ES2199734T3 - Vacuna con adyuvante de aceite. - Google Patents
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Abstract
Una vacuna con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG que comprende una fase acuosa exterior que comprende 0, 5- 20% en peso de un derivado de polietilenglicol que tiene un peso molecular de 400-20.000, que está representado por la siguiente fórmula (I) R1-O-(-CH2-CH2-O-)n-R2 (I) en la que R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes y cada uno es un átomo de hidrógeno o alquilo que tiene 1 a 4 átomos de carbono y n es un grado de polimerización, y una fase acuosa interior que comprende una cantidad eficaz y biológicamente aceptable de un antígeno.
Description
Vacuna con adyuvante de aceite.
La presente invención se refiere a una vacuna con
adyuvante de aceite. Más particularmente, la presente invención se
refiere a una vacuna con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG
(agua/aceite/agua) superior en efecto adyuvante y estabilidad, en
forma de una preparación.
Las vacunas con adyuvantes de aceite son
conocidas desde hace tiempo para potenciar de manera eficaz la
inmunidad. Particularmente, el adyuvante de Freund muestra un efecto
de potenciación de la inmunidad extremadamente superior cuando se
usa un antígeno inactivado y es un adyuvante representativo
ampliamente usado en ensayos animales. Sin embargo, puesto que
este adyuvante ocasiona igualmente fuertes efectos secundarios tales
como abscesos graves y granuloma, se usa únicamente en
laboratorios.
Por ello, se han realizado muchos intentos para
reducir dichos efectos secundarios y para aplicar un adyuvante de
aceite de uso general. Los adyuvantes de aceite tienen diversos
tipos de preparación, tal como un tipo AG/AC tal como el adyuvante
de Freund, un tipo AG/AC superior en seguridad, un tipo AG/AC/AG
complejo y similares.
Por ejemplo, el documento
JP-B-6-81731 informa
de un adyuvante de aceite tipo AG/AC que contiene éster oleico de
manitol anhidro como un tensioactivo y parafina líquida como un
componente aceite, y el documento WO 91/00107 (Solicitud de Patente
Japonesa bajo PCT abierta a consulta pública bajo Kohyo Nº
4-506521) informa de un adyuvante de aceite tipo
AG/AC de baja viscosidad que contiene un aceite metabolizable, tal
como aceite vegetal, y un aceite no metabolizable, tal como aceite
mineral en combinación como un componente aceite.
Además, el documento WO 90/14837 describe un
adyuvante tipo AC/AG como una preparación adyuvante que contiene
una emulsión de gotas de aceite submicrónicas, y el documento
EP-A-315153 describe una vacuna
adyuvante tipo AC/AG que contiene un emulsionante que contiene un
polímero de bloques de POP-POE y glicopéptido como
un inmunoestimulante.
De estos adyuvantes, un adyuvante de aceite tipo
AG/AC muestra un alto efecto inmunopotenciador, pero tiene una
tendencia a permanecer en el sitio de la inyección debido a la fase
aceite continua de la preparación. En algunos casos no raros,
desarrolla abscesos estériles y granuloma en la proximidad de un
sitio de inoculación, y posiblemente ocasiona un dolor agudo
durante la inoculación. Por ello, este tipo de adyuvante de aceite
se ha limitado en su uso como forma de una preparación que permite
la inoculación directa a un cuerpo. Un adyuvante de aceite tipo
AC/AG muestra una respuesta tópica ligera en el sitio de la
inyección y es superior en cuanto a seguridad. Sin embargo, puesto
que está contenido un antígeno en una fase continua, éste se
difunde rápidamente en el sitio de la inyección, haciendo difícil
de proporcionar un efecto suficiente y, frecuentemente, requiere un
inmunoestimulante específico.
En vista de la situación anterior, en los últimos
años se ha sometido a investigación un nuevo tipo de adyuvante de
aceite, un adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG.
Por ejemplo, el documento WO 91/00106 describe
una emulsión multi-fase tipo AG/AC/AG que se
transforma en tipo AG/AC mediante exposición a la temperatura del
cuerpo de un animal después de la inyección. Esta técnica omite
resolver todos los problemas asociados con los adyuvantes de aceite
tipo AG/AC convencionales, tal como respuesta tópica y similares,
ya que en el cuerpo se encuentra presente un adyuvante de aceite en
la forma de un adyuvante tipo AG/AC.
Puesto que un adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG
adopta la forma de una emulsión compleja, la estabilidad en forma
de una preparación no puede mantenerse fácilmente, en comparación
con adyuvantes de aceite de un tipo AG/AC y un tipo AC/AG. Por
ello, una vacuna con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG de la que se
espera que simultáneamente muestre los aspectos característicos de
un tipo AG/AC que exhibe una adyuvancia superior y de un tipo AC/AG
superior en seguridad, plantea muchos problemas a resolver antes de
hacer posible el desarrollo de un adyuvante de aceite capaz de
mostrar características bien compensadas de los dos tipos.
Los autores de la presente invención han
mostrado, en la Patente de EE.UU. 5.814.321, una vacuna con
adyuvante de aceite tipo AG/AC superior en seguridad y estabilidad
de preparación y una vacuna con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG
obtenida mediante la dispersión de la vacuna AG/AC en una fase
acuosa.
El documento
JP-A-11-106351
describe una vacuna con adyuvante de aceite que contiene A
(10-90% en peso de un ingrediente de aceite que se
comporta como un líquido a temperatura ordinaria), B
(0,5-30% en peso de un agente emulsionante
seleccionado entre tensioactivos no iónicos), y C (un ingrediente
acuoso que contiene 0,1-30% en peso de
polietilenglicol y una cantidad de antígeno eficaz aceptable
biológicamente).
Sin embargo, una vacuna con adyuvante de aceite
tipo AG/AC/AG preparada mediante una técnica convencional muestra
una gran variedad de propiedades, dependiendo de la formulación y
del método de preparación. Esto se asocia con problemas debidos a
que, a veces, el componente antígeno incrementa notablemente su
viscosidad, y a que la introducción de manera estable de la
inmunidad no es factible en comparación con un adyuvante de aceite
tipo AG/AC.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención
es proporcionar una vacuna con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG
mejorada en la estabilidad al almacenamiento en forma de una
preparación y en la respuesta tópica en el sitio de la inyección,
que muestra un alto efecto inmunológico.
De acuerdo con la presente invención, se ha
proporcionado una vacuna con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG que
comprende, en una fase acuosa exterior, una cantidad específica de
un derivado de polietilenglicol que tiene un peso molecular
específico, cuya vacuna muestra alta estabilidad en forma de una
preparación, seguridad superior en términos de respuesta tópica y
similares, y un alto efecto de inmunopotenciación.
De acuerdo con ello, la presente invención
proporciona lo siguiente:
(1) Una vacuna con adyuvante de aceite tipo
AG/AC/AG que comprende una fase acuosa exterior que contiene
0,5-20% en peso de un derivado de polietilenglicol
que tiene un peso molecular de 400-20.000, el cual
se representa por la siguiente fórmula (I)
R^{1}-O-(-CH_{2}-CH_{2}-O-)_{n}-R^{2}(I)
en la que R^{1} y R^{2} pueden ser iguales o
diferentes y cada uno es un átomo de hidrógeno o un alquilo que
tiene 1 a 4 átomos de carbono y n es un grado de polimerización, y
una fase acuosa interior que contiene una cantidad eficaz y
biológicamente aceptable de un
antígeno.
(2) La vacuna con adyuvante de aceite
anteriormente mencionada (1), en la que el derivado de
polietilenglicol de la fórmula (I) tiene un peso molecular de
1.000-10.000.
(3) La vacuna con adyuvante de aceite
anteriormente mencionada (1), en la que la fase acuosa exterior
contiene 1-10% en peso del derivado de
polietilenglicol de la fórmula (I).
(4) La vacuna con adyuvante de aceite
anteriormente mencionada (1), la cual es una vacuna con adyuvante
de aceite tipo AG/AC/AG preparada mediante la dispersión o emulsión
de una emulsión de AG/AC preparada a partir de un componente
aceite (A) que se convierte en líquido a temperatura ambiente, un
emulsionante (B) y un componente acuoso (C) que contiene una
cantidad eficaz y biológicamente aceptable de un antígeno, en un
líquido que contiene un emulsionante (D) y un componente acuoso
(E), en que el líquido contiene 0,5-20% en peso del
derivado de polietilenglicol de la fórmula (I) que tiene un peso
molecular de 400-20.000.
(5) La vacuna con adyuvante de aceite
anteriormente mencionada (1), la cual es una vacuna con adyuvante
de aceite tipo AG/AC/AG preparada mediante la dispersión o emulsión
de una emulsión de AG/AC preparada a partir de un componente
aceite (A) que se convierte en líquido a temperatura ambiente, un
emulsionante (B) y un componente acuoso (C) que contiene una
cantidad eficaz y biológicamente aceptable de un antígeno, en un
líquido que contiene un emulsionante (D) y un componente acuoso (E)
y, a continuación, la adición del derivado de polietilenglicol de
la fórmula (I), el cual tiene un peso molecular de
400-20.000, a la fase acuosa exterior a una
concentración de 0,5-20% en peso.
(6) La vacuna con adyuvante de aceite
anteriormente mencionada (4) ó (5), en la que el componente aceite
(A), que se convierte en líquido a temperatura ambiente, contiene
un éster de ácido graso y/o escualeno en una proporción no inferior
al 20% en peso de una fase aceite.
(7) La vacuna con adyuvante de aceite
anteriormente mencionada (4) ó (5), en la que el emulsionante (B)
tiene un HLB (equilibrio hidrófilo-lipófilo) menor
que 10.
(8) La vacuna con adyuvante de aceite
anteriormente mencionada (7), en la que el emulsionante (B)
contiene al menos un miembro seleccionado entre un éster parcial de
alcohol polihídrico y un ácido graso y un tensioactivo no iónico
que tiene una cadena de polioxietileno.
(9) La vacuna con adyuvante de aceite
anteriormente mencionada (4) ó (5), en la que el emulsionante (D)
tiene un HLB no menor que 10.
(10) La vacuna con adyuvante de aceite
anteriormente mencionada (9), en la que el emulsionante (D)
contiene un tensioactivo no iónico que tiene una cadena de
polioxietileno.
La vacuna con adyuvante de aceite de la presente
invención se prepara dispersando o emulsionando (Etapa 2) una
emulsión de AG/AC preparada (Etapa 1) a partir de un componente
aceite (A) que se convierte en líquido a temperatura ambiente, un
emulsionante (B) y un componente acuoso (C) que contiene una
cantidad eficaz y biológicamente aceptable de un antígeno, en un
líquido que contiene un emulsionante (D) y un componente acuoso
(E), en el que una fase acuosa exterior de la vacuna con adyuvante
de aceite tipo AG/AC/AG obtenida en última instancia contiene una
cantidad específica de un derivado de polietilenglicol que tiene un
peso molecular específico.
El componente aceite (A) que se convierte en
líquido a temperatura ambiente constituye una fase continua de la
emulsión de AG/AC preparada en la Etapa 1, y constituye una fase
aceite que se convierte en una fase de dispersión de una vacuna con
adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG obtenida en la Etapa 2. En la
presente invención, por fase aceite se entiende una fase aceite en
esta vacuna con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG. En esta memoria
descriptiva, por "a temperatura ambiente" se entiende una
temperatura dentro del intervalo de 15-25ºC. El
componente aceite (A) que se convierte en líquido a temperatura
ambiente puede seleccionarse para uso a partir de bases aceite
éster y no éster convencionalmente usadas para alimentación,
productos farmacéuticos, cosméticos y similares, que se convierten
en líquidos a temperatura ambiente.
La base aceite no éster que se convierte en
líquida a temperatura ambiente puede ser, por ejemplo, un
hidrocarburo tal como parafina líquida ligera, escualeno,
escualano, polibuteno y similares, un ácido graso tal como ácido
graso saturado de cadena media (p. ej., ácido caprílico, ácido
cáprico y similares), ácido graso insaturado de cadena larga (p.
ej. ácido oleico, ácido linólico, ácido linolénico y similares),
alcohol alifático de cadena media o cadena larga y similares.
Ejemplos de la base aceite éster que es líquida a temperatura
ambiente incluyen diversos ésteres de ácidos grasos derivados de
ácidos grasos saturados de cadena media tal como ácido caprílico y
ácido cáprico, o ácido graso insaturado de cadena larga tal como
ácido oleico y ácido linólico y alcohol, así como ésteres de ácidos
grasos que se producen de manera natural, tal como aceite vegetal
líquido (p. ej., aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de
cártamo, aceite de girasol, aceite de jójoba y similares), un
aceite líquido procedente de animales, tal como aceite crudo
naranja, y similares.
Como el componente aceite (A), puede usarse uno
de los ejemplos anteriores, o pueden mezclarse y usarse dos o más
de los ejemplos anteriores. De estos componentes aceite, un aceite
tal como ésteres de ácidos grasos, aceite vegetal y escualeno
tienen de manera beneficiosa una resistencia relativamente alta a
la oxidación y alta afinidad por un cuerpo. Por ello, como un
componente aceite a usar para la vacuna con adyuvante de aceite de
la presente invención, preferiblemente se seleccionan un o más de
estos aceites. Particularmente, como un éster de ácido graso es
preferible una base de aceite obtenida a partir de un compuesto
esterificado de ácido graso
cis-\Delta9-insaturado que tiene
16 a 22 átomos de carbono, el cual es igualmente un componente
constituyente de un lípido biológico, y alcohol que tiene 1 a 3
átomos de carbono.
Más aún, al contener un éster de ácido graso y/o
escualeno en una fase aceite al menos en una proporción no menor
que 20% en peso, la vacuna con adyuvante de aceite final puede,
además, reducir efectos secundarios tales como respuesta tópica y
similares, así como mejorar la seguridad. Cuando se usa
simultáneamente un éster de ácido graso y escualeno, la cantidad
total de los mismos debería ser al menos no inferior al 20% en peso
de la fase aceite.
En la presente invención, pueden seleccionarse y
usarse uno o más tensioactivos que muestran alta seguridad para un
cuerpo, los cuales se usan generalmente para productos farmacéuticos
y alimentos, como el emulsionante (B) y el emulsionante (D) que
constituyen una vacuna con adyuvante de aceite.
El emulsionante (B) se usa en la Etapa 1 para la
preparación de una emulsión de AG/AC que consiste en un componente
acuoso (C) que contiene un antígeno y un componente aceite (A).
A la vista de la estabilidad de la vacuna con
adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG final, un tensioactivo usado como
emulsionante (B) es, preferiblemente, lipofílico. Es decir,
preferiblemente tiene un HLB (equilibrio
hidrófilo-lipófilo) relativamente bajo, de modo
particularmente preferible un HLB menor que 10. El emulsionante (B)
puede ser de un único tipo o una combinación de dos o más tipos. En
este caso, el emulsionante (B) se selecciona preferiblemente con el
fin de obtener un HLB total menor que 10.
Más específicamente, se usan un éster parcial de
alcohol polihídrico y ácido graso, tal como un éster de ácido graso
y sorbitan (p. ej., monooleato de sorbitan, dioleato de sorbitan,
sesquiolato de sorbitan, etc.), éster de ácido graso y glicerol (p.
ej. monooleato de glicerol, etc.), éster de ácido graso y
poliglicerol (p. ej., monooleato de diglicerol, dioleato de
diglicerol, etc.) y similares, un tensioactivo no iónico, que tiene
una cadena de polioxietileno en una molécula, tal como éster de
ácido graso y polioxietileno y sorbitan (polisorbato) [p. ej.,
monooleato de polioxietileno(20)sorbitan, etc.],
aceite de ricino polioxietileno hidrogenado,
polioxietileno-polioxipropilen-glicol
y similares.
De estos, un éster parcial de alcohol polihídrico
que tiene 3 a 10 grupos hidroxilo en una molécula, tal como
sorbitan, glicerol y poliglicerol, y un ácido graso que tiene 12 a
20 átomos de carbono, y triglicérido de hidroxi ácido graso
adicionado con una cadena de polioxietileno, el cual está
representado por el aceite de ricino polioxietileno hidrogenado,
son los particularmente usados en combinación, de manera que el HLB
total del emulsionante (B) es menor que 10. De esta manera, puede
obtenerse una vacuna con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG que
tiene una estabilidad muy superior, en forma de una
preparación.
En la presente memoria descriptiva, el HLB se
determina de acuerdo con la fórmula propuesta por W.C. Griffin
[W.C. Griffin, J. Soc. Cosmetic. Chemists, 1, 311, (1949)].
Para la preparación de la vacuna con adyuvante de
aceite de la presente invención, se usa una composición de
emulsionante como un componente que constituye una emulsión de
AG/AC que contiene una solución de antígeno, que se obtiene
mezclando, previamente, aminoácido o una sal del mismo y una
solución acuosa que contiene azúcar no reductor o
azúcar-alcohol que tiene al menos 5 grupos
hidroxilo en una molécula, y éster parcial de alcohol polihídrico
que tiene 3 o más grupos hidroxilo y un ácido graso, que es un
tensioactivo no iónico que se convierte en líquido a temperatura
ambiente, conjuntamente con el emulsionante (B) anteriormente
mencionado para potenciar la eficacia del adyuvante de aceite y la
estabilidad de la preparación. El aminoácido o una sal del mismo, y
el azúcar o el azúcar-alcohol usado en forma de una
solución acuosa puede seleccionarse a partir de los usados
generalmente para alimentos, productos farmacéuticos listados en la
Farmacopea Japonesa y Fármacos del Código Farmacéutico Japonés. La
solución de antígeno aquí usada puede adoptar cualquier forma,
siempre y cuando que ésta sea un líquido, siendo éste a modo de
ejemplo una solución, suspensión y similares. Por ejemplo, el
aminoácido o una sal del mismo puede ser glicina, alanina,
hidrocloruro de arginina, histidina, fenilalanina, aspartato
sódico, aspartato potásico, glutamato sódico, glutamato potásico o
un hidrato del mismo, en que el azúcar o el
azúcar-alcohol se seleccionan preferiblemente entre
trehalosa, xilitol, sorbitol, manitol, maltitol, lactitol, y
similares.
La composición de emulsionante anteriormente
mencionada se obtiene mediante la preparación de una solución
acuosa que contiene el aminoácido anteriormente mencionado o una
sal del mismo y el azúcar o azúcar-alcohol
anteriormente mencionado, y mezclando y agitando la solución acuosa
con el tensioactivo no iónico anteriormente indicado a una relación
en peso de 10:1-1:1 (solución acuosa:tensioactivo).
La composición del emulsionante se usa en una proporción de
aproximadamente 1-20% en peso, de preferencia
aproximadamente 2-10% en peso, de una emulsión de
AG/AC que contiene una solución de antígeno.
El emulsionante (D) se usa en la Etapa 2 para
dispersar o emulsionar la emulsión de AG/AC anteriormente
mencionada en un líquido que contiene un emulsionante (D) y un
componente acuoso (E).
A la vista de la estabilidad de la vacuna con
adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG final, el tensioactivo usado como
emulsionante (D) es, preferiblemente, hidrófilo y tiene un valor
HLB relativamente alto, el cual es particularmente de modo
preferible no menor que 10. Este emulsionante (D) puede usarse solo
o en combinación según sea preciso. En este caso, el emulsionante
(D) se determina, preferiblemente, de forma que se obtenga un HLB
total no menor que 10.
Más específicamente, se usa un tensioactivo no
iónico con una cadena de polioxietileno en una molécula y que tiene
un HLB no menor que 10, tal como éster(es) de ácido graso y
polioxietilen-sorbitan, aceite de ricino
polioxietileno hidrogenado,
polioxietileno-polioxipropilen-glicol
y similares. Estos tensioactivos pueden usarse en combinación con
un éster parcial de alcohol polihídrico y ácido graso, tal como
éster de ácido graso y sorbitan, éster de ácido graso y glicerol,
éster de ácido graso y sacarosa, éster de ácido graso y
poliglicerol y similares, y glicerofosfolípido que contiene
lecitina que se produce de manera natural. De estos, el uso
particularmente de
polioxietileno-polioxipropilenglicol solo o en
combinación con otros tensioactivos, hace posible la preparación de
una vacuna con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG que tiene una
estabilidad de preparación superior.
El glicerofosfolípido a usar como emulsionante
(B) o emulsionante (D) puede ser, por ejemplo, fosfolípido que se
produce de manera natural tal como fosfolípido extraído y
purificado a partir de yema de huevo y habas de soja y aducto
hidrogenado de las mismas, y diversos fosfolípidos y
lisofosfolípidos sintéticos en los que la composición del resto
acilo y el resto base ha sido controlada.
En la vacuna con adyuvante de aceite tipo
AG/AC/AG de la presente invención, el componente acuoso (C)
constituye una fase acuosa que es una fase de dispersión en la
emulsión de AG/AC preparada en la Etapa 1 y constituye una fase
acuosa interior dispersada en una fase aceite que es una fase de
dispersión en la vacuna con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG
final. El componente acuoso (C) contiene diversos antígenos.
El antígeno a estar contenido en el componente
acuoso (C) puede ser de diversos tipos y puede tener diversas
formas. Más específicamente, en general se usan células
inactivadas, partículas víricas inactivadas, Micoplasma inactivado,
así como se usan factores preventivos de infección patógena, tal
como proteína de unión, antígeno de envoltura y similares para la
vacuna subunidad. Las células inactivadas pueden ser bacterias
Gram-negativas tales como Actinobacillus
pleuropneumoniae, Escherichia coli, etc., bacterias
Gram-positivas tal como Erysipelothrix coli,
etc., y similares. El virus de la partícula vírica inactivada
incluye, por ejemplo, el virus de la encefalitis japonesa y
similares. El Micoplasma del Micoplasma inactivado se ejemplifica
mediante el Micoplasma de cerdo y pollo. Como factor preventivo de
infección patógena, un ejemplo es la proteína F del virus de la
enfermedad de Newcastle. Igualmente, es posible usar una vacuna
combinada que contenga una pluralidad de antígenos.
La vacuna con adyuvante de aceite de la presente
invención puede contener, además de un antígeno, un componente
eficaz distinto del antígeno, tal como antibióticos. Ejemplos de
los antibióticos incluyen sulfato de kanamicina, hidrocloruro de
oxitetraciclina y similares.
La cantidad aceptable biológicamente y eficaz de
un antígeno en el componente acuoso (C) se determina según sea el
caso de acuerdo con el objeto y el tipo de antígeno a usar.
En la presente invención, el antígeno
anteriormente mencionado está contenido en la fase acuosa interior.
Incluso cuando una parte del antígeno pasa dentro de la fase acuosa
exterior durante el procedimiento de preparación de la vacuna con
adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG de la presente invención, no se
perjudica el efecto de la presente invención.
En la presente invención, el componente acuoso
(E) constituye la fase acuosa exterior de la vacuna con adyuvante
de aceite tipo AG/AC/AG. Más específicamente, el componente acuoso
(E) se selecciona según el caso teniendo en consideración la
estabilidad y la seguridad para el cuerpo de la vacuna con
adyuvante final. Por ejemplo, se usa solución salina fisiológica,
solución salina fisiológica tamponada con fosfato y similares.
De acuerdo con la presente invención, el derivado
de polietilenglicol contenido en la fase acuosa exterior de una
vacuna con adyuvante se expresa mediante la fórmula siguiente
(I):
R^{1}-O-(-CH_{2}-CH_{2}-O-)_{n}-R^{2}(I)
en la que R^{1} y R^{2} pueden ser iguales o
diferentes y cada uno es un átomo de hidrógeno o alquilo que tiene
1 a 4 átomos de carbono y n es un grado de polimerización.
En la fórmula (I) anteriormente mencionada, el
alquilo que tiene 1 a 4 átomos de carbono en R^{1} y R^{2}
puede ser una cadena lineal o una cadena ramificada, ejemplificada
por metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo,
isobutilo, sec-butilo y
terc-butilo. R^{1} y R^{2} adecuados son átomos
de hidrógeno, metilo y etilo en que el átomo de hidrógeno es
particularmente adecuado. Combinaciones adecuadas de R^{1} y
R^{2} son átomo de hidrógeno y átomo de hidrógeno, átomo de
hidrógeno y metilo, átomo de hidrógeno y etilo, metilo y metilo, y
similares. La combinación de átomo de hidrógeno y átomo de
hidrógeno es particularmente adecuada. La n es un grado de
polimerización que hace que el peso molecular esté comprendido
dentro del intervalo de 400-20.000.
El derivado de polietilenglicol de la fórmula (I)
anteriormente mencionada tiene un peso molecular de
400-20.000, preferiblemente
1.000-10.000, de modo particularmente preferible
3.000-9.000. Está contenido en la fase acuosa
exterior en una proporción de 0,5-20% en peso,
preferiblemente 1-10% en peso, más preferiblemente
1-5% en peso, de dicha fase.
Cuando el derivado de polietilenglicol tiene un
peso molecular menor que 400 o cuando el contenido es menor que
0,5% en peso, no puede alcanzarse un efecto reductor de la
viscosidad suficiente. Además, puede debilitarse el efecto como un
adyuvante. Cuando el peso molecular del derivado de
polietilenglicol excede de 20.000, la propia fase acuosa exterior
tiene una viscosidad incrementada, lo cual, a su vez, incrementa la
viscosidad de la vacuna con adyuvante de aceite en su conjunto,
proporcionando de esta forma un efecto reductor de la viscosidad
insuficiente. Cuando el contenido excede del 20% en peso, la fase
acuosa interior y la fase acuosa exterior muestran presiones
osmóticas completamente diferentes. Como resultado de ello, no
puede proporcionarse una emulsión de tipo AG/AC/AG estable, lo
cual, a su vez, hace que posiblemente sea inalcanzable la
preparación de una vacuna con adyuvante de aceite estable.
En la presente invención, un peso molecular más
alto del derivado de polietilenglicol anteriormente mencionado
ocasiona una viscosidad más elevada de la fase acuosa exterior, y
como resultado de lo cual la vacuna con adyuvante de aceite tiene
una viscosidad más alta. Es deseable ajustar su contenido para que
caiga dentro del intervalo anteriormente mencionado de acuerdo con
el peso molecular del derivado de polietilenglicol.
De acuerdo con la presente invención, puede
usarse un derivado de polietilenglicol, de entre los ejemplificados
anteriormente, que tenga un peso molecular dentro del intervalo de
400-20.000, o puede usarse en combinación dos o más
derivados que tengan pesos moleculares diferentes.
A la vista de la estabilidad en forma de una
preparación y un efecto adyuvante de la vacuna con adyuvante de
aceite final, un derivado de polietilenglicol tiene preferiblemente
un peso molecular de 1.000-10.000, y está contenido
en una fase acuosa exterior particularmente en una proporción de
1-10% en peso, preferiblemente 1-5%
en peso, de dicha fase.
La vacuna con adyuvante de aceite preparada de
acuerdo con la presente invención se caracteriza por un efecto
adyuvante superior y una menor viscosidad que son atribuibles al
hecho de que el derivado de polietilenglicol está presente en la
fase acuosa exterior. En general, una emulsión de tipo AG/AC/AG
muestra a menudo una viscosidad y agregación altamente incrementada
de partículas de AG/AC, debido al efecto de las substancias
contenidas en la fase acuosa interior y al hecho de que están
contenidos componentes diferentes en la fase acuosa interior y la
fase acuosa exterior. Particularmente, una solución de antígeno
utilizada para una vacuna con adyuvante de aceite podría contener
diversos ingredientes a altas concentraciones, tales como
componentes de células y componentes de medios. De acuerdo con
ello, para uso como una vacuna con adyuvante de aceite tipo
AG/AC/AG, las emulsiones de tipo AG/AC/AG que tienen la misma
composición pueden mostrar niveles demasiado drásticamente
diferentes de viscosidad y estabilidad, debido al efecto de otros
componentes en la solución de antígeno a usar. Esto plantea un
serio problema, particularmente cuando se mezclan tipos plurales de
antígenos para obtener una vacuna, y necesita ser evitado por todos
los medios durante la producción y control de una vacuna. Sin
embargo, en la presente invención un derivado de polietilenglicol
está contenido en la fase acuosa exterior con el fin de reducir la
viscosidad, independientemente de la composición o de los
componentes de la fase acuosa interior, lo cual, a su vez, supera
dicho problema. Cuando una vacuna con adyuvante de aceite tiene una
alta viscosidad, la capacidad de manipulación durante la
administración a un cuerpo se vuelve deficiente, lo cual, a su vez,
pueda dar como resultado un comportamiento de difusión más bajo en
el cuerpo y efectos adversos, tal como respuesta tópica, y vacuna
residual en un sitio de inyección. Mediante la adición de un
derivado de polietilenglicol a la fase acuosa exterior, estos
aspectos pueden ser igualmente mejorados.
Uno de los factores principales que afectan a las
propiedades del adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG es el tamaño de
partícula de la emulsión de AG/AC contenida en la fase acuosa
exterior. En términos generales, cuando el tamaño de partícula de
la emulsión de AG/AC contenida en la fase acuosa exterior es
grande, el adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG muestra un
comportamiento de un adyuvante de aceite tipo AG/AC tras la
inoculación. Esto significa que el efecto adyuvante se vuelve
mayor, pero los efectos secundarios, tal como la respuesta tópica,
se vuelven igualmente fuertes. Además, las partículas tienden a
aglomerarse, disminuyendo de esta forma la estabilidad en forma de
una preparación. Por el contrario, cuando una emulsión de AG/AC
contiene partículas relativamente más pequeñas, la preparación
tiene una estabilidad mayor, efectos secundarios reducidos y un
efecto adyuvante más débil. La vacuna con adyuvante de aceite tipo
AG/AC/AG preparada mediante la presente invención, muestra un alto
efecto inmunopotenciador, incluso cuando las partículas de la
emulsión de AG/AC son relativamente pequeñas. Así, la vacuna de la
invención muestra una estabilidad superior en forma de una
preparación, menos y más bajos niveles de efectos secundarios y
eficacia superior. A partir de los aspectos de la estabilidad en
forma de una preparación y de reducción de los efectos secundarios,
substancialmente todas las partículas de la emulsión de AG/AC que
constituyen la vacuna con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG tienen,
preferiblemente, un tamaño de partícula no mayor que 50 \mum y un
tamaño medio de partícula no mayor que 20 \mum.
El método de producción de la vacuna con
adyuvante de aceite de la presente invención no está
particularmente limitado y puede ser un método conocido. Cuando se
prepara la vacuna con adyuvante de aceite de la presente invención,
la emulsión de AG/AC preparada en la Etapa 1 contiene,
preferiblemente, un componente aceite (A) en una proporción de
30-90% en peso, preferiblemente
40-80% en peso, un emulsionante (B) en una
proporción de 1-20% en peso, preferiblemente
2-15% en peso, y un componente acuoso (C) que
contiene un antígeno, en una proporción de 5-75% en
peso, preferiblemente 15-60% en peso, todos ellos
con relación a la emulsión de AG/AC. El emulsionante (D) se usa en
la Etapa 2 en una proporción de 0,1-20% en peso,
preferiblemente 0,5-10% en peso, del total del
emulsionante (D), el componente acuoso (E) y el derivado de
polietilenglicol.
La relación de mezcladura de la emulsión de AG/AC
(preparada en la Etapa 1) y el líquido que contiene un
emulsionante (D) y un componente acuoso (E) en la Etapa 2 se
determina según sea el caso, dependiendo del objetivo o tipo de
antígeno seleccionado. Preferiblemente, la relación en peso de la
emulsión de AG/AC a un líquido que contiene un emulsionante (D) y
un componente acuoso (E) es igual a 2:1-1:10,
preferiblemente 2:1-1:5.
De acuerdo con la presente invención, se agrega
un derivado de polietilenglicol a la fase acuosa exterior mediante
la adición parcial o total del derivado de polietilenglicol de la
fórmula (I) anteriormente mencionado, el cual tiene un peso
molecular de 400-20.000, con anterioridad al líquido
anteriormente mencionado que contiene un emulsionante (D) y un
componente acuoso (E). Como alternativa, se prepara un adyuvante de
aceite tipo AG/AC/AG y se agrega el derivado de polietilenglicol
disuelto por separado en agua, solución salina fisiológica o
tampón. La cantidad del derivado de polietilenglicol a agregar es
la anteriormente mencionada.
Cuando se prepara una vacuna con adyuvante de
aceite que contiene tipos plurales de antígenos, se preparan
emulsiones de AG/AC que contienen cada tipo de antígeno en la fase
acuosa interior, se mezclan, y se dispersan en un líquido que
contiene un emulsionante (D) y un componente acuoso (E), tal como
se muestra más adelante. Como alternativa, los adyuvantes de aceite
tipo AG/AC/AG para cualquier número de antígenos se preparan y se
mezclan, tal como se menciona más adelante.
La vacuna con adyuvante de aceite de la presente
invención en forma de un producto farmacéutico puede contener
diversos aditivos que no están directamente implicados en la
actividad adyuvante, tal como agente tampón, antisépticos, agente
controlador de la presión osmótica y similares.
Para la preparación de la vacuna con adyuvante de
aceite de la presente invención, puede usarse cualquier aparato
capaz de emulsionar tanto para la preparación de una emulsión de
AG/AC que contiene un antígeno en la fase acuosa interior (Etapa
1), como para la dispersión o emulsión de la emulsión de AG/AC en
un líquido que contiene un emulsionante (D) y un componente acuoso
(E) (Etapa 2); puede usarse un aparato de emulsión típico (p. ej.,
homomezclador, homogeneizador, CLEARMIX (fabricado por M.
TECHNIQUE) y similares), un aparato de emulsión de membrana que usa
una membrana porosa, un aparato de emulsión de chorro a alta
presión y similares. En los casos necesarios, la emulsión de AG/AC
que constituye la vacuna con adyuvante de aceite de la presente
invención se hace pasar a través de un filtro de membrana para
hacer que el tamaño de partícula esté por debajo de un cierto
nivel.
Más aún, en la preparación de una vacuna, cada
componente a usar puede ser sometido a un tratamiento de
esterilización previo, dependiendo de la propiedad del mismo, tal
como esterilización por calentamiento y esterilización por
filtración.
Cuando la vacuna con adyuvante de aceite
preparada mediante la presente invención se aplica a un cuerpo, se
emplea una vía de administración adecuada, tal como inyecciones
subcutánea, intramuscular e intraperitoneal, y administración a
través de la membrana de la mucosa de la cavidad nasal y lumen
intestinal. La dosis y frecuencia de administración han de ser
determinadas adecuadamente con el fin de lograr un efecto
inmunológico deseado de acuerdo con un método típicamente empleado
en el sector pertinente.
La presente invención se explica detalladamente
con referencia a ejemplos ilustrativos.
En los Ejemplos siguientes, se usó
polietilenglicol (denominado aquí más adelante también como PEG o
Macrogol) como un derivado de polietilenglicol.
La vacuna con adyuvante de aceite usada en cada
uno de los Ejemplos siguientes se preparó mediante el método
siguiente usando CLEARMIX CLM-0.8S (M. TECHNIQUE).
La emulsión se realizó a temperatura ambiente y se usó enfriamiento
con agua cuando fue necesario. Cada componente en las
composiciones siguientes se sometió a un tratamiento de
esterilización mediante un método de esterilización adecuado. Cada
operación de agitación, emulsión, etc. se realizó bajo un ambiente
estéril. En los Ejemplos "partes" significa "partes en
peso".
En las preparaciones siguientes de vacunas con
adyuvante de aceite, la "fase acuosa exterior" significa un
líquido a mezclar con una emulsión de AG/AC para la preparación de
una vacuna con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG.
De acuerdo con la composición de
AG/AC-1 en la Tabla 1, cada componente distinto de
la suspensión de antígeno se pesó e introdujo en un vaso de
precipitados. Antes de su uso, se calentó a 50ºC y disolvió un
aceite de ricino polioxietileno hidrogenado. Se mezcló una solución
acuosa de glutamato sódico y sorbitol con sesquioleato de sorbitan
en una relación en peso de 1:1, se agitó y se agregó. El
sesquioleato de sorbitan restante se agregó tal cual. A esto, se
agregó gradualmente la suspensión de antígeno con agitación y se
mezcló mediante agitación a 12.000 rpm durante 5 min a temperatura
normal en CLEARMIX CLM-0,8S (M. TECHNIQUE) para
obtener una emulsión de tipo AG/AC (AG/AC-1).
De acuerdo con la composición de la fase acuosa
exterior 1 en la Tabla 3, cada componente se disolvió en solución
salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) (fase acuosa exterior 1).
La AG/AC-1 anteriormente mencionada (1 parte) y la
fase acuosa exterior 1 (1 parte) se pesaron en un vaso de
precipitados y se mezclaron usando un CLEARMIX
CLM-0.8S a 9.000 rpm durante 5 min con el fin de
obtener una vacuna con adyuvante de aceite 1. En los Ejemplos y
Ejemplos Comparativos siguientes la emulsión de AG/AC y la capa
acuosa exterior se mezclaron bajo las mismas condiciones que en el
Ejemplo 1 para la preparación de la vacuna, salvo que se
especifique particularmente.
La emulsión de tipo AG/AC
(AG/AC-1, 1 parte) preparada en el Ejemplo 1 y la
fase acuosa exterior 2 (1 parte) preparada de acuerdo con la
composición de la fase acuosa exterior 2 en la Tabla 3, se pesaron
y se preparó una vacuna con adyuvante de aceite 2.
De acuerdo con la composición de la
AG/AC-2 en la Tabla 1, cada componente distinto de
la suspensión de antígeno se pesó en un vaso de precipitados. Antes
de su uso, se calentó a 50ºC y se disolvió el aceite de ricino
polioxietileno hidrogenado. Previamente, el Macrogol 6000 de la
Farmacopea Japonesa se disolvió homogéneamente en la suspensión de
antígeno. Bajo las mismas condiciones que en el Ejemplo 1, se
preparó una emulsión de tipo AG/AC (AG/AC-2).
A continuación, la AG/AC-2 (3
partes) y la fase acuosa exterior 3 (2 partes) preparada de acuerdo
con la composición de la fase acuosa exterior 3 en la Tabla 3 se
pesaron y se preparó una vacuna con adyuvante de aceite 3.
De acuerdo con la composición de la fase acuosa
exterior 4 en la Tabla 3, se pesó cada componente. Los componentes
se calentaron aproximadamente a 60ºC, se mezclaron a fondo, se
dispersaron y se enfriaron a temperatura ambiente para uso como
fase acuosa exterior 4. A continuación, una emulsión de tipo AG/AC
(AG/AC-2, 1 parte) preparada en el Ejemplo 3 y fase
acuosa exterior 4 (3 partes) se pesaron, y se preparó una vacuna
con adyuvante de aceite 4.
De acuerdo con la composición de la
AG/AC-3 en la Tabla 1, cada componente distinto de
la solución de antígeno se pesó en vaso de precipitados. De la
misma manera que en el Ejemplo 1, la suspensión de antígeno se
agregó gradualmente mientras se agitaba la mezcla y se preparó una
emulsión de tipo AG/AC (AG/AC-3) de la misma manera
que en el Ejemplo 1.
A continuación, esta emulsión de tipo AG/AC
(AG/AC-3, 2 partes) y la fase acuosa exterior 2 (3
partes) se pesaron en un vaso de precipitados y se preparó una
vacuna con adyuvante de aceite 5.
La emulsión de tipo AG/AC
(AG/AC-3, 2 partes) preparada en el Ejemplo 5 y la
fase acuosa exterior 5 (2 partes) preparada de acuerdo con la
composición de la fase acuosa exterior 5 en la Tabla 4, se pesaron
y mezclaron usando un CLEARMIX CLM-8.0S a 9.000 rpm
durante 5 min para obtener una emulsión. El Macrogol 6000 de la
Farmacopea Japonesa se disolvió en PBS a la concentración de 10% en
peso y se agregó la solución resultante (1 parte). La mezcla se
agitó suavemente para obtener la vacuna con adyuvante de aceite
6.
De acuerdo con la composición de la
AG/AC-4 en la Tabla 2, cada componente distinto de
la suspensión de antígeno se pesó en un vaso de precipitados. De la
misma manera que en el Ejemplo 1, se preparó una emulsión de tipo
AG/AC (AG/AC-4) usando un CLEARMIX
CLM-0.8S.
A continuación, la AG/AC-4, (1
parte) y la fase acuosa exterior 4 (1 parte, preparada de acuerdo
con la composición de la fase acuosa exterior 4 en la Tabla 3, se
pesaron y se preparó una vacuna con adyuvante de aceite 7.
De acuerdo con la composición de la
AG/AC-5 en la Tabla 2, cada componente distinto de
la suspensión de antígeno se pesó en un vaso de precipitados. Antes
de su uso, se calentó a 60ºC y se disolvió el aceite de ricino
polioxietileno hidrogenado. La suspensión de antígeno se agregó
gradualmente con agitación y se preparó una emulsión de tipo AG/AC
(AG/AC-5) de la misma manera que en el Ejemplo
1.
A continuación, la AG/AC-5 (3
partes) y la fase acuosa exterior 2 (1 parte) se pesaron y se
preparó una vacuna con adyuvante de aceite 8.
De acuerdo con la composición de la
AG/AC-6 en la Tabla 2, cada componente distinto de
la suspensión de antígeno se pesó en un vaso de precipitados. En la
fase aceite se disolvió homogéneamente lecitina de yema de huevo y,
antes de su uso, se calentó a 60ºC y disolvió el aceite de ricino
polioxietileno hidrogenado. La suspensión de antígeno se agregó
gradualmente con agitación y se preparó una emulsión de tipo AG/AC
(AG/AC-6) de la misma manera que en el Ejemplo
1.
A continuación, la AG/AC-6 (3
partes) y la fase acuosa exterior 3 (2 partes) se pesaron y se
preparó una vacuna con adyuvante de aceite 9.
Ejemplo Comparativo
1
La AG/AC-1 (1 parte) preparada en
el Ejemplo 1 y la fase acuosa exterior 5 (1 parte) mostrada en la
Tabla 4 se pesaron y se preparó una vacuna con adyuvante de aceite
10.
Ejemplo Comparativo
2
La AG/AC-1 (1 parte) preparada en
el Ejemplo 1 y la fase acuosa exterior 6 (1 parte) mostrada en la
Tabla 4 se pesaron y se preparó una vacuna con adyuvante de aceite
11.
Ejemplo Comparativo
3
La AG/AC-2 (3 partes) preparada
en el Ejemplo 3 y la fase acuosa exterior 7 (2 partes) mostrada en
la Tabla 4 se pesaron y se preparó una vacuna con adyuvante de
aceite 12.
Ejemplo Comparativo
4
La AG/AC-3 (2 partes) preparada
en el Ejemplo 5 y la fase acuosa exterior 5 (3 partes) mostrada en
la Tabla 4 se pesaron y se preparó una vacuna con adyuvante de
aceite 13.
Ejemplo Comparativo
5
La AG/AC-4 (1 parte) preparada en
el Ejemplo 7 y la fase acuosa exterior 8 (1 parte) mostrada en la
Tabla 4 se pesaron y se preparó una vacuna con adyuvante de aceite
14.
Ejemplo Comparativo
6
La AG/AC-5 (1 parte) preparada en
el Ejemplo 8 y la fase acuosa exterior 6 (1 parte) mostrada en la
Tabla 4 se pesaron y se preparó una vacuna con adyuvante de aceite
15.
Ejemplo Comparativo
7
La AG/AC-6 (3 partes) preparada
en el Ejemplo 9 y la fase acuosa exterior 7 (2 partes) mostrada en
la Tabla 4 se pesaron y se preparó una vacuna con adyuvante de
aceite 16.
Las composiciones de las emulsiones de AG/AC
usadas para las vacunas de los Ejemplos y Ejemplos Comparativos se
muestran en las Tablas 1 y 2, las composiciones de las fases
acuosas exteriores se muestran en las Tablas 3 y 4, y las relaciones
de mezcladura de la emulsión de AG/AC y la fase acuosa exterior de
las vacunas se muestran en la Tabla 5.
Composición de la emulsión de
AG/AC-1
| Componentes agregados | Relación de mezcladura | ||
| (% en peso) | |||
| Compuesto | AG/AC-1 | AG/AC-2 | AG/AC-3 |
| Oleato de etilo | 40 | - | - |
| Escualeno | - | 55 | 20 |
| Aceite de soja purificado | - | - | 15 |
| Sesquioleato de sorbitan | 10 | 10 | 10 |
| Aceite de ricino polioxietileno (20) hidrogenado ^{*1)} | - | - | 5 |
| Componentes agregados | Relación de mezcladura | ||
| (% en peso) | |||
| Aceite de ricino polioxietileno (40) hidrogenado ^{*1)} | 5 | 3 | - |
| Monooleato de polioxietileno (20) sorbitano ^{*1)} | - | 2 | - |
| Solución de glutamato sódico y sorbitol ^{*2)} | 5 | - | - |
| Suspensión de antígeno | 40 | 29 | 50 |
| Macrogol 6000 de la Farmacopea Japonesa ^{*3)} | - | 1 | - |
| Total | 100 | 100 | 100 |
| *1) Los números entre paréntesis muestran números medios de moles de óxido de etileno agregado. | |||
| *2) Solución acuosa (100 ml) preparada disolviendo glutamato sódico monohidrato (25 g) y sorbitol | |||
| (10 g) en agua destilada. | |||
| *3) El Macrogol se disolvió previamente en la suspensión de antígeno. |
| Componentes agregados | Relación de mezcladura | ||
| (% en peso) | |||
| Compuesto | AG/AC-4 | AG/AC-5 | AG/AC-6 |
| Oleato de etilo | 40 | - | 30 |
| Escualeno | - | - | 20 |
| Miristato de isopropilo | - | 60 | - |
| Lecitina de yema purificada | - | - | 2 |
| Monooleato de glicerol | 15 | 10 | 8 |
| Aceite de ricino polioxietileno (10) hidrogenado ^{*1)} | 5 | 5 | - |
| Aceite de ricino polioxietileno (60) hidrogenado ^{*1)} | - | 5 | 5 |
| Suspensión de antígeno | 40 | 20 | 35 |
| Total | 100 | 100 | 100 |
| *1) Los números entre paréntesis muestran números medios de moles de óxido de etileno agregado. |
| Componentes agregados | Relación de mezcladura (%) | |||
| Compuesto | Fase acuosa | Fase acuosa | Fase acuosa | Fase acuosa |
| exterior 1 | exterior 2 | exterior 3 | exterior 4 | |
| Aceite de ricino polioxietileno (60) hidrogenado ^{*1)} | 2 | - | - | 2 |
| Monooleato de polioxietileno (20) sorbitan ^{*1)} | - | - | 2 | - |
| Polioxietileno (196) polipropileno (67) glicol ^{*1)} | 1 | 3 | - | - |
| Lecitina de yema purificada | - | - | - | 2 |
| Macrogol 1000 ^{*2)} | - | - | - | 1 |
| Macrogol 4000 de la Farmacopea Japonesa | - | 4 | 1 | - |
| Macrogol 6000 de la Farmacopea Japonesa | 3 | - | 1 | - |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | 94 | 93 | 96 | 95 |
| Total | 100 | 100 | 100 | 100 |
| *1) Los números entre paréntesis muestran números medios de moles de óxido de etileno agregado. | ||||
| *2) Producto aceptable como excipiente farmacéutico japonés. |
| Componentes agregados | Relación de mezcladura (%) | |||
| Compuesto | Fase acuosa | Fase acuosa | Fase acuosa | Fase acuosa |
| exterior 5 | exterior 6 | exterior 7 | exterior 8 | |
| Aceite de ricino polioxietileno (60) hidrogenado ^{*1)} | 2 | - | - | 2 |
| Monooleato de polioxietileno (20) sorbitan ^{*1)} | - | - | 2 | - |
| Polioxietileno (196) polipropileno glicol ^{*1)} (67) | 1 | 3 | - | - |
| Lecitina de yema purificada | - | - | - | 2 |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | 97 | 97 | 98 | 96 |
| Total | 100 | 100 | 100 | 100 |
| *1) Los números entre paréntesis muestran números medios de moles de óxido de etileno agregado. |
| Vacuna Nº | Emulsión de AG/AC | Fase acuosa exterior | |
| Ejemplo | Vacuna 1 | AG/AC-1 (1 parte) | Fase acuosa exterior 1 (1 parte) |
| Vacuna 2 | AG/AC-1 (1 parte) | Fase acuosa exterior 2 (1 parte) | |
| Vacuna 3 | AG/AC-2 (3 partes) | Fase acuosa exterior 3 (2 partes) | |
| Vacuna 4 | AG/AC-2 (1 parte) | Fase acuosa exterior 4 (3 partes) | |
| Vacuna 5 | AG/AC-3 (2 partes) | Fase acuosa exterior 2 (3 partes) | |
| Vacuna 6 | AG/AC-3 (2 partes) | Fase acuosa exterior 5 (2 partes) | |
| Solución de Macrogol (1 parte) ^{*1)} | |||
| Vacuna 7 | AG/AC-4 (1 parte) | Fase acuosa exterior 4 (1 parte) | |
| Vacuna 8 | AG/AC-5 (1 parte) | Fase acuosa exterior 2 (1 parte) | |
| Vacuna 9 | AG/AC-6 (3 partes) | Fase acuosa exterior 3 (partes) | |
| Ejemplo | Vacuna 10 | AG/AC-1 (1 parte) | Fase acuosa exterior 5 (1 parte) |
| Comparativo | Vacuna 11 | AG/AC-1 (1 parte) | Fase acuosa exterior 6 (1 parte) |
| Vacuna 12 | AG/AC-2 (3 partes) | Fase acuosa exterior 7 (2 partes) | |
| Vacuna 13 | AG/AC-3 (2 partes) | Fase acuosa exterior 5 (3 partes) | |
| Vacuna 14 | AG/AC-4 (1 parte) | Fase acuosa exterior 8 (1 parte) | |
| Vacuna 15 | AG/AC-5 (1 parte) | Fase acuosa exterior 6 (1 parte) | |
| Vacuna 16 | AG/AC-6 (3 partes) | Fase acuosa exterior 7 (2 partes) | |
| *1) Para detalles del método de preparación, véase el Ejemplo 6 en la memoria descriptiva. |
Ensayo de
inmunidad
Las vacunas con adyuvantes de aceite que
contenían diversos antígenos se sometieron a ensayos de inmunidad.
Los símbolos de las vacunas usadas en los respectivos Ejemplos
Experimentales corresponden a los usados en los Ejemplos y Ejemplos
Comparativos anteriormente mencionados.
Ejemplo Experimental
1
El cultivo de la cepa SE-9 de
Erysipelothrix rhusiopathiae (AMERICAN TYPE CULTURE
COLLECTION) en medio que contenía suero bovino al 5% y caldo de
infusión de cerebro y corazón (BHIB) se inactivó con formalina con
el fin de dar un antígeno. Usando el antígeno, se prepararon las
vacunas 1, 3, 5, 7, 10, 12, 14. Para la preparación, la
concentración de antígeno de cada vacuna se ajustó de manera
apropiada a 5,0 x 10^{8} UFC/ml con solución salina tamponada con
fosfato (PBS). Para cada vacuna se preparó placebo que contenía PBS
en lugar de la solución de antígeno. Cada vacuna se diluyó con el
placebo correspondiente con el fin de dar una dilución en serie de 5
veces. Como control se agregó adyuvante incompleto de Freund (AIF),
un adyuvante (AIF-PEG) en el que el PEG 1000 se
agregó a la fase acuosa interior de AIF en una proporción de 5% de
la fase acuosa interior, y se preparó una vacuna que contenía gel de
hidróxido de aluminio como un adyuvante.
Cada vacuna (o vacuna diluida) se inoculó (0,25
ml/ratón) subcutáneamente al muslo interior de ratones Clean de 5
semanas de edad (5 ratones por grupo). 3 semanas después de la
inmunización, se inyectó cepa Fujisawa de Er [Japanese Association
of Veterinary Biologics (JAVB)] subcutáneamente (2,2 x 10^{6}
UFC/0,1 ml/ratón) dentro del muslo interior de cada ratón. Después
de la inyección, se vigiló la supervivencia de los ratones durante
10 días, y se calculó el 50% de supervivencia de dilución de vacuna
múltiple que se expresó en PD_{50}. 2 semanas después de la
inmunización, se inoculó a los ratones una vacuna sin diluir y una
vacuna diluida 5 veces (10 ratones para cada formulación) y el sitio
de inyección se examinó mediante palpación con el fin de determinar
el grado de induración. El grado de induración se puntuó en 5
niveles (0: nada, 1: ligera - 4: severa) y se calculó una media para
cada formulación.
Las vacunas con adyuvantes de aceite tipo
AG/AC/AG preparadas en este tiempo se midieron con el fin de
determinar el tamaño de partícula medio mediante un analizador de
tamaño de partícula por difracción de rayos láser
SALD-2100 (SHIMADZU CORPORATION).
Los resultados de la eficacia (PD_{50}) se
resumen en la Tabla 6.
| Resultados del ensayo (ratones supervivientes/ratones ensayados) | PD_{50} | |||||||
| Vacuna sin | X | X | X | X | X | X | (veces) | |
| diluir | 5 | 25 | 125 | 625 | 3125 | 15625 | ||
| [Grupo de inmunización] | ||||||||
| Vacuna 1 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 4/5 | 3/5 | 0/5 | 2660,4 |
| Vacuna 3 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 3/5 | 2/5 | 0/5 | 1397,5 |
| Vacuna 5 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 4/5 | 2/5 | 0/5 | 1928,2 |
| Vacuna 7 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 4/5 | 1/5 | 0/5 | 1397,5 |
| [Grupo de inmunización para comparación] | ||||||||
| Vacune 10 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 2/5 | 0/5 | 0/5 | 532,1 |
| Vacuna 12 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 3/5 | 2/5 | 1/5 | 0/5 | 385,7 |
| Vacuna 14 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 3/5 | 2/5 | 0/5 | 0/5 | 279,5 |
| AIF | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 3/5 | 0/5 | 3670,7 |
| AIF-PEG | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 4/5 | 1/5 | 0/5 | 1397,5 |
| Gel de aluminio | 5/5 | 5/5 | 4/5 | 2/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 77,1 |
Los resultados se muestran en el número de
ratones supervivientes inoculados con una vacuna diluida (o una
vacuna sin diluir) y los valores de PD_{50} de las mismas. Tal
como aquí se usa, un PD_{50} más alto indica mayor eficacia. De
los grupos de inmunización, el grupo de inoculación de las vacunas
1, 3, 5 y 7 mostró un PD_{50} no inferior a 1300, lo que indica
una eficacia superior comparable a AIF. Por el contrario, el grupo
de inmunización para comparación (administrado con las vacunas 10,
12, 14 y adyuvante de gel de aluminio) mostraron valores PD_{50}
de 532,1, 385,7, 279,5 y 77,1. Es evidente que la vacuna preparada
mediante la presente invención mostró valores de PD_{50}
significativamente altos. Estos resultados han establecido que la
vacuna preparada mediante la presente invención es altamente
eficaz.
A continuación, se examinó el sitio de inyección
mediante palpación para determinar el grado de induración. El tamaño
medio de partícula de la vacuna con adyuvante de aceite tipo
AG/AC/AG se muestra en la Tabla 7 conjuntamente con el grado de
induración.
| Respuesta tópica | Tamaño medio de | |
| (media) del sitio | partícula (\mum) | |
| de inyección | ||
| [Grupo de inmunización] | ||
| Vacuna 1 | 0,1 | 6,8 |
| Vacuna 3 | 0,2 | 8,1 |
| Vacuna 5 | 0 | 7,2 |
| Vacuna 7 | 0,2 | 7,9 |
| [Grupo de inmunización para comparación] | ||
| Vacuna 10 | 0,3 | 7,5 |
| Vacuna 12 | 0,2 | 8,5 |
| Vacuna 14 | 0,8 | 8,8 |
| AIF | 3,8 | - |
| AIF-PEG | 3,2 | - |
| Gel de aluminio | 0 | - |
El grupo de inmunización apenas mostró reacción
en el sitio de inyección, demostrando, de esta forma, la alta
seguridad de la inyección, y el tamaño medio de partícula no fue
mayor que 7,2-8,1 ó 20 \mum. Por el contrario, el
grupo de inmunización para comparación mostró un tamaño medio de
partícula de la vacuna con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG casi
del mismo nivel, y la respuesta en el sitio de inyección del grupo
de inmunización, excepto AIF y AIF-PEG, fue pequeña.
Sin embargo, los ratones en los grupos de inyección AIF y
AIF-PEG desarrollaron una induración severa,
haciendo que la puntuación de la reacción fuera extremadamente
elevada, en que aproximadamente 3/4 o más de los ratones inoculados
con AIF o AIF-PEG sufrieron de alteraciones en el
modo de andar.
Los resultados anteriores establecen que la
vacuna con adyuvante aceite de la presente invención muestra una
eficacia drásticamente superior, así como una respuesta
extremadamente ligera en el sitio de inyección como con una vacuna
de gel de aluminio. La vacuna de la invención es altamente
segura.
Ejemplo Experimental
2
Las vacunas 2, 4, 6, 11 y 13 se prepararon a
partir de la cepa 92-28 de Mycoplasma
hyopneumoniae (cepa aislada de cerdo de campo; Juridical
Foundation, The
Chemo-Sero-Therapeutic Research
Institute) cultivada en medio BHL suplementado con suero de cerdo e
inactivada con formalina. Para la preparación, el contenido de
antígeno de cada vacuna se ajustó con solución salina tamponada con
fosfato (PBS) hasta la concentración de antígeno de 8,0 x 10^{8}
CCU/ml. Con el fin de que tuvieran la misma concentración de
antígeno, se ajustaron una vacuna (vacuna AL) que usa un gel de
hidróxido de aluminio ALHYDROGEL 85, Superfos, 9 g/ml de conversión
de aluminio) como un adyuvante, y una vacuna (vacuna
AL-PEG) obtenida mediante la adición de Macrogol
4000 de la Farmacopea Japonesa a un gel de hidróxido de aluminio
hasta la concentración final del 4%.
Cada vacuna (2 ml/cerdo) se inoculó dos veces a
cerdos EPE (exentos de patógeno específico) (8 cerdos/grupo, de 4
semanas de edad en el momento de la primera inmunización) dentro del
músculo cervical con 2 semanas de intervalo. Una semana después de
la segunda inmunización, se administró dentro de la tráquea material
homogeneizado de pulmón (3 x 10^{6} CCU/6 ml/cerdo) procedente de
cerdos infectados con la cepa 92-28 de Mycoplasma
hyopneumoniae (cepa aislada de cerdo de campo; Juridical
Foundation, The
Chemo-Sero-Therapeutic Research
Institute). Cuatro semanas después de la administración, los cerdos
se sometieron a autopsia, y se observó la lesión pulmonar. Las
lesiones pulmonares respectivas se puntuaron, y se calculó una
disminución (%) en la lesión para cada vacuna con relación a la
lesión de los cerdos control no imunizados.
En la Tabla 8 se muestras los resultados.
| Grupo de inmunización | Grupo de inmunización para comparación | |||||||
| Vacuna | Vacuna | Vacuna | Vacuna | Vacuna | Vacuna | Vacuna | Control | |
| 2 | 4 | 6 | 11 | 13 | AL | AL-PEG | sin inmu- | |
| nización | ||||||||
| 0 | 0 | 0 | 15,2 | 16,4 | 23,6 | 50,2 | 5,5 | |
| 1,5 | 2,0 | 0 | 0,5 | 5,5 | 15,2 | 16,5 | 11,8 | |
| 0,5 | 9,6 | 3,6 | 9,1 | 22,0 | 5,5 | 22,1 | 14,5 | |
| Puntuación de | 16,2 | 30,2 | 5,8 | 4,5 | 4,58 | 19,6 | 25,9 | 32,7 |
| la lesión | 2,6 | 5,5 | 18,6 | 14,2 | 19,5 | 56,3 | 30,6 | 15,9 |
| (cada individuo) | 9,2 | 16,3 | 20,6 | 23,0 | 23,3 | 12,4 | 11,1 | 40,2 |
| 3,5 | 1,5 | 9,6 | 38,6 | 36,2 | 28,4 | 9,1 | 25,5 | |
| 19,6 | 10,5 | 10,2 | 10,2 | 14,4 | 30 | 30 | 45,5 | |
| (Media) | 6,6 | 9,5 | 8,6 | 14,4 | 17,7 | 23,9 | 24,4 | 24,0 |
| Disminución (%) | 72,3 | 60,5 | 64,3 | 39,8 | 26,0 | 0,3 | -2,0 | - |
| en la lesión |
Los grupos de inmunización inoculados con las
vacunas 2, 4 y 6 mostraron una disminución en la lesión del 60% o
superior, lo cual establece una eficacia superior. La vacuna 6, a
la cual se agregó PEG después de la emulsión secundaria, mostró casi
el mismo efecto que los otros grupos de inmunización. Por el
contrario, los grupos de inmunización para comparación a los que se
administró las vacunas 11 y 13 mostraron una disminución en la
lesión del 39,8% y 26,0%, respectivamente, y la vacuna de gel de
aluminio no mostró en absoluto un efecto de disminución de la lesión
por parte de la vacuna, independientemente de la presencia o de otro
modo de adición de PEG.
Los efectos anteriores establecen que la vacuna
con adyuvante de aceite de la presente invención muestra efectos
superiores, incluso cuando se usa Mycoplasma como un antígeno.
Además, los resultados establecen que la adición de PEG a la fase
acuosa exterior es eficaz ya sea antes o después de la emulsión
secundaria.
Las vacunas con adyuvantes de aceite tipo
AG/AC/AG se midieron con el fin de determinar su viscosidad. La
vacuna de Erysipelothrix rhusiopathiae del cerdo (vacunas 1,
3, 5, 7, 10, 12, 14) preparadas en el Ejemplo Experimental 1
anterior, así como las vacunas respectivas preparadas de acuerdo con
las formulaciones de las vacunas 2, 4, 6, 8, 9, 11, 13, 15 y 16 y
usando Erysipelothrix rhusiopathiae del cerdo como un
antígeno se sometieron a medición, de manera que la comparación
puede hacerse con la misma formulación de suspensión de antígeno.
La viscosidad se midió una semana después de la preparación de la
vacuna, usando un viscosímetro rotatorio tipo E (TOKI SANGYO CO.,
LTD., tipo RE105H) a 25ºC. En la Tabla 9 se muestran los
resultados.
| Vacuna Nº | Viscosidad (mPa\cdots, 25ºC) | |
| Ejemplo | Vacuna 1 | 33 |
| Vacuna 2 | 28 | |
| Vacuna 3 | 42 | |
| Vacuna 4 | 35 | |
| Vacuna 5 | 31 |
| Vacuna Nº | Viscosidad (mPa\cdots, 25ºC) | |
| Vacuna 6 | 32 | |
| Vacuna 7 | 38 | |
| Vacuna 8 | 45 | |
| Vacuna 9 | 29 | |
| Ejemplo Comparativo | Vacuna 10 | 153 |
| Vacuna 11 | 161 | |
| Vacuna 12 | 206 | |
| Vacuna 13 | 187 | |
| Vacuna 14 | 470 | |
| Vacuna 15 | 396 | |
| Vacuna 16 | 315 |
Tal como se muestra en la Tabla 9, las vacunas de
los Ejemplos mostraron todas una viscosidad a 25ºC no superior a 50
mPa\cdots. La viscosidad fue muy baja y esto facilitó la
inyección. Por el contrario, las vacunas de los Ejemplos
Comparativos tenían una viscosidad no menor que 150 mPa\cdot s, lo
que exigió una fuerza y tiempo considerables de inyección.
Los resultados anteriores sugieren que la vacuna
con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG de la presente invención puede
tener una viscosidad significativamente reducida al contener un
derivado de polietilenglicol en la fase acuosa exterior, lo cual
indica que la administración de la vacuna de la invención puede
ahorrar trabajo en gran medida.
Las vacunas con adyuvantes de aceite tipo
AG/AC/AG preparadas se midieron con el fin de determinar la tasa de
inclusión. La vacuna de Mycoplasma del cerdo (vacunas 2, 4, 6, 11,
13) usadas en el Ejemplo Experimental 2 anterior, así como las
vacunas respectivas preparadas de acuerdo con las formulaciones de
las vacunas 1, 3, 5, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15 y 16 y usando dicho
Mycoplasma como un antígeno, se sometieron a la medición, de manera
que la comparación puede hacerse con la misma formulación de
suspensión de antígeno. Las vacunas preparadas se diluyeron con PBS,
se centrifugaron para separar la parte de emulsión de la fase acuosa
exterior. Éstas de recolectaron y se midió la cantidad de proteína
en la fase acuosa exterior. La cantidad de proteína en la fase
acuosa exterior se restó de la existente en la suspensión de
antígeno (que constituye la fase acuosa interior) agregada durante
la preparación de la emulsión de AG/AC, para determinar la cantidad
de la proteína retenida en la fase acuosa interior, en base a lo
cual se calculó la tasa de inclusión a partir de la fórmula
siguiente:
Tasa de inclusión (%) = [(cantidad de proteína en
la solución de antígeno agregada) - (cantidad de proteína en la fase
acuosa exterior)] / cantidad de proteína en la suspensión de
antígeno agregada
Las vacunas se almacenaron a 4ºC después de la
preparación, y la tasa de inclusión se midió al día siguiente de la
preparación de la vacuna y 3 meses después.
En la Tabla 10 se muestran los resultados de la
tasa de inclusión.
| Proporción de inclusión (%) | |||
| Al día siguien- | 3 meses después | ||
| te de la prepara- | de la prepara- | ||
| ción | ción | ||
| Ejemplo | Vacuna 1 | 98 | 97 |
| Vacuna 2 | 98 | 98 | |
| Vacuna 3 | 93 | 90 | |
| Vacuna 4 | 94 | 92 | |
| Vacuna 5 | 93 | 93 | |
| Vacuna 6 | 92 | 90 | |
| Vacuna 7 | 94 | 92 | |
| Vacuna 8 | 97 | 97 | |
| Vacuna 9 | 92 | 89 | |
| Ejemplo Comparativo | Vacuna 10 | 97 | 95 |
| Vacuna 11 | 98 | 98 | |
| Vacuna 12 | 81 | 71 | |
| Vacuna 13 | 91 | 90 | |
| Vacuna 14 | 96 | 96 | |
| Vacuna 15 | 94 | 94 | |
| Vacuna 16 | 87 | 85 |
Tanto en los Ejemplos como en los Ejemplos
Comparativos se observaron altas tasas de inclusión no menores del
70% al día siguiente de la preparación y 3 meses después de la
preparación, lo cual demuestra la superior estabilidad. En
particular, las vacunas de los Ejemplos mostraron una viscosidad
extremadamente baja tal como se muestra en la Tabla 9 y proporción
de inclusión de proteína superior.
Los resultados anteriores establecen que la
vacuna con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG de la presente
invención que tiene viscosidad drásticamente baja tiene una alta
estabilidad.
Tal como resulta evidente a partir de los
resultados mostrados en la Tabla 6 - Tabla 10, la vacuna con
adyuvante de aceite de la presente invención muestra una
característica de eficacia superior del adyuvante de aceite tipo
AG/AC y una característica de seguridad superior del adyuvante de
aceite tipo AC/AG bien compensadas. La constitución de la presente
invención, en la que un derivado de polietilenglicol específico está
contenido en la fase acuosa exterior de la vacuna con adyuvante de
aceite tipo AG/AC/AG, hace posible la preparación de una vacuna con
adyuvante de aceite útil que está libre de la influencia de los
componentes contenidos en la fase acuosa interior y que es superior
en cuanto a estabilidad y manipulabilidad de la preparación, lo
cual permite administrar fácilmente a una persona una inyección
debido a la viscosidad reducida.
La vacuna con adyuvante de aceite tipo AG/AC/AG
de la presente invención proporciona un alto efecto adyuvante y
muestra una estabilidad superior de la preparación y menos efectos
secundarios tal como respuesta tópica.
Claims (10)
1. Una vacuna con adyuvante de aceite tipo
AG/AC/AG que comprende una fase acuosa exterior que comprende
0,5-20% en peso de un derivado de polietilenglicol
que tiene un peso molecular de 400-20.000, que está
representado por la siguiente fórmula (I)
R^{1}-O-(-CH_{2}-CH_{2}-O-)_{n}-R^{2}(I)
en la que R^{1} y R^{2} pueden ser iguales o
diferentes y cada uno es un átomo de hidrógeno o alquilo que tiene 1
a 4 átomos de carbono y n es un grado de polimerización, y una fase
acuosa interior que comprende una cantidad eficaz y biológicamente
aceptable de un
antígeno.
2. La vacuna con adyuvante de aceite de la
reivindicación 1, en la que el derivado de polietilenglicol de la
fórmula (I) tiene un peso molecular de
1.000-10.000.
3. La vacuna con adyuvante de aceite de la
reivindicación 1, en la que la fase acuosa exterior comprende
1-10% en peso del derivado de polietilenglicol de la
fórmula (I).
4. La vacuna con adyuvante de aceite de la
reivindicación 1, la cual es una vacuna con adyuvante de aceite
tipo AG/AC/AG preparada mediante las etapas de:
(a) preparar una emulsión de AG/AC que comprende
un componente aceite (A) que se convierte en líquido a una
temperatura comprendida dentro del intervalo de
15-25ºC, un emulsionante (B) y un componente acuoso
(C) que comprende una cantidad eficaz y biológicamente aceptable de
un antígeno, y
(b) dispersar o emulsionar la emulsión de AG/AC
en un líquido que comprende un emulsionante (D) y un componente
acuoso (E), en el que el líquido comprende 0,5-20%
en peso de un derivado de polietilenglicol que tiene un peso
molecular de 400-20.000, que está representado por
la fórmula (I).
5. La vacuna con adyuvante de aceite de la
reivindicación 1, la cual es una vacuna con adyuvante de aceite
tipo AG/AC/AG preparada mediante las etapas de:
(a) preparar una emulsión de AG/AC que comprende
un componente aceite (A) que se convierte en líquido a una
temperatura comprendida dentro del intervalo de
15-25ºC, un emulsionante (B) y un componente acuoso
(C) que comprende una cantidad eficaz y biológicamente aceptable de
un antígeno,
(b) dispersar o emulsionar la emulsión de AG/AC
en un líquido que comprende un emulsionante (D) y un componente
acuoso (E) y,
(c) añadir un derivado de polietilenglicol que
tiene un peso molecular de 400-20.000, que está
representado por la fórmula (I), a la fase acuosa exterior a una
concentración de 0,5-20%.
6. La vacuna con adyuvante de aceite de la
reivindicación 4 o la reivindicación 5, en la que el componente
aceite (A), que se convierte en líquido a una temperatura
comprendida dentro del intervalo de 15-25ºC,
comprende un éster de ácido graso o escualeno o un éster de ácido
graso y escualeno en una proporción no inferior al 20% en peso de
una fase aceite.
7. La vacuna con adyuvante de aceite de la
reivindicación 4 o la reivindicación 5, en la que el emulsionante
(B) tiene un HLB menor que 10.
8. La vacuna con adyuvante de aceite de la
reivindicación 7, en la que el emulsionante (B) comprende al menos
un miembro seleccionado del grupo que consiste en un éster parcial
de alcohol polihídrico y un ácido graso, y un tensioactivo no
iónico que tiene una cadena de polioxietileno.
9. La vacuna con adyuvante de aceite de la
reivindicación 4 o la reivindicación 5, en la que el emulsionante
(D) tiene un HLB no menor que 10.
\newpage
10. La vacuna con adyuvante de aceite de la
reivindicación 9, en la que el emulsionante (D) comprende un
tensioactivo no iónico que tiene una cadena de polioxietileno.
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- 2004-12-17 US US11/016,389 patent/US20050158330A1/en not_active Abandoned
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