ES2277887T3 - Vacunas estratificadas y criogenicamente almacenadas, proceso para su preparacion. - Google Patents
Vacunas estratificadas y criogenicamente almacenadas, proceso para su preparacion. Download PDFInfo
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Abstract
Método para preparar una composición que consiste en una fase antigénica, una fase de adyuvante oleoso y, opcionalmente, una fase diluyente para la fase antigénica, en la que el medio antigénico constituye una fase que está separada de la fase adyuvante cuando la composición está en estado sólido, estando dicha composición en estado líquido cuando su temperatura es mayor que o igual a 4ºC, caracterizado porque: a) la primera fase de entre las fases del adyuvante oleoso, del diluyente o antigénica que sea líquida a temperatura ambiente se lleva hasta una temperatura menor que o igual a su punto de solidificación, de modo que se forme una primera fase sólida; b) se añade sobre la fase sólida preparada en a) la segunda fase de entre las fases del adyuvante oleoso, del diluyente o antigénica, en estado líquido y, a continuación, la nueva combinación se lleva hasta una temperatura menor que o igual a la del punto de solidificación más bajo de cualquiera de las dos fases, de modo que se forme unacombinación sólida con dos fases separadas; c) cuando proceda, se añade sobre dicha combinación sólida preparada en la etapa b) la última fase de entre las fases del adyuvante oleoso, antigénica o del diluyente, en estado líquido y, a continuación, la nueva combinación se lleva hasta una temperatura menor que o igual a la del punto de solidificación más bajo de cualquiera de las tres fases de modo que se forme una combinación sólida con tres fases diferentes.
Description
Vacunas estratificadas y criogénicamente
almacenadas, proceso para su preparación.
La presente invención está relacionada con una
formulación de una nueva vacuna que comprende al menos un antígeno,
en particular un antígeno de origen viral, bacteriano o parasitario,
y un método para su preparación.
Actualmente, las vacunas convencionales tienen
un período de conservación que no excede de 18 a 24 meses a +4ºC,
tanto si son a base de aceites como acuosas. Unos experimentos
realizados por el Institute for Animal Health (IAH) en Gran Bretaña
han mostrado que las vacunas a base de aceite congeladas a -20ºC y a
-70ºC pierden su actividad. De acuerdo con ello, las etiquetas de
las vacunas que se comercializan en este país indican: "No
congelar".
Los antígenos se pueden conservar durante
períodos más largos, hasta 15 años, a temperatura muy baja, en forma
de concentrados. En este caso, es esencial disponer de los medios
para formular las vacunas cerca de su lugar de conservación para
evitar pérdidas de tiempo cuando la vacuna se necesita con
urgencia.
La solicitud internacional WO 96/32964 divulga
emulsiones que contienen una fase antigénica y una fase de
adyuvante oleoso que son estables durante al menos un año a 4ºC.
La solicitud internacional WO 00/03744 divulga
una composición de vacuna acuosa congelada que contiene una
suspensión coloidal acuosa de monofosforil lípido A como adyuvante y
un glucoconjugado neumocócico como antígeno.
Estas consideraciones han llevado al solicitante
a apoyar el trabajo dirigido al desarrollo de vacunas que se puedan
conservar durante varios años y que estén listas para ser utilizadas
al ser descongeladas.
De acuerdo con un primer aspecto, el objeto de
la invención es un método para preparar una composición que consta
de una fase antigénica, una fase de adyuvante oleoso y,
opcionalmente, una fase diluyente para la fase antigénica, en la
que el medio antigénico constituye una fase que está separada de la
fase adyuvante cuando la composición se encuentra en estado sólido,
encontrándose dicha composición en estado líquido cuando su
temperatura es mayor que o igual a 4ºC, caracterizado porque:
a) La primera fase de entre las fases del
adyuvante oleoso, del diluyente o antigénica que sea líquida a
temperatura ambiente se lleva hasta una temperatura menor que o
igual a la de su punto de solidificación, de modo que se forme una
primera fase sólida;
b) se añade sobre la fase sólida preparada en a)
la segunda fase de entre las fases del adyuvante oleoso, del
diluyente o antigénica en estado líquido y, a continuación, la nueva
combinación se lleva hasta una temperatura menor que o igual a la
del punto de solidificación más bajo de cualquiera de las dos fases,
de modo que se forme una combinación sólida con dos fases
separadas;
c) cuando proceda, se añade sobre dicha
combinación sólida preparada en la etapa b) la última fase de entre
las fases del adyuvante oleoso, antigénica o del diluyente en estado
líquido y, a continuación, la nueva combinación se lleva hasta una
temperatura menor que o igual a la del punto de solidificación más
bajo de cualquiera de las tres fases, de modo que se forme una
combinación sólida con tres fases separadas.
La expresión fases separadas indica que, en la
composición que es objeto de la presente invención, en el estado
sólido ninguna de las fases está incluida, disuelta, emulsionada o
dispersa en otra.
De acuerdo con un primer aspecto particular de
la presente invención, las diversas fases que constituyen la
composición en estado sólido son adyacentes, como máximo, a dos
fases diferentes; más en particular, en dicha composición están
dispuestas de forma estratificada y se encuentran preferiblemente
superpuestas unas sobre las otras.
En el contexto de la presente invención, se
entiende que la expresión medio antigénico se refiere a un
concentrado de material antigénico o una mezcla de concentrados de
materiales antigénicos, tanto si dichos concentrados están diluidos
como no diluidos en un vehículo líquido apropiado. De aquí en
adelante, en la presente solicitud el medio antigénico se
denominará "fase antigénica".
La expresión material antigénico designa a un
antígeno, una mezcla de antígenos, un generador in vivo de un
compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos, una mezcla de
generadores in vivo de un compuesto que comprende una
secuencia de aminoácidos o, alternativamente, una mezcla de uno o
más antígenos con uno o más generadores in vivo de un
compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos.
La expresión antígeno o al menos un generador
in vivo de un compuesto que comprende una secuencia de
aminoácidos designa o bien microorganismos muertos como, por
ejemplo, virus, bacterias o parásitos, o bien fragmentos
purificados de esos organismos, o bien microorganismos vivos cuyo
potencial patogénico ha sido atenuado.
Como virus que pueden constituir un antígeno de
acuerdo con la presente invención se pueden mencionar el virus de
la rabia, herpesvirus como, por ejemplo, el virus de la enfermedad
de Aujeszky, ortomixovirus como, por ejemplo, el virus de la gripe,
picornavirus como, por ejemplo, el virus de la fiebre aftosa, o
retrovirus como, por ejemplo, el VIH.
Como microorganismos de tipo bacteriano que
pueden constituir un antígeno de acuerdo con la presente invención
se pueden mencionar E. coli, así como los de los géneros
pasteurella, furunculosis, vibrio, estafilococo y estreptococo.
Como parásitos, se pueden mencionar los de los
géneros tripanosoma, plasmodio y leishmania.
También se pueden mencionar los virus
recombinantes, en particular los virus sin envoltura como, por
ejemplo, los adenovirus, los virus vaccinia, los virus canaripox,
los herpesvirus o los baculovirus.
También se puede mencionar un vector viral vivo
recombinante sin envoltura cuyo genoma contiene, preferiblemente
insertado en una porción que no es esencial para la replicación del
virus con envoltura correspondiente, una secuencia que codifica una
subunidad antigénica que induce la síntesis de anticuerpos y/o un
efecto protector contra el virus con envoltura o microorganismo
patógeno mencionado más arriba; dicha subunidad antigénica es, por
ejemplo, una proteína una glicoproteína, un péptido o una fracción
de un péptido y/o una fracción que es efectiva contra la infección
por un microorganismo vivo como, por ejemplo, un virus con
envoltura, una bacteria o un parásito. El gen exógeno insertado en
el microorganismo se obtiene, por ejemplo, a partir de un virus de
Aujeszky o un virus
VIH.
VIH.
En particular, se puede mencionar un plásmido
recombinante que consiste en una secuencia de nucleótidos en la que
se inserta una secuencia de nucleótidos exógenos obtenida a partir
de un microorganismo o un virus patógeno. La función de la última
secuencia de nucleótidos es permitir la expresión de un compuesto
que comprende una secuencia de aminoácidos, cuyo papel es estimular
una reacción inmunitaria en un organismo receptor.
La expresión generador "in vivo" de
un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos designa a
cualquier producto biológico capaz de expresar dicho compuesto en
el organismo receptor, en el que se ha introducido dicho generador
in vivo. El compuesto que comprende la secuencia de
aminoácidos puede ser una proteína, un péptido o una glicoproteína.
Estos generadores in vivo se obtienen generalmente mediante
métodos derivados de la ingeniería genética. Más concretamente,
pueden consistir en microorganismos vivos, generalmente un virus,
que actúa como vector recombinante, en el que se inserta una
secuencia de nucleótidos, en particular un gen exógeno. Estos
compuestos son conocidos per se y se utilizan, en particular,
como vacuna de subunidad recombinante. A este respecto, se puede
hacer referencia al artículo de M. ELOIT y otros, Journal of
Virology (1990) 71, 2925-2431 y a las solicitudes
internacionales de patente publicadas bajo los números
WO-A-91/00107 y
WO-A-94/16681.
Los generadores in vivo de acuerdo con la
invención también pueden consistir en un plásmido recombinante que
comprende una secuencia de nucleótidos exógenos capaz de expresar,
en un organismo receptor, un compuesto que comprende una secuencia
de aminoácidos. Dichos plásmidos recombinantes y su forma de
administración en un organismo receptor fueron descritos en 1990
por LIN y otros, Circulation 82: 2217, 2221; COX y otros, J. of
Virol., Sept. 1993, 67, 9, 5664-5667 y en la
solicitud de patente internacional publicada bajo el número WO
95/25542. En función de la naturaleza de la secuencia de nucleótidos
contenida en el generador in vivo, el compuesto que
comprende la secuencia de aminoácidos que se expresa en el organismo
receptor puede:
(i) Ser un antígeno y puede permitir que se
estimule una reacción inmunitaria.
(ii) Tener una acción curativa en relación con
una enfermedad, esencialmente una enfermedad de naturaleza
funcional, que se activa en el organismo receptor. En este caso, el
generador in vivo permite un tratamiento del receptor de
tipo terapia génica. Dicha acción curativa consiste, por ejemplo, en
una síntesis por parte del generador in vivo de citocinas
como, por ejemplo, interleucina, en particular,
interleucina-2. Estas permiten suscitar o potenciar
una reacción inmunitaria dirigida a la eliminación selectiva de
células cancerosas.
Una composición de acuerdo con la invención
comprende una concentración de antígeno que depende de la naturaleza
de este antígeno y de la naturaleza del sujeto tratado. La
concentración de antígeno adecuada se puede determinar de forma
convencional por personas experimentadas en la técnica.
Generalmente, esta dosis es del orden de 0,1 \mug/cm^{3} a 1
g/cm^{3}, más generalmente de entre 1 \mug/cm^{3} y 100
mg/cm^{3} de la composición en estado líquido.
En este caso la concentración de dicho generador
in vivo en la composición de acuerdo con la invención
depende, de nuevo, en particular, de la naturaleza de dicho
generador y del receptor en el que se administra. Esta
concentración puede ser determinada fácilmente por personas
conocedoras de la técnica a partir de un experimento rutinario. No
obstante, a modo de guía se puede puntualizar que cuando el
generador in vivo es un microorganismo recombinante, su
concentración en la composición de acuerdo con la invención puede
estar entre 10^{2} y 10^{15} microorganismos/cm^{3},
preferiblemente entre 10^{5} y 10^{12} microorganismos/cm^{3}
de la composición en estado líquido.
Cuando el generador in vivo es un
plásmido recombinante, su concentración en la composición de acuerdo
con la invención está generalmente entre 0,01 g/dm^{3} y 100
g/dm^{3} de la composición en estado líquido.
La forma de los concentrados de antígenos
depende esencialmente del modo en que se extraen los antígenos del
organismo o de la molécula que los contiene, así como de su
naturaleza. Los concentrados de antígenos no son, per se,
objeto de la presente invención. Se pueden incluir en forma líquida
como, por ejemplo, los sobrenadantes de materiales antigénicos o
los concentrados de sobrenadantes de materiales antigénicos o,
alternativamente, en forma sólida como, por ejemplo,
liofilizados.
La composición que constituye el objeto de la
presente invención puede comprender uno o más antígenos y una o más
fases antigénicas.
De acuerdo con un primer aspecto particular de
la presente invención, su objeto es una composición como la
definida más arriba caracterizada porque el medio antigénico
consiste en un liofilizado de material antigénico.
De acuerdo con un segundo aspecto particular de
la presente invención, su objeto es una composición como la
definida más arriba caracterizada porque el medio antigénico es en
una fase acuosa o acuoso-alcohólica de material
antigénico.
Los disolventes que constituyen la fase
antigénica son, por ejemplo, agua, tampón PBS, tampón TRIS o una
mezcla de los mismos.
En el contexto de la presente invención, el
término adyuvante designa productos que potencian las reacciones
del sistema inmunitario cuando se administran en presencia de
material antigénico, independientemente de si es de origen viral,
bacteriano, parasitario o sintético. Dan lugar a la aparición masiva
de macrófagos en el lugar de la inyección y, a continuación, en los
ganglios linfáticos, así como un incremento en la producción de
inmunoglobulinas específicas, anticuerpos, estimulando de este modo
a numerosas células involucradas en los mecanismos de defensa
inmunitaria.
La naturaleza de estos adyuvantes es diversa.
Pueden ser sales inorgánicas solubles o insolubles en agua,
soluciones acuosas o acuoso-alcohólicas de sales,
compuestos orgánicos aceites o mezclas de estos diversos tipos de
adyuvantes. La fase que contiene uno o más adyuvantes se denominará
de aquí en adelante en la presente solicitud la fase adyuvante.
Como adyuvantes convencionales en forma de sal
se encuentran también sales de metales como, por ejemplo, hidróxido
de aluminio, nitrato de cerio, sulfato de cinc, hidróxido de hierro
coloidal o cloruro de calcio. Entre estos, el más comúnmente
utilizado es el hidróxido de aluminio. Estos adyuvantes se describen
en el artículo de Rajesh K. Gupta y otros, "Adjuvants, balance
between toxicity and adjuvanticity", Vaccine, vol. 11, nº 3,
1993, páginas 993-306.
Como ejemplos de sales solubles en agua, se
encuentran sales de cationes metálicos y de ácidos orgánicos que
poseen al menos un grupo fosfórico o un grupo carboxílico, como, por
ejemplo, las sales de los ácidos glicerofosfórico, acético,
láctico, tartárico, málico, cítrico, pirúvico, glucónico,
glucurónico, fructoheptónico, gluconoheptónico o glucoheptónico,
glutámico y aspártico, o metionina. Estas sales de cationes
metálicos se escogen más particularmente entre las sales de
manganeso, aluminio, calcio o cinc, como, por ejemplo, gluconato de
manganeso, gluconato de calcio, gluconato de cinc, fructoheptonato
de calcio, glicerofosfato de calcio, acetato de aluminio soluble y
salicilato de aluminio. Algunos de estos adyuvantes se describen en
las solicitudes de patente internacionales publicadas bajo los
números WO 96/32964 y WO 98/17311.
Cuando en la composición que es objeto de la
presente invención están presentes sales solubles en agua, su
concentración total está entre 0,02 mg/cm^{3} y 3000 mg/cm^{3},
preferiblemente 0,1 mg/cm^{3} y 1000 mg/cm^{3} y, más
particularmente, desde 0,1 mg/cm^{3} hasta 150 mg/cm^{3} de
dicha composición en estado líquido.
Como otros adyuvantes, también se encuentran
tensioactivos o mezclas de tensioactivos que tienen un número HLB
global entre 5 y 15. Para los fines de la presente invención, el
número HLB se calcula mediante la fórmula
HLB=20(1-l_{s}/l_{a}), en la que l_{s}
representa el índice de saponificación y l_{a} el índice de
acidez para dicho tensioactivo o para dicha mezcla de tensioactivos.
Estos dos valores, el índice de saponificación y el índice de
acidez se determinan mediante métodos descritos en la Farmacopea
Europea.
Como ejemplos de dichos tensioactivos se
encuentran sustancias grasas modificadas que tienen un número HLB
global entre 6 y 14. Las sustancias grasas modificadas pueden ser de
origen inorgánico, vegetal o animal. Como sustancias grasas
modificadas de origen inorgánico se encuentran aceites modificados
de origen petroquímico. Como sustancias grasas modificadas de
origen vegetal se encuentran aceites vegetales modificados como, por
ejemplo, aceites modificados de cacahuete, oliva, sésamo, soja,
germen de trigo, pepita de uva, girasol, ricino, semilla de lino,
maíz, copra, palma, nuez, avellana o colza. Como sustancias grasas
modificadas de origen animal se encuentran, por ejemplo, el aceite
de espermaceti o el aceite de sebo modificados.
La expresión sustancias grasas modificadas
designa en general a los derivados alcoxilados de sustancias grasas
y, más particularmente, los derivados alcoxilados de aceites o los
derivados alcoxilados de alquilésteres de aceites, y más
particularmente los derivados etoxilados y/o propoxilados de aceites
o los derivados etoxilados y/o propoxilados de los ésteres lineales
o ramificados de metilo, etilo, propilo o butilo, de dichos aceites.
El objeto de esta invención es, más específicamente, una
composición como la definida más arriba en la que, cuando el
adyuvante es una sustancia grasa modificada o una mezcla de
sustancias grasas modificadas, las últimas se escogen entre los
derivados etoxilados de aceites que tienen un número de unidades de
OE entre 1 y 60, y más particularmente, entre los derivados
alcoxilados de aceite de maíz, mezclas de derivados alcoxilados de
aceite de maíz, que tienen un número HLB global entre 10 y 14, o
entre los derivados etoxilados de aceite de ricino o mezclas de
derivados alcoxilados de aceite de ricino que tienen un número HLB
global entre 7 y 10.
Cuando en la composición que es objeto de la
presente invención están presentes tensioactivos o mezclas de
tensioactivos que tienen un número HLB global entre 5 y 15, su
concentración total está entre 0,2 mg/cm^{3} y 500 mg/cm^{3},
más particularmente entre 2 mg/cm^{3} y 500 mg/cm^{3}, de
adyuvante, y preferiblemente entre 50 mg/cm^{3} y 200 mg/cm^{3}
de dicha composición en estado líquido.
Como otros adyuvantes, también se encuentran los
derivados alcoxilados de ésteres de ácidos grasos y de polioles, o
los derivados alcoxilados de éteres de alcoholes grasos y de
polioles, y más particularmente los triglicéridos de ácidos grasos
alcoxilados, los ésteres alcoxilados de poliglicerol y de ácidos
grasos, los ésteres alcoxilados de ácidos grasos con un hexol,
como, por ejemplo, sorbitol o manitol, o los ésteres alcoxilados de
ácidos grasos con un hexol anhídrido, como, por ejemplo, sorbitan o
manitan.
Como ácidos grasos más particularmente
apropiados para la preparación de estos ésteres modificados se
encuentran los que comprenden desde 12 hasta 22 átomos de carbono,
ventajosamente un ácido graso que es líquido a 20ºC, como, por
ejemplo, los que comprenden desde 16 hasta 18 átomos de carbono,
como, por ejemplo, ácido oleico, ácido ricinoleico o ácido
isoesteárico. Como ejemplos de estos derivados se encuentran los
derivados etoxilados del oleato de manitan que tienen un número de
unidades de OE entre 5 y 15, y preferiblemente entre 7 y 11.
Como otros ejemplos de adyuvantes se encuentran
las saponinas, las lecitinas o las composiciones que comprenden:
a) un compuesto de fórmula (I):
(I)R_{1}-O-(G)_{x}-H
en la que R_{1} representa un
radical hidrocarburo saturado o no saturado, lineal o ramificado,
que comprende desde 1 hasta 30 átomos de carbono, G representa el
residuo de un sacárido y x representa un número decimal entre 1 y
5, o una mezcla de compuestos de fórmula (I); y, si se
desea
b) un compuesto de fórmula (II):
(II)R_{2}-OH
en la que R_{2} representa,
independientemente de R_{1}, un radical hidrocarburo saturado o no
saturado, lineal o ramificado, que comprende desde 8 hasta 30
átomos de carbono, o una mezcla de compuestos de fórmula
(II).
La expresión residuo de un sacárido designa
mediante G a un radical bivalente resultante de la eliminación en
una molécula de azúcar, por un lado de un átomo de hidrógeno de uno
de sus grupos hidroxilo y, por otro lado, del grupo hidroxilo
anomérico. El término sacárido designa en particular glucosa o
dextrosa, fructosa, manosa, galactosa, altrosa, idosa, arabinosa,
xilosa, ribosa, gulosa, lixosa, maltosa, maltotriosa, lactosa,
celobiosa, dextrano, talosa, alosa, rafinosa, levoglucano, celulosa
o almidón. La estructura oligomérica (G)_{x} puede existir
en cualquier forma de isomería, tanto si esta incluye la isomería
óptica, isomería geométrica o isomería de posición; también puede
representar una combinación de isómeros.
El número x, que en la fórmula (I) representa el
grado de polimerización promedio del sacárido, se encuentra más
particularmente entre 1 y 3, en particular entre 1,05 y 2,5, más
particularmente entre 1,1 y 2,0, y preferiblemente menor que o
igual a 1,5.
G representa más particularmente el residuo de
glucosa o el residuo de xilosa.
El radical R_{1} representa en particular un
radical que comprende desde 5 hasta 22 átomos de carbono escogido
entre radicales pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo,
undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo,
hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, nonadecilo, eicosilo,
uneicosilo, docosilo, heptadecenilo, eicosenilo, uneicosenilo,
docosenilo, heptadecadienilo, o decenilo, siendo dichos radicales
lineales o ramificados. R_{1} representa preferiblemente un
radical que comprende desde 8 hasta 20 átomos de carbono, siendo
dichos radicales lineales o
ramificados.
ramificados.
R_{2} representa más particularmente un
radical que comprende desde 8 hasta 22 átomos de carbono escogido
entre radicales octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo,
tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo,
octadecilo, nonadecilo, eicosilo, uneicosilo, docosilo,
heptadecenilo, eicosenilo, uneicosenilo, docosenilo,
heptadecadienilo o decenilo, siendo dichos radicales lineales o
ramificados.
\newpage
Cuando la mezcla como la definida más arriba
comprende al menos un compuesto de fórmula (I) y al menos un
compuesto de fórmula (II), la proporción en peso del compuesto de
fórmula (I) respecto al compuesto de fórmula (II) está generalmente
entre 10/90 y 90/10, más particularmente entre 10/90 y 60/40.
Como otros adyuvantes se encuentran aceites y,
en particular, aceites conocidos por su baja toxicidad, tanto si
son aceites minerales, aceites sintéticos, aceites vegetales o
aceites animales.
Como ejemplos de aceites minerales se encuentran
los aceites minerales blancos conformes con las normas FDA 21 CFR
172.878 y CFR 178.3620 (a) como, por ejemplo, MARCOL® 52, que es un
aceite comercial que corresponde a la definición de las parafinas
líquidas del French CODEX, o DRAKEOL® 6VR.
Como ejemplos de aceites sintéticos se
encuentran poli-isoprenos,
poli-isobutenos, poli-isobuteno
hidrogenado, comercializado bajo el nombre PARLEAM – POLYSYNLANE® y
citado en: Michel e Irene Ash; Thesaurus of Chemical Products,
Chemical Publishing Co., Inc. 1986, Volumen 1, página 211 (ISBN 0
7131 3603 0), escualano, comercializado bajo el nombre
PHYTOSQUALAN® e identificado en Chemical Abstracts mediante el
número RN = 111-01-3; se trata de
una mezcla de hidrocarburos que contiene más del 80% en peso de
2,6,10,15,19,23-hexametiltetracosano; también se
encuentra escualeno, isohexadecano, identificado en Chemical
Abstracts mediante el número RN =
93685-80-4, que es una mezcla de
isoparafinas C_{12}, C_{16} y C_{20} que contiene al menos un
97% de isoparafinas C_{16}, entre las cuales el principal
constituyente es 2,2,4,4,6,8,8-heptametilnonano (RN
= 4390-04-9); isododecano.
Como otros ejemplos de aceites no minerales
sintéticos se encuentran los ésteres de alcoholes y ácidos grasos,
como, por ejemplo, oleato de etilo, miristato de isopropilo, oleato
de oleilo, mono, di o triglicéridos de ácidos grasos o los ésteres
de propilenglicol.
Como ejemplos de aceites de origen vegetal se
encuentran los aceites de cacahuete, oliva, sésamo, soja, germen de
trigo, pepita de uva, girasol, ricino, semilla de lino, maíz, copra,
palma, nuez, avellana o colza.
Como ejemplo de adyuvante oleoso, los adyuvantes
de Freund son muy efectivos; son el resultado de la combinación de
un aceite mineral y de un éster de manitol que contiene o no una
micobacteria inactivada.
Como ejemplos de aceites de origen animal se
encuentran escualano, escualeno o aceite de espermaceti.
Cuando la composición que es objeto de la
presente invención se encuentra en estado líquido, una emulsión, el
aceite se combina generalmente con uno o más tensioactivos no
iónicos que son, preferiblemente, farmacéuticamente aceptables. En
particular, deben estar libres de metales pesados y deben tener
índices de acidez o de peróxido muy bajos. También es deseable que
satisfagan las normas de los ensayos de seguridad como, por ejemplo,
las descritas por S.S. Berllin, Annals of Allergy, 1962, 20, 473, o
las normas para los ensayos de toxicidad anormal descritas en la
Farmacopea Europea.
Como ejemplos de tensioactivos que se pueden
combinar con un aceite en la misma fase adyuvante se encuentran los
descritos anteriormente como intrínsecamente poseedores de
propiedades adyuvantes. Más generalmente, se encuentran
tensioactivos no iónicos de las siguientes familias químicas:
- los ésteres o éteres de ácidos grasos y de un
azúcar como, por ejemplo, sorbitol, manitol, sucrosa o glucosa;
- los ésteres de ácidos grasos y glicerol o un
poliol;
- los derivados hidrófilos de esos ésteres
obtenidos injertando alcohol, óxido de éter, carboxilo, grupos
funcionales amina o amida;
- lecitinas;
- alcoholes o ácidos grasos etoxilados y/o
propoxilados;
- las cadenas grasas de estos tensioactivos que
comprenden desde 8 hasta 22 átomos de carbono.
Entre estos tensioactivos, los preferidos son
los que tienen una cadena grasa que comprende desde 14 hasta 20
átomos de carbono, y más particularmente, ácidos oleico, ricinoleico
y cetoesteárico y derivados de los mismos, y más particularmente
oleatos de manitol y los derivados de oleatos de manitol obtenidos
injertando grupos funcionales hidrófilos como, por ejemplo, grupos
funcionales amida, amina, alcohol, poliol o carboxilo, o radicales
etoxi, propoxi, y/o butoxi, u oleatos de manitan o derivados de los
mismos; se obtienen mediante deshidratación de la cadena de
carbonos del manitol polihidroxilada que se convierte en ciclada en
la posición 1-4 ó 2-6.
En general, cuando en una composición de vacuna
se encuentra presente un tensioactivo no iónico o una mezcla de
tensioactivos no iónicos combinados con un aceite para expresar sus
propiedades emulsionantes, su concentración está entre 0,01 mg/ml y
500 mg/ml, y, preferiblemente, entre 0,1 mg/ml y 200 mg/ml.
\newpage
Como ejemplos de combinaciones de aceites con
tensioactivos no iónicos se encuentran los productos comercializados
bajo el nombre de MONTANIDE®, cuyas características se presentan en
la siguiente tabla:
En este caso, en estado sólido, esta fase oleosa
constituye más particularmente la fase inferior de dicha
composición. Ciertamente, se ha observado que se obtenía más
fácilmente una emulsión en esta configuración mediante agitación
manual simple a temperatura ambiente.
La composición de acuerdo con la invención puede
comprender un agente inmunoestimulante convencional como, por
ejemplo, Avridine®,
N,N-dioctadecil-N',N'-bis(2-hidroxietil)propano-diamina,
derivados de MDP (muramil dipéptido), en particular
treonil-MDP, derivados del ácido micólico o
derivados del Lípido A.
De ahora en adelante en la presente solicitud,
la fase o las fases que contienen el/los adyuvante(s) se
denominará(n) fase(s) adyuvante(s). La composición
que es objeto de la presente invención puede comprender una o más
fases adyuvantes.
La composición tal como se ha definido más
arriba puede comprender, además, una o más fases diluyentes para al
menos una de las fases antigénicas, cuyo carácter diluyente se
expresa en el estado líquido, y que, cuando la composición se
encuentra en estado sólido, están separadas de la fase antigénica o
de las fases antigénicas y de la fase adyuvante o de las fases
adyuvantes.
La composición tal como se ha definido más
arriba puede comprender, además, una o más fases diluyentes para al
menos una de las fases adyuvantes, cuyo carácter diluyente se
expresa en el estado líquido, y que, cuando la composición se
encuentra en estado sólido, están separadas de la fase antigénica o
de las fases antigénicas y de la fase adyuvante o de las fases
adyuvantes.
De acuerdo con un tercer aspecto particular de
la presente invención, la composición tal como se ha definido más
arriba consta de una fase antigénica y una fase de adyuvante
oleoso.
De acuerdo con un cuarto aspecto particular de
la presente invención, la composición tal como se ha definido más
arriba consta de una fase antigénica, una fase de adyuvante oleoso y
una fase diluyente para la fase antigénica.
En las dos últimas configuraciones, en la
composición tal como se ha definido más arriba, en estado sólido,
la fase oleosa constituye preferiblemente la capa inferior y la fase
antigénica la fase superior.
Más específicamente, para preparar una
composición que consta de una fase antigénica, una fase de adyuvante
oleoso y, opcionalmente, una fase diluyente para la fase
antigénica, en el método definido más arriba, la fase utilizada en
la etapa a) es la fase de adyuvante oleoso, la fase utilizada en la
etapa b) es o bien la fase diluyente, cuando la composición
contiene una, o bien la fase antigénica, y la fase utilizada, cuando
proceda, en la etapa c) es la fase antigénica.
Todavía más específicamente, para preparar una
emulsión de vacuna de una fase antigénica y una fase oleosa que
está formada por una combinación de uno o más aceites con uno o más
tensioactivos no iónicos, el proceso comprende las siguientes
etapas:
(a) Se separan alícuotamente los volúmenes
requeridos de la fase oleosa en un recipiente primario deseado, se
introducen en la fase gaseosa a ultra baja temperatura de nitrógeno
líquido, y se congelan instantáneamente;
(b) se retira momentáneamente de las condiciones
de baja temperatura la fase congelada obtenida en la etapa (a) y se
deposita cuidadosamente el volumen requerido de tampón acuoso sobre
la fase congelada para formar dos capas o estratos separados; se
devuelve inmediatamente a las condiciones de ultra baja temperatura
para congelar instantáneamente el tampón acuoso;
(c) se retira momentáneamente de las condiciones
de baja temperatura la combinación estratificada obtenida en la
etapa (b) y se deposita cuidadosamente el volumen requerido de
antígeno concentrado sobre la capa de tampón congelado de dicha
combinación estratificada para formar una tercera capa o estrato
separado; se devuelve inmediatamente a las condiciones de ultra
baja temperatura para congelar instantáneamente el concentrado de
antígeno.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente
invención, su objeto es una composición como la que se ha definido
más arriba para aplicar un método de tratamiento del organismo
humano o animal mediante inyección subcutánea, mediante inyección
intramuscular o mediante inyección intravenosa.
Más específicamente, cuando se necesite, la
vacuna estratificada y criogénicamente conservada (SACS) se
descongela a temperatura ambiente, se mezcla mediante simple
agitación y se administra al receptor destinatario.
La composición de acuerdo con la invención se
puede utilizar como un medicamento preventivo o curativo. En
función de la naturaleza del antígeno o del generador in
vivo, se puede administrar una composición de acuerdo con la
invención a peces, crustáceos como, por ejemplo, gambas, aves de
corral, en particular gansos, pavos, palomas y gallinas, a cánidos
como, por ejemplo, perros, felinos como, por ejemplo, gatos, a
cerdos, a primates, a bóvidos, a óvidos y a equinos.
De acuerdo con un último aspecto de la presente
invención, su objeto es un método para la conservación mediante
congelación de una composición que está compuesta por una fase
antigénica, una fase de adyuvante oleoso y, opcionalmente, una fase
diluyente para la fase antigénica, en la que el medio antigénico
constituye una fase que está separada de la fase adyuvante cuando
la composición se encuentra en estado sólido, encontrándose dicha
composición en estado líquido cuando su temperatura es mayor que o
igual a 4ºC, caracterizada porque:
a) La primera fase de entre las fases del
adyuvante oleoso, del diluyente o antigénica que sea líquida a
temperatura ambiente se lleva hasta una temperatura menor que o
igual a la de su punto de solidificación, de modo que se forme una
primera fase sólida;
b) se añade sobre la fase sólida preparada en a)
la segunda fase de entre las fases antigénica, del adyuvante o del
diluyente en estado líquido y, a continuación, la nueva combinación
se lleva hasta una temperatura menor que o igual a la del punto de
solidificación más bajo de las dos fases, de modo que se forme una
combinación sólida con dos fases separadas;
c) cuando proceda, se añade sobre dicha
combinación sólida preparada en la etapa b) una nueva fase
antigénica adyuvante o diluyente en estado líquido y, a
continuación, la nueva combinación se lleva hasta una temperatura
menor que o igual a la del punto de solidificación más bajo de
cualquiera de las tres fases de modo que se forme una combinación
sólida con tres fases separadas;
d) la composición congelada de este modo se
mantiene a una temperatura inferior a la del punto de congelación
más bajo de cualquiera de las fases que la componen.
Inesperadamente, se ha observado que mientras
las vacunas en forma de emulsiones
agua-en-aceite (W/O),
aceite-en-agua (O/W) y
agua-en-aceite-en-agua
(W/O/W) pierden su actividad tras haber sido conservadas a -20ºC
durante 7 meses, las conservadas de acuerdo con el método definido
más arriba bajo las mismas condiciones de temperatura y duración
permanecían igual de activas.
Más particularmente, para conservar una
composición constituida por una fase antigénica, una fase de
adyuvante oleoso y, opcionalmente, una fase diluyente para la fase
antigénica, en el método definido más arriba, la fase utilizada en
la etapa a) es la fase de adyuvante oleoso, la fase utilizada en la
etapa b) es o bien la fase diluyente, cuando la composición
contiene una, o bien la fase antigénica, y la fase utilizada, cuando
proceda, en el paso c) es la fase antigénica.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención
sin limitarla por otro lado.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Primera secuencia de
experimentos
Se preparan dosis de 5 mililitros (ml) de vacuna
para el tratamiento de la fiebre aftosa de la siguiente
manera:
manera:
1 - Se congelan a aproximadamente -18ºC muestras
de 2,5 ml de MONTANIDE® ISA206 compuestas por la combinación de
aproximadamente 2,15 ml de aceite mineral inyectable con 0,35 ml de
una mezcla de oleato de manitan y PEG 500;
2 - tras ser congeladas, las muestras se retiran
del congelador y se les agregan inmediatamente 2,45 ml de tampón
fosfato (PBS) y, a continuación, se vuelven a congelar;
3 - de nuevo, se retiran las muestras del
congelador y se les agregan inmediatamente 0,05 ml de un concentrado
que contiene 10 mg/ml de antígeno de la fiebre aftosa, y se vuelven
a congelan para que se formen las composiciones de vacuna
A_{i}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon dosis de 5 ml de vacunas para el
tratamiento de la fiebre aftosa en ovinos mezclando 2,5 ml de un
adyuvante oleoso, MONTANIDE® ISA206, compuesto por la combinación de
aproximadamente 2,25 ml de aceite mineral inyectable con 0,25 ml de
una mezcla de oleato de manitan, que se emulsiona de acuerdo con el
método descrito en la publicación internacional WO 91/00106, en 2,5
ml de una solución PBS que contiene 0,5 mg de antígeno de la fiebre
aftosa, para que se formen composiciones de vacuna en forma de
emulsiones agua-aceite-agua
(composiciones B_{j}).
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudia la eficacia de las vacunas de acuerdo
con la invención comparándola con la eficacia de dosis de placebo
de 5 ml que contienen 2,5 ml de MONTANIDE® ISA206 y 2,5 ml de tampón
PBS (composiciones P_{k}) y con las del estado de la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Prueba
1
Se inyecta 1 ml de diversas concentraciones de
antígenos en grupos de 5 cobayas utilizando las composiciones
A_{i}, que se utilizan inmediatamente después de su
descongelación, dilución opcional en PBS y agitación manual para
que se forme una emulsión inmediatamente antes de ser inyectadas. Se
realiza el mismo procedimiento con las composiciones placebo.
Se determina la actividad de la vacuna mediante
un ensayo ELISA del IG1 tras una inyección de refuerzo a los 28
días para determinar la respuesta inmunitaria humoral, y del IG2a
para determinar la respuesta inmunitaria
celular.
celular.
En cada grupo de 5 cobayas se hizo recuento de
los animales protegidos 90 días después de la primera
vacunación.
\newpage
Los resultados, expresados como % de animales
protegidos, se muestran en la tabla siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Prueba
2
Se inyecta 1 ml de diversas concentraciones de
antígenos en grupos de 5 cobayas utilizando composiciones A_{4},
conservadas durante 7 meses a -20ºC, que se utilizan inmediatamente
después de su descongelación, dilución opcional en PBS y agitación
manual para que se forme una emulsión inmediatamente antes de ser
inyectadas. Se realiza el mismo procedimiento con composiciones
placebo P_{4} y una emulsión W/O/W (composición B_{4})
conservada durante 7 meses a -20ºC. Se determina la actividad de la
vacuna mediante un ensayo ELISA del IG1 tras una inyección de
refuerzo a los 28 días para determinar la respuesta inmunitaria
humoral, y del IG2a para determinar la respuesta inmunitaria
celular. Se hizo un recuento en cada grupo de 5 cobayas de los
animales protegidos 90 días después de la primera vacunación y se
determinó el índice PD_{50}, que expresa el grado de dilución por
debajo del cual está protegido menos del 50% del grupo. Los
resultados, expresados como % de animales protegidos, se muestran
en la tabla siguiente:
Mediante extrapolación, para las composiciones
A_{4} se deduce un índice PD_{50} igual a 106,5, que corresponde
a una dilución de la composición de aproximadamente 1/100, y para
las composiciones B_{4} se deduce también mediante extrapolación
un índice PD_{50} igual a 46,71, que corresponde a una dilución de
la composición de aproximadamente 1/50.
Esta prueba evidenció que una composición de
vacuna que comprende, en estado sólido, una fase antigénica y una
fase adyuvante separadas entre sí, entendiéndose el término
separadas de acuerdo con la definición que se ha dado en la
presente descripción, es más efectiva cuando se utiliza después de 7
meses de conservación a 20ºC que una composición de vacuna que
contenga los mismos constituyentes pero que se ha conservado durante
el mismo tiempo y a la misma temperatura en forma de emulsión
(congelada) de las diversas fases.
\vskip1.000000\baselineskip
Prueba
3
Se inyecta 1 ml de diversas concentraciones de
antígenos en grupos de 5 cobayas utilizando composiciones de vacuna
de acuerdo con la invención, conservadas durante 7 meses a -20ºC,
descongeladas, conservadas a +4ºC (en estado líquido) durante 4
meses (composiciones A_{5}) o 7 meses (composiciones A_{6}), y
utilizadas en diversas [diluciones] opcionales en PBS. Se realiza
el mismo procedimiento con composiciones placebo P_{5} y P_{6}.
Se determina la actividad de la vacuna mediante un ensayo ELISA del
IG1s tras una inyección de refuerzo a los 28 días para determinar
la respuesta inmunitaria humoral, y del IG2a para determinar la
respuesta inmunitaria celular. Se hizo un recuento en cada grupo de
5 cobayas de los animales protegidos 90 días después de la primera
vacunación. Los resultados, expresados como % de animales
protegidos, se muestran en la tabla siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Esta prueba evidenció que el período de
congelación no tiene un efecto perjudicial sobre el conservación
posterior de la composición de vacuna en estado líquido. Por
consiguiente, en el caso de intervenciones urgentes, las
composiciones congeladas de acuerdo con la invención se pueden
transportar al lugar de su utilización bajo condiciones de
refrigeración idénticas a las del estado de la técnica (+4ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Segunda secuencia de
experimentos
Se prepararon formulaciones de vacuna que
incluían antígeno inactivado del FMDV O_{1} Lausanne, bien como
una emulsión
agua-en-aceite-en-agua
(W/O/W) con Montanide® ISA 206, o bien como una emulsión
aceite-en-agua (O/W) con Montanide®
ISA 25, convencionalmente (Barnett y otros, Vaccine 14 (13), páginas
1187-1198; 1996) o bien mediante el nuevo
procedimiento, utilizando un concentrado de antígeno procedente del
International Vaccine Bank (IVB) sobre nitrógeno líquido con un
valor PD_{50} de 41 por cada dosis bovina.
La vacuna formulada contenía 5,62 \mug de
antígeno 146S por cada dosis bovina de 2 ml.
El nuevo procedimiento de formulación comprendía
4 etapas principales como se indica a continuación:
1. Se dividieron de forma alícuota adyuvantes
oleosos Montanide ISA 206 ó 25, en los volúmenes requeridos, en el
recipiente primario deseado, se introdujeron en la fase gaseosa de
ultra baja temperatura de nitrógeno líquido y se congelaron
instantáneamente.
2. Se retira momentáneamente de las condiciones
de baja temperatura el adyuvante oleoso congelado y se deposita
cuidadosamente el volumen requerido de tampón acuoso en una capa
sobre el adyuvante oleoso congelado, de modo que formen dos capas o
estratos distinguibles. Se vuelve a introducir inmediata y
cuidadosamente en la fase gaseosa de ultra baja temperatura de
nitrógeno líquido para congelar instantáneamente el tampón
acuoso.
3. Se vuelven a retirar momentáneamente de las
condiciones de baja temperatura las capas del adyuvante oleoso y
del tampón acuosos congelados y, a continuación, se deposita
cuidadosamente el volumen requerido de antígeno concentrado sobre
el tampón congelado. Se devuelve a introducir inmediatamente en las
condiciones de ultra baja temperatura para congelar
instantáneamente el concentrado de antígeno.
4. Cuando se necesiten, las vacunas
estratificadas y criogénicamente conservadas (SACS) se descongelan a
temperatura ambiente, se mezclan mediante simple agitación y se
administran al receptor destinatario.
Para poder realizar la comparación, también se
congelaron de forma inmediata vacunas formuladas convencionalmente
adyuvadas con Montanide ISA 206 y 25, introduciéndolas en la fase
gaseosa de ultra baja temperatura de nitrógeno líquido.
Se ensayaron preparaciones de vacuna en cobayas
Duncan-Hartley hembra de aproximadamente
400-500 gm de peso. Cada grupo de cinco animales
recibió un volumen de vacuna específico de 1 ml, 0,33 ml ó 0,11 ml.
administrado por vía subcutánea. Los animales fueron desafiados 28
días después de la vacunación con 3 \times 10^{3} ID_{50} del
virus adaptado de cobaya homólogo, inyectados por vía intraplantar.
Se observó estrechamente a todos los animales durante
7-10 días y se consideró protegidos a los cobayas
inmunizados si el virus no había conseguido propagarse más allá de
la zona de inoculación.
Experimentos posteriores contenían diluciones de
la vacuna en lugar de la dosis de volumen reducido descrita
previamente. Esencialmente, las vacunas se diluyeron en una vacuna
formulada de forma similar que no contenía el componente antígeno,
de modo que fue el antígeno pero no el adyuvante lo que se diluyó.
El rango de disolución utilizado se hizo terciando desde cero hasta
1/81. Después de 28 días de la vacunación los animales fueron
desafiados de nuevo con 3 \times 10^{3} ID_{50} del virus
adaptado de cobaya homólogo, inyectados por vía intraplantar y
observados como se ha descrito previamente. Este rango de dilución
permitió calcular la potencia (PD_{50}) de la vacuna mediante el
método de Karber (Karber, Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 1931, 162,
480).
En la primera evaluación, se examinó la
estabilidad a temperatura ultra-baja a lo largo de
un período de 7 meses de las vacunas SACS basadas en Montanide® ISA
206 o Montanide® ISA 25. Utilizando un régimen de dosis
fraccionarias los resultados fueron alentadores, mostrando que, en
ausencia de cualquier pérdida en la potencia de la vacuna, el
procedimiento no era perjudicial para ninguna formulación adyuvada
(Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
En la segunda evaluación, se diluyeron vacunas
SACS basadas en Montanide® ISA 206 o ISA 25 en una vacuna tratada de
forma similar sin el componente antígeno y se compararon con los
valores PD_{50} de las vacunas formuladas convencionalmente (Tabla
2).
Estudios posteriores evidenciaron que muestras
de vacunas SACS que utilizan los dos adyuvantes de aceite mineral,
todavía conservan su potencia después de 7 meses cuando se
descongelan, mezclan y posteriormente se conservan a +4ºC (Tabla
3). Esto se asemejó bastante a observaciones anteriores con vacunas
de emergencia formuladas convencionalmente compuestas por los
mismos adyuvantes (Barnett y otros, Vaccine 14 (13), páginas
1187-1198; 1996).
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Resulta interesante que la congelación inmediata
de emulsiones de aceite formuladas convencionalmente dio lugar a
resultados diferentes y dependía del adyuvante oleoso utilizado.
Mientras la vacuna convencional formulada con ISA 25 mostró una
considerable pérdida de potencia (Tabla 4), la vacuna basada en
Montanide® ISA 206 no pareció verse afectada por la congelación
instantánea en la fase gaseosa de nitrógeno líquido. Esto era lo
contrario de lo que se había observado previamente al conservar este
tipo de vacuna a -20ºC y a -70ºC, y sugiere que el nuevo
procedimiento de formulación por estratificación tiene más
beneficios para unos adyuvantes oleosos "listos para ser
utilizados en la fórmula" que para otros.
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\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar todo ello con más detenimiento, se
comparó la potencia de una vacuna ISA 206 formulada
convencionalmente que había sido congelada instantáneamente con
otras del mismo lote no congeladas instantáneamente pero dejadas a
+4ºC durante la noche (Tabla 5). Estos resultados sugieren que la
vacuna formulada con Montanide ISA 206 se puede conservar congelada
a condición de que el procedimiento de congelación sea rápido y a
una temperatura muy baja.
Claims (11)
1. Método para preparar una composición que
consiste en una fase antigénica, una fase de adyuvante oleoso y,
opcionalmente, una fase diluyente para la fase antigénica, en la que
el medio antigénico constituye una fase que está separada de la
fase adyuvante cuando la composición está en estado sólido, estando
dicha composición en estado líquido cuando su temperatura es mayor
que o igual a 4ºC, caracterizado porque:
a) la primera fase de entre las fases del
adyuvante oleoso, del diluyente o antigénica que sea líquida a
temperatura ambiente se lleva hasta una temperatura menor que o
igual a su punto de solidificación, de modo que se forme una
primera fase sólida;
b) se añade sobre la fase sólida preparada en a)
la segunda fase de entre las fases del adyuvante oleoso, del
diluyente o antigénica, en estado líquido y, a continuación, la
nueva combinación se lleva hasta una temperatura menor que o igual
a la del punto de solidificación más bajo de cualquiera de las dos
fases, de modo que se forme una combinación sólida con dos fases
separadas;
c) cuando proceda, se añade sobre dicha
combinación sólida preparada en la etapa b) la última fase de entre
las fases del adyuvante oleoso, antigénica o del diluyente, en
estado líquido y, a continuación, la nueva combinación se lleva
hasta una temperatura menor que o igual a la del punto de
solidificación más bajo de cualquiera de las tres fases de modo que
se forme una combinación sólida con tres fases diferentes.
2. Método según la reivindicación 1, para
preparar una composición en la que las diversas fases que
constituyen la composición en estado sólido están dispuestas de una
forma estratificada en dicha composición y están, preferiblemente,
superpuestas unas sobre las otras.
3. Método según una de las reivindicaciones 1 a
2, para preparar una composición en la que el medio antigénico es
una fase acuosa o acuoso-alcohólica de material
antigénico.
4. Método según una de las reivindicaciones 1 a
3, para preparar una composición en la que la fase del adyuvante
oleoso o las fases de adyuvantes oleosos se escogen entre aceites
minerales, aceites sintéticos, aceites vegetales o aceites
animales.
5. Método según la reivindicación 4, para
preparar una composición en la que el aceite o la mezcla de aceites
que constituyen la fase oleosa se combina con un tensioactivo no
iónico o con una mezcla de tensioactivos no iónicos.
6. Método según la reivindicación 5, para
preparar una composición en la que uno de los tensioactivos no
iónicos combinado con el aceite o con la mezcla de aceites se escoge
entre ácidos oleico, ricinoleico y cetoesteárico y derivados de los
mismos, y, más particularmente, oleatos de manitol y los derivados
de oleatos de manitol obtenidos mediante injerto de grupos
funcionales hidrófilos como, por ejemplo, grupos funcionales amida,
amina, alcohol, poliol, o carboxilo, o radicales etoxi, propoxi,
y/o butoxi, u oleatos de manitan o derivados de los mismos.
7. Método según una de las reivindicaciones 1 a
6, para preparar una composición que consiste en una fase
antigénica y una fase de adyuvante oleoso.
8. Método según una de las reivindicaciones 1 a
6, para preparar una composición que consiste en una fase
antigénica, una fase de adyuvante oleoso y una fase diluyente para
la fase antigénica.
9. Método según una de las reivindicaciones 1 a
8, para preparar una composición en la que, en estado sólido, la
fase oleosa constituye el estrato inferior y la fase antigénica el
estrato superior.
10. Método para la conservación en estado de
congelación de una composición que consiste en una fase antigénica,
una fase de adyuvante oleoso y, opcionalmente, una fase diluyente
para la fase antigénica, en la que el medio antigénico constituye
una fase que está separada de la fase adyuvante cuando la
composición está en estado sólido, estando dicha composición en
estado líquido cuando su temperatura es mayor que o igual a 4ºC,
caracterizado porque:
a) una primera fase entre la del adyuvante, del
diluyente o antigénica que sea líquida a temperatura ambiente se
lleva hasta una temperatura menor que o igual a la de su punto de
solidificación, de modo que se forme una primera fase sólida;
b) se añade sobre la fase sólida preparada en a)
una segunda fase entre la antigénica, adyuvante o diluyente en
estado líquido y, a continuación, la nueva combinación se lleva
hasta una temperatura menor que o igual a la del punto de
solidificación más bajo de las dos fases, de modo que se forme una
combinación sólida con dos fases diferentes;
c) cuando proceda, se añade sobre dicha
combinación sólida preparada en la etapa b) una nueva fase
antigénica, adyuvante o diluyente, en estado líquido y, a
continuación, la nueva combinación se lleva hasta una temperatura
menor que o igual a la del punto de solidificación más bajo de las
tres fases de modo que se forme una combinación sólida con tres
fases diferentes;
d) la composición congelada de este modo se
mantiene a una temperatura inferior a la del punto de congelación
más bajo de las fases que la constituyen.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
la fase utilizada en la etapa a) es la fase del adyuvante oleoso,
la fase utilizada en la etapa b) es o bien la fase diluyente, cuando
la composición contiene una, o bien la fase antigénica, y la fase
utilizada, cuando proceda, en la etapa c) es la fase antigénica.
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