ES2277438T3 - Metodos de transferencia de genes. - Google Patents
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Abstract
Un método para transferir un gen a células diana utilizando un retrovirus que comprende: i. poner en contacto (a) una solución que contiene un retrovirus con (b) una sustancia funcional inmovilizada sobre un sustrato, donde la sustancia funcional comprende un sitio de unión al retrovirus y es capaz de unirse al retrovirus, ii. precipitar el retrovirus por medio de la fuerza centrífuga sobre la sustancia funcional, iii. lavar el sustrato al que está unido el retrovirus, y iv. poner en contacto e incubar el sustrato al que está unido el retrovirus con las células diana.
Description
Métodos de transferencia de genes.
La presente invención se refiere a un método
para transferir eficazmente un gen a células diana que permite una
transducción eficaz de las células diana.
Se han elucidado los mecanismos de numerosas
enfermedades humanas. Las técnicas de ADN recombinante y las
técnicas para transferir un gen a las células han progresado
rápidamente. En estas circunstancias, se han desarrollado
recientemente protocolos para las terapias génicas somáticas para el
tratamiento de enfermedades genéticas graves. Más recientemente, se
han hecho intentos de aplicar la terapia génica no solamente al
tratamiento de enfermedades genéticas sino también al tratamiento
de infecciones virales tales como el SIDA y los cánceres.
En la mayoría de las terapias génicas que se han
examinado para la aplicación clínica a seres humanos hasta la
fecha, se transfiere un gen a las células utilizando un vector
retroviral recombinante. El vector retroviral transfiere
eficazmente el gen foráneo de interés a las células e integra
establemente el gen en su ADN cromosómico. Por lo tanto, es un
medio preferible de transferencia génica concretamente para la
terapia génica en la que se desea una expresión génica a largo
plazo. Semejante vector se ha sometido a diversas modificaciones con
el fin de que no tenga una influencia nociva sobre el organismo al
que se va a transferir un gen. Por ejemplo, la función de
replicación del vector se elimina de manera que el vector utilizado
para la transferencia génica no se replica en las células aunque se
mantiene una infección ilimitada (transferencia génica).
Puesto que semejante vector (un vector
retroviral carente de replicación) no puede replicarse
autónomamente, generalmente se prepara un vector retroviral
encapsulado en una partícula de virus utilizando células productoras
de retrovirus (células de empaquetamiento). El método más simple
para transferir eficazmente un gen a células diana comprende
cultivar simultáneamente las células diana con las células
productoras de retrovirus. No obstante, las células productoras de
retrovirus pueden contaminar las células diana a las cuales se ha
transferido un gen y de ese modo, se transplantarán a un organismo
vivo en este método.
Recientemente, se informó de que la presencia de
fibronectina, un componente de la matriz extracelular, o un
fragmento de la misma aumenta la eficacia de la transferencia génica
en las células utilizando un retrovirus (J. Clin. Invest.,
93:1451-1457 (1994); Blood,
88:855-862 (1996)). Asimismo, se ha demostrado que
un fragmento de fibronectina producido por técnicas de ingeniería
genética tiene propiedades similares y se puede utilizar para
transferir eficazmente un gen foráneo a células troncales
hematopoyéticas (documento WO 95/26200). Se ha sugerido que la
unión de una región de unión a heparina en la fibronectina a un
retrovirus está implicada en el incremento de la eficacia de la
transferencia génica debida a la fibronectina.
Además, se describe en el documento WO 97/18318
(EP-A-0 870 839) que las sustancias
funcionales distintas de la fibronectina tales como el factor de
crecimiento de fibroblastos aumentan la eficacia de la transferencia
génica. En la publicación también se describe que se observa
asimismo un incremento similar en la eficacia de la transferencia
génica cuando se utiliza una mezcla de una sustancia funcional capaz
de unirse a retrovirus y otra sustancia capaz de unirse a las
células.
Los métodos de transferencia génica que utilizan
sustancias funcionales permiten una transferencia génica eficaz sin
cultivar simultáneamente células productoras de retrovirus y células
diana. Se cree que el incremento de eficacia en la transferencia
génica por estos métodos se debe a un incremento en la oportunidad
de interacción entre el retrovirus y las células diana que están
localizados entre sí de manera próxima con la ayuda de las
sustancias funcionales.
En la transferencia génica en la que se utiliza
un retrovirus, las células diana se infectan con el retrovirus,
dando lugar a la transferencia génica como se ha descrito antes. No
obstante, la eficacia de la transferencia génica en la que se
utiliza un retrovirus todavía no es satisfactoria para la aplicación
clínica práctica. De este modo, se desea incrementar adicionalmente
la eficacia de infección.
Se puede obtener una eficacia de infección o una
eficacia de la transferencia génica aumentadas incrementando la
concentración (título) del retrovirus en la suspensión de virus
(sobrenadante) utilizada. No obstante, la construcción y el
establecimiento de células productoras de virus que pueden producir
virus con un elevado título requieren normalmente mucho trabajo. Se
puede concentrar un vector de tipo pseudoviral que utiliza una
proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8033-8037 (1993)]
mediante centrifugación. No obstante, puesto que semejante
concentración se puede utilizar solamente para este vector, ésta no
se puede utilizar ampliamente.
Adicionalmente, la infección específica de las
células diana con un retrovirus en la transferencia génica puede
obtener una elevada eficacia de transferencia génica incluso si la
pureza de las células diana es baja. Sin embargo, en el estado
actual de la técnica no se conoce un método conveniente y
eficaz.
A la vista de lo anterior, el principal objeto
de la presente invención es proporcionar un método mejorado para
transferir un gen a células diana utilizando un retrovirus, en el
cual la eficacia de la transferencia génica aumenta y las células
diana son eficazmente transducidas.
Más adelante, se explicarán con detalle otros
objetos y ventajas de la presente invención con referencia a los
dibujos adjuntos.
La Figura 1 ilustra la estructura de una cadena
de azúcar del tipo de elevado contenido de manosa que contiene
nueve restos manosa en la molécula.
La Figura 2 es un gráfico que muestra la
eficacia de la transferencia génica (%) obtenida utilizando
CH-296 químicamente modificado (Ejemplo 3).
La Figura 3 es un gráfico que muestra la
relación entre la eficacia de la transferencia génica relativa (%)
y el tiempo de contacto/unión en un estudio sobre el efecto de la
separación de sustancias inhibidoras de la infección viral (Ejemplo
13).
La Figura 4 es un gráfico que muestra la
relación entre la eficacia de la transferencia génica relativa (%)
y los respectivos procedimientos de unión al virus en un estudio
sobre el efecto de la unión de retrovirus a sustancias funcionales
utilizando el método de centrifugación (Ejemplo 15).
La Figura 5 es un gráfico que muestra la
eficacia de la transferencia génica (%) obtenida utilizando el
método de centrifugación o el método de infección por
centrifugación (Ejemplo 15).
La presente invención se refiere a un método
para transferir un gen a células diana utilizando un retrovirus,
que comprende: i. poner en contacto (a) una solución que contiene un
retrovirus con (b) una sustancia funcional inmovilizada sobre un
sustrato, donde la sustancia funcional comprende un sitio de unión a
un retrovirus y es capaz de unirse al retrovirus, ii. precipitar el
retrovirus por medio de la fuerza centrífuga sobre la sustancia
funcional, iii. lavar el sustrato al cual se une el retrovirus, y
iv. poner en contacto e incubar el sustrato al cual se une el
retrovirus con las células diana.
Sin limitación, la etapa i anterior se lleva a
cabo, por ejemplo, durante 1 hora o más, preferiblemente 3 horas o
más. Además, la frecuencia de contacto entre el retrovirus y la
sustancia funcional capaz de unirse al retrovirus puede
incrementarse físicamente.
Los ejemplos de las sustancias funcionales
capaces de unirse al retrovirus que se pueden utilizar en la
presente invención incluyen, pero no están limitados a,
fibronectina o su dominio de unión a heparina-II,
una sustancia que tiene actividad de unión a heparina, factor de
crecimiento de fibroblastos, colágeno de tipo V, polilisina y
DEAE-dextrano. La sustancia funcional también puede
ser capaz de unirse a las células diana. Alternativamente, la
sustancia funcional capaz de unirse al retrovirus se puede utilizar
combinada con otra sustancia funcional capaz de unirse a las
células diana. Los ejemplos de las sustancias funcionales capaces de
unirse a las células diana que se pueden utilizar incluyen, pero no
están limitados a, proteínas de adherencia celular, hormonas,
citocinas, anticuerpos, y cadenas de azúcar.
La solución que contiene el retrovirus puede
ser, por ejemplo, el sobrenadante de un cultivo de células
productoras de retrovirus, preferiblemente incubado en presencia de
una sustancia que potencia la producción de retrovirus tal como
butirato de sodio.
Los ejemplos de los anticuerpos capaces de
unirse con las células diana utilizados en la presente invención
incluyen, pero no están limitados a, un anticuerpo que reconoce una
sustancia biológica sobre la superficie de las células diana.
Normalmente se utiliza un vector retroviral
recombinante en el método de transferencia génica de la presente
invención. En particular, se utiliza preferiblemente un vector
retroviral recombinante carente de replicación. La capacidad de
replicación de semejante vector se elimina de manera que no puede
replicarse autónomamente en las células infectadas y, por lo tanto,
el vector es no patógeno. El vector puede invadir una célula
anfitriona tal como una célula de vertebrado (concretamente, una
célula de mamífero) e integrarse establemente en un gen foráneo
insertado dentro del vector en el ADN cromosómico.
\newpage
En la presente invención, el gen foráneo que va
a ser transferido a las células puede ser utilizado insertándolo en
el vector retroviral recombinante bajo el control de un promotor
apropiado, por ejemplo, el promotor LTR en el vector retroviral o
un promotor foráneo. Además, pueden estar presentes otro elemento
regulador (por ejemplo., una secuencia potenciadora o una secuencia
terminadora) que coopera con el promotor y un sitio de inicio de la
transcripción en el vector con el fin de obtener una transcripción
eficaz del gen foráneo. El gen foráneo que se va a transferir puede
ser un gen de origen natural o un gen preparado artificialmente.
Alternativamente, el gen foráneo puede ser uno en el que las
moléculas de ADN de diferentes orígenes se reúnen por medio de
ligación u otro medio conocido en la técnica.
El gen foráneo puede ser cualquier gen del cual
se desea la transferencia a las células. Por ejemplo, se puede
utilizar como gen foráneo un gen que codifica una enzima o una
proteína asociada con la enfermedad que se va a tratar, un
anticuerpo intracelular (ver, por ejemplo, documento WO 94/02610),
un factor de crecimiento, un ácido nucleico antisentido, una
ribozima, un falso cebador (ver, por ejemplo, documento WO 90/13641)
o similar.
El vector retroviral utilizado en la presente
invención puede contener un gen marcador adecuado que permita la
selección de las células a las que se ha transferido el gen. Por
ejemplo, se puede utilizar como gen marcador un gen de resistencia
a fármacos que confiere resistencia a los antibióticos a las células
o un gen informador que hace posible distinguir las células a las
que se ha transferido el gen detectando una actividad
enzimática.
Los vectores que se pueden utilizar en la
presente invención incluyen, por ejemplo, vectores retrovirales
tales como el vector MFG (ATCC Núm. 68754), el vector
\alpha-SGC (ATCC Núm. 68755) y el vector LXSN
[BioTechniques, 7:980-990 (1989)]. Los vectores
retrovirales utilizados en los Ejemplos más abajo incluyendo el
vector PM5neo [Exp. Hematol., 23:630-638 (1995)]
contienen un gen de la neomicina-fosfotransferasa
como gen marcador. De este modo, se pueden confirmar las células a
las cuales ha sido transferido un gen utilizando el vector basándose
en su resistencia a G418 como índice.
Los vectores pueden ser preparados en forma de
partículas de virales en las cuales se empaquetan los vectores
utilizando una línea celular de empaquetamiento conocida tal como
PG13 (ATCC CRL-10686), PG13/LNc8 (ATCC
CRL-10685), PA317 (ATCC CRL-9078),
GP+E-86 (ATCC CRL-9642), GP+envAm12
(ATCC CRL-9641) y \varphiCRIP [Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 85:6460-6464 (1988)].
Se pueden utilizar medios conocidos tales como
Medio de Eagle Modificado de Dulbecco y Medio de Dulbecco modificado
de Iscoves para cultivar células productoras de virus que se
producen transfiriendo un vector retroviral a células de
empaquetamiento, o para cultivar células diana. Tales medios son
asequibles comercialmente, por ejemplo, de Gibco. Se pueden añadir
diversos constituyentes a estos medios dependiendo del tipo de
células diana para la transferencia génica u otros objetos. Por
ejemplo, se pueden añadir suero o diversas citocinas al medio con
el fin de promover o suprimir el crecimiento o la diferenciación de
las células diana. Por ejemplo, se puede utilizar suero de ternera
(CS) o suero de ternera fetal (FCS) como suero. Los ejemplos de las
citocinas incluyen interleucinas (IL-3,
IL-6, etc.), factores estimuladores de colonias
(G-CSF, GM-CSF etc), factor de
células troncales (SCF), eritropoyetina y diversos factores de
crecimiento celulares. Muchas de estas citocinas derivadas de seres
humanos son asequibles comercialmente. La citocina se selecciona
basándose en la actividad adecuada para los objetos. Opcionalmente,
las citocinas se pueden utilizar combinadas.
Se utiliza una muestra que contiene un
retrovirus tal como un sobrenadante de cultivo de células
productoras de virus para el método de transferencia génica de la
presente invención. El método para preparar el sobrenadante no está
limitado a uno específico. Por ejemplo, se sabe que la adición de
butirato de sodio durante el cultivo de células productoras de
virus aumenta la cantidad de partículas de virus producidas en el
sobrenadante [Human Gene Therapy, 6:1195-1202
(1995)]. El sobrenadante de virus de elevado título preparado de
este modo se puede utilizar sin problemas utilizando el método de
transferencia génica de la presente invención.
El método de la presente invención se
caracteriza porque las células diana se infectan con un retrovirus
en presencia de una sustancia funcional que tiene un sitio de unión
a retrovirus. Las células a las que se ha transferido el gen se
pueden obtener eficazmente infectando las células con un retrovirus
en presencia de una cantidad eficaz de semejante sustancia
funcional. Además, las sustancias inhibidoras de la infección viral
del sobrenadante del virus se pueden separar fácilmente utilizando
la sustancia funcional. Adicionalmente, la presencia de una
sustancia funcional capaz de unirse a las células diana permite una
transferencia génica con una mayor especificidad y/o eficacia.
Según se utiliza en la presente memoria, una
cantidad eficaz es una cantidad eficaz para dar lugar a la
transducción de las células diana por medio de la transferencia
génica a las células diana utilizando un retrovirus. Una cantidad
adecuada se selecciona dependiendo de la sustancia funcional que se
va a utilizar y del tipo de células diana. La cantidad se puede
determinar, por ejemplo, midiendo la eficacia de la transferencia
génica mediante el método descrito en la presente memoria. Según se
utiliza en la presente memoria, la capacidad de unirse a las
células diana incluye no solamente la capacidad de unirse
sustancialmente a las células sino también la capacidad de
permanecer en contacto con las células diana en una solución. Estas
capacidades se pueden medir basándose en la contribución a la
eficacia de la transferencia génica como se ha descrito antes.
Además, la eficacia de la transferencia génica representa la
eficacia de la transducción.
El sustrato para inmovilizar una sustancia
funcional no está limitado a uno específico. Normalmente, se utiliza
un recipiente para el cultivo celular o un sustrato con forma de
cuentas.
Cuando se utiliza una sustancia funcional que
tiene la capacidad de unirse a un virus y de ser inmovilizada sobre
un sustrato, la eficacia de la transferencia génica puede
incrementarse adicionalmente utilizando las etapas ejemplificadas
más abajo.
La etapa de poner en contacto una muestra
líquida que contiene un retrovirus con un sustrato sobre el cual
está inmovilizada una sustancia funcional capaz de unirse al
retrovirus se lleva a cabo, por ejemplo, durante 1 hora o más,
preferiblemente durante tres horas o más, sin limitación. Asimismo,
tampoco están específicamente limitadas otras condiciones
incluyendo la temperatura. Por ejemplo, la etapa se puede llevar a
cabo a la temperatura ambiente o a 37ºC. Se pueden utilizar bajas
temperaturas de alrededor de 4ºC dependiendo de la estabilidad de
los virus o similares. El sustrato para inmovilizar una sustancia
funcional se puede seleccionar apropiadamente dependiendo de los
objetos. Si se utiliza un recipiente para el cultivo celular, se
pueden iniciar las etapas de transferencia génica añadiendo
solamente las células diana. Por ejemplo, se puede utilizar solución
salina tamponada con fosfato o solución salina de Hanks, medio
líquido utilizado para cultivar células diana o similares para
lavar el sustrato.
Un retrovirus se puede unir más eficazmente a
una sustancia funcional capaz de unirse al retrovirus incrementando
físicamente la frecuencia de contacto entre el retrovirus y la
sustancia funcional. Los ejemplos de semejante medio físico
incluyen, pero no están limitados a, la utilización del
sacudimiento, la filtración y la fuerza centrífuga. La utilización
de la fuerza centrífuga se ejemplifica específicamente por un método
en el cual se añade una muestra líquida que contiene un retrovirus
a un tubo de centrifugación en el cual una sustancia funcional
capaz de unirse al retrovirus está inmovilizada al fondo y después
el tubo de centrifugación se centrifuga. El retrovirus precipita
sobre el fondo del tubo de centrifugación por la fuerza centrífuga
durante la centrifugación. Por consiguiente, la frecuencia de
contacto entre el retrovirus y la sustancia funcional capaz de
unirse al retrovirus aumenta, dando lugar a un incremento en la
frecuencia de unión. El método mencionado antes no coloca las
células bajo un estrés físico como el método en el cual se hacen
precipitar los virus sobre células por medio de la fuerza
centrífuga para la infección (documento WO 95/10619). De este modo,
el método de la presente invención da lugar a una mayor eficacia de
transferencia génica.
La transferencia génica se puede llevar a cabo
después de separar una sustancia contenida en una muestra que
contiene un retrovirus, cuya existencia no es preferible para la
transferencia génica, mediante el procedimiento descrito antes. Por
ejemplo, las sustancias separadas mediante el método de la presente
invención incluyen sustancias inhibidoras de la infección
retroviral derivadas de células de empaquetamiento contenidas en un
sobrenadante de virus [Human Gene Therapy,
8:1459-1467 (1997): J. Virol.,
70:6468-6473 (1996)], sustancias añadidas durante
el cultivo de células productoras de retrovirus con el fin de
potenciar la producción de retrovirus tal como forbol
12-miristato 13-acetato (TPA) y
dexametasona [Gene Therapy, 2:547-551 (1995)], así
como butirato de sodio como se ha descrito antes.
Los ejemplos de las sustancias funcionales
capaces de unirse a un retrovirus que puede ser utilizado en la
presente invención incluyen, pero no están limitados a, dominio de
heparina II de fibronectina, factor de crecimiento de fibroblastos,
colágeno de tipo V, polilisina y DEAE-dextrano.
Además, se puede utilizar una mezcla de las sustancias funcionales,
un polipéptido que contiene la sustancia funcional, un polímero de
la sustancia funcional, un derivado de la sustancia funcional y
similares.
La capacidad de unirse a un virus de la
sustancia funcional se puede potenciar modificándola químicamente.
Los ejemplos de las modificaciones químicas incluyen la activación
de un resto aminoácido en la sustancia funcional utilizada y la
introducción de un resto alcalino en la sustancia. Por ejemplo, la
capacidad de unirse a un retrovirus se puede incrementar
modificando un grupo carboxilo libre en la sustancia funcional que
consiste en un péptido o una proteína con una carbodiimida soluble
en agua tal como hidrocloruro de
1-etil-3-dimetilaminopropilcarbodiimida
para activar el grupo carboxilo. Además, la capacidad de unirse a
un retrovirus se puede incrementar utilizando el grupo carboxilo
activado de este modo para introducir un resto alcalino tal como un
grupo amino en la sustancia
funcional.
funcional.
Los ejemplos de la sustancia funcional capaz de
unirse a las células diana utilizada en la presente invención
incluyen, pero no están limitados a, una sustancia que tiene un
ligando que se une a las células diana. Los ligandos incluyen
proteínas de adherencia celular, hormonas, citocinas, anticuerpos
contra los antígenos de la superficie celular, polisacáridos,
glicoproteínas, glicolípidos, cadenas de azúcares derivadas de
glicoproteínas o glicolípidos, y metabolitos de las células diana.
Además, se puede utilizar un polipéptido que contiene la sustancia
funcional, un polímero de la sustancia funcional, un derivado de la
sustancia funcional, un equivalente funcional de la sustancia
funcional o
similar.
similar.
Un anticuerpo que se une específicamente a las
células diana es particularmente útil para transferir específica y
eficazmente un gen a células específicas. El anticuerpo que se puede
utilizar en la presente invención no está limitado a uno
específico. Un anticuerpo contra un antígeno expresado sobre las
células diana a las cuales se va a transferir un gen se puede
seleccionar apropiadamente para su uso. Semejante anticuerpo se
puede producir según los métodos conocidos. Alternativamente,
también se pueden utilizar muchos anticuerpos asequibles
comercialmente en la actualidad. El anticuerpo puede ser un
anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal con tal que tenga
las propiedades deseadas tales como la especificidad celular.
Adicionalmente, también se puede utilizar un anticuerpo o un
derivado de un anticuerpo modificado utilizando técnicas conocidas
tales como un anticuerpo humanizado, un fragmento Fab o un
anticuerpo de cadena sencilla.
Se ha estudiado con detalle la expresión de los
respectivos antígenos de leucocitos (también conocidos como
antígenos CD) sobre diversas células. De este modo, se puede
transferir un gen a las células diana con una elevada especificidad
seleccionando un anticuerpo que reconoce un antígeno CD expresado
sobre las células diana de interés y utilizándolo en el método de
transferencia génica de la presente invención. Por ejemplo, se
puede dirigir la transferencia génica a las células T coadyuvantes
utilizando un anticuerpo anti-CD4, o a las células
troncales hematopoyéticas utilizando un anticuerpo
anti-CD34.
Además, se puede utilizar una glicoproteína, la
laminina, como sustancia funcional capaz de unirse a las células
diana para transferir eficazmente un gen a diversas células diana
tales como las células hematopoyéticas. La laminina que se puede
utilizar en la presente invención puede derivar de ratón o de seres
humanos, o puede ser un fragmento de la misma con tal que sea capaz
de unirse a las células diana. Como se describe en los ejemplos de
más abajo, la cadena de azúcar de la laminina juega un importante
papel en la transferencia génica en la que se utiliza la laminina.
Por lo tanto, también se puede utilizar una cadena de azúcar
liberada de la laminina según un método conocido en el método de la
presente invención. Además, también se puede utilizar una
glicoproteína que tiene una cadena de azúcar unida a N del tipo de
elevado contenido de manosa como la laminina, o una cadena de
azúcar liberada de allí o sintetizada químicamente en la presente
invención. Adicionalmente, se puede utilizar una sustancia tal como
una proteína o similar que tiene la cadena de azúcar mencionada
antes anclada a esta. Por ejemplo, se puede utilizar
preferiblemente una sustancia funcional capaz de unirse a un
retrovirus y que tenga una cadena de azúcar anclada a esta para la
transferencia génica.
La cadena de azúcar de tipo alto contenido de
manosa mencionada antes no está limitada a una específica con tal
que tenga de 1 a 20 restos manosa en la molécula. Preferiblemente se
utiliza una que tiene un resto manosa en su extremo no reductor en
el método de la presente invención. La cadena de azúcar se puede
utilizar mientras está anclada a otra molécula apropiada tal como
una molécula biológica (por ejemplo, un monosacárido, un
oligosacárido, un polisacárido, un aminoácido, un péptido, una
proteína o un lípido) o una sustancia artificial tal como una
macromolécula sintética.
Las cadenas de azúcar de tipo alto contenido de
manosa representativas derivadas de organismos están ejemplificadas
por aquellas que tienen una estructura representada por
(Manosa)_{n}-(GlucNAc)_{2} [Protein, Nucleic Acid
and Enzime, 43:2631-2639 (1998)]. Por ejemplo, se
puede utilizar preferiblemente
(Manosa)_{9}-(GlucNAc)_{2}, una cadena de azúcar
que tiene la estructura descrita antes y contiene nueve restos
manosa en la molécula, en el método de transferencia génica de la
presente invención, sin limitación (la estructura de esta cadena de
azúcar se muestra en la Figura 1).
La sustancia funcional descrita antes se puede
obtener a partir de sustancias de origen natural, preparadas
artificialmente (por ejemplo, mediante técnicas de ADN recombinante
o técnicas de síntesis química), o se puede preparar combinando una
sustancia de origen natural y una sustancia preparada
artificialmente. Además, se puede utilizar una mezcla de una
sustancia funcional que tiene un sitio de unión a retrovirus y otra
sustancia funcional que tiene un sitio de unión a una célula diana
para la transferencia génica utilizando las sustancias funcionales
descritas en el documento WO 97/18318. Alternativamente, se puede
utilizar una sustancia funcional que tiene un sitio de unión a
retrovirus y un sitio de unión a la célula diana en una única
molécula. Se utilizan sustancias funcionales sustancialmente libres
de otras proteínas asociadas naturalmente con ellas. Adicionalmente,
se puede combinar la sustancia funcional o una combinación de las
sustancias funcionales con un medio utilizado para cultivar células
diana, factor de crecimiento celular y similares para producir un
estuche para la transferencia génica.
La fibronectina o un fragmento de la misma para
su uso en el método de la presente invención se puede preparar en
una forma sustancialmente pura a partir de materiales de origen
natural según los métodos descritos, por ejemplo, en J. Biol.
Chem., 256:7277 (1981); J. Cell. Biol., 102:449 (1986); o J. Cell.
Biol., 105:489 (1987). La fibronectina o el fragmento de la misma
se pueden preparar utilizando técnicas de ADN recombinante como se
describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.198.423.
Específicamente, los fragmentos de fibronectina que contienen el
dominio de heparina II, que es un sitio de unión a retrovirus, tal
como los polipéptidos recombinantes incluyendo
CH-296, H-271, H-296
y CH-271 utilizados en los Ejemplos de más abajo,
así como los métodos para obtenerlos se describen con detalle en la
publicación de la patente mencionada antes. Estos fragmentos se
pueden obtener cultivando cepas de Escherichia coli
consignadas con los números de acceso FERM P-10721
(H-296) (fecha de la consigna original: 12 de Mayo
de 1989), FERM BP-2799 (CH-271)
(fecha de la consigna original: 12 de Mayo de 1989), FERM
BP-2800 (CH-296) (fecha de la
consigna original: 12 de Mayo de 1989) y FERM
BP-2264 (H-271) (fecha de la
consigna original: 30 de Enero de 1989) en el National Institute of
Bioscience and Human-Technology, Agency of
Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade
and Industry, 1-3, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken como se
describe en la publicación. Además, los fragmentos que pueden
derivar típicamente de estos fragmentos se pueden preparar
modificando los plásmidos albergados en estas cepas de Escherichia
coli utilizando técnicas de ADN recombinante conocidas. Entre los
fragmentos de fibronectina descritos antes, H-296
tiene un polipéptido de la región de unión a VLA-4,
CH-271 tiene un péptido de la región de unión a
VLA-5; y CH-296 tiene ambos [Nature
Medicine, 2:876-882 (1996)].
Las células a las que se ha transferido el gen
se pueden obtener eficazmente infectando las células diana con un
retrovirus en presencia de la sustancia funcional. La infección con
el retrovirus se puede llevar a cabo según un método convencional,
por ejemplo, incubando a 37ºC en CO_{2} al 5%. Estas condiciones y
el tiempo de incubación se pueden cambiar adecuadamente dependiendo
de las células diana o de los objetos.
Las células diana no son infectadas con un
retrovirus cuando están en la fase G_{0}. Por lo tanto, es
preferible conducir las células al ciclo celular estimulándolas
previamente. Para este propósito, las células diana se cultivan en
presencia de un factor de crecimiento adecuado para las células
diana antes de la infección de las células con el retrovirus. Por
ejemplo, se utilizan diversas citocinas tales como la
interleucina-3, la interleucina-6 y
el factor de las células troncales para estimular previamente
células de médula ósea o células troncales hematopoyéticas para la
transferencia génica.
Se sabe que los receptores de la superficie de
las células están implicados en la infección de las células con
retrovirus. Se sabe que los transportadores de aminoácidos alcalinos
y los transportadores de fosfato funcionan como receptores para los
virus ecotrópicos y los virus anfotrópicos, respectivamente [Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 93:11407-11413 (1996)]. Es
posible producir células diana susceptibles de infección viral
tratando previamente las células en un medio en el cual las
concentraciones de los aminoácidos alcalinos o los fosfatos, o sus
sales o precursores se reducen para activar la expresión o el
recambio metabólico de los transportadores.
Sorprendentemente, los autores de la presente
invención han descubierto que la activación del receptor de
transferrina, del cual no se conocía la implicación en la infección
viral, también aumenta la eficacia de la infección retroviral o la
eficacia de la transferencia génica. El receptor de transferrina se
puede activar, sin limitación, tratando las células diana en un
medio que contiene una concentración limitada de Fe. Por ejemplo,
se puede utilizar un medio en el cual el Fe es quelado añadiendo
desferoxamina.
Preferiblemente, la transferencia génica en la
que se utiliza la activación de la transferrina también se lleva a
cabo en presencia de la sustancia funcional como se ha descrito
antes.
Los ejemplos de las células que se pueden
utilizar como diana para la transferencia génica en el método de la
presente invención incluyen, pero no están limitados a, células
troncales, células hematopoyéticas, células mononucleares de baja
densidad no adherentes, células adherentes, células de médula ósea,
células troncales hematopoyéticas, células troncales de sangre
periférica, células de sangre de cordón umbilical, células troncales
hematopoyéticas fetales, células troncales embriogénicas, células
embrionarias, células germinales primordiales, oocitos, oogonios,
óvulos, espermatocitos, espermatozoides, células CD34+, células
c-kit+, células progenitoras hematopoyéticas
pluripotentes, células progenitoras hematopoyéticas unipotentes,
células precursoras eritroides, células madre linfoides, células
sanguíneas maduras, linfocitos, células B, células T, fibroblastos,
neuroblastos, neurocitos, células endoteliales, células
endoteliales vasculares, hepatocitos, mioblastos, células de músculo
esquelético, células de músculo liso, células cancerosas, células
de mieloma, células de leucemia, etcétera. El método de la presente
invención se utiliza preferiblemente para las células
hematopoyéticas que son asequibles de la sangre y la médula ósea
debido a que estas células son relativamente fáciles de obtener y
debido a que las técnicas para cultivarlas y mantenerlas están
establecidas. Concretamente, si se pretende la expresión a largo
plazo del gen transfectado, las células progenitoras de la sangre
tales como las células troncales hematopoyéticas, las células CD34
positivas, las células c-kit positivas y las células
progenitoras hematopoyéticas pluripotentes son adecuadas como
células diana.
Por ejemplo, la terapia génica utilizando
células troncales hematopoyéticas como células diana se puede llevar
a cabo mediante el siguiente procedimiento.
Primero, se recoge una sustancia que contiene
células troncales hematopoyéticas tales como tejido de médula ósea,
sangre periférica y sangre de cordón umbilical. Semejante sustancia
puede ser utilizada directamente en el procedimiento de
transferencia génica. No obstante, las fracciones de células
mononucleares que contienen células troncales hematopoyéticas se
preparan normalmente por medio de centrifugación en gradiente de
densidad y similares, o las células troncales hematopoyéticas se
purifican adicionalmente utilizando moléculas marcadoras de la
superficie celular tales como CD34 y/o c-kit. La
sustancia que contiene las células troncales hematopoyéticas se
infecta con un vector retroviral recombinante, en el cual está
insertado un gen de interés, según el método de la presente
invención, después de haber sido estimulado previamente utilizando
un factor de crecimiento celular adecuado, si fuera necesario. Las
células con el gen transferido obtenidas de este modo se pueden
transplantar a un receptor, por ejemplo, mediante administración
intravenosa. Aunque el receptor es preferiblemente el propio
donante, se puede llevar a cabo un transplante alogénico, por
ejemplo, si se utiliza sangre de cordón umbilical.
Algunas de las terapias génicas que utilizan
células troncales hematopoyéticas como células diana son para
complementar un gen deficiente o anómalo en un paciente (p. ej., la
terapia génica para la deficiencia en ADA o la enfermedad de
Gaucher). Además, se puede transferir un gen de resistencia a
fármacos a las células troncales hematopoyéticas con el fin de
aliviar la lesión de las células hematopoyéticas debida a agentes
quimioterapéuticos utilizados para el tratamiento del cáncer o la
leucemia, por ejemplo.
Se investiga una terapia de vacunación contra
tumores como terapia génica para el cáncer. En semejante terapia,
se transfiere un gen para una citocina a células cancerosas, la
capacidad de las células cancerosas para proliferar se impide, y
después las células se hacen volver al organismo del paciente para
potenciar la inmunidad tumoral [Human Gene Therapy,
5:153-164 (1994)]. Además, se realizan intentos de
tratar el SIDA utilizando la terapia génica. En este caso, se
considera el siguiente procedimiento: Un gen que codifica una
molécula de ácido nucleico (p. ej., un ácido nucleico antisentido o
una ribozima) que interfiere en la replicación o la expresión del
gen del VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) se transfiere a
las células T infectadas con el VIH, el agente causal del SIDA [p.
ej., J. Virol., 69:4045-4052 (1995)].
Como se ha descrito antes con detalle, se puede
transferir un gen a las células diana con una elevada eficacia y
especificidad utilizando el método de la presente invención. Además,
el método de la presente invención no requiere un equipo o
instrumental especializado y es eficaz para diversos vectores
retrovirales y células diana.
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Los siguientes Ejemplos ilustran la presente
invención con más detalle, pero no se debe considerar que limiten
el alcance de la misma.
Se preparó un polipéptido derivado de
fibronectina humana, H-271, a partir de
Escherichia coli HB101/pHD101 (FERM BP-2264)
que contenía el plásmido recombinante pHD101 que contiene un ADN que
codifica el polipéptido según el método descrito en la Patente de
los Estados Unidos Núm. 5.198.423.
Se preparó un polipéptido derivado de
fibronectina humana, H-296, a partir de
Escherichia coli HB101/pHD102 (FERM P-10721)
que contenía el plásmido recombinante pHD102 que contiene un ADN que
codifica el polipéptido según el método descrito en la publicación
mencionada antes.
El polipéptido CH-271 se preparó
como sigue.
Brevemente, se cultivó Escherichia coli
HB101/pCH101 (FERM BP-2799) según el método descrito
en la publicación mencionada antes. CH-271 se
obtuvo del cultivo.
El polipéptido CH-296 se preparó
como sigue.
Brevemente, se cultivó Escherichia coli
HB101/pCH102 (FERM BP-2800) según el método descrito
en la publicación mencionada antes. CH-296 se
obtuvo del cultivo.
El polipéptido CH-274 se preparó
como sigue.
Brevemente, se cultivó Escherichia coli
JM109/pTF7221 (FERM BP-1915) según el método
descrito en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.102.988.
C-274 se obtuvo del cultivo.
Se preparó un polipéptido capaz de unirse a un
retrovirus derivado de colágeno de tipo V, colV, según el método
descrito en WO 97/18318.
Se introdujo un plásmido de retrovirus, vector
PM5neo, que contiene un gen de la
neomicina-fosfotransferasa [Exp. Hematol.,
23:630-638 (1995)] en células
GP+E-86 (ATCC CRL-9642). Las células
se cultivaron en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM; Bio
Whittaker) que contenía 10% de suero de ternera fetal (FCS; Gibco),
50 unidades/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina (ambas
de Gibco). Todos los DMEM utilizados en el procedimiento de más
abajo contenían los antibióticos mencionados antes. Se preparó un
sobrenadante que contenía el virus PM5neo añadiendo 4 ml de DMEM
conteniendo 10% de FCS a una placa (placa para cultivo celular de
10 cm cubierta con gelatina, Iwaki Glass) en la cual se habían
desarrollado las células productoras mencionadas antes hasta la
semi-confluencia, cultivando durante la noche y
recogiendo después el sobrenadante. El sobrenadante de cultivo
recogido de este modo se filtró a través de un filtro de 0,45 micras
(Millipore) para preparar una solución de partida de sobrenadante
de virus, que se almacenó a -80ºC hasta su uso.
Los sobrenadantes de virus se prepararon a
partir de las siguientes células según el procedimiento descrito
antes: células BOSC23 de empaquetamiento ecotrópicas [Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 90:8392-8396 (1993)], en las cuales
se había introducido el plásmido de retrovirus pLEIN (Clontech; que
contiene un gen de la neomicina fosfotransferasa y un gen de la
proteína fluorescente verde potenciado (EGFP)); y células
\varphiCRIP de empaquetamiento anfotrópicas [Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 85:6460-6464 (1988)]. Aquí en los
sucesivo, un virus preparado a partir de células BOSC23 es referido
como Eco-EGFP, y un virus preparado a partir de
células \varphiCRIP es referido como Anfo-EGFP,
respectivamente.
Además, se preparó un sobrenadante de virus a
partir de células GP+EnvAm12 (ATCC CRL-9641) que
contenía un plásmido de retrovirus, vector TKNeo [J. Exp. Med.,
178:529-536 (1993)] (que contiene un gen de la
neomicina-fosfotransferasa) según el procedimiento
descrito antes. Se utilizó DMEM que contenía 10% de suero de ternera
(CS; Gibco) en lugar de FCS.
El título del sobrenadante de virus se midió
según un método normalizado [J. Virol., 62:1120-1124
(1988)] en el que se utiliza como índice la eficacia de la
transfección de un gen de la
neomicina-fosfotranferasa a células NIH/3T3 (ATCC
CRL-1658). Se calculó el número de partículas
infecciosas contenidas en 1 ml del sobrenadante [cfu/ml]. La
cantidad del sobrenadante de virus que se va a añadir en los
experimentos de más abajo se determinó basándose en el valor
calculado, es decir, el título del sobrenadante.
Se añadieron 50 \mul de una solución de 80
\mug/ml de H-271, H-296,
C-274, CH-271,
CH-296, ColV, factor de crecimiento de fibroblastos
básico humano (bFGF; Progen), tenascina (Gibco) o factor de
crecimiento epidérmico (EGF; Takara Shuzo), o 50 \mul de
seralbúmina bovina al 2% (BSA, Sigma) a cada pocillo de una
microplaca no tratada de 96 pocillos para el cultivo celular
(Falcon). La placa se dejó estar a 4ºC durante la noche y después
se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS;
Roman Kogyo). Alternativamente, una vez que la placa se hubo
tratado como se ha descrito antes, se dispensaron 0,1 ml de una
solución de 4 mg/ml de hidrocloruro de
1-etil-3-dimetilaminopropilcarbodiimida
(Sigma) en agua pura estéril en cada pocillo. La reacción se dejó
continuar a 37ºC durante 2 horas. La placa se lavó extensamente con
agua pura para preparar una placa tratada con carbodiimida. Estas
placas se almacenaron a 4ºC hasta que se llevaron a cabo los
experimentos de infección viral.
Se añadieron 10^{4} células de leucemia de
ratón L1210 (ATCC CCL-219), que se habían hecho
crecer en medio RPMI 1640 (Bio Whittaker) suplementado con 10% de
FCS, 50 unidades/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina,
y 50 \mul de sobrenadante de virus PM5neo (10^{4} cfu/ml) al
pocillo de la microplaca. Una vez que la placa se hubo incubado
durante 24 horas, el medio se cambió por el mismo medio que contenía
G418 (Gibco) a una concentración final de 0,75 mg/ml, y la placa se
incubó después durante 48 horas más. Las células resistentes a G418
se evaluaron según el método descrito por S. Kim y col., [Gene
Therapy, 3:1018-1020 (1996)] con una modificación
parcial en la que se medía el color desarrollado utilizando el
reactivo Premix WST-1 (Takara Shuzo) como la
absorbancia a 450 nm. Después de la incubación, se añadieron 10
\mul/100 \mul de cultivo del reactivo WST-1 al
pocillo, y la placa se incubó a 37ºC durante 4 horas más. Después se
midió la absorbancia a 450 nm y 650 nm utilizando un lector de
microplaca, y se calculó la diferencia (450 nm - 650 nm). El valor
obtenido utilizando una placa recubierta con 2% de BSA sin
tratamiento con carbodiimida se definió como el fondo. Los
resultados de las tres rondas de estudios se resumen en la Tabla
1.
Como se muestra en la Tabla 1, el incremento de
la eficacia de la transferencia génica se observaba para las
sustancias funcionales conocidas capaces de unirse a un virus, es
decir, H-271, H-296,
CH-271, CH-296, ColV y bFGF.
Además, aumentaba la aparición de células resistentes a G418 cuando
se utilizaban C-274, tenascina, EGF, y BSA, que no
tienen la capacidad de unirse a un virus y se llevaba a cabo el
tratamiento con carbodiimida.
A continuación, se utilizó
CH-296 como sustancia funcional para llevar a cabo
los experimentos siguientes.
Se añadieron 0,5 ml de CH-296 de
40 \mug/ml a cada pocillo de una microplaca no tratada de 24
pocillos para el cultivo celular (Falcon). La placa se incubó a 4ºC
durante la noche y después se lavó con PBS (pH 5,8). Se añadieron a
cada pocillo 625 \mul de solución de 10 mg/ml de hidrocloruro de
1-etil-3-dimetilaminopropilcarbodiimida
(Sigma) en PBS (pH 5,8) que contenía etilendiamina
[NH_{2}(CH_{2})NH_{2}; Nacalai Tesque],
trimetilendiamina [NH_{2}(CH_{2})_{3}NH_{2};
Nacalai Tesque] o putrescina
[NH_{2}(CH_{2})_{4}NH_{2}; Nacalai Tesque] a
diversas concentraciones. La placa se incubó a 37ºC durante 2 horas.
Se introdujo un grupo amino en el grupo carboxilo en la molécula de
CH-296 por mediación de la carbodiimida en este
procedimiento. La placa se lavó tres veces con PBS, y después se
bloqueó con glicina/2% de PBS seguido de BSA/2% de PBS.
Las células GP+E86 en las cuales se había
introducido el plásmido vector retroviral pLEIN se cultivaron en
DMEM que contenía el 10% de CS. Después, se recogió el sobrenadante
del cultivo. Se añadieron 0,5 ml de sobrenadante de virus preparado
diluyendo el sobrenadante a una concentración de 1 x 10^{5} cfu/ml
a cada pocillo de la placa. La placa se incubó durante 4 horas. Se
añadieron adicionalmente 1 x 10^{4} células NIH/3T3 al pocillo.
La placa se incubó durante 2 días. Tras la incubación, las células
se recogieron utilizando un tampón de separación de células (Bio
Whittaker) y se lavaron. Las células que expresaban EGFP se
analizaron mediante citometría de flujo utilizando FACSVantage
(Becton Dickinson) a una longitud de onda de excitación de 488 nm y
una longitud de onda de emisión de 515-545 nm. La
capacidad de unión del virus a la placa se expresaba mediante la
eficacia de la transferencia del gen a las células. Los resultados
se muestran en la Figura 2.
Como se muestra en la Figura 2, la capacidad de
unión del virus aumentaba a medida que la concentración del
compuesto diamínico utilizado para introducir un grupo amino
aumentaba. Se observaba un incremento de aproximadamente dos veces
en la capacidad de unión del virus cuando se utilizaba putrescina,
trimetilendiamina o etilendiamina en la reacción a una
concentración de 2 mM en comparación con la capacidad observada
utilizando CH-296 no tratado.
Se utilizó laminina de ratón (Gibco) o laminina
humana (Takara Shuzo) combinada con una sustancia funcional capaz
de unirse a un virus para llevar a cabo un experimento de
transferencia génica. Se recubrió una microplaca no tratada de 24
pocillos para el cultivo celular (Falcon) utilizada en el
experimento con estas sustancias funcionales según los dos
siguientes métodos.
El método del cóctel: Se añade una mezcla de dos
sustancias funcionales a la placa. La placa se deja estar a 4ºC
durante la noche. La placa se bloquea con el 2% de BSA a 37ºC
durante 20 minutos y después se lava con PBS.
El método del recubrimiento previo: Se añade una
solución de una sustancia funcional capaz de unirse a un virus a la
placa. La placa se deja estar a 4ºC durante la noche. La solución se
separa. Se añade a la placa una solución de laminina. La placa se
incuba a 37ºC durante 2 horas, se bloquea con el 2% de BSA, y
después se lava con PBS.
Se utilizaron 0,5 ml de la solución de la
sustancia funcional para recubrir cada pocillo.
Se añadieron 10^{5} células L1210 y 0,5 ml de
sobrenadante de virus Eco-EGFP (10^{5} cfu/ml) al
pocillo. La placa se incubó durante 24 horas. Tras la incubación,
las células se recogieron utilizando un tampón de separación de
células (Bio Whittaker) y se lavaron. Las células que expresaban
EGFP se analizaron mediante citometría de flujo utilizando
FACSVantage (Becton Dickinson) a una longitud de onda de excitación
de 488 nm y una longitud de onda de emisión de
515-545 nm. Se calculó la eficacia de la
transferencia génica (la razón de las células que expresaban EFGP
con respecto a las células totales). Los resultados experimentales
se muestran en las Tablas 2 a 5.
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Como se muestra en las Tablas 2 y 3, se demostró
que un gen es transferido a las células diana muy eficazmente con
independencia del método de inmovilización cuando se utilizaba
laminina de ratón o humana combinada con una sustancia funcional
capaz de unirse a un virus para la transferencia génica utilizando
un retrovirus. Se examinó la eficacia de la transferencia génica
utilizando una placa recubierta con CH-296 o
CH-271 y laminina según el método del cóctel. Como
se muestra en las Tablas 4 y 5, las razones óptimas eran 8:1 (por
ejemplo, 80 \mug/ml: 10 \mug/ml) para la combinación de
CH-296/laminina de ratón, y 16:1 (por ejemplo, 80
\mug/ml: 5 \mug/ml) para CH-271/laminina de
ratón, respectivamente. La eficacia de la transferencia génica
aumentaba 2,6 veces y 5,1 veces para CH-296 y
CH-271, respectivamente, en comparación con la
eficacia de la transferencia génica sin adición de laminina.
Se prepararon células de médula ósea
c-kit positivas de ratón como sigue. Se sometieron
células de médula ósea recogidas de un fémur de un ratón hembra
C3H/He de 6-8 semanas de edad (Japan SLC) a
centrifugación en gradiente de densidad utilizando
Ficoll-Hypaque (1,0875 g/ml, Pharmacia) para
preparar una fracción que contenía las células mononucleares de
baja densidad. Las células se lavaron con PBS, los eritrocitos se
sometieron a lisis utilizando tampón Ery-Lysis
(NH_{4}Cl 155 mM, KHCO_{3} 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,4), y las
células se lavaron de nuevo con PBS. Se añadió 1 \mug/10^{7}
células de anticuerpo anti-CD117 de ratón
(Pharmingen) a las células de médula ósea resultantes. La mezcla se
hizo reaccionar sobre hielo durante 30 minutos. Las células se
lavaron con PBS que contenía EDTA 5 mM y 0,5% de BSA, y después se
suspendieron en el mismo tampón. Se añadieron a las células 20
\mul/10^{7} células de un anticuerpo secundario conjugado con
una microcuenta (Miltenyi Biotec). La mezcla se hizo reaccionar a
4ºC durante 30 minutos. Las células se lavaron con y se
resuspendieron en el tampón mencionado antes. Las células unidas a
las microcuentas se recogieron utilizando el sistema MACS (Miltenyi
Biotec) para obtener células c-kit positivas.
Antes de la infección viral, las células de
médula ósea de ratón c-kit positivas se estimularon
previamente con el método de Luskey y col. [Blood,
80:396-402 (1992)]. Brevemente, las células se
cultivaron en \alpha-MEM (Bio Whittaker) que
contenía un 20% de FCS, 20 ng/ml de interleucina-3
de ratón recombinante (Genzyme), 50 ng/ml de
interleucina-6 humana recombinante (Genzyme), 100
ng/ml de factor de crecimiento de células troncales de ratón
(Genzyme), 50 unidades/ml de penicilina y 50 \mug/ml de
estreptomicina a 37ºC durante 2 días en presencia de 5% de
CO_{2}.
Se recubrió una microplaca no tratada de 24
pocillos para el cultivo celular según el método del cóctel
utilizando una mezcla que contenía laminina de ratón a
concentraciones variables y 80 \mug/ml de CH-271.
La placa se bloqueó con un 2% de BSA durante 30 minutos, y después
se lavó con PBS. Se preparó una placa de control utilizando BSA al
2% en lugar de CH-271. Se añadieron 10^{5} células
de médula ósea c-kit positivas y 0,5 ml de
sobrenadante de virus Eco-EGFP (10^{5} cfu/ml) a
cada pocillo de la microplaca para la infección viral. Tras la
incubación durante 48 horas, se añadieron 0,5 ml de medio de nueva
aportación al pocillo, y la placa se incubó durante 24 horas más.
Tras la incubación, las células se recogieron utilizando un tampón
de separación de células y se lavaron. Se calculó la eficacia de la
transferencia génica como se describe en el Ejemplo 4. Los
resultados de las dos rondas de experimentos se muestran en las
Tablas 6 y 7.
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Como se muestra en las Tablas 6 y 7, se demostró
que también se observaba un efecto muy fuerte de aumento de la
eficacia de la transferencia génica cuando se infectaban células de
médula ósea c-kit positivas con un retrovirus en
una placa recubierta con laminina de ratón y una sustancia funcional
capaz de unirse a un virus, CH-271, según el método
del cóctel. La eficacia de la transferencia génica utilizando
CH-271 combinado con laminina se incrementa 5,7
veces a lo sumo en comparación con aquella en la que se utiliza
CH-271 solo.
Además, se llevó a cabo el mismo procedimiento
descrito antes utilizando sobrenadante del virus
Eco-EGFP a un título de 10^{7} cfu/ml. La
eficacia de transferencia génica media de las tres rondas de
experimentos se muestra en la Tabla 8. También se demostró en este
caso que la eficacia de la transferencia génica cuando se utilizaba
una sustancia funcional capaz de unirse a un retrovirus aumentaba al
utilizar laminina combinada.
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Se prepararon células T CD3 positivas derivadas
de bazo de ratón como sigue. Se recogieron células del bazo de un
ratón hembra C3H/He de 6-8 semanas de edad. Las
células se hicieron pasar a través de un tamiz de 100 \mum
(Falcon) para separar los residuos. Las células restantes se lavaron
con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, Bio Whittaker) que
contenía FCS al 10%, los eritrocitos se lisaron utilizando tampón
Ery-Lysis, y las células se lavaron de nuevo con
HBSS. Las células resultantes se hicieron pasar a través de un tamiz
de 30 \mum (Miltenyi Biotec) para separar los residuos y después
se purificaron utilizando una columna para concentrar las células T
CD3 positivas (R&D Systems). Las células T CD3 positivas de
ratón utilizadas para los experimentos de infección viral se
estimularon previamente como sigue. Las células se cultivaron para
la estimulación previa en una placa de Petri sobre la cual se habían
inmovilizado un anticuerpo anti-CD3 de ratón y un
anticuerpo anti-CD28 de ratón (ambos a 1 \mug/ml,
Pharmingen). La placa de Petri contenía medio RPMI 1640 (Bio
Whittaker) suplementado con 10% de FCS, 50 unidades/ml de penicilina
y 50 \mug/ml de estreptomicina. Las células se cultivaron a 37ºC
durante 2 días en presencia de 5% de CO_{2}.
Se recubrió una microplaca de 24 pocillos
utilizando una mezcla que contenía 20 \mug/ml de laminina de ratón
y 80 \mug/ml de CH-296 como se describe en el
Ejemplo 5. Se añadieron 10^{5} células T
CD3-positivas y 0,5 ml de sobrenadante de virus
Eco-EGFP (10^{5} cfu/ml) a cada pocillo de la
microplaca para la infección viral durante 3 horas. A esto se le
añadió el medio RPMI 1640 que contenía 10% de FCS, 500 unidades/ml
de interleucina-1\alpha de ratón recombinante
(Genzyme), 10 ng/ml de interleucina-2 de ratón
recombinante (Genzyme), 50 unidades/ml de penicilina y 50 \mug/ml
de estreptomicina. La incubación continuó durante 48 horas. Tras la
incubación, se recogieron las células utilizando un tampón de
separación de células y se lavaron. La eficacia de la transferencia
génica se calculó como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados
se muestran en la Tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recubrió una microplaca de 96 pocillos
utilizando 50 \mul/pocillo de una mezcla que contenía 5 \mug/ml
de laminina de ratón y 80 \mug/ml de CH-271 como
se describe en el Ejemplo 5. Se examinaron los efectos del
tratamiento de la placa con diversas enzimas que tenían actividades
de escisión de cadenas de azúcar sobre la eficacia de la
transferencia génica.
Las placas se trataron con las enzimas como
sigue: Se prepararon soluciones de enzima que contenían 500 mU/ml
de O-glicanasa
(endo-\alpha-N-acetilgalactosaminidasa,
Seikagaku Corp.), 500 mU/ml de endoglicosidasa H
(endo-\beta-N-acetilglucosaminidasa
H, (Seikagaku Corp.), 250 mU/ml de
endo-\beta-galactosidasa
(Seikagaku Corp.) y 2 mU/ml de \alpha-manosidasa
(Seikagaku Corp.) en tampón citrato-fosfato 50 mM
(pH 5,0). Se preparó una solución de enzima que contenía 250 mU/ml
de glicopeptidasa F (péptido: N-glicosidasa F,
Takara Shuzo) en tampón tris-hidrocloruro 100 mM
(pH 8,6). Se dispensaron 50 \mul de cada una de las soluciones de
enzima en cada pocillo para que reaccionaran a 37ºC durante 20
horas. La placa se lavó luego tres veces con PBS y después se
utilizó para los experimentos de infección viral.
A cada pocillo de la microplaca se le añadieron
10^{4} células L1210 de leucemia de ratón en medio RPMI
suplementado con un 10% de FCS, 50 unidades/ml de penicilina y 50
\mul/ml de estreptomicina, y 50 \mul de sobrenadante de virus
PM5neo (10^{4} cfu/ml). La placa se incubó durante 24 horas. El
medio se cambió por el mismo medio que contenía G418 (Gibco) a una
concentración final de 0,75 mg/ml. La placa se incubó durante 48
horas más. Las células resistentes a G418 se evaluaron como se
describe en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Tabla
10. La Tabla 10 resume los resultados de tres rondas de
experimentos.
Como se muestra en la Tabla 10, cuando se
utilizaba CH-271 combinado con laminina, aumentaba
la aparición de células resistentes a G418 en comparación con el
caso en el que se utilizaba CH-271 solo. El
tratamiento de la placa recubierta con laminina con endoglicosidasa
H anulaba completamente el efecto promotor de la transferencia
génica de la laminina. Además, el tratamiento de la placa con
\alpha-manosidasa o glicopeptidasa F disminuía la
eficacia de la transferencia génica hasta cierto punto. Según un
informe relacionado con las cadenas de azúcar de la molécula de
laminina [Biochim. Biophys. Acta, 883:112-126
(1986), la mayor parte de las cadenas de azúcar de la molécula de
laminina son cadenas de azúcar conectadas a N que están unidas a
asparragina. Cuarenta y tres moléculas de cadenas de azúcar
conectadas a N están unidas a una molécula de laminina. Entre las
cadenas de azúcar, las cadenas de azúcar conectadas a N de la
asparragina del tipo de alto contenido en manosa son liberadas
mediante el tratamiento con endoglicosidasa H. El hecho de que
también se observara un descenso en la eficacia de la transferencia
génica cuando se calentaba con \alpha-manosidasa
sugiere que las cadenas de azúcar de la molécula de la laminina
juegan un importante papel. Tales cadenas de azúcar tienen una
estructura que contiene manosa unida \alpha1-2-
y/o \alpha1-6-, que es escindida con
\alpha-manosidasa, representada por
(Manosa)_{9}-(GluNAc)_{2}-Asn y/o
(Manosa)_{6}-(GluNAc)_{2}-Asn.
Como se ha descrito antes, se demostró que el efecto promotor de la
transferencia génica de la laminina se debe a las cadenas de azúcar
de la molécula de laminina, en particular a las cadenas de azúcar
del tipo de elevado contenido en manosa.
La implicación de
(Manosa)_{9}-(GluNAc)_{2}-Asn en
la transferencia génica se confirmó mediante los siguientes
experimentos.
Se desnaturalizó con calor 1 g de aglutinina de
soja preparada a partir de harina de soja desgrasada (Sigma)
utilizando Sepharose C-2B (Pharmacia) en la cual se
había inmovilizado lactosa, y después se digirió con 20 mg de
Actinasa E (Kaken Pharmaceutical) en 20 ml de tampón
tris-hidrocloruro 50 mM (pH 7,2) que contenía
cloruro de calcio 10 mM a 37ºC durante 2 días. Después de inactivar
con calor la enzima, la mezcla se sometió a cromatografía
utilizando columnas Sephadex G-15 (50 ml) y Sephadex
G-25 (150 ml) para purificar
(Manosa)_{9}-(GluNAc)_{2}-Asn. La
Figura 1 ilustra la estructura de
(Manosa)_{9}-(GluNAc)_{2}-Asn de
la cual se separa el resto asparragina.
Se preparó una microplaca en la que se habían
inmovilizado CH-271 y
(Manosa)_{9}-(GluNAc)_{2}-Asn por
medio de enlaces covalentes. Brevemente, se activó una Carboplate de
96 pocillos (placa ELISA Carbo-type) (Sumitomo
Bakelite) utilizando 4 mg/ml de solución de carbodiimida soluble en
agua a 37ºC durante 2 horas, y después se lavó tres veces con agua
estéril. A cada pocillo de la Carboplate de 96 pocillos activada se
añadieron 50 \mul de cada una de las soluciones que contenían un
2% de BSA o 80 \mug/ml de CH-271 así como
(Manosa)_{9}-(GluNAc)_{2}-Asn a
concentraciones variables. La placa se sometió a una reacción de
inmovilización a 37ºC durante 2 horas. La placa se bloqueó
utilizando solución de glicina al 0,2% a 4ºC durante 15 horas y
después se utilizó para los siguientes experimentos de transferencia
génica.
Se añadieron 10^{3} células L1210 y 0,1 ml de
sobrenadante de virus Eco-EGFP (10^{6} cfu/ml) al
pocillo de la microplaca. Después de incubar la placa durante 48
horas, se añadieron al pocillo 0,1 ml de medio RPMI 1640 de nueva
aportación que contenía FCS, penicilina y estreptomicina. La placa
se incubó durante 24 horas más. Las células se recogieron y se
lavaron. La eficacia de la transferencia génica se calculó como se
describe en el Ejemplo 4. Los resultados medios de dos experimentos
independientes se muestran en la Tabla 11.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Tabla 11, la eficacia de
la transferencia génica para los pocillos en los cuales se había
inmovilizado
(Manosa)_{9}-(GluNAc)_{2}-Asn y
CH-271 aumentaba dependiendo de la concentración de
la cadena de azúcar utilizada. De este modo, se confirmó que la
cadena de azúcar que tenía la misma estructura que la de la
molécula de laminina contribuía al incremento de la eficacia de la
transferencia génica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recubrió una microplaca no tratada de 24
pocillos para el cultivo celular con una combinación de 1 \mug/ml
de anticuerpo monoclonal anti-CD4 de ratón o
anticuerpo monoclonal anti-CD44 de ratón (ambos de
Pharmingen) y
80 \mug/ml de H-271, CH-271 o CH-296 como se describe en el Ejemplo 4. Se aplicó como recubrimiento H-271 según el método de recubrimiento previo mientras CH-271 y CH-296 se aplicaron como recubrimiento según el método del cóctel.
80 \mug/ml de H-271, CH-271 o CH-296 como se describe en el Ejemplo 4. Se aplicó como recubrimiento H-271 según el método de recubrimiento previo mientras CH-271 y CH-296 se aplicaron como recubrimiento según el método del cóctel.
Se añadieron 0,5 ml de sobrenadante de virus
Eco-EGFP (10^{7} cfu/ml) a cada pocillo de la
microplaca. La placa se incubó a 32ºC durante 3 horas, y después se
lavó con medio RPMI 1640 que contenía un 10% de FCS, 50 unidades/ml
de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina. Se añadieron al
pocillo 10^{5} células T CD3 positivas derivadas de células de
bazo de ratón preparadas y previamente estimuladas como se describe
en el Ejemplo 6 para la infección viral durante 3 horas. Después de
eso, se añadió al pocillo medio RPMI 1640 que contenía un 10% de
FCS, 500 unidades de interleucina-1\alpha de ratón
recombinante, 10 ng/ml de interleucina-2 de ratón
recombinante, 50 unidades/ml de penicilina y 50 \mug/ml de
estreptomicina. La placa se incubó durante 48 horas más. Tras la
incubación, las células se recogieron utilizando un tampón de
separación de células, se lavaron y después se tiñeron con un
anticuerpo monoclonal anti-CD4 de ratón (Pharmingen)
marcado con ficoeritrina (PE; Pharmingen) y yoduro de propinio (PI,
Sigma). Estas células se sometieron a citometría de flujo utilizando
FACSVantage a una longitud de onda de excitación de 488 nm y una
longitud de onda de emisión de 515-545 nm o
562-588 nm para analizar bidimensionalmente la
expresión del antígeno CD4 y la expresión de EGFP en las células
viables. Se calcularon las eficacias de la transferencia génica en
las células CD4-positivas y las células
CD4-negativas. Los resultados se muestran en la
Tabla 12. La Tabla 12 resume los resultados de cuatro rondas de
experimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Tabla 12, cuando se
llevaba a cabo una infección retroviral en una placa recubierta
tanto con un anticuerpo monoclonal como con un fragmento de
fibronectina, se observaba un efecto de aumento de la eficacia de
la transferencia génica para las células T CD3 positivas derivadas
de células de bazo de ratón.
Entre otros, se debe observar que la eficacia de
la transferencia génica a células CD4 positivas era mucho mayor que
a las células CD4 negativas cuando la infección viral se llevaba a
cabo utilizando una combinación de anticuerpo monoclonal
anti-CD4 y una sustancia funcional capaz de unirse a
un retrovirus. Por ejemplo, la eficacia de la transferencia génica
a células CD4 positivas utilizando una combinación de un anticuerpo
monoclonal anti-CD4 y H-271 era muy
elevada (aproximadamente 60%), mientras la eficacia de la
transferencia génica a células CD4 negativas era sólo de
aproximadamente el 20%. Se observaban resultados similares cuando
se utilizaba CH-271 o CH-296 como
fragmento de fibronectina.
Por otra parte, el antígeno CD44 se expresa en
un 98% o más de las células CD4 positivas y de las células CD4
negativas. Por lo tanto, se esperaba que la eficacia de la
transferencia génica se incrementara con independencia de la
expresión del antígeno CD4 en las células cuando se utilizaba un
anticuerpo monoclonal anti-CD44 para la infección
retroviral como se ha descrito antes. Los resultados de la Tabla 12
confirman semejante expectativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo experimentos como se describe
en el Ejemplo 8 excepto que se utilizaron H-271 como
sustancia funcional capaz de unirse a un retrovirus, y anticuerpo
monoclonal anti-CD8a de ratón (Pharmingen) y
anticuerpo monoclonal anti-CD44 de ratón como
anticuerpos. Se utilizó un anticuerpo monoclonal
anti-CD8a de ratón (Pharmingen) marcado con
ficoeritrina (PE; Pharmingen) para detectar las células CD8
positivas y CD8 negativas. Los resultados se muestran en la Tabla
13. La Tabla 13 resume los resultados de dos rondas de
experimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Tabla 13, se observaba un
efecto de aumento de la eficacia de la transferencia génica a las
células T CD3 positivas derivadas de células de bazo de ratón cuando
se utilizaba una combinación de un anticuerpo monoclonal
anti-CD8a y un fragmento de fibronectina.
Cuando se utilizaba el anticuerpo monoclonal
anti-CD8a, como se observa en el Ejemplo 8, se
observaba una elevada eficacia de la transferencia génica para las
células que expresaban el antígeno CD8 reconocidas por el
anticuerpo. Por otra parte, cuando se utilizaba un anticuerpo
monoclonal contra CD44 que es expresado en un 98% o más de las
células CD8 positivas y las células CD8 negativas, no se reconocía
una diferencia en la eficacia de la transferencia génica entre las
células CD8 positivas y las células CD8 negativas.
Los resultados experimentales de los Ejemplos 8
y 9 son muy significativos. Estos resultados demuestran que un gen
de interés se puede transferir específicamente a las células diana
si la población celular que contiene las células diana es infectada
con un retrovirus que contiene el gen de interés en un recipiente de
cultivo que ha sido recubierto utilizando una mezcla (cóctel) de un
anticuerpo que se une específicamente a las células diana y una
sustancia funcional capaz de unirse al virus.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recubrió una microplaca para el cultivo
celular de 24 pocillos no tratada como se describe en el Ejemplo 4
según el método del cóctel utilizando 80 \mug/ml de
CH-271 y 1 \mug/ml de uno de los diversos
anticuerpos monoclonales contra diferentes antígenos de la
superficie celular (anticuerpos anti-CD4,
anti-CD8, anti-CD44,
anti-CD49c, anti-CD49d y
anti-CD49e; todos de Pharmingen).
Como células diana se utilizaron K562 (células
de leucemia mielógena crónica humana, ATCC CCL-243),
HSB-2 (células de leucemia linfoblástica aguda
humana, CCRF-HSB-2, ATCC
CCL-120.1), MOLT-3 (células de
leucemia linfoblástica aguda humana, ATCC CRL-1552)
y TF-1 (células de eritroleucemia humana, ATCC
CRL-2003). Se llevó a cabo el análisis FACS en
estas células utilizando los respectivos anticuerpos monoclonales
marcados para determinar la expresión de los antígenos
correspondientes a los anticuerpos.
Se añadieron 0,5 ml de sobrenadante de virus
Ampho-EGFP (1 x 10^{6} cfu/ml) a cada pocillo de
la microplaca. La placa se incubó a 32ºC durante 3 horas, y después
se lavó con medio RPMI 1640 que contenía 10% de FCS, 50 unidades/ml
de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina. Se añadieron a cada
pocillo 1 x 10^{5} de cada una de las respectivas células
suspendidas en 1 ml del medio para la infección viral. Después de
incubar durante 3 días más, se recogieron las células utilizando un
tampón de separación celular y se lavaron. La eficacia de la
transferencia génica con EGFP se calculó según el método de
citometría de flujo descrito en el Ejemplo 4.
\newpage
Los resultados se muestran en la Tabla 14. Se
muestran los resultados medios de tres experimentos
independientes.
La eficacia de la transferencia génica (Efic.
transf.) se expresa como un valor relativo (%) suponiendo la
eficacia de la transferencia génica sin la adición de un anticuerpo
para las respectivas células como el 100%.
Las razones de expresión del antígeno CD (razón
exp. ag. CD) representan las proporciones de células positivas (%)
en las mediciones FACS como sigue:
-: 10% o menos; +/-: 10-30%; +:
30-60%; ++: 60-90%; +++: 90% o
más.
Como se muestra en la Tabla 14, la razón de
expresión del antígeno se correspondía con la eficacia de la
transferencia génica utilizando el método del cóctel en el cual se
utilizaban CH-271 como sustancia de unión al virus y
el anticuerpo contra el antígeno de la célula como sustancia de
unión a la célula.
Además, se llevaron a cabo experimentos de
transferencia génica utilizando 80 \mug/ml de polilisina como
sustancia funcional capaz de unirse a un retrovirus en lugar de
CH-271. Los anticuerpos monoclonales y las células
utilizados así como otras condiciones experimentales fueron los
descritos antes. Los resultados se muestran en la Tabla 15. Se
muestran los resultados medios de tres experimentos
independientes.
La eficacia de la transferencia génica (Efic.
transf.) se expresa como un valor relativo (%) suponiendo la
eficacia de la transferencia génica sin la adición de un anticuerpo
para las respectivas células como el 100%.
Las razones de expresión del antígeno CD (razón
exp. ag. CD) representan las proporciones de células positivas (%)
en las mediciones FACS como sigue:
-: 10% o menos; +/-: 10-30%; +:
30-60%; ++: 60-90%; +++: 90% o
más.
Como se muestra en la Tabla 15, la razón de
expresión del antígeno se correspondía con la eficacia de la
transferencia génica utilizando el método del cóctel en el cual se
utilizaban polilisina como sustancia de unión al virus y el
anticuerpo contra el antígeno de la célula como sustancia de unión a
la célula.
Las dos series de resultados experimentales
descritas antes demuestran que se puede transferir un gen
específicamente a las células diana de interés transfiriendo un gen
según el método del cóctel utilizando un anticuerpo que reconoce
específicamente un antígeno expresado sobre la célula diana como
sustancia de unión a la célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfirieron células de leucemia mielocítica
humana HL-60 (ATCC CCL-240)
cultivadas en medio RPMI 1640 que contenía un 10% de FCS, 50
unidades/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina al mismo
medio que contenía desferoxamina (Sigma) a concentraciones
variables el día anterior a los experimentos de infección. Las
células se cultivaron a 37ºC durante 20 horas en presencia de 5% de
CO_{2}. Las células se lavaron con medio de nueva aportación sin
desferoxamina después de su uso, y luego se suspendieron a una
concentración de 2 x 10^{5} células/ml para su uso en los
siguientes experimentos de infección.
Se añadieron 0,5 ml de CH-271 de
80 \mug/ml a cada pocillo de una microplaca no tratada de 24
pocillos para el cultivo celular. La placa se dejó estar a 4ºC
durante la noche, se bloqueó utilizando un 2% de BSA durante 30
minutos y se lavó con PBS. Se añadieron 0,5 ml de sobrenadante de
virus Ampho-EGFP (10^{6} cfu/ml) al pocillo de la
microplaca. La placa se incubó a 32ºC durante 3 horas y se lavó con
medio RPMI 1640 que contenía 10% de FCS, 50 unidades de penicilina
y 50 \mug/ml de estreptomicina. Se añadieron 10^{5} células
HL-60 precultivadas al pocillo. La placa se incubó
durante 48 horas. Al pocillo se le añadieron 0,5 ml de medio RPMI
1640 que contenía un 10% de FCS, 50 unidades/ml de penicilina y 50
\mug/ml de estreptomicina. La placa se incubó durante 24 horas
más. Después de eso, se determinó la eficacia de la transferencia
génica como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados se muestran
en las Tablas 16 y 17.
Como se muestra en las Tablas 16 y 17, se
observaba un incremento de la eficacia de la transferencia génica
incluso para las células HL-60 mediante el
tratamiento previo de las células con desferoxamina durante 20
horas. Se sabía que un gen se transfiere a las células
HL-60 con una eficacia muy baja al utilizar
CH-271 solo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diluyó el sobrenadante del virus TKNeo
preparado en el Ejemplo 2 con DMEM, un sobrenadante de cultivo de
células NIH/3T3 (ATCC CRL-1658) o un sobrenadante de
cultivo de células \varphiCRIP a una concentración de 312,5
cfu/ml para su uso en los siguientes procedimientos.
Se añadieron 0,5 ml de CH-296 de
32 \mug/ml a cada pocillo de una microplaca no tratada de 24
pocillos para el cultivo celular. La placa se dejó estar a la
temperatura ambiente durante 2 horas, se bloqueó con un 2% de BSA
durante 30 minutos y se lavó con PBS. Se añadieron 1 ml del
sobrenadante de virus mencionado antes y 2 x 10^{4} células
NIH/3T3 al pocillo de la placa. La placa se incubó a 37ºC durante la
noche. Las células se cultivaron después en un medio selectivo que
contenía 0,75 mg/ml de G418 durante 10 días. Se contó el número de
colonias formadas. La razón del número de colonias con respecto al
número de colonias formadas en un medio sin G418 se definió como la
eficacia de la transferencia génica. Los resultados se muestran en
la Tabla 18.
Como se muestra en la Tabla 18, la eficacia de
la transferencia génica disminuía un quinto o menos cuando se
utilizaba la dilución del virus del sobrenadante de cultivo de las
células NIH/3T3 o el sobrenadante de cultivo de las células
\varphiCRIP en comparación con la eficacia de la transferencia
génica en la que se utilizaba la dilución con DMEM. NIH/3T3 es la
cepa parental de muchas líneas celulares de empaquetamiento tales
como \varphiCRIP y GP+EmvAm12, que se utilizó para generar las
células productoras del vector de virus TKNeo utilizado en este
experimento. El hecho de que se encuentre actividad inhibidora de la
infección retroviral en los sobrenadantes de cultivo de estas
células sugiere que los sobrenadantes de virus preparados utilizando
células de empaquetamiento similares también contienen sustancias
inhibidoras.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron los siguientes procedimientos para
eliminar la sustancia inhibidora de la infección viral encontrada
en el Ejemplo 12. El sobrenadante de virus TKNeo preparado en el
Ejemplo 2 se diluyó con el sobrenadante de cultivo de las células
\varphiCRIP a una concentración de 5000 cfu/ml. El sobrenadante
diluido se diluyó además doblemente con DMEM para utilizarlo como
muestra que contenía un retrovirus.
Se añadió 1 ml del sobrenadante de virus a cada
pocillo de una placa recubierta con CH-296 como se
describe en el Ejemplo 11. La placa se incubó durante 1 a 5 horas
para poner en contacto y unir las partículas de virus con
CH-296. Después la placa se lavó tres veces con PBS.
Se añadió al pocillo 1 ml de DMEM que contenía 2 x 10^{4} células
NIH/3T3. Como control, se suspendieron 2 x 10^{4} células NIH/3T3
en 1 ml del sobrenadante de virus mencionado antes y después se
transfirió inmediatamente a la placa recubierta con
CH-296. Estas placas se incubaron a 37ºC durante la
noche para permitir que el virus infectara las células. Tras la
infección, las células se cultivaron en un medio selectivo que
contenía 0,75 mg/ml de G418 durante 10 días, y se contó el número
de colonias formadas. Se definió la razón del número de colonias
resistentes a G418 con respecto al número de colonias formadas en
el medio sin G418 como la eficacia de la transferencia génica. Los
resultados se muestran en la Figura 3.
Como se muestra en la Figura 3, se observaba una
eficacia de transferencia superior a las 3 horas cuando las
partículas de virus se ponían en contacto y se unían con la placa
recubierta de CH-296 en comparación con la eficacia
del grupo de control. De este modo, se demostró que la actividad de
inhibición de la infección viral en un sobrenadante de virus se
podía eliminar mediante los procedimientos descritos antes.
Las células productoras de retrovirus
recombinante obtenidas introduciendo el plásmido vector retroviral
pLEIN en las células \varphiCRIP se cultivaron en DMEM que
contenía un 10% de CS. Cuando las células crecieron hasta la
semi-confluencia en una placa de 10 cm, se cambió el
medio por 7 ml de RPMI 1640 que contenía un 10% de FCS o 7 ml de
RPMI que contenía butirato de sodio 5 mM (Nacalai Tesque) y 10% de
FCS. Después de que las células se cultivaran durante 24 horas, los
sobrenadantes se filtraron a través de filtros de 0,45 \mum para
obtener sobrenadantes de virus. El título del sobrenadante de virus
se determinó como se describe en el Ejemplo 2. El título del
sobrenadante de virus sin butirato de sodio era 3,3 x 10^{4}
cfu/ml, mientras el título del sobrenadante de virus que contenía
butirato de sodio 5 mM era 2 x 10^{6} cfu/ml.
El butirato de sodio tiene actividades de
detención del ciclo celular para suprimir el crecimiento celular e
inducir la diferenciación. De este modo, puede tener una influencia
nociva sobre las células infectadas. La eliminación del butirato de
sodio contenido en un sobrenadante de virus se evaluó como
sigue.
Se utilizaron células HL-60 como
células diana. Se añadieron 0,5 ml del sobrenadante de virus antes
mencionado a cada pocillo de una placa recubierta con
CH-296 como se describe en el Ejemplo 12. La placa
se incubó a 37ºC durante 3 horas para poner en contacto y unir las
partículas de virus con CH-296. Tras la incubación,
la placa se lavó tres veces con PBS. Se añadieron 0,5 ml de medio
RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS que contenía 5 x 10^{4}
células HL-60 al pocillo. Como control, se
suspendieron 5 x 10^{4} células HL-60 en 0,5 ml
del sobrenadante de virus mencionado antes e inmediatamente después
se añadieron a la placa recubierta con CH-296.
Estas placas se incubaron a 37ºC durante la noche para permitir que
el virus infectara las células. Después de la incubación, se añadió
al pocillo 1 ml de medio RPMI 1640 que contenía un 10% de FCS. La
placa se incubó durante 48 horas más. Luego se contó el número de
células. Además, se detectaron las células que expresaban EGFP
según el método de citometría de flujo descrito en el Ejemplo 4 para
analizar la eficacia de la transferencia génica. Los resultados se
muestran en la Tabla 19.
Como se muestra en la Tabla 19, se observaba una
eficacia de la transferencia génica mayor para el grupo de control
cuando se utilizaba un sobrenadante de virus preparado añadiendo
butirato de sodio, confirmando la eficacia del butirato de sodio en
la preparación de virus. No obstante, el número de células viables
observado utilizando el sobrenadante que contiene butirato de sodio
era un cuarto o menos del observado utilizando el sobrenadante sin
butirato de sodio, confirmando que el butirato de sodio suprimía el
crecimiento celular. Por otra parte, cuando se ponían en contacto y
se unían las partículas de virus con la placa recubierta con
CH-296 de antemano, la supresión del crecimiento
celular, que se observaba para el grupo de control utilizando el
sobrenadante que contenía butirato de sodio, no se observaba. Se
observaba un incremento en lugar de un descenso, de la eficacia de
la transferencia génica. De este modo, se demostró que se podía
obtener una elevada eficacia de la transferencia génica sin la
influencia de butirato de sodio poniendo en contacto el virus con
CH-296 seguido de lavado.
A continuación, se utilizó
DEAE-dextrano para llevar a cabo experimentos
similares.
Se disolvió DEAE-dextrano
(Sigma) a una concentración de 10 mg/ml en PBS. La solución se
esterilizó filtrando a través de un filtro de 0,22 \mum y se
utilizó para recubrir una placa. Se añadieron 1,1 ml de una mezcla
obtenida mezclando 10 volúmenes de PBS y 1 volumen de la solución de
DEAE-dextrano a cada pocillo de una placa para el
cultivo celular no tratada de 6 pocillos (Iwaki Glass). La placa se
incubó a 4ºC durante la noche. La solución de
DEAE-dextrano se separó de la placa. Se añadieron 2
ml de una solución con el 2% de BSA al pocillo para el tratamiento
durante 30 minutos. La placa se lavó tres veces con 2 ml/pocillo de
PBS. Como control, se preparó una placa llevando a cabo los mismos
procedimientos excepto que se utilizó PBS en lugar de la solución
de DEAE-dextrano.
Se preparó un sobrenadante de virus según el
método en el cual se añadía butirato de sodio como se ha descrito
antes utilizando células productoras de retrovirus recombinante
producidas introduciendo un plásmido vector retroviral pLEIN en
células GP+E86 [J. Virol., 62:1120-1124 (1988)]. Se
añadió a cada pocillo 1 ml de una dilución de virus (1,6 x 10^{6}
cfu/ml) obtenido diluyendo 1 volumen del sobrenadante de virus con
20 volúmenes de DMEM que contenía 10% de CS. La placa se incubó a
37ºC durante 2 horas, y después se lavó tres veces con 2 ml/pocillo
de PBS. Se añadieron 5 x 10^{4} células NIH/3T3 al pocillo. La
placa se incubó a 37ºC durante 3 días en presencia de 5% de
CO_{2}. Después de la incubación, las células se trataron con
tripsina y se recogieron. Se analizaron las células que expresaban
EGFP según el método de citometría de flujo descrito en el Ejemplo
4 para determinar la eficacia de la transferencia génica. Los
resultados se muestran en la Tabla 20.
Como se muestra en la Tabla 20, se demostró que
el DEAE-dextrano también es capaz de unirse a un
retrovirus, y se puede utilizar para el método de transferencia
génica de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células \varphiCRIP en las
cuales se había introducido un plásmido de retrovirus, vector DOL,
que contenía un gen de resistencia a la neomicina [Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 84:2150-2154 (1987)] en DMEM que contenía
10% de CS, 50 unidades/ml de penicilina y 50 \mug/ml de
estreptomicina. Se preparó sobrenadante de virus DOL como sigue. Se
cambió el medio de una placa de 10 cm en la cual se habían hecho
crecer células productoras hasta la semiconfluencia por 5 ml de
DMEM que contenía 10% de CS. Al cabo de 24 horas, se recogió el
sobrenadante y se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum
(Millipore). El título del sobrenadante de virus era de 8,7 x
10^{5} cfu/ml.
Se recubrió con CH-296 un tubo
de centrifugación (tubo cónico de polipropileno de 50 ml, Falcon)
utilizado para infectar células con un retrovirus como sigue.
Brevemente, se colocaron lentamente 3 ml de PBS que contenía
40 \mug/ml de CH-296 en la base del tubo de centrifugación. El tubo se dejó estar boca arriba para la incubación a 4ºC durante 16 horas. La solución de CH-296 se cambió por 3,5 ml de PBS que contenía 2% de BSA. El tubo se incubó durante 30 minutos más a la temperatura ambiente, y después se lavó con 5 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, Gibco).
40 \mug/ml de CH-296 en la base del tubo de centrifugación. El tubo se dejó estar boca arriba para la incubación a 4ºC durante 16 horas. La solución de CH-296 se cambió por 3,5 ml de PBS que contenía 2% de BSA. El tubo se incubó durante 30 minutos más a la temperatura ambiente, y después se lavó con 5 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, Gibco).
El retrovirus DOL se unió a la base del tubo de
centrifugación recubierto con CH-296 como sigue.
Brevemente, se colocaron 5 ml de sobrenadante de virus DOL no
diluido, o una dilución a la décima o a la centésima del mismo en
el tubo de centrifugación. El tubo se centrifugó a 2900 x g a 25ºC
durante 3 horas para forzar la unión del retrovirus a
CH-296. Como comparación, se añadió a una placa no
tratada de 6 pocillos para el cultivo celular (Falcon) recubierta
con CH-296 el sobrenadante del virus mencionado
antes utilizando PBS que contenía 40 \mug/ml de
CH-296 de manera que diera lugar a una densidad de 8
\mug/cm^{2}. Se dejó estar la placa a 37ºC durante 4 horas para
la unión y se utilizó en los siguientes procedimientos.
Se llevó a cabo la transferencia génica a
células NIH/3T3 utilizando el tubo de centrifugación recubierto con
CH-296 al cual se había obligado a unirse el
retrovirus mediante centrifugación. Brevemente, se colocaron 1 x
10^{5} células NIH/3T3 en el tubo de centrifugación recubierto con
CH-296 en el cual se había centrifugado una de las
diluciones seriadas del sobrenadante del virus. El tubo se incubó a
37ºC durante 3 horas (en adelante referido como método de
centrifugación). Alternativamente, se incubó la microplaca
mencionada antes en las misma condiciones (referidas en adelante
como método de unión). Como control, se añadió una mezcla de
sobrenadante de virus y NIH/3T3 a la microplaca recubierta con
CH-296, y la placa se incubó a 37ºC durante 3 horas.
Los resultados obtenidos utilizando el último método se definieron
como los del método de infección convencional y se utilizaron para
la comparación (referido en adelante como método del sobrenadante).
Después de la incubación, se recogieron las células. Se determinó
la eficacia de la transferencia génica en las células recogidas como
se describe en el Ejemplo 13. Los resultados se muestran en la
Figura 4. En la Figura 4, el eje horizontal representa la velocidad
de dilución del sobrenadante del virus y el eje vertical representa
la eficacia de la transferencia génica. Las barras abiertas, las
barras sombreadas y las barras cerradas representan los resultados
obtenidos utilizando el método del sobrenadante, el método de unión
y el método de centrifugación, respectivamente.
Como se muestra en la Figura 4, la eficacia de
la transferencia génica en la que se utiliza el método de
centrifugación era mayor que la que utiliza el método del
sobrenadante convencional y el método en el cual se ha adsorbido
espontáneamente el virus a CH-296 antes de la
infección (el método de unión). De este modo, se demostró que se
unían más partículas de virus a CH-296 en la base
del recipiente obligando al virus a precipitar por la fuerza
centrífuga. En particular, el efecto debido a la centrifugación era
notable cuando se utilizaba un sobrenadante de virus diluido.
Además, se medían los títulos de los
sobrenadantes del virus recogidos después de la unión al virus
utilizando la centrifugación o el reposo (unión). Los resultados se
muestran en la Tabla 21.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en le Tabla 21, en caso de
reposo, el sobrenadante recogido tenía aproximadamente de un 80 a
un 90% del título del sobrenadante antes de la unión. Por otra
parte, el título de sobrenadante después de forzar la unión
mediante centrifugación era un décimo o menos de la del sobrenadante
antes de la unión. Estos resultados demuestran que se unían más
partículas de virus a CH-296 por la fuerza
centrífuga. El PBS utilizado para lavar el tubo de centrifugación
después de la centrifugación contenía aproximadamente un 2% de la
cantidad original del virus. Además, se observaba casi la misma
eficacia de transferencia génica con independencia de la presencia
de la etapa de lavado. Estos resultados sugieren que las partículas
de virus eran firmemente mantenidas por CH-296
cuando se utilizaba la centrifugación.
Además, la eficacia de la transferencia génica
mediante el método de centrifugación se comparaba con la del método
en el cual las células se infectaban con un virus durante la
centrifugación.
La eficacia de la transferencia génica a las
células NIH/3T3 mediante el método de centrifugación se comparó con
la del método de infección por centrifugación, en el cual se hacía
precipitar un virus por la fuerza centrífuga sobre las células para
su infección (ver documento WO 95/10619). Como comparación se
utilizaron 5 ml de un sobrenadante de virus diluyendo el
sobrenadante de virus preparado utilizando células GP+E86 como se
describe en el Ejemplo 14 con un sobrenadante de cultivo de células
NIH/3T3 a una concentración de 1 x 10^{5} cfu/ml. Brevemente, la
transferencia se llevó a cabo como sigue. Se añadió el sobrenadante
de virus mencionado antes a un tubo de centrifugación recubierto
con CH-296. El tubo se centrifugó a 30ºC a 2.900 x g
durante 4 horas, y después se lavó con PBS. Después las células se
añadieron al tubo para la infección a 37ºC durante 4 horas (método
de centrifugación). Se añadieron células a un tubo de centrifugación
recubierto con CH-296, y se cultivaron durante 2
horas. Se añadió el sobrenadante de virus al tubo. El tubo se
centrifugó a 30ºC a 2.900 x g durante 4 horas para la infección
(método de infección por centrifugación). En estos métodos, los
tubos de centrifugación se recubrían con CH-296
como se ha descrito antes, y se utilizaban 1 x 10^{5} células
NIH/3T3 para la transferencia génica. Después de la infección las
células se volvieron a cultivar en placa en una placa de 60 mm, y se
cultivaron durante 2 días. La eficacia de la transferencia génica
con EGFP se determinó después según el método de citometría de
flujo descrito en el Ejemplo 4. Los resultados se muestran en la
Figura 5.
Como se muestra en la Figura 5, se demostró que
la eficacia de la transferencia génica mediante el método de
centrifugación era superior que la del método de infección por
centrifugación. Se considera que esto es porque las sustancias
inhibidoras de la infección del sobrenadante de virus se habían
eliminado mediante lavado.
Claims (7)
1. Un método para transferir un gen a
células diana utilizando un retrovirus que comprende:
- i.
- poner en contacto (a) una solución que contiene un retrovirus con (b) una sustancia funcional inmovilizada sobre un sustrato, donde la sustancia funcional comprende un sitio de unión al retrovirus y es capaz de unirse al retrovirus,
- ii.
- precipitar el retrovirus por medio de la fuerza centrífuga sobre la sustancia funcional,
- iii.
- lavar el sustrato al que está unido el retrovirus, y
- iv.
- poner en contacto e incubar el sustrato al que está unido el retrovirus con las células diana.
2. El método según la reivindicación 1,
donde la sustancia funcional capaz de unirse al retrovirus se
selecciona del grupo que consiste en fibronectina o su dominio de
unión a heparina II, una sustancia que tiene una actividad de unión
a heparina, el factor de crecimiento de fibroblastos, el colágeno de
tipo V, la polilisina y DEAE-dextrano.
3. El método según la reivindicación 1 ó
2, donde la sustancia funcional inmovilizada sobre el sustrato
también tiene un sitio de unión a la célula diana y es capaz de
unirse a las células diana.
4. El método según la reivindicación 1 ó
2, donde una sustancia funcional adicional se inmoviliza sobre el
sustrato, y dicha sustancia funcional adicional tiene un sitio de
unión a las células diana y es capaz de unirse a las células
diana.
5. El método según la reivindicación 4,
donde la sustancia funcional capaz de unirse a las células diana se
selecciona del grupo que consiste en proteínas de adherencia
celular, hormonas, citocinas, anticuerpos y cadenas de azúcar.
6. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde el sustrato es un recipiente para el
cultivo celular o un sustrato en forma de partículas.
7. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde la solución que contiene el
retrovirus es el sobrenadante de un cultivo de células productoras
de retrovirus incubadas en presencia de butirato de sodio.
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