ES2277363T3

ES2277363T3 - Proteinas antimicrobianas.

Info

Publication number: ES2277363T3
Application number: ES97948648T
Authority: ES
Inventors: John Michael Manners; John Paul Marcus; Kenneth Clifford Goulter; Jodie Lyn Green; Neil Ivan Bower
Original assignee: University of Queensland UQ
Current assignee: University of Queensland UQ
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-22
Publication date: 2007-07-01
Anticipated expiration: 2017-12-22
Also published as: CA2274730A1; AUPO427596A0; US20030171274A1; NZ336337A; DE69736904T2; EP1006785B1; CN1244769A; WO1998027805A1; BR9713772A; US20020168392A1; EP1006785A4; KR20000057699A; EP1006785A1; US7067624B2; DE69736904D1; JP2001510995A; ATE343927T1

Abstract

Fragmento de proteína con actividad antimicrobiana, en el que dicho fragmento de proteína se selecciona de entre los siguientes: (i) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre: restos 29 a 73 de SEC. ID. nº: 1 restos 74 a 116 de SEC. ID. nº: 1 restos 117 a 185 de SEC. ID. nº: 1 restos 186 a 248 de SEC. ID. nº: 1 restos 29 a 73 de SEC. ID. nº: 3 restos 74 a 116 de SEC. ID. nº: 3 restos 117 a 185 de SEC. ID. nº: 3 restos 186 a 248 de SEC. ID. nº: 3 restos 1 a 32 de SEC. ID. nº: 5 restos 33 a 75 de SEC. ID. nº: 5 restos 76 a 144 de SEC. ID. nº: 5 restos 145 a 210 de SEC. ID. nº: 5 restos 34 a 80 de SEC. ID. nº: 7 restos 81 a 140 de SEC. ID. nº: 7 restos 33 a 79 de SEC. ID. nº: 8 restos 80 a 119 de SEC. ID. nº: 8 restos 120 a 161 de SEC. ID. nº: 8 restos 32 a 91 de SEC. ID. nº: 21 restos 25 a 84 de SEC. ID. nº: 22 restos 29 a 94 de SEC. ID. nº: 24 restos 31 a 85 de SEC. ID. nº: 25 restos 1 a 23 de SEC. ID. nº: 26 restos 1 a 17 de SEC. ID. nº: 27 restos 1 a 28 de SEC.ID. nº: 28 (ii) un polipéptido que contiene un espaciamiento de cisteína relativo C-2X-C-3X-C-nX-C-3X-C-3X-C, en el que X es cualquier resto de aminoácidos distinto de la cisteína, C es cisteína y n es 11 ó 12; (iii) un polipéptido que contiene un espaciamiento de cisteína relativo Z-2X-C-3X-C-nX-C-3X-C-3X-Z y la tirosina/fenilalanina, en el que X es cualquier resto de aminoácidos distinto de la cisteína, C es cisteína, Z es tirosina o fenilalanina y n es 11 ó 12; (iv) un polipéptido que contiene un espaciamiento de cisteína relativo C-3X-C-nX-C-3X-C-, en el que X es cualquier resto de aminoácido distinto de la cisteína; C es cisteína y n es 11 ó 12; (v) un polipéptido con el mismo espaciamiento de los restos con carga positiva en relación con el espaciamiento de los restos de cisteína que (i).

Description

Proteínas antimicrobianas.

Campo técnico

La presente invención se refiere a proteínas aisladas que ejercen actividad inhibidora sobre el crecimiento de hongos y bacterias, incluyendo dichos hongos y bacterias algunos patógenos microbianos de plantas y animales. La invención se refiere asimismo a genes recombinantes que incluyen secuencias que codifican la proteínas antimicrobianas, cuyos productos de expresión de los genes recombinantes pueden contribuir a la defensa de las células vegetales o de células de otros organismos contra la invasión de patógenos microbianos.

Antecedentes de la técnica

Las enfermedades microbianas de plantas son un problema significativo para las industrias agrícola y hortícola. Las enfermedades de las plantas producen en general anualmente millones de toneladas de pérdidas de cosechas siendo las enfermedades micóticas y bacterias responsables de partes significativas de estas pérdidas. Una posible manera de combatir las enfermedades micóticas y bacterianas consiste en proporcionar plantas transgénicas capaces de expresar una proteína o proteínas que de alguna manera aumentan la resistencia de la planta al ataque patógeno. Una estrategia sencilla consiste en identificar en primer lugar una proteína con actividad antimicrobiana in vitro, clonar la secuencia de ADN que codifica la proteína, preparar un constructo del gen híbrido para la expresión eficaz de la proteína en las plantas, transferir este gen a las plantas transgénicas y evaluar el efecto del gen introducido sobre la resistencia a los patógenos microbianos por comparación con las plantas de referencia.

La primera y más importante etapa en la estrategia para el control de la enfermedad descrita anteriormente consiste en identificar una proteína con actividad antimicrobiana potente. En los últimos años, se han identificado y descrito muchas proteínas vegetales diferentes con actividad antimicrobiana y/o antimicótica. Estas proteínas han sido clasificadas en varias clases según su modo de acción supuesto y/o sus homologías de secuencia de aminoácidos. Estas clases incluyen las siguientes: quitinasas (Roberts, W. K. et al. [1986] Biochim. Biophys. Acta 880:161-170); \beta-1,3-glucanasas (Manners, J. D. et al. [1973] Phytochemistry 12:547-553); tioninas (Bolmann, H. et al. [1988] EMBO J. 7:1559-1565 y Fernández de Caleya, R. et al. [1972] Appl. Microbiol. 23:998-1000); permatinas (Roberts, W. K. et al. [1990] J. Gen. Microbiol. 136:1771-1778 y Vigers, A. J. et al. [1991] Mol. Plant-Microbe Interact. 4:315-323); proteínas inactivadoras de ribosomas (Roberts, W. K. et al. [1986] Biochim. Biophys. Acta 880:161-170 y Leah, R. et al. [1991] J. Biol. Chem. 266:1564-1573); defensinas vegetales (Terras, F. R. G. et al. [1995] The Plant Cell 7:573-588); proteínas que se unen a la quitina (De Bolle, M. F. C. et al. [1992] Plant Mol. Biol. 22:1187-1190 y Van Parijs, J. et al. [1991] Planta 183:258-264); proteínas similares a la taumatina o similares a la osmotina (Woloshuk, C. P. et al. [1991] The Plant Cell 3:619-628 y Hejgaard, J. [1991] FEBS Letts. 291:127-131); proteínas de tipo PR1 (Niderman, T. et al. [1995] Plant Physiol. 108:17-27); y proteínas no específicas de transferencia de lípidos (Terras, F. R. G. et al. [1992] Plant Physiol. 100:1055-1058 y Molina, A. et al. [1993] FEBS Letts. 3166:119-122). Otra clase de proteínas antimicrobianas procedentes de las plantas es la knottina o las proteínas antimicrobianas similares a la knottina (Cammue, B. P. A. et al. [1992] J. Biol. Chem. 67:2228-2233; Broekaert W. F. et al. (1997) Crit. Rev. In Plant Sci. 16(3):297-323). Una clase de proteínas antimicrobianas denominadas proteínas 4-cisteína se ha descrito asimismo en la bibliografía cuya clase incluye la Proteína Básica del Maíz (MBP-1) (Duvick J. P. et al. [1992] J. Biol. Chem. 267:18114-18120). Una nueva proteína antimicrobiana que no se ajusta a ninguna clase de proteínas antimicrobianas descrita anteriormente se ha aislado asimismo de las semillas de Macadamia integrifolia denominada MiAMP1 (Marcus J.P. et al. [1997] Eur. J. Biochem. 244:743-749). Además, las plantas no son la única fuente de proteínas antimicrobianas y existen muchos informes del aislamiento de proteínas antimicrobianas de animales y de células microbianas (estudiado en Gabay, J. E. [1994] Science 264:373-374 y en "Antimicrobial peptides" [1994] CIBA Foundation Symposium 186, John Wiley y Sons Publ., Chichester, UK).

Existen pruebas de que la expresión ectópica de los genes que codifican proteínas que presentan actividad antimicrobiana in vitro en plantas transgénicas puede producir una mayor resistencia a patógenos microbianos. Ejemplos de esta resistencia manipulada genéticamente incluyen las plantas transgénicas que expresan genes que codifican: una quitinasa vegetal, ya sea sola (Broglie, K. et al. [1991] Science 254:1194-1197) o en combinación con una \beta-1,3-glucanasa (Van den Elzen, P. J. M. et al. [1993] Phil. Trans. Roy. Soc. 342:271-278); una defensina vegetal (Terras, F. R. G. et al. [1995] The Plant Cell 7:573-588); una proteína similar a la osmotina (Liu, D. et al. [1994] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1888-1892); una proteína de la clase PR1 (Alexander, D. et al. [1993] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7327-7331) y una proteína que inactiva ribosomas (Logemann, J. et al. [1992] Bio/Technology 10:305-308).

Aunque la utilización potencial de proteínas antimicrobianas para modificar genéticamente la resistencia a la enfermedad en plantas transgénicas ha sido descrita de manera exhaustiva, existen otras aplicaciones que son dignas de mención. En primer lugar, pueden utilizarse proteínas antimicrobianas muy potentes para el control de enfermedades de plantas por aplicación directa (De Bolle, M. F. C. et al. [1993] en Mechanisms of Plant Defence Responses, B. Fritig y M. Legrand eds., Kluwer Acad. Publ., Dordrecht, NL, págs. 433-436).

Las proteínas antimicrobianas presentan una variedad de estructuras tridimensionales que determinarán en gran parte la actividad que manifiestan. Muchas de estas estructuras globales presentadas por estas proteínas han sido determinadas (Broekaert W. F. et al. (1997) Crit. Rev. in Plant Sci. 16(3):297-323). Un factor en la determinación de la estabilidad de estas proteínas es la presencia de puentes disulfuro entre varias cisteínas situadas en las zonas de la hélice \alpha y de la hoja \beta. Muchos péptidos con actividad tóxica tales como la conotoxina son bien conocidos por estar estabilizados por puentes disulfuro (véase por ejemplo Hill, J. M. et al. (1996) Biochemistry 35(27):8824-8835). En el caso de la conotoxina citada anteriormente, se forma una estructura compacta constituida por una hélice, una pequeña horquilla, una cis-hidroxiprolina y varias espiras. La molécula está estabilizada por tres puentes disulfuro, dos de los cuales están conectados a la hélice \alpha y a la hoja \beta, formando un núcleo estructural sólido. Cabe destacar que ocho cadenas laterales con arginina y lisina en esta molécula se proyectan en el disolvente en una orientación radial con respecto al núcleo de la molécula. Estas cadenas laterales catiónicas forman puntos potenciales de interacción con puntos aniónicos en las membranas patógenas (Hill, J. M. et al., supra).

La invención descrita en la presente memoria constituye proteínas no descubiertas anteriormente y por tanto nuevas proteínas con actividad antimicrobiana. Estas proteínas pueden aislarse de semillas de Macadamia integrifolia (Mi) o de semillas del algodón o del cacao. Además, los fragmentos de proteína que son antimicóticos pueden proceder de almacenamiento en semillas mayores que contienen zonas de similitud sustancial a las proteínas antimicrobianas de macadamia descritas en la presente memoria. Ejemplos de proteínas de almacenamiento en semillas que contienen zonas similares a las proteínas que han sido purificadas pueden observarse en la Figura 4. Macadamia integrifolia pertenece a la familia de las Proteáceas. M. integrifolia, conocida también como Bauple Nut (avellano de Australia) o Queensland Nut (nuez de Australia), es considerada por algunos como la mejor nuez comestible del mundo. El algodón (Gossypium hirsutum) pertenece a la familia de las Malváceas y se cultiva extensamente por su fibra. El cacao (Theobroma cacao) pertenece a la familia de las Esterculiáceas y se utiliza en todo el mundo para una amplia variedad de productos del cacao.

El hecho de que las proteínas antimicrobianas tanto de macadamia como del cacao se encuentren en partes comestibles de estas plantas hace atractivos a estos péptidos para su utilización en ingeniería genética por resistencia a las enfermedades ya que las plantas transgénicas que expresan estas proteínas es improbable que presenten más toxicidad.

Sumario de la invención

Según una primera forma de realización de la invención, se proporciona un fragmento de proteína con actividad antimicrobiana, en el que dicho fragmento de proteína se selecciona de entre los siguientes:

: (i) un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre:

: restos 29 a 73 de la SEC. ID. nº: 1

: restos 74 a 116 de SEC. ID. nº: 1

: restos 117 a 185 de SEC. ID. nº: 1

: restos 186 a 248 de SEC. ID. nº: 1

: restos 29 a 73 de SEC. ID. nº: 3

: restos 74 a 116 de SEC. ID. nº: 3

: restos 117 a 185 de SEC. ID. nº: 3

: restos 186 a 248 de SEC. ID. nº: 3

: restos 1 a 32 de SEC. ID. nº: 5

: restos 33 a 75 de SEC. ID. nº: 5

: restos 76 a 144 de SEC. ID. nº: 5

: restos 145 a 210 de SEC. ID. nº: 5

: restos 34 a 80 de SEC. ID. nº: 7

: restos 81 a 140 de SEC. ID. nº: 7

: restos 33 a 79 de SEC. ID. nº: 8

: restos 80 a 119 de SEC. ID. nº: 8

: restos 120 a 161 de SEC. ID. nº: 8

: restos 32 a 91 de SEC. ID. nº: 21

: restos 25 a 84 de SEC. ID. nº: 22

: restos 29 a 94 de SEC. ID. nº: 24

: restos 31 a 85 de SEC. ID. nº: 25

: restos 1 a 23 de SEC. ID. nº: 26

: restos 1 a 17 de SEC. ID. nº: 27

: restos 1 a 28 de SEC. ID. nº: 28

(ii): un polipéptido que contiene un espaciamiento de C-2X-C-3X-C-nX-C-3X-C-3X-C relacionado con la cisteína, en el que X es cualquier resto de aminoácidos distinto de la cisteína, C es cisteína y n es 11 ó 12;

(iii): un polipéptido que contiene un espaciamiento de Z-2X-C-3X-C-nX-C-3X-C-3X-Z relacionado con la cisteína y la tirosina/fenilalanina, en el que X es cualquier resto de aminoácidos distinto de la cisteína, C es cisteína, Z es tirosina o fenilalanina y n es 11 ó 12''.

(iv): un polipéptido que contiene un espaciamiento de C-3X-C-nX-C-3X-C- relacionado con la cisteína, en el que X es cualquier resto de aminoácido distinto de la cisteína; C es cisteína y n es 11 ó 12.

(v): un polipéptido con el mismo espaciamiento de restos con carga positiva en relación con el espaciamiento de restos de cisteína que (i); y

Según la segunda forma de realización de la invención, se proporciona una proteína que contiene por lo menos un fragmento de polipéptido según la primera forma de realización, en la que dicho fragmento de polipéptido presenta una secuencia seleccionada de entre una secuencia que comprende SEC. ID. nº: 1, SEC. ID. nº: 3 o SEC. ID. nº: 5.

Según una tercera forma de realización de la invención, se proporciona una proteína que presenta una secuencia seleccionada de entre SEC. ID. nº: 1, SEC. ID. nº: 3 o SEC. ID. nº: 5.

Según una cuarta forma de realización de la invención, se proporciona un ADN aislado o sintético que codifica una proteína según la primera forma de realización.

Según una quinta forma de realización de la invención, se proporciona un constructo de ADN que incluye un ADN según la cuarta forma de realización unido funcionalmente a elementos para la expresión de dicha proteína codificada.

Según una sexta forma de realización de la invención, se proporciona una planta transgénica que alberga un constructo de ADN según la quinta forma de realización.

Según una séptima forma de realización de la invención, se proporciona material reproductivo de una planta transgénica según la sexta forma de realización.

Según una octava forma de realización de la invención, se proporciona una composición que comprende una proteína antimicrobiana según la primera forma de realización junto con un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde un punto de vista agrícola.

Según una novena forma de realización de la invención, se proporciona una composición que comprende una proteína antimicrobiana según la primera forma de realización junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Según una décima forma de realización de la invención, se proporciona un procedimiento de control de la infestación microbiana de una planta, comprendiendo dicho procedimiento:

i): tratar dicha planta con una proteína antimicrobiana según la primera forma de realización o con una composición según la octava forma de realización; o

ii): introducir un constructo de ADN según la quinta forma de realización en dicha planta.

La solicitud da a conocer asimismo un procedimiento de preparación de una proteína antimicrobiana, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

a): obtener o diseñar una secuencia de aminoácidos que forme una estructura hélice-espira-hélice;

b): sustituir los restos individuales para conseguir sustancialmente la misma distribución de restos con carga positiva y de restos de cisteína como en una o más de las secuencias de aminoácidos mostradas en la Figura 4;

c): sintetizar una proteína que comprende dicha secuencia de aminoácidos químicamente o por técnicas de ADN recombinante en cultivo líquido; y

d): si fuera necesario, formar enlaces disulfuro entre dichos restos de cisteína.

Otras formas de realización de la invención incluyen procedimientos para producir proteína antimicrobiana.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 presenta los resultados de la cromatografía de intercambio catiónico de la fracción de proteína básica de un extracto de Macadamia integrifolia con los resultados de un bioanálisis de actividad antimicrobiana mostrados para las fracciones en la zona de elución de MiAMP2c.

La Figura 2 presenta los resultados de la inclusión de Ca^{2+} 1 mM en un bioanálisis paralelo de las fracciones procedentes de la separación por intercambio catiónico.

La Figura 3 presenta un perfil de HPLC en fase inversa de fracciones muy inhibidoras que contienen MiAMP2c procedente de la separación por intercambio catiónico en las Figuras 1 y 2 junto con el % de inhibición del crecimiento presentado por las fracciones de HPLC.

La Figura 4 presenta las secuencias de aminoácidos de MiAMP2a, b, c y d y los fragmentos de proteína procedentes de otras proteínas de almacenamiento en semilla que contienen zonas de homología con la serie MiAMP2 de proteínas antimicrobianas.

La Figura 5 presenta un ejemplo de una secuencia nucleotídica sintética que puede utilizarse para la expresión y la secreción de MiAMP2c en plantas transgénicas.

La Figura 6 presenta la alineación de los clones 1 a 3 de macadamia que contienen las subunidades de MiAMP2a, b, c y d junto con la secuencia de las proteínas de almacenamiento de la semilla de vicilina del cacao y del algodón que presentan homología significativa con los clones de macadamia.

La Figura 7 presenta una serie de predicciones de la estructura secundaria de MiAMP2c.

La Figura 8 presenta un modelo tridimensional de la proteína MiAMP2c.

La Figura 9 presenta geles de SDS-PAGE teñidos de fracciones de proteína en varias etapas en la expresión y la purificación de TcAMP1 (subunidad 1 de Theobroma cacao), MiAMP2a, MiAMP2b, MiAMP2c y MiAMP2d expresadas en cultivo líquido de E. coli.

La Figura 10 presenta la purificación por HPLC en fase inversa de la subunidad 2 (TcAMP2) tras la etapa de purificación inicial utilizando medio Ni-NTA.

La Figura 11 representa una transferencia Western de los extractos de proteína en bruto de varias especies vegetales utilizando antisuero de conejo producido contra MiAMP2c.

La Figura 12 presenta un fraccionamiento por intercambio catiónico de la fracción de proteína básica de Stenocarpus sinuatus junto con la transferencia Western adjunta que presenta la presencia de proteínas relacionadas inmunológicamente en un intervalo de fracciones.

La Figura 13 presenta una separación por HPLC en fase inversa de fracciones de intercambio catiónico de Stenocarpus sinuatus que había reaccionado previamente con anticuerpos de MiAMP2c (véase la Figura 14). Se presenta asimismo una transferencia Western que pone de manifiesto la presencia de homólogos supuestos de MiAMP2c en fracciones individuales de HPLC.

La Figura 14 es una cartografía del vector binario pPCV91-MiAMP2c como ejemplo de un vector que puede utilizarse para expresar estas proteínas antimicrobianas en plantas transgénicas.

La Figura 15 presenta una transferencia Western para detectar MiAMP2c expresada en plantas de tabaco transgénicas.

Mejor modo y otros modos de poner en práctica la invención

En adelante se utilizan las abreviaturas siguientes:

EDTA: ácido etilendiamintetracético

IPTG: isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido

MeCN: cianuro de metilo (acetonitrilo)

Mi: Macadamia integrifolia

MiAMP2: Serie número 2 de proteína antimicrobiana de Macadamia integrifolia

Ni-NTA: Medio cromatográfico Níquel-ácido nitriloacético

ND: no determinado

PCR: reacción en cadena de polimerasa

PMSF: fluoruro de fenilmetilsulfonilo

SDS-PAGE: electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico poliacrilamida

TFA: ácido trifluoroacetato.

Los presentes inventores han identificado una nueva clase de proteínas con actividad antimicrobiana. Pueden aislarse prototipos de proteínas de las semillas de Macadamia integrifolia. La invención proporciona asimismo proteínas antimicrobianas de por sí, así como secuencias de ADN que codifican las proteínas antimicrobianas.

La invención proporciona asimismo secuencias de aminoácidos de proteínas que son homólogas al prototipo de proteínas antimicrobianas de Macadamia integrifolia. Por tanto, además de las proteínas antimicrobianas de Macadamia, la presente invención proporciona asimismo secuencias de aminoácidos de homólogos de otras especies que hasta ahora no se ha reconocido que presentan actividad antimicrobiana.

Aunque la primera proteína antimicrobiana en la presente serie se aisló directamente de Macadamia integrifolia, se identificaron proteínas antimicrobianas adicionales mediante operaciones de clonación, investigaciones de homología y experimentación antimicrobiana posterior de la proteínas codificadas tras la expresión y purificación del cultivo líquido. Una vez purificada la primera proteína de esta serie procedente de macadamia y denominada MiAMP2, se obtuvieron clones que codificaban una preproteína que contiene MiAMP2. Esta proteína grande (666 aminoácidos), representada por varios clones casi idénticos, contenía cuatro zonas adyacentes con similitud significativa con el fragmento de proteína antimicrobiana purificado (MiAMP2) que se descubrió que se une en la zona tres en la secuencia nucleotídica clonada. Por consiguiente la proteína antimicrobiana purificada se denomina MiAMP2c. Otros fragmentos contenidos en el clon de 666 aminoácidos se denominan MiAMP2a, b y d por sus posiciones en la secuencia nucleotídica clonada. Varias otras secuencias con homología significativa con los fragmentos de proteína MiAMP2a, b, c y d se identificaron a continuación en la base de datos Entrez. Estas secuencias homólogas estaban contenidas en las proteínas de almacenamiento en semillas mayores del algodón y del cacao cuyas secuencias no habían sido descritas anteriormente que contienen secuencias de proteína antimicrobiana o que presentan actividad antimicrobiana. Se determinaron los fragmentos de las proteínas de almacenamiento en semillas mayores que contienen secuencias homólogas a MiAMP2c y se demuestra en esta memoria que presentan actividad antimicrobiana. Por lo tanto, los inventores han creado un procedimiento para obtener fragmentos de proteína antimicrobiana procedentes de las proteínas de almacenamiento en semilla mayores. A la luz de estos descubrimientos, es evidente que los fragmentos de otras proteínas de almacenamiento en semilla que contienen secuencias similares a las proteínas descritas presentarán actividad antimicrobiana.

En particular, las secuencias TcAMP1 de 47 aminoácidos (para la proteína 1 antimicrobiana de Theobroma cacao) y la TcAMP2 de 60 aminoácidos procedían de la secuencia génica de la proteína de almacenamiento en semilla vicilina de cacao (que contiene 525 aminoácidos) (Spencer, M. E. y Hodge R. [1992] Planta 186:567-576). Estos fragmentos derivados se expresaron a continuación en cultivo líquido. Los fragmentos de vicilina de cacao expresados de este modo y purificados ulteriormente (Ejemplos 10 y 11), se demuestra que son antimicrobinos (Ejemplo 15). Esta es la primera información en relación a que los fragmentos de la proteína vicilina de cacao poseen actividad antimicrobiana. Grupos de secuencias que contienen fragmentos homólogos a MiAMP2c liberados aparentemente de la proteína de almacenamiento de la semilla vicilina del algodón se ha demostrado que poseen actividad antimicrobiana (Chung, R. P. T. et al. [1997] Plant Science 127:1-16). Este descubrimiento se materializa claramente en las secuencias dadas a conocer en esta solicitud.

Además de demostrar que los fragmentos procedentes de vicilina del cacao presentan actividad antimicrobiana, se describen en la presente memoria proteínas adicionales que presentan actividad antimicrobiana. Por ejemplo, se describen a continuación proteínas procedentes de Stenocarpus sinuatus que son de tamaño similar a las subunidades de MiAMP2, reaccionan con antisuero de MiAMP2c y contienen secuencias homólogas a las proteínas MiAMP2 (véase la Figura 4). Basándose en las pruebas proporcionadas en la presente memoria, las secuencias homólogas a la subunidad MiAMP2c (es decir, MiAMP2a, b, d; TcAMP1; TcAMP2; y fragmentos 1, 2 y 3 de algodón, véase la Figura 4) constituyen proteínas que contienen el fragmento con actividad antimicrobiana. La actividad antimicrobiana de los fragmentos de MiAMP2 de macadamia y de los fragmentos de TcAMP1 y 2 del cacao, se ejemplifica a continuación. R. P. T. Chung et al. (Plant Science 127:1-16 [1997]) han demostrado que los fragmentos de algodón presentan actividad antimicrobiana. Otras proteínas antimicrobianas pueden también proceder de las proteínas de almacenamiento en semilla tales como el alergeno Ara h del cacahuete (Burks, A. W. et al. [1995] J. Clin. Invest. 96 (4), 1715-1721), globulina de maíz (Belanger, F. C. y Kriz, A. L. [1991] Genetics 129 (3), 863-872), globulina de cebada (Heck, G. R. et al. [1993] Mol. Gen. Genet. 239 (1-2), 209-218) y conglicinina de soja (Sebastiani, F. L. et al. [1990] Plant. Mol. Biol. 15 (1), 197-201), todas las cuales contienen los mismos elementos clave que están presentes en las secuencias que se presentan en la presente memoria que presentan actividad antimicrobiana.

Las proteínas que contienen zonas de secuencia homóloga a MiAMP2 (como en la Figura 4) pueden utilizarse para construir secuencias nucleotídicas que codifican 1) los fragmentos activos de proteínas mayores, o 2) fusiones de fragmentos antimicrobianos múltiples. Esto puede realizarse utilizando tablas de codones y procedimientos de clonación habituales como se describe en los manuales de laboratorio tales como Current Protocols in Molecular Biology (derechos de autor 1987-1995, editado por Ausubel F. M. et al. y publicado por John Wiley & Sons, Inc., impreso en los EEUU). Posteriormente, éstas pueden expresarse en cultivo líquido para la purificación y ka experimentación, o las secuencias pueden expresarse en plantas transgénicas después de colocarlas en vectores de expresión apropiados.

Las proteínas antimicrobianas de por sí manifestarán una determinada estructura tridimensional que puede determinarse utilizando técnicas de cristalografía de rayos X o resonancia magnética nuclear. Esta estructura será responsable en gran parte de la actividad antimicrobiana de la proteína. La secuencia de la proteína puede someterse también a algoritmos de predicción de estructura para evaluar si alguno de los elementos de la estructura secundaria es probable que sean presentados por la proteína (véase el Ejemplo 8 y la Figura 7). Las estructuras secundarias, previstas de este modo, pueden utilizarse a continuación para las estructuras globales del modelo tridimensional. Aunque la función de la estructura tridimensional no sea factible para la mayoría de las proteínas, las predicciones de la estructura secundaria para MiAMP2c eran suficientemente sencillas y claras de que una estructura con modelo tridimensional se ha obtenido para la proteína MiAMP2c. Los homólogos que presentan el mismo espaciado de cisteína y otros elementos clave adoptarán también la misma estructura tridimensional. El ejemplo 8 demuestra que la estructura más probablemente adoptada por MiAMP2c (y homólogos) es una estructura en hélice-espira-hélice creada por lo menos por dos puentes disulfuro que conectan los dos segmentos de hélice \alpha antiparalelos (véase Figura 8). Puede proporcionarse estabilización adicional mediante un puente disulfuro más (p. ej., como en MiAMP2b) o mediante una interacción con superposición del anillo hidrófobo entre los restos de tirosina y/o fenilalanina (p. ej. MiAMP2a y MiAMP2c), situado cada uno en la misma cara de los segmentos de la hélice \alpha que los restos de cisteína normalmente presentes que participan en los 2 enlaces disulfuro mencionados anteriormente. Las señales de RMN presentadas por MiAMP2c son coherentes con el modelo global tridimensional producido a partir de las predicciones de la estructura secundaria mencionadas anteriormente.

Se apreciará que un experto en la materia puede tomar una proteína de estructura conocida, alterar significativamente la secuencia e incluso conservar la forma tridimensional general y la actividad antimicrobiana de la proteína. Un aspecto de la estructura que lo más probable es que no pudiera alterarse sin afectar seriamente a la estructura (y, por consiguiente la actividad de la proteína) es el contenido y espaciado de los restos de cisteína ya que esto destruiría la formación de los enlaces disulfuro que son críticos para a) mantener la estructura general de la proteína y/o b) hacer más resistente la proteína a la desnaturalización y proteólisis (estabilizando la estructura de la proteína). En particular, es esencial que los restos de cisteína residan en una cara de la hélice en la que están contenidos. Esto puede realizarse de una manera más satisfactoria manteniendo un espaciamiento de tres restos entre los restos de cisteína en cada hélice, pero, puede realizarse también con un intervalo de dos restos entre los restos de cisteína, con la condición de que las cisternas en el otro segmento helicoidal estén separadas por tres restos (es decir, C-X-X-C-X-X-X-C-nX-C-X-X-X-C-X-X-X-C en la que C es cisteína, X es cualquier aminoácido y n es el número de restos que forman una espira entre los dos segmentos de la hélice \alpha). Los restos de tirosina (o fenilalanina) aromáticos pueden asimismo funcionar para añadir estabilidad a la estructura proteica si están situados en la misma cara de la hélice que las cadenas laterales de cisteína. Esto puede realizarse proporcionando un espaciamiento apropiado de dos o tres restos entre el resto aromático y la cisteína próxima (es decir, Z-X-X-C-X-X-X-C-nX-C-X-X-X-C-X-X-X-Z, en la que Z es tirosina o fenilalanina).

La distribución de cargas positivas (y negativas) en varias superficies de la proteína servirá también una función crítica en la determinación de la estructura y actividad de la proteína. En particular, la distribución de los restos con carga positiva en una zona de la hélice \alpha de una proteína puede producir cargas positivas que están situadas sobre una cara de la hélice o pueden producir restos con carga que están concentrados en alguna parte concreta de la molécula. Una distribución alternativa de restos con carga positiva sirve para proyectarles en el disolvente en una orientación radial al núcleo de la proteína. Esta orientación está prevista para varios homólogos de MiAMP2 (datos no mostrados). El espaciamiento que se requiere para la colocación de los restos en una cara de la hélice o el espaciamiento requerido para realizar una orientación radial del núcleo puede ser determinado fácilmente por un experto en la materia utilizando un esquema de espira helicoidal con la secuencia de interés. Un esquema de espira helicoidal utiliza el hecho de que, en las hélices \alpha, cada espira de la hélice está compuesta por 3,6 restos por término medio. Este número se traduce en 100º de traducción de la rotación por resto lo que hace posible construir un esquema que presente la distribución de cadenas laterales en una zona de la hélice. La Figura 8 presenta cómo el espaciamiento de los restos con carga puede conducir a la mayoría de las cadenas laterales con carga positiva que se localizan en una cara de la hélice. Un experto en la materia apreciará que estas cargas positivas están proporcionadas por los restos de arginina y lisina.

Para que la proteína se desarrolle en una estructura en hélice-espira-hélice, es necesario asimismo que posea restos específicos que favorezcan una formación de la hélice \alpha y que favorezcan asimismo una estructura en espira en la parte central de la secuencia de aminoácidos (y perjudiquen una estructura helicoidal en la zona de la espira). Esto puede realizarse mediante un resto o restos de prolina en la mitad del segmento de la espira como se aprecia con muchos de los homólogos de MiAMP2. Cuando la prolina no está presente, la glicina puede contribuir a destruir una estructura en hélice contínua, y producir la formación de una espira en esta posición. En un caso (es decir, TcAMP1), parece que la serina puede considerarse en esta función. Se apreciará que los restos en esta zona de la proteína favorecerán normalmente la formación de una estructura de espira; los restos que cumplen este requisito incluyen prolina, glicina, serina y ácido aspártico; pero también se permiten otros restos.

Las secuencias de ADN descritas en la presente memoria son una herramienta sumamente potente que puede utilizarse para obtener genes homólogos de otras especies. Utilizando las secuencias de ADN, un experto en la materia puede diseñar y sintetizar sondas oligonucleotídicas que pueden utilizarse para identificar en bancos de ADNc de otras especies de plantas, la presencia de genes que codifican proteínas antimicrobianas homólogas a las descritas en la presente memoria. Esto implicaría simplemente la construcción de un banco de ADNc y la identificación posterior del banco utilizando como sonda oligonucleotídica una o parte de una de las secuencias descritas en la presente memoria (tal como la ID. nº: 2 o el fragmento de PCR descrito en el Ejemplo 9). Pueden utilizarse asimismo con este propósito otras secuencias oligonucleotídicas que codifican proteínas homólogas a MiAMP2 (p. ej., las secuencias de ADN que corresponden a vicilinas de algodón y de cacao). La construcción e identificación de un banco de ADNc puede realizarse adquiriendo un kit con este fin (p. ej. en Stratagene) o siguiendo los protocolos bien establecidos descritos en los manuales de clonación de ADN disponibles (véase Current Protocols in Molecular Biology, supra). Es relativamente sencillo construir bancos de varias especies y aislar específicamente homólogos de vicilina que son similares a las vicilinas de Macadamia, algodón o cacao utilizando una técnica de hibridación de ADN sencilla para identificar dichos bancos. Una vez clonadas, en estas secuencias relacionadas con la vicilina puede examinarse a continuación la presencia de subunidades similares a MiAMP2. Dichas subunidades pueden expresarse fácilmente en E. coli utilizando el sistema descrito en los Ejemplos 10 y 11. Posteriormente, estas proteínas pueden también expresarse en transgénicos.

Los genes, o fragmentos de los mismos, bajo el control de un activador constitutivo o inducible, pueden clonarse a continuación en un sistema biológico que permita la expresión de la proteína codificada por ellos. Son conocidos los procedimientos de transformación que permiten a la proteína expresarse en una variedad de sistemas. La proteína de esta manera puede expresarse en cualquier sistema adecuado a fin de producir la proteína para su utilización posterior. Los hospedadores adecuados para la expresión de esta proteína incluyen E. coli, células de hongos, células de insecto, células de mamífero y plantas. Los procedimientos normalizados para expresar las proteínas en dichos hospedadores se describen en una variedad de textos que se incluyen en el apartado 16 (Protein Expression) de Current Protocols in Molecular Biology (supra).

Las células vegetales pueden transformarse con constructos de ADN de la invención según una variedad de procedimientos conocidos (Agrobacterium, plásmidos Ti, electroporación, microinyecciones, pistola de microproyectiles y similares). Las secuencias de ADN que codifican las subunidades de la proteína antimicrobiana de Macadamia integrifolia (es decir fragmentos a, b, c y d de los clones de MiAMP2), así como la codificación del ADN para otros homólogos puede utilizarse junto con una secuencia de ADN que codifica una preproteína a partir de la cual se produce la proteína madura. Esta preproteína puede contener una secuencia de péptido señal natural o sintética que dirigirá la proteína a un compartimento específico de la célula. Estas secuencias de codificación podrían estar ligadas a una secuencia activadora de la planta lo que asegurará la expresión acusada en las células vegetales. Esta secuencia activadora puede asegurar la expresión constitutiva acusada de la proteína en la mayoría o en todas las células vegetales, puede ser un activador que asegure la expresión en los tejidos o células específicos que son susceptibles a las infecciones microbianas y puede ser también un activador que asegure la inducción acusada de la expresión durante el proceso de infección. Estos tipos de casetes génicas incluirán asimismo una terminación de la transcripción y una secuencia 3' de poliadenilación de la zona de codificación de la proteína antimicrobiana para asegurar la producción y estabilización eficaz del ARNm que codifica las proteínas antimicrobianas. Es posible que la expresión eficaz de las proteínas antimicrobianas pueda facilitarse por inclusión de su secuencia de ADN en una secuencia que codifica una proteína mucho mayor que se procesa en la planta para producir una o más fragmentos activos similares a MiAMP2.

Las casetes génicas que codifican las proteínas antimicrobianas de la serie MiAMP2 (es decir, MiAMP2a, b, c o d; o todas las subunidades juntas; o el clon de MiAMP2 completo) u homólogos de las proteínas MiAMP2 descritos anteriormente pueden expresarse a continuación en células vegetales utilizando dos procedimientos corrientes. En primer lugar, las casetes génicas podrían ligarse en vectores binarios que llevan, i) secuencias en el extremo izquierdo y derecho que flanquean el T-ADN del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, ii) un gen marcador seleccionable adecuado para la selección de células vegetales resistentes a antibióticos, iii) orígenes de replicación que funcionan en A. tumefaciens o Escherichia coli y iv) genes con resistencia a antibióticos que permiten la selección de células de A. tumefaciens y E. coli que llevan plásmidos. Este vector binario que lleva el gen híbrido que codifica a MiAMP2 podría introducirse por electroporación o por acoplamiento tripaterno en cepas de A. tumefaciens que llevan plásmidos de Ti desarmados tales como las cepas LBA4404, GV3101 y AGL1 o en las cepas de A. rhizogenes tales como A4 o NCCP1885. Estas cepas de Agrobacterium pueden cultivarse conjuntamente a continuación con explantes vegetales adecuados o tejido vegetal intacto y células vegetales transformadas y/o los regenerantes seleccionados utilizando la resistencia al antibiótico.

Un segundo procedimiento de transferencia génica a plantas puede conseguirse mediante la inserción directa del gen en células vegetales diana. Por ejemplo, la casete génica que codifica a MiAMP2 puede precipitarse conjuntamente en partículas de oro o tungsteno junto con un plásmido que codifica un gen híbrido para la resistencia a antibióticos en plantas. Las partículas de tungsteno pueden acelerarse utilizando un flujo rápido de gas helio y permitir que las partículas bombardeen un tejido vegetal adecuado. Éste puede ser un cultivo celular embrionario, un explante vegetal, un tejido calloso o una suspensión celular o un meristema intacto. Las plantas pueden recuperarse utilizando el gen con resistencia al antibiótico para la selección y los anticuerpos utilizarse para detectar células vegetales que expresan las proteínas MiAMP2 o fragmentos relacionados.

La expresión de proteínas MiAMP2 en las plantas transgénicas puede detectarse utilizando anticuerpos producidos contra la(s) proteína(s) o utilizando bioanálisis antimicrobiano. Estos y otros procedimientos relacionados para la expresión de la MiAMP1 en plantas se describen en "Plant Molecular Biology" (2ª ed., editada por Gelvin, S. B. y Schilperoort, R. A., © 1994 publicado por Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Holanda).

Tanto las plantas monocotiledóneas como las dicotiledóneas pueden transformarse y regenerarse. Ejemplos de plantas modificadas genéticamente incluyen: maíz, plátanos, cacahuete, guisantes, girasol, tomates, canela, tabaco, trigo, cebada, avena, patatas, soja, algodón, claveles, rosas y sorgo. Estos, así como otras plantas agrícolas, pueden transformarse con los genes antimicrobianos de modo que presenten un mayor grado de resistencia al ataque patógeno. Alternativamente, pueden utilizarse proteínas para el control de enfermedades por aplicación tópica.

Como se indicó anteriormente en la descripción de la décima forma de realización, la invención incluye dentro de su alcance la preparación de proteínas antimicrobianas basadas en el prototipo de la serie MiAMP2 de proteínas. Pueden diseñarse nuevas secuencias a partir de las secuencias de aminoácidos de MiAMP2 que conservan sustancialmente la distribución de restos con carga positiva en comparación con los restos de cisteína encontrados en las proteínas MiAMP2. La nueva secuencia puede sintetizarse o expresarse en un gen que codifica la secuencia en una célula hospedadora apropiada. Los procedimientos adecuados para tales procedimientos han sido descritos anteriormente. La expresión de la nueva proteína en una célula modificada genéticamente producirá típicamente un producto que tiene una estructura tridimensional correcta, incluyendo los enlaces disulfuros formados correctamente entre los restos de cisteína. Sin embargo, aun si la proteína se sintetiza químicamente, se conocen procedimientos en la técnica para el tratamiento adicional de la proteína para romper los puentes disulfuro indeseables y formar los puentes entre los restos de cisteína deseados para proporcionar la estructura tridimensional deseada que fuese necesaria.

Serie número 2 de proteínas antimicrobianas de Macadamia integrifolia

Como se indicó anteriormente, se ha identificado y caracterizado una nueva clase de proteína antimicrobiana potente en las semillas de Macadamia integrifolia. Las proteínas en conjunto se denominan serie MiAMP2 de proteínas antimicrobianas (o proteínas MiAMP2) debido a que todas se encuentran en una gran proporción que se procesa en subunidades más pequeñas, presentando cada una actividad antimicrobiana; representan la segunda clase de proteínas antimicrobianas aisladas de Macadamia integrifolia. Cada fragmento de proteína de la serie tiene un valor pI característico. Las subunidades MiAMP2a, b, c y d como se muestra en la Figura 4 han predicho valores de pI de 4,4, 4,6, 11,5 y 11,6 respectivamente (predichos utilizando los datos de la secuencia en bruto sin la etiqueta His o las secuencias de escisión asociadas con la expresión de fragmentos en el vector pET16b), y contienen dos series de motivos CXXXC que son importantes en la estabilización de la estructura tridimensional de la proteína mediante la formación de puentes disulfuro. Además, las proteínas contienen bien una serie añadida de restos aromáticos (tirosina/fenilalanina) o una serie añadida de restos de cisteína situada en las posiciones que proporcionarían mayor estabilidad a la estructura hélice-espira-hélice tal como se describió anteriormente y en el Ejemplo 8.

Las secuencias de aminoácidos de la serie MiAMP2 comparten homología significativa con los fragmentos de proteínas descritos anteriormente en las bases de datos de la secuencia (Swiss Prot y bases de datos no redundantes) investigadas utilizando el algoritmo BLASTP (Altschul, S. F. et al. [1990] J. Mol. Biol. 215:403). En particular, las secuencias de MiAMP2a, b, c y d presentan similitud significativa con las zonas de vicilina de cacao y de vicilina de algodón (como se aprecia en la Figura 6). Se observa también alguna similitud con los fragmentos de otras proteínas de almacenamiento en semillas de cacahuete (Burks, A. W. et al. [1995] J. Clin. Invest. 96 (4), 1715-1721), maíz (Belanger, F. C. y Kriz, A. L. [1991] Genetics 129 (3), 863-872), cebada (Heck, G. R. et al. [1993] Mol. Gen. Genet. 239 (1-2), 209-218) y soja (Sebastiani, F. L. et al. [1990] Plant Mol. Biol. 15 (1), 197-201). Aunque, en algunos casos la homología no es extremadamente elevada (por ejemplo, 18% de identidad entre MiAMP2a y la subunidad 1 del algodón; véase la Figura 4), el espaciamiento de los cuatro principales restos de cisteína se conserva en todas las subunidades y homólogos. Además, tanto las subunidades derivadas de vicilina de algodón como de cacao conservan los restos conservados de tirosina o fenilalanina como estabilizadores adicionales de la estructura terciaria. Las vicilinas de algodón y de cacao con 525 y 590 aminoácidos, respectivamente, son proteínas mucho mayores que MiAMP2c (47 aminoácidos) (véase las Figuras 4 y 6). Aunque las subunidades de MiAMP2 también comparten alguna homología con la proteína antimicrobiana MBP-1 del maíz (Duvick, J. P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:18814-20) el número de restos entre los motivos CXXXC es 13 lo que sitúa a MBP-1 fuera de las especificaciones para el espaciamiento proporcionadas en la presente solicitud. MPB-1 es asimismo una proteína más pequeña (33 aminoácidos), en conjunto, que las secuencias reivindicadas en la presente memoria y no existen pruebas disponibles de que MBP-1 derive de una proteína de almacenamiento en semillas mayor aparte de alguna similitud con un fragmento de la proteína globulina del maíz. Sin embargo, MBP-1 no puede proceder de la globulina del maíz ya que la globulina del maíz contiene 10 restos entre los dos motivos CXXXC mientras que MBP-1 contiene 13. Las alineaciones en las Figuras 4 y 6 presentan similitud en el espaciamiento de cisteína entre las subunidades MiAMP2 y las moléculas derivadas de vicilina del cacao y del algodón. La cisteína y los restos vinilaromáticos de tirosina/fenilalanina en las Figuras 4 y 6 están destacados con texto en negrita subrayado. La Figura 4 también presenta la alineación de proteínas adicionales que pueden expresarse en cultivo líquido y demuestra que presenta actividad antimicrobiana.

Todos los homólogos de MiAMP2 que se han probado presentan actividad antimicótica. Los homólogos de
MiAMP2 presentan inhibición muy significativa del crecimiento micótico a concentraciones tan bajas como 2 \mug/ml para algunos de los patógenos/microbios contra los que se probaron las proteínas. Por lo tanto pueden utilizarse para proporcionar protección contra varias enfermedades de plantas. Los homólogos de MiAMP2 pueden utilizarse como fungicidas o antibióticos mediante aplicación a partes de la planta. Las proteínas pueden también utilizarse para inhibir el desarrollo de patógenos expresándoles en plantas transgénicas. Una característica de las proteínas es que la inhibición de algunos microbios se suprime por la presencia de Ca^{2+} (1 mM). Un ejemplo de este efecto se proporciona en la Tabla 1 para la subunidad MiAMP2c.

Ejemplo 1 Extracción de la proteína básica de semillas de Macadamia integrifolia

Veinticinco kilogramos de nueces de Mi (adquiridas en la Macadamia Nut Factory Queensland, Australia) se molieron en un procesador de alimentos (The Big Oscar, Sunbeam) y la harina resultante se extrajo durante 2 a 4 horas a 4ºC con 50 l de un tampón de extracción enfriado en hielo que contenía NaH_{2}PO_{4} 10 mM, Na_{2}HPO_{4} 15 mM, KCl 100 mM, EDTA 2 mM, polivinilpirrolidona al 0,75% y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,5 mM. El homogeneizado resultante se pasó a través de un colador de cocina para eliminar el material en partículas mayores y a continuación se clarificó más por centrifugación (4.000 rpm durante 15 min.) en una centrifugadora de gran capacidad. Se añadió sulfato amónico sólido al sobrenadante para obtener 30% de saturación relativa y el precipitado se dejó formar toda la noche en agitación a 4ºC. Después de la centrifugación a 4.000 rpm durante 30 min., se extrajo el sobrenadante y se añadió sulfato amónico para conseguir 70% de saturación relativa. Se dejó precipitar la solución durante a noche y a continuación se centrifugó a 4.000 rpm durante 30 min para recoger la fracción proteica precipitada. La proteína precipitada se volvió a poner en suspensión en un volumen mínimo de tampón de extracción y se centrifugó una vez más (13.000 rpm \times 30 min.) para eliminar cualquier material insoluble todavía restante. Después de la diálisis (etanolamina 10 mM pH 9,0, EDTA 2 mM y PMSF 1 mM) para eliminar el sulfato amónico residual, la solución proteica se pasó a través de una columna Q-Sepharose Fast Flow (5 \times 12 cm) equilibrada previamente con etanolamina 10 mM (pH 9) en EDTA 2 mM. El flujo a través recogido de esta columna representa la fracción proteica básica
(pI > 9) de las semillas. Esta fracción se continúa purificando tal como se describe en el Ejemplo 3.

Ejemplo 2 Ensayos de actividad antimicótica y antibacteriana

En general, los bioanálisis para evaluar la actividad antimicótica y antibacteriana se realizaron en placas de microvaloración de 96 pocillos. Típicamente, el organismo de ensayo se puso en suspensión en un medio de cultivo sintético constituido por K_{2}HPO_{4} (2,5 mM), MgSO_{4} (50 \muM), CaCl_{2} (50 \muM), FeSO_{4} (5 \muM), CoCl_{2} (0,1 \muM), CuSO_{4} (0,1 \muM), Na_{2}MoO_{4} (2 \muM), H_{3}BO_{3} (0,5 \muM), Kl (0,1 \muM), ZnSO_{4} (0,5 \muM), MnSO_{4} (0,1 \muM), glucosa (10 g/l), asparagina (1 g/l), metionina (20 mg/l), mio-inositol (2 mg/l), biotina (0,2 mg/l), tiamina-HCl (1 mg/l) y piridoxina-HCl (0,2 mg/l). El organismo de ensayo estaba constituido por células bacterianas, esporas de hongos (50.000 esporas/ml) o fragmentos de micelio de hongos (producidos por mezclado de una masa de hifas procedentes de un cultivo del hongo que va a ensayarse y a continuación filtrando a través de una malla fina para eliminar las masas de hifas mayores). En cada pocillo de la placa de microvaloración se colocaron cincuenta microlitros del organismo de ensayo suspendidos en el medio. Se añadieron 50 \mul más de la solución antimicrobiana de ensayo a los pocillos apropiados. Para tratar la variabilidad pocillo a pocillo en el bioanálisis, se realizaron 4 réplicas de cada solución de ensayo. Se utilizaron dieciséis pocillos de cada placa de 96 pocillos como referencias para comparación con las soluciones de
ensayo.

A menos que se indique de otra manera, la incubación fue a 25ºC durante 48 horas. Todos los hongos incluyendo la levadura se cultivaron a 25ºC. E. coli se cultivó a 37ºC y otras bacterias se bioanalizaron a 28ºC. El porcentaje de inhibición del crecimiento se midió siguiendo la absorbancia a 600 nm de los cultivos en crecimiento durante varios intervalos de tiempo y se define como 100 veces la relación del cambio medio en la absorbancia en los pocillos de referencia menos el cambio de absorbancia en el pocillo de ensayo dividido por el cambio medio de absorbancia a 600 nm para los pocillos de referencia (es decir [(cambio medio en los pocillos de referencia - cambio en el pocillo de ensayo) / (cambio medio en los pocillos de referencia)] \times 100). Típicamente, se tomaron mediciones a intervalos de 24 horas y se utilizó el periodo de 24 a 48 horas para las mediciones de % de inhibición.

Ejemplo 3 Purificación de la proteína antimicrobiana de la fracción proteica básica de Macadamia integrifolia

El material de partida para el aislamiento de la proteína antimicrobiana Mi fue la fracción básica extraída de las semillas maduras tal como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Esta proteína se siguió purificando por cromatografía de intercambio catiónico como se muestra en la Figura 1.

Aproximadamente 4 g de la fracción proteica básica disueltos en succinato sódico 20 mM (pH 4) se aplicaron a una columna S-Sepharose High Performance (5 \times 60 cm) (Pharmacia) equilibrada previamente con el tampón de succinato. Se eluyó la columna a 17 ml/min con un gradiente lineal de 20 l de NaCl desde 0 hasta 2 M en succinato sódico 20 mM (pH 4). Se controló la proteína en el eluído mediante una medición en línea de la absorbancia a 280 nm y se recogió en fracciones de 200 ml. Se determinaron posteriormente las porciones de cada fracción en el ensayo de actividad antimicótica frente a Phytophora cryptogea a una concentración de 100 \mug/ml en presencia y ausencia de Ca^{2+} 1 mM. Los resultados del bioanálisis están incluidos en las Figuras 1a y 1b en las que se presenta el gradiente de elución como línea llena y las barras sombreadas representan el % de inhibición. Los análisis de la Figura 1a se realizaron sin añadir Ca^{2+} mientras que en los análisis de la Figura 1b se incluyó Ca^{2+} 1 mM. El fraccionamiento proporcionó numerosos picos no resueltos que eluyeron entre 0,05 y 2 M de NaCl. Un pico mayor que eluyó a aproximadamente 16 horas en la separación (fracciones 90 a 92) presentaba actividad antimicrobiana significativa.

Las fracciones que presentan actividad antimicrobiana significativa se continuaron purificando por cromatografía en fase inversa. Alícuotas de las fracciones 90 a 92 combinadas se cargaron en una columna Pep-S (C_{2}/C_{18}), (25 \times 0,93 cm) (Pharmacia) equilibrada con 95% de H_{2}O/5% de MeCN/0,1% de TFA (=100% de A). La columna se eluyó a 3 ml/min con un gradiente lineal de 240 ml (80 min.) desde 100% de A hasta 100% de B (= 5% de H_{2}O/95% de MeCN/0,1% de TFA). Se recogieron los picos individuales, se secaron al vacío tres veces para eliminar los vestigios de TFA y se volvieron a poner en suspensión posteriormente en 500 \mul de agua milli-Q (sistema de purificación de agua de Millipore Corporation) para su utilización en bioanálisis tal como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 2 presenta el perfil de HPLC de la fracción 92 purificada procedente de la separación por intercambio catiónico mostrada en las Figuras 1 y 2. La elución de la proteína se controló a 214 nm. El gradiente de acetonitrilo está representado por la línea recta. La actividad antimicrobiana fue bioanalizada en los picos individuales: las barras en la Figura 3 muestran la inhibición correspondiente a 15 \mug/ml de material de cada una de las fracciones. La proteína activa eluye a aproximadamente 27 min (\sim30% de MeCN/0,1% de TFA) y se denominó MiAMP2c.

Ejemplo 4 Pureza de MiAMP2c aislada

Se verificó la pureza de la proteína antimicrobiana aislada por SDS-PAGE natural seguido de tinción con solución azul coomassie de tinción de proteínas. Se realizó la electroforesis en un gel con gradiente entre el 10 y el 20% de tricina (Novex) según las recomendaciones de los fabricantes (100 V, tiempo de separación de 1 a 2 horas). En estas condiciones la MiAMP2c purificada migra como una única banda discreta (de tamaño < 10 kDa). La detección de una única banda principal en el análisis SDS-PAGE junto con los únicos picos que eluyen en el intercambio catiónico y en las separaciones en fase inversa (no mostradas), proporciona una indicación acusada de que la preparación de MiAMP2c presenta una pureza mayor del 95% y por consiguiente la actividad de la preparación fue casi con certeza debida a la MiAMP2c sola y no a un componente contaminante menor. Una señal nítida en el análisis espectrométrico de masas (Ejemplo 5 a continuación) apoya también esta conclusión.

Ejemplo 5 Análisis espectroscópico de masas de MiAMP2c

La MiAMP2c purificada se sometió a análisis espectroscópico de masas. Se utilizó aproximadamente 1 \mug de proteína en solución para el análisis. El análisis demostró que la proteína tiene un peso molecular de 6216,8 Da \pm 2 Da. Además, la proteína se sometió a reducción de enlaces disulfuros con ditiotreitol y alquilación con 4-vinilpiridina. El producto de esta reducción/alquilación se sometió también a continuación a análisis espectroscópico de masas y se demostró que había ganado 427 unidades de masa (es decir, el peso molecular aumentó aproximadamente en 4 x 106 Da). La ganancia de masa indicaba que cuatro grupos 4-vinilpiridina habían reaccionado con la proteína reducida, lo que demuestra que la proteína contiene un total de 4 restos de cisteína. El contenido de cisteína se ha confirmado asimismo posteriormente por secuenciado de aminoácidos.

Ejemplo 6 Secuencia de aminoácidos de MiAMP2c

Aproximadamente 1 \mug de la proteína pura que había sido reducida y alquilada se sometió a secuenciado N-terminal por degradación automática de Edman. En la primera serie de secuenciado, se determinaron 39 restos de la secuencia. Posteriormente, se hizo reaccionar 1 mg de MiAMP2c con bromuro de cianógeno que escindió la proteína en el lado C-terminal de la Metionina-26. El fragmento C-terminal generado por la reacción de escisión se purificó por HPLC en fase inversa y se secuenció, proporcionando la secuencia restante de MiAMP2c (es decir los restos 27 a 47). La secuencia completa de aminoácidos es RQRDP QQQYE QCQER CQRHE TEPRH MQTCQ QRCER RYEKE KRKQQ KR y representa los aminoácidos 118 a 164 del clon 3 del Ejemplo 9 (véase la Figura 6 y la SECUENCIA ID. nº: 5). En la figura, los restos de cisteína están en negrita y subrayados para facilitar el reconocimiento de los patrones de espaciamiento. Dependiendo del número de enlaces disulfuros que se formen, la masa de proteína estará comprendida entre 6215,6 y 6219,6 Da. Ésta es una coincidencia estrecha con la masa de 6216.R \pm 2 Da obtenida por análisis espectrométrico de masas (Ejemplo 5). La masa medida se aproxima mucho a la masa prevista de MiAMP2c en forma de dos disulfuros como es de esperar que sea el caso.

Ejemplo 7 Secuencia de ADN sintético que codifica a MiAMP2c con un péptido principal

Utilizando tablas de codones habituales es posible traducir a la inversa las secuencias proteicas para obtener secuencias de ADN que codificarán las proteínas antimicrobianas. Se utilizó el programa informático MacVector 4.5.3 para introducir la secuencia proteica y obtener una secuencia nucleotídica degenerada. Una tabla para utilización de codones para el tabaco se utilizó como referencia para seleccionar los codones que estarían representados adecuadamente en el tabaco con objeto de obtener alta expresión en esta planta de ensayo. Se diseñó asimismo un péptido principal de 30 aminoácidos para asegurar el tratamiento eficaz del péptido señal y la secreción del péptido extracelularmente. Con este objeto, se utilizó el procedimiento de Von Hiejne para evaluar la probabilidad de escisión en una serie de posibles secuencias principales en la posición corregida [Von Hiejne, G. (1986) Nucleic Acids Research 14(11):4683-4690]. En particular, la secuencia de aminoácidos MAWFH VSVCN AVFVV IIIIM LLMFV PVVRG (SEC. ID. nº: 11) se halló que proporciona una probabilidad óptima de tratamiento correcto del péptido señal inmediatamente después de G (Gly) de esta secuencia principal. Una zona 5' no traducida del virus del mosaico del tabaco se añadió también a este gen sintético para activar mayor eficacia de traducción [Dowson, M. J., et al. (1994) Plant Mol. Biol. Rep. 12(4):347-357]. El gen sintético contiene también secuencias de restricción en los extremos 5' y 3' e inmediatamente 5' del comienzo ATG para los procedimientos de clonación y subclonación eficaces. La Figura 5 presenta una secuencia de ADN sintético adecuada para su utilización en los experimentos de expresión en la planta. En esta Figura, la flecha muestra dónde se inicia la traducción y el símbolo triangular indica el punto de escisión del péptido señal.

Ejemplo 8 Predicción de la estructura de la proteína MiAMP2c

Utilizando los algoritmos para análisis de la secuencia, pueden asignarse a la proteína motivos de la estructura secundaria supuesta. Se utilizaron cinco algoritmos diferentes para predecir si las hélices \alpha, las hojas \beta o las espiras pueden aparecer en la proteína MiAMP2c (Figura 4). Se obtuvieron procedimientos a partir de las fuentes siguientes: procedimiento DPM, Deleage, G. y Roux, B. (1987) Prot. Eng. 1:289-294; procedimiento SOPMA, Geourjon, C. y Deleage, G. (1994) Prot. Eng. 7:157-164; procedimiento Gibrat, Gibrat, J. F., Garnier, J., y Robson, B. (1987) J. Mol. Biol. 198:425-443; procedimiento de Levin, Levin, J. M., Robson, B., y Garnier, J. (1986) FEBS Lett. 205:303-308; y procedimiento PhD, Rost, B., y Sander, C. (1994) Proteins 19:55-72. La Figura 7 presenta las posiciones previstas de las hélices \alpha, las hélices \beta y las espiras. En la Figura 7 se han utilizado los símbolos siguientes: C, serpentín (no estructurado); H, hélice alfa; E, hoja \beta; y S, espira. Los restos subrayados son los que estaba previsto que presentaran una estructura de hélice \alpha mediante por lo menos 2 métodos de predicción de estructura independientes; éstos están representados como hélices en la Figura 8.

A partir de la estructura secundaria resulta evidente que la proteína es muy \alpha helicoidal. Mientras que la predicción de la estructura secundaria es difícil con frecuencia e inexacta, esta predicción específica proporciona una indicación clara de la estructura de la proteína. El examen de las predicciones de la estructura secundaria presenta una preponderancia clara de dos zonas \alpha helicoidales rotas por una separación de aproximadamente 5 a 8 restos. Es muy sugerente de un motivo hélice-espira-hélice.

El análisis de la espira helicoidal de la secuencia de aminoácidos de MiAMP2c demuestra que los restos de cisteína con un espaciamiento CXXXC estarán alineados en una cara de la hélice en la que están situados. Dado que las cisteínas están implicadas en la formación del enlace disulfuro, las cadenas laterales de cisteína en una hélice deben formar enlaces covalentes con las cadenas laterales de cisteína situadas en el otro segmento helicoidal. Cuando los segmentos helicoidales están dispuestos de tal manera que llevan cadenas laterales de cisteína en cada hélice respectiva en proximidad con las otras cadenas laterales de cisteína, la estructura tridimensional resultante se muestra en la Figura 8. La estructura presenta una distribución notable de los restos con carga positiva en una cara de la proteína compuesta por dos hélices mantenidas juntas por dos enlaces disulfuro. La Figura 8 presenta cómo el espaciamiento de restos con carga positiva en zonas helicoidales de esta molécula dará lugar a que estas cadenas laterales se sitúen en una cara de la hélice. Los restos con carga positiva son las cadenas laterales oscuras subrayadas en negro. Otras cadenas laterales oscuras representan restos ácidos. Un resto de prolina (de color gris marcado con una "P") está situado en el extremo izquierdo de la molécula en la zona de la espira. Las líneas negras llenas presentan dónde interactúan están conectados los enlaces disulfuro en las dos hélices. La línea de puntos presenta dónde los dos restos aromáticos hidrófobos para añadir estabilidad a la estructura hélice-espira-hélice.

Esta estructura hélice-espira-hélice será adoptada por todos los homólogos de MiAMP2 que contienen el mismo espaciamiento y restos de cisteína propensos a formar hélice y espira. Otras secuencias con fragmento MiAMP2 pueden sobreponerse sobre la estructura global mostrada en la Fragmento 8. La estructura global permanecerá esencialmente la misma pero la distribución de cargas variará según las secuencias implicadas. En el caso de MiAMP2b, la línea de puntos representaría un puente disulfuro añadido en lugar de una interacción hidrófoba.

Ejemplo 9 Clonación en ADNc de genes correspondientes al gen de MiAMP2c Ampliación por PCR de un fragmento genómico del gen de MiAMP2c

Utilizando las secuencias nucleotídicas traducidas a la inversa, se prepararon cebadores degenerados para su utilización en reacciones de PCR ADN genómico de Macadamia. La secuencia del cebador JPM 17 fue 5' CAG CAG CAG TAT GAG CAG TG 3' y la secuencia generada del cebador JPM20 fue 5' TTT TTC GTA (T/T)C(T/G) (G/T)C(T/G) TTC GCA 3' (SEC. ID. nº: 12 y nº: 13). Se utilizaron los cebadores JPM17 y JPM20 en las ampliaciones por PCR realizadas durante 30 ciclos en 30 s a 95ºC, 1 min a 50ºC, y 1 min a 72ºC. Los productos de la PCR con dimensiones próximas a las que era de esperar se secuenciaron directamente (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit de Perkin Elmer Corporation) escindiendo a continuación las bandas de ADN en geles de agarosa y purificándolos utilizando un kit de purificación de ADN de Qiagen. Utilizando este método, fue posible ampliar un fragmento de ADN de aproximadamente 100 bp. El secuenciado directo de este fragmento nucleotídico proporcionó la secuencia nucleotídica correspondiente a una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína antimicrobiana MiAMP2c (aminoácidos 7 a 39 de la Figura 4). La secuencia nucleotídica parcial obtenida a partir del fragmento mencionado anteriormente excluyendo las secuencias del cebador fue 5' TCA GAA GCG CTG CCA ACG GCG CGA GAC AGA GCC ACG ACA CAT GCA AAT TTG TCA ACA ACG C 3' (correspondiente a los pares de bases 264 a 324 en la SEC. ID. nº: 6). Esta secuencia puede utilizarse para una variedad de fines incluyendo el cribado del ADNc y de los bancos genómicos para los clones de MiAMP2 homólogos o el diseño de cebadores específicos para las reacciones de ampliación por PCR.

Aislamiento del ARN mensajero procedente de pipas de nuez Macadamia

Se molieron hasta polvo cincuenta y ocho gramos de pipas de nuez Macadamia bajo nitrógeno líquido utilizando un mortero y mano de mortero. El ARN procedente del material molido se purificó a continuación utilizando una técnica con tiocianato de guanidina/cloruro de cesio (Current Protocols in Molecular Biology, supra). Utilizando este procedimiento se aislaron aproximadamente 5 mg de ARN completo. El ARN mensajero se purificó a continuación a partir del ARN completo utilizando un kit de purificación de ARNm con columna giratoria (Pharmacia).

Construcción del banco de ADNc

Se construyó un banco de ADNc en un vector lambda ZAP utilizando un kit del banco de Stratagene. Se realizaron un total de 6 reacciones utilizando 25 microgramos de ARN mensajero. La síntesis de la primera y segunda cadena del ADNc se realizó utilizando MMLV transcriptasa inversa y ADN polimerasa I, respectivamente. Después de truncar el ADNc con Pfu ADN polimerasa, se ligaron los adaptadores del enlazador Eco RI al ADN. A continuación el ADN se trató con cinasa utilizando polinucleótido T4 cinasa y el ADN se digirió posteriormente con Xho I endonucleasa de restricción. En este punto el material del ADNc se fraccionó según el tamaño utilizando una columna sephacryl-S500 suministrada con el kit. El ADN se ligó a continuación en el vector lambda ZAP. El vector que contenía la inserción ligada se encapsuló a continuación en el fago lambda (extracto de encapsulación Gigapack III de
Stratagene).

Cribado del banco

El banco construido anteriormente se colocó a continuación en placas y se cribó en linones bacterianos de E. coli con XL1-azul desarrollándose en la parte superior de agarosa. Las placas que contenían clones aislados se aislaron recogiendo en membranas Hybond N+ (Amersham LIFE SCIENCE), hibridando a una versión radiomarcada del fragmento de ADN genómico ampliado anteriormente, detectando por imagen la transferencia y seleccionando los clones positivos para la próxima ronda de cribado. Después del cribado secundario y terciario, las placas se aislaron suficientemente para permitir la selección de los clones aislados. Se obtuvieron varios clones, y posteriormente se escindió la fracción del vector pBK-CMV del vector lambda mayor.

Secuencia de los clones del ADNc de MiAMP2c

Los vectores (pBK-CMV) que contienen los supuestos clones de MiAMP2c se secuenciaron para obtener la secuencia de ADN de las inserciones clonadas. Se secuenciaron parcialmente siete clones y unos tres clones adicionales se secuenciaron completamente (véanse las SEC. ID. nº: 2, nº:4 y nº: 6 para las secuencias de ADN de los clones de macadamia). La traducción de las secuencias de ADN demostró que los clones completos codificaban proteínas muy similares de 666 aminoácidos. La Figura 6 demuestra que estas proteínas tenían similitud sustancial con las proteínas de almacenamiento en semilla de vicilina del cacao y del algodón. Las estrellas muestran las posiciones de las identidades conservadas y los puntos muestran las posiciones de las similitudes conservadas. El examen de las secuencias proteicas puso de manifiesto que la secuencia exacta de MiAMP2c se encuentra dentro de la secuencia proteica traducida del clon 3 en las posiciones de los aminoácidos 118 a 164 (véase la Figura 6); los clones 1 y 2 contenían las secuencias que se diferencian de MiAMP2c en 2 y 3 residuos, respectivamente, de un total de 47 aminoácidos en la secuencia de MiAMP2c.

\newpage

Los productos de la traducción de los clones completos (es decir, los clones 1 y 2) consisten en un péptido señal corto de los restos 1 al 28, una zona hidrófila de los restos 29 al \sim246, y a continuación dos segmentos distanciados de los restos \sim246 al 666 con un distanciamiento de los restos ácidos que les separa en las posiciones 542 a 546.

De manera significativa, la zona hidrófila que contiene la secuencia para MiAMP2c, contiene también 3 segmentos adicionales que son muy similares a MiAMP2 (denominados MiAMP2a, b y d). Estos 4 segmentos (hallados entre los restos 28 y \sim246) se separan por distanciamientos en los que aproximadamente cuatro de cada cinco restos son ácidos (normalmente ácido glutámico). Estos distanciamientos ácidos tienen lugar en las posiciones 64 a 68, 111 a 115, 171 a 174 y 241 a 246 y parecen delinear los puntos de tratamiento para la escisión de la preproteína de 666 restos en fragmentos funcionales más pequeños (en la Figura 6 se muestran en caracteres en negrita los puntos de escisión que trazan los distanciamientos ácidos). Los cuatro segmentos de tipo MiAMP2 de la proteína contienen 2 dobletes de restos de cisteína separados por 10 a 12 restos para dar la configuración siguiente C-X-X-X-C-(10-12X)-C-X-X-X-C en la que X es cualquier aminoácido y C es cisteína. Es de esperar que los cuatro segmentos formen motivos hélice-espira-hélice tal como se describe en el Ejemplo 8 anteriormente. Es evidente que las cisteínas en estas posiciones formarán puentes de disulfuro que estabilizan la estructura de las proteínas manteniendo juntas las dos partes helicoidales.

Los motivos hélice-espira-hélice previstos pueden estabilizarse más de varias maneras. El primer método de estabilización está ejemplificado en los segmentos 1 y 3 (es decir, los restos 29 a 63 y 118 a 170, respectivamente, de la proteína similiar a vicilina de Macadamia de 666 restos). Estos segmentos están estabilizados por una interacción hidrófoba de superposición del anillo entre dos restos aromáticos (uno en cada segmento helicoidal \alpha); esto se realiza normalmente con restos de tirosina pero se utiliza asimismo fenilalanina. Como con los restos de cisteína, la posición de estos restos aromáticos en los segmentos helicoidales \alpha previstos es crítica si se arquean para ofrecer estabilización a la estructura hélice-espira-hélice. En los segmentos 1 y 3, los restos aromáticos arquean 2 y 3 restos separados de los dobletes de cisteína como se presenta a continuación: Z-X-X-C-X-X-X-C-(10-12X)-C-X-X-X-C-X-X-X-Z, en la que C
es cisteína y Z es normalmente tirosina pero puede estar sustituida por fenilalanina como se efectúa en el segmento 1.

La segunda manera de estabilizar el fragmento hélice-espira-hélice es utilizando un puente disulfuro añadido como se observa en el fragmento 2 (restos 71 a 110). Esto se realiza colocando los restos 2 y 3 de cisteína adicionales separados de los dobletes de cisteína como se presenta a continuación: nX-C-X-X-C-X-X-X-C-(10-12X)-C-X-X-X-C-X-X-X-C-nX. Este es el único informe que los inventores conocen en el que un dominio hélice-espira-hélice en una proteína antimicrobiana está estabilizado por tres puentes disulfuro. Aunque el segmento 4 (restos 175 a 241) no contiene más puentes disulfuro o la estabilización hidrófoba con superposición de anillo, está probablemente estabilizada por medio de interacciones iónicas más débiles y/o de puente de hidrógeno.

Ejemplo 10 Vectores para la expresión en cultivo líquido de MiAMP2c y homólogos

Los cebadores de la PCR que flanquean la zona nucleotídica que codifican a MiAMP2c se manipularon genéticamente para que contengan las secuencias de restricción de Nde I y Bam HI (correspondientes a los extremos 5' y 3' de la zona de codificación, respectivamente; secuencia del cebador JPM31: 5' A CAC CAT ATG CGA CAA CGT GAT CC 3'; secuencia del cebador JPM32: 3' C GTT GTT TTC TCT ATT CCT AGG GTT G 5', SEC. ID. nº: 14 y nº: 15). Estos cebadores se utilizaron a continuación para ampliar la zona de codificación del ADNc de MiAMP2c. El producto de PCR de esta ampliación se digerió a continuación con Nde I y Bam HI y se ligó en un vector pET17b (Novagen/Studier, F. W. et al. [1986] J. Mol. Biol. 189:113) con la zona de codificación en el marco para producir el vector pET17-MiAMP2c.

Se utilizó un método similar al anterior para construir los vectores que llevan las secuencias de codificación de los homólogos de MiAMP2c (es decir, MiAMP2a, b y d así como Tc AMP1 y TcAMP2). Para construir los vectores de expresión para los fragmentos a, b y d en el clon 1 de MiAMP2, los cebadores de PCR específicos que incorporan las secuencias Nde I y Bam HI se diseñaron para ampliar los fragmentos de interés. Los productos se digirieron a continuación con las enzimas de restricción apropiadas y se ligaron en las secuencias Nde I/Bam HI de un vector pET16b [Novagen] que contiene una etiqueta His y una secuencia de escisión del factor Xa (secuencia de aminoácidos MGHHH HHHHH HHSSG HIEGR HM, SEC. ID. nº: 16). Los productos proteicos expresados a partir del vector pET16b es una fusión con la proteína antimicrobiana. Las secuencias de codificación de las subunidades similares a MiAMP2 del cacao (Figura 4, TcAMP1 y TcAMP2) se obtuvieron de la secuencia ADN publicada del gen de vicilina de cacao (Spencer, M. E. y Hodge R. [1992] Planta 186:567-576). Se situaron dos fragmentos similares a MiAMP2 dentro del gen de vicilina de cacao en el extremo 5' (correspondiente a los restos mostrados en la Figura 4) y se diseñaron dos series de oligonucleótidos complementarios correspondientes a las secuencias de codificación deseadas. Los oligonucleótidos complementarios (90 a \sim100 bases) correspondiente a cada subunidad de cacao contenía un solapamiento de 200 bp y contenía también las secuencias de corte Nde I y Bam HI de endonucleasa de restricción.

Para TcAMP, se sintetizaron los siguientes nucleótidos:

Oligo transcrito TcAMP1: 5' GGGAATTCCA TATGTATGAG CGTGATCCTC GACAGCAATA CGAGCAATGC CAGAGGCGAT GCGAGTCGGA AGCGACTGAA GAAAGGGAGC 3';

Oligo complementario TcAMP1: 5' GAAGCGACTG AAGAAAGGGA GCAAGAGCAG TGTGAACAAC GCTGTGAAAG GGAGTACAAG GAGCAGCAGA GACAGCAATA GGGATCCACA C 3'.

Para TcAMP2, se utilizaron los siguientes oligonucleótidos:

Oligo transcrito TcAMP2: 5' GGGAATTCCA TATGCTTCAA AGGCAATACC AGCAATGTCA AGGGCGTTGT CAAGAGCAAC AACAGGGGCA GAGAGAGCAG CAGCAGTGCC AGAGAAAATG C 3';

Oligo complementario de TcAMP2: 5' GTGTGGATCC CTAGCTCCTA TTTTTTTTGT GATTATGGTA ATTCTCGTGC TCGCCTCTCT CTTGTTCCTT ATATTGCTCC CAGCATTTTC TCTGGCACTG CT 3'.

Se añadieron conjuntos de oligonucleótidos a las reacciones de ampliación por PCR individuales para preparar fragmentos por PCR individuales que contienen la zona de codificación deseada. Dado que las ampliaciones por PCR iniciales proporcionaron bandas poco definidas, se realizó la reampliación de los productos originales utilizando nuevos cebadores de 20 monómeros (complementarios con los extremos 5' de los oligonucleótidos transcrito y complementario mostrados anteriormente) diseñados para ampliar la zona de codificación completa de las subunidades de cacao. Una vez ampliados, los productos de PCR se digirieron por restricción con las enzimas apropiadas y se ligaron en el vector pET16b como anteriormente. Este procedimiento se realizó para ambos fragmentos de cacao con similitudes con MiAMP2c (mostrados en la Figura 4).

Ejemplo 11 Expresión en E. coli y purificación de MiAMP2c y homólogos

Cultivos iniciales (50 ml) de la cepa BL21 de E. coli (Grodberg, J. [1988] J. Bacteriol. 170:1245) transformados con el constructo pET apropiado (Ejemplo 10) se añadieron a 500 ml de medio NZCYM (Current Protocols in Molecular Biology, supra) y se cultivaron a una densidad óptica de 0,6 (600 nm) y se indujeron con la adición de 0,4 a 1,0 mM de IPTG dependiendo de si se estaba utilizando el vector pETI 7b (que contiene un activador T7) o pET16b (que contiene una fusión de etiqueta His y un activador T7/operador lac). Una vez se indujeron las células, se dejó desarrollar los cultivos durante 4 horas antes de la recogida. Se separaron alícuotas de los cultivos en crecimiento a intervalos de tiempo y se introdujeron extractos de proteína en un gel de SDS-PAGE para seguir los niveles de expresión de MiAMP2 y homólogos en los cultivos. Los fragmentos que se expresan con una etiqueta de Histidina (es decir, en el vector pET16b) se recogieron centrifugando los cultivos celulares inducidos a 5.000 g durante 10 minutos. Los sedimentos celulares se volvieron a poner en suspensión y se disgregaron agitando durante una hora en guanidina 6 M-HCl, tamponada con fosfato sódico 100 mM y Tris 10 mM a pH 8,0. Se centrifugaron las suspensiones celulares disgregadas a 10.000 g durante 20 a 30 minutos para sedimentar el residuo celular. Se separaron los sobrenadantes a tubos nuevos y se añadieron 500 mg de resina Ni-NTA Fast Flow (Qiagen) a cada sobrenadante. Tras mezclado suave a 4ºC durante 30 a 60 minutos, se cargó la suspensión en una columna pequeña, se enjuagó dos veces con urea 8 M (pH 8,0 y a continuación pH 6,3) y posteriormente, se eluyó la proteína utilizando urea 8 M pH 4,5. Las fracciones proteicas obtenidas de este modo fueron sustancialmente puras pero se purificaron más utilizando una columna C2/C18 en fase inversa de 9,3 \times 250 mm (Pharmacia) y un gradiente de 75 minutos desde el 5% al 50% de acetonitrilo (TFA al 0,1%) circulando a 3 ml/min (datos no mostrados).

Todos los homólogos de MiAMP2c (excepto MiAMP2c que se expresaron en pET17b) se expresaron en el vector pET16b que contiene la etiqueta Histidina. Aunque la inducción del cultivo de MiAMP2c procedió como anteriormente, el resto de la purificación fue algo diferente. En este caso, se recogieron las células que expresan a MiAMP2c por centrifugación pero se volvieron a poner en suspensión a continuación en tampón fosfato (100 mM, pH 7,0 que contenía EDTA 10 mM y PMSF 1 mM) y se abrieron por disgregación utilizando una prensa francesa. Se solubilizaron los residuos celulares que contenían cuerpos de inclusión de MiAMP2c utilizando un tampón de guanidina 6 M-HCl, MES 10 mM pH 6,0. Se recuperó a continuación el material soluble después de la centrifugación para eliminar el residuo insoluble que quedaba de la etapa de solubilización. El material soluble de guanidina-HCl se dializó a continuación frente a MES 10 mM pH 6,0 que contenía PMSF (1 mM) y EDTA (10 mM). El fraccionamiento por intercambio catiónico se realizó tal como se describe en el Ejemplo 3 excepto a una escala menor después de la etapa de diálisis. Posteriormente, la proteína de elución principal procedente de la columna de intercambio catiónico, que era MiAMP2c, se purificó más a continuación utilizando HPLC en fase inversa tal como se describe en el
Ejemplo 3.

La Figura 9 presenta el análisis del gel de SDS-PAGE de varias etapas de purificación obtenidas tras la inducción con IPTG y purificación ulterior de las proteínas expresadas. Las muestras analizadas durante la purificación de TcAMP1 fueron las siguientes: banda 1, marcadores de peso molecular; banda 2, fracción que no se une a Ni-NTA; banda 3, enjuague de la resina Ni-NTA con urea a pH 8; banda 4, enjuague de la resina Ni-NTA con urea a pH 6,3; banda 5, elución de TcAMP1 con urea a pH 4,5; y banda 6, segunda elución de TcAMP1 con urea a pH 4,5. Se purificó TcAMP2 de manera similar y se sometió también a HPLC en fase inversa para purificar más la fracción eluyendo en la resina Ni-NTA. La Figura 10 presenta la purificación en fase inversa de la subunidad número 2 de cacao (TcAMP2).

El análisis del gel de SDS-PAGE de la purificación de los fragmentos de MiAMP2a, b y d se muestra en el segundo panel de la Figura 9. Los contenidos de las bandas son los siguientes: banda 1, marcadores de peso molecular; banda 2, extracto celular preinducido de MiAMP2a; banda 3, extracto celular inducido por IPTG de MiAMP2a; banda 4, fracción que no se une por Ni-NTA a MiAMP2a; banda 5, elución de MiAMP2a en Ni-NTA; banda 6, extracto celular preinducido de MiAMP2b; banda 7, extracto celular inducido por IPTG de MiAMP2b; banda 8, fracción que no se une por Ni-NTA a MiAMP2b; banda 9, elución de MiAMP2b en Ni-NTA; banda 10, extracto celular preinducido de MiAMP2d; banda 11, extracto celular inducido por IPTG de MiAMP2d; banda 12, fracción que no se une por Ni-NTA a MiAMP2d; y banda 13, elución de MiAMP2d en Ni-NTA.

Utilizando los vectores descritos en el Ejemplo 10, MiAMP2c y 5 homólogos (es decir, MiAMP2a, MiAMP2b, MiAMP2d, TcAMP1 y TcAMP2) se expresaron todos, se purificaron y se determinó su actividad antimicrobiana. El método seguido anteriormente puede aplicarse a todos los fragmentos antimicrobianos descritos en la Figura 4. En los fragmentos purificados puede determinarse a continuación la inhibición específica frente a patógenos microbianos de interés.

Ejemplo 12 Detección de homólogos deMiAMP2 en otras especies utilizando anticuerpos producidos contra MiAMO2c

Se inmunizaron conejos por vía intramuscular según los protocolos normalizados con MiAMP2 conjugada con vacuna contra la difteria en suspensión en adyuvante incompleto de Freund. Se extrajo suero de los animales a intervalos regulares administrando después a los animales dosis añadidas de adyuvante MiAMP2 para potenciar la respuesta inmunitaria. Se extrajeron aproximadamente 100 ml de suero y se utilizaron para identificar los extractos en bruto obtenidos de varias semillas vegetales. Se cultivaron cantidades de cien gramos de semillas y se extrajeron para obtener un extracto en bruto como en el Ejemplo 1. Se separaron alícuotas de proteína en geles de SDS-PAGE y se transfirieron los geles a continuación sobre una membrana de nitrocelulosa para la detección ulterior de las proteínas que reaccionan con el anticuerpo. Se incubaron las membranas con anticuerpos primarios de conejo con MiAMP2c, se lavaron y a continuación se incubaron con IgG anti-conejo de cabra conjugada con fosfatasa alcalina para la detección colorimétrica de bandas antigénicas utilizando el sistema de sustrato químico fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo/nitroazul tetrazolio (Schleicher y Schuell). La Figura 11 demuestra que otras varias especies contienen proteínas relacionadas inmunológicamente de tamaño similar a MiAMP2c. Las bandas 1 a 15 contienen los extractos de las especies siguientes: 1) Stenocarpus sinuatus, 2) Stenocarpus sinuatus (carga 1/10), 3) Restio tremulus, 4) Mesomalaena Tetragona, 5) Nitraria billardieri, 6) Petrophile canescens, 7) Synaphae acutiloba, 8) Dryandra formosa, 9) Lambertia inermes, 10) Stirlingia latifolia, 11) Xylomelum angustifolium, 12) Conospermum bracteosum, 13) Conospermum triplinecmium, 14) marcador de peso molecular, 15) MiAMP2c pura de Macadamia integrifolia. Las bandas 1 a 13 contienen una variedad de especies, algunas de las cuales demuestra la presencia de proteínas relacionadas antigénicamente de un tamaño similar a MiAMP2c. Otras bandas que presentan pesos moleculares mayores representan probablemente las proteínas de almacenamiento en semillas del precursor mayor a partir de las cuales proceden las proteínas antimicrobianas. En las bandas 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9 y 11 a 13 pueden observarse las proteínas relacionadas antigénicamente.

Se realizaron también bioanálisis utilizando extractos en bruto de varias especies de Proteáceas. Específicamente, se ha demostrado que todos los extractos de Banksia robur, Banksia canei, Hakea gibbosa, Stenocarpus sinuatus y Stirfingia latifolia presentan actividad antimicrobiana. Esta actividad puede proceder de homólogos de MiAMP2c ya que estas especies están relacionadas con Macadamia.

Ejemplo 13 Purificación de homólogos de MiAMP2c en otras especies utilizando anticuerpos contra MiAMP2c

Basándose en la detección de proteínas relacionadas inmunológicamente en otras especies de la familia proteáceas y en la presencia de actividad antimicrobiana en extractos en bruto, se seleccionó Stenocarpus sinuatis para un experimento de fraccionamiento a gran escala en un intento de aislar homólogos de MiAMP2c. Se congelaron cinco kg de semillas de S. sinuatus en nitrógeno líquido y se molieron en un procesador de alimentos (Big Oscar Sunbeam). La semillas molidas se colocaron inmediatamente en 12 l de tampón de extracción H_{2}SO_{4} 50 mM y se extrajeron a 4ºC durante 1 hora en agitación. La suspensión se centrifugó a continuación durante 20 min a 10.000 g para separar la materia en partículas. El sobrenadante se ajustó a continuación a pH 9 utilizando una solución de amoniaco 50 mM. Se añadieron PMSF y EDTA a una concentración final de 1 y 10 mM respectivamente.

El extracto de proteína en bruto se aplicó a una columna de intercambio aniónico (Amberlite IRA-938, Rohm and Haas) (3 cm \times 90 cm) equilibrada con NH_{4}Ac 50 mM a pH 9,0 a un caudal de 40 ml/min. La proteína no ligada que comprende la fracción proteica básica se recogió y se utilizó en las etapas de purificación ulteriores.

La fracción proteica básica se ajustó a pH 5,5 con ácido acético y a continuación se aplicó a 10 ml/minuto durante 12 h a una columna (5 cm \times 60 cm) SP-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) preequilibrada con acetato amónico 25 mM. Se lavó a continuación la columna durante 3,5 h con acetato 25 mM a pH 5,5. La elución de las proteínas ligadas se consiguió aplicando un gradiente lineal de NH_{4}Ac desde 25 mM hasta 2,0 M (pH 5,5) a 10 ml/min durante 10 h. Se observó la absorbancia del eluído a 280 nm y se recogieron fracciones de 100 ml (véase la Figura 12).

Las fracciones de intercambio catiónico que interreaccionaron con el antisuero (fracciones 14 a 28, Figura 12) se purificaron más a continuación por cromatografía en fase inversa. Las fracciones que interreaccionaron se cargaron en una columna C18 en fase inversa de 7 \mum (Brownlee) equilibrada con 90% de H_{2}O, 10% de acetonitrilo y 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) (=100%A). Las proteínas ligadas se eluyeron con un gradiente lineal desde 100% de A hasta 100% de B (5% de H_{2}O, 95% de acetonitrilo, 0,08% de TFA). La absorbancia de las proteínas eluídas se controló a 214 nm y 280 nm. Se secaron al vacío las proteínas eluídas y se volvieron a poner en suspensión en agua tres veces para eliminar los vestigios de TFA de las muestras. Las fracciones 20 a 61 de la elución de la proteína en fase inversa se analizaron agrupando 2 fracciones adyacentes y realizando un análisis de transferencia Western (véase la Figura 13). Las fracciones 22 a 41 dieron una reacción positiva débil y las fracciones 42 a 57 dieron una reacción positiva fuerte al antisuero anti-MiAMP2c. Las fracciones que presentaban actividad antimicótica contra S. sclerotiorum a
50 \mug/ml y a 10 \mug/ml están indicadas con flechas en el cromatograma.

Utilizando el método anterior, se obtuvieron varias fracciones activas (denominadas SsAMP1 y SsAMP2) en las que se evaluó su actividad antimicótica contra Sclerotinia sclerotiorum, Alternaria brassicola, Leptosphaeria maculans, Verticilium dahliae y Fusarium oxysporum. Se realizaron bioanálisis tal como se describe en el Ejemplo 2 y los resultados se presentan en el Ejemplo 15. Se purificó y secuenció otro fragmento que reaccionó con antisuero de MiAMP2 (SsAMP3) pero estaba disponible proteína insuficiente para la caracterización de la actividad antimicrobiana. Las secuencias parciales obtenidas de estas proteínas se presentan en la Figura 4 (SEC. ID. nº: 26, 27 y 28). El secuenciado completo de los péptidos o la clonación de los ADNc que codifican a las proteínas de almacenamiento en semillas en estas especies pondrá de manifiesto el alcance de la homología entre estos péptidos y los homólogos de la serie MiAMP2.

Ejemplo 14 Síntesis de pequeños fragmentos de MiAMP2c

En un esfuerzo para determinar si la molécula de MiAMP2c completa era absolutamente necesaria para que la proteína presente actividad antimicrobiana, Auspep Pty. Ltd. (Australia) sintetizó químicamente dos péptidos independientes. En cada péptido, se cambiaron los restos de cisteína por restos de alanina de manera que no fueran ya capaces de formarse enlaces disulfuro entre las dos cadenas de proteína independientes. Se cambiaron también restos de tirosina por alanina ya que era de esperar que la tirosina participase también en la estabilización de hélice-espira-hélice y esto no sería necesario en los péptidos sintéticos que carecen de una de las hélices. Alanina es también favorable a la formación de hélices alfa de manera que no debería interferir en gran medida con la estructura helicoidal natural. El péptido uno está compuesto por 22 aminoácidos desde el 118 al 139 en la secuencia de aminoácidos del clon 3 (secuencia: RQRDP QQQAE QAQKR AQRRE TE, SEC. ID. nº: 9). El péptido 2 es: de 25 aminoácidos de longitud y va desde el 140 al 164 en el clon 3 (secuencia: PRHMQ IAQQR AERRA EKEKR KQQDR, SEC. ID. nº: 10). Los péptidos 1 y 2 son el pep1 de MiAMP2c y el pep2 de MiAMP2c marcados respectivamente. Estos péptidos se volvieron a poner en suspensión en agua Milli-Q y se bioanalizaron frente a numerosos hongos. Como se observa en la Tabla 2, el péptido 2 presenta actividad inhibidora frente a una variedad de hongos mientras que el péptido 1 presenta poca o ninguna actividad. Las mezclas de péptido 1 y péptido 2 presentan niveles similares de actividad como se observa con el péptido 2 solo, lo que indica que solamente el péptido 2 está presentando actividad. El hecho de que el péptido 2 presente actividad antimicrobiana en ausencia de la estructura hélice-espira-hélice presentada por MiAMP2c pone de manifiesto que la estructura hélice-espira-hélice no es absolutamente necesaria para que los péptidos conserven la actividad. No obstante, el péptido 2 no presentó el mismo grado de actividad en una base molar como MiAMP2c (fragmento completo) lo que indica que la estructura hélice-espira-hélice es importante para la expresión máxima de la actividad antimicrobiana por los fragmentos implicados. Asimismo es de esperar que la estructura hélice-espira-hélice proporcione mayor estabilidad a los homólogos de MiAMP2, haciendo de este modo a estas proteínas menos susceptibles a la escisión proteolítica y a otras formas de degradación. Mayor estabilidad conduciría al mantenimiento de la actividad antimicrobiana durante un periodo de tiempo mayor.

Ejemplo 15 Actividad antimicótica de homólogos y fragmento(s) de MiAMP2c

Se analizaron MiAMP2c y cada uno de varios homólogos de MiAMP2 frente a una variedad de hongos a concentraciones comprendidas entre 2 y 50 \mug/ml. La Tabla 1 presenta el índice IC_{50} de MiAMP2c pura frente a varios hongos y bacterias. En la tabla, ">50" indica que no se consiguió la inhibición del 50% de los hongos a 50 \mug/ml que fue la mayor concentración probada. La abreviatura "ND" indica que no se realizó el ensayo o que no se pudieron interpretar los resultados. Se determinó también la actividad antimicrobiana de MiAMP2c en presencia de Ca^{2+} 1 mM en el ensayo medio y los índices IC_{50} para estos ensayos se dan en la columna de la derecha. Como puede apreciarse en la tabla, la actividad inhibidora de MiAMP2c está reducida en gran medida (aunque no eliminada) en presencia
de Ca^{2+}.

TABLA 1 Concentraciones de MiAMP2c a las que se observó 50% de inhibición del crecimiento

Organismo	IC_{50} (\mug/ml)	IC_{50} + Ca^{2+} (\mug/ml)
Alternaria helianthi	5-10	ND
Candida albicans	> 50	> 50
Ceratocystis paradoxa	20-50	> 50
Cercospora nicotianae	5-10	5-10
Clavibacter michiganensis	50	> 50
Chalara elegans	2-5	10-20
Fusarium oxysporum	10	20-50
Sclerotinia sclerotiorum	20-50	> 50
Phytophthora cryptogea	5-10	10-25
Phytophthora parasitica nicotiana	10-20	> 50
Verticillium dahliae	5-10	> 50
Ralstonia solanacearum	> 50	> 50
Pseudomonas syringae tabaci	> 50	> 50
Saccharomyces cerevisiae	20-50	> 50
Escherichia coli	> 50	> 50

La Tabla 2 presenta la actividad antimicrobiana de varios homólogos y fragmentos de MiAMP2c. En la tabla, se utilizan las siguientes abreviaturas: Ab, Alternaria brassicola; Cp: Ceratocystis paradoxa; Foc: Fusarium oxysporum; Lm: Leptosphaeria maculans; Ss: Sclerotinia sclerotiorum; Vd: Verticillium dahliae. ">50" indica que a concentraciones superiores a 50 \mug/ml no se determinaron de modo que no se pudo demostrar un valor de IC_{50}. Un espacio en blanco indica que no se realizó la prueba o que no pudieron interpretarse los resultados.

La TcAMP1 y 2 utilizadas para los resultados presentados en la Tabla 2 se determinaron en vicilina de cacao (Ejemplos 10 y 11). SsAMP1 y 2 presentan reactividad con los anticuerpos de MiAMP2c y presentan asimismo actividad antimicrobiana como se observa en la tabla a continuación. Las versiones de MiAMP2a, b y d así como TcAMP1 y TcAMP2 demostraron en el bioanálisis que todas contienen una fusión de la etiqueta His procedente de la expresión en el vector pET16b. pep1 y 2 de MiAMP2c son las zonas N y C terminales, respectivamente, del péptido antimicrobiano MiAMP2c tal como se especifica en el Ejemplo 14 anterior. El valor de la concentración listado para "MiAMP2c pep 1+2" es la concentración de cada péptido individual en la mezcla. Debe recordarse que pep1 y pep2 de MiAMP2c son ambos aproximadamente ½ del tamaño de MiAMP2c; las comparaciones de la actividad de estos péptidos con la proteína MiAMP2c debería, por consiguiente, realizarse en base molar en lugar de en base de concentración estricta de \mug/ml. Los péptidos se probaron únicamente en medio A que no contenía Ca^{2+} añadido.

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TABLA 2 Valores de IC_{50} (\mug/ml) de proteínas relacionadas con MiAMP2 frente a varios hongos

Péptido probado	Hongos utilizados en el bioanálisis
	Ab	Cp	Foc	Lm	Ss	Vd
MiAMP2a			5-10	2,5-5	5-10
MiAMP2b			2,5	2,5	5-10
MiAMP2c		20-50	10		20-50	5-10
MiAMP2d			5	2,5	5-10
MiAMP2c pep1			100		>50
MiAMP2c pep2			10-20	10-20	50	10-20
MiAMP2c pep 1+2			10-25		50
TcAMP1		10	5-10	2-5	10	5-20
TcAMP2		5-10	5-10	2-5	5	5-20
SsAMP1			20-50	20-50	20-50	10-20
SsAMP2	20-50		>50	>50	>50	>50

Es digno de apuntar que aunque las secuencias 1 y 2 de TcAMP están fácilmente disponibles en las bases de datos públicas, no se había asignado nunca ninguna actividad antimicrobiana a ellas. Estas secuencias proceden de proteínas mucho mayores implicadas en las funciones de almacenamiento en semillas. Los inventores han descrito así una actividad completamente nueva para una parte pequeña de las moléculas de vicilina de cacao en conjunto. La actividad de los fragmentos 1, 2 y 3 del algodón ha sido ejemplificada por otros autores (Chung, R. P. T. et al. [1997] Plant Science 127:1-16).

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Ejemplo 16 Construcción del vector PCV91-MiAMP2c de transformación de plantas

El vector de expresión pPCV91-MiAMP2c (Figura 14) contiene la zona de codificación completa del ADN de MiAMP2c (Ejemplo 7) flanqueada en su extremo 5' por el activador constitutivo potente de ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (pCaMV35S) (Odel et al., [1985] Nature 313: 810-812) con un elemento potenciador de la repetición cuádruple (e-35S) que permite actividad de transcripción elevada (Kay et al. [1987] Science 236:1299-1302). La zona de codificación del ADN de MiAMP2c está flanqueada en su extremo 3' por la secuencia de poliadenilación del ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (pA35S). El eje central del plásmido de este vector es el plásmido pPCV91 (Walden, R. et al. [1990] Methods Mol. Cell. Biol. 1:175-194). El plásmido contiene también otros elementos útiles para la transformación de la planta tal como un gen con resistencia a la ampicilina (bla) y un gen con resistencia a la higromicina (hph) dirigidos por el activador nos (pnos). Estas y otras características permiten la selección en varios procedimientos de clonación y transformación. El plásmido pPCV-91-MiAMP2c se construyó de la forma siguiente: Un fragmento clonado que codifica a MiAMP2c (Ejemplo 7) se digirió utilizando las enzimas de restricción para liberar el fragmento génico de MiAMP1 que contiene una secuencia principal sintética. El vector binario pPCV91 se digirió con la enzima de restricción Bam HI. Tanto el fragmento de ADN de MiAMP2c como el vector binario se ligaron utilizando T4 ADN ligasa para producir el vector binario pPCV91-MiAMP2c para la transformación de la planta (Figura 12).

Utilizando este método, pueden expresarse otros homólogos de MiAMP2c en plantas. No solamente pueden expresarse homólogos individuales, sino que pueden expresarse en combinación con otras proteínas como proteínas de fusión o como partes de proteínas precursoras mayores. Por ejemplo, es posible expresar la zona N-terminal del clon 1 de MiAMP2 (aminoácidos 1 a \sim246) que contiene un péptido señal y la zona hidrófila que contiene cuatro segmentos antimicrobianos. Pueden evaluarse a continuación plantas transgénicas para examinar si los fragmentos individuales están siendo procesados en los fragmentos esperados por el sistema de tratamiento ya presente en las células vegetales. También es posible expresar el clon 1 completo de MiAMP2 (aminoácidos 1 a 666) y examinar el tratamiento de la proteína completa cuando se expresa en plantas transgénicas. Las zonas homólogas procedentes de otras secuencias pueden también utilizarse en combinaciones múltiples con, por ejemplo, diez (10) o más fragmentos similares a MiAMP2 expresados como una proteína de fusión grande con secuencias de escisión ácidas situadas como posiciones apropiadas entre cada uno de los fragmentos. Además de unir los fragmentos de MiAMP2, también sería posible unir los fragmentos de MiAMP2 a otras proteínas útiles para la expresión en
plantas.

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Ejemplo 17 Transformación de plantas que expresan MiAMP2c (o fragmentos relacionados)

La cepa GV3101 (pMP90RK) de Agrobacterium tumefaciens desarmada (Koncz, C. s. [1986] Mol. Gen. Genet. 204:383-396) se transformó con el vector pPCV91-MiAMP1 (Ejemplo 12) utilizando el procedimiento de Walkerpeach et al. (Walkerpeach, C. R. et al. Plant Mol. Biol. Manual B1:1-19 [1994]) adaptado de Van Haute (Van Haute, E. et al. [1983] EMBO J. 2:411-417 [1983]).

La transformación del tabaco se realizó utilizando discos foliares de Nicotiana tabacum basándose en el procedimiento de Horsch et al. Science 227:1129-1231 [1985]) y cultivando conjuntamente cepas que contienen pPCV91-MiAMP1. Tras el cultivo conjunto de discos foliares de Agrobacterium y tabaco, las plantas transgénicas (transformadas con pPCV91-MiAMP1) se regeneraron en un medio que contiene 50 \mug/ml de hidromicina y 500 \mug/ml de Cefotaxima. En estas plantas transgénicas se analizó a continuación la expresión de los genes recién introducidos utilizando técnicas de transferencia Western habituales (figura 15). La figura 15 muestra una transferencia Western de los extractos de tabaco transgénico que llevan el constructo para MiAMP2c del ejemplo 16. La línea 1 contiene MiAMPC2c pura como un estándar, las líneas 2 y 3 contienen extractos de plantas transgénicas que llevan el constructo pPCU91-MiAMP2c. Como se puede apreciar en la figura, las bandas tenues están presentes en aproximadamente el peso molecular correcto, indicando que las plantas transgénicas parecen expresar la proteína MiAMP2c. Las plantas capaces de expresión constitutiva de los genes introducidos pueden seleccionarse y autopolinizarse para dar semillas. Los plantones F1 de las plantas transgénicas pueden analizarse más.

\newpage

Ejemplo 18 Homólogos de MiAMP2c

Cada homólogo de MiAMP2c que se ha probado ha presentado alguna actividad antimicrobiana. Esta prueba indica que otros homólogos presentarán asimismo actividad antimicrobiana. Estos homólogos incluyen fragmentos de 1) cacahuete (Burks, A. W. et al. [1995] J. Clin. Invest. 96 (4), 1715-1721), 2) maíz (Belanger, F. C. y Kriz, A. L. [1991] Genetics 129 (3), 863-872), 3) cebada (Heck, G. R. et al. [1993] Mol. Gen. Genet. 239 (1-2), 209-218) y 4) soja (Sebastiani, F. L. et al. [1990] Plant. Mol. Biol. 15 (1), 197-201), (véanse las SEC. ID. nº: 21, nº: 22, nº: 24 y nº: 25). Es de esperar asimismo que otras secuencias procedentes de proteínas de almacenamiento en semillas de la clase 7S proporcionen homólogos de proteínas MiAMP2.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(A): SOLICITANTE: COOPERATIVE RESEARCH CENTRE EOR TROPICAL PLANT PATHOLOGY

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(B): CALLE: The University of Queensland

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(C): CIUDAD: St. Lucía

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(D): ESTADO: Queensland

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(E): PAÍS: Australia

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4067

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas antimicrobianas

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 28

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(iv):: LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 666 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Macadamia integrifolia

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

3

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2171 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Macadamia integrifolia

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DENOMINACIÓN/CLAVE: sig_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 1..85

\vskip0.800000\baselineskip

(x): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DENOMINACIÓN/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 86..1999

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 666 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Macadamia integrifolia

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DENOMINACIÓN/CLAVE: sig_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 1..28

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DENOMINACIÓN/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 29..666

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2171 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Macadamia integrifolia

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DENOMINACIÓN/CLAVE: sig_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 1..86

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DENOMINACIÓN/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 87..1999

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 625 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Macadamia integrifolia

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DENOMINACIÓN/CLAVE: sig_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 1..625

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2140 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Macadamia integrifolia

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DENOMINACIÓN/CLAVE: partial mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 1..1875

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 525 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Theobroma cacao

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 590 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Gossypium hirsutum

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: nucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGCAGCAGT ATGAGCAGTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTTCGTAK CKKCKTTCGC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACACCAATAG CGACAACGTG ATCC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTTGTTTTC TCTATTCCTA GGGTTG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 90 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 91 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 101 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 102 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Cacahuete

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 46 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Maíz

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 22:

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Maíz

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Cebada

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 55 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Semilla de soja (Glicina máx.)

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Stenocarpus sinuatus

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Stenocarpus sinuatus

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 27:

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORGANISMO: Stenocarpus sinuatus

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Semillas

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

44

Claims

1. Fragmento de proteína con actividad antimicrobiana, en el que dicho fragmento de proteína se selecciona de entre los siguientes:

(i): un polipéptido con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre:

: restos 29 a 73 de SEC. ID. nº: 1

: restos 74 a 116 de SEC. ID. nº: 1

: restos 117 a 185 de SEC. ID. nº: 1

: restos 186 a 248 de SEC. ID. nº: 1

: restos 29 a 73 de SEC. ID. nº: 3

: restos 74 a 116 de SEC. ID. nº: 3

: restos 117 a 185 de SEC. ID. nº: 3

: restos 186 a 248 de SEC. ID. nº: 3

: restos 1 a 32 de SEC. ID. nº: 5

: restos 33 a 75 de SEC. ID. nº: 5

: restos 76 a 144 de SEC. ID. nº: 5

: restos 145 a 210 de SEC. ID. nº: 5

: restos 34 a 80 de SEC. ID. nº: 7

: restos 81 a 140 de SEC. ID. nº: 7

: restos 33 a 79 de SEC. ID. nº: 8

: restos 80 a 119 de SEC. ID. nº: 8

: restos 120 a 161 de SEC. ID. nº: 8

: restos 32 a 91 de SEC. ID. nº: 21

: restos 25 a 84 de SEC. ID. nº: 22

: restos 29 a 94 de SEC. ID. nº: 24

: restos 31 a 85 de SEC. ID. nº: 25

: restos 1 a 23 de SEC. ID. nº: 26

: restos 1 a 17 de SEC. ID. nº: 27

: restos 1 a 28 de SEC. ID. nº: 28

(ii): un polipéptido que contiene un espaciamiento de cisteína relativo C-2X-C-3X-C-nX-C-3X-C-3X-C, en el que X es cualquier resto de aminoácidos distinto de la cisteína, C es cisteína y n es 11 ó 12;

(iii): un polipéptido que contiene un espaciamiento de cisteína relativo Z-2X-C-3X-C-nX-C-3X-C-3X-Z y la tirosina/fenilalanina, en el que X es cualquier resto de aminoácidos distinto de la cisteína, C es cisteína, Z es tirosina o fenilalanina y n es 11 ó 12;

(iv): un polipéptido que contiene un espaciamiento de cisteína relativo C-3X-C-nX-C-3X-C-, en el que X es cualquier resto de aminoácido distinto de la cisteína; C es cisteína y n es 11 ó 12;

(v): un polipéptido con el mismo espaciamiento de los restos con carga positiva en relación con el espaciamiento de los restos de cisteína que (i).

2. Proteína que contiene por lo menos un fragmento de polipéptido según la reivindicación 1, en el que dicho fragmento de polipéptido presenta una secuencia seleccionada dentro de una secuencia que comprende la SEC. ID. nº: 1, la SEC. ID. nº: 3 o la SEC. ID. nº: 5.

3. Proteína que presenta una secuencia seleccionada de entre la SEC. ID. nº: 1, la SEC. ID. nº: 3 o la SEC. ID. nº: 5.

4. ADN aislado o sintético que codifica un fragmento de polipéptido según la reivindicación 1.

5. ADN según la reivindicación 4, en el que dicho ADN presenta una secuencia seleccionada de entre la SEC. ID. nº: 2, la SEC. ID. nº: 4 o la SEC. ID. nº: 6.

6. Constructo de ADN que incluye un ADN según la reivindicación 4 ligado funcionalmente a elementos para la expresión de dicha proteína codificada.

7. Planta transgénica que alberga un constructo de ADN según la reivindicación 6.

8. Planta transgénica según la reivindicación 7, en la que dicha planta es una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea.

9. Planta transgénica según la reivindicación 7, en la que dicha planta se selecciona de entre maíz, plátanos, cacahuete, guisantes, girasol, tomates, canela, tabaco, trigo, cebada, avena, patatas, semillas de soja, algodón, claveles, rosas o sorgo.

10. Material reproductivo de una planta transgénica según la reivindicación 7.

11. Composición que comprende una proteína antimicrobiana según la reivindicación 1, junto con un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde un punto de vista agrícola.

12. Composición que comprende una proteína antimicrobiana según la reivindicación 1, junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

13. Procedimiento para el control de la infestación microbiana de una planta, comprendiendo dicho procedimiento:

i): tratar dicha planta con una proteína antimicrobiana según la reivindicación 1 o con una composición según la reivindicación 11; o

ii): introducir un constructo de ADN según la reivindicación 6 en dicha planta.