ES2277815T3 - Proteina que se une a apoptina. - Google Patents
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Abstract
REIVINDICACIONES 1. Ácido nucleico que codifica apoptina y AAP-1, en el que dicha AAP-1 comprende los aminoácidos 23 a 250 de la figura 3 o SEQ ID NO:10 o un fragmento funcional del mismo que es capaz de inducir apoptosis.
Description
Proteína que se une a apoptina.
La presente invención se refiere al sector de la
apoptosis. La apoptosis es un proceso fisiológico activo y
programado para eliminar células superfluas, alteradas o malignas
(Earnshaw, 1995, Duke y otros, 1996). La apoptosis se caracteriza
por la retracción de las células, segmentación del núcleo,
condensación y fraccionamiento del DNA en fragmentos con tamaños de
dominio, seguido la mayor parte de células por degradación
internucleosomal. Las células apoptóticas se fragmentan en cuerpos
apoptóticos encerrados por una membrana. Finalmente, las células
adyacentes y/o macrófagos fagocitan rápidamente estas células que
mueren (Wyllie y otros, 1980, White, 1996). Las células cultivadas
bajo condiciones de cultivo de tejidos y células procedentes de
material de tejidos pueden ser analizadas en cuanto a estado
apoptótico con agentes de tinción de DNA, por ejemplo DAPI, que
efectúa tinción de DNA normal, de manera fuerte y regular, mientras
que el DNA apoptótipo es objeto de tinción débil y/o irregular
(Noteborn y otros, 1994, Telford y otros, 1992).
El proceso apoptótico puede ser iniciado por una
serie de estímulos reguladores (Wyllie, 1995, White 1996, Levine,
1997). Los cambios en la tasa de supervivencia de células juega un
importante papel en la patogénesis humana de enfermedades, por
ejemplo, desarrollo de cáncer y enfermedades autoinmunes, en la que
se observa una proliferación incrementada o disminución de muerte de
las células (Kerr y otros, 1994, Paulovich, 1997). Se ha demostrado
que una serie de compuestos quimioterapéuticos y de radiación
inducen apoptosis en células tumorales, en muchos casos, con
intermedio de la proteína de tipo salvaje p53 (Thompson, 1995,
Bellamy y otros, 1995, Steller, 1995, McDonell y otros, 1995).
No obstante, muchos tumores adquieren una
mutación en p53 durante su desarrollo, que se correlaciona
frecuentemente con una respuesta desfavorable a la terapia del
cáncer. Algunos genes transformantes de virus de DNA tumorigénicos
pueden inactivar p53 por unión directa al mismo (Teodoro, 1997). Un
ejemplo de este agente es el antígeno T grande del virus de DNA
tumoral SV40. Para varios tumores (leucémicos), un elevado nivel de
expresión del proto-oncógeno Bcl-2
o Bcr-abl se asocia con una fuerte resistencia a
varios agentes quimioterapéuticos inductores de apoptosis
(Hockenberry 1994, Sachs y Lotem, 1997).
Para estos tumores en los que falta p53
funcional (lo que representa más de la mitad de los tumores) se
están desarrollando terapias alternativas antitumorales basándose
en la inducción de apoptosis independiente de p53 (Thompson 1995,
Paulovich y otros, 1997). Se tienen que buscar los factores
involucrados en la inducción de apoptosis, que no necesitan p53 y/o
no pueden ser bloqueados por actividades antiapoptóticas, tales como
Bcl-2 o similares a Bcr-abl. Esos
factores pueden ser parte de una ruta de apoptosis diferente o
podrían encontrarse (mucho) más abajo de los compuestos inhibidores
de apoptosis.
La apoptina es una proteína pequeña derivada del
virus de anemia de pollo (CAV; Noteborn y De Boer, 1995, Noteborn y
otros, 1991, Noteborn y otros, 1994; 1998a), que puede inducir
apoptosis en líneas celulares malignas humanas y transformadas,
pero no en cultivos de células humanas no transformadas. In
vitro, la apoptina deja de inducir muerte celular programada en
células normales linfoides, dérmicas, epidérmicas, endoteliales y
de músculos lisos. No obstante, cuando las células normales son
transformadas pasan a ser susceptibles a apoptosis por la acción de
la apoptina. La expresión a largo plazo de la apoptina en
fibroblastos humanos normales ha revelado que la apoptina no tiene
actividad tóxica o transformante en estas células
(Danen-van Oorschot, 1997 y Noteborn,
1996).
1996).
En células normales, se ha descubierto que la
apoptina se encontraba predominantemente en el citoplasma, mientras
que, en células transformadas o malignas, es decir, caracterizadas
por hiperplasia, metaplasia, displasia o aplasia, se localizó en el
núcleo, sugiriendo que la localización de la apoptina está
relacionada con su actividad (Danen-van Oorschot y
otros, 1997). La apoptosis inducida por apoptina tiene lugar en
ausencia de p53 funcional (Zhuang y otros, 1995a), y no puede ser
bloqueada por Bcl-2, Bcr-abl (Zhuang
y otros, 1995), o las proteínas que se asocian a
Bcl-2 BAG-1
(Danen-Van Oorschot, 1997a, Noteborn, 1996).
Por lo tanto, la apoptina es un compuesto
terapéutico para la destrucción selectiva de células tumorales, u
otras células de hiperplasia, metaplasia, aplasia o displasia,
especialmente para las células tumorales que han resultados
resistentes a la inducción quimioterapéutica de la apoptosis, debido
a la falta de p53 funcional y (sobre)expresión de
Bcl-2 y otros agentes inhibidores de apoptosis
(Noteborn y Pietersen, 1998). Parece que, incluso las células
transformadas en grado mínimo, premalignas, son sensibles al efecto
inductor de muerte de la apoptina. Además, Noteborn y Zhang (1998)
han demostrado que la apoptosis inducida por apoptina puede ser
utilizada como diagnóstico de células con tendencia cancerosa y para
el tratamiento de células con tendencia cancerosa.
El hecho de que la apoptina no induce apoptosis
en células humanas normales, por lo menos no in vitro,
demuestra que el efecto tóxico de un tratamiento de apoptina in
vivo será muy bajo. Noteborn y Pietersen (1998) y Pietersen y
otros (1998) han aportado pruebas de que la apoptina expresada por
adenovirus no tiene un efecto tóxico agudo in vivo. Además,
en ratones se ha demostrado que la apoptina tiene una fuerte
actividad antitumoral.
No obstante, para ampliar adicionalmente la
cantidad de compuestos terapéuticos anticáncer o antienfermedad
inmune que se disponen en este sector, son deseables compuestos
terapéuticos adicionales diseñados para funcionar solos,
secuencialmente, o conjuntamente con la apoptina, especialmente en
los casos en los que la p53 es (parcialmente) no funcional.
La presente invención da a conocer nuevas
posibilidades terapéuticas, por ejemplo, nuevas terapias de
combinación o nuevos compuestos terapéuticos que pueden funcionar
solos, secuencialmente, o conjuntamente con la apoptina,
especialmente en los casos en los que la p53 es (parcialmente) no
funcional.
En una primera realización, la invención da a
conocer un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica
AAP-1 y apoptina, en el que dicho
AAP-1 comprende los aminoácidos 23 a 250 de la
figura 3 o SEQ ID NO:10, o un fragmento funcional de los mismos,
cuyo fragmento es capaz de inducir apoptosis. La substancia
proteinácea involucrada se define como substancia que comprende un
péptido, polipéptido o proteína, que ha sido modificada
opcionalmente, por ejemplo, por glicosilación, miristilación,
fosforilación, adición de lípidos, por dimerización o
multimerización homóloga o heteróloga, o cualesquiera otras
modificaciones (postraducción) conocidas en el sector.
La asociación de apoptina de esta descripción se
define como perteneciente a la cascada de substancias
específicamente involucradas en la cascada de eventos que se
encuentran en la ruta de la apoptosis inducibles por apoptina,
preferentemente las substancias que están específicamente
involucradas en la ruta de apoptosis independiente de p53.
En una realización precedente, la invención da a
conocer un ácido nucleico aislado o recombinante, de acuerdo con la
invención, en la que dicho ácido nucleico que codifica AAP1
comprende en la figura 2 (SEQ ID NO:9) los ácidos nucleicos 142 a
829, o un fragmento funcional de los mismos, cuyo fragmento es capaz
de inducir apoptosis. Más preferentemente, la substancia proteinácea
asociada a la apoptina, codificada, co-localiza con
otras substancias inductoras de apoptosis, por ejemplo, apoptina,
cuando las dos substancias inductoras de apoptosis se encuentran
presentes en las misma célula. En células normales no transformadas,
las dos proteínas inductoras de apoptosis se
co-localizan en el citoplasma, mientras que, en
células transformadas o malignas, las dos proteínas inductoras de
apoptosis se co-localizan en el núcleo. En otra
realización, la substancia de asociación a apoptina es capaz de
unión con el factor de transcripción de ratón YY1, que se ha
indicado anteriormente que se une al homólogo AAP-1
de ratón RYBP (García y otros, 1999). En una realización preferente,
el ácido nucleico aislado o recombinante o equivalente funcional o
fragmento del mismo, que codifica una substancia proteinácea de
asociación a apoptina, capaz de proporcionar apoptosis, se deriva de
una biblioteca o genoteca de cDNA, preferentemente una genoteca de
cDNA de vertebrados, tal como se puede derivar de aves, pero más
preferentemente una genoteca de cDNA de mamíferos, preferentemente
en la que dicha genoteca de cDNA comprende cDNA humano.
En otra realización, la invención da a conocer
un ácido nucleico aislado o recombinante o fragmento funcional del
mismo que codifica una substancia proteinácea de asociación a
apoptina, capaz de proporcionar apoptosis tal como se muestra en la
figura 1 ó 2, codificando en particular una nueva proteína capaz de
proporcionar apoptosis o un fragmento funcional de la misma, llamado
proteína 1 de asociación a apoptina, que se abreviará en esta
descripción AAP-1. Desde luego, un ácido nucleico
aislado o recombinante o fragmento funcional del mismo, que
codifica una substancia proteinácea de asociación a apoptina
adicional, capaz de asociación con la proteína
AAP-1, son objeto también de la invención, así como
métodos y medios para conseguir dicha proteína adicional situada en
la cascada de apoptina que se deduce entre la descripción detallada
que se facilita.
Además, la presente invención proporciona un
vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención.
Se indican ejemplos de dicho vector en la descripción detallada
siguiente, tal como el vector
pMT2SM-AAP-1-a o b,
el vector pMT2SM que expresa cDNA marcados Myc
AAP-1-a o
APP-1-b, un plásmido que expresa un
fragmento de proteína de asociación a apoptina, vectores de
(sobre)expresión de E. coli, tales como pMAL y pET22b,
que comprenden un ácido nucleico de acuerdo con la invención y
otros. Estos y otros vectores son útiles, por ejemplo, en hallar
substancias proteináceas adicionales de asociación a apoptina de la
cascada, que se ha definido anteriormente, o para la
(sobre)expresión de una proteína codificada por un ácido
nucleico de acuerdo con la invención.
En otra realización adicional, la invención da a
conocer un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la
invención, comprendiendo dicho vector un vehículo de suministro de
un gen, haciendo la invención muy útil en terapia de genes. Al
equipar un vehículo de suministro de genes con un ácido nucleico
según la invención, y al direccionar dicho vehículo a un célula o
células que han sido extraproliferantes y/o que han mostrado tasas
de muerte disminuidas, dicho vehículo de suministro de genes
proporciona a dicha célula o células los medios necesarios para la
apoptosis, proporcionando amplias posibilidades terapéuticas.
Además, la presente invención da a conocer una
célula huésped que comprende un ácido nucleico o un vector de
acuerdo con la invención. Entre los ejemplos se comprenden células
bacterianas o de levaduras transformadas o transfectadas, tal como
se describe en la presente descripción detallada. Es preferente una
célula huésped de acuerdo con la invención, que es una célula
eucariótica transformada tal como una célula de levadura o una
célula de vertebrado, tal como una célula de mamífero o célula Cos
transformada o transfectada con un ácido nucleico o un vector de
acuerdo con la invención. Estas células son capaces, en general, de
expresar o producir una substancia proteinácea capaz de
proporcionar apoptosis con capacidad de asociación con apoptina.
La invención proporciona además un método
(reivindicación 7).
\newpage
La invención describe además una substancia
proteinácea de asociación a apoptina aislada o recombinante, capaz
de proporcionar apoptosis. Tal como se ha demostrado, por ejemplo,
en la figura 4, la expresión de dicha substancia proteinácea de
asociación a apoptina en células, tales como células tumorales, u
otras células extraproliferantes, induce el proceso apoptótico.
Puede proceder de este modo sola, o en presencia de otras
substancias inductoras de apoptosis, tales como apoptina, y
especialmente independientes de p53, demostrando que también en los
casos en los que la proteína p53 (funcional) se encuentra ausente,
la apoptosis puede ser inducida por una substancia de acuerdo con
la invención. Cuando la substancia proteinácea asociada con
apoptina, capaz de proporcionar apoptosis es utilizada junto con
otra substancia inductora de apoptosis, por ejemplo, apoptina, las
dos substancias proteináceas se co-localizan en el
citoplasma de células normales y no tienen como resultado apoptosis.
No obstante, en células transformadas o malignas las dos proteínas
inductoras de apoptosis se co-localizan en el
núcleo e inducen apoptosis. La invención describe también una
substancia proteinácea de acuerdo con la invención, que se une al
factor de transcripción YY1, que se ha mostrado anteriormente que se
une al homólogo RYBP de ratón AAP1. En particular, la invención
describe una substancia proteinácea de acuerdo con la invención,
codificada por un ácido nucleico de acuerdo con la invención, por
ejemplo, comprendiendo como mínimo una parte de una secuencia de
aminoácido tal como se muestra en la figura 3, o un equivalente
funcional o fragmento funcional del mismo, capaz de proporcionar
apoptosis solo o en combinación con otras substancias inductoras de
apoptosis tales como apoptina. La invención proporciona además un
compuesto de proteína (reivindicación 3).
La invención da a conocer además un método para
la inducción de apoptosis en células in vitro, en las que se
observa una proliferación de células incrementada o disminución de
muerte de células, comprendiendo el proporcionar a dichas células
una secuencia de ácido nucleico que codifica AAP-1,
en la que dicho AAP-1 comprende los aminoácidos 23
a 250 de la figura 3 o SEQ ID NO:10, o un fragmento funcional de los
mismos, cuyo fragmento es capaz de inducir apoptosis o un método
para inducir apoptosis in vitro en células en las que se ha
observado un incremento de proliferación celular o disminución de
muerte celular, comprendiendo el proporcionar dichas células
AAP-1, de manera que dicho AAP-1
comprende los aminoácidos 23 a 250 de la figura 3 o SEQ ID NO:10, o
un fragmento funcional del mismo, cuyo fragmento es capaz de inducir
apoptosis.
La invención prevé también un método que
comprende adicionalmente un método según la reivindicación 8 ó 9,
comprendiendo además la proteína apoptina o un ácido nucleico que
codifica apoptina.
La presente invención da a conocer además un
método para la inducción de apoptosis in vitro, en el que se
facilita a dichas células un ácido nucleico de acuerdo con la
invención o un compuesto de proteína de acuerdo con la
invención.
La invención da a conocer también un método para
la inducción de apoptosis in vitro, en el que un método según
la reivindicación 8 ó 10, en el que dicho ácido nucleico que
codifica AAP-1 comprende en la figura 2 (SEQ ID
NO:9) los ácidos nucleicos 142 a 829, o un fragmento funcional de
los mismos, cuyo fragmento codifica dicha AAP-1 y
cuyo fragmento es capaz de inducir apoptosis.
La invención describe también la producción de
un anticuerpo aislado o sintético que específicamente reconoce una
sustancia proteinácea o equivalente funcional o fragmento funcional
de la misma, de acuerdo con la invención. Este anticuerpo se puede
obtener, por ejemplo, inmunizando un animal experimental con una
sustancia proteinácea de asociación a apoptina o un fragmento
inmunogénico o equivalente del mismo, y recogiendo anticuerpos
policlonales de dicho animal inmunizado (tal como se muestra en la
descripción detallada), o que se pueda obtener por otros métodos
conocidos en la técnica, tales como por producción de anticuerpos
monoclonales o anticuerpos (cadena única) o proteínas de unión
expresadas a partir de ácido nucleico recombinante derivado de una
biblioteca de ácido nucleico, por ejemplo, obtenible mediante
técnicas de exhibición de fago.
Con un anticuerpo de este tipo, la invención
describe también una sustancia proteinácea específicamente
reconocible por este anticuerpo de acuerdo con la invención,
obtenible, por ejemplo, a través de inmunoprecipitación,
transferencia Western u otras técnicas inmunológicas conocidas en el
sector.
Además, la invención da a conocer la utilización
de un ácido nucleico, vector, célula huésped o sustancia
proteinácea, de acuerdo con la invención, para la inducción de
apoptosis, tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 4. En
particular, esta utilización es facilitada de manera que dicha
apoptosis es independiente de p-53. En particular,
esta utilización es facilitada asimismo comprendiendo además la
utilización de una apoptina que codifica ácido nucleico o un
equivalente funcional o fragmento de la misma, o utilización de
apoptina o de un equivalente funcional o fragmento de la misma. Tal
como se puede apreciar en la figura 4, combinando estas sustancias
inductoras de apoptina se incrementa el porcentaje de apoptosis de
las células tumorales tratadas.
Esta utilización conseguida por la invención es
particularmente útil desde un punto de vista terapéutico. La
invención proporciona un compuesto farmacéutico que comprende un
ácido nucleico, un vector, una célula huésped o una sustancia
proteinácea de acuerdo con la invención. Además, este compuesto
farmacéutico de acuerdo con la invención puede comprender además
una apoptina que codifica ácido nucleico o un equivalente funcional
o fragmento del mismo, o apoptina o un equivalente funcional o
fragmento de la misma.
Este compuesto farmacéutico es facilitado en
particular para la inducción de apoptosis, por ejemplo, de manera
que dicha apoptosis es independiente de p53, para el tratamiento de
una enfermedad en la que se ha observado proliferación incrementada
de células o muerte reducida de células, tal como es, en general, el
caso en el que dicha enfermedad incluye cáncer o una enfermedad
auto-inmune. La presente invención da a conocer un
método para el tratamiento de un individuo portador de la
enfermedad en la que se ha observado incremento de proliferación
celular o disminución de muerte celular, comprendiendo el
tratamiento de dicho individuo con un compuesto farmacéutico según
la invención. En particular, estos compuestos comprenden un factor
de una ruta de apoptosis, que es específico para células
transformadas. Por lo tanto, estos compuestos son esenciales para
nuevos tratamientos, pero también para diagnóstico de enfermedades
relacionadas con aberraciones en el proceso apoptótico, tales como
cáncer y enfermedades auto-inmunes.
En el campo del diagnóstico, la invención
describe un método para detectar la presencia de células de cáncer
o células que son propensas a cáncer en una muestra de células, que
comprende el transfectado de células en dicha muestra con un ácido
nucleico de acuerdo con la invención o un vector según la invención,
cultivando dichas células y determinando el porcentaje de apoptosis
de células en dicha muestra. Por ejemplo, se puede llegar a la
conclusión de que la localización celular de AAP-1
es diferente en células tumorigénicas/transformadas en comparación
con células normales no transformadas. Además, la acumulación de
AAP-1 en el núcleo se correlaciona con la inducción
de apoptosis, mientras que la localización citoplásmica se
correlaciona con viabilidad de las células y capacidad
proliferativa normal. Por lo tanto, la presente invención describe
un método para detectar la presencia de células de cáncer o células
que son propensas a cáncer en una muestra de células, que comprende
transfectar células en dicha muestra con un ácido nucleico o un
vector de acuerdo con la invención, y determinar la localización
intracelular de una sustancia proteinácea derivada de dicho ácido
nucleico o vector en células de dicha muestra. En particular, la
invención describe un método en el que la presencia de dicha
sustancia proteinácea en dichas células es detectada por
inmunotinción de dichas células con un anticuerpo, tal como en un
ensayo de inmunofluorescencia u otro inmunoensayo conocido en la
técnica. Preferentemente, dicho anticuerpo comprende un anticuerpo
de acuerdo con la invención.
Asimismo, la invención describe un método para
identificar un agente putativo inductor de cáncer, tal como genes
transformantes o fragmentos funcionales del mismo, que comprenden el
someter una muestra de células a dicho agente, por ejemplo, por
transfectado o meramente facilitando el agente al medio que rodea
las células, y detectando la presencia de células de cáncer o
células propensas a cáncer en un muestra de células con un método de
acuerdo con la invención.
De manera adicional, la invención describe un
método para detectar la tendencia a cáncer de una muestra de
células, y para detectar de esta manera la tendencia a padecer
cáncer de la persona de la cual dichas células han sido extraídas,
comprendiendo el someter dichas células a un agente inductor de
cáncer, tal como luz UV, y la detección de presencia de células
cancerosas o células con tendencia a cáncer en la muestra de células
con un método de acuerdo con la invención.
La invención se explicará de forma más detallada
en la descripción siguiente, que no es limitativa de la
invención.
Los inventores han utilizado el sistema
levadura-2 híbrido
("yeast-2-hybrid") (Durfee y
otros, 1993) para identificar compuestos celulares de asociación
con apoptina, que son esenciales en la inducción de apoptosis. El
sistema utilizado es una estrategia in vivo para identificar
proteínas humanas capaces de asociarse físicamente con la apoptina.
Se ha utilizado para rastrear genotecas de cDNA para clones que
codifican proteínas capaces de unión a la proteína de interés
(Fields y Song, 1989, Yang y otros, 1992). La invención da a
conocer, por ejemplo, una nueva proteína de asociación con
apoptina, que se designa proteína 1 de asociación con apoptina,
abreviada AAP-1. La invención da a conocer también
un método para inducir apoptosis por interferencia con la función
de esta proteína nueva AAP-1 o equivalentes
funcionales o fragmentos de la misma y/o la inducción de apoptosis
por medio de (sobre)expresión de AAP-1 o
equivalentes correspondientes de genes o equivalentes funcionales o
fragmentos de los mismos.
La invención da a conocer también una terapia
antitumoral basada en la interferencia con la función de proteínas
similares a AAP-1 y/o su (sobre)expresión.
Las proteínas similares a AAP-1 no se encuentran
normalmente presentes de forma muy abundante en líneas de células
inmortalizadas. Por lo tanto, un nivel aberrantemente alto de
proteínas similares a AAP-1 resultará en la
inducción del proceso opuesto de transformación celular, es decir,
apoptosis. La invención proporciona además el mediador de apoptosis
inducido por apoptina, que es específica de tumor. La invención
proporciona una terapia para cáncer, enfermedades autoinmunes o
enfermedades relacionadas que se basan en proteínas similares a
AAP-1 solas o en combinación con apoptina y/o
compuestos similares a apoptina.
Para la construcción del plásmido cebo, que
posibilita la identificación de proteínas de asociación con la
poptina por medio de un sistema
levadura-2-híbrido, se trató el
plásmido pET-16b-VP3 (Noteborn,
resultados no publicados) con NdeI y BamHI. El fragmento
NdeI-BamHI DNA de 0,4 kb fue aislado de agarosa con
bajo punto de fusión. El plásmido pGBT9 (Clontech Laboratories, Inc,
Palo Alto, USA) fue tratado con encimas de restricción EcoRI y
BamHI. El fragmento de DNA de unos 5,4 kb fue aislado y ligado a un
enlazador EcoRI-NdeI y el fragmento de DNA de 0,4
kb conteniendo las secuencias codificadoras de apoptina, empezando
por su propio codón de iniciación ATG. El constructo final
conteniendo un gen de fusión de la secuencia de dominio de unión con
GAL4 y apoptina bajo la regulación del promotor de levadura ADH fue
designado pGBT-VP3 y se demostró que era correcto
por análisis de encima de restricción y secuenciado de DNA de
acuerdo con el método Sanger (1977).
Todas las etapas de clonado fueron llevadas a
cabo esencialmente tal como se describe por Maniatis y otros
(1992). El plásmido pGBT-VP3 fue purificado por
centrifugación en un gradiente de CsCl y cromatografía de columna en
Sephacril S500 (Pharmacia).
El vector de expresión pACT, conteniendo los
cDNAs de las células B humanas transformadas por virus de
Epstein-Barr, fusionado al dominio de activación
transcripcional GAL4, fue utilizado para detectar proteínas de
asociación a apoptina. La genoteca de cDNA pACT se deriva de la
genoteca de cDNA lambda ACT, tal como se describe por Durfee y
otros, 1993.
La cepa de E. coli JM109 era el
recipiente de transformación para el plásmido pGBT9 y
pGBT-VP3. La cepa bacteriana electromax/DH10B fue
utilizada para la transformación necesaria para la recuperación de
los pACT-cDNA de asociación a apoptina, y se obtuvo
de la firma GIBCO-BRL, USA.
La cepa de levadura Y190 fue utilizada para
rastreo de la genoteca de cDNA, así como todas las demás
transformaciones, que forman parte del sistema utilizado de
levadura-dos-híbrido.
Para selecciones de medicamentos se
suplementaron placas Luria Broth (LB) para E. coli con
ampicilina (50 microgramos por ml). Se prepararon medios de levadura
YPD y SC tal como se describe por Rose y otros (1990).
Transformación de cepa competente de levadura
Y190 con plásmidos pGBT-VP3 y
pACT-cDNA y rastreo de actividad de
beta-galactosidasa.
La cepa de levadura Y190 se hizo competente y
transformada de acuerdo con los métodos descritos por Klebe y otros
(1983). Las células de levadura fueron transformadas, en primer
lugar con pGBT-VP3 y a continuación transformadas
con pACT-cDNA, y estas células de levadura
transformadas fueron cultivadas en placas carentes de histidina, a
las que faltaba también leucina y triptofán.
Se colocaron sobre colonias de levadura filtros
Hybond-N, que fueron positivos a histidina y se
dejaron humectar por completo. Los filtros fueron sacados y
sumergidos en nitrógeno líquido para permeabilizar las células de
levadura. Los filtros fueron descongelados y colocados con el lado
de la colonia hacia arriba sobre papel Whattman 3MM en un platillo
petri con tampón Z (Por litro: 16,1 gr Na_{2}HPO_{4}.7H_{2}O,
5,5 gr NaH_{2}HPO_{4}.H_{2}O, 0,75 gr KCl y 0,246 gr
MgSO_{4}.7H_{2}O, pH 7,0) conteniendo 0,27% de
beta-mercapto-etanol y 1 mg/ml de
X-gal. Los filtros fueron incubados durante un
mínimo de 15 minutos o durante la noche.
El DNA total a partir de células de levadura,
que eran positivas a histidina y beta-galactosidasa,
se preparó utilizando un método de lisis
glusulasa-alcalina tal como se describe por Hoffman
y Winston (1987), y se utilizó para transformar bacterias
Electromax/DH10B con intermedio de electroporación utilizando un
Bio-Rad GenePulser según las especificaciones del
fabricante.
Los transformantes fueron aplicados en forma de
capa sobre medios LB conteniendo el agente antibiótico de
ampicilina.
Por medio de ensayo de
colonia-filtro, las colonias fueron sometidas a
lisis e hibridadas a un oligómero 17-mer con
marcado radioactivo, que es específico para pACT (ver también
sección análisis de Secuencia). El DNA plásmido fue aislado de los
clones pACT, y por medio de digestión XhoI analizado en
cuanto a presencia de un inserto de cDNA.
Los subclones conteniendo las secuencias que
codifican proteínas de asociación de apoptina fueron secuenciados
utilizando dideoxi NTP según el método de Sanger, que fue llevado a
cabo por Eurogentec, Seraing, Bélgica. El cebador de secuenciado
utilizado era un 17-mer específico de pACT,
comprendiendo la secuencia de DNA
5'-TACCACTACAATGGATG-3'.
Las secuencias de los cDNA de asociación
apoptina fueron comparadas con secuencias de genes conocidas a
partir de EMBL/Genbank.
Para la construcción de los plásmidos de
(sobre)expresión de proteína, que posibilitan la producción y
aislamiento de proteína asociada a apoptina, se utilizaron los
plásmidos pMALTB y pET22b. El plásmido pMALTB es un derivado de
pMAL-C2 (New England Biolabs) en el que el factor
del lugar Xa ha sido sustituido por un lugar de Trombina. El
plásmido pMALTB fue tratado con BamHI y SalI y el
fragmento de \pm 7,0 kb DNA fue aislado de un gel de agarosa/TBE
(kit de extracción de gel QIAGEN). La secuencia AAP1 que codifica el
marco completo de lectura abierta fue obtenida por reacción PCR
sobre pACT-AAP-1b con el
cebador:
el fragmento de \pm 0,7 kb PCR
fue digerido con BamHI y SalI y aislado de un gel de
agarosa/TBE (kit de extracción de gel QIAGEN). El constructo final
conteniendo una fusión entre el gen MBP y el gen AAP1 bajo la
regulación del promotor tac inducible IPTG fue designado
pMAL-AAP1.
El plásmido pET22b (Novagen) fue tratado con
NdeI y NotI y el fragmento \pm 5,5 kb DNA fue
aislado de un gel de agarosa/TBE (kit de extracción de gel QIAGEN).
La secuencia AAP1 que codifica el marco de lectura abierta fue
obtenido por una reacción PCR sobre
pACT-AAP-1b con el cebador
directo:
el producto PCR fue tratado con
NdeI y NotI y el fragmento de \pm 0,7 kb fue aislado
a partir de un gel de agarosa/TBE (kit de extracción de gel QIAGEN).
El constructo final conteniendo una fusión entre el gen AAP1 y la
cola (His)6 bajo la regulación del promotor T7lac inducible
por IPTG fue designado
pET22b-AAP1.
Se comprobó que ambos constructos eran correctos
por análisis de enzima de restricción y secuenciado de DNA de
acuerdo con el método Sanger (1977).
Todas las etapas de clonado fueron llevadas a
cabo esencialmente tal como se describe por Maniatis y otros
(1992).
Para la producción de proteínas con el plásmido
pMAL-AAP1 se utilizó la cepa E. coli
B834(\lambdaDE3) y para el plásmido
pET22b-AAP1 se utilizó la cepa E. coli
BL21(DE3). Ambas cepas fueron obtenidas de Novagen.
La apoptina induce específicamente apoptosis en
células transformadas, tales como líneas celulares derivadas de
tumores humanos. Para identificar los compuestos esenciales en esta
trayectoria de apoptosis específica de transformación celular y/o
específica de tumores, se llevó a cabo un rastreo genético de
levadura. Los inventores utilizaron una genoteca de cDNA humano, que
está basada en el vector plásmido pACT conteniendo las copias
completas de cDNA realizadas a partir de las células B humanas
transformadas por virus Epstein-Barr (Durfee y
otros,
1993).
1993).
Para examinar la existencia de proteínas de
asociación de apoptina en la genoteca de cDNA
transformada/tumorigé-
nica humana se tuvo que construir un llamado plásmido cebo ("bait plasmid"). Con este objetivo, la región completa codificante de apoptina, flanqueada aproximadamente por 40 pares de bases más abajo del gen de apoptina, fue clonada en el lugar de clonado múltiple del plásmido pGBT9.
nica humana se tuvo que construir un llamado plásmido cebo ("bait plasmid"). Con este objetivo, la región completa codificante de apoptina, flanqueada aproximadamente por 40 pares de bases más abajo del gen de apoptina, fue clonada en el lugar de clonado múltiple del plásmido pGBT9.
El constructo final, llamado
pGBT-VP3, fue analizado por análisis de enzima de
restricción y secuenciado del área de fusión entre la apoptina y el
dominio de unión con GAL4-DNA.
Se determinó un gen (fragmento) codificando una
proteína de asociación a apoptina por transactivación de un promotor
sensible a GAL4 en levadura.
El gen de apoptina es fusionado al dominio de
unión con GAL4-DNA del plásmido
pGBT-VP3, mientras que todos los cDNA derivados de
las células B humanas transformadas fueron fusionados al dominio de
activación GAL4 del plásmido pACT. Si una de las sustancias
proteináceas codificadas por dichos cDNA se une a apoptina, el
dominio de unión GAL4-DNA se encontrará en las
proximidades del dominio de activación GAL4, en la activación del
promotor sensible a GAL4, que regula los genes indicadores HIS3 y
LacZ.
Los clones de levadura, conteniendo plásmido
expresando apoptina y un plásmido expresando un fragmento de
proteína de asociación de apoptina, pueden ser cultivados en un
medio carente de histidina ("histidine-minus")
y darán tinción azul en el ensayo de
beta-galactosidasa. A continuación, el plásmido con
el inserto de cDNA que codifica la proteína de asociación a apoptina
puede ser aislado y caracterizado.
Antes de que se pueda proceder de este modo, no
obstante, se tiene que determinar que la transformación de células
de levadura con plásmido pGBT-VP3 solo, o en
combinación con un vector vacío pACT, no tiene como resultado la
activación del promotor sensible a GAL4.
Los inventores han descubierto dos colonias de
levadura que, después de su transformación con
pGBT-VP3 y pACT-cDNA, son incapaces
de cultivo en un medio carente de histidina (al que faltaba también
leucina y triptofán), y que dió tinción azul en un ensayo de
beta-galactosidasa. Estos resultados indican que las
colonias de levadura observadas contienen además del plásmido cebo
pGBT-VP3 también un plásmido pACT que codifica una
proteína potencial de asociación a apoptina.
El DNA del plásmido fue aislado de la colonia de
levadura positiva, que fue transformada en bacterias. Por medio de
un ensayo de filtro-hibridación utilizando una sonda
de DNA marcada, específica de pACT, se pudieron determinar los
clones conteniendo plásmido pACT. A continuación, se aisló el DNA de
pACT y se digirió con enzima de restricción XhoI, que es
indicativo de la presencia de un inserto de cDNA. Finalmente, el
plásmido pACT conteniendo un inserto de cDNA fue secuenciado
utilizando el método Sanger (Sanger y otros, 1977).
El rastreo genético de levadura para las
proteínas de asociación a apoptina resultó en la detección de dos
clones de cDNA A y B, comprendiendo un tipo único de proteína, a
saber, una nueva proteína llamada proteína 1 de asociación a
apoptina, abreviada como AAP-1. La cDNA
AAP-1-b contiene el marco de lectura
abierta completo con el codón de iniciación ATG, mientras que la
secuencia AAP-1-a cDNA contiene un
marco de lectura abierta parcial de AAP-1, que es
completamente homólogo con la secuencia de
AAP-1-b DNA.
La secuencia de DNA determinada de los clones
AAP-1-a y AAP-1b
cDNA se muestra en las figuras 1 y 2, respectivamente. La secuencia
de aminoácido es derivada de la secuencia de DNA detectada del clon
AAP-1-b, que representa la secuencia
completa AAP-1 a.a., se indica en la figura 3.
Para estudiar si los cDNA
AAP-1-a y
AAP-1-b clonados codifican realmente
(asociación con apoptina) productos de proteína, los inventores
llevaron a cabo los siguientes experimentos.
El plásmido DNA pMT2SM contiene el promotor
principal (MLP) de adenovirus 5 y SV40 ori, posibilitando altos
niveles de expresión de genes extraños en células de mamíferos
transformadas, tales como células Cos transformadas por
SV-40. Además, el vector pMT2SM contiene una
etiqueta Myc (aminoácidos: EQKLISEEDL) que está en línea con el
producto de gen extraño. Esta etiqueta Myc posibilita el
reconocimiento de, por ejemplo, proteínas de asociación a apoptina
por medio del anticuerpo 9E10 específico de la etiqueta Myc.
Los vectores pMT2SM que expresan cDNA de
AAP-1-a o AAP-1b
etiquetados Myc fueron construidos del modo siguiente. Los clones
de cDNA de
pACT-AAP-1-a y
pACT-AAP-1-b fueron
digeridos con el enzima de restricción XhoI y los insertos de cDNA
fueron aislados. El vector de expresión pMT2SM fue digerido con XhoI
y tratado con fosfatasa alcalina de intestino vacuno y ligado a los
insertos de cDNA de AAP-1 aislados. Por análisis de
secuencia, los constructos de pMT2SM conteniendo el cDNA de
AAP-1-a o
AAP-1-b en la orientación correcta
fueron identificados.
La síntesis de la proteína AAP-1
con etiqueta Myc fue analizada por transfección de células Cos con
el plásmido
pMT2SM-AAP-1-a o
pMT2SM-AAP-1-b. Como
control negativo, células Cos fueron transfectadas en falso. Dos
días después de la transfección, las células fueron sometidas a
lisis y se llevó a cabo análisis de transferencia Western utilizando
el anticuerpo 9E10 específico de la etiqueta Myc.
Las células Cos transfectadas con
pMT2SM-AAP-1-a y
pMT2SM-AAP-1-b se
demostró que sintetizaban un producto AAP-1
etiquetado Myc con el tamaño esperado de aproximadamente 33kDa
(AAP-1-a) o 35 kDA
(AAP-1-b). Tal como era de esperar,
los lisados de las células Cos transfectadas en falso no contenían
un producto de proteína reaccionando con los anticuerpos específicos
de etiqueta Myc.
Estos resultados indican que se ha podido aislar
cDNA que son capaces de producir un producto de proteína con la
capacidad de asociarse a la proteína inductora de apoptosis
apoptina.
A continuación, se ha analizado la asociación de
apoptina y la proteína AAP-1 por medio de
co-inmunoprecipitaciones utilizando el anticuerpo
9E10 específico de etiqueta Myc. Los anticuerpos 9E10 se ha
demostrado que no se unen directamente a la apoptina, lo que
posibilita la utilización de 9E10 para llevar a cabo
co-inmunoprecipitaciones con proteínas asociadas a
apoptina (con etiqueta myc) y apoptina.
Con este objetivo, se
co-transfectaron células Cos con apoptina que
codifica el plásmido pCMV-VP3 y con el plásmido
pMT2SM-AAP-1-a. Como
control negativo, se transfectaron células con apoptina expresando
pCMV-VP3 y un plásmido
pcDNA3.1.LacZ-myc/His LacZ que codifica la
beta-galactosidasa etiquetada myc, que no se asocia
con apoptina.
Dos días después de la transfección, las células
fueron sometidas a lisis en un tampón que consistía en 50 mM Tris
(7.5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X100, 1 mg/ml
Na_{4}P_{2}O_{7} e inhibidores de proteasa recién añadidos
tales como PMSF, inhibidor de Tripsina, Leupeptina y
Na_{3}VO_{4}. Las proteínas específicas fueron
inmunoprecipitadas tal como se describe por Noteborn y otros (1998)
utilizando los anticuerpos 9E10 específicos de etiqueta Myc, y
analizados por transferencia Western.
La tinción de la transferencia Western con
anticuerpos 9E10 y anticuerpos 111.3, que están dirigidos
específicamente contra etiqueta Myc y apoptina respectivamente,
demostraron que los listados celulares "totales" contenían
apoptina y la proteína AAP-1 con etiqueta Myc o el
producto de beta-galactosidasa. La
inmunoprecipitación de los productos AAP-1 con la
etiqueta Myc fue acompañada por la inmunoprecipitación de producto
de apoptina de 16kDa. En contraste, la inmunoprecipitación de
beta-galactosidasa con la etiqueta myc no tuvo como
resultado una co-precipitación significativa de la
proteína apoptina.
En total, se llevaron a cabo tres experimentos
independientes de inmunoprecipitación, todos los cuales mostraron la
capacidad de asociación de apoptina a la proteína
AAP-1.
Estos resultados indican que la proteína de
nueva determinación AAP-1 es capaz de asociarse
específicamente con apoptina no solamente con el fondo de levadura,
sino también en un sistema celular transformado de mamífero.
Además, los inventores han examinado si la
proteína AAP-1 lleva a cabo actividad apoptótica. En
primer lugar, analizaron la localización celular de la nueva
proteína AAP-1 en células humanas transformadas. Con
ese objetivo, se transfectaron las células Saos-2
derivadas de osteosarcoma humano, tal como se describe por
Danen-van Oorschot (1997), con plásmido
pMT2SM-AAP-1-a o
pMT2SM-AAP-1-b
codificando las proteínas AAP-1-a o
AAP-1-b con etiqueta myc,
respectivamente.
Por inmunofluorescencia indirecta utilizando el
anticuerpo 9E10 específico de etiqueta myc y DAPI, que efectúa
tinción del DNA nuclear, se demostró que tanto la proteína parcial
como AAP-1 completa, se encontraban presentes en el
núcleo de la célula. En realidad, co-localiza con
las estructuras de cromatina/DNA.
Finalmente, los inventores examinaron si la
(sobre)expresión de ambos cDNA que codifican la proteína
AAP-1 completa o parcial tiene como resultado la
inducción de apoptosis. Cuatro días después de la transfección, la
mayor parte de células positivas AAP-1 fueron objeto
de tinción aberrante con DAPI, lo que es indicativo de la inducción
de apoptosis (Telford, 1992, Danen-van Oorschot,
1997).
La co-expresión de apoptina y
ambas proteínas AAP-1 en células de tumores humanos,
tales como células Saos-2, tiene como resultado un
proceso apoptótico más rápido como expresión de apoptina o de la
proteína AAP-1 sola. Los resultados de la actividad
apoptótica de la proteína AAP-1 completa se muestran
en la figura 4. El hecho de que la proteína AAP-1
pueda inducir apoptosis en células Saos-2 sin p53
indica que la proteína AAP-1 puede inducir
apoptosis independiente de p53. Estos resultados implican que se
puede utilizar AAP-1 como agente antitumoral en
casos en los que fallarán otros agentes (quimio)terapéuticos.
Además, el descubrimiento de que tanto la apoptina como la proteína
AAP-1 inducen una ruta independiente de p53, indica
que AAP-1 se incluye en la ruta apoptótica inducida
por apoptina.
Para establecer la posible
co-localización de Apoptina y AAP-1
en células humanas transformadas, se transfectaron en células
Saos-2 plásmidos que codifican Apoptina y
AAP-1. La expresión de AAP-1 y de
Apoptina fue controlada por inmunofluorescencia indirecta por medio
de microscopio de exploración confocal-láser con
ayuda de anticuerpos específicos mAb myc 9E10 contra la etiqueta myc
en AAP-1 y pAb VP3-c contra el
término C de Apoptina.
Las células co-transfectadas con
un plásmido que codifica AAP-1 y un plásmido que
codifica Apoptina expresaron estas proteínas de modo predominante
en el núcleo. Tanto la Apoptina como AAP-1 tenían
estructuras granulares y las estructuras características antes
descritas. Por medio de microscopio de exploración
confocal-láser, se demostró de forma clara que
tenía lugar co-localización parcial de
AAP-1 y Apoptina en estas estructuras nucleares.
Como conclusión, los inventores han identificado
una proteína de asociación a apoptina, es decir, la nueva proteína
AAP-1, que se encuentra presente en el núcleo y que
es capaz de inducir apoptosis (independiente de p53) en células
tumorales humanas. Además, cuando se expresan AAP1 y apoptina en la
misma célula, las dos proteínas inductoras de apoptosis están
co-localizadas en el núcleo de células tumorales
humanas.
A continuación, los inventores han examinado si
AAP-1 se comporta de manera similar en células
diploides humanas normales no transformadas, tal como se ha
observado para AAP-1 en células tumorales
humanas.
Con este objetivo, se transfectaron fibroblastos
VH10 diploides humanos (Danen-Van Oorschot, 1997)
utilizando Fugene de acuerdo con el protocolo del suministrador
(Roche, Almere, Holanda), con el plásmido
pMT2SM-AAP-1b que codifica la
proteína AAP completa, con la etiqueta myc. En paralelo, se
transfectaron también células Saos-2 derivadas de
tumor humano con plásmido
pMT2SM-AAP-1b.
Por inmunofluorescencia indirecta utilizando el
anticuerpo específico de myc-tag 9E10, se demostró
que en fibroblastos diploides normales VH10 la proteína
AAP-1 está localizada en el citoplasma. Tal como se
esperaba, en las células Saos-2 de tumor humano
AAP-1 se localiza en el núcleo.
Además, los inventores han examinado el efecto
de co-expresión de AAP-1 y apoptina
en fibroblastos VH10 humanos sobre la localización celular de
AAP-1, tal como se ha descrito para células que
expresan AAP-1 solo. Los datos de
inmunofluorescencia muestran que tanto la apoptina como
AAP-1, están localizados en estructuras
citoplásmicas. Estos hallazgos indican que la expresión de
AAP-1 y/o de apoptina no resulta en la localización
nuclear de una u otra en células diploides normales (humanas).
Para establecer la posible
co-localización de Apoptina y AAP-1
en células no transformadas, se transfectaron plásmidos codificando
Apoptina y AAP-1 en células VH10. Se controló la
expresión de AAP-1 y Apoptina por
inmunofluorescencia indirecta por medio de un microscopio de
exploración confocal-láser con la utilización de
anticuerpos específicos mAb myc 9E10 contra la etiqueta myc sobre
AAP-1 y pAb VP3-c contra el término
C de Apoptina. Las células C fueron rastreadas para
co-localización de Apoptina y AAP-1
y para inducción de apoptosis por tinción nuclear con DAPI.
Células co-transfectadas con un
plásmido que codifica AAP-1 y un plásmido que
codifica Apoptina expresaron estas proteínas predominantemente en el
citoplasma. Tanto Apoptina como AAP-1 tenían una
estructura enroscada y en algunos casos granular. Por medio de
microscopio de exploración confocal-láser, se
demostró claramente que tenía lugar co-localización
de AAP-1 y Apoptina en estas estructuras
citoplásmicas. Se observaron estructuras citoplásmicas similares en
AAP-1 cuando se expresaron solas o viceversa cuando
la Apoptina se expresó sola.
Por lo tanto, en presencia o ausencia de
Apoptina, la AAP-1 tiene una localización
citoplásmica y estructuras agregadas enroscadas en fibroblastos
humanos no transformados.
Como conclusión, los inventores han identificado
una proteína que asocia apoptina, es decir AAP-1,
que está localizada de forma diferencial en células humanas
diploides no transformadas con respecto a células tumorigénicas
humanas. Estos resultados muestran que AAP-1
funciona de manera diferente en células diploides normales que en
células tumorigénicas. Además, cuando se expresan
AAP-1 y apoptina en la misma célula normal no
transformada, las dos proteínas inductoras de apoptosis se
co-localizan en el citoplasma.
En los experimentos siguientes, los inventores
han examinado si la expresión de una proteína quimérica consistiendo
en apoptina y la señal de localización nuclear de antígeno SV40 LT
(aminoácidos
N-terminal-Prolina-Prolina-Lisina-Lisina-Lisina-Arginina-Lisina-Valina-C-Terminal
de antígeno T grande SV40 enlazado de forma covalente al término N
de Apoptina) tiene como resultado la inducción de apoptosis en
células humanas transformadas y no transformadas. La proteína
quimérica se llama NLS-apoptina.
Con este objetivo, fibroblastos humanos VH10 no
transformados y células Saos-2 derivadas de
osteosarcoma humano transformado (Danen-van
Oorschot y otros, 1997) fueron transfectadas con un plásmido que
codifica la proteína quimérica NLS-apoptina. En
células humanas transformadas, la expresión de
NLS-apoptina resultó en la localización nuclear de
apoptina e inducción de apoptosis. No obstante, la expresión de
NLS-apoptina en fibroblastos humanos normales
resultó en la localización nuclear de apoptina, pero no en inducción
de apoptosis. Esto indica que el "forzamiento" del transporte
de apoptina al núcleo no resulta en actividad apoptótica por sí
mismo. La apoptina parece requerir un evento adicional relacionado
con tumor.
El efecto de expresión de
NLS-apoptina sobre AAP-1 en
fibroblastos humanos normales.
A continuación, los inventores examinaron si la
expresión de NLS-apoptina puede influir en la
localización celular de AAP-1 y/o su actividad
apoptótica en fibroblastos humanos normales. Con este objetivo se
co-transfectaron células VH10 con plásmidos
codificando NLS-apoptina o AAP-1.
Por medio de inmunofluorescencia indirecta y tinción DAPI
utilizando microscopio de fluorescencia se demostró claramente que
tanto la NLS-apoptina como AAP-1 se
localizaban en el núcleo sin inducir apoptosis. Esto indica que el
"forzamiento" del transporte de AAP-1 con
intermedio de NLS-apoptina en el núcleo no tiene
como resultado la actividad apoptótica de AAP-1 por
sí mismo. La apoptina similar a AAP-1 parece
requerir un evento adicional relacionado con tumor para pasar a ser
apoptótica en el núcleo de células transformadas.
AAP-1 no induce apoptosis en
células diploides humanas no transformadas.
En los siguientes experimentos, los inventores
han examinado si AAP-1 solo o en combinación con
apoptina es también capaz de inducir apoptosis en fibroblastos
diploides humanos no transformados tal como se ha observado para
células humanas tumorigénicas/transformadas.
Con este objetivo se transfectaron células VH10
con plásmido
pMT2SM-AAP-1-b, tal
como se ha descrito en lo anterior. Las células transfectadas
fueron analizadas por inmunofluorescencia indirecta utilizando
anticuerpos específicos de etiqueta myc y/o apoptina y tinción
DAPI. DAPI marca el DNA intacto de manera diferente que el DNA
apoptótico (Telford y otros, 1992). El análisis muestra claramente
que los fibroblastos VH10 que contienen proteína
AAP-1 sola o AAP-1 y apoptina no
experimentan apoptosis.
Los resultados obtenidos muestran que las
proteínas relacionadas con apoptina, tales como
AAP-1, pueden comportarse de diferentes maneras en
células "sanas" en comparación con células tumorales.
Basándose en el presente informe, los inventores
pueden llegar a la conclusión de que la localización celular de
AAP-1 es distinta en células humanas
tumorigénicas/transformadas en comparación con células humanas
normales no transformadas. Además, la acumulación de
AAP-1 en el núcleo se correlaciona con inducción de
apoptosis, mientras que la localización citoplásmica se
correlaciona con viabilidad de células y capacidad de proliferación
normal. Por lo tanto, los inventores han sido capaces de desarrollar
un ensayo de diagnóstico para la identificación de células de cáncer
(humano) con respecto a células normales "sanas" no
transformadas.
El ensayo consiste en transfectar células
(humanas) "sospechosas", por ejemplo de origen humano, con un
plásmido que codifica AAP-1 o infectando las
células con vectores virales que expresan AAP-1. A
continuación, las células serán examinadas 1) en cuanto a capacidad
de experimentar apoptosis por la (sobre)expresión del gen
AAP-1 y 2) por un desplazamiento en la localización
de AAP-1 desde el citoplasma al núcleo.
La localización intracelular de
AAP-1 puede ser determinada utilizando el ensayo de
inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales específicos para
AAP-1 y/o específicos para una etiqueta enlazada a
AAP-1, tal como la etiqueta myc que se ha descrito.
Si el porcentaje de apoptosis y/o la localización nuclear de
AAP-1 en las células analizadas expresando
AAP-1 es significativamente mayor que en células
"sanas" de control positivas en AAP-1, se
puede llegar a la conclusión de que las células analizadas han
pasado a ser tumorigénicas/transformadas. Como control positivo se
utilizarán células tumorigénicas humanas conocidas para expresión de
AAP-1.
La co-expresión de antígeno T
grande SV40 y AAP-1 tiene como resultado la
translocación de AAP-1 y la inducción de
apoptosis.
Los inventores han examinado el efecto de
expresión de genes transformantes sobre apoptosis inducida por
AAP-1 en células humanas normales derivadas de
individuos sanos. Con este objetivo se
co-transfectaron transitoriamente fibroblastos
diploides VH10 humanos con plásmido
pMT2SM-AAP-1b codificando la
proteína AAP-1 completa y plásmido
pR-s884 codificando antígeno T grande SV40 o el
plásmido de control negativo pCMV-neo (Noteborn y
Zhang, 1998).
Por inmunofluorescencia indirecta las células
fueron analizadas en cuanto a apoptosis inducida por
AAP-1. Las células VH10 normales no experimentan
apoptosis cuando se transfectó AAP-1 con el plásmido
de control negativo. Los resultados han mostrado, tal como se
esperaba, que la expresión de AAP-1 no es capaz de
inducir apoptosis en células diploides humanas normales,
confirmando los datos anteriormente mencionados. No obstante,
fibroblastos humanos diploides normales expresando tanto
AAP-1 como antígeno T grande SV40 experimentaron
apoptosis inducida por AAP-1.
La transición de células humanas normales de
AAP-1-resistencia a
AAP-1-susceptibilidad puede ser
explicada probablemente por el hecho de que la proteína
AAP-1 transloca de una localización citoplásmica a
una localización nuclear. Esta transición resulta aparente 2 días
después de la transfección de plásmidos que codifican la proteína
transformante antígeno T grande SV40. Se puede llegar a la
conclusión de que tiene lugar un evento, en este ejemplo debido a
la expresión de un producto transformante derivado de un virus de
tumor DNA que resulta en la translocación de AAP-1
sobre-expresada desde el citoplasma al núcleo, lo
que es seguido de inducción de apoptosis.
Basados en el presente trabajo, los inventores
han sido capaces de desarrollar un ensayo diagnóstico para la
identificación de agentes o genes inductores de cáncer y/o
transformantes.
Un primer tipo de ensayo consiste en transfectar
células "normales", por ejemplo de origen humano, con un
plásmido que codifica AAP-1 o infectando las células
con vectores virales expresando AAP-1 junto con un
plásmido que codifica un gen putativo tranformante/inductor de
cáncer. A continuación, las células serán examinadas 1) en cuanto a
capacidad de experimentar apoptosis por el gen AAP-1
sobre-expresante y 2) por un desplazamiento en la
localización de AAP-1 del citoplasma al núcleo.
La localización intracelular de
AAP-1 puede ser determinada utilizando un ensayo de
inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales específicos para
AAP-1 y/o específicos para una etiqueta enlazada a
AAP-1, tal como la etiqueta myc que se ha descrito.
Si el porcentaje de apoptosis y/o de localización nuclear de
AAP-1 en células normales que
co-expresan AAP-1 y el gen
transformante putativo/inductor de cáncer es significativamente
mayor que en células de control positivo AAP-1
expresando un plásmido de control, se puede llegar a la conclusión
de que el gen analizado tiene ciertamente actividad
transformante/inductora de cáncer.
Un segundo ejemplo de una prueba de diagnóstico
se basa en el tratamiento de células diploides normales cultivadas
con un agente carcinogénico putativo. El agente puede ser añadido,
por ejemplo, al medio de cultivo durante varios períodos de tiempo.
A continuación, las células son transfectadas con un plásmido que
codifica AAP-1. Este enfoque puede ser llevado a
cabo también transfectando/infectando en primer lugar las células
diploides normales y tratando luego las células con el agente a
comprobar.
Las etapas subsiguientes del ensayo son iguales
que las descritas en esta sección, describiendo el primer tipo de
ensayo diagnóstico. Si el porcentaje de apoptosis y/o la
localización nuclear de AAP-1 en células normales
expresando AAP-1 y el agente carcinogénico putativo
es significativamente mayor que las células de control positivo
AAP-1 expresando un agente de control, se puede
llegar a la conclusión de que el agente analizado tiene ciertamente
actividad transformante/inductora de cáncer.
Un tercer ejemplo de una prueba de diagnóstico
se basa en el tratamiento de células diploides normales cultivadas
derivadas de una biopsia de piel de un individuo potencialmente con
tendencia de cáncer a comprobar y cultivado en un medio adecuado. A
continuación, las células son irradiadas con UV y a continuación
transfectadas con un plásmido que codifica AAP-1, o
infectadas con un vector viral que expresa AAP-1, o
las células son en primer lugar transfectadas/infectadas y luego
irradiadas. En paralelo, se utilizaron como control células
diploides de un individuo sano normal.
Las etapas subsiguientes del ensayo son iguales
que las descritas en esta sección que describe el primer tipo de
ensayo diagnóstico. Si después del tratamiento UV el porcentaje de
apoptosis y/o la localización nuclear de AAP-1 en
los diploides derivados del individuo con potencial tendencia a
cáncer es significativamente más elevada que las células de control
positivas en AAP-1, tratadas por UV, se puede llegar
a la conclusión de que el individuo analizado tiene tendencia a
cáncer.
El homólogo de ratón de AAP-1,
RYBP (García y otros, 1999) puede interaccionar con YY1. YY1 puede
activar o reducir la transcripción de proteínas celulares y
virales.
Las interacciones
proteína-proteína pueden influir en la actividad de
YY1.AAP-1 puede interaccionar con YY1. La
interacción entre AAP-1 y YY1 puede influir en la
actividad de YY1, resultando en represión o activación
transcripcional. La transcripción de genes podría ser importante
para la actividad apoptótica de la apoptina y/o
AAP-1.
Para establecer si AAP-1 forma
un complejo con YY1 in vitro, se
co-transfectaron en células Cos plásmidos que
codifican AAP-1 y YY1
(pCMV-HAVY-1; amable regalo del Dr.
Yang Shi, Harvard Medical School, Boston, USA). Como control
negativo se co-expresó YY-1 con
LacZ. Las células fueron sometidas a lisis y se llevó a cabo un
ensayo de inmunoprecipitación con utilización de anticuerpos
específicos contra la etiqueta myc de AAP-1 (o
LacZ), anti-myc 9E10 y contra YY1,
anti-YY1. Los complejos resultantes fueron
analizados por técnicas de transferencia Western. En los lisados de
células se detectaron, tal como se esperaba, AAP-1
y/o YY1 y/o LacZ.
En células transfectadas con
AAP-1 y YY1 era claramente visible que cuando los
inventores llevaron a cabo una inmunoprecipitación con anticuerpos
específicos para AAP-1 con etiqueta myc se podían
detectar ambos AAP-1 y YY1. La transferencia
demostró una banda a 32 kD (AAP-1) y una banda en 67
kD (YY1). Adicionalmente, los inventores llevaron a cabo una
inmunoprecipitación utilizando anticuerpos específicos para YY1.
Nuevamente, fueron detectables ambos YY1 y AAP-1 en
la transferencia Western.
En células transfectadas con un plásmido
expresando solamente AAP-1, solamente se pudo
detectar AAP-1. Las células transfectadas con un
plásmido que codifica YY1 mostraron expresión de YY1, no
detectándose AAP-1. Para excluir una unión
específica de AAP-1 con YY1 se transfectaron células
con AAP-1 y LacZ y se llevaron a cabo
inmunoprecipitaciones con anticuerpos específicos para LacZ. Si bien
la proteína LacZ era claramente visible en la transferencia Western,
no era visible la proteína AAP-1.
Por lo tanto, los resultados obtenidos muestran
que AAP-1 se une específicamente al factor YY1
relacionado con la transcripción.
Para examinar la posibilidad de producción de la
proteína de fusión MBP-AAP1 y AAP1-(His)6 se
clonó el ácido nucleico de AAP1 que codifica para el marco de
lectura abierta en los cassettes de (sobre)expresión de
proteína pMALTB y pET22b. La inducción de células E. coli de
acuerdo con las instrucciones del fabricante (Novagen) conduce a la
producción de la proteína de fusión soluble.
El aislamiento de la proteína de fusión
MBP-AAP1 por cromatografía de afinidad (resina de
amilosa, New England Biolabs) y cromatografía de intercambio iónico
(High-S, Biorad) conducen a una proteína de longitud
completa con una pureza de 90 a 95%. La aplicación de cromatografía
de exclusión de tamaño (Pharmacia Superose 6 HR 10/30) de esta
proteína muestra que una parte sustancial del preparado
MBP-AAP1 parece comportarse como una especie
separada, un homotrímero o tetrámero. Este descubrimiento podría
sugerir que la APP1 recombinante (en forma de la proteína de fusión
MBP) es capaz de asumir un plegado correcto y es probable que sea
biológicamente activa.
El aislamiento de la proteína AAP1-(His)6
por cromatografía de afinidad con metal
(Ni^{2+}-NTA, QIAGEN) conduce a un lote de
proteína con una pureza de \pm 80%.
Como conclusión, la fusión de AAP1 con MBP tiene
como resultado una proteína AAP1 soluble apropiadamente plegada que
es probable que sea biológicamente activa.
Para la producción de anticuerpos policlonales
contra proteínas AAP-1 se sintetizó un péptido
inmunogénico putativo (péptido AAP1 que consiste en los aminoácidos
N/término-CTKTSETNHTSRPRLK-C/término;
EuroGentec SA, Bélgica). A continuación, se inyectaron conejos con
los péptidos específicos de acuerdo con procedimientos estándar del
fabricante.
El derivado de suero de los conejos inyectados
con péptido AAP-1 se demostró que era específico
para los productos AAP-1 anteriormente descritos
por medio de ensayos ELISA y transferencia Western. Estos resultados
implican que se han generado anticuerpos específicos que pueden ser
utilizados para detectar la proteína de asociación a apoptina
AAP-1.
Como conclusión, los inventores han
proporcionado pruebas de que la interferencia de factores
específicos con la función de proteínas AAP-1 tiene
como resultado la inducción de apoptosis. Son posibles terapias
basadas en la inducción de apoptosis (independiente de p53)
utilizando la interferencia con la función de proteínas
AAP-1. Un ejemplo de dicho factor de interferencia
es la apoptina. Otra proteína derivada de CAV que se sabe que
induce apoptosis y que es también conocida por el incremento de la
actividad de la apoptina es VP2 (Noteborn y otros, 1997).
La figura 1 muestra la secuencia parcial del
vector
pMT2SM-AAP-1-a. La
secuencia de DNA del cDNA de AAP-1-a
se indica en negritas.
La figura 2 muestra la secuencia parcial del
vector
pMT2SM-AAP-1-b. La
secuencia de DNA del cDNA de AAP-1-b
se indica en negritas.
La figura 3 muestra la secuencia de aminoácido
de la zona analizada del clon de asociación de apoptina
AAP-1-b (negritas). Además, los
tres aminoácidos H-E-G del terminal
C del lugar de clonado múltiple de pACT se han indicado para
ilustrar que la secuencia de aminoácido AAP-1 se
encuentra en línea con el dominio de activación de GAL4. Esta
característica demuestra que la región AAP-1 está
realmente sintetizada en células de levadura. Se debe observar que
en la figura 3 la posición de aminoácido 23 corresponde al primer
aminoácido de una proteína similar a AAP-1. Los
dominios funcionales o fragmentos pueden ser identificados en este
caso como dominio de unión de factor de transcripción que va desde
la posición de aminoácido 1 (= 23 en figura 3) hasta 54
aproximadamente; un motivo prolongación de zinc, interacción
proteína-proteína y/o interacción proteína-ácido
nucleico en dominio que va aproximadamente desde las posiciones de
aminoácido 25 (= 47 en figura 3) hasta 42 aproximadamente; una zona
asociada a apoptosis que va desde las posiciones de aminoácidos
aproximadas 32 a 226; una señal de localización nuclear que va
desde la posición de aminoácido aproximada 74 a 81; y una señal de
localización nuclear que va desde aproximadamente la posición de
aminoácido 102 a 108 o a posiciones equivalentes en otra proteína
similar a AAP-1.
La figura 4 muestra la activida apoptótica de la
proteína AAP-1-b en células
Saos-2 cuando se expresa sola (cuadrado lleno) o en
combinación con apoptina (cuadrado en blanco). El porcentaje de
apoptosis inducido por apoptina se indica también (triángulo
lleno).
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apoptina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P50664EP10
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<140> 00203042.7
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-09-01
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador
pACT-especifico 17-mer"
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskiptaccactaca atggatg
\hfill17
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<210> 2
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<211> 40
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador directo
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<221> característica misc
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipaacgggatcc ggcggcatgg gcgacaagaa gagcccgacc
\hfill40
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<210> 3
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
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<292> (1)..(40)
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipaaaagtcgac tcagaaagat tcatcattga ctgctgacat
\hfill40
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<210> 4
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<211> 35
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador directo
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<220>
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<221> característica_misc
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\hskip-.1em\dddseqskipgggaattcca tatgggcgac aagaagagcc cgacc
\hfill35
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<211> 47
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador inverso
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<220>
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<221> característica_misc
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\hskip-.1em\dddseqskipaaggaagtac gcggccgcga aagattcatc attgactgct gacatgt
\hfill47
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Myc-tag
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<220>
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<221> BINDING
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
/nota="Myc-tag"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CHAIN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Inmunógeno"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Thr Lys Thr Ser Glu Thr Asn His Thr Ser
Arg Pro Arg Leu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 947
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(947)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
/nota="AAP-1-a ácido nucléico en
el que N puede ser A, C, G o T"
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1131)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
/nota="AAP-1-b ácido
nucleico"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 352
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CHAIN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(352)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota= "secuencia parcial de
Aminoácido de MP-1-b en la que X
significa residuo de aminoácido desconocido"
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Leadd B.V.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteína de asociación a
apoptina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P50664EP10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 00203042.7
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-09-01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 99202858.9
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-09-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 99203465.2
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-10-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211>17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota= "Cebador
pACT-especifico 17-mer"
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaccactaca atggatg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(40)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacgggatcc ggcggcatgg gcgacaagaa gagcccgacc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(40)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaagtcgac tcagaaagat tcatcattga ctgctgacat
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(35)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggaattcca tatgggcgac aagaagagcc cgacc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador inverso
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(47)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggaagtac gcggccgcga aagattcatc attgactgct gacatgt
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Myc-tag
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> UNIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota=
"Myc-tag"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CHAIN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota= "Inmunógeno"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Thr Lys Thr Ser Glu Thr Asn His Thr Ser
Arg Pro Arg Leu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 947
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(947)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota=
"AAP-1-a ácido nucléico en el que
N puede ser A, C, G o T"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1131)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota=
"AAP-1-b ácido nucléico"
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 352
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CHAIN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(352)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota= "secuencia parcial
Aminoácido de AAP-1-b en la que X
significa un residuo de aminoácido desconocido"
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
Claims (18)
1. Ácido nucleico que codifica apoptina y
AAP-1, en el que dicha AAP-1
comprende los aminoácidos 23 a 250 de la figura 3 o SEQ ID NO:10 o
un fragmento funcional del mismo que es capaz de inducir
apoptosis.
2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en
el que dicho ácido nucleico que codifica AAP-1
comprende en la figura 2 (SEQ ID NO:9) los ácidos nucleicos 142 a
829 o un fragmento funcional de los mismos que es capaz de inducir
apoptosis.
3. Compuesto de proteína que comprende apoptina
recombinante y AAP-1, en el que dicha
AAP-1 comprende los aminoácidos 23 a 250 de la
figura 3 o SEQ ID NO:10 o un fragmento funcional de los mismos que
es capaz de inducir apoptosis.
4. Vector que comprende un ácido nucleico según
la reivindicación 1 ó 2.
5. Vehículo para suministro de un gen que
comprende un ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2 o un
vector según la reivindicación 4.
6. Célula huésped transfectada con un ácido
nucleico que codifica AAP-1 en la que dicha
AAP-1 comprende los aminoácidos 23 a 250 de la
figura 3 o SEQ ID NO:10 o un fragmento funcional de los mismos, que
es capaz de inducir apoptosis y cuya célula huésped es transfectada
posteriormente con un ácido nucleico que codifica apoptina.
7. Método de producción de un compuesto de
proteína según la reivindicación 3 que comprende el facilitar una
célula huésped un ácido nucleico que codifica AAP-1
en el que dicha AAP-1 comprende los aminoácidos 23 a
250 de la figura 3 o SEQ ID NO:10 o un fragmento funcional de los
mismos que es capaz de inducir apoptosis y proporcionando además a
dicha célula huésped un ácido nucleico que codifica apoptina,
cultivando dicha célula huésped y recuperando dicho compuesto de
proteína.
8. Método para la inducción de apoptosis in
vitro en células en el que se observa proliferación celular
incrementada o muerte celular reducida, comprendiendo proporcionar a
dichas células una secuencia de ácido nucleico que codifica
AAP-1, en el que dicha AAP-1
comprende los aminoácidos 23 a 250 de la figura 3 o SEQ ID NO:10 o
un fragmento funcional de los mismos que es capaz de inducir
apoptosis.
9. Método para inducir apoptosis in vitro
en células en el que se observa proliferación celular incrementada o
muerte celular reducida comprendiendo proporcionar a dichas células
AAP-1 en el que dicha AAP-1
comprende los aminoácidos 23 a 250 de la figura 3 o SEQ ID NO:10 o
un fragmento funcional de los mismos que es capaz de inducir
apoptosis.
10. Método según la reivindicación 8 ó 9 que
comprende además el proporcionar a la proteína apoptina o un ácido
nucleico que codifica apoptina.
11. Método según la reivindicación 10 en el que
dichas células están dotadas de un ácido nucleico según la
reivindicación 1 ó 2 o un compuesto de proteína según la
reivindicación 3.
12. Método según la reivindicación 8 ó 10 en el
que dicho ácido nucleico que codifica a AAP-1
comprende en la figura 2 (SEQ ID NO:9) los ácidos nucleicos 142 a
829 o un fragmento funcional de los mismos que codifica dicha
AAP-1 y que es capaz de inducir apoptosis.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12 en el que dichas células son células de
cáncer o células involucradas en una enfermedad autoinmune.
14. Utilización de ácido nucleico según la
reivindicación 1 ó 2 o un compuesto de proteína según la
reivindicación 3 como agente farmacéutico.
15. Utilización de una secuencia de ácido
nucleico que codifica AAP-1 en la que dicha
AAP-1 comprende los aminoácidos 23 a 250 de la
figura 3 o SEQ ID NO:10 o un fragmento funcional de los mismos que
es capaz de inducir apoptosis, en la preparación de un medicamento
para el tratamiento de cáncer o enfermedades autoinmunes en el que
dicho tratamiento comprende además el proporcionar la proteína
apoptina o un ácido nucleico que codifica apoptina.
16. Utilización de AAP-1 en la
que dicha AAP-1 comprende los aminoácidos 23 a 250
de la figura 3 o SEQ ID NO:10 o un fragmento funcional de los
mismos que es capaz de inducir apoptosis en la preparación de un
medicamento para el tratamiento de cáncer o una enfermedad
autoinmune, en el que dicho tratamiento comprende además
proporcionar la proteína apoptina o un ácido nucleico que codifica
apoptina.
17. Utilización según la reivindicación 15 ó 16
que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2 o un
compuesto de proteína de acuerdo con la reivindicación 3 o un vector
de acuerdo con la reivindicación 4.
18. Utilización según la reivindicación 15 ó 16
en la que dicho ácido nucleico que codifica AAP-1
comprende en la figura 2 (SEQ ID NO: 9) los ácidos nucleicos 142 a
829 o un fragmento funcional de los mismos que es capaz de inducir
apoptosis.
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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