ES2278899T3 - Deteccion y cuantificacion de cripto-1. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la detección de Cripto-1 en una muestra, que comprende: a) proporcionar: i) un fluido biológico sospechoso de contener Cripto-1, ii) un anticuerpo dirigido contra dicho Cripto-1; b) exponer dicho fluido biológico a dicho anticuerpo bajo condiciones tales que dicho Cripto-1 y el anticuerpo se unen para formar un complejo antígeno-anticuerpo; y c) detectar dicho complejo de antígeno-anticuerpo.
Description
Detección y cuantificación de
Cripto-1.
La presente invención proporciona procedimientos
y composiciones para la detección y cuantificación de
Cripto-1. De manera concreta, la presente invención
proporciona procedimientos y composiciones para la detección y
cuantificación de Cripto-1 en muestras tales como
leche, plasma, suero y otros fluidos biológicos.
La Cripto-1 humana
(CR-1) es un miembro de una familia más grande de
proteínas estructuralmente relacionadas, denominada la familia
EGF-CFC que incluye CR-1 de ratón,
ratón críptico, FRL-1 de Xenopus y pez
cebra de ojo pequeño (oep) (Ciccodicola y col., EMBO J.,
8:1987-1991 [1090]; Dono y col., Develop.,
118:1157-1168 [1993]; Shen y col., Develop.,
124:428-442 [1997]: Kinoshita y col., Cell
83:621-630 [1995]; y Zhang y col., Cell
92:241-251 [1997]). Estas proteínas se caracterizan
por la presencia de un dominio similar a la EGF modificada y por un
segundo dominio rico en cisteína denominado dominio CFC (Salomón y
col., BioEssays 21:61-70 [1999]) y la Patente de
los Estados Unidos 5.792.616. Ellas comparten también una secuencia
señal convencional y un término C hidrófobo que es esencial para el
anclado a la membrana por una fracción glicosilfosfatidilinositol
(GPI) (Minchiott y col., Mech. Develop.,
90:133-142 [2000]). Los genes CR-1
humano y CR-1 de ratón codifican la glicoproteínas
de los aminoácidos 188 y 171 de manera respectiva, con pesos
moleculares de 28 y 24 kDa, de manera respectiva (Brandt y
col., J. Biol. Chem., 269: 17320-17328 [1994]).
Las proteínas EGF-CFC llevan a cabo un papel
esencial durante la embriogénesis temprana de los vertebrados
promoviendo la formación del mesodermo y la migración celular
durante la gastrulación (Zhang y col., más arriba; Gritsman
y col., Cell 97:121-132 [1999]; y Ding y
col., Nature 395: 702-707 [1998]). El ARNm de
CR-1 y la proteína inmunorreactiva se expresan en
diversas líneas celulares de cánceres de mama humanos, en
aproximadamente el 80% de los carcinomas de mama primarios y en
tumores de mama que se presentan en ratones que sobreexpresan
diferentes transgenes en la glándula mamaria tal como c-neu,
el factor \alpha de crecimiento transformante (TGF\alpha),
int-3, el gen T del políoma medio, y el gen T
grande del SV40 (Kenney ycol., Mol Carcinogen.,
15:44-56 [1996]; Qi y col., Brit. J- Cancer
69:903-910 [1994]; y Dublín y col., Int. J.
Oncol., 7:617-622 [1995]). Se puede detectar
también CR-1 en la glándula mamaria de ratón en
desarrollo con diferentes niveles de expresión, en la glándula
mamaria de virgen, de embarazada, de lactante y de anciana (Kenney
y col., Mol Reprod. Develop., 41:277-286
[1995]). En la glándula mamaria de virgen, la expresión de
CR-1 se encuentra principalmente en las células
madre del remate de las yemas de los extremos terminales en
crecimiento y la expresión de CR-1 aumenta en
varias veces en las células del epitelio ductal durante el embarazo,
la lactancia y en la glándula mamaria de anciana (Kenney y
col., Mol. Reprod. Develop., 41:277-286 [1995];
y Herrington y col., J. Cell. Physiol.,
131:215-226 [1997]). De manera adicional,
CR-1 puede modular la expresión de las proteínas de
la leche en una línea celular epitelial mamaria de ratón
(HC-11) y en cultivos primarios de explante mamario
de ratón (De Santis y col., Cell Growth Different,
8:1257-1266 [1997]). Sin embargo, a pesar de la
identificación de CR-1 en glándulas mamarias, su
papel en la salud y enfermedad del mamífero ha permanecido durante
bastante tiempo desconocido. De esta manera permanece una necesidad
en la técnica
de procedimientos que proporcionen la detección y cuantificación simple de Cripto-1 en diversos fluidos biológicos.
de procedimientos que proporcionen la detección y cuantificación simple de Cripto-1 en diversos fluidos biológicos.
La presente invención proporciona procedimientos
para la detección y cuantificación de Cripto-1. De
manera concreta, la presente invención proporciona procedimientos
para la detección y cuantificación de Cripto-1 en
muestras tales como leche (por ejemplo, leche humana) y otros
fluidos biológicos.
La presente invención proporciona procedimientos
para la detección de Cripto-1, que comprenden:
proporcionar un fluido biológico sospechoso de contener
Cripto-1, y un anticuerpo dirigido contra
Cripto-1; exponer el fluido biológico al anticuerpo
bajo condiciones tales que Cripto-1 y el anticuerpo
enlacen para formar un complejo
antígeno-anticuerpo; y detectar el complejo
antígeno-anticuerpo. En algunas formas de
realización preferidas se selecciona el fluido biológico entre el
grupo constituido por leche, suero, y plasma. En algunas formas de
realización más particularmente preferidas, el fluido biológico es
de un ser humano. En formas de realización adicionales, el
anticuerpo se selecciona entre el grupo constituido por anticuerpos
monoclonales y anticuerpos policlonales. En formas de realización
preferidas alternativas el procedimientos es un procedimiento de
ensayo inmunosorbente de enzimas ligadas. En formas de realización
más adicionales, el procedimiento comprende además la etapa de
cuantificar la cantidad de Cripto-1 en el fluido
biológico midiendo la cantidad de complejo
antígeno-anticuerpo.
La presente invención proporciona también
procedimientos para cuantificar Cripto-1 en un
fluido biológico que comprende: proporcionar un fluido biológico
que contenga Cripto-1, y un anticuerpo dirigido
contra Cripto-1; exponer el fluido biológico al
anticuerpo bajo condiciones tales que Cripto-1 y el
anticuerpo enlacen para formar un complejo
antígeno-anticuerpo; y medir la cantidad de complejo
antígeno-anticuerpo. En algunas formas de
realización preferidas, se selecciona el fluido biológico entre el
grupo constituido por leche, suero, y plasma. En algunas formas de
realización particularmente preferidas, el fluido biológico es de un
ser humano. En formas de realización adicionales, se selecciona el
anticuerpo entre el grupo constituido por anticuerpos monoclonales
y anticuerpos policlonales. En formas de realización preferidas
alternativas, el procedimiento es un procedimiento de ensayo
inmunosorbente de enzimas ligadas.
La Figura 1 proporciona los resultados del
análisis de la transferencia Western de CR-1 en 24
muestra de leche humana (ensayado en un gel
SDS-PAGE al 4-20%) y sondadas con un
anticuerpo policlonal de conejo
anti-CR-1.
La Figura 2 muestra un análisis de la
transferencia Western de CR-1 en leche humana usando
anticuerpo anti-CR-1 policlonal que
se preincubó con CR-1 recombinante. Se ensayaron
1-9 muestras de leche humana sobre un gel
SDS-PAGE al 4-20% y se sondaron con
diluciones 1:1000 de anticuerpo anti-CR1 policlonal
de conejo que se había preincubado con proteína
CR-1 recombinante (1 \mug/ml) durante 2 horas a
temperatura ambiente.
La Figura 3 proporciona los resultados del ELISA
para la detección de CR-1 en muestras de leche
humana. En estos ensayos, se recubrieron 96 pocillos de
microvaloración durante la noche con 200 \mul de muestras de
leche humana deslipidizada y se bloquearon con leche al 2%. Se
estimó el panel A que proporciona los resultados que muestran la
concentración de CR-1 en las muestras usando
diferentes concentraciones de proteína CR-1
recombinante. El panel B proporciona los resultados de las placas
incubadas con anticuerpo anti-CR-1
policlonal de conejo.
La Figura 4 proporciona los resultados de los
análisis de la transferencia Western de CR-1
inmunopurificada derivada de leche, sondada con anticuerpo
anti-CR-1 policlonal de conejo. En
este experimento, 100 ng de proteína CR-1
recombinante (hilera 1) y 40 \mul de la muestra de leche
inmunopurificada (hilera 2) se ensayaron sobre un gel
SDS-PAGE al 4-20% y tras la
transferencia para el análisis Western, se sondaron las muestras con
dilución 1:1000 de anticuerpo
anti-CR-1 policlonal de conejo.
La Figura 5 proporciona los resultados
SDS-PAGE de los experimentos que implican la
fosforilación de MAPK en células NMuMg epiteliales mamarias de
ratón inducidas por la CR-1 purificada a partir de
leche humana. Se estimularon células NMuMG privadas de suero
durante 5 minutos a 37ºC, con diferentes concentraciones de
CR-1 que se había inmunopurificado a partir de leche
humana a diversas concentraciones. Se ensayaron los lisados
celulares sobre un gel SDS-PAGE al 10%. Tras la
transferencia para el análisis Western, se sondaron las muestras
con un anticuerpo policlonal de conejo anti-fosfo
MAPK (Biolab) que reconoce las formas fosforiladas activadas de
MAPK (p44 y p42). La hilera 1 contiene las células privadas de
suero; la hilera 2 contiene 100 ng/ml de rhCR-1; la
hilera 3 contiene 50 ng/ml de CR-1 de leche; la
hilera 4 contiene 100 ng/ml de CR-1 de leche; la
hilera 5 contiene 300 ng/ml de CR-1 de leche; y la
hilera 6 contiene 500 ng/ml de CR-1 de leche.
La Figura 6 proporciona un gráfico que muestra
los resultados de OD_{450} para 28 muestras de plasma humano, que
indican la presencia de CR-1 en concentraciones
variables en estas muestras.
La presente invención proporciona los
procedimientos y composiciones para la detección y cuantificación de
Cripto-1. De manera concreta, la presente invención
proporciona los procedimientos y composiciones para la detección y
cuantificación de Cripto-1 en muestras tales como
leche, suero, plasma, y otros fluidos biológicos.
De manera adicional a los nutrientes, vitaminas
y minerales que contiene, la leche humana se compone también de una
variedad de factores de crecimiento y citoquinas que se piensa son
importantes en la regulación de las funciones del crecimiento y
secretora de la glándula mamaria y en la regulación del crecimiento,
desarrollo y maduración de la mucosa intestinal y el sistema inmune
en el recién nacido (Kidwell y col., En Atkinson y Lonnerdal
(eds), Protein and Non-Protein Nitrogen in Human
Milk, CRC Press, Boca Raton, FL [1989], pp.
77-91).
Entre los diversos factores de crecimiento
identificados en la leche humana, EGF y TGF\alpha son los factores
mitogénicos más importantes para el epitelio mamario normal
(Carpenter, Science 210:198-199 [1980]; y Okada
y col., Life Sci., 48:1540-1543 [1991]). A
este respecto, diversos estudios han demostrado que EGF y
TGF\alpha estimulan la proliferación de células epiteliales
mamarias humanas y de ratón y se contempla que su presencia en la
leche humana es fisiológicamente importante para el crecimiento
celular epitelial mamario y la diferenciación (Snedecker y
col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:1063-1069
[1991]).
Por tanto, la leche humana contiene una variedad
de diferentes proteínas y péptidos que poseen actividad biológica
(Rodríguez-Palmero y col., Clin. Perinatol.,
26:355-359 [1999]). Entre las muchas sustancias
bioactivas presentes en la leche, están un gran número de factores
de crecimiento y citoquinas (Grosvenor y col., Endocrin.
Rev., 14:710-728 [1992]). Estas incluyen insulina,
factor 1 de crecimiento similar a la insulina
(IGF-1), EGF, TGF\alpha, factor \beta 1
transformante del crecimiento (TGF-\beta 1) y
TGF-\beta 2, bombesina, factores I y II del
crecimiento mamario derivado, factor estimulante de colonias,
factores I, II y III del crecimiento de la leche humana, factor de
crecimiento derivado de las plaquetas, factor de crecimiento del
hepatocito, factor de crecimiento celular endotelial vascular,
betacelulina, factor estimulante de las colonias de granulocitos
(GSF), factor \alpha de necrosis tumoral (TNF\alpha),
interleuquina-1 (IL-1), e
interleuquina-6 (IL-6) (Grosvenor
y col., Endocrin. Rev., 14:710-728 [1992];
Scahms, Endocrin. Regul., 28:3-8 [1994]; Yamada y
col., Am. J. Reprod. Immunol., 40:112-120
[1998]; Bryan y col., Pediatr. Res.,
45:858-859 [1999]; Siafakas y col., Pediatr.
Res., 45:652-657 [1999]; Hawkes y col.,
Pediatr. Res., 46:194-199 [1999];
Donnet-Hughes y col., Immunol. Cell Biol.,
78:74-79 [2000]; Calhoun y col., Pediatr.,
105:1-6 [2000]; y Dunbar y col., Biochem. J.,
344:713-721 [1999]).
Los experimentos llevados a cabo durante el
desarrollo de la presente invención demostraron por primera vez que
un miembro de la familia EGF-CFC de péptidos,
CR-1, está presente en la leche humana. Tal como se
describe en el presente documento, se analizaron veinticuatro
muestras de leche humana para la presencia de CR-1
usando el análisis de la transferencia Western y ELISA. Se
identificó la proteína CR-1 en todas las muestras
con concentraciones entre 62 y 118 ng/ml. Se ha informado de
concentraciones similares para la EGF en leche humana (Carpenter,
Science 210:198-199 [1980]; y Okada y col.,
Life Sci., 48:1540-1543 [1991]). Desafortunadamente,
no existía información disponible en el momento en el que se
recogieron las muestras de leche tras la liberación; por tanto, no
fue posible discernir si puede existir una correlación potencial
entre la concentración de CR-1 en leche humana y un
período definido de lactancia. A este respecto, diversos factores de
crecimiento alcanzan sus concentraciones más altas en el calostro,
que caen rápidamente en el posparto y permanecen constantes hasta
el final de la lactancia (Yamada y col., Am- J- Reprod.
Immunol., 40:112-120 [1998]; Bryan y col.,
Pediatr. Res., 45:858-859 [1999]; y Read y
col., Pediatr. Res., 18:133-139 [1984].
CR-1, que se purificó a partir de leche humana
mediante cromatografía de inmunoafinidad fue diferente en tamaño de
la proteína CR-1 recombinante humana, tal como se
evaluó mediante el análisis de la transferencia Western. A este
respecto, la proteína CR-1 humana contiene un sitio
de N-glicosilación sencillo, cinco sitios
potenciales de miristilación y tres sitios consenso para la
fosforilación potencial mediante la proteína quinasa A y la proteína
quinasa C (Brand y col., J. Biol. Chem.,
269:17320-17328 [1994]. De hecho, de manera
adicional a las proteínas CR-1 humana y de ratón de
28 y 24 kDa de tamaño, se han descrito otras proteínas que oscilan
entre 14 y 60 kDa que están inmunológicamente relacionadas con la
CR-1 de ratón (Kenney y col., Mol.
Carcinogen., 15:44-56 [1996]; y Seno y col.,
Growth Factors 15:215-229 [1997]). Se contempla que
estas modificaciones postraduccionales sean responsables de la
diferencia en la movilidad de la CR-1 derivada de
leche frente a la proteína CR-1 recombinante humana.
Sin embargo, no es necesaria una comprensión del(os)
mecanismo(s) implicado(s) con el fin del uso de la
presente invención. Finalmente, la proteína CR-1
derivada de leche es biológicamente activa debido a que es capaz de
estimular la fosforilación de MAPK en las células NMuMG epiteliales
mamarias de ratón. La activación de la vía de MAPK está mediada por
el enlace de CR-1 a un receptor superficial celular
todavía desconocido (Bianco y col., J. Biol. Chem.,
274:8624-8629 [1999]).
Se contempla que la presencia de
CR-1 biológicamente activa en leche sea
fisiológicamente significativa, basándose en algunos de los efectos
biológicos de este factor de crecimiento. Por ejemplo, además de
producir un efecto mitogénico en las células epiteliales mamarias
de ratón mediante la activación de la vía ras/raf/MAPK
(Kankan y col., J. Biol. Chem.,
272:3330-3335 [1997]), CR-1 puede
modular también la diferenciación de una línea celular epitelial
mamaria de ratón (HC-11) y los cultivos primarios de
explantes mamarios de ratón establecidos a partir de ratones a
mitad de embarazo (De Santis y col., Cell Growth Different.,
8:1257-1266 [1997]). Las células
HC-11 y las células primarias epiteliales mamarias
de ratón responden a las hormonas lactogénicas dexametasona,
insulina y prolactina (DIP) expresando las proteínas de la leche
tales como la \beta-caseína y la proteína ácida
del suero (WAP). CR-1 es un inhibidor de la
expresión de la \beta-caseína y WAP en las
células HC-11 confluentes y en los cultivos
primarios estáticos de explante mamario de ratón en respuesta a las
hormonas lactogénicas. Sin embargo, en el crecimiento logarítmico de
las células HC-11, CR-1 puede
sensibilizar las células para un incremento posterior inducido por
la hormona lactogénica subsiguiente en la expresión de la
\beta-caseína (De Santis y col., Cell
Growth Different., 8:1257-1266 [1997]). El efecto
inhibidor de CR-1 sobre la expresión de la
\beta-caseína en respuesta a las DIP en las
células HC-11 está mediado a través de la
activación de p21^{ras} y de la vía dependiente de la
fosfatidilinositol 3’-quinasa. Por tanto, CR-1
tiene un efecto mitogénico o de diferenciación en las células
epiteliales mamarias de ratón dependiendo de que esté activada la
vía de la señal de transducción. De esta manera, se contempla que
CR-1 module dos respuestas diferentes en la leche
humana. Durante el embarazo, cuando la expresión de
CR-1 es elevada (Kenney y col., Mol. Reprod.
Develop., 41:277-286 [1995]; y Herrington y
col., J. Cell Physiol., 131:215-226 [1997]), se
contempla que CR-1 ejerza su efecto mitogénico sobre
el epitelio mamario, estimulando por tanto la proliferación y
diferenciación de las células epiteliales mamarias con la inducción
de las expresión de la proteína de la leche. Por contraste, durante
la lactancia, cuando la proliferación celular ha cesado, se
contempla que la CR-1 presente en la leche sea
importante en la reducción de la expresión de la proteína de la
leche y por tanto inhibiendo la diferenciación y facilitando la
involución de la glándula mamaria. Por tanto, esta función se apoya
por la demostración reciente de que CR-1 puede
inducir la apóptosis en las células HC-11
confluentes, con el factor de supervivencia disminuido (De Santis
y col., Cell Death Different., 7:189-196
[2000]. Este efecto está mediado a través de un aumento en la
expresión de una proteasa similar a la caspasa 3 y una
infrarregulación en el nivel de Bcl-x_{1} (De
Santis y col., Cell Death Different.,
7:189-196 [200]). Sin embargo, no es necesaria una
comprensión del(os) mecanismo(s) con el fin del uso de
la presente invención. Por tanto, no se pretende que la presente
invención esté limitada por ningún mecanismo particular.
De manera adicional a la regulación del
crecimiento y la morfogénesis de la glándula mamaria de ratón, se
ha demostrado que CR-1 puede ser relevante en la
patogénesis del cáncer de mama humano (Qi y col., Brit. J.
Cancer 69:903-910 [1994]; Dublín y col., Int.
J. Oncol., 7:617-622 [1995]; y Salomón y
col., Crit. Rev. Oncol. Hematol, 19:183-232
[1995]).Se ha detectado la expresión de CR-1 en
aproximadamente el 80% de los carcinomas ductales o lobulares
infiltrantes y en el 50% del carcinoma ductal in situ (Qi
y col., Brit. J. Cancer 69:903-910 [1994]).
De manera interesante, únicamente un 15% de los especímenes de
epitelio mamario adyacente no implicado fueron positivos para la
expresión de CR-1, indicando un papel para
CR-1 como marcador del tumor potencial para esta
enfermedad (Qi y col., Brit. J. Cancer
69:903-910 [1994]). Sin embargo, no se encontró
correlación significativa entre la expresión de
CR-1 y diversos parámetros clinicopatológicos, tales
como tamaño del tumor, implicación del nódulo linfático, índice
proliferativo o estatus del receptor del estrógeno y la progesterona
(Dublín y col., Int. J. Oncol., 7:617-622
[1995]). Los datos incluidos en el presente documento, que
demuestran la presencia de CR-1 en la leche humana,
indican que CR-1 expresada a niveles suficientemente
altos por los tumores de mama es liberada por las células
cancerosas y alcanza la circulación sanguínea. Por tanto, se
contempla que la detección y medida de los niveles de
CR-1 en el suero y/o el plasma humano encontrarán
significación clínica en el diagnóstico del cáncer de mama. De
hecho, se ha informado que diversos factores de crecimiento y
citoquinas diferentes están presentes en el plasma o el suero de
pacientes humanos con cáncer de mama, y sus concentraciones están
significativamente correlacionadas con la progresión de la
enfermedad y la respuesta a la quimioterapia y a la terapia
endocrina (Zhang y col., Anticancer Res.,
19:1427-1432 [1999]; Taniguchi y col., Clin.
Cancer Res., 1:1031-1034 [1995]; y Dorix y
col., Br. J. Cancer 76:238-243 [1997]). Por
tanto, se llevaron a cabo experimentos durante el desarrollo de la
presente invención para detectar la CR-1 en el
plasma humano de pacientes con cáncer de mama.
Durante el desarrollo de la presente invención,
se llevó a cabo una evaluación para determinar si el incremento en
la expresión de CR-1 que se detectó en la glándula
mamaria de ratón durante el embarazo y la lactancia se asociaba con
la secreción de este factor de crecimiento en la leche. Basándose en
estos resultados tempranos, se desarrolló la presente invención,
que proporciona los procedimientos de análisis ELISA y análisis de
la transferencia Western adecuados para la detección y la
cuantificación de CR-1 en leche humana y otras
muestras. Tal como se ha indicado en el presente documento, los
procedimientos y composiciones proporcionan los medios para
detectar una banda específica para CR-1 de 28 kDa en
muestras de leche con concentraciones entre 62 y 118 ng/ml. De
manera adicional, tal como se describe en mayor detalle en el
presente documento, la CR-1 purificada a partir de
leche humana usando una columna de inmunoafinidad, fue capaz de
estimular la fosforilación de MAPK en las células NMuMG epiteliales
mamarias de ratón.
Se analizaron veinticuatro muestras de leche
humana para la expresión de CR-1 mediante análisis
de la transferencia Western usando un anticuerpo monoespecífico
anti-CR-1 policlonal de conejo. Se
identifico una banda de 28 kDa que se hizo reaccionar con el
anticuerpo anti-CR-1 policlonal de
conejo a una intensidad variable en las muestras de leche humana
(Véase la Figura 1). Todas las muestras expresaron la
proteína CR-1 inmunorreactiva pero en diversos
grados.
Para demostrar que la banda reconocida por el
anticuerpo anti-CR-1 es específica,
se sondaron las muestras 1 a 9 con al anticuerpo
anti-CR-1 policlonal de conejo que
se había preincubado con un exceso de CR-1
recombinante. No se detectaron bandas cuando se incubaron las
muestras con el anticuerpo anti CR-1 preabsorbido
con la proteína CR-1, demostrando la especificidad
de la banda que fue reconocida por el anticuerpo
anti-CR-1 (Figura 2). Se evaluó y
cuantificó también la presencia y cantidad de CR-1
en la leche humana mediante ELISA. Usando la proteína
CR-1 recombinante como un patrón a diferentes
concentraciones, se estimó la concentración de CR-1
en las muestras de leche humana deslipidizadas. El panel A de la
Figura 3 muestra que el anticuerpo policlonal
anti-CR-1 de conejo puede detectar
de manera lineal la CR-1 humana recombinante en un
intervalo de concentración de 100 pg a 1 \mug. La
CR-1 inmunorreactiva estuvo presente a
concentraciones entre 62 y 118 ng/ml en las muestras de leche
(Véase, Figura 3, Panel B). Hubo una correlación significativa entre
las cantidades relativas de proteína inmunorreactiva
CR-1 de 28 kDa en las muestras de leche tal como se
detectó mediante análisis de la transferencia Western y la
concentración de CR-1 inmunorreactiva que se midió
en el ELISA.
Para evaluar si la CR-1 en leche
humana es biológicamente activa en las células epiteliales mamarias,
se escogió para la purificación una única muestra de leche humana
con altos niveles de expresión de CR-1 tal como se
determinó mediante el análisis de la transferencia Western y ELISA
(muestra número 2). Se purificó CR-1 a partir de
leche humana deslipidizada usando una columna de inmunoafinidad a la
cual se enlazó el anticuerpo
anti-CR-1 policlonal de conejo. Tras
la concentración, diálisis y estimación de la concentración de
CR-1 tal como se determinó mediante el análisis de
la transferencia Western (Figura 4), se evaluó la proteína
CR-1 purificada para su actividad sobre las células
NMuMG epiteliales mamarias de ratón.
Se ha demostrado previamente en diversas líneas
celulares epiteliales mamarias de ratón y ser humano que
CR-1 puede inducir un rápido aumento en la
fosforilación de la tirosina de las isoformas p66, p52 y p46 de Shc
que después pueden activar la vía ras/raf/MAPK tal como se
evidenció por la un aumento de la fosforilación de las isoformas
p42 y p44 de MAPK (Kankan y col., J. Biol. Chem.,
272:3330-3335 [1997]). Las células NMuMG
epiteliales mamarias de ratón responden a la CR-1
recombinante o sintetizada químicamente con un aumento en la
fosforilación de Shc y MAPK (Seno y col., Growth Factors
15:215-229 [1998]; y Kankan y col., más
arriba). Para determinar si la CR-1 purificada a
partir de la leche humana tenía una actividad comparable a la
CR-1 recombinante, se trató el suero privado de
células NMuMG con diferentes concentraciones de proteína
CR-1 derivada de leche inmunopurificada y se
comparó con la CR-1 humana recombinante. Se detectó
una activación dependiente de la dosis de MAPK tras el tratamiento
de las células con CR-1 derivada de leche (Véase la
Figura 5). La CR-1 humana recombinante (100 ng/ml)
fue también capaz de estimular la fosforilación de MAPK que fue casi
equivalente al nivel de estimulación de MAPK por 100 ng/l de
CR-1 derivada de leche.
Los términos "muestra" y "espécimen"
en la presente memoria y reivindicaciones se usan en el sentido más
amplio. En las formas de realización preferidas, estos términos
abarcan todos los tipos de muestras obtenidos de seres humanos y
otros animales, que incluyen, pero no se limitan a, fluidos
corporales tales como orina, sangre, fluido cerebroespinal (CSF),
materia fecal, semen, y saliva. Sin embargo, las muestras biológicas
pueden ser animales, incluyendo seres humanos, fluidos o tejidos,
de tal manera que estos ejemplos no se consideran como limitantes
de los tipos de muestra aplicables a la presente invención.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "muestra de fluido" se refiere a una muestra que es
líquida. Por ejemplo, el término abarca los fluidos corporales
(por ejemplo, "fluidos biológicos"), tales como leche,
sangre, suero, plasma, CSF, orina, semen, saliva, fluido seroso,
etc. No se pretende que la presente invención está limitada por
ningún fluido en particular.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "anticuerpo" se usa en referencia a cualquier molécula
de inmunoglobulina que reacciona con un antígeno específico. Se
pretende que el término abarque cualquier inmunoglobulina (por
ejemplo., IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc) obtenida a partir de
cualquier fuente (por ejemplo, seres humanos, roedores, primates no
humanos, lagomorfos, caprinos, bovinos, equinos, ovinos, etc.).
Tal como se usa en el presente documento, el
término "antígeno" se usa en referencia a cualquier sustancia
que es capaz de reaccionar con un anticuerpo. Se pretende que este
término abarque cualquier antígeno e "inmunógeno" (es decir,
una sustancia que induce la formación de anticuerpos). De esta
manera, en una reacción inmunógena, los anticuerpos se producen en
respuesta a la presencia de un antígeno o porción de un
antígeno.
Tal como se usan en el presente documento, los
términos "fragmento de antígeno" y "porción de un
antígeno" se usan en referencia a un trozo de un antígeno. Se
pueden producir los fragmentos o porciones de antígeno en diversos
tamaños, oscilando entre un porcentaje pequeño del antígeno completo
hasta un porcentaje grande pero no del 100% del antígeno. Sin
embargo, en situaciones en la que se especifica "al menos una
porción de antígeno", se contempla que pueda estar presente el
antígeno completo. En algunas formas de realización preferidas, los
fragmentos o porciones de antígeno comprenden un "epítope"
(por ejemplo, un "determinante antigénico") reconocido
por un anticuerpo. En otras formas de realización, los fragmentos o
porciones de antígeno son inmunogénicos (es decir, tales
fragmentos o porciones son capaces de inducir una respuesta inmune),
mientras que en otras formas de realización, los fragmentos o
porciones de antígeno no son inmunogénicos (es decir, dichos
fragmentos o porciones no son capaces de inducir una respuesta
inmune).
Tal como se usa en el presente documento, el
término "inmunoensayo" se usa en referencia a cualquier
procedimiento en el que se usan anticuerpos en la detección de un
antígeno. Se contempla que se abarquen por esta definición una
diversidad de formatos de inmunoensayos, que incluyen, pero no se
limitan a inmunoensayos directos, inmunoensayos indirectos, e
inmunoensayos "sándwich". Un formato particularmente preferido
es un ensayo inmunosorbente de enzimas ligadas (ELISA). Sin
embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a
este formato. Se contempla que otros formatos, que incluyen
radioinmunoensayos (RIA), ensayos inmunofluorescentes (IFA), y
otros formatos de ensayo, que incluyen, pero no se limitan a,
variaciones sobre el procedimiento ELISA, encontrarán uso en el
procedimiento de la presente invención. Por tanto, se contempla que
otros formatos de la reacción antígeno-anticuerpo
encontrarán uso en la presente invención, que incluyen, pero no se
limitan a la "floculación" (es decir, una suspensión
coloidal producida tras la formación de los complejos
antígeno-anticuerpo), "aglutinación" (es
decir, agrupamiento de células u otras sustancias tras la
exposición al anticuerpo), "aglutinación de partículas" (es
decir, agrupamiento de partículas recubiertas con antígeno en
presencia del anticuerpo o el agrupamiento de partículas
recubiertas con anticuerpo en presencia del antígeno), "fijación
del complemento" (es decir, el uso del complemento en un
procedimiento de reacción anticuerpo-antígeno) y
otros procedimientos comúnmente usados en serología, inmunología,
inmunohistoquímica, histoquímica, y los campos relacionados.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "tinción celular" se usa en referencia a los
procedimientos usados para marcar o teñir las células para mejorar
su visualización. Esta tinción o marcado se consigue mediante el
uso de diversos compuestos, que incluyen, pero no se limitan a,
fluorocromos, enzimas, oro, y yodo. Se contempla que la definición
abarque dichos procedimientos tales como "ensayos cromogénicos
in situ" en los que se lleva a cabo un ensayo (es decir,
un ensayo) sobre una muestra in situ. Se contempla también
que el ensayo cromogénico in situ implicará el uso de un
inmunoensayo (es decir, un ELISA) o de inmunocitohistoquímica. Sin
embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada por
ningún formato de ensayo en particular para la tinción celular.
Tal como se usan en el presente documento, el
término "captura de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo que
se usa para enlazar un antígeno y permitir por tanto el
reconocimiento del antígeno por un anticuerpo aplicado después. Por
ejemplo, en algunas formas de realización preferidas, el anticuerpo
de captura se enlaza a un pocillo de microvaloración y sirve para
enlazar los antígenos (por ejemplo, Cripto-1)
presentes en una muestra añadida al pocillo. A continuación se usa
otro anticuerpo (denominado "anticuerpo primario") para
enlazarse al complejo antígeno-anticuerpo, para
formar un "sandwich" formado por
anticuerpo-antígeno-anticuerpo. Se
puede llevar a cabo la detección de este complejo mediante diversos
procedimientos. En algunas formas de realización particularmente
preferidas, se preparó el anticuerpo primario con una marca tal como
biotina, un enzima, un marcador fluorescente, o radiactividad, y se
detectó usando directamente esta marca. De manera alternativa, se
añadió un "anticuerpo secundario" marcado o "anticuerpo
indicador" que reconocía el anticuerpo primario, formando un
complejo formado por
anticuerpo-antígeno-anticuerpo-antígeno.
De nuevo, se añaden a continuación los reactivos indicadores
apropiados para detectar el anticuerpo marcado. En otras formas de
realización se añaden cualquier número de anticuerpos adicionales
tal como se desee. En algunas formas de realización, se marcan
también estos anticuerpos con un marcador, que incluye, pero no se
limita a un enzima, marcador fluorescente, o radiactividad.
Tal como se usa en el presente documento, el
término ·"reactivo indicador" o "molécula indicadora" se
usa en referencia a los compuestos que son capaces de detectar la
presencia del anticuerpo enlazado al antígeno. Por ejemplo, en las
formas de realización preferidas, un reactivo indicador es una
sustancia colorimétrica que se liga a un sustrato enzimático. Tras
el enlace del anticuerpo y el antígeno, el enzima actúa sobre su
sustrato y produce la producción de un color. Otros reactivos
indicadores incluyen, pero no se limitan a compuestos o moléculas
fluorogénicas, cromogénicas, luminogénicas, y radiactivas. Esta
definición abarca también el uso de compuestos basados en biotina y
avidina (por ejemplo, que incluyen los compuestos pero que no
se limitan a neutravidina y estreptavidina) como parte del sistema
de detección En una forma de realización de la presente invención,
se usan anticuerpos biotinilados en conjunción con un soporte sólido
recubierto de avidina.
Tal como se usa en el presente documento el
término "señal" se usa en referencia a un indicador de que se
producido una reacción, por ejemplo, el enlace del anticuerpo al
antígeno. Se contempla que se usarán con la presente invención
señales en forma de radiactividad, reacciones fluorogénicas, y
reacciones enzimáticas. Sin embargo, no se pretende que la presente
invención esté limitada por ninguna señal concreta. En algunas
formas de realización, la señal se evalúa cuantitativa y/o
cualitativamente.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "amplificador" se usa en referencia a un sistema que
mejora la señal en un procedimiento de ensayo tal como un ELISA. Sin
embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada al
uso de amplificadores en ningún sistema o formato de ensayo
concreto.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "soporte sólido" se usa en referencia a cualquier
material sólido adecuado para la unión de diversos reactivos tales
como anticuerpos, antígenos, y/u otros compuestos. Por ejemplo, en
el procedimiento ELISA, los pocillos de placas de microvaloración
proporcionan a menudo soportes sólidos. Otros ejemplos de soportes
sólidos incluyen portaobjetos de microscopio, cubreobjetos, perlas,
partículas, matraces de cultivo celular, así como muchos otros
artículos.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "kit" se usa en referencia a una combinación de
reactivos y otros materiales. En las formas de realización
preferidas, los kits de la presente invención comprenden placas de
microvaloración, tampones, anticuerpos marcados, controles positivos
y negativos, manuales de instrucción para usuarios, etc. No se
pretende que los kits de la presente invención están limitados por
ningún componente, reactivos, etc. concretos. Por tanto, se
pretende que encontrarán uso con la presente invención diversos
formatos de kits.
Se proporcionan los siguientes ejemplos con el
fin de demostrar e ilustrar de manera adicional algunas formas de
realización preferidas y aspectos de la presente invención y no se
consideran como limitantes del alcance de la misma.
En la descripción experimental que sigue, se
aplican las siguientes abreviaturas: ºC (grados centígrados); rpm
(revoluciones por minuto); BSA (albúmina de suero bovino); CFA
(adyuvante de Freund completo); IFA(adyuvante de Freund
incompleto); IgG (Inmunoglobulina G); IM (intramuscular); IP
(intraperitoneal); IV (intravenosa o intravascular); SC
(subcutánea); H_{2}O (agua); HCl (ácido clorhídrico); aa
(aminoácido); pb (par de bases); kb (par de kilobases); KD
(kilodaltons); g (gramos); \mug (microgramos); mg (miligramos); ng
(nanogramos); \mul (microlitros); ml (mililitros); mm
(milímetros); nm (nanometros); \mum (micrómetros); M (molar); mM
(milimolar); \muM (micromolar); U (unidades); V (voltios); MW
(peso molecular); s (segundos; min(s) (minuto/minutos);
h(s) hora/horas); MgCl_{2} (cloruro de magnesio); NaCl
(cloruro de sodio); DO_{280} (densidad óptica a 280 nm);
DO_{600} (densidad óptica a 600 nm); PAGE (electroforesis en gel
de poliacrilamida); PBS (solución salina tamponada con fosfato
[NaCl 150 mM, tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 7,2]); PCR
(reacción en cadena de la polimerasa); PEG (polietilenglicol); PMSF
(fluoruro de fenilmetilsulfonilo); RT-PCR (PCR
mediante transcripción inversa); SDS (dodecil sulfato de sodio);
Tris (tris(hidroximetil)aminoetano); p/v (peso a
volumen); v/v (volumen a volumen); Amersham (Amersham Pharmacia
Biotech, Arlington Heights, IL); Pierce (Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL); ICN (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA);
Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA); ATCC (American Type Culture
Collection, Rockville, MD); Kirkergaard & Perry (Kirkergaard
& Perry Laboratorios, Gaithersburg, MD); BioRad (BioRad,
Richmond, CA); GIBCO BRL o Gibco BRL (Life Technologies, Inc.,
Gaithersburg, MD); New England Biolabs (New England Biolabs, Inc.,
Beverly, MA); Pharmacia (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ); y Sigma
(Sigma Chemical Co., San Luis, MO).
En estos experimentos, se usaron muestras de
leche humana obtenidas de 24 mujeres sanas. No están disponibles
los datos acerca del tiempo en el que se recogieron las muestras
tras la dosificación. Se centrifugaron las muestras a 14.000 rpm
durante 10 min y se recogió la capa acuosa de la leche tras la
eliminación de la capa de lípidos.
Se cultivaron células NMuMG epiteliales mamarias
de ratón normal en medio Eagle modificado de Dulbecco que contenía
suero bovino fetal al 10%. Se expresó la proteína
CR-1 humana recombinante (rhCR-1) en
E. coli y se purificó tal como se conoce en la técnica
(Véase, Seno y col., Growth Factors
15:215-229 [1998]).
En estos experimentos, se cargaron 40 \mul de
muestras de leche humana deslipidizada sobre un gel de
SDS-PAGE al 4-20% y se ensayaron
bajo condiciones de reducción. Tras la electroforesis, se
transfirieron las proteínas sobre el gel a una membrana de PVDF y
se bloquearon con leche seca al 5% en solución salina tamponada con
Tris 20 mM con tensioactivo TWEEN® al 0,05%. Se incubaron las
membranas durante la noche a 4ºC en una dilución 1:1000 de
anticuerpo anti-CR-1 policlonal de
conejo (Biocon). Se sondó una membrana en una dilución 1:1000 de
anticuerpo anti-CR-1 policlonal de
conejo que se había preincubado con CR-1
recombinante humano (1 \mug/ml) durante 2 h a temperatura
ambiente. Se detectó el anticuerpo de conejo enlazado usando una
dilución 1:2000 de IgG de anti-conejo cabra
conjugada con peroxidasa de rábano picante (Amersham) y se
detectaron las bandas inmunorreactivas mediante quimioluminiscencia
mejorada (Amersham).
Tal como se muestra en la Figura 1, se
identificó una banda de 28 kDa reactiva con el anticuerpo
anti-R1 policlonal de conejo a una intensidad
variable en las muestras de leche humana. Todas las muestras
ensayadas expresaron la proteína CR-1
inmunorreactiva pero en diversos grados.
Para demostrar que la banda reconocida por el
anticuerpo anti-CR1 es específica, se sondaron la
muestras 1 a 9 con el anticuerpo
anti-CR-1 policlonal de conejo que
se había preincubado con un exceso de CR-1
recombinante. No se detectaron bandas cuando se incubaron las
muestras con el anticuerpo anti-CR-1
preabsorbido con la proteína CR-1, lo que demuestra
la especificidad de la banda que fue reconocida por el anticuerpo
anti-CR-1 (Figura 2). Se evaluó
también la presencia y cantidad de CR-1 en la leche
humana y se cuantifico mediante ELISA, tal como se describe a
continuación en el Ejemplo 2.
En estos experimentos, se añadieron 200 \mul
de cada muestra de leche deslipidizada a placas de microvaloración
de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 4ºC. Se absorbió
también la proteína CR-1 recombinante humana a
concentraciones que oscilan entre 100 pg y 1 \mug. Se bloquearon
las placas con leche al 2% (Kirkergaard & Perry) durante 1 h a
37ºC y se incubaron en una dilución 1:3000 de anticuerpo
anti-CR-1 policlonal de conejo
(Biocon) durante 1 h a 37ºC. Tras lavar las placas 3 veces con
tampón de lavado (Kirkegaard & Perry), se añadió una dilución
1:3000 de IgG de anti-conejo de burro conjugada con
peroxidasa de rábano picante (Amersham) y se incubaron durante 1 h
a 37ºC. A continuación, las placas se lavaron cinco veces con tampón
de lavado y se añadieron a los pocillos 100 \mul de tampón con
sustrato de peroxidasa TMB (Kirkergaarg & Perry). Para permitir
el desarrollo del color, se incubaron las placas en la oscuridad
durante 5 min. Se detuvo la reacción mediante la adición de
solución de detención (Kirkergaard & Perry) y se leyó la
absorbancia a 450 nm. Se llevó a cabo el experimento por triplicado
y se repitió tres veces.
En la Figura 3 se muestran los resultados de
algunos experimentos ELISA. El Panel A de La Figura 3 proporciona
los resultados para las placas en los que se estimó la concentración
de CR-1 en las muestras usando diferentes
concentraciones de proteína CR-1 recombinante. Esta
Figura muestra que el anticuerpo
anti-CR-1 policlonal de conejo
puede detectar CR-1 humana recombinante de manera
lineal sobre un intervalo de concentración de 100 pg a 1 \mug. De
manera adicional, tal como se ha indicado en el Panel B de la Figura
3, la CR-1 inmunorreactiva estuvo presente a
concentraciones entre 62 y 118 ng/ml en las muestras de leche. Hubo
una correlación significativa entre las cantidades relativas de
proteína inmunorreactiva CR-1 de 28 kDa en las
muestras de leche tal como se detectó mediante el análisis de la
transferencia Western (tal como se ha descrito en el Ejemplo 1) y la
concentración de CR-1 inmunorreactiva que se midió
en el ELISA descrito en este Ejemplo.
Se purificó la proteína CR-1 de
la leche humana usando un kit de inmovilización AMINOLINK® Plus
(Pierce), tal como indican las instrucciones del fabricante. De
manera breve, la IgG del anti-CR-1
policlonal de conejo se acopló con el gel de acoplamiento del
AMINOLINK® Plus usando un tampón de acoplamiento de pH 10 que
contenía citrato de sodio 0,1 M y carbonato de sodio 0,05 M. A
continuación se usó la columna acoplada con al anticuerpo
anti-CR-1 para la purificación por
afinidad de CR-1 de la leche humana deslipidizada.
Se escogió para la purificación la muestra de leche humana número
2, debido a sus altos niveles de CR-1 tal como se
detectó mediante análisis de la transferencia Western (Véase
el Ejemplo 1) y mediante ELISA (Véase el Ejemplo 2).
Se aplicaron cinco ml de leche humana a la
columna y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Tras el
lavado con PBS, se eluyó la proteína CR-1 enlazada
en diversas fracciones con glicina 0,1 M pH 2,5, y se neutralizó
con Tris 1 M pH 9,5. Las fracciones que contenían la proteína se
reunieron, se concentraron con un concentrador CENTRICON® 10
(Amicon) y se dializaron frente a PBS. Se estimó la concentración de
la proteína purificada mediante análisis de la transferencia
Western usando concentraciones conocidas de CR-1
recombinante humana como patrón, tal como se ha descrito en el
Ejemplo 1. En este análisis de la transferencia Western, se
ensayaron 100 ng de proteína CR-1 recombinante
humana (hilera 1) y 40 \mul de la muestra de leche
inmunopurificada (hilera 2) sobre un gel SDS-PAGE
al 4-20% y se sondaron con una dilución 1:1000 de
anticuerpo anti-CR-1 policlonal de
conejo. En la Figura 4 se muestran los resultados.
Para ensayar la actividad de la proteína
CR-1 purificada de la leche humana, se sembraron
células NMuMG epiteliales mamarias de ratón en placas de 100 mm y
se hicieron crecer hasta que alcanzaron un 70-80% de
confluencia. A continuación se cambiaron las células a un medio de
Eagle modificado de Dulbecco libre de suero que contenía
transferrina humana (10 \mug/ml) y fetuína Pedersen de tipo IV (1
mg/ml) durante 24 h. Se estimularon las células durante 5 min a
37ºC con proteína CR-1 humana recombinante a 100
ng/ml de CR-1 que se purificó a partir de leche
humana mediante cromatografía de inmunoafinidad tal como se ha
descrito en el en el Ejemplo 2. Se lisaron las células en un tampón
que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM,
Nonidet P-40 al 1%, desoxicolato al 0,5%, MgCl_{2}
5 mM, 2 \mug/ml de aprotinina, 2 \mug/ml de leupeptina, fluoruro
de fenilmetilsulfonilo 1 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, y fluoruro
de sodio 20 mM.
Se ensayaron los lisados brutos de las proteínas
(30 \mug/muestra) sobre un gel SDS-PAGE al 10%, se
transfirieron a una membrana de PVDF, se bloquearon en una solución
preparada a partir de leche seca al 5% (Véase el Ejemplo 1) y se
incubaron con una dilución 1:1000 de un anticuerpo antifosfo MAPK
policlonal de conejo (Biolab). Tras la incubación con una IgG de
anticonejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante
(Amersham), se detectaron las bandas inmunorreactivas mediante
quimioluminiscencia mejorada (Amersham).
La Figura 5 proporciona los resultados de los
lisados celulares que se ensayaron sobre un gel
SDS-PAGE al 10% y se sondó con un anticuerpo
policlonal de conejo antifosfo MAPK (Biolab) que reconoce las formas
fosforiladas activadas de MAPK (p44 y p42). En esta Figura, la
hilera 1 contiene las células privadas de suero, la hilera 2
contiene rhCR-1 (100 ng/ml); la hilera 3 contiene la
CR-1 de leche (50 ng/ml); la hilera 4 contiene la
CR-1 de leche (100 ng/ml); la hilera 5 contiene la
CR-1 de leche (300 ng/ml); y la hilera 6 contiene la
CR-1 de leche (500 ng/ml).
Tal como se ha indicado en la Figura 5, se
detectó una activación dependiente de la dosis de MAPK tras el
tratamiento de las células con CR-1 derivada de
leche. La CR-1 recombinante humana (100 ng/ml) fue
también capaz de estimular la fosforilación de MAPK a un nivel que
fue casi equivalente al nivel de estimulación de MAPK mediante 100
ng/ml de la CR-1-derivada de
leche.
En estos experimentos, se añadieron alícuotas de
200 \mul procedentes de muestras de plasma humano obtenidas a
partir de 38 pacientes con cáncer de mama a placas de
microvaloración de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a
4ºC. Se absorbió también la proteína CR-1
recombinante humana a concentraciones que oscilaban entre 100 pg y
1 \mug. Se bloquearon las placas con solución de leche al 2%
(Kirkergaard & Perry) durante 1 h a 37ºC, y se incubaron con
una dilución 1:3000 de anticuerpo
anti-CR-1 policlonal de conejo
(Biocon) durante 1 h a 37ºC. Tras lavar las placas 3 veces con
tampón de lavado (Kirkergaard & Perry), se añadió una dilución
1:3000 de IgG de anticonejo de burro conjugada con peroxidasa de
rábano picante (Amersham) durante 1 h a 37ºC. A continuación se
lavaron las placas cinco veces con tampón de lavado y se añadieron
100 \mul de tampón con substrato de peroxidasa TMB (Kirkergaard
& Perry) a los pocillos. Para permitir el desarrollo del color,
se incubaron las placas en la oscuridad durante 5 minutos. Se detuvo
la reacción mediante la adición de una solución de detención
(Kirkergaard & Perry) y se leyó la absorbancia a 450 nm. El
experimento se llevó a cabo por triplicado y se repitió tres veces.
En la Figura 6 se muestran los resultados de estos experimentos
ELISA. Tal como se ha indicado en esta Figura, CR-1
estuvo presente en las muestras a concentraciones variables.
Diversas modificaciones y variaciones del
procedimiento descrito y sistema de la invención serán aparentes a
aquellas personas expertas en la técnica. Aunque se ha descrito la
invención en conexión con las forma de realización específicas
preferidas, deberá entenderse que tal como se reivindica la
invención, no deberá limitarse indebidamente a dichas formas de
realización específicas. Por tanto, se pretende que las diversas
modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la
invención que son obvias para aquellas personas expertas en la
técnica de los inmunoensayos, biología molecular, endocrinología y
campos relacionados estén dentro del alcance de la presente
invención.
Claims (10)
1. Un procedimiento para la detección
de Cripto-1 en una muestra, que comprende:
a) proporcionar:
- i)
- un fluido biológico sospechoso de contener Cripto-1,
- ii)
- un anticuerpo dirigido contra dicho Cripto-1;
b) exponer dicho fluido
biológico a dicho anticuerpo bajo condiciones tales que dicho
Cripto-1 y el anticuerpo se unen para formar un
complejo antígeno-anticuerpo; y
c) detectar dicho complejo de
antígeno-anticuerpo.
2. El procedimiento de la
reivindicación 1 que comprende además una etapa de cuantificación de
dicho Cripto-1 en dicho fluido biológico midiendo
la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo.
3. Un procedimiento para cuantificar
Cripto-1 en una muestra, que comprende:
a) proporcionar:
- i)
- un fluido biológico que contiene Cripto-1
- ii)
- un anticuerpo dirigido contra dicho Cripto-1;
b) exponer dicho fluido
biológico a dicho anticuerpo bajo condiciones tales que dicho
Cripto-1 y el anticuerpo se unen para formar un
complejo antígeno-anticuerpo; y
c) medir la cantidad de dicho
complejo antígeno-anticuerpo
4. El procedimiento de cualquiera de
la reivindicaciones 1-3, en el que dicho fluido
biológico es leche.
5. El procedimiento de cualquiera de
la reivindicaciones 1-3, en el que dicho fluido
biológico es suero.
6. El procedimiento de cualquiera de
las reivindicaciones 1-3, en el que dicho fluido
biológico es plasma.
7. El procedimiento de cualquiera de
las reivindicaciones 1-6, en el que dicho fluido
biológico es de un ser humano.
8. El procedimiento de cualquiera de
las reivindicaciones 1-5, en el que dicho anticuerpo
es monoclonal
9. El procedimiento de cualquiera de
la reivindicaciones 1-5, en el que dicho anticuerpo
es un anticuerpo policlonal.
10. El procedimiento de cualquiera de
las reivindicaciones 1-6, en el que dicho
procedimiento es un ensayo inmunosorbente de enzimas ligadas.
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