ES2277352T3 - Proteina antimicrobiana. - Google Patents

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John Michael Manners
John Paul Marcus
Kenneth Clifford Goulter
Jodie Lyn Green
Stuart John Harrison
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Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Queensland University of Technology QUT
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University of Queensland UQ
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Abstract

SE DESCRIBE UNA NUEVA FAMILIA DE PROTEINAS ANTIMICROBIANAS. SE PUEDE AISLAR UNA PROTEINA PROTOTIPO DE MACADAMIA INTEGRIFOLIA. TAMBIEN SE DESCRIBE DNA QUE CODIFICA LA PROTEINA ASI COMO ESTRUCTURA DE DNA QUE SE PUEDEN UTILIZAR PARA EXPRESAR LA PROTEINA ANTIMICROBIANA O PARA INTRODUCIR LA PROTEINA ANTIMICROBIANA EN UNA PLANTA. SE PUEDEN ADMINISTRAR COMPOSICIONES QUE LLEVAN LA PROTEINA ANTIMICROBIANA O LA PROTEINA ANTIMICROBIANA PER SE A PLANTAS O ANIMALES MAMIFEROS PARA COMBATIR LA INFESTACION MICROBIANA.

Description

Proteína antimicrobiana.
Campo técnico
La presente invención se refiere a proteínas aisladas que ejercen actividad inhibidora sobre el crecimiento de hongos y bacterias, comprendiendo dichos hongos y bacterias algunos patógenos microbianos de plantas y animales. La invención se refiere asimismo a genes recombinantes que incluyen secuencias que codifican la proteínas antimicrobianas, cuyos productos de expresión pueden contribuir a la defensa de las células vegetales o de otras células de organismos contra la invasión de patógenos microbianos. La invención se refiere además a la utilización de las proteínas y/o de los genes que codifican las proteínas para el control de microbios en enfermedades clínicas humanas y veterinarias.
Antecedentes de la técnica
Las enfermedades microbianas de plantas son un problema significativo para las industrias agrícolas y hortícolas. Las enfermedades de las plantas en general producen anualmente millones de toneladas de pérdidas de cosechas siendo las enfermedades micóticas y bacterianas responsables de partes significativas de estas pérdidas. Una posible manera de combatir las enfermedades micóticas y bacterianas consiste en proporcionar plantas transgénicas capaces de expresar una proteína o proteínas que de alguna manera aumentan la resistencia de la planta al ataque patógeno. Una estrategia sencilla consiste en identificar en primer lugar una proteína con actividad antimicrobiana in vitro, clonar la secuencia de ADN que codifica la proteína, preparar un constructo génico híbrido para la expresión eficaz de la proteína en las plantas, transferir este gen a las plantas transgénicas y evaluar el efecto del gen introducido sobre la resistencia a los patógenos microbianos en comparación con las plantas de referencia.
La primera y más importante etapa en la estrategia para el control de la enfermedad descrita anteriormente consiste en identificar una proteína con actividad antimicrobiana potente. En los últimos años, se han identificado y descrito muchas proteínas vegetales diferentes con actividad antimicrobiana y/o antimicótica. Estas proteínas han sido clasificadas en varias clases según su modo de acción supuesto y/o sus homologías de secuencia de aminoácidos. Estas clases incluyen las siguientes: quitinasas (Roberts, W. K. et al. [1986] Biochim. Biophys. Acta 880:161-170); \beta-1,3-glucanasas (Manners, J. D. et al. [1973] Phytochemistry 12:547-553); tioninas (Bolmann, H. et al. [1988] EMBO J. 7:1559-1565 y Fernández de Celaya, R. et al. [1972] Appl. Microbiol. 23:998-1000); permatinas (Roberts, W. K. et al. [1990] J. Gen. Microbiol. 136:1771-1778 y Vigers, A. J. et al. [1991] Mol. Plant-Microbe Interact. 4:315-323); proteínas inactivadoras de ribosomas (Roberts, W. K. et al. [1986] Biochim. Biophys. Acta 880:161-170 y Leah, R. et al. [1991] J. Biol. Chem. 266:1564-1573); defensinas vegetales (Terras, F. R. G. et al. [1995] The Plant Cell 7:573-588); proteínas que se unen a quitina (De Bolle, M. F. C. et al. [1992] Plant Mol. Biol. 22:1187-1190 y Van Parijs, J. et al. [1991] Planta 183:258-264); proteínas similares a taumatina o similares a osmotina (Woloshuk, C. P. et al. [1991] The Plant Cell 3:619-628 y Hejgaard, J. [1991] FEBS Letts. 291:127-131); proteínas de tipo PR1 (Niderman, T. et al. [1995] Plant Physiol. 108:17-27); proteínas no específicas de transferencia de lípidos (Terras, F. R. G. et al. [1992] Plant Physiol. 100:1055-1058 y Molina, A. et al. [1993] FEBS Letts. 3166:119-122); y, proteínas de knottin o similares a knottin (Cammue, B. P. A. et al. [1992] J. Biol. Chem. 67:2228-2233). Además, las plantas no son la única fuente de proteínas antimicrobianas y existen muchos informes del aislamiento de proteínas antimicrobianas de animales y de células microbianas (estudiado en Gabay, J. E. [1994] Science 264:373-374 y en "Antimicrobial peptides" [1994] CIBA Foundation Symposium 186, John Wiley y Sons Publ., Chichester, UK).
Existen algunas pruebas de que la expresión ectópica de los genes que codifican proteínas que presentan actividad antimicrobiana in vitro en plantas transgénicas puede producir aumento de resistencia a patógenos microbianos. Ejemplos de esta resistencia manipulada genéticamente incluyen las plantas transgénicas que expresan genes que codifican: una quitinasa vegetal, ya sea sola (Broglie, K. et al. [1991] Science 254:1194-1197) o en combinación con una \beta-1,3-glucanasa (Van den Elzen, P. J. M. et al. [1993] Phil. Trans. Roy. Soc. 342:271-278); una defensina vegetal (Terras, F. R. G. et al. [1995] The Plant Cell 7:573-588); una proteína similar a osmotina (Liu, D. et al. [1994] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1888-1892); una proteína de la clase PR1 (Alexander, D. et al. [1993] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7327-7331) y una proteína que inactiva ribosomas (Logemann, J. et al. [1992] Bio/Technology 10:305-308).
Aunque la utilización potencial de proteínas antimicrobianas para modificar genéticamente la resistencia a la enfermedad en plantas transgénicas ha sido descrita extensamente, existen otras aplicaciones que son dignas de mención. En primer lugar, pueden utilizarse proteínas antimicrobianas muy potentes para el control de enfermedades de plantas por aplicación directa (De Bolle, M. F. C. et al. [1993] en Mechanisms of Plant Defence Responses, B. Fritig y M. Legrand eds., Kluwer Acad. Publ., Dordrecht, NL, págs. 433-436). Además, los péptidos antimicrobianos tienen aplicaciones terapéuticas potenciales en medicina humana y veterinaria. Aunque esto no ha sido descrito para los péptidos de origen vegetal se está explorando activamente en los péptidos de animales y se ha conseguido pruebas clínicas (Jacob, L. y Zasloff, M. [1994] en "Antimicrobial Peptides", CIBA Foundation Symposium 186, John Wiley and Sons Publ., Chichester, UK, págs. 197-223).
La invención descrita en la presente memoria constituye una proteína no descubierta anteriormente y nueva con actividad antimicrobiana. Esta proteína puede aislarse de las plantas Macadamia integrifolia (Mi). Macadamia integrifolia pertenece a la familia Proteaceae M. integrifolia, conocida también como Bauple Nut o Queensland Nut es considerada por algunos como la mejor nuez comestible del mundo. Por esta razón se cultiva comercialmente extensamente, tanto en Australia como en ultramar (Williams, Keith A. W., Native Plants (Queensland), volumen II, 1984, publicado por Keith A. W. Williams e impreso por Printcraft de Newstead, Qld, Australia).
Sumario de la invención
Según una primera forma de realización de la invención, se proporciona una proteína antimicrobiana aislada o sintética seleccionada de entre las siguientes:
(i)
una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos 27 a 102 de la secuencia mostrada en la Figura 6 (SEC. ID. nº: 1);
(ii)
un homólogo de (i);
(iii)
una proteína que tiene forma tridimensional esencialmente igual que (i) y que presenta esencialmente la misma actividad antimicrobiana que (i);
(iv)
una proteína que incluye un espaciamiento afín a la cisteína de -C-9X-C-X-C-25X-C-14X-C-11X-C-, en el que X es cualquier resto de aminoácidos distinto de cisteína; y
(v)
una proteína aislada de la familia Proteaceae que reacciona específicamente con anticuerpos producidos contra (i) y que presenta esencialmente la misma actividad antimicrobiana que (i).
Según una segunda forma de realización de la invención, se proporciona un ADN aislado o sintético que codifica una proteína según la primera forma de realización.
Según una tercera forma de realización de la invención, se proporciona un constructo de ADN que incluye un ADN según la segunda forma de realización unido funcionalmente a elementos para la expresión de dicha proteína codificada.
Según una cuarta forma de realización de la invención, se proporciona una célula hospedadora que alberga un constructo de ADN según la tercera forma de realización.
Según una quinta forma de realización de la invención, se proporciona una planta transgénica que alberga un constructo de ADN según la tercera forma de realización.
Según una sexta forma de realización de la invención, se proporciona material reproductivo de una planta transgénica según la quinta forma de realización.
Según una séptima forma de realización de la invención, se proporciona una composición que comprende una proteína antimicrobiana según la primera forma de realización junto con un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde un punto de vista agrícola.
Según una octava forma de realización de la invención, se proporciona una composición que comprende una proteína antimicrobiana según la primera forma de realización junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Según una novena forma de realización de la invención, se proporciona un procedimiento de control de la infestación microbiana de una planta, comprendiendo dicho procedimiento:
i)
introducir un constructo de ADN según la tercera forma de realización en dicha planta; o
ii)
tratar dicha planta con una proteína antimicrobiana según la primera forma de realización o con una composición según la séptima forma de realización.
Según una décima forma de realización de la invención, se proporciona un procedimiento de control de la infestación microbiana de un animal mamífero, procedimiento que comprende el tratamiento del animal con una proteína antimicrobiana según la primera forma de realización o con una composición según la octava forma de realización.
Otras formas de realización de la invención incluyen procedimientos para producir proteína antimicrobiana.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 presenta un perfil de cromatografía de intercambio catiónico de la fracción de proteína básica extraída de nueces de Macadamia con los resultados de un bioanálisis mostrado por fracciones de interés.
La Figura 2 presenta un perfil de HPLC en fase inversa de las fracciones 31 y 32 muy inhibidoras tomadas de la separación por intercambio catiónico y de los correspondientes datos del bioanálisis.
La Figura 3 presenta un análisis por SDS-PAGE de MiAMP1 purificada.
La Figura 4 presenta los resultados de un análisis espectrométrico de masas de MiAMP1.
La Figura 5 representa los resultados de un análisis espectrométrico de masas de MiAMP1 reducida y alquilada.
La Figura 6 presenta la secuencia de aminoácidos de MiAMP1 junto con una secuencia nucleotídica que codifica la proteína.
La Figura 7 representa una transferencia Western de los extractos de proteína de varias especies de Proteaceae utilizando antisuero de conejo contra MiAMP1.
La Figura 8 es una cartografía del plásmido pPCV91-MiAMP1.
La Figura 9 es una cartografía del plásmido pET-MiAMP1.
La Figura 10 representa un gel teñido de SDS-PAGE utilizado para las muestras de análisis de cultivos de E. coli transformada y no transformada.
Mejor modo y otros modos de poner en práctica la invención
En adelante se utilizan las abreviaturas siguientes:
FBS
suero bovino fetal
EDTA
ácido etilendiamintetracético
LDH
lactato deshidrogenasa
MeCN
cianuro de metilo (acetonitrilo)
Mi
Macadamia integrifolia
MiAMP1
proteína 1 antimicrobiana de Macadamia integrifolia
ND
no determinado
PCR
reacción en cadena de polimerasa
PMSF
fluoruro de fenilmetilsulfonilo
SDS-PAGE
electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico poliacrilamida
TFA
ácido trifluoroacético
TPCK
tosilfenilalanina clorometilcetona
RACE
ampliación rápida de los extremos de ADNc
Los presentes inventores han identificado una nueva clase de proteínas antimicrobianas. Una proteína prototipo puede aislarse de las semillas de Macadamia integrifolia (en adelante Mi). La invención proporciona así una proteína antimicrobiana de por sí así como secuencias de ADN que codifican la proteína antimicrobiana.
La invención proporciona asimismo un procedimiento de obtención de proteínas relacionadas procedentes del tejido vegetal de la familia Proteaceae. Con los anticuerpos producidos contra un ejemplo concreto de la proteína antimicrobiana - proteína antimicrobiana de Macadamia integrifolia número uno (MiAMP1), - es posible identificar el tejido de otras especies de árboles relacionados con Macadamia integrifolia. Otras especies de Macadamia así como especies en la categoría más amplia de la familia Proteaceae son los objetivos primarios de dicha identificación. De hecho, como se muestra en el Ejemplo 10, dicha identificación ha sido utilizada para identificar varias especies que contienen proteínas que están relacionadas con MiAMP1 basadas en la respuesta antigénica, el tamaño y la localización en el tejido de la semilla. La identificación de las proteínas relacionadas no necesita estar limitada a la familia Proteaceae ya que es probable que otras especies puedan contener también proteínas similares.
La invención proporciona asimismo una secuencia de aminoácidos del prototipo de proteína antimicrobiana (Ejemplo 9). A partir de esta secuencia, puede derivarse la secuencia de ADN que codifica la proteína por traducción inversa de la secuencia de aminoácidos. El ADN que tiene una secuencia nucleotídica que codifica la proteína antimicrobiana puede sintetizarse a continuación químicamente (y/o enzimáticamente) o aislarse del tejido vegetal de las Macadamias utilizando procedimientos de clonación normalizados como se describe en los manuales de laboratorio tales como Current Protocols in Molecular Biology (copyright 1987-1995, editado por Ausubel F. M. et al. y publicado por John Wiley & Sons, Inc., impreso en los EEUU).
La proteína antimicrobiana de por sí manifestará una determinada estructura tridimensional que puede determinarse utilizando técnicas de cristalografía de rayos X o resonancia magnética nuclear. Esta estructura será responsable en gran parte de la actividad antimicrobiana de la proteína. A partir de la secuencia de la proteína, es posible asimismo hacer predicciones que se refieren a posibles configuraciones y motivos estructurales (estructura secundaria) que probablemente serán exhibidos por la proteína. Se apreciará que un experto en la materia pueda tomar una proteína de estructura conocida y alterar significativamente la secuencia e incluso conservar la forma tridimensional general y la actividad antimicrobiana de la proteína. Un aspecto de la estructura es probablemente no pudiera alterarse sin graves consecuencias en el contenido de cisteína y el espaciado de los restos de cisteína ya que esto destruiría la formación de los enlaces disulfuro que son críticos para mantener la estructura general de la proteína. Otros restos que probablemente sean críticos al determinar la forma y función de la proteína son la glicina y la prolina que suponen configuraciones únicas en los ejes centrales de las proteínas. Asimismo, la distribución de restos con carga (es decir, arginina, lisina, histidina, glutamato y aspartato) en el espacio tridimensional de la proteína serán importantes para la estructura y la actividad que se presenta. En particular, se ha demostrado que una densidad elevada de restos con carga positiva proporciona actividad antimicrobiana en una variedad de proteínas (Pathak et al. [1995] PROTEINS: Structure, Function and Genetics 22:182-186).
Las secuencias de ADN que codifican estas proteínas puede deducirse utilizando las tablas de codones habituales. Utilizando este número finito de posibles secuencias de ADN, pueden derivarse sondas oligonucleotídicas y utilizarse para aislar el gen o genes existente(s) (Ejemplo 11) así como secuencias de referencia. Es posible también sintetizar químicamente el gen utilizando un instrumento de síntesis de ADN habitual (tal como un instrumento Beckman Oligo 1000) junto con técnicas conocidas para construir fragmentos de gen sintetizados en un gen completo (véase Current Protocols in Molecular Biology, supra).
Este gen, bajo el control de un activador constitutivo o inducible (Ejemplos 12 y 14), puede clonarse a continuación en un sistema biológico que permite la expresión de la proteína (Ejemplos 13 y 15). Son conocidos los procedimientos de transformación que permiten a la proteína expresarse en una variedad de sistemas. La proteína puede de esta manera expresarse en cualquier sistema adecuado a fin de producir la proteína para su utilización posterior. Los hospedadores adecuados para la expresión de esta proteína incluyen E. coli, células de hongos, células de insecto, células de mamífero y plantas. Los procedimientos normalizados para expresar las proteínas en dichos hospedadores se describen en una variedad de textos que se incluyen en el apartado 16 (Protein Expression) de Current Protocols in Molecular Biology (supra).
Las células vegetales pueden transformarse con constructos de ADN de la invención según una variedad de procedimientos conocidos (Agrobacterium, plásmidos Ti, electroporación, microinyecciones, pistola de microproyectiles y similares). Para la expresión en plantas, la secuencia de ADN que codifica, MiAMP1, por ejemplo, se utilizaría junto con una secuencia de ADN que codifica la secuencia de péptido señal heteróloga que dirigiría la proteína a un compartimento celular concreto (p. ej., al apoplasto o la vacuola). Estas secuencias de codificación podrían estar ligadas a una secuencia activadora de la planta que aseguraría la expresión acusada en las células vegetales. Esta secuencia activadora puede asegurar la expresión constitutiva acusada de la proteína en la mayoría o en todas las células vegetales, puede ser un activador que asegure la expresión en los tejidos o células específicos que son susceptibles a las infecciones microbianas y puede ser también un activador que asegure la inducción acusada de la expresión durante el proceso de infección. Estos tipos de casetes génicos incluirán asimismo una terminación de la transcripción y una secuencia 3' de poliadenilación de la zona de codificación de MiAMP para asegurar la producción y la estabilización eficaz del ARNm que codifica la MiAMP. Es posible que la expresión eficaz de la MiAMP pueda facilitarse por inclusión de su secuencia de ADN en una secuencia que codifica una proteína mucho mayor que se procesa en la planta para producir una o más moléculas activas de MiAMP. Los casetes génicos que codifican MiAMP tal como se describió anteriormente pueden expresarse a continuación en células vegetales utilizando dos procedimientos corrientes. En primer lugar, los casetes génicos podrían ligarse en vectores binarios que llevan, i) secuencias en el extremo izquierdo y derecho que flanquean el T-ADN del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, ii) un gen marcador seleccionable adecuado para la selección de células vegetales resistentes a antibióticos, iii) orígenes de replicación que funcionan en A. tumefaciens o Escherichia coli y iv) genes con resistencia a antibióticos que permiten la selección de células que llevan plásmidos de A. tumefaciens y E. coli. Este vector binario que lleva el gen híbrido que codifica a MiAMP1 podría introducirse por electroporación o por acoplamiento tripaterno en cepas de A. tumefaciens que llevan plásmidos de Ti desarmados tales como las cepas LBA4404, GV3101 y AGL1 o en las cepas de A. rhizogenes tales como R4 o NCCP1885. Estas cepas de Agrobacterium pueden cultivarse conjuntamente a continuación con explantes vegetales adecuados o tejido vegetal intacto y las células vegetales transformadas y/o los regenerantes seleccionarse utilizando la resistencia al antibiótico (Ejemplos 12 y 13). La expresión de la proteína MiAMP1 en las plantas transgénicas puede detectarse utilizando anticuerpos producidos contra la proteína o utilizando bioanálisis antimicrobiano. Un segundo procedimiento de transferencia génica a plantas puede conseguirse mediante la inserción directa del gen en las células vegetales diana. Por ejemplo, el casete génico que codifica a MiAMP1 puede precipitarse conjuntamente en partículas de oro o tungsteno junto con un plásmido que codifica un gen híbrido para la resistencia a antibióticos en plantas. Las partículas de tungsteno pueden acelerarse utilizando un flujo rápido de gas helio y permitir que las partículas bombardeen un tejido vegetal adecuado. Éste puede ser un cultivo celular embrionario, un explante vegetal, un tejido calloso o una suspensión celular o un meristema intacto. Las plantas pueden recuperarse utilizando el gen con resistencia al antibiótico para la selección y los anticuerpos utilizarse para detectar células vegetales que expresan la proteína MiAMP1. Estos y otros procedimientos relacionados para la expresión de la MiAMP1 en plantas se describen en "Plant Molecular Biology" (2ª ed., editada por Gelvin, S. B. y Schilperoort, R. A., © 1994 publicado por Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Países Bajos).
Tanto las plantas monocotiledóneas como las dicotiledóneas pueden transformarse y regenerarse. Las plantas que pueden modificarse genéticamente incluyen granos, cultivos de forraje, frutos, vegetales, cultivos de semilla y de aceite, palmeras, silvicultura y vinos. Ejemplos específicos de plantas que pueden modificarse son los siguientes: maíz, plátanos, cacahuete, guisantes, girasol, tomates, canela, tabaco, trigo, cebada, avena, patatas, soja, algodón, clavel, sorgo, altramuz y arroz. Éstos, así como otras plantas agrícolas, pueden transformarse con los genes antimicrobianos de modo que presenten un mayor grado de resistencia al ataque patógeno. Alternativamente, pueden utilizarse proteínas para el control de enfermedades por aplicación tópica.
La invención se refiere también a la aplicación de la proteína antimicrobiana en el control de patógenos de mamíferos incluyendo los humanos. La proteína puede utilizarse en aplicaciones tópicas o intravenosas para el control de infecciones microbianas.
Proteína antimicrobiana de Macadamia integrifolia (MiAMP1)
Como se indicó anteriormente, se ha identificado y caracterizado una nueva clase de proteína antimicrobiana potente (aislada de las semillas de Mi). La clase incluye un factor proteico específico, denominado MiAMP1 como se definió anteriormente. La proteína es muy básica con un valor pI previsto de 10,1 y contiene 6 restos de cisteína (Ejemplos 8 y 9) que se supone que son importantes en la creación de la estructura tridimensional de la proteína mediante la formación de enlaces disulfuro. Además, la masa molecular relativa de la proteína se ha determinado por espectrometría de masas que se demuestra que es de 8.134 \pm 2 Da. La secuencia de aminoácidos no comparte ninguna homología significativa con las proteínas descritas anteriormente en las bases de datos de la secuencia (Swiss Prot y bases de datos no redundantes) investigadas utilizando el algoritmo blast (Altschul, S. F. et al. [1990] J. Mol. Biol. 215:403) construyendo éste una proteína antimicrobiana desconocida hasta ahora. La proteína no se ajusta a ninguna de las clases descritas anteriormente de proteínas antimicrobianas de ninguna de las fuentes vegetales, animales o microbianas.
La proteína MiAMP1 presenta una gama amplia de actividad antimicótica (Ejemplo 4). MiAMP1 presenta una inhibición muy significativa del crecimiento micótico a concentraciones tan bajas como 1 \mug/ml para alguno de los patógenos/microbios contra los que se probó la proteína con valores de IC_{50} tan bajos como 2 \mug/ml. Por lo tanto, puede utilizarse para proporcionar protección contra varias enfermedades vegetales. MiAMP1 puede utilizarse como fungicida o antibiótico mediante aplicación a partes de la planta. La proteína puede utilizarse también para inhibir el crecimiento de patógenos expresándolos en todas las plantas transgénicas (Ejemplo 13). La proteína puede utilizarse para el control de los patógenos humanos por aplicación tópica o inyección intravenosa. Una característica de la proteína consiste en que la inhibición de algunos microbios se suprime por la presencia de Ca^{2+} (1mM).
Haciendo referencia de manera específica a las formas de realización de la invención definidas anteriormente, una proteína antimicrobiana preferida según la primera forma de realización es MiAMP1. Esta proteína tiene una secuencia correspondiente a los restos 27 a 102 de la secuencia mostrada en la Figura 6 (SEC. ID. nº: 1).
Las proteínas antimicrobianas según la invención pueden aislarse por cualquiera de los procedimientos conocidos por los expertos en la materia incluyendo el procedimiento ejemplificado en la presente memoria. Las proteínas antimicrobianas pueden sintetizarse bien por vía química o enzimática. Estos procedimientos de nuevo serán conocidos por los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en Hancock, D. C. et al. (1995) Mol. Biotech. 4(1):73-86, y Wong, C. H. y Wang, K. T. (1991) Experientia (Basel) 47(11-12):1123-1129.
Un homólogo de la proteína de la Figura 6 se define como una proteína que presenta sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia mostrada en la figura. Esto significa que la mayoría de los restos presentes en MiAMP1 estarán presentes en un homólogo en la misma posición relativa entre sí o estará representado por otro resto de aminoácido que contenga una cadena lateral con propiedades similares. Por ejemplo, es posible frecuentemente intercambiar asparagina y ácido aspártico; alanina y glicina; serina, treonina y alanina; isoleucina, valina y leucina; así como lisina y arginina; mientras que, los restos de cisteína e histidina pueden ser sustituidos raras veces con otros aminoácidos (Bordo, D. y Argos, P. [1991] J. Mol. Biol. 217:721-729). Un experto en la materia apreciará que un homólogo pueda tener muchas sustituciones conservadoras aparte de los ejemplos ya mencionados. Haciendo referencia a la tercera forma de realización de la invención, el término "constructo" incluye vectores tales como plásmidos, cósmidos, virus y similares, así como ADN desnudo de por sí. Los elementos de control que pueden incluirse en los constructos son conocidos por los expertos en la materia. Ejemplos de dichos elementos son los activadores, los potenciadores, las señales de poliadenilación y los terminadores de transcripción.
El material reproductivo de un vegetal transgénico, como el referido en la sexta forma de realización, incluye semillas, plantas de la descendencia y material clonal.
Como se aborda en las séptima y octava formas de realización de la invención definidas anteriormente, las proteínas antimicrobianas según la primera forma de realización pueden incluirse en las composiciones para la administración a plantas y animales mamíferos. Una proteína antimicrobiana puede estar presente en una composición como sal de la proteína. Dichas sales serán conocidas por los expertos en la materia como dispone la naturaleza de los vehículos, diluyentes o excipientes que puedan incluirse en las composiciones. Por ejemplo, el vehículo presente en una composición farmacéutica puede ser un tampón fisiológicamente compatible tal como la solución de Hank o de Ringer, la solución salina fisiológica, una mezcla constituida por solución salina y glucosa, y solución heparinizada de citrato sódico-ácido cítrico y dextrosa. La composición farmacéutica puede administrarse por vía oral o parenteral según el objeto del tratamiento, y puede prepararse en polvo, gránulos, una solución para administración por inyección u oral, comprimidos, supositorios, óvulos vaginales, pomada, crema, gel o aerosol. Las composiciones para utilización agrícola se administran típicamente por atomización.
Las composiciones pueden incluir otros agentes antimicrobianos además de una proteína antimicrobiana según la invención. Dichos agentes serán típicamente un agente antimicótico.
Los ejemplos no limitativos de la invención se exponen a continuación.
Ejemplo 1 Extracción de la proteína básica de semillas de Macadamia integrifolia
Veinticinco kilogramos de nueces de Mi (adquiridas en la Macadamia Nut Factory Queensland, Australia) se molieron en un procesador de alimentos (The Big Oscar, Sunbeam) y la harina resultante se extrajo durante 2 a 4 horas a 4ºC con 50 l de un tampón de extracción enfriado en hielo que contenía NaH_{2}PO_{4} 10 mM, Na_{2}HPO_{4} 15 mM, KCl 100 mM, EDTA 2 mM, polivinilpirrolidona al 0,75% y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,5 mM. El homogeneizado resultante se pasó a través de un colador de cocina para eliminar el material en partículas mayores y a continuación se clarificó más por centrifugación (4.000 rpm durante 15 min.) en una centrifugadora de gran capacidad. Se añadió sulfato amónico sólido al sobrenadante para obtener 30% de saturación relativa y el precipitado se dejó formar toda la noche en agitación a 4ºC. Después de la centrifugación a 4.000 rpm durante 30 min., se extrajo el sobrenadante y se añadió sulfato amónico para conseguir 70% de saturación relativa. Se dejó precipitar la solución durante a noche y a continuación se centrifugó a 4.000 rpm durante 30 min. para recoger la fracción proteica precipitada. La proteína precipitada se volvió a poner en suspensión en un volumen mínimo de tampón de extracción y se centrifugó una vez más (13.000 rpm \times 30 min.) para eliminar la fracción no disuelta. Después de la diálisis (etanolamina 10 mM pH 9,0, EDTA 2 mM y PMSF 1 mM) para eliminar el sulfato amónico residual, la solución proteica se pasó a través de una columna Q-Sepharose Fast Flow (5 \times 12 cm) equilibrada previamente con etanolamina 10 mM (pH 9) en EDTA 2 mM.
El flujo a través recogido de esta columna representa la fracción proteica básica (pI > 9) de las semillas. Esta fracción se continúa purificando tal como se describe en el Ejemplo 3.
Ejemplo 2 Ensayos de actividad antimicrobiana
En general, los bioanálisis para evaluar la actividad antimicótica y antibacteriana se realizaron en placas de microvaloración de 96 pocillos. Típicamente, el organismo de ensayo se puso en suspensión en un medio de cultivo sintético constituido por K_{2}HPO_{4} (2,5 mM), MgSO_{4} (50 \muM), CaCl_{2} (50 \muM), FeSO_{4} (5 \muM), CoCl_{2} (0,1 \muM), CuSO_{4} (0,1 \muM), Na_{2}MoO_{4} (2 \muM), H_{3}BO_{3} (0,5 \muM), Kl (0,1 \muM), ZnSO_{4} (0,5 \muM), MnSO_{4} (0,1 \muM), glucosa (10 g/l), asparagina (1 g/l), metionina (20 mg/l), mio-inositol (2 mg), biotina (0,2 mg/l), tiamina-HCl (1 mg/l) y piridoxina-HCl (0,2 mg/l). El organismo de ensayo estaba constituido por células bacterianas, esporas de hongos (50.000 esporas/ml) o fragmentos de micelio de hongos (producidos por mezclado de una masa de hifas procedentes de un cultivo del hongo que va a ensayarse y a continuación filtrando a través de una malla fina para eliminar las masas de hifas mayores). En cada pocillo de la placa de microvaloración se colocaron cincuenta microlitros del organismo de ensayo suspendidos en el medio. Se añadieron 50 \mul más de la solución antimicrobiana de ensayo a los pocillos apropiados. Para tratar la variabilidad pocillo a pocillo en el bioanálisis, se realizaron 4 réplicas de cada solución de ensayo. Se utilizaron dieciséis pocillos de cada placa de 96 pocillos como referencias para comparación con las soluciones de ensayo.
A menos que se indique de otra manera, el organismo de ensayo utilizado fue Phytophthora cryptogea y la incubación fue a 25ºC durante 48 horas. Todos los hongos incluyendo la levadura se cultivaron a 25ºC y E. coli se cultivó a 37ºC. El porcentaje de inhibición del crecimiento se midió siguiendo la absorbancia a 600 nm de los cultivos en crecimiento durante varios intervalos de tiempo y se define como 100 veces la relación del cambio medio en la absorbancia en los pocillos de referencia menos el cambio de absorbancia en el pocillo de ensayo dividido por el cambio medio de absorbancia a 600 nm para los pocillos de referencia (es decir [(cambio medio en los pocillos de referencia - cambio en el pocillo de referencia) / (cambio medio en los pocillos de referencia)] \times 100). Típicamente, se tomaron mediciones a intervalos de 24 horas y se utilizó el periodo de 24 a 48 horas para las mediciones de % de inhibición.
Ejemplo 3 Purificación de la proteína antimicrobiana de la fracción proteica básica de Macadamia integrifolia
El material de partida para el aislamiento de la proteína antimicrobiana Mi fue la fracción básica extraída de las semillas maduras tal como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Esta proteína se siguió purificando por cromatografía de intercambio catiónico como se muestra en la Figura 1.
Aproximadamente 4 g de la fracción proteica básica disueltos en succinato sódico 20 mM (pH 4) se aplicaron a una columna S-Sepharose High Performance (5 \times 60 cm) (Pharmacia) equilibrada previamente con el tampón de succinato. Se eluyó la columna a 17 ml/min con un gradiente lineal de 20 litros de NaCl desde 0 hasta 2 M en succinato sódico 20 mM (pH 4). Se controló el eluído para la proteína mediante una medición en línea de la absorbancia a 280 nm (véase Figura 1) y se recogió en fracciones de 200 ml. Las porciones de cada fracción se determinaron posteriormente en el ensayo de actividad antimicótica a una concentración de 100 \mug/ml. Los resultados de este bioanálisis están incluidos en la Figura 1: las barras sombreadas representan el porcentaje de inhibición mostrando la fracción más activa el 100% de inhibición. El fraccionamiento proporcionó numerosos picos no resueltos eluyendo entre 0,05 y 1 M de NaCl. Un pico mayor eluyendo a aproximadamente 6 horas en la separación (fracciones 31 y 32) presentó la actividad antimicrobiana más significativa.
Las fracciones que presentan actividad antimicrobiana significativa se continuaron purificando por cromatografía en fase inversa. Cantidades de aproximadamente 1 mg de las fracciones 31 y 32 combinadas se cargaron en una columna Pep-S (C_{2}/C_{18}) (25 \times 0,93 cm) (Pharmacia) equilibrada con 95% de H_{2}O/5% de MeCN/0,1% de TFA (=100% de A). La columna se eluyó a razón de 3 ml/min con un gradiente lineal de 300 ml (100 min.) desde 100% de A hasta 5% de H_{2}O/95% de MeCN/0,1% de TFA (=100% de B). Los picos individuales se recogieron manualmente, se secó al vacío tres veces para eliminar los vestigios de TFA y se volvieron a poner en suspensión posteriormente en 500 \mul de agua milli-Q (sistema de purificación de agua de Millipore Corporation) para su utilización en bioanálisis tal como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 2 presenta el perfil de HPLC de la fracción 31/32 purificada procedente de la separación por intercambio catiónico mostrada en la Figura 1. La elución de la proteína se controló a 214 nm. La actividad antimicrobiana fue bioanalizada en los picos individuales: las barras en la Figura 2 muestran la inhibición correspondiente a 100 \mug/ml de material de cada uno de los picos. La proteína activa que constituye el pico 7 que eluye a aproximadamente 47 min (35% de MeCN) se denominó MiAMP1.
Ejemplo 4 Potencia antimicrobiana de MiAMP1
MiAMP1 se purificó como en el Ejemplo 3. Se determinó la potencia antimicrobiana tal como se describió anteriormente en el Ejemplo 2. La Tabla 1 a continuación presenta el índice IC_{50} de MiAMP1 pura cuando se determina frente a varios hongos y bacterias. En la tabla, ">100" indica que no se determinaron las concentraciones mayores de 100 \mug/ml; "<x" indica que no se determinó una concentración menor del valor (x). La abreviatura "ND" indica que no se realizó el ensayo o que no se pudieron interpretar los resultados. La proteína antimicrobiana se determinó también en presencia de Ca^{2+} 1 mM en el ensayo medio y los índices IC_{50} para estos ensayos se dan en la columna de la izquierda. Como puede apreciarse en la tabla, la actividad inhibidora de MiAMP1 está reducida en gran medida (aunque no completamente eliminada) en presencia de Ca^{2+}.
TABLA 1 Concentraciones de MiAMP1 en las que se observó 50% de inhibición del crecimiento
Organismo IC_{50} (\mug/ml) IC_{50} + Ca^{2+}
Alternaria helianthi 2-5 > 100
Aspergillus fumigatus > 100 > 100
Botrytis cinerea 2-5 > 100
Candida albicans > 100 > 100
Ceratocystis paradoxa 20 75
Colletotrichum falcatum > 100 > 100
Colletotrichum gloeosporioides 2-5 > 100
Fusarium oxysporum 2-5 100
Leptosphaeria maculans 5 > 100
Macrophomina phaseolina <25 > 100
Microsporum gypseum > 100 > 100
Phytophthora cryptogea 5-10 > 100
Pythium graminicola 5 > 100
TABLA 1 (continuación)
Organismo IC_{50} (\mug/ml) IC_{50} + Ca^{2+}
Sclerotinia sclerotiorum 5 > 100
Sclerotium rolfsii > 100 > 100
Verticillium dahliae 2-5 > 100
Saccharomyces cerevisiae ND 1-5
Clavibacter michiganensis <10 <10
Pseudomonas rubrilineans > 100 > 100
Escherichia coli > 100 ND 
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Ejemplo 5 Efecto de MiAMP1 purificada sobre las células vegetales
Dado que MiAMP1 puede ser una proteína útil para expresarse en las plantas agrícolas transgénicas, los investigadores determinaron si MiAMP1 era tóxica para las células vegetales. Se cultivaron cultivos de microcallos de tabaco (Nicotiana plumbaginofolia) en medio CSV modificado (Gibson, 1976 nº 219) en la oscuridad con agitación a 110 rpm a 28ºC como para el procedimiento descrito en Gibson et al. (Gibson et al. [1976] Plant 128:223-229). Alícuotas de cincuenta microlitros de proteína antimicrobiana esterilizada por filtración en medio 1 \times CSV se añadieron a 50 \mul de suspensiones celulares vegetales para obtener una concentración final de 100 \mug/ml. Después de incubación durante la noche a 28ºC, se realizó un ensayo con fenosafranina más diacetato de fluoresceína para estimar la viabilidad celular. Se añadieron cincuenta microlitros de solución madre de FDA (5 mg/ml en acetona) a 2,5 ml de solución madre PS (0,05% en medio de cultivo) para preparar la mezcla colorante (Widholm, J. M. [1972] Stain Technology 47:189-194). Una gota del colorante mezclado se añadió a una gota de suspensión celular y se observó a continuación al microscopio de campo brillante y al microscopio de excitación de UV para determinar la viabilidad celular. Se utilizó una solución al 0,1% de Triton X-100 como referencia positiva en estos experimentos. Los cultivos de microcallos del tabaco no presentaban ninguna disminución de viabilidad medida por el número de células fluorescentes (tinción con diacetato de fluoresceína) ni ningún aumento en el número de células muertas (tinción con fenosafranina) en la exposición a MiAMP1 a concentraciones hasta de 100 \mug/ml durante hasta 72 horas.
Ejemplo 6 Efecto de MiAMP1 sobre las células cultivadas y los glóbulos rojos humanos
Se realizaron ensayos de toxicidad con cultivos de células HeLa para investigar la toxicidad de MiAMP1 para con las células humanas. Se mantuvo un cultivo de células HeLa en un cultivo de monocapa a 37ºC con 5% de CO_{2} en medio RPMI 1640 modificado (Trace Biosciences, NSW, Australia). Se enriqueció medio RPMI con suero bovino fetal (FBS) al 10%, L-glutamina 2 mM, 2 g/l de NaHCO_{3} más penicilina G (10.000 U/l) y sulfato de estreptomicina (100 g/l). Cantidades de cien microlitros de células recién recogidas y diluidas se transfirieron a placas de microvaloración (10^{4} - 10^{5} células por pocillo). Una vez las células se habían llegado a acoplar y casi confluentes, se eliminó el sobrenadante y se reemplazó con 100 \mul de proteína antimicrobiana esterilizada por filtración previamente suspendida en 1 \times medio de cultivo celular. Se añadieron por triplicado concentraciones de hasta 1 mg/ml de proteína antimicrobiana a pocillos que contenían una microcapa de células HeLa y los cultivos se incubaron a continuación durante la noche a 37ºC con 5% de CO_{2}. Las células se incubaron también en presencia de hordotionina a concentraciones entre 10 y 400 \mug/ml como referencias positivas. Tras la incubación, se eliminó el sobrenadante, se enjuagaron las células con 2\times solución salina tamponada con fosfato (KH_{2}PO_{4} 1,5 mM, K_{2}HPO_{4} 8 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 135 mM a 37ºC) y se tiñeron a continuación con colorante rojo neutro (Terras, F. R. G. et al. [1992] J. Biol. Chem. 267:15301-15309). En el sobrenadante del cultivo se determinó asimismo la actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) como una medición de la muerte celular (Legrand [1992] J. Biotech. 25:231-243). Además de la determinación en el medio normal, se determinaron también las células en el medio que carece de FBS debido a la posibilidad de que FBS pueda enmascarar la toxicidad.
La viabilidad o proliferación celular no se afectó a concentraciones tan elevadas como 1 mg/ml tal como se demostró por examen microscópico y cuantificación de la absorción de colorante tras la tinción. En cambio, la hordotionina (una proteína conocida por ser antibiótico para con las células humanas) produjo una pérdida completa de viabilidad celular a concentraciones de 10 \mug/ml y superiores. La falta de efecto sobre la viabilidad celular de MiAMP1 se confirmó midiendo las concentraciones de LDH en sobrenadantes de cultivo que no presentaban ningún cambio en las concentraciones.
Además de los ensayos de viabilidad celular, se realizaron ensayos hemolíticos con eritrocitos humanos según Cammue (Cammue, B. P. A. et al. [1995] Plant Physiol. 109:445-455). Se lavaron los eritrocitos humanos varias veces volviendo a poner en suspensión las células en fosfato 10 mM, NaCl 120 mM, KCl 27 mM (pH 7,2), mezclando suavemente y sedimentando las células con centrifugación suave (3 min., 300 g). Cuando el sobrenadante no presentaba ninguna decoloración visible, se volvieron a poner en suspensión las células en PBS para obtener una suspensión al 0,5%. Se añadieron alícuotas de 100 \mul a pocillos de placa de microvaloración. Se añadieron soluciones proteicas (100 \mul) a pocillos individuales para conseguir concentraciones finales entre 10 y 500 \mug/ml. Se utilizó Triton X-100 (concentración final del 0,05%) como referencia positiva para hemolisis y se utilizó agua como referencia negativa. Se incubaron las suspensiones celulares durante 1 h a 37ºC, se centrifugó la placa de microvaloración a 300 g, 10ºC, durante 5 min y el sobrenadante se transfirió a una placa fresca tras lo cual se midió la absorbancia (405 nm). Estos ensayos no mostraron ninguna lisis de glóbulos rojos en el momento de la exposición a MiAMP1 a concentraciones hasta de 100 \mug/ml. Los resultados contrastan con los péptidos antimicrobianos de tionina (p. ej. hordotionina) que se ha descrito que producen la destrucción de los eritrocitos cultivados a concentraciones entre 5 y 40 \mug/ml (Terras, F. R. G. et al. [1992] J. Biol. Chem. 267:15301-15309).
Ejemplo 7 Pureza de MiAMP1 aislada
Se verificó la pureza de la proteína antimicrobiana aislada por SDS-PAGE natural seguido de tinción con solución de tinción de proteínas azul coomassie (véase Figura 3). Se realizó la electroforesis en un gel con gradiente entre el 10 y el 20% de tricina (Novex) siguiendo las recomendaciones de los fabricantes (100 V, tiempo de separación de 1 a 2 horas). Se incluyen las normas (Kaleidascope polypeptide standards, Biorad) en la banda 3, para determinar un peso molecular aproximado de la proteína.
En la Figura 3 puede apreciarse que la MiAMP1 purificada migra a aproximadamente 8 kDa junto con la aprotinina en patrones de peso molecular (P.M. de los patrones que aparecen desde la parte superior a la inferior en la Figura 3: 38,6 kDa, 25,0 kDa, 16,3 kDa, 7,8 kDa, 3,4 kDa). La detección de una única banda principal en el análisis SDS-PAGE junto con un único pico que eluye en intercambio catiónico analítico y separaciones en fase inversa (no mostradas), proporciona una indicación acusada de que la actividad de la MiAMP1 era debido a la proteína purificada sola y no a un componente contaminante menor.
Ejemplo 8 Análisis espectroscópico de masas de MiAMP1
MiAMP1 purificada se sometió a análisis espectroscópico de masas. Se utilizó aproximadamente 1 \mug de proteína en solución para el análisis. El análisis demostró que la proteína tiene un peso molecular de 8.134 Da \pm 2 Da (véase la Figura 4). Además, la proteína se sometió a reducción de enlaces disulfuros con ditiotreitol y alquilación con 4-vinilpiridina. El producto de esta reducción/alquilación se sometió también a continuación a análisis espectroscópico de masas y se demostró que había ganado 638 unidades de masa (es decir, el peso molecular aumentó hasta 8.773 \pm 2 Da, véase la Figura 5). La ganancia de masa se interpretó que indicaba que seis grupos 4-vinilpiridina (masa 106 Da) habían reaccionado con la proteína reducida, lo que indica que la proteína contiene un total de 6 restos de cisteína. El contenido de cisteína se ha confirmado también posteriormente por secuenciado de aminoácidos y de nucleótidos (véase los Ejemplos 9 y 11).
Ejemplo 9 Secuencia de aminoácidos de MiAMP1
Aproximadamente 1 \mug de la proteína pura que había sido reducida y alquilada se sometió a secuenciado N-terminal por degradación automática de Edman. En un primer secuenciado, se determinaron 35 restos de la secuencia. Posteriormente, se digirió MiAMP1 con la endoproteinasa Lys-C que escinde después el grupo carboxilo de los restos lisilo. Se digirió un miligramo de la proteína reducida/alquilada con Lys-C (Boehringer Mannheim) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Se purificaron los fragmentos por HPLC en fase inversa y se secuenciaron. Utilizando este digesto, se determinó la secuencia de la proteína hasta el resto 68. Tras la digestión del fragmento Lys-C con la enzima de endoproteinasa (TPCK tratada, Sigma) proporcionó dos fragmentos. El secuenciado ulterior proporcionó dos restos adicionales de la secuencia para dar 70 restos de la secuencia parcial (véase la Figura 6 para la secuencia completa de la proteína madura). Posteriormente, los 6 aminoácidos restantes se dedujeron de la secuencia del ADN (véase Figura 8) para dar la secuencia de la proteína completa de 76 restos de aminoácidos. La Figura 6 presenta la secuencia de la proteína madura (encasillada) así como la secuencia del péptido señal (subrayada) determinada a partir de la secuencia del ADNc (Ejemplo 8). El comienzo ATG de la traducción y los codones de terminación TAG están también subrayados en la secuencia nucleotídica presentada anteriormente en la secuencia de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de la proteína que se ha determinado, fue posible para predecir la masa de la proteína. Utilizando el programa informático MacVector 4.5.3, se obtuvo una masa prevista de 8.137,51 Da. Dependiendo del número de enlaces disulfuros que se formen, la masa de proteína estará comprendida entre 8.131,5 y 8.137,5 Da. Esta es una coincidencia estrecha con la masa de 8.134,4 \pm 2 Da obtenida por análisis espectrométrico de masas (Ejemplo 5) incluso si la proteína forma supuestamente 3 enlaces disulfuros (disminuyendo la masa en 6 Da). Dado que la masa de la proteína medida por espectrometría de masas y la masa calculada a partir de la secuencia de aminoácidos coincidió casi exactamente, la secuencia de aminoácidos se interpretó que es correcta.
Ejemplo 10 Identificación de las proteínas relacionadas en otras escisiones de la familia Proteaceae
Se inmunizaron por vía intramuscular conejos según los protocolos normalizados con MiAMP1 conjugada con vacuna contra la difteria en suspensión en adyuvante incompleto de Freund. Se extrajo suero de los animales a intervalos regulares administrando después a los animales dosis añadidas de adyuvante MiAMP1 para potenciar la respuesta inmunitaria. Se extrajeron aproximadamente 100 ml de suero y se utilizaron para identificar los extractos en bruto obtenidos de varias semillas vegetales. Se cultivaron cantidades de cien gramos de semillas y se extrajeron para obtener un extracto en bruto como en el Ejemplo 1. Se separaron alícuotas que contenían cantidades de 5 y 50 \mug en geles de SDS-PAGE y los geles se transfirieron a continuación sobre membrana de nitrocelulosa para la detección ulterior de las proteínas antigénicas. Se incubaron las membranas con anticuerpos primarios de conejo MiAMP1, se lavaron y a continuación se incubaron con IgG anticonejo de cabra conjugada con fosfatasa alcalina para la detección colorimétrica de las bandas antigénicas utilizando el sistema de sustrato químico fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo/nitroazul tetrazolio (Schleicher y Schuell). En la Figura 7 se representa una membrana teñida.
La Figura 7 demuestra que varias especies de Proteaceae contienen proteínas relacionadas antigénicamente de tamaño similar a MiAMP1. Las bandas 1 a 22 contienen los extractos siguientes: 1) Persoonia levis, 2) Stirlingia simplex, 3) Isopogon trilobus, 4) Protea pulchra, 5) Cardwellia sublimis, 6) Stenocarpus sinuatus, 7) Telopea oreades, 8) Xylomelum protocea, 9) Macadamia integrifolia, 10) Grevillea robusta, 11) Hakea platysperma, 12) Banksia asplenifolia, 13) Banksia robur, 14) MiAMP1 (pura), 15) arroz, 16) cebada, 17) garbanzo, 18) judía mungo, 19) Flindersia australis, 20) rábano, 21) canela, 22) MiAMP1 (pura). Las bandas 1 a 14 contienen extractos de la familia Proteaceae y todas presentan la presencia de proteínas relacionadas antigénicamente de un tamaño similar a MiAMP1 (incluyendo una señal muy débil en la banda 2 que no se fotografió bien). Las bandas de referencia (15 a 21) que contienen extractos de las especies no relacionadas no presentan ninguna proteína de tamaño y antigenicidad similares.
Se realizaron también bioanálisis utilizando varios extractos en bruto de la especie Proteáceas. Específicamente, se ha demostrado que los extractos de Banksia robur, Banksia canei, Hakea gibbosa, Stenocarpus sinuatus, Stirlingia latifolia y Macadamia integrifolia que presentan actividad antimicrobiana.
Ejemplo 11 Clonación molecular de ADN que codifica MiAMP1
Se utilizaron cebadores degenerados correspondientes a la secuencia nucleotídica traducida a la inversa en reacciones de PCR con transcriptasa inversa (secuencia del cebador \alpha 5' CCG AAG CAG TTG CA[C/G/T] GC[C/G/T] C 3' y la secuencia del cebador \beta 5' GAG [C/A]G[T/G] TAT [T/A][C/G][T/G] AAG TGT GG 3'). Los productos de la PCR se secuenciaron a continuación directamente (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit de Perkin Elmer Corporation) después de la escisión de las bandas de ADN en geles de agarosa y purificándolos utilizando un kit de limpieza de ADN de Qiagen. Utilizando este método, los investigadores fueron capaces de ampliar un fragmento de 160 pares de bases de ADN procedente de de ARNm de almendras de Mi utilizando ADNc como plantilla en la reacción en cadena de polimerasa. Se diseñaron a continuación cebadores de oligonucleótidos específicos a partir de esta secuencia nucleotídica para su utilización en la ampliación rápida de 5' y 3' de los extremos del ADNc (RACE). El protocolo 3' RACE utilizó un cebador específico procedente de la secuencia nucleotídica conocida (cebador alfa, 5' TGC TCT CTA CAA CCA GGC TG 3') junto con un cebador oligo d(T)_{25} (cebador \beta) para ampliar un fragmento correspondiente al extremo 3' del ADNc (Figura 6, posiciones 334 a 493). El protocolo 5' RACE utiliza otro cebador específico (cebador \beta, 5'-GCA TTG GAT GAA GAT ACT C-3') procedente de la secuencia conocida en combinación con un cebador (cebador \alpha, 5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3') diseñado para hibridar eficazmente al ADNc terminado en poli-C utilizado en el protocolo 5' RACE (Frohman, M. A. [1990] "RACE: Rapid amplification of cDNA ends", en PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, Innis, M. A., Gelfan, D. H., Sninsky, J. J. y White, T. J. eds., págs. 28-38, Academic Press, Londres). El protocolo 5' RACE condujo a la determinación de las bases 1 a 282 (Figura 6). Posteriormente, se sintetizaron dos cebadores específicos correspondientes a los extremos 5' y 3' y se utilizaron para ampliar un fragmento nucleotídico casi completo (Figura 6, posiciones 15 a 481) que se ligó directamente en el punto de clonación de un vector pGEM-T (Promega) para manipulaciones y secuenciado posteriores.
Ejemplo 12 Construcción del vector pPCV91-MiAMP1 de transformación de plantas
El vector de expresión pPCV91-MiAMP1 (Figura 8) contiene la zona de codificación completa del ADN de MiAMP1 flanqueada en su extremo 5' por el activador constitutivo potente de ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (pCaMV35S) (Odel et al., [1985] Nature 313:810-812) con un elemento potenciador de la repetición cuádruple (e-35S) que permite la actividad de transcripción elevada (Kay et al. [1987] Science 236:1299-1302). La zona de codificación del ADN de MiAMP1 está flanqueada en su extremo 3' por la secuencia de poliadenilación del ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (pA35S). El eje central del plásmido de este vector es el plásmido pPCV91 (Walden, R. et al. [1990] Methods Mol. Cell. Biol. 1:175-194). El plásmido contiene también otros elementos útiles para la transformación de la planta tal como un gen con resistencia a la ampicilina (bla) y un gen con resistencia a la higromicina (hph) conducido por el activador nos (pnos). Estas y otras características permiten la selección en varios procedimientos de clonación y transformación. El plásmido pPCV-91-MiAMP1 se construyó de la forma siguiente: El fragmento clonado por PCR en el vector pGEM-T (Ejemplo 11) se digirió utilizando las enzimas de restricción Sac II y Spe I para liberar el fragmento génico MiAMP1. El vector binario pPCV91 se digirió con la enzima de restricción Bam HI. Tanto el fragmento de ADN de MiAMP1 como el vector binario se trataron a continuación con T4 ADN polimerasa para truncar las prolongaciones. Posteriormente, se ligaron los dos fragmentos utilizando T4 ADN ligasa para producir el vector binario pPCV91-MiAMP1 para la transformación de la planta (Figura 8).
Ejemplo 13 Transformación de la planta
La cepa GV3101 (pMP90RK) de Agrobacterium tumefaciens desarmada (Koncz, C. S. [1986] Mol. Gen. Genet. 204:383-396) se transformó con el vector pPCV91-MiAMP1 (Ejemplo 12) utilizando el procedimiento de Walkerpeach et al. (Walkerpeach, C. R. et al. [1994] Plant Mol. Biol. Manual B1:1-19) adaptado de Van Haute (Van Haute, E. et al. [1983] EMBO J. 2:411-417).
La transformación del tabaco se realizó utilizando discos foliares de Nicotiana tabacum basándose en el procedimiento de Horsch et al. (Horsch et al. [1985] Science 227:1129-1231) y cultivando conjuntamente cepas que contienen pPCV91-MiAMP1. Tras el cultivo conjunto de discos foliares de Agrobacterium y tabaco, las plantas transgénicas (transformadas con pPCV91-MiAMP1) se regeneraron en un medio que contiene 50 \mug/ml de hidromicina y 500 \mug/ml de Cefotaxima. En estas plantas transgénicas se analizó a continuación la expresión de los genes recién introducidos utilizando técnicas de transferencia Western habituales. Las plantas capaces de expresión constitutiva de los genes introducidos pueden seleccionarse y autopolinizarse para dar semillas. Los plantones F1 de las plantas transgénicas pueden analizarse más.
Ejemplo 14 Construcción del vector de expresión bacteriano pET-MiAMP1
Los cebadores por PCR que flanquean la zona de codificación del gen de MiAMP1 se manipularon genéticamente para que contengan los puntos de restricción de Nde I y Bam HI (correspondientes a los extremos 5' y 3' de la zona de codificación, respectivamente). Estos cebadores se utilizaron a continuación para ampliar la zona de codificación del ADNc de MiAMP1. Tras la digestión con Nde I y Bam HI, el producto de PCR de esta ampliación se ligó a continuación en un vector pET-17b (Novagen/Studier, F. W. et al. [1986] J. Mol. Biol. 189:113) con la zona de codificación en el marco para producir el vector pET-MiAMP1 (Figura 9).
Ejemplo 15 Expresión de la proteína MiAMP1 en cultivo líquido
La cepa BL21 de E. coli (Grodberg, J. [1988] J. Bacteriol. 170:1245) transformada con el vector pET-MiAMP1 (Ejemplo 14) se cultivó hasta una densidad óptica de 0,6 y se provocó con adición de IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido) 0,4 mM. Las alícuotas del cultivo de crecimiento se eliminaron a intervalos de tiempo y los extractos de proteína se introdujeron en un gel SDS-PAGE para seguir los niveles de expresión de MiAMP1 en el cultivo.
La Figura 10 presenta el análisis por SDS-PAGE de los extractos obtenidos después de la provocación. La banda 1 contiene marcadores de peso molecular. Las bandas 2 a 7 contienen extractos del cultivo a 0, 1, 2, 3, 4 y 5 horas después de la provocación. La banda 8 contiene extracto de una cepa BL21 de E. coli no transformada. La banda 9 contiene MiAMP1 pura. La flecha en la Figura 10 señala la banda de la proteína MiAMP1 producida en el cultivo. Es evidente una acumulación drástica de las concentraciones de MiAMP1 después de la provocación.
Los expertos en la materia apreciarán que pueden introducirse muchos cambios en las formas de realización ejemplificadas anteriormente sin apartarse del ámbito y del alcance amplios de la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
SOLICITANTE: COOPERATIVE RESEARCH CENTRE FOR TROPICAL PLANT PATHOLOGY
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: The University of Queensland
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: St. Lucía
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Queensland
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Australia
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4067
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: MANNERS, John M. (EEUU solamente)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 28 Warmington Street
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Paddington
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Queensland
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Australia
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4064
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: MARCUS, John P. (EEUU solamente)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 1-10 Balderstone Street
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Corinda
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Queensland
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Australia
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4075
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: GOULTER, Kenneth C. (EEUU solamente)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 26 Emblem Street
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Jamboree Heights
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Queensland
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Australia
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4074
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: GREEN, Jodie L. (EEUU solamente)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 4 Reef Close
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Jamboree Heights
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Queensland
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Australia
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4074
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: HARRISON, Stuart J. (EEUU solamente)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 8 Thurlow Street
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Newmarket
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Queensland
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Australia
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4051
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína antimicrobiana
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Macadamia integrifolia 
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO DE TEJIDO: Semillas
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 480 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Macadamia integrifolia 
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO DE TEJIDO: Semillas
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DENOMINACIÓN/CLAVE: sig_peptide
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 70..147
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DENOMINACIÓN/CLAVE: mat_peptide
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 148..375
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
2

Claims (19)

1. Proteína antimicrobiana aislada o sintética seleccionada de entre las siguientes:
(i)
una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos 27 a 102 de la secuencia mostrada en la SEC. ID. nº: 1;
(ii)
un homólogo de (i);
(iii)
una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos 27 a 102 de la secuencia mostrada en la SEC. ID. nº: 1;
(iv)
una proteína que incluye un espaciamiento de cisteína de -C-9X-C-X-C-25X-C-14X-C-11X-C-, en el que X es cualquier resto de aminoácido distinto de la cisteína; y
(v)
una proteína aislable de la familia Proteaceae que reacciona específicamente con anticuerpos producidos contra (i) y que presenta la misma actividad antimicrobiana que (i).
2. Proteína según la reivindicación 1, que presenta una secuencia de aminoácidos de los restos 27 a 102 de SEC. ID. nº: 1.
3. ADN aislado o sintético que codifica una proteína seleccionada de entre:
(i)
una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos 27 a 102 de la secuencia mostrada en la SEC. ID. nº: 1;
(ii)
un homólogo de (i);
(iii)
una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos 27 a 102 de la secuencia mostrada en la SEC. ID. nº: 1;
(iv)
una proteína que incluye un espaciamiento de cisteína de -C-9X-C-X-C-25X-C-14X-C-11X-C-, en el que X es cualquier resto de aminoácido distinto de la cisteína; y
(v)
una proteína aislable de la familia Proteaceae que reacciona específicamente con anticuerpos producidos contra (i) y que presenta esencialmente la misma actividad antimicrobiana que (i).
4. ADN según la reivindicación 3 que comprende los nucleótidos 148 a 375 de la SEC. ID. nº: 2.
5. Constructo de ADN que incluye un ADN según la reivindicación 3, unido funcionalmente a elementos para la expresión de dicha proteína codificada.
6. Constructo según la reivindicación 5, en el que dicho ADN incluye los nucleótidos 70 a 375 de la SEC. ID. nº: 2.
7. Constructo según la reivindicación 5, que se selecciona de entre el grupo constituido por pPCV91-MiAMP1 y pET-MiAMP1, como se muestra en las Figuras 8 y 9, respectivamente.
8. Célula hospedadora que alberga un constructo de ADN según la reivindicación 5.
9. Célula hospedadora según la reivindicación 8, que se selecciona de entre el grupo constituido por una célula bacteriana, una célula micótica, una célula de insecto, una célula vegetal y una célula de mamífero.
10. Planta transgénica que alberga un constructo de ADN según la reivindicación 5.
11. Planta transgénica según la reivindicación 10, que es monocotiledónea o dicotiledónea.
12. Planta transgénica según la reivindicación 11, que se selecciona de entre el grupo de plantas constituido por granos, cultivos de forraje, frutos, vegetales, cultivos de semilla de aceite, palmeras, silvicultura y vinos.
13. Planta transgénica según la reivindicación 11, que se selecciona de entre el grupo constituido por maíz, plátano, cacahuete, guisantes, girasol, tomate, canela, tabaco, trigo, cebada, avena, patata, soja, algodón, clavel, sorgo, altramuz y arroz.
14. Material reproductivo de una planta transgénica según la reivindicación 11.
\newpage
15. Material reproductivo según la reivindicación 14, que se selecciona de entre el grupo constituido por semillas, plantas de la descendencia y material clonal.
16. Composición que comprende una proteína antimicrobiana según la reivindicación 1, junto con un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde un punto de vista agrícola.
17. Composición que comprende una proteína antimicrobiana según la reivindicación 1, junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
18. Procedimiento de control de infestación microbiana de una planta, comprendiendo dicho procedimiento:
i)
introducir un constructo de ADN según la la reivindicación 5 en dicha planta; o
ii)
tratar dicha planta con una proteína antimicrobiana según la reivindicación 1 o con una composición según la reivindicación 16.
19. Utilización de una proteína antimicrobiana según la reivindicación 1 en la preparación de un medicamento para controlar la infestación microbiana de un animal mamífero.
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