ES2321065T3 - Anticuerpos bloqueantes de cripto y usos de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo que se une específicamente a un epitopo de Cripto comprendido en el dominio que abarca los residuos de aminoácidos desde el aminoácido 46 al aminoácido 62 de SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO:
Description
Anticuerpos bloqueantes de Cripto y usos de los
mismos.
Esta es una continuación de US número de serie
60/367002, presentada el 22 de marzo de 2002, que es una
continuación en parte de US número de serie 60/301091, presentada
el 26 de junio de 2001, que es una continuación en parte de US
número de serie 60/293020, presentada el 17 de mayo de 2001, que es
una continuación en parte de US número de serie 60/286782,
presentada el 26 de abril de 2001.
La presente invención se refiere en general con
los campos de la genética y la biología celular y molecular. Más en
particular, la invención se refiere a anticuerpos que se unen a y
modulan la señalización de Cripto, kits que comprenden tales
anticuerpos, y métodos que usan los anticuerpos.
Cripto es una proteína de la superficie celular
de 188 residuos de aminoácidos aislada de forma fortuita en un
cribado de ADNc de una genoteca de carcinoma embrionario humano
(Ciccodicola et al., 1989, EMBO J., vol. 8, no. 7, pp.
1987-1991). La proteína Cripto tiene al menos dos
dominios notables: un dominio rico en cisteína, y un dominio
caracterizado primero como similar al dominio encontrado en la
familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF). Cripto se
clasificó inicialmente como un miembro de la familia del EGF
(Ciccodicola et al., supra); sin embargo, análisis
posteriores mostraron que Cripto no se une a ninguno de los
receptores de EGF conocidos y su dominio similar a EGF era
realmente divergente de la familia del EGF (Bianco et al.,
1999, J. Biol. Chem., 274:8624-8629).
La vía de señalización de Cripto ha permanecido
elusiva a pesar de la investigación continua, apoyando la
bibliografía la activación de varias vías diferentes, incluyendo una
vía de MAP quinasa (DeSantis et al., 1997, Cell Growth
Differ., 8:1257-1266; Kannan et al., 1997,
J. Biol. Chem., 272:3330-3335), la vía del
TGF-R (Gritsman et al., 1999, Development,
127:921-932; Schier et al., 2000, Nature,
403:385-389), posibles interacciones con la vía de
Wnt (Salomon et al., Endocr Relat Cancer. Dic 2000;
7(4):199-226; e intercomunicación con la vía
del EGF (Bianco et al., 1999, J. Biol. Chem.,
274:8624-8629).
La patente de EE.UU. 5256643 y dos solicitudes
divisionarias relacionadas con la misma (patentes de EE.UU. 5654140
y 5792616), divulgan un gen humano de Cripto, la proteína Cripto, y
anticuerpos contra Cripto.
La patente de EE.UU. 5264557 y tres solicitudes
divisionarias relacionadas con la misma (patentes de EE.UU.
5620866, 5650285 y 5854399), divulgan un gen y proteína humanos
relacionados con Cripto. También se divulgan anticuerpos que se
unen a la proteína relacionada con Cripto pero no dan reactividad
cruzada uniéndose a la proteína Cripto misma.
La sobreexpresión de la proteína Cripto se
asocia con muchos tipos de tumores (incluyendo pero no limitados a
mama, testículo, colon, pulmón, ovario, vejiga, útero, cervical,
páncreas, y estómago), como se demuestra mediante la inmunotinción
de tejido humano con anticuerpos policlonales de conejo preparados
contra péptidos pequeños de cripto. Panico et al., 1996,
Int. J. Cancer, 65: 51-56; Byrne et al.,
1998, J Pathology, 185:108-111; De Angelis et
al., 1999, Int J Oncology, 14:437-440. La
técnica por lo tanto tiene necesidad de medios de controlar,
restringir y/o prevenir tal sobreexpresión, modulando la
señalización de Cripto, y modulando las consecuencias de la
expresión de Cripto (es decir, fomento y/o mantenimiento de la
transformación celular).
La presente invención proporciona nuevos
anticuerpos que se unen específicamente a Cripto, y métodos para
hacer y usar tales anticuerpos. La invención también proporciona
anticuerpos que se unen a Cripto, y modulan la señalización o
interacción proteica de Cripto, por ejemplo, un anticuerpo que se
une a Cripto de modo que la señal resultante de una interacción
proteica se modula por descenso. La invención también proporciona
anticuerpos que se unen a Cripto y bloquean la interacción entre
Cripto y ALK4. La invención también proporciona anticuerpos que se
unen a Cripto y modulan el crecimiento tumoral. La invención
también proporciona anticuerpos que se unen a Cripto, modulan la
señalización de Cripto y modulan el crecimiento tumoral. La
invención también proporciona anticuerpos que se unen a Cripto,
bloquean la interacción entre Cripto y ALK4 y modulan el
crecimiento tumoral.
En un aspecto de la invención, el anticuerpo de
la presente invención se une específicamente a un epítopo
seleccionado del grupo de epítopos a los que se unen los
anticuerpos AlOB2.18 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC
PTA-3311) o B3F6.17 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC
PTA-3319).
En otro aspecto de la invención, el anticuerpo
de la presente invención se une específicamente a un epítopo en el
dominio de unión ligando/receptor de Cripto. Cripto se puede
seleccionar de CR-1 (SEQ ID NO: 1) ó
CR-3 (SEQ ID NO: 2).
En otra forma de realización el epítopo al que
se unen los anticuerpos de la presente invención está en el dominio
que abarca los residuos de aminoácidos 46-62 de
Cripto. Los anticuerpos que se unen específicamente al epítopo en
el dominio que abarca los residuos de aminoácidos
46-62 de Cripto incluyen pero no están limitados a
AlOB2.18 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC PTA-3311) y
B3F6.17 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC PTA-3319).
La presente invención también contempla
anticuerpos que se unen específicamente a Cripto y bloquean la
interacción entre Cripto y ALK4.
En otro aspecto, la presente invención contempla
anticuerpos que se unen específicamente a Cripto y son capaces de
modular el crecimiento tumoral.
En aún otro aspecto, la presente invención
contempla anticuerpos que se unen específicamente a Cripto, que son
capaces de modular la señalización de Cripto, y que son capaces de
modular el crecimiento tumoral.
En aún otro aspecto, la presente invención
contempla anticuerpos que se unen específicamente a Cripto, que son
capaces de bloquear la interacción entre Cripto y ALK4, y que son
capaces de modular el crecimiento tumoral.
En otra forma de realización, la presente
invención proporciona un anticuerpo producido por un hibridoma
seleccionado del grupo que consiste en AlOB2.18 (NO. DE ACCESO DE
LA ATCC PTA-3311) y B3F6.17 (NO. DE ACCESO DE LA
ATCC PTA-3319).
Los anticuerpos de la presente invención
incluyen pero no están limitados a anticuerpos monoclonales,
policlonales, humanizados, quiméricos y humanos.
La presente invención también proporciona una
composición para la administración a un sujeto que tiene un tumor
que expresa Cripto que comprende al menos uno de los anticuerpos
descritos anteriormente. En una forma de realización más particular
el sujeto es un ser humano. La composición puede incluir un
excipiente farmacéuticamente aceptable. Los anticuerpos descritos
anteriormente se pueden conjugar a un agente quimioterapéutico o
estar suministrados en combinación con un agente quimioterapéutico
no conjugado.
En otro aspecto de la invención se contemplan
métodos de modulación del crecimiento de células tumorales in
vitro en una muestra que comprende el paso de añadir a la
muestra las composiciones descritas anteriormente.
También se contemplan métodos de modular el
crecimiento de células tumorales in vivo en un sujeto que
comprende el paso de administrar al sujeto una cantidad eficaz de
las composiciones descritas anteriormente. En una forma de
realización particular el sujeto es un ser humano.
Otro aspecto de la invención son métodos de
tratar a sujetos que tienen un tumor que sobreexpresa Cripto que
comprenden administrar al sujeto las composiciones descritas
anteriormente en una cantidad eficaz. Las composiciones para
administración pueden incluir excipientes farmacéuticamente
aceptables, anticuerpos conjugados a agentes quimioterapéuticos y
anticuerpos administrados en combinación con agentes
quimioterapéuticos no conjugados.
Los métodos de la presente invención son
particularmente útiles en modular el crecimiento de células
tumorales y/o tratar un sujeto (es decir, un ser humano) que tiene
un tumor donde la célula tumoral se selecciona de células de tumor
de mama, testículo, colon, pulmón, ovario, vejiga, útero, cervical,
páncreas, y estómago.
En aún otra forma de realización, la presente
invención contempla métodos de determinar si un tejido expresa
Cripto, que comprenden el paso de analizar tejido del sujeto en un
inmunoensayo usando cualquiera de los anticuerpos descritos
anteriormente. También se contemplan métodos de determinar si una
línea celular sobreexpresa Cripto, que comprenden el paso de
analizar la línea celular en un inmunoensayo usando cualquiera de
los anticuerpos descritos anteriormente.
Estos y otros aspectos de la invención se
explican en mayor detalle a continuación en la descripción
detallada de la invención.
Se han descubierto anticuerpos que se unen
específicamente a Cripto y sus usos para modular la señalización o
interacción proteica de Cripto, y/o bloquear la interacción entre
Cripto y ALK4, y/o modular el crecimiento de células tumorales. Se
han descubierto varias clases de anticuerpos que se unen a Cripto
específicamente, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos que se unen
específicamente a un epítopo en el dominio de unión
ligando/receptor de una proteína Cripto nativa o una forma
desnaturalizada de Cripto; anticuerpos que se unen a un dominio
similar a EGF, un dominio rico en cisteína, o un péptido (por
ejemplo, desde alrededor de 3 hasta alrededor de 20 aminoácidos) de
la región que comprende los residuos de aminoácidos 46 a 150;
anticuerpos que se unen a Cripto y modulan la señalización de
Cripto; anticuerpos que se unen a Cripto y modulan el crecimiento
de células tumorales; y anticuerpos que se unen a Cripto, modulan
la señalización de Cripto, y modulan el crecimiento de células
tumorales. Estos anticuerpos se seleccionan usando ensayos
convencionales in vitro para la selección de anticuerpos que
se unen al dominio de unión ligando/receptor, modulan la
señalización de Cripto, o modulan el crecimiento de células
tumorales.
Los métodos de esta invención son útiles en la
terapia contra tumores malignos o benignos de mamíferos donde la
velocidad de crecimiento del tumor (que es una velocidad anormal
para el tejido normal) es al menos parcialmente dependiente de
Cripto. Velocidad anormal de crecimiento es una velocidad de
crecimiento que está por encima de la requerida para la homeostasis
normal y está por encima de la de tejidos normales del mismo
origen.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hacen varias definiciones a lo largo de este
documento. La mayoría de las palabras tienen el significado que se
les atribuiría a esas palabras por un experto en la materia. Las
palabras específicamente definidas bien a continuación o en otra
parte en este documento tienen el significado proporcionado en el
contexto de la presente invención como un todo y como se entienden
típicamente por los expertos en la materia.
Como se usa aquí, el término "región"
significa una parte físicamente contigua de la estructura primaria
de una biomolécula. En el caso de proteínas, una región se define
mediante una parte contigua de la secuencia de aminoácidos de esa
proteína.
Como se usa aquí, el término "dominio" se
refiere a una parte estructural de una biomolécula que contribuye a
una función conocida o sospechada de la biomolécula. Los dominios
pueden ser de la misma extensión que regiones o partes de las
mismas; los dominios también pueden incorporar una parte de una
biomolécula que es distinta de una región particular, además de
toda o parte de esa región. Los ejemplos de dominios de proteínas
incluyen, pero no están limitados al dominio extracelular (abarca
desde alrededor del residuo 31 hasta alrededor del residuo 188 de
Cripto, incluyendo Cripto, CR-1 (SEQ ID NO: 1) y
CR-3 (SEQ ID NO: 2)) y dominio transmembrana
(abarca desde alrededor del residuo 169 hasta alrededor del residuo
188 de Cripto, incluyendo Cripto, CR-1 (SEQ ID NO:
1) y CR-3 (SEQ ID NO: 2)). Un dominio de unión
ligando/receptor de la proteína Cripto abarca desde alrededor del
residuo 75 hasta alrededor del residuo 150 de Cripto, incluyendo
Cripto, CR-1 (SEQ ID NO: 1) y CR-3
(SEQ ID NO: 2) e incluye el dominio similar a EGF de Cripto que
abarca, por ejemplo, desde alrededor del residuo 75 hasta alrededor
del residuo 112 de Cripto, incluyendo Cripto, CR-1
(SEQ ID NO: 1) y CR-3 (SEQ ID NO: 2) y el dominio
rico en cisteína de Cripto, que abarca, por ejemplo, desde
alrededor del residuo 114 hasta alrededor del residuo 150 de
Cripto, incluyendo Cripto, CR-1 (SEQ ID NO: 1) y
CR-3 (SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, se han
identificado muchos anticuerpos monoclonales como que se unen a los
dominios similar a EGF o rico en cisteína. Además se han
identificado los anticuerpos monoclonales AlOB2.18 (NO. DE ACCESO
DE LA ATCC PTA-3311), B3F6.17 (NO. DE ACCESO DE LA
ATCC PTA-3319) y A17A2.16 como que se unen a un
epítopo formado en un dominio en la región que abarca los residuos
de aminoácidos 46-62, anterior al dominio similar a
EGF. Ver el ejemplo 3 más adelante. Un epítopo en el dominio de
unión ligando/receptor es un epítopo, que esté formado en la
proteína Cripto nativa conformacional o en la proteína Cripto
desnaturalizada, al que se pueden unir anticuerpos.
Como se usa aquí, el término "anticuerpo"
se pretende que se refiera a anticuerpos completos, intactos, y a
fragmentos Fab, Fab', F(ab)2, y otros fragmentos de
los mismos. Los anticuerpos completos, intactos incluyen, pero no
están limitados a, anticuerpos monoclonales tal como anticuerpos
monoclonales murinos, anticuerpos policlonales, anticuerpos
quiméricos, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados. Se
pueden producir varias formas de anticuerpos usando técnicas
estándar de ADN recombinante (Winter y Milstein, Nature 349:
293-99, 1991). Por ejemplo, se pueden construir
anticuerpos "quiméricos", en los que el dominio de unión a
antígeno de un anticuerpo animal se una a un dominio constante
humano (un anticuerpo derivado inicialmente de un mamífero no humano
en el que se ha usado la tecnología del ADN recombinante para
cambiar todo o parte de las regiones bisagra y constante de la
cadena pesada y/o la región constante de la cadena ligera, con las
regiones correspondientes de una cadena ligera o cadena pesada de
una inmunoglobulina humana) (ver, por ejemplo, Cabilly et
al., Patente de Estados Unidos 4816567; Morrison et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-55, 1984). Los
anticuerpos quiméricos reducen las respuestas inmunogénicas
provocadas por anticuerpos animales cuando se usan en tratamientos
clínicos humanos.
Además, se pueden sintetizar anticuerpos
recombinantes "humanizados". Los anticuerpos humanizados son
anticuerpos inicialmente derivados de un mamífero no humano en los
que se ha usado la tecnología del ADN recombinante para cambiar
parte o todos los aminoácidos no requeridos para la unión al
antígeno con aminoácidos de regiones correspondientes de una cadena
ligera o pesada de inmunoglobulina humana. Esto es, son quimeras
que comprenden mayoritariamente secuencias de inmunoglobulinas
humanas en las que se han insertado las regiones responsables para
la unión específica al antígeno (ver, por ejemplo, solicitud de
patente PCT WO 94/04679). Los animales se inmunizan con el antígeno
deseado, los anticuerpos correspondientes se aíslan y la parte de
las secuencias de la región variable responsable de la unión
específica al antígeno se eliminan. Las regiones de unión al
antígeno derivadas del animal se clonan después en la posición
apropiada de los genes de anticuerpos humanos en los que han
delecionado las regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos
humanizados minimizan el uso de secuencias heterólogas
(inter-especies) en anticuerpos para su uso en
terapias humanas, y es menos probable que provoquen respuestas
inmunes no deseadas. Se pueden producen anticuerpos primatizados de
forma similar.
Otra forma de realización de la invención
incluye el uso de anticuerpos humanos, que se pueden producir en
animales no humanos, tal como animales transgénicos que llevan uno
o más transgenes de inmunoglobulinas humanas. Tales animales se
pueden usar como fuente de esplenocitos para producir hibridomas,
como se describe en la patente de EE.UU. 5569825.
También se pueden usar fragmentos de anticuerpo
y anticuerpos univalentes en los métodos y composiciones de esta
invención. Los anticuerpos univalentes comprenden un dímero cadena
ligera/cadena pesada unido a la región Fc (o tallo) de una segunda
cadena pesada. "Región Fab" se refiere a aquellas partes de
las cadenas que son aproximadamente equivalentes, o análogas, a las
secuencias que comprenden las partes de las ramas de la Y de la
cadena pesada y a la cadena ligera en su totalidad, y que se ha
mostrado que colectivamente (en agregados) muestran actividad de
anticuerpo. Una proteína Fab incluye agregados de una cadena pesada
y una ligera (normalmente conocido como Fab'), así como tetrámeros
que corresponden a los dos segmentos de las ramas de la Y del
anticuerpo, (normalmente conocido como F(ab)2), que
estén cualquiera de los anteriores agregados de forma covalente o
no covalente, mientras la agregación sea capaz de reaccionar
específicamente con un antígeno o familia de antígenos
particular.
Cualquiera de los anticuerpos de la invención se
puede conjugar opcionalmente a un agente quimioterapéutico, como se
define más adelante.
Como se usa aquí, el término "unión"
significa la interacción física o química entre dos proteínas o
compuestos o proteínas o compuestos asociados o combinaciones de
los mismos, incluyendo la interacción entre un anticuerpo y una
proteína. La unión incluye interacciones iónicas, no fónicas, por
puentes de hidrógeno, de Van der Waals, hidrofóbicas, etc. La
interacción física, la unión, puede ser directa o indirecta, siendo
indirecta a través de o debido a los efectos de otra proteína o
compuesto. La unión directa se refiere a interacciones que no
tienen lugar a través de debido al efecto de otra proteína o
compuesto pero en su lugar son sin otros intermedios químicos
sustanciales. La unión se puede detectar de muchas maneras
diferentes. Los métodos para detectar la unión son conocidos para
los expertos en la materia.
Como se usa aquí, "un anticuerpo capaz de
internalizar Cripto" significa un anticuerpo que entra en la
célula al tiempo que elimina Cripto de la superficie celular. Se
puede cribar para anticuerpos contra Cripto que sean capaces de
internalizar Cripto usando anticuerpos monoclonales contra Cripto
marcados con fluorescencia. Para determinar que anticuerpos
internalizan en las células positivas para Cripto se puede ensayar
para la absorción de la señal fluorescente de los anticuerpos en
las células viendo las células en un microscopio de fluorescencia
y/o confocal. Aquellos anticuerpos que se internalizan se verán
como señales fluorescentes en las vesículas citoplásmicas o
celulares. Ejemplos no limitantes de anticuerpos anti Cripto
capaces de internalizar Cripto incluyen A27F6.1 y B3F6.17.
Como se usa aquí, el término "compuesto"
significa cualquier molécula o sustancia química identificable,
incluyendo, pero no limitado a, ión, átomo, molécula pequeña,
péptido, proteína, azúcar, nucleótido, o ácido nucleico, y tal
compuesto puede ser natural o sintético.
Como se usa aquí, los términos "modula" o
"modifica" significa un aumento o descenso en la cantidad,
calidad, o efecto de una actividad o proteína particulares.
Como se usa aquí, el término "modular la
señalización de Cripto" significa un aumento o descenso en la
cantidad, calidad o efecto de la actividad de Cripto, en alrededor
del 5%, preferiblemente del 10%, más preferiblemente del 20%, más
preferiblemente el 30%, más preferiblemente el 40%, más
preferiblemente el 50%, más preferiblemente el 60%, más
preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 80%, más
preferiblemente el 90%, y lo más preferiblemente el 100%. La
actividad se puede medir mediante ensayos conocidos en la técnica,
tal como el ensayo de células nulas mostrado en el ejemplo 3. En
otra forma de realización, la interacción proteica entre Cripto y
otra proteína se modula similarmente en descenso a través de la
unión de los anticuerpos de la invención.
Como se usa aquí, el término "bloquear la
interacción entre Cripto y ALK4" significa un aumento o descenso
en la interacción, es decir, la unión, entre Cripto y ALK4, en
alrededor del 5%, preferiblemente el 10%, más preferiblemente del
20%, más preferiblemente el 30%, más preferiblemente el 40%, más
preferiblemente el 50%, más preferiblemente el 60%, más
preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 80%, más
preferiblemente el 90%, y lo más preferiblemente el 100%. La
actividad se puede medir mediante ensayos conocidos en la técnica,
tal como el ensayo de unión mostrado en el ejemplo 8.
Como se usa aquí, el término "modular el
crecimiento de células tumorales in vitro" significa un
aumento o descenso en el número de células tumorales, in
vitro, en alrededor del 5%, preferiblemente el 10%, más
preferiblemente del 20%, más preferiblemente el 30%, más
preferiblemente el 40%, más preferiblemente el 50%, más
preferiblemente el 60%, más preferiblemente el 70%, más
preferiblemente el 80%, más preferiblemente el 90%, y lo más
preferiblemente el 100%. La modulación in vitro del
crecimiento de células tumorales se puede medir mediante ensayos
conocidos en la técnica, tal como el ensayo en agar blando de
células GEO mostrado en el ejemplo 4.
Como se usa aquí, el término "modular el
crecimiento de células tumorales in vivo" significa un
aumento o descenso en el número de células tumorales, in
vivo, en alrededor del 5%, preferiblemente el 10%, más
preferiblemente del 20%, más preferiblemente el 30%, más
preferiblemente el 40%, más preferiblemente el 50%, más
preferiblemente el 60%, más preferiblemente el 70%, más
preferiblemente el 80%, más preferiblemente el 90%, y lo más
preferiblemente el 100%. La modulación in vivo del
crecimiento de células tumorales se puede medir mediante ensayos
conocidos en la técnica, tal como el mostrado en el ejemplo 5.
El término "prevenir" se refiere a la
disminución de la probabilidad de que un organismo contraiga o
desarrolle una anomalía.
El término "tratar" se refiere a tener un
efecto terapéutico y aliviar o abrogar al menos parcialmente una
anomalía en el organismo. Tratar incluye el mantenimiento de
crecimiento tumoral inhibido, e inducción de remisión.
El término "efecto terapéutico" se refiere
a la inhibición de una anomalía. Un efecto terapéutico alivia en
algún grado uno o más de los síntomas de la anomalía. En referencia
al tratamiento de anomalías, un efecto terapéutico se puede referir
a uno o más de los siguientes: (a) un aumento o disminución en la
proliferación, crecimiento, y/o diferenciación de células; (b)
inhibición (es decir desacelerar o parar) o fomento de la muerte
celular; (c) inhibición de degeneración; (d) aliviar en algún grado
uno o más de los síntomas asociados con la anomalía; y (e) aumentar
la función de una población de células. Se pueden identificar
compuestos que demuestran eficacia contra las anomalías como se
describe aquí.
El término "administrar" se refiere a un
método de incorporar un compuesto en células o tejidos de un
organismo. La anomalía se puede prevenir o tratar cuando las
células o tejidos del organismo existen dentro del organismo o
fuera del organismo. Las células que existen fuera del organismo se
pueden mantener o hacer crecer en placas de cultivo celular, o en
otro organismo. Para las células que están en el organismo, existen
muchos métodos en la técnica para administrar compuestos,
incluyendo (pero no limitado a) aplicaciones oral, parenteral,
dérmica, en inyección, y en aerosol. Para células fuera del
organismo, existen múltiples métodos en la técnica para administrar
los compuestos, incluyendo (pero no limitado a) técnicas de
microinyección celular, técnicas de transformación y técnicas de
transportadores. La administración se puede realizar mediante los
muchos modos conocidos en la técnica, por ejemplo, oral,
intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, y similares. Cuando se
usan en terapia in vivo, los anticuerpos del objeto de la
invención se administran a un paciente en cantidades eficaces. Como
se usa aquí una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente
para llevar a cabo resultados clínicos beneficiosos o deseados (es
decir, cantidades que eliminan o reducen la carga tumoral del
paciente). Una cantidad eficaz se puede administrar en una o más
administraciones. Para los fines de esta invención, una cantidad
eficaz de los anticuerpos de la presente invención es una cantidad
de los anticuerpos que es suficiente para mejorar, estabilizar, o
retrasar el desarrollo del estado de enfermedad asociado a Cripto,
particularmente tumores asociados a Cripto. La detección y medida
de estos indicadores de eficacia se discute posteriormente. Un
ejemplo de una pauta de tratamiento típica incluye administrar
mediante infusión intravenosa al sujeto los anticuerpos de la
invención en un programa semanal, a una dosis de alrededor de
2-5 mg/kg. Los anticuerpos se administran en una
unidad de quimioinfusión ambulatoria, a menos que el paciente
requiera hospitalización. También se contemplan otras pautas de
administración conocidas.
La anomalía también se puede prevenir o tratar
administrando un anticuerpo de la invención a un grupo de células
que tienen una aberración en una vía de transducción de señales a
un organismo. El efecto de administrar un compuesto sobre la
función del organismo se puede controlar después. El organismo es
preferiblemente un ser humano.
"Sobreexpresión de Cripto" se pretende que
signifique la expresión de Cripto por un tejido cuya expresión es
mayor que la expresión de Cripto de tejido adyacente normal en una
cantidad estadísticamente significativa.
"Agentes quimioterapéuticos" se refiere a
cualquier agente identificado en la técnica como que tiene efecto
terapéutico sobre la inhibición de crecimiento tumoral,
mantenimiento del crecimiento tumoral inhibido, y/o inducción de
remisión, tal como compuestos naturales, compuestos sintéticos,
proteínas, proteínas modificadas, y compuestos radioactivos.
Los agentes quimioterapéuticos contemplados aquí
incluyen agentes que se pueden conjugar con los anticuerpos de la
presente invención o de forma alternativa agentes que se pueden
usar en combinación con anticuerpos de la presente invención sin
estar conjugados al anticuerpo. Los agentes quimioterapéuticos
ejemplares que se pueden conjugar a los anticuerpos de la presente
invención incluyen, pero no están limitados a radioconjugados (90Y,
131I, 99mTc, 111In, 186Rh, et al.), profármacos activados
por tumor (maitansinoides, análogos de CC-1065,
derivados de caliqueamicina, antraciclinas, alcaloides de la vinca,
et al.), ricina, toxina de la difteria, exotoxina de
pseudomonas.
Los agentes quimioterapéuticos se pueden usar en
combinación con los anticuerpos de la invención, más que ser
conjugados a los mismos (es decir, agentes quimioterapéuticos no
conjugados), incluyen, pero no están limitados a los siguientes:
platinos (es decir, cisplatino), antraciclinas, análogos de
nucleósidos (purina y pirimidina), taxanos, camptotecinas,
epipodofilotoxinas, agentes alquilantes de ADN, antagonistas de
folato, alcaloides de la vinca, inhibidores de la ribonucleótido
reductasa, inhibidores de estrógeno, inhibidores de progesterona,
inhibidores de andrógeno, inhibidores de aromatasa, interferones,
interleuquinas, anticuerpos monoclonales, taxol, camptosar,
adriamicina (dox), 5-FU y gemcitabina. Tales
agentes quimioterapéuticos se pueden emplear en la práctica de la
invención en combinación con los anticuerpos de la invención
mediante coadministración del anticuerpo y el agente
quimioterapéutico no conjugado.
"Soporte o excipiente farmacéuticamente
aceptable" se refiere a compuestos biológicamente inertes
conocidos en la técnica y empleados en la administración de los
anticuerpos de la invención. Los soportes aceptables son bien
conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en
Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack
Publishing Co., 1990. Los soportes aceptables pueden incluir sales
biocompatibles, inertes o bioabsorbibles, agentes tamponantes,
oligo- y polisacáridos, polímeros, compuestos viscoelásticos tal
como ácido hialurónico, agentes que mejoran la viscosidad,
conservantes, y similares.
\newpage
Un "sujeto" se refiere a vertebrados,
particularmente miembros de las especies de mamíferos e incluye
pero no está limitado a animales domésticos, animales deportivos, y
primates, incluyendo los seres humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos de la invención se unen
específicamente a Cripto: Como se usa aquí, Cripto incluye la
proteína Cripto CR-1, la proteína Cripto
CR-3, y fragmentos de las mismas. Tales fragmentos
pueden ser dominios enteros, tal como los dominios extracelular o
intracelular, el dominio similar a EGF, el dominio rico en
cisteína, el dominio de unión al receptor, y similares. Tales
fragmentos también pueden incluir epítopos contiguos y no contiguos
en cualquier dominio de la proteína Cripto.
La secuencia de 188 aminoácidos para
CR-1 es como sigue [SEQ ID NO: 1]:
La secuencia de 188 aminoácidos para
CR-3 es como sigue [SEQ ID NO: 2]:
El dominio similar a EGF abarca desde alrededor
del residuo de aminoácido 75 hasta alrededor del residuo de
aminoácido 112 de la proteína Cripto madura. Los epitopos en el
dominio similar a EGF pueden comprender extensiones lineales o no
lineales de residuos de aminoácidos. Ejemplos de epítopos lineales
contemplados incluyen pero no están limitados a alrededor de los
residuos 75-85, 80-90,
85-95, 90-100,
95-105, 100-110, ó
105-112.
El dominio rico en cisteína abarca desde
alrededor del residuo de aminoácido 114 hasta alrededor del residuo
de aminoácido 150 de la proteína Cripto madura. Los epitopos en el
dominio rico en cisteína pueden comprenden extensiones lineales o
no lineales de residuos de aminoácidos. Ejemplos de epítopos
lineales contemplados incluyen pero no están limitados a los
residuos alrededor de 114-125,
120-130, 125-135,
130-140, 135-145 ó
140-150.
Una vez se han generado los anticuerpos, la
unión de los anticuerpos a Cripto se puede ensayar usando métodos
estándar conocidos en la técnica, tal como ELISA, al tiempo que la
presencia de Cripto en la superficie celular se puede ensayar
usando citometría de flujo (FACS), como se muestra en el ejemplo 2.
Alternativamente se puede usar cualquier otra técnica de medir tal
unión.
La presente invención proporciona anticuerpos
(por ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos
de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos, anticuerpos
bifuncionales/biespecíficos, anticuerpos humanizados, anticuerpos
humanos, y anticuerpos con regiones determinantes de
complementariedad (CDR) injertadas, incluyendo compuestos que
incluyen secuencias CDR que específicamente reconocen un
polipéptido de la invención) específicos para Cripto o fragmentos
de los mismos. La invención también proporciona fragmentos de
anticuerpo, incluyendo Fab, Fab', F(ab')_{2}, y F_{v}.
Los términos "específico" y "selectivo", cuando se usan
para describir la unión de los anticuerpos de la invención, indican
que las regiones variables de los anticuerpos de la invención
reconocen y se unen a polipéptidos de Cripto. Se entenderá que los
anticuerpos específicos de la invención también pueden
interaccionar con otras proteínas (por ejemplo, proteína A de S.
aureus u otros anticuerpos en técnicas de ELISA) a través de
interacciones con secuencias fuera de la región variable de los
anticuerpos, y, en particular, en la región constante de la
molécula. Los ensayos de cribado para determinar la especificidad
de unión de un anticuerpo de la invención (es decir, anticuerpos
que se unen específicamente a un epítopo del dominio de unión
ligando/receptor y el dominio que abarca los residuos de
aminoácidos 46-62) son bien conocidos y practicados
de forma rutinaria en la técnica. Para una discusión completa de
tales ensayos, ver Harlow et al. (Eds.), Antibodies A
Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring
Harbor, NY (1988), capítulo 6. También se contemplan anticuerpos
que reconocen y se unen a fragmentos de la proteína Cripto, siempre
que los anticuerpos sean específicos para polipéptidos de Cripto.
Los anticuerpos de la invención se pueden producir usando cualquier
método bien conocido y practicado rutinariamente en la técnica.
La especificidad de los anticuerpos se describe
con mayor detalle posteriormente. Sin embargo, se debe enfatizar
que los anticuerpos que se pueden generar de otros polipéptidos que
se han descrito previamente en la bibliografía y que son capaces de
dar reactividad cruzada fortuita con Cripto (por ejemplo, debido a
la existencia fortuita de un epítopo similar en ambos polipéptidos)
se consideran "anticuerpos transreactivos". Tales anticuerpos
transreactivos no son anticuerpos que sean "específicos" para
Cripto. La determinación de si un anticuerpo se une específicamente
a un epitopo de Cripto se hace usando cualquiera de varios ensayos,
tal como ensayos de inmunotransferencia, que son bien conocidos en
la técnica. Para identificar células que expresan Cripto y también
para modular la actividad de unión ligando/receptor de Cripto, los
anticuerpos que se unen específicamente a un epitopo extracelular
de la proteína Cripto (es decir, partes de la proteína Cripto que
se encuentran fuera de la célula) son particularmente útiles.
En una forma de realización, la invención
proporciona una composición libre de células que comprende
anticuerpos policlonales, en donde al menos uno de los anticuerpos
es un anticuerpo de la invención específico para Cripto. Los
antisueros aislados de un animal es una composición de ejemplo,
como es una composición que comprende una fracción de anticuerpo de
un antisuero que se ha resuspendido en agua o en otro diluyente,
excipiente, o soporte.
En otra forma de realización, la invención
proporciona anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales
son muy específicos, están dirigidos contra un sitio antigénico
individual. Además en contraste con las preparaciones policlonales
que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra
diferentes epítopos, cada anticuerpo monoclonal está dirigido
contra un determinante individual en el antígeno. Los anticuerpos
monoclonales son útiles para mejorar la selectividad y
especificidad de métodos de ensayo diagnóstico y analítico usando
la unión antígeno-anticuerpo. Otra ventaja de los
anticuerpos monoclonales es que se sintetizan mediante un cultivo
de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. Los
hibridomas que producen tales anticuerpos también se pretende que
sean aspectos de la invención.
En aún otra forma de realización relacionada, la
invención proporciona un anticuerpo anti-idiotípico
específico para un anticuerpo que es específico para Cripto. Para
una discusión más detallada de los anticuerpos
anti-idiotípicos, ver por ejemplo las patentes de
EE.UU. 6063379 y 5780029.
Es bien sabido que los anticuerpos contienen
dominios de unión al antígeno relativamente pequeños que se pueden
aislar de forma química o mediante técnicas recombinantes. Tales
dominios son en Si mismos moléculas de unión a Cripto útiles, y
también se pueden reintroducir en anticuerpos humanos, o fusionar a
un agente quimioterapéutico o polipéptido. De esta manera, en aún
otra forma de realización, la invención proporciona un polipéptido
que comprende un fragmento de un anticuerpo específico para Cripto,
en donde el fragmento y la molécula asociada, si hay alguna, se
unen a Cripto. A modo de ejemplo no limitante, la invención
proporciona polipéptidos que son anticuerpos de cadena sencilla y
anticuerpos con CDR injertada. Para una discusión más detallada de
los anticuerpos con CDR injertada, ver por ejemplo, la patente de
EE.UU. 5859205.
En otra forma de realización, los anticuerpos no
humanos se pueden humanizar mediante cualquiera de los métodos
conocidos en la técnica. Los anticuerpos humanizados son útiles
para aplicaciones terapéuticas in vivo. Además, se pueden
sintetizar anticuerpos recombinantes "humanizados". Los
anticuerpos humanizados son anticuerpos inicialmente derivados de
un mamífero no humano en los que se ha usado la tecnología de ADN
recombinante para sustituir algunos o todos de los aminoácidos no
requeridos para la unión al antígeno con aminoácidos de las
regiones correspondientes de un cadena ligera o pesada de
inmunoglobulina humana. Es decir, son quimeras que comprenden
mayoritariamente secuencias de inmunoglobulina humana en las que se
han insertado las regiones responsables para la unión específica al
antígeno (ver, por ejemplo solicitud de patente PCT WO 94/04679).
Los animales se inmunizan con el antígeno deseado, los anticuerpos
correspondientes se aíslan y las partes de las secuencias de las
regiones variables responsables de la unión específica al antígeno
se eliminan. Las regiones de unión al antígeno derivadas del animal
se clonan entonces en la posición adecuada de los genes de
anticuerpos humanos en los que se han delecionado las regiones de
unión al antígeno. Los anticuerpos humanizados minimizan el uso de
secuencias heterólogas (inter-especie) en
anticuerpos para su uso en terapias humanas, y es menos probable
que provoquen respuestas inmunes no deseadas. De forma similar se
pueden producir anticuerpos primatizados usando genes de anticuerpos
de primates (por ejemplo, rhesus, babuino y chimpancé). Se pueden
introducir después cambios adicionales en el marco del anticuerpos
para modular la afinidad o inmunogenicidad. Ver, por ejemplo, las
patentes de EE.UU. Nos. 5585089, 5693761, 5693762, y 6180370.
Otra forma de realización de la invención
incluye el uso de anticuerpos humanos, que se pueden producir en
animales no humanos, tal como animales transgénicos que llevan uno
o más transgenes de inmunoglobulinas humanas. Tales animales se
pueden usar como fuente de esplenocitos para producir hibridomas,
como se describe en la patente de Estados Unidos 5569825,
WO00076310, WO00058499 y WO00037504.
En otra forma de realización, los anticuerpos de
la invención se unen a Cripto, y modulan la señalización de Cripto
o las interacciones proteicas de Cripto. La sobreexpresión de la
actividad Cripto puede producir un estado desdiferenciado que
fomenta las características de célula mesenquimatosa, proliferación
aumentada, y migración celular (Salomon et al., BioEssays
21: 61-70, 1999; Ciardiello et al., Oncogene
9: 291-298, 1994; y Baldassarre et al., Int.
J. Cancer 66:538-543, 1996), fenotipos asociados
con las transformación celular vista en neoplasia.
Un método de probar la actividad de los
anticuerpos anti-Cripto y su capacidad para modular
la señalización de Cripto es una línea celular
F9-deficiente en Cripto (Minchiotti et al.,
Mech. Dev. 90: 133-142, 2000). Cripto estimula la
fosforilación de smad2 y el factor de transcripción FAST en
embriones de Xenopus, y la actividad del factor de transcripción
FAST se puede controlar midiendo la actividad luciferasa de un gen
indicador luciferasa con un elemento regulador de FAST (Saijoh
et al., Mol. Cell 5:35-47, 2000). A las
células F9-decifientes en Cripto se les delecionado
el gen de Cripto y por lo tanto son nulas para Cripto y la
señalización dependiente de Cripto (Minchiotti et al., Mech.
Dev. 90: 133-142, 2000). La señalización de Cripto
se puede ensayar en las células F9 deficientes en Cripto
transfectando Cripto, FAST y la construcción elemento regulador
FAST-gen de luciferasa. No se verá actividad
luciferasa por FAST dependiente de Cripto en estas líneas celulares
a menos que se transfecte en ellas el ADNc de Cripto y el ADNc de
FAST. Los anticuerpos capaces de bloquear la señalización de Nodal
dependiente de Cripto son anticuerpos que bloquean la función de
señalización de Cripto.
Los expertos en la materia pueden emplear otros
ensayos capaces de medir la actividad de Cripto, tal como el ensayo
de crecimiento en agar blando (ver el ejemplo 4 más adelante). La
capacidad de las células de crecer en agar blando está asociada con
la transformación celular y el ensayo es un ensayo clásico in
vitro para medir la inhibición del crecimiento de células
tumorales. Otros ensayos útiles en determinar la inhibición de la
actividad incluyen ensayos in vitro en plástico, y
similares.
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Los anticuerpos de la invención también son
útiles para fines terapéuticos, tal como modulación de crecimiento
de células tumorales, fines diagnósticos para detectar o
cuantificar Cripto, y purificación de Cripto.
En una forma de realización de la invención, se
proporcionan anticuerpos que son capaces de unirse específicamente
a Cripto y que modulan el crecimiento de células tumorales en un
paciente. En una forma de realización, las células tumorales son
células de tumor de testículo, mama, testículo, colon, pulmón,
ovario, vejiga, útero, cervical, páncreas y estómago.
En otra forma de realización, se proporcionan
anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a Cripto y
que modulan el crecimiento de células tumorales que sobreexpresan
Cripto. En una forma de realización, las células tumorales, son
líneas celulares que sobreexpresan Cripto, tal como líneas
celulares derivadas de cáncer de mama, testículo, colon, pulmón,
ovario, vejiga, útero, cervical, páncreas y estómago.
Se pueden cribar anticuerpos
anti-Cripto para actividad in vivo como
potenciales agentes anticancerosos siguiendo protocolos estándar
usados por los expertos en la materia, como se ilustra en el
ejemplo 4 posteriormente. El Instituto Nacional del Cáncer (NCI) da
ejemplos de tales protocolos en sus protocolos de "cribado de
modelos de cáncer in vivo", publicación del NIH número
84-2635 (febrero 1984).
En otra forma de realización de la invención,
los anticuerpos de la invención se usan para tratar a un paciente
que tiene un tumor canceroso.
Los anticuerpos de la presente invención se
pueden combinar con un excipiente farmacéuticamente aceptable y
administrar al paciente en una dosis terapéuticamente eficaz. Para
una discusión de los métodos de inhibir el crecimiento de tumores,
ver, por ejemplo, la patente de EE.UU. 6165464.
También se contemplan métodos de tratar a un
sujeto que padece un trastorno asociado con niveles anormales (es
decir, elevados o disminuidos) de Cripto en donde el método
comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un
anticuerpo que se une específicamente a un epítopo de Cripto.
También se contemplan métodos de tratar a un
sujeto que padece un trastorno asociado con niveles anormales (es
decir, elevados o disminuidos) de Cripto en donde el método
comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un
anticuerpo que específicamente forma un complejo con Cripto y está
dirigido al epitopo al que se dirige un anticuerpo seleccionado del
grupo que consiste en AlOB2.18 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC
PTA-3311) y B3F6.17 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC
PTA-3319).
El diagnóstico a través de la detección Cripto
se lleva a cabo fácilmente mediante ensayos de unión estándar
usando los anticuerpos nuevos de la invención, que permiten a los
expertos en la materia detectar la presencia de Cripto
específicamente en un amplia variedad de muestras, cultivos, y
similares.
También están comprendidos kits que comprenden
un anticuerpo de la invención para cualquiera de los fines
descritos aquí. En general, un kit de la invención también incluye
un antígeno control para el que el anticuerpo es inmunoespecífico.
Las formas de realización incluyen kits que comprenden todos los
reactivos e instrucciones para el uso de los mismos.
Las características adicionales de la invención
serán aparentes a partir de los siguientes ejemplos
ilustrativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un plásmido de expresión designado
pSGS480 mediante subclonación de un ADNc que codifica los residuos
de aminoácidos de Cripto humana 1 a 169 de Cripto [aminoácidos
1-169 de SEQ ID NO: 1], fusionada al dominio Fc de
la IgG_{1} humana (es decir, "CR(del
C)-Fc") en el vector pEAG1100. Para una
descripción más detallada de este vector, ver la solicitud de
patente de EE.UU., en tramitación junto a esta, No. de serie
60/233148, presentada el 18 de septiembre de 2000. El vector
pEAG1100 es un derivado del plásmido
pCMV-Sport-betagal de
GIBCO-BRL Life Techonologies, cuyo uso en
transfecciones transitorias en CHO fue descrito por Schifferli
et al., 1999, Focus 21: 16. Se hizo eliminando el
fragmento NotI del gen indicador beta-galactosidasa
del plásmido pCMV-Sport-Betagal
(número de catálogo 10586-014) como sigue: el
plásmido se digirió con NotI y EcoRV, el fragmento NotI del
esqueleto del plásmido de 4,38 kb se purificó por gel y se ligó. El
ADN ligado se transformó en células competentes de E. coli
DH5alfa. pEAG1100 se aisló como un plásmido que contenía el
recombinante deseado de una colonia aislada individual. Se confirmó
la secuencia de pEAG1100 que abarca el promotor, sitio de
multiclonación y señal de terminación de la transcripción.
El plásmido pSGS480 se transfectó de forma
transitoria en células CHO y las célula se hicieron crecer a 28ºC
durante 7 días. Se examinó la presencia de la proteína
CR(del C)-Fc en estas células y los medios
condicionados mediante análisis de inmunotransferencia. Para el
análisis de inmunotransferencia, los medios condicionados y las
células de las células transfectadas con Cripto se sometieron a
SDS-PAGE en geles en gradiente del
4-20% en condiciones reductoras, se transfirieron
electroforéticamente a nitrocelulosa y la proteína de fusión de
Cripto se detectó con un anticuerpo policlonal de conejo preparado
contra un conjugado del péptido 17-mero de Cripto
(que comprendía los residuos 97-113 de SEQ ID NO:
1)-hemocianina de lapa californiana. Tras la
centrifugación para eliminar las células, el análisis de
inmunotransferencia mostró que la proteína CR(del
C)-Fc se secretaba de forma eficaz al medio
condicionado (sobrenadante). El sobrenadante se aplicó a Proteína
A-Sepharosa (Pharmacia), y la proteína unida se
eluyó con fosfato de sodio 25 mM pH 2,8, NaCl 100 mM. La proteína
eluida se neutralizó con fosfato de sodio 0,5 M a pH 8,6, y se
analizó para el contenido total de proteína a partir de medidas de
absorbancia a 240-340 nm, y para la pureza mediante
SDS-PAGE. La proteína eluida se filtró a través de
un filtro de 0,2 micrómetros, y se almacenó a -70ºC.
La proteína CR(del C)-Fc
eluida se inyecta a ratones, y se usan técnicas estándar de
hibridoma conocidas por los expertos en la materia para generar
anticuerpos monoclonales.
En particular, se inmunizaron
intraperitonealmente ratones hembras Robertsonian (Jackson Labs)
con 25 \mug de CR del C-Fc humana purificada
emulsionada con adyuvante de freund completo (GibcoBRL
#15721-012). Recibieron dosis de refuerzo
intraperitonealmente dos veces con 25 \mug de CR del
C-Fc emulsionada con adyuvante de freund incompleto
(GibcoBRL #15720-014) y una vez con bolas de
proteína A. Se cribaron los sueros y 3 semanas después de la última
dosis, el ratón con mejor título recibió una dosis de refuerzo
intraperitonealmente con 50 \mug de CR del C-Fc
soluble tres días antes de la fusión. El ratón recibió una dosis de
refuerzo intravenosa con 50 \mug de CR del C-Fc el
día antes de la fusión. Las células del bazo del ratón se
fusionaron con células de mieloma FL653 a una proporción 1 de bazo:
6 de mieloma y se sembraron a 100.000, 33.000 y 11.000 células por
pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos en medio de selección.
Los pocillos positivos para crecimiento se cribaron mediante FACS y
ELISA una semana después. Se realizaron dos fusiones.
Los sobrenadantes resultantes del la primera o
segunda fusión se cribaron primero en placas de ELISA para el
reconocimiento de las proteína Cripto del C y/o dominio similar a
EGF de Cripto. Se recubrieron las placas de ELISA con una proteína
de fusión control (receptor de
LT-beta-Fc) para descartar
anticuerpos monoclonales que reconocieran el epítopo Fc humano. El
ELISA se realizó como se describe a continuación en la sección C.
En la primera fusión, también se cribaron los sobrenadantes
primarios para su capacidad para reconocer la proteína Cripto de la
superficie celular en la línea de células de tumor de testículo
NCCIT mediante FACS. En el caso de la segunda fusión, se analizó la
capacidad de los sobrenadantes de reconocer Cripto en dos líneas de
células tumorales, NCCIT y la línea de cáncer de mama DU4475
mediante FACS. Los cribados secundarios incluyeron probar la
capacidad del sobrenadante del anticuerpo monoclonal para reconocer
Cripto de la superficie celular en un panel de líneas de células
tumorales (ver las tablas 1 y 2 para los resultados), la capacidad
de los anticuerpos monoclonales para reconocer Cripto humana
inmunohistoquímicamente en secciones de tejido tumoral de mama y de
colon humanos, la capacidad de los anticuerpos monoclonales de
bloquear el ensayo de señalización Cripto-Nodal, la
capacidad de bloquear el crecimiento de líneas de células tumorales
en ensayos plástico o agar blando, y la capacidad de internalizar
Cripto de la superficie celular.
Los ensayos de ELISA se realizaron como
sigue:
Placas: placas de 96 pocillos de Costar de alta
unión y lavado fácil
(07-200-642).
Anticuerpo 2': IgG (H + L) de cabra
anti-ratón-HRP de Pierce
(P131430)
Sustrato: Kit de sustrato TMB de Pierce
(34021)
Solución de parada: H2SO4 1 N
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de unión: NaHPO4 0,1 M pH 9,0
Tampón de bloqueo: PBS + suero de ternera
donante al 10%
Tampón de lavado: PBS + Tween-20
al 0,1%.
Se diluyeron los antígenos
CR-del-C-Fc y
CR-EGF-fc, la proteína de fusión hu
IgG1 control en tampón de unión a 500 ng/ml. Se añadieron 100
\mul por pocillo y se incubaron durante 1 hora a 37ºC o durante
la noche a 4ºC. El líquido se decantó y la placa se invirtió y se
absorbió hasta que estuvo seca. Se añadieron después 250
\mul/pocillo de tampón de bloqueo, seguido mediante incubación
durante 30 minutos a 37ºC. De nuevo, el líquido se decanto, y la
\mulaca se invirtió y se absorbió hasta que estuvo seca. Los
sobrenadantes se diluyeron 1:50 en tampón de lavado, y se añadieron
a 50 \mul/pocillo, seguido mediante incubación durante 1 hora a
temperatura ambiente. Las \mulacas se lavaron 3X vigorosamente
con 250 \mul/pocillo de tampón de lavado. Después se añadieron
100 \mul/pocillo de anticuerpo 2' diluido en tampón de lavado a
1:10.000, seguido mediante incubación durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Las \mulacas se lavaron después 3X
vigorosamente con 250 \mul/pocillo de tampón de lavado, después
se añadió el sustrato a 100 \mul/pocillo. Se dejó desarrollar el
color hasta que fue lo suficientemente oscuro, después se añadieron
100 \mul/pocillo de solución de parada y se leyó la absorbancia
de las \mulacas a 450 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Las líneas celulares positivas para Cripto se
pueden usar para ensayar los anticuerpos monoclonales para la unión
a Cripto usando tinción de la superficie celular y citometría de
flujo como sigue:
Liberar las células de botellas T162 con 2 ml de
PBS con EDTA 5 mM, 10 minutos, a 37ºC. Llevar a 20 ml con medio con
suero, pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces para
separar las células. Centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos.
Lavar las células con 5-10 ml de PBS a 4ºC con BSA
al 0,1% (tampón de lavado). Centrifugar a 1200 rpm durante 5
minutos. Resuspender a 4x10^{6}-10^{7}/ml en
tampón de lavado. Mantener en hielo.
Preparar los anticuerpos para la tinción. Los
anticuerpos purificados se diluyen a 1-10 \mug/ml
en tampón de lavado. Añadir 50 \mul de células a una placa de 96
pocillos de fondo en V de Linbro (ICN 7632105). Sembrar un pocillo
de células por cada control por cada línea celular a ser analizada,
incluyendo células sin anticuerpo, anticuerpo 2º solo, medio de
hibridoma, sobrenadante de anticuerpo control positivo, si hay, o
purificado, y una subclase de IgG control (si se usan anticuerpos
purificados).
Sembrar un pocillo de células por cada muestra
experimental por cada línea celular a ser analizada. Centrifugar la
placa, 12000 rpm durante 5 minutos, usando una centrífuga de mesa a
4ºC. Eliminar el tampón invirtiendo la placa y agitando hasta que
el líquido esté sustancialmente descartado. Añadir 40- 50 \mul de
anticuerpos (o tampón de lavado para los pocillos control sin
anticuerpo y sólo anticuerpo 2º) a los pocillos. Incubar al menos
30 minutos-1 hora a 4ºC. Centrifugar la placa, 1200
rpm durante 5 minutos. Eliminar las soluciones de anticuerpo. Lavar
los pocillos dos veces con 200 \mul de tampón de lavado por
pocillo, centrifugando tras cada lavado. Eliminar el tampón.
Resuspender las células en cada pocillo en 50
\mul de una dilución 1:200 (en tampón de lavado) de IgG de cabra
anti-ratón con etiqueta R-PE,
específica de Fc (Jackson Immunoresearch Laboratories Cat#
115-116-071). Incubar 20 minutos,
4ºC, en la oscuridad. Añadir 150 \mul de tampón de lavado a las
células en cada pocillo. Centrifugar la \mulaca a 1200 rpm
durante 5 minutos. Lavar una vez con 200 \mul de tampón de lavado
por pocillo. Resuspender las células en 150 \mul de PFA al 1% en
PBS. Transferir el contenido de cada pocillo a tubos separados
(tubos de 5 ml de poliestireno con fondo redondeado Falcon 352052).
Envolver los tubos en papel de aluminio.
El contenido de los tubos se lee después
mediante citometría de flujo.
Los resultados de dos cribados de anticuerpos
monoclonales producidos mediante este método produjo los resultados
siguientes, resumidos en las tablas 1 y 2 a continuación, en donde
la primera columna proporciona los nombres designados para los
subclones de hibridoma, las siguientes dos columnas muestran los
resultados de los cribados de ELISA, y las columnas restantes
muestran los resultados del análisis de citometría de flujo en
cuatro líneas celulares positivas para cripto. Los resultados se
dan en unidades de índice medio de fluorescencia (IMF).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describe un ensayo de
señalización en células F9 nulas para Cripto usado para evaluar la
inhibición de la señalización de Cripto.
Día 0 Recubrir placas de 6 pocillos con gelatina
al 0,1%, 2 ml/pocillo a 37ºC durante 15 minutos.
Sembrar las células a 6x10^{5} células F9
nulas para Cripto por pocillo.
\vskip1.000000\baselineskip
Día 1 Transfección:
Se añade cada una de las siguientes muestras a
300 \mul de OptiMeml para dar la Solución A para cada
muestra:
Muestra 1: 0,5 \mug de ADNc de indicador
(N_{2})_{7} luciferasa FAST más 1,5 \mug de ADNc de
vector vacío.
Muestra 2: 0,5 \mug de ADNc de
(N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de FAST, y 1,5 \mug
de vector vacío.
Muestra 3: 0,5 \mug de ADNc de
(N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de Cripto ADD 0,5
FAST, y 0,5 \mug de vector vacío.
Muestra 4: 0,5 \mug de ADNc de
(N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de Cripto, 0,5 FAST,
y 0,5 \mug de vector vacío.
Muestra 5: 0,5 \mug de ADNc de
(N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de Cripto, 0,5 FAST,
y 0,5 \mug de vector vacío.
Muestra 6: 0,5 \mug de ADNc de
(N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de Cripto, 0,5 FAST,
y 0,5 \mug de vector vacío.
Muestra 7: 0,5 \mug de ADNc de
(N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de Cripto, 0,5 FAST,
y 0,5 \mug de vector vacío.
Muestra 8: 0,5 \mug de ADNc de
(N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de Cripto, 0,5 FAST,
y 0,5 \mug de vector vacío.
Muestra 9: 0,5 \mug de ADNc de
(N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de Cripto, 0,5 FAST,
y 0,5 \mug de vector vacío.
La solución B comprende 30 \mul de
Lipofectamina más 270 \mul de OptiMeml.
Para cada muestra, mezclar la solución A y la
solución B.
Incubar 45 minutos a temperatura ambiente.
Enjuagar los pocillos con 2 ml/pocillo de OptiMeml. Aspirar justo
antes del siguiente paso.
Añadir 2,4 ml de OptiMeml a cada mezcla de
soluciones A+B, mezclar, añadir 1,5 ml/pocillo a pocillos en
duplicado. Incubar 5 horas a 37ºC. Añadir 1,5 ml/pocillo de DMEM +
SFT al 10%, Gln 2 mM, P/S a los pocillos que recibieron las
muestran 1-3. Añadir anticuerpos
anti-Cripto como sigue: pocillos de la muestra 4:
A27F6.1, 10 \mug/ml; pocillos de la muestra 5: A27F6.1, 2
\mug/ml; pocillos de la muestra 6: A40G12.8, 10 \mug/ml;
pocillos de la muestra 7: A40G12.8, 2 \mug/ml; pocillos de la
muestra 8: A10B26.18, 10 \mug/ml; pocillos de la muestra 5:
A10B2.18, 2 \mug/ml.
Día 2 Eliminar el medio, lavar las células con
PBS, 2 ml/pocillo. Añadir DMEM + SFT al 0,5%, Gln 2 mM, P/S con la
misma cantidad de anticuerpos anti-Cripto que el día
anterior, a los mismos pocillos.
Día 3 Revelar la señal de luciferasa. Lavar los
pocillos con PBS + Ca^{2+} y Mg^{2+}, 2 ml/pocillo. Usar el kit
LucLite, Packard cat# 6016911. Llevar el tampón y el sustrato a
temperatura ambiente. Apagar las luces. Reconstruir el sustrato con
10 ml de tampón. Diluir 1:1 con PBS + Ca^{2+} y Mg^{2+}.
Aspirar los pocillos. Añadir rápidamente 250 \mul de sustrato
diluido por pocillo usando una pipeta de repetición. Agitar la
solución y transferir 200 \mul a los pocillos de una placa de 96
pocillos con fondo blanco opaco, Falcon 35-3296.
Leer la placa en un luminómetro usando Winglow, exportando los
datos a Excel.
Los resultados de este ensayo se resumen a
continuación en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
La inhibición de la señalización de Cripto
también se puede ensayar midiendo el crecimiento de células GEO en
agar blando. Ver, por ejemplo, Ciardiello et al., Oncogene.
Ene 1994; 9(1):291-8; Ciardiello et
al., Cancer Res. 1 Feb 1991;
51(3):1051-4.
Primero, fundir bactoagar al 3%. Mantener a 42ºC
en un baño de agua. Después, mezclar la solución de bactoagar al 3%
con medio completo precalentado para hacer una solución de
bactoagar al 0,6%, manteniendo a 42ºC. Plaquear 4 ml de la solución
en una placa de 6 cm y dejar enfriar durante al menos 30 minutos
para formar la capa inferior de agar. Tripsinizar las células GEO y
resuspender a 10^{5} células/ml en medio completo. Añadir los
anticuerpos a ensayar, o controles, a las suspensiones de células,
titulando los anticuerpos desde 20 \mug a 1 \mug. Mezclar
volúmenes iguales de las suspensiones de células GEO y bactoagar al
0,6% y cubrir con 2 ml encima de la capa de agar inferior. Dejar
enfriar durante al menos 1 hora. Incubar 14 días a 37ºC en un
incubador de CO_{2}. Contar las colonias visibles sin el uso de
un microscopio. La ausencia de colonias, comparada con los
controles negativos, indica que el anticuerpo probado inhibe el
crecimiento in vitro de las células tumorales.
Este ensayo se usó para dar los resultados
mostrados en la tabla 4, para los anticuerpos A27F6.1 y B6G7.10,
ambos de los cuales demostraron la capacidad de disminuir el
crecimiento de las colonias de células GEO.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar la inhibición del crecimiento de
células tumorales, se implanta una línea de células tumorales
humanas subcutáneamente en ratones desnudos atimicos y se observan
los efectos de los anticuerpos de la invención, con y sin
tratamientos quimioterapéuticos adicionales que pueden proporcionar
efectos sinergísticos o aditivos sobre la inhibición tumoral.
Este ensayo se puede realizar alternativamente
usando diferentes líneas de células tumorales, tal como, por
ejemplo, GEO (una línea celular in vitro de cáncer de colon
humano bien diferenciada, obtenida de la Colección de Americana de
Cultivos Tipo (ATCC)), DU-4475 (una línea de
células in vitro de cáncer de mama obtenida de la ATCC),
NCCTI (una línea celular de tumor de testículo obtenida de la
ATCC), u otras conocidas en la técnica. Un ejemplo de tales ensayos
es como sigue:
Los animales se marcan individualmente mediante
perforaciones en las orejas. La línea de células GEO se pasa in
vitro o in vivo durante 1-4 pases. A los
animales se les implanta las células GEO subcutáneamente en la zona
del flanco derecho. Se pueden usar los siguientes grupos de
animales:
\vskip1.000000\baselineskip
Día 0: Implantar el tumor, registrar el peso
corporal inicial de los animales.
Día 1: Iniciar los tratamientos como se ha
indicado anteriormente.
Día 5: Empezar las medidas de tamaño del tumor y
peso corporal y continuar dos veces por semana hasta la terminación
del experimento.
Se examinan el peso corporal inicial, medidas
del tamaño del tumor y el peso corporal, histología en el
sacrificio, y análisis de inmunohistoquímica en los tumores,
analizando la expresión de Cripto, el crecimiento del tumor, y la
inhibición de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar la respuesta de NCCIT, se implantó
subcutáneamente una línea celular de carcinoma de testículo humano
con un anticuerpo que se une a un dominio rico en cisteina de
Cripto. Los métodos experimentales se enumeran a continuación. Los
resultados se muestran en la figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Animales: Se usaron ratones desnudos atimicos
macho. Los animales se numeraron individualmente mediante
perforaciones en las orejas.
Tumor: NCCIT, línea celular humana in
vitro de carcinoma de testículo mezcla de células mediastinales
y germinales originalmente obtenido de la Colección Americana de
Cultivos Tipo. La línea celular se pasó in vitro durante
seis pases en RPMI-1640/SBF al 10% sin
antibióticos. Los animales se implantaron subcutáneamente con 5 x
10^{6} células/0,2 ml de matrigel en el flanco derecho de los
animales.
\vskip1.000000\baselineskip
Día -1: Se separaron los ratones al azar en
grupos control y de tratamiento. Se registra el peso corporal
inicial de los animales. Se administraron los primeros tratamientos
a los grupos de anticuerpo. Se prepararon las soluciones de dosis.
Los tratamientos fueron ciegos para los técnicos hasta que el
ensayo terminó.
Día 0: Se implantó el tumor. Se corrieron
cultivos bacterianos sobre el tumor implantado en los ratones.
Día 1: Se administraron los primeros
tratamientos al grupo quimioterapéutico positivo.
Día 4: Se registraron las medidas iniciales de
tamaño del tumor para la línea base tumoral en matrigel. Se
continuó registrando el tamaño del tumor y los pesos corporales en
ratones 2x/semana. Se controló el estudio diariamente y se hicieron
anotaciones de cualquier observación inusual en los animales.
\vskip1.000000\baselineskip
Peso corporal inicial.
Medidas del tamaño del tumor y peso
corporal.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar la respuesta de NCCIT, se implantó
subcutáneamente una línea celular de carcinoma de testículo humano
con un anticuerpo que se une a un dominio similar a EGF de Cripto.
Los métodos experimentales se enumeran a continuación. Los
resultados se muestran en la figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Animales: Se usaron ratones desnudos atímicos
macho. Los animales se numeraron individualmente mediante
perforaciones en las orejas.
\newpage
Tumor: NCCIT, línea celular humana in
vitro de carcinoma de testículo mezcla de células mediastinales
y germinales originalmente obtenido de la Colección Americana de
Cultivos Tipo. La línea celular se pasó in vitro durante
ocho pases en RPMI-1640/SBF al 10% sin
antibióticos. Los animales se implantaron subcutáneamente con 5 x
10^{6} células/0,2 ml de matrigel en el flanco derecho de los
animales.
Día -1: Se separaron los ratones al azar en
grupos control y de tratamiento. Se registró el peso corporal
inicial de los animales. Se administraron los primeros tratamientos
a los grupos de anticuerpo. Se prepararon las soluciones de las
dosis.
Los tratamientos fueron ciegos para los técnicos
hasta que el ensayo terminó.
Día 0: Implantar el tumor. Se corrieron cultivos
bacterianos sobre los tumores implantados en los ratones. Los
cultivos bacterianos fueron negativos para contaminación a las 24 y
48 tras el muestreo
Día 1: Se administraron los primeros
tratamientos al grupo quimioterapéutico positivo.
Día 4: Se registraron las medidas iniciales de
tamaño del tumor para la línea base tumoral en matrigel. Se
continuó registrando el tamaño del tumor y los pesos corporales en
ratones 2x/semana. Se controló el estudio diariamente y se hicieron
anotaciones de cualquier observación inusual en los animales.
\vskip1.000000\baselineskip
Peso corporal inicial.
Medidas del tamaño del tumor y peso
corporal.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar si los anticuerpos monoclonales
específicos de Cripto pueden interferir con la capacidad de Cripto
de unirse a Alk4, el receptor de activina de tipo I, se usó
análisis por citometría de flujo usando una línea de células 293
que expresan Alk4 de forma estable. Para generar esta línea
celular, las células 293 se cotransfectaron con un plásmido que
expresa Alk-4 con etiqueta de epítopo HA en el
C-terminal y un plásmido que expresa el fármaco,
puromicina, en una proporción 1:10. Las células transfectadas se
seleccionaron después en puromicina hasta que se formaron colonias.
Se recogieron colonias, se expandieron y después se analizaron para
la expresión de Alk4 usando análisis de inmunotransferencia para
HA. Se determinó que el clon 21
(293-A1k4-21) expresaba niveles
altos de Alk4 comparado con el control, células 293 no
transfectadas.
Para analizar la unión
Cripto-Alk4 mediante citometría de flujo, se empleó
una forma purificada soluble de Cripto humana (aa
1-169) fusionada a la parte Fc de la IgG humana
(CrdelC-Fc). Se incubaron aproximadamente 5
\mug/ml de proteína CrdelC-Fc o Fc control con
3x10^{5} células 293-A1k4-21 en
hielo durante 30 minutos en un volumen total de 50 \mul de tampón
FACS (PBS con BSA al 0,1%). Para las muestras que contenían
anticuerpos anti-Cripto, se preincubaron 5
\mug/ml de CrdelC-Fc con 50 \mug/ml de cada
anticuerpo contra Cripto (A10.B2.18, A40.G12.8, A27.F6.1, A8.H3.1,
A19.A10.30, A6.F8.6, A8.G3.5, A6.C12.11) en hielo antes de la
adición de las células. Las células se lavaron después en tampón de
FACS y la proteína Fc unida se detectó incubando las células con
una IgG anti-humana de cabra conjugada con
R-ficoeritrina (específica del fragmento Fc) de
Jackson Immunologics. Las muestras se lavaron de nuevo, se fijaron
en paraformaldehído al 1% en PBS, y se analizaron usando
procedimientos estándar de citometría de flujo. Los resultados del
ensayo de FACS se muestran en la figura 3.
Algunas de las formas de realización de la
invención descritas anteriormente se esbozan a continuación e
incluyen, pero no están limitadas a, las siguientes formas de
realización. Como apreciarán los expertos en la materia, se pueden
hacer numerosos cambios y modificaciones a las varias formas de
realización de la invención. Se pretende que todas esas variaciones
estén dentro del ámbito de la invención.
<110> Biogen, Inc.
\hskip1cmSanicola-Nadel, Michele
\hskip1cmWilliams, Kevin
\hskip1cmSchiffer, Susan
\hskip1cmRayhorn, Paul
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Anticuerpos bloqueantes contra
Cripto y usos de los mismos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> A117 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> No asignado aún
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
16-04-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/286782
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
26-04-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/293020
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-05-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/301091
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
26-06-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/367002
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
22-03-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de 188 aminoácidos
para CR-1 es como sigue [SEQ IE NO:
1]:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de 188 aminoácidos
para CR-3 es como sigue [SEQ ID NO:
2]:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Un anticuerpo que se une específicamente a un
epitopo de Cripto comprendido en el dominio que abarca los residuos
de aminoácidos desde el aminoácido 46 al aminoácido 62 de SEQ ID
NO: 1 ó SEQ ID NO: 2.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en
donde el anticuerpo se une a un epítopo seleccionado del grupo de
epitopos a los que se unen los anticuerpos producidos por los
hibridomas seleccionados del grupo que consiste en AlOB2.18 y
B3F6.7.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2, en
donde el anticuerpo es capaz de internalizar Cripto.
4. El anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 que es un fragmento de anticuerpo
seleccionado del grupo que consiste en un fragmento Fab, un Fab' y
un F(ab)2.
5. El anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 que es un anticuerpo de longitud
completa.
6. El anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 que es un anticuerpo de cadena sencilla.
7. El anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 que está conjugado a un agente
quimioterapéutico.
8. El anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 para su uso en terapia en combinación con un
agente quimioterapéutico no conjugado.
9. El anticuerpo de la reivindicación 7, en
donde el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que
consiste en un profármaco activado por tumor, un radionúclido y una
toxina seleccionada del grupo que consiste en ricina, toxina de la
difteria y exotoxina de pseudomonas.
10. El anticuerpo de la reivindicación 7 ó 9, en
donde el agente quimioterapéutico es un maitansinoide.
11. El anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 que es humano.
12. El anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 que es monoclonal.
13. El anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12 que es humanizado.
14. Una composición farmacéutica que comprende
al menos uno de los anticuerpos de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 y 9 a 13 y opcionalmente un soporte.
15. La composición farmacéutica según la
reivindicación 14, que comprende además un agente quimioterapéutico
no conjugado.
16. La composición farmacéutica de la
reivindicación 14 ó 15, en donde el anticuerpo es B3F6.7
humanizado.
17. Uso de un anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13 o una composición de cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16 para disminuir el crecimiento tumoral
in vitro.
18. Uso de un anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13 o una composición de cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16 para la preparación de una composición
farmacéutica para disminuir el crecimiento tumoral in
vitro.
19. El uso según la reivindicación 17 ó 18, en
donde la célula tumoral se selecciona del grupo que consiste en
células de tumor de mama, testículo, colon, pulmón, ovario, vejiga,
útero, cervical, páncreas y estómago.
20. Uso de un anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13 o una composición de cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16 para la preparación de una composición
farmacéutica para el tratamiento de proliferación celular no
deseada.
21. Un método de modular el crecimiento de
células tumorales in vitro en una muestra que comprende el
paso de añadir a la muestra el anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13 o la composición de cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16.
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