevenir la expresión de un gen de toxina.
La mutación con atenuación adicional puede ser
una mutación que ya se sabe que va a ser atenuante. Tales
mutaciones incluyen las mutaciones en los genes aro (por ejemplo
aroA, aroD y aroE), pur, htrA, ompR, galE, cya,
crp, phoP y surA (véanse por ejemplo las referencias 2,
4, 5, 9, 12, 13, 16, 17 y 18).
Una mutación para proporcionar la selección para
el mantenimiento de un plásmido se puede hacer mutando un gen que
es esencial para que sobreviva la bacteria. Un plásmido que lleva el
gen esencial es introducido entonces en la bacteria de modo que
solamente las células que llevan el plásmido puedan sobrevivir. Esto
puede ser útil en donde el plásmido contiene, por ejemplo, un
antigeno heterólogo que va a ser expresado por la bacteria.
Una mutación para prevenir la expresión de un gen
de toxina se puede hacer para reducir cualesquiera efectos laterales
provocados por la vacunación con la bacteria. Por ejemplo, en el
caso de la vacunación con las cepas de E.coli tales como
ETEC, puede ser deseable mutar los genes de la toxina lábil
en caliente (LT) o de la toxina estable en caliente (ST) de modo
que los mismos no sean expresados.
Las mutaciones introducidas en la vacuna
bacteriana dejan fuera de combate totalmente la función del gen.
Esto puede lograrse ya sea aboliendo la síntesis de cualquier
polipéptido en su totalidad desde el gen o haciendo una mutación
que conduzca a la síntesis del polipéptido no funcional. Para abolir
la síntesis del polipéptido, ya sea el gen completo o su extremo
5' pueden ser delecionados. Una deleción o inserción dentro de
la secuencia de codificación de un gen puede ser utilizada para
crear un gen que sintetiza solamente el polipéptido no funcional
(por ejemplo el polipéptido que contiene solamente la secuencia
N-terminal de la proteína del tipo salvaje).
Las mutaciones son mutaciones no reversibles.
Estas mutaciones que esencialmente no muestran inversión, regresan
al tipo salvaje cuando la bacteria es utilizada como una vacuna.
Tales mutaciones incluyen inserciones y deleciones. Las inserciones
y deleciones son preferentemente grandes, típicamente de al menos 10
nucleótidos de longitud, por ejemplo desde 10 hasta 600
nucleótidos. Preferentemente, la secuencia de codificación total es
delecionada.
La bacteria utilizada en la vacuna contiene
preferentemente solo mutaciones definidas, es decir mutaciones que
están caracterizadas. Es claramente no deseable utilizar como
vacuna una bacteria que tenga mutaciones no caracterizadas en su
genoma, porque podría existir un riesgo de que las mutaciones no
caracterizadas pueden conferir propiedades sobre la bacteria que
provoquen efectos colaterales indeseables.
Las mutaciones de atenuación pueden ser
introducidas por métodos bien conocidos por aquellos expertos en la
técnica (véase la ref. 14). Los métodos apropiados incluyen la
clonación de la secuencia de ADN del gen del tipo salvaje en un
vector, por ejemplo un plásmido, y la inserción en un marcador
seleccionable en la secuencia de ADN clonada o la deleción de una
parte de la secuencia de ADN, conduciendo a su inactivación. Una
deleción puede ser introducida, por ejemplo, por el corte de la
secuencia de ADN utilizando las enzimas de restricción que realizan
el corte en dos puntos o justo fuera de la secuencia de codificación
y ligando o uniendo conjuntamente los dos extremos en la secuencia
remanente. Un plásmido que lleva la secuencia de ADN inactivada
puede ser transformado en la bacteria por técnicas bien conocidas
tales como electroporación y conjugación. Entonces es posible por
una selección adecuada, identificar un mutante en donde la
secuencia de ADN inactivada se ha recombinado en el cromosoma de la
bacteria y la secuencia de ADN del tipo salvaje se ha vuelto no
funcional por recombinación homóloga.
La bacteria atenuada de la invención puede ser
diseñada genéticamente para expresar un antígeno que no es
expresado por la bacteria natural o silvestre (un "antígeno
heterólogo"), de modo que la bacteria atenuada actúa como un
portador del antígeno heterólogo. El antígeno puede ser de otro
organismo, de modo que la vacuna proporcione protección contra el
otro organismo. Puede producirse una vacuna multivalente, que no
solamente proporciona inmunidad contra el origen virulento de la
bacteria atenuada sino también proporciona inmunidad contra el otro
organismo. Además, la bacteria atenuada puede ser diseñada para
expresar más de un antígeno heterólogo, en tal caso los antígenos
heterólogos pueden ser de los mismos organismos o de diferentes
organismos.
El antígeno heterólogo puede ser una proteína
completa o una parte de una proteína que contiene un epitope. El
antígeno puede ser de otra bacteria, un virus, una levadura o un
hongo. Más especialmente, la secuencia antigénica puede ser de
E.coli (por ejemplo ETEC), tétanos, virus de la
hepatitis A, B o C, rinovirus humano tal como del tipo 2 o
del tipo 14, virus del herpes simplex, poliovirus del tipo 2
o 3, virus de la enfermedad aftosa, virus de la influenza, virus
de Coxsackie o Chlamydia trachomatis. Los antígenos útiles
incluyen componentes no tóxicos de la toxina lábil en caliente de
E. coli, antígenos K88 de E. coli, antígenos del
factor de colonización de ETEC, la proteína P.69 de B.
pertussis y el fragmento C de la toxina del tétanos. Los
factores de colonización de ETEC y los componentes del mismo
son candidatos principales para la expresión como antígenos
heterólogos. Para inducir la enfermedad diarreica, las cepas
patógenas de ETEC deben ser capaces de colonizar el
intestino y elaborar enterotoxinas. La mayoría de las cepas de los
factores de colonización de ETEC (CF) que son requeridas
para la adhesión a la mucosa intestinal han sido identificadas. En
casi todos los casos los CFs son expresados como fimbrillas o
franjas sobre la superficie externa de la bacteria. Un gran número
de CFs ha sido identificado, los más prevalecientes son
CFAI, CRAII (incluye CS1, CS2, CS3) y CFAIV (incluye
CS4, CS5, CS6).
Una vacuna para ETEC idealmente
proporcionará protección contra una gama de antígenos del factor de
colonización para asegurar que se obtenga la protección contra las
diferentes cepas. Para lograr esto, podría ser posible expresar
varios factores de colonización en una cepa. Alternativamente, las
mismas atenuaciones se podrían hacer en una gama de diferentes
cepas de ETEC, cada una con un factor de colonización
diferente. Esto podría involucrar la deleción de las toxinas de
tales cepas.
El ADN que codifica el antígeno heterólogo es
expresado desde un promotor que es activo in vivo. Dos
promotores que se ha mostrado que trabajan bien en la Salmonella
son el promotor de nirB (19, 20) y el promotor de htrA
(20). Para la expresión de los antígenos del factor de colonización
de ETEC, se podrían utilizar promotores del tipo
silvestre.
Una construcción de ADN que comprende el promotor
enlazado operativamente al ADN que codifica el antígeno heterólogo
se puede fabricar y transformar en la bacteria atenuada utilizando
técnicas convencionales. Los agentes de transformación que
contienen la construcción de ADN pueden ser seleccionados, por
ejemplo eligiendo un marcador seleccionable sobre la construcción.
Las bacterias que contienen la construcción se pueden hacer crecer
in vitro antes de ser formulada para la administración al
huésped para propósitos de vacunación.
La vacuna puede ser formulada utilizando técnicas
conocidas para la formulación de vacunas bacterianas atenuadas. La
vacuna es presentada ventajosamente para la administración oral, por
ejemplo en una forma encapsulada liofilizada. Tales cápsulas pueden
ser provistas con un recubrimiento entérico que comprende, por
ejemplo, Eudragate "S" (Marca Registrada), Eudragate
"L" (Marca Registrada), acetato de celulosa, ftalato de
celulosa o hidroxipropilmetil celulosa. Estas cápsulas
pueden ser utilizadas como tales, o alternativamente, el material
liofilizado puede ser reconstituido previo a la administración, por
ejemplo como una suspensión. La reconstitución es efectuada
ventajosamente en una solución amortiguadora a un pH adecuado para
asegurar la viabilidad o factibilidad de la bacteria. Para proteger
la bacteria atenuada y la vacuna de la acidez gástrica, una
preparación de bicarbonato de sodio es administrada ventajosamente
antes de cada administración de la vacuna. Alternativamente, la
vacuna puede ser preparada para administración parenteral,
administración intranasal o administración intramuscular.
La vacuna puede ser utilizada en la vacunación de
un huésped de mamífero, particularmente un huésped humano pero
también un huésped de animal. Una infección provocada por un
microorganismo, especialmente un patógeno, puede ser prevenida por
lo tanto por la administración de una dosis efectiva de una vacuna
preparada de acuerdo con la invención. La dosificación empleada será
por último a discreción del médico que proporciona la atención,
pero dependerá de varios factores que incluyen el tamaño y el peso
del huésped y el tipo de vacuna formulada. Sin embargo, una
dosificación que comprende la administración oral desde 10^{7}
hasta 10^{u} bacterias por dosis puede ser conveniente para un
huésped humano adulto de 70 kg.
Los Ejemplos descritos en esta sección sirven
para ilustrar la invención.
La Figura 1 muestra un sistema para la
construcción de deleciones definidas en los genes de blanco u
objetivo utilizando el empalme por mutagénesis de PCR de extensión
superpuesta.
La Figura 2 muestra las secuencias esperadas de
los genes de blanco u objetivo después de la recombinación y
selección para las deleciones.
La Figura 3 muestra la clonación de los casetes
de deleción en el plásmido pCVD442.
La Figura 4 muestra un análisis de
SDS-PAGE de las membranas externas
preparadas a partir de las cepas de ETEC bajo las condiciones
de osmolaridad baja (caldo sin la sal L) y elevada (caldo sin la
sal L + 15% de sucrosa). M = marcadores; Muestra 1 = PTL010;
Muestra 2 = PTL002; Muestra 3 = PTL003; Muestra 4 =
\DeltaaroC\DeltaompC; Muestra 5 =
\DeltaompF.
La Figura 5 muestra la expresión de CS1 y
CS3 en las cepas de deleción después del crecimiento sobre
el agar de CFA. Números iguales de las células de cada cepa
fueron cargados sobre un gel de SDS-PAGE al
15% y manchado de Western con anticuerpos policlonales de
anti-CSl o anti-CS3
monoespecíficos. Los controles para la especificidad del anticuerpo
fueron lisados de células enteras de células TG1 que
expresan la proteína de pilina principal de CS1, o la
proteína de pilina principal purificada de CS3. La franja M,
los marcadores de masa molecular baja de arcoiris; franja 1,
células de TG1 inducidas que colectan la pKK223;
franja 2, células de TGI inducidas que colectan la
PKKcsl; franja 3, cepa de CS1-ETEC;
franja 4, PTL010; franja 5, PTL001; franja 6,
PTL002; franja 7, PTL003; franja 8, proteína de
pilina principal de CS3 purificada.
La Figura 6 muestra un manchado de Southern del
sitio mutante. El ADN cromosómico fue extraído del ETEC del
tipo salvaje (E1392/75-2A), PTL001 (htrA aroC),
PTL002 (aroC ompR) y PTL003 (aroC ompC ompF) como se
indicó, digerido con la endonucleasa de restricción EcoRV, y
el campo pulsado sometido a electroforesis por medio de agarosa al
1%. El ADN fue transferido desde el gel sobre membranas de
Hybond N+ nilón (Amersham) y se hibridizó con las sondas de
ADN derivadas de los sitios de aroC, htrA, ompR, ompC, u
ompF como es mostrado. Las configuraciones de las bandas o
franjas son consistentes con el sitio mutante que son las
deleciones.
La Figura 7 muestra las respuestas de IgA
en voluntarios administrados con una vacuna de acuerdo con la
invención.
Las deleciones fueron diseñadas para remover el
marco de lectura abierta completo del gen de blanco u objetivo.
Utilizando la secuencia del genoma de E. coli como un
molde, los cebadores de PCR fueron diseñados para amplificar los
fragmentos de 500-600 pares base que flanquean el
marco de lectura abierta de blanco u objetivo (véase la Tabla 1
para las secuencias del cebador) . El empalme por la extensión
superpuesta utilizando la PCR se utilizó para fusionar las dos
secuencias de flanqueo, creando un producto de PCR con el gen
completo delecionado (Figura 1). Las secuencias del tipo silvestre
alrededor del sitio de deleción y las secuencias predichas después
de la deleción son mostradas en la Figura 2.
Para cada gen se introdujeron dos sitios de
restricción diferentes en la región de empalme (véase la Tabla 2
posterior). Estos fueron utilizados para la identificación de los
clones para la deleción. Los cebadores de PCR en cualquier extremo
del fragmento de PCR introdujeron sitios de restricción única que
son utilizados para clonar el fragmento en el sitio de clonación
múltiple del pCVD442 (Figura 3).
Los productos de PCR fueron purificados por
gelificación utilizando un juego o conjunto de extracción con gel y
se digirió con las enzimas de restricción relevantes previo al
ligamiento o unión al plásmido suicida pCVD442(22)
digerido con la misma enzima y tratado con la fosfatasa alcalina
para prevenir el autoligamiento del vector (Figura 3). La mezcla de
ligamiento se transformó en SY327^pir y se colocó en placas
sobre placas de L-Ampicilina (100 jxg/ml)-.
Los plásmidos de los transformantes resistentes a la Ampicilina
fueron elegidos para verificar la presencia de los casetes de
deleción por la digestión de restricción. Se generaron los
siguientes plásmidos:
El plásmido suicida pCVD442 solamente
puede replicarse en las células que colectan el gen pir.
Durante la introducción en las cepas diferentes de pir, el
pCVD442 es incapaz de replicarse, y la resistencia a la
Ampicilina conferida por el plásmido solamente puede ser mantenida
si el plásmido es integrado en el cromosoma por un evento
recombinante homólogo único. El plásmido también tiene un gen de
sacB, que codifica la sucrasa de levan, la cual es tóxica
para las bacterias gram negativas en la presencia de la sucrosa.
Este puede ser utilizado para seleccionar clones que han padecido
un segundo evento recombinante, en el cual el plásmido es
escindido. Tales células serán resistentes a la sucrosa, pero
sensibles a la Ampicilina.
Esta sección describe la cronología de la
construcción y la historia de una cepa de
\DeltaAroC\DeltaOmpC\DeltaOmpF. En la
sección, "ETEC" se refiere específicamente a la cepa
E1392/75/2A o sus derivados.
Las deleciones de
\DeltaAroC\DeltaOmpC\DeltaOmpF fueron
introducidas en E1392/75/2A en el siguiente orden:
\DeltaAroC \rightarrow
\DeltaAroC\DeltaOmpC \rightarrow
\DeltaAroC\DeltaOmpC\DeltaOmpF
1) El E1392/75/2A del material en
almacenamiento en microbancos, original, se colocó en placas sobre
L-Agar.
2) Las células competentes por
electroporación fueron preparadas a partir de estas células. Se
congelaron alícuotas de 100 jal.
3) El pCVD\DeltaAroC se purificó a
partir de las células de SY327pir utilizando un midiprep
de Qiagen Qiafilter (Nombre Registrado). El plásmido se
concentró aproximadamente 10 veces por precipitación con etanol. La
construcción de pCVD\DeltaAroC es como se describió
anteriormente.
4) 5 jal del plásmido concentrado se mezclaron
con 100 jal de las células descongeladas y se sometieron a
electroporación. La transformación completa se colocó en placas
sobre una placa de L-Ampicilina (50 jag/ml) y
se incubó toda la noche a 37ºC.
5) Creció una sola colonia resistente a la
Ampicilina.
6) La colonia se marcó con rayas sobre una plana
de L-Ampicilina (100 \mug/ml) y se hizo
crecer toda la noche a 37ºC ("placa merodiploide").
7) La PCR utilizando los cebadores TT19 y TT20
(específicos para el gen de aroC) y una colonia recuperada de las
dos bandas amplificadas de la placa merodiploide, con tamaños que
corresponden a aquellos del tipo silvestre y los genes de
\DeltaaroC. Las secuencias de los cebadores se muestran en la
Tabla 1 que se da posteriormente.
8) Una colonia de la placa merodiploide se hizo
crecer durante 7 horas en a) caldo de
L-Ampicilina (100 \mug/ml) y b) Caldo L. La
colonia que se hizo crecer sobre L-Ampicilina se
colocó un microbancos o microcubetas.
9) Las diluciones en serie de los cultivos del
caldo L fueron establecidos sobre:
- a)
- agar-L L sin sal
- b)
- agar-L sin sal + 5% de sucrosa.
Las placas fueron incubadas toda la noche a
30ºC.
10) Los conteos de la colonia mostraron que
10^{4} colonias más crecieron sobre L-agar que
sobre L-agar + 5% de sucrosa, que muestra la
selección de sucrosa trabajada.
11) Las colonias resistentes a la sucrosa fueron
elegidas para verificar la presencia del gen \DeltaaroC
por PCR. Las colonias elegidas para la selección fueron
recuperadas o colocadas sobre una placa de agar-L y
se hicieron crecer toda la noche a 37ºC. Esta placa se almacenó a
4ºC, mientras que se llevan a cabo pruebas adicionales.
12) 50% de las 90 colonias probadas tuvieron el
\DeltaaroC solamente.
13) Las colonias fueron probadas para
verificar su crecimiento sobre:
- a)
- placas del medio mínimo M-9
- b)
- placas del medio mínimo M-9 + Aromix
- c)
- L-amp (100 \mug/ml)
Las colonias de \DeltaaroC no deben
crecer sobre el medio mínimo de M-9 sin
Aromix o sobre L-Amp. Aromix es una
mezcla de los compuestos aromáticos como sigue
| Substancia | Concentración final (% p/v) |
| Fenilalanina | 0.004 |
| Triptófano | 0.004 |
| Tirosina | 0.004 |
| Ácido p-aminobenzoico | 0.001 |
| Ácido dihidroxibenzoico | 0.001 |
Estos compuestos están hechos en bacterias del
tipo silvestre, pero la mutación de aro previene su síntesis.
14) Las 13/14 colonias de \DeltaAroC
supuestas requirieron Aromix para el crecimiento sobre un
medio mínimo de M-9 y fueron susceptibles a la
Ampicilina.
15) 3 colonias (Nos. 1,2,3) fueron probadas para
verificar la presencia del gen de la proteína pilina principal
mayor de CS1 por PCR utilizando los cebadores MGR169 y MGR170.
Todas las tres colonias dieron los productos de PCR del
tamaño esperado (700 pb). Las secuencias de los cebadores se
muestran en la Tabla 1.
16) Las colonias 1, 2 y 3 de la selección de la
placa maestra se colocaron en forma de rayas sobre
L-Agar y se hicieron crecer toda la noche a
37ºC. Las células de estas placas se utilizaron para inocular los
tubos de los microbancos.
17) La colonia 1, almacenada en un microbanco, se
utilizó para trabajo adicional.
18) Para almacenamiento permanente, una perla de
la bandeja del microbanco se inoculó en 1 mi del
caldo-L, se hizo crecer durante 4 horas con
agitación a 37ºC y se utilizó para hacer declives de agar los
cuales se utilizaron para fabricar materiales en almacenamiento
secos congelados. Los materiales secos congelados de
E1392/75/2A\DeltaAroC se designaron PTL004. 20
mi del caldo L se agregaron al resto del 1 mi del cultivo y
el cultivo se incubó toda la noche a 30ºC. 1 mi del cultivo de toda
la noche se transfirió a cada una de las tres crioampollas y se
almacenó en nitrógeno líquido.
Una colonia del SY327X,pir que colecta el
pCVD\DeltaOmpc se hizo crecer toda la noche a 37ºC en 100
mi del caldo de Ampicilina-L (100 \mug/ml).
El ADN del plásmido se purificó utilizando 2 midipreps de Qiagen
Qiafilter (Nombre Registrado). El ADN se concentró
adicionalmente por precipitación con etanol. La construcción del
pCVD\Deltaompc se describió anteriormente.
Las células de ETEC\DeltaAroC de la
bandeja de microbancos producida en el paso 17 de la sección
precedente se colocaron como fajas o bandas sobre
L-agar, se hicieron crecer a 37ºC toda la
noche y luego se almacenaron a 4ºC durante no más de 1 semana antes
de ser utilizadas para inocular cultivos para la preparación de
células electrocompetentes.
3) Las células de ETEC\DeltaAroC se
sometieron a electroporación con 5 \mul de ADN de
pCVD\DeltaOmpc concentrado, y cada transformación se
colocó en placas sobre una placa de
L-Ampicilina única (50 \mug/ml) y se hizo
crecer toda la noche a 37ºC.
4) 17 colonias resistentes a la ampicilina
(merodiploides de ETEC\DeltaAroC/pCVD\DeltaOmpC supuestos)
fueron obtenidas.
5) Estas colonias se transfirieron como puntos
sobre una placa de L-Ampicilina maestra (100
\mug/ml) y se utilizaron como moldes para PCR con los
cebadores TT7/TT8. La placa maestra se hizo crecer a
temperatura ambiente el fin de semana. Las secuencias de los
cebadores se dan en la Tabla 1 posterior.
6) Una sola colonia (No. 7) tuvo el gen de
\DeltaompC.
7) La colonia se hizo crecer durante 5 horas en
el caldo L.
8) Las diluciones en serie del cultivo del caldo
L se establecieron sobre:
- a)
- agar-L sin sal
- b)
- agar-L sin sal + 5% de sucrosa
Las placas se incubaron toda la noche a 30ºC.
9) Los conteos de las colonias mostraron que
10^{4} más colonias crecieron sobre el L-agar
que sobre L-agar + 5% de sucrosa, mostrando que
la selección de sucrosa trabajó.
10) 45 colonias resistentes a la sucrosa fueron
seleccionadas para \DeltaompC por PCR utilizando los
cebadores TT7 y TT8. 9 colonias tuvieron el gen de
\DeltaompC, pero la mayoría tuvieron trazas del gen de
ompC de w.t. Las secuencias de los cebadores son provistas en la
Tabla 1 posterior.
11) Para caracterizar adicionalmente las
colonias de ETEC\DeltaAroC\DeltaOmpC, las mismas se hicieron
crecer en 1 mi de Caldo-L durante 5 horas y se
colocaron en placas sobre:
- a)
- L-Agar + 100 jag/ml de Ampicilina
- b)
- L-Agar
- c)
- L-Agar + 5% de sucrosa
Las colonias de \DeltaOmpC deben ser
resistentes a la sucrosa y sensibles a la Ampicilina.
12) Solamente 1 colonia (No. 1) fue
sensible a la Ampicilina y resistente a la sucrosa.
13) La colonia 1 se verificó para detectar la
presencia de los genes de \DeltaaroC, \DeltaompC
y CS1 por PCR con los cebadores TT19/TT20, TT7/TT8 y MGR169
y 170. Las secuencias de los cebadores se dan en la Tabla 1
posteriormente.
14) La colonia 1 dio productos de PCR sencillos
del tamaño esperado para los genes de \DeltaaroC,
\DeltaompC y CS1.
15) La colonia fue colocada en microbancos.
16) Para el almacenamiento permanente, una
perla del microbanco se inoculó en 1 mi del
caldo-L, se hizo crecer durante 4 horas con
agitación a 37ºC y se utilizó para hacer declives de agar los
cuales son secados por congelamiento o deshidratados por
aspersión. Los materiales deshidratados por aspersión de
E1392/75/2A\DeltaaroC\DeltaOmpC se designaron
PTL008. 20 mi del caldo-L se regaron
al resto del 1 mi del cultivo y el cultivo se incubó toda la
noche a 30ºC. 1 mi del cultivo toda la noche se transfirió a cada
una de las tres crioampollas y se almacenó en nitrógeno líquido.
Se utilizó la conjugación para introducir el
pCVD\Delta0mpF en el
1392/75/2A\DeltaAroC\DeltaOmpC.
1) Las células donadoras SM10>.pir
de conjugación se transformaron con pCVD\DeltaOmpF. La
construcción del pCVD\DeltaOmpF del plásmido es como se
describió anteriormente.
2) Las células de
ETEC\DeltaAroC\DeltaOmpC se conjugaron con las células
SM10\lambdapil pCVD\DeltaOmpF. El plásmido pCVD
442 incluye un origen de transferencia el cual permite que
el plásmido sea transferido desde una cepa donadora que contiene
los genes de transferencia RP4 (por ejemplo
SM10\lambdapir) a una cepa receptora (por ejemplo ETEC).
Las células de ETEC\DeltaAroC\DeltaOmpC y la cepa
SM10\lambdapir del E.coli que colecta la
Pcvd\DeltaompF recombinante fueron colocadas como rayas
cruzadas sobre las placas de L-agar para cubrir un
área de aproximadamente 10 cm^{2}. Las placas fueron incubadas a
37ºC durante 20 h, luego el material que creció se retiró por lavado
utilizando 4 mi del caldo L y la suspensión se colocó en placas
sobre agar de McConkey (Difco) que contiene la estreptomicina a 20
fig mi-^{1} y la ampicilina a 300 \muq
mi-^{1}. Las placas fueron incubadas toda la noche
a 37ºC y las colonias resultantes fueron verificadas para
merodiploidia por PCR utilizando los oligonucleotidos apropiados
como cebadores.
3) Los materiales transconjugantes de ETEC
supuestos fueron seleccionados. 10 colonias fueron retiradas de las
placas de agar de MacConkey y se hicieron crecer toda la noche
sobre L-Ampicilina (100 \mug/ml) agar. La
presencia del gen de \DeltaompF se verificó por PCR con los
cebadores TT1/TT2. Las secuencias de los cebadores se dan en la
Tabla 1 posterior.
4) Las colonias se hicieron crecer durante 5
horas en el caldo-L.
5) Las diluciones en serie del cultivo del
caldo-L se establecieron sobre:
- a)
- agar-L sin sal
- b)
- agar-L sin sal + 5% de sucrosa
Las placas se incubaron toda la noche a 30ºC.
6) Los conteos de la colonia mostraron 10^{5}
más colonias que crecieron sobre L-agar que sobre
L-agar + 5% de sucrosa, que muestra la selección de
la sucrosa trabajada.
7) Las colonias resistentes a la sucrosa fueron
seleccionadas para el gen \DeltaompF por PCR con los
cebadores de TT1/TT2. Las secuencias de los cebadores se dan en la
Tabla 1 posterior. Las colonias seleccionadas se hicieron crecer
toda la noche sobre L-Agar. 3 Colonias de 47
tuvieron el gen de \DeltaompF sin evidencia del gen de ompF del
tipo silvestre.
8) Para caracterizar adicionalmente las colonias
de ETEC\DeltaAroC\DeltaOmpC\DeltaOmpF supuestas, las
mismas se colocaron sobre:
- a)
- L-Agar + 100 \mug/ml de Ampicilina
- b)
- L-Agar
- c)
- L-Agar + 5% de sucrosa
Las colonias de \DeltaompF deben ser
resistentes a la sucrosa y sensibles a la Ampicilina.
9) Todas las tres colonias de \DeltaompF
fueron sensibles a la Ampicilina y resistentes a la sucrosa.
10) Las colonias fueron colocadas en microbancos
y una colonia se eligió como una materia prima maestra.
11) Para el almacenamiento permanente, una perla
de la materia prima maestra se inoculó en 1 m del caldo L, se hizo
crecer durante 4 horas con agitación a 37ºC y se utilizó para
fabricar pendientes o declives de agar los cuales son utilizados
para fabricar materiales deshidratados por aspersión. Los materiales
deshidratados por aspersión de E1392/75/2A
\DeltaaroC\DeltaompC\DeltaompF se designaron PTL003. 20 mi
del caldo L se agregaron al resto del 1 mi de cultivo y el cultivo
se incubó toda la noche a 30ºC. 1 mi del cultivo de toda la noche
se transfirió a cada una de las tres crioampollas y se almacenó en
nitrógeno líquido.
Las células tomadas de la materia prima maestra
producida en el paso 10 de la sección precedente se colocaron como
rayas sobre la placa de agar-L. Al mismo tiempo se
inocularon 8 mi del caldo L para una preparación de ADN cromosómico
para los manchados de Southern. Tanto el cultivo de la placa como el
cultivo líquido se hicieron crecer toda la noche a 37ºC.
Las células de la placa de crecimiento se
colocaron en forma de rayas sobre el siguiente medio y se hicieron
crecer toda la noche a 37ºC.
| Medio | Crecimiento |
| L-Amp | No |
| Medio mínimo de M9 | No |
| M9 mínimo + Aromix | Sí |
| M9 + sulfatiazol (100 \mug/ml) | No |
| M9 + sulfatizol (100 \mug/ml) + Aromix | Sí |
| L-Agar + 50 \mug/ml de estreptomicina | Sí |
| L-Agar + 5% de sucrosa | Sí |
Como se esperaba, las células fueron sensibles a
Amp. Las células fueron resistentes a la sucrosa, estreptomicina y
sulfatiazol, pero requirieron Aromix para el crecimiento sobre el
medio mínimo.
a) Un ampolla deshidratada por aspersión de
PTL003 se abre rompiéndola. El cultivo se vuelve a suspender
en Caldo-L y se coloca en placas sobre
L-Agar para el crecimiento. Algunas células fueron
retiradas por raspado y almacenadas en microbancos.
b) Más células fueron retiradas por raspado y
se analizó el perfil de LPS. No existió diferencia visible entre el
perfil de LPS de PTL003 y la cepa E1392/75/2A
original.
a) un raspado de las células se tomó de la placa
hecha en 2a y se colocó en forma de rayas sobre
L-Agar y se hizo crecer toda la noche.
b) Las células que han crecido recientemente
se utilizaron para PCR con los cebadores que flanquean los
siguientes genes: aroC, htrA, ompC, ompF y ompR.
c) El PTL003 se mostró que tiene
deleciones en los genes de aroC, ompC y ompF, pero no en
htrA u ompR.
Las fracciones de la proteína de la membrana
externa se prepararon a partir de las cepas PTL010
(E1392/75/2A) y las cepas de deleción PTL002 y
PTL003. Una cepa con una deleción de ompF única y una
cepa con las deleciones tanto de aroC como de ompC
también fueron analizadas. Las cepas se hicieron crecer bajo
condiciones de osmolaridad baja (caldo-L sin sal) y
osmolaridad elevada (caldo-L sin sal + 15% de
sucrosa). El producto de la proteína de OmpF es expresado
normalmente a osmolaridad baja mientras que el producto de
OmpC es expresado a una osmolaridad elevada. Las proteínas de
OmpC y OmpF tienen movilidades electroporéticas
similares. A osmolaridades tanto elevadas como bajas, la cepa
PTL003 carece de proteínas en la región de OmpC/OmpF
cuando se compara con la cepa de E1392/75/2A del tipo
silvestre o con las cepas de deleción de
\DeltaaroC\DeltaompC o \DeltaompF. Los
resultados se muestran en la Figura 4.
La expresión de los pilus de CS1 y
CS3 en las de deleción fue examinada. Números iguales (2
unidades de AeoomJ de las cepas PTL010, PTL001, PTL002
y PTL003 de las bacterias que se hicieron crecer toda la
noche a 37ºC sobre agar CFA se sometieron a CDS PAGE
y se analizaron por manchado de Western con anticuerpos
monoclonales monoespecíficos contra CS1 o CS3. Los pilus de CS1 y
CS3 fueron expresados igualmente bien en cuatro cepas (Figura
5).
Un derivado negativo de CFAII de
E1392/75/2A se construyó para su uso como un control. Esto
se hizo por el curado especifico del CS que codifica los plásmidos
de la cepa E1392/75/2A de ETEC. Un fragmento corto del ADN se
amplificó a partir del gen cooB utilizando PCR con los
oligonucleótidos CSA01 y CSA02 como los cebadores y se ligaron en
el vector del plásmido pGEM-T Easy (Nombre
Registrado, Promega) diseñados para la clonación de los productos
de PCR. El fragmento se subclonó en pCVD442 en virtud de los
sitios de la enzima de restricción de Salí y Sphl. El derivado de
pCVD442-cooB se introdujo en la cepa
E1392/75/2A de ETEC por la conjugación desde
SM10\lambdaApir. Los materiales transconjugantes
resistentes a la ampicilina es muy probable que sean el resultado de
la fusión del derivado de pCVD442-cooB con el
plásmido que lleva el cooB. Tales materiales transconjugados se
hicieron crecer entonces sobre L-agar suplementado
con sucrosa al 5% para seleccionar la pérdida del gen sacB
de pCVD442. Las colonias resultantes fueron probadas para
verificar la sensibilidad de la ampicilina, y por PCR utilizando
CSA01 y CSA02 como los cebadores. Tres colonias de
E1392/75/2A fueron incluidas como controles positivos entre
estos PCRs. Dos colonias resistentes a la sucrosa que no dieron el
producto con la PCR fueron colocados en forma de rayas sobre
L-agar fresco suplementado con 5% de sucrosa para
obtener cultivos puros. Estos se hicieron crecer en el caldo L a
37ºC durante aproximadamente 16 h y se colocaron en microbancos a
-70ºC. La pérdida del CS1 que codifica el plásmido se confirmó por
análisis de los perfiles del plásmido de los derivados utilizando
la electrofóresis del gel de agarosa. Dos derivados fueron
confirmados como negativos de CS1, pero fueron todavía
CS3+.
Estructura de las mutaciones por deleción. El ADN
total se extrajo de los cultivos de los tres mutantes de deleción
que se hicieron crecer a partir de los materiales colocados en
microbancos, se digirieron con la endonucleasa de restricción
EcoRV, y el ADN digerido se sometió a electroforesis de gel
de agarosa de campo pulsante. El ADN se transfirió como manchas
desde los geles sobre membranas de nilón Hybond N+ (Marca
Registrada) y se hibridizó con las sondas de ADN apropiadas de
acuerdo con los procedimientos estándares. Los resultados (Figura
6) muestran que la hibridación de los fragmentos del ADN
cromosómico de los mutantes son más cortos que los del tipo
silvestre, consistente con las mutaciones que son deleciones.
Confirmación de la ausencia de los genes de la
toxina Estable con Calentamiento (ST) y Lábil con Calentamiento
(LT) en la cepa E1392/75/2A de E.coli. Para esto los genes
de ST y LT-AB fueron utilizados como las sondas de
ADN contra el ADN total a partir de E1392/75/2A. El ADN total de la
cepa E1393/75 de ETEC positiva para la toxina estuvo incluido como
un control positivo, mientras que aquel de la cepa JM109 de
E.coli de laboratorio estuvo incluido como un control
negativo. Las membranas hibridizadas fueron dejadas bajo
Hyperfilm-ECL (Marca Registrada) durante 1 h para
obtener la cantidad máxima de la señal. Las sondas fueron
preparadas utilizando PCR con el ADN del plásmido extraído de
E1392/75/2A como molde y EST01 y EST02 de los oligonucleotidos como
los cebadores para ST, o LT-R1 y
LT-03 para LT-AB. No existió
hibridación significativa con el ADN total utilizando la sonda ya
sea de LT-AB o de ST, a pesar de obtener una señal
muy intensa desde el ADN total del control positivo.
Confirmación de la ausencia de las secuencias de
pCVD442 del cromosoma de los mutantes de deleción. El pCVD442 del
plásmido se etiquetó y se hibridizó hasta el ADN total de los
mutantes de deleción PTL001, PTL002 y PTL003 digeridos con EcoRV. El
ADN total de la cepa E1392/75/2A de ETEC se incluyó como un
control. Una configuración compleja de la hibridación de los
fragmentos de ADN fue obtenida. Pero, no existió diferencia
significativa entre la configuración obtenida para el tipo
silvestre y aquella para los mutantes, indicando que probablemente
la secuencia de nucleótidos de pCVD442 no residual fue dejada en
los genomas de los mutantes. La configuración compleja de los
fragmentos de hibridación fue más probablemente debido a la sonda
de pCVD442 que se hibridiza con los componentes de ADN del plásmido
de la cepa de E1392/75/2A y los derivados mutantes.
| Gen de objetivo | Sitios utilizados para la | Sitios introducidos | ||
| clonación en pCVD4 42 | para propósitos de selección | |||
| Sitio 1 | Sitio 2 | Sitio 3 | Sitio 4 | |
| AroC | Xbal | Sacl | Xhol | Sphl |
| HtrA | Sall | Sphl | Xhol | Xbal |
| OmpC | Sall | Sacl | Blpl | Xhol |
| OmpF | Sacl | Sphl | Blpl | Xhol |
| OmpR | Sall | Sacl | Blpl | Sphl |
El estudio se diseñó para evaluar una cepa de la
vacuna atenuada viva candidata del E.coli enterotoxigénica,
especialmente el PTL003 de \DeltaaroC/\DeltaompC/\DeltaompF
descrito anteriormente.
La cepa bacteriana se colocó en chapas sobre agar
de MacConkey para verificar la pureza y para la confirmación
de la identidad, y 5 colonias se utilizaron para inocular un
recipiente que contiene 200 mi de caldo de luria. Después de 8
horas de incubación a +37ºC, se agregan 30 mi de glicerol estéril al
cultivo del caldo y se prepararon alícuotas (1 mi por ampolleta).
Un ciento de tales ampolletas fueron congeladas a -70ºC. Estas
ampolletas constituyeron el lote de siembra para la cepa de la
vacuna.
La pureza del lote de siembra se aseguró
seleccionando diez ampolletas al azar, y probándolas para verificar
la pureza bacteriana y la libertad o exención de los hongos. Unas
tres ampolletas adicionales fueron probadas para determinar el
número de las bacterias en las ampolletas utilizando métodos de
conteo estándares de la placa con diluciones en serie del caldo de
cultivo.
La vacuna se preparó recientemente previo a cada
vacunación y todos los pasos en la preparación del inoculo se
llevaron a cabo en un gabinete de seguridad. El día previo a la
vacunación, 0.2 mi se difunden o dispersan en la superficie de las
placas de agar de luria utilizando torundas de algodón estéril para
preparar el pasto de las bacterias. El mismo caldo de cultivo se
colocó en forma de rayas sobre las placas de agar de MacConkey y
luria para verificar la pureza. Las placas de agar se incubaron a
37ºC durante 18 horas en un recipiente sellado con una tapa
indicadora resistente al uso indebido para asegurar que las placas
no fueran utilizadas indebidamente durante la incubación. Después
de la incubación, el pasto de las bacterias se colectó con 5 mi de
solución salada amortiguada con fosfato, estéril (PBS), y la
densidad óptica de la suspensión se midió. El volumen apropiado de
esta suspensión, que corresponde a la dosis deseada, fue colocada
entonces en botellas de dosificación unitaria con 30 mi de solución
amortiguadora de bicarbonato y se administraron a los voluntarios.
Una dosis extra de la vacuna se preparó y se dejó en el laboratorio,
e inmediatamente después que los voluntarios han sido vacunados el
número real de bacterias en cada dosis de la vacuna se legitimó
utilizando procedimientos de conteo de las colonias estándares con
diluciones de diez veces para la vacuna.
El procedimiento para diluir las bacterias se
estableció durante los estudios preliminares utilizando los
cultivos del ``pasto o césped preparados y se incubaron exactamente
como se hizo para las preparaciones de vacuna administradas a los
voluntarios. Las suspensiones se hicieron y el número de bacterias
disponibles se enumeró por los conteos de colonias de las diluciones
en serie y se relacionó con la densidad óptica determinada. Con
base en estos estudios preliminares, se desarrolló un procedimiento
estándar para preparar y validar las diluciones correctas de las
bacterias para dar las dosis establecidas.
Una solución amortiguadora que consiste de
bicarbonato de sodio en agua fue utilizada. Para cada dosis de la
vacuna se prepararon 150 mi del agua desionizada que contiene 2
gramos de bicarbonato de sodio y el filtro se esterilizó. 30 mi de
la solución amortiguadora se colocaron en ampolletas estériles de
50 mi y la dosis de las bacterias de la vacuna se agregó a estas
ampolletas. Los restantes 120 mi de la solución amortiguadora se
colocaron en botellas estériles separadas. En el tiempo de la
vacunación, los voluntarios fueron administrados primero con 120 mi
de la solución amortiguadora, luego un minuto más tarde, 30 mi de
la solución amortiguadora que contiene la vacuna.
Los grupos de voluntarios fueron estudiados en de
una manera escalada en cuanto a la dosis. El primer grupo de
voluntarios recibió una dosis de aproximadamente 5x10^{7}
bacterias, el segundo una dosis de aproximadamente 5x10^{9} y el
tercer grupo una dosis de aproximadamente 5x10^{8}.
A los voluntarios se les proporcionó
Ciprofloxacina 500 mg BID durante tres días empezando en el día 4.
Los mismos fueron descargados en el día 6, habiendo tenido una
selección de hematología y química por razones de seguridad. El
suero fue guardado para la medición de anticuerpos.
En los días 9 y 14 los voluntarios regresaron
para continuar con visitas de pacientes externos, tiempo en el cual
se hizo una historia interna y se obtuvo una muestra de sangre para
los ensayos serológicos. En total, la sangre (40 ml) se colectó
para serología tres veces, previo a la vacunación y el día 9 y el
día 14 después de la vacunación.
Hasta dos especímenes fecales fueron cultivados
cada día mientras que los voluntarios estuvieron en el hospital.
Para cultivos cualitativos, una torunda fecal se colocó en el medio
de transporte de Cary Blair y se tomó para el laboratorio en donde
los mismos se inocularon directamente sobre agar de MacConkey y
sobre agar de MacConkey que contiene antibióticos selectivos para la
cepa de la vacuna. Hasta cinco colonias se mostró que van a estar
aglutinadas utilizando antisueros específicos para la cepa de la
vacuna. Para el cultivo cuantitativo (primer espécimen de cada día
solamente) los especímenes fecales fueron pesados y diluidos en
PBS, con diluciones de 10 veces en serie hasta 10^{-4}, y luego
100 \mul de cada dilución se rociaron o dispersaron sobre agar de
MacConkey con los antibióticos. Las colonias sospechosas fueron
confirmadas por aglutinación con suero anti-O.
El suero se colectó y se guardó para el ensayo
subsiguiente para verificar la presencia de los anticuerpos contra
los antígenos de CFA II por ELISA y los anticuerpos bactericidas
contra la cepa de la vacuna.
Las células mononucleares de la sangre
periféricas fueron separadas de la sangre entera colectada en el
citrato y se lavaron. Estas células fueron cultivadas a una
densidad de 10^{7} células por mi en el medio de cultivo del
tejido de RPMI a 37ºC durante 48 horas. Después de 48 horas el
sobrenadante se transfirió a una crioampolleta y se congeló a -20ºC
hasta que el mismo pudiera ser evaluado para verificar la presencia
de los anticuerpos de IgG e IgA para CFA II por ELISA.
| Día (el día de la vacunación es el día 0) | pr | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 9 | 14 |
| Reclinación | X | ||||||||||
| HCG (orina) | X | X | |||||||||
| Entrenamiento/ consentimiento | X | ||||||||||
| Permanencia del paciente | X | X | X | X | X | X | X | X | |||
| Vacunación | X | ||||||||||
| Visita de paciente externo | X | X | X | ||||||||
| Herramientas-cultivos | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X | |
| Herramientas-cultivos | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X | |
| Serología | X | X | X | ||||||||
| Panel de CBC/Química | X | X | |||||||||
| Ciprofloxacina 500 mg BID | X | X | X |
No se observó ningún síntoma en todas las dosis
reales de 6.8 x 10^{7} y 3.7 x 10^{8} cfu. A la dosis más
elevada de 4.7 x 10^{9} 1/6 de los voluntarios experimentó
diarrea y 2/6 tuvieron calambres abdominales suaves. El
esparcimiento bacteriano fue observado en todos los voluntarios al
nivel de la dosis de 5x10^{9} cfu el desde día 1 posvacunación,
hasta que, como por el protocolo, la ciprofloxacina se empezó el
día 4 después de la vacunación. Esto indica la colonización
intestinal buena, lo cual es indicativo del potencial para inducir
una buena respuesta inmune. A las dos dosis más bajas, la cepa de
la vacuna se recuperó de todos los voluntarios sobre al menos un
punto del tiempo a continuación de la vacunación pero la duración de
la excreción se redujo comparado con aquella observada a la dosis
más elevada.
En el instante de la presentación de la
solicitud, el análisis de las respuestas inmune generadas por la
vacuna estuvo incompleto. Sin embargo, las respuestas de
anti-CFA II de IgA en los sobrenadantes del cultivo
del PBMNC purificados a partir de la sangre de los pacientes o
receptores de la dosis más elevada de la vacuna en el día 0 (antes
de la vacunación) y los días 7 y 10 posvacunación han sido
analizados (véase la Figura 7). Los sobrenadantes fueron analizados
por ELISA sobre las placas de ensayo recubiertas con el antigeno de
CFA II purificado. Los valores de OL observados de las muestras del
día 7 y el día 10 fueron significativamente más elevados que
aquellos de las muestras de prevacunación, demostrando la inducción
de una respuesta de IgG especifica en estos puntos del tiempo. Como
se esperaba, las respuestas muestran un pico en el día 7 y son
reducidas en el día 10, consistente con la guía del IgA cebado que
secreta las células B desde la sangre hasta los sitios efectores
mucosales del Tejido Linfoide Asociado con el Intestino.
La cepa viva atenuada de ETEC
(\DeltaaroC/\DeltaompC/\DeltaompF) se ha mostrado que va a
ser bien tolerada en voluntarios adultos sanos y que coloniza el
intestino de una manera consistente con su utilidad como una vacuna
oral para la protección contra la diarrea de los viajeros. También
se ha demostrado la producción de una respuesta inmune mucosal
especifica.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: PEPTIDE THERAPEUTICS LIMITED
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 100 Fulbourn Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Cambridge
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: no disponible
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): CB1 9PT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: BACTERIAS ATENUADAS ÚTILES EN VACUNAS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADORA: compatible con IBM PC
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- NÚMERO DE LA SOLICITUD:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1690 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: aroC de E. coli
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 492..1562
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 356 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1713 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ompC de E.coli
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 491..1594
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 367 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1808 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ompF de E.coli
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 457..1545'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 362 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\hskip0.5cm
\hskip0.5cm
Claims (13)
1. Una bacteria atenuada por medio de una
mutación knock-out no reversible en cada uno de los
genes aroC, los genes ompF y los genes ompC,
donde la bacteria es del género Escherichia, Salmonella, Vibrio,
Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella o
Brucella.
2. Una bacteria según la reivindicación 1 que es
una cepa de Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Salmonella
typhi, Salmonella enteritidis, Salmonella choleraesuis, Salmonella
dublin, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorroheae, Yersinia
enterocolitica, Bordetella pertussis o Brucella
abortus.
3. Una bacteria según la reivindicación 2, que es
una cepa de E.coli enterotoxigénica (ETEC).
4. Una bacteria según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que está además atenuada mediante una
mutación en un cuarto gen.
5. Una bacteria según la reivindicación 4, donde
el cuarto gen es aroA, aroD, aroE, pur, htrA, galE, cya, crp,
phoP o surA.
6. Una bacteria según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde la mutación en cada gen es una
mutación definida.
7. Una bacteria según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde la mutación de cada gen es el
borrado de la secuencia de codificación completa.
8. Una bacteria según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que ha sido diseñada mediante
ingeniería genética para expresar un antígeno heterólogo.
9. Una bacteria según la reivindicación 8, donde
la expresión del antígeno está impulsada por el promotor nirB
o el promotor htrA.
10. Una vacuna que comprende una bacteria según
se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un
portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
11. Una bacteria según se define en cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9 para utilizar en un método de vacunación
humana o animal.
12. Una célula E. coli enterotoxigénica
según la reivindicación 3, para utilizar en un método de vacunación
humana o animal contra la diarrea.
13. Utilización de una bacteria según se define
en una de las reivindicaciones 1 a 9 para la fabricación de un
medicamento para la vacunación humana o animal.
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