ES2279552T3 - Secuencia nucleotidica que codifica una flavina mono-oxigenasa, proteina correspondiente y sus aplicaciones en los campos del diagnostico y de la terapia. - Google Patents

Secuencia nucleotidica que codifica una flavina mono-oxigenasa, proteina correspondiente y sus aplicaciones en los campos del diagnostico y de la terapia. Download PDF

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE PARTICULARMENTE A LA FLAVINA MONO - OXIGENASA 2 HUMANA (HFMO2), ASI COMO A OTRA ENZIMA HUMANA DE LA FAMILIA FMO, HFMOX, A SUS SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS Y POLIPEPTIDICAS. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A VECTORES DE CLONACION Y/O DE EXPRESION QUE CONTIENEN DICHAS SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS Y CELULAS TRANSFORMADAS POR ESTOS VECTORES ASI COMO A PROCEDIMIENTOS DE PREPARACION DE DICHOS POLIPEPTIDOS. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN PROCEDIMIENTOS DE SELECCION DE COMPUESTOS Y DE DIAGNOSTICO DE PREDISPOSICION A PATOLOGIAS Y/O DEFICIENCIAS ASOCIADAS A LA FMOS ASI COMO COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE TIENEN DICHOS COMPUESTOS DESTINADOS AL TRATAMIENTO Y/O A LA PREVENCION DE ESTAS PATOLOGIAS.

Description

Secuencia nucleotídica que codifica una flavina mono-oxigenasa, proteína correspondiente y sus aplicaciones en los campos del diagnóstico y de la terapia.
La presente invención se refiere a una flavina mono-oxigenasa 2 humana (hFMO2), mutada, así como a sus secuencias nucleotídicas y polipeptídicas. La presente invención también se refiere a vectores de clonación y/o de expresión que contienen dichas secuencias nucleotídicas y células transformadas por estos vectores así como a métodos de preparación de dichos polipéptidos. La invención también comprende métodos de selección de compuestos y de diagnóstico de predisposición a patologías y/o deficiencias ligadas a esta FMO2 humana mutada así como composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos destinados al tratamiento y/o a la prevención de estas patologías.
Las flavinas mono-oxigenasas (FMOs) (Lawton et al., 1994) forman una familia de enzimas microsomales que catalizan la oxidación NADPH-dependiente de numerosos compuestos orgánicos exógenos (xenobióticos) que poseen un heteroátomo nucleófilo como en particular el átomo de nitrógeno, azufre, fósforo o selenio (Ziegler, D. M., 1988; Ziegler, D. M., 1993), se trate de medicamentos, pesticidas u otras sustancias potencialmente tóxicas. La cisteamina es el único substrato endógeno de las FMOs conocido actualmente.
Las FMOs representan una familia multigénica. La expresión de formas diferentes de FMOs depende a la vez del tejido y de la especie considerados.
Las FMOs han sido localizadas en diferentes tipos de tejidos, en particular, el hígado, los pulmones y los riñones.
Hasta el día de hoy, se han caracterizado cinco isoformas de las FMOs en la especie de referencia, el conejo. Su homología es de 50-60%. También se puede citar el documento Yueh et al. (AC U59453, EMBL Database, Heidelberg), que describe la secuencia de la proteína FMO2 del macaco. Cuatro de estas isoformas, FMO1, FMO3, FMO4 y FMO5 han sido identificadas en el hombre (secuencias GeneBank M64082, M83772, Z11737 y L37080 respectivamente). Entre las especies mamíferas, la homología entre FMO ortólogas es superior al 80%. La existencia de una FMO2, incluso otras isoformas, en el hombre, se puede postular razonablemente.
Las FMOs se asocian al retículo endoplasmático y están implicadas en la detoxificación de compuestos xenobióticos, permitiendo la mono-oxigenación transformar la xenobiótica en sustancia más polar, etapa preliminar antes de su excreción. También pueden estar implicadas en la activación metabólica de diferentes compuestos tóxicos y/o carcinogénicos presentes en el medioambiente.
El mecanismo de la reacción FMO se ha descrito de forma detallada (Poulsen, L. L. et al., 1995). En oposición a todas las demás oxidasas o mono-oxigenasas conocidas, las FMOs tienen la propiedad única de formar una enzima intermedia estable 4\alpha-hidroperoxiflavina, NADP(H)- y oxígeno-dependiente, en ausencia de substrato oxidable. Como la energía de catálisis ya está presente en la enzima FMO antes del contacto con su substrato potencial, no es necesario que la adecuación del substrato sea tan precisa como para otros tipos de enzimas. Esta característica específica de la FMO es responsable de la gran variedad de sustancias aceptadas por las FMOs (incluyendo por ejemplo los alquil- y aril-aminas terciarias y secundarias, numerosas hidracinas, tiocarbamidas, tioamidas, sulfidas, disulfidas y tioles).
Numerosas moléculas, compuestos activos de medicamentos, están reconocidas como substratos de las FMOs, bien por una N-oxidación, o bien por una S-oxidación (Gasser, 1996), entre los que se encuentran principalmente anti-depresivos, antipsicóticos, antiulcerosos, vasodilatadores y anti-hipertensores.
Aunque algunos substratos de FMO se oxiden a derivados menos activos, numerosos compuestos nucleófilos se pueden metabolizar en intermedios que pueden ser más reactivos y/o potencialmente tóxicos; más bien que ser excretados, dichos productos pueden inducir respuestas tóxicas por fijación covalente a macromoléculas celulares, o por otros mecanismos. Por ejemplo, las mercaptopirimidinas y las tiocarbamidas se pueden activar de forma predominante por una actividad FMO (Hines et al., 1994). De forma más precisa, se ha demostrado que la nefrotoxicidad asociada al conjugado glutatión de la acroleína está ligado a su metabolismo en el que interviene la FMO renal; la FMO forma un S-óxido que a continuación se libera, por reacción de eliminación catalizada en medio básico, en forma de acroleína citotóxica (Park, S. B. et al., 1992). Así, las FMOs pueden desempeñar un importante papel tanto en las primeras etapas de toxicidad química como en la detoxificación de compuestos xenobióticos.
Tal como se ha descrito anteriormente, un gran número de medicamentos actualmente en fase de ensayos clínicos, o ampliamente prescritos, contienen funciones de carácter nucleófilo de tipo nitrógeno, azufre, fósforo u otros. Sin embargo, el papel de la FMO en el metabolismo oxidativo de los medicamentos y de los compuestos químicos endógenos en el hombre no se conoce bien.
Cashman et al. (1996) han estudiado recientemente las contribuciones de las enzimas FMOs en el metabolismo fisiológico de la cimetidina y de la S-nicotina in vivo. La mayor parte de sus resultados confirma el hecho de que la actividad FMO3 del hígado de adulto es responsable de la oxigenación de la cimetidina y de la S-nicotina, siendo esta oxigenación estéreo-específica. Los autores muestran además que la estereoquímica de los metabolitos principales de la cimetidina y de la S-nicotina en los pequeños animales de experimentación es diferente a la observada en el hombre, y sugieren que diferentes isoformas de FMOs pueden ser predominantes según las especies, lo que puede tener consecuencias importantes en relación con la elección de los animales de experimentación para los programas de elaboración y de desarrollo de medicamentos para el hombre.
La FMO1 se conoce por manifestarse en el hombre en los riñones, pero no en el hígado. La FMO2 se manifiesta mayoritariamente en los pulmones en todas las especies de mamíferos ensayados. La FMO3 ha sido aislada en el hombre en el hígado donde es predominante en el adulto. La FMO3 es la isoforma más importante implicada en la sulfoxidación de la metionina y en la oxigenación estéreo-específica de la cimetidina y de la S-nicotina. La FMO3 presenta una especificidad por su substrato más grande que la de las FMO1 encontradas en el hígado de la mayoría de las especies animales estudiadas. La FMO4 es una isoforma menor cuya función y especificidad de substrato son poco conocidas. Está presente en el hígado humano y también se manifiesta en el cerebro donde podría estar implicada en la oxidación de medicamentos antidepresivos como la imipramina. La FMO5 se manifiesta en el hígado del hombre de forma menos importante que la FMO3. Su aparente falta de eficacia como enzima implicada en el metabolismo de medicamentos sugiere que podría estar implicada en una función fisiológica.
Los diferentes perfiles de expresión de las isoformas de FMO según los tejidos y/o especies constituyen por lo tanto probablemente un factor significativo que contribuye a las diferencias de actividades FMO observadas entre los tejidos y/o entre especies. Así, la variedad de las formas de FMOs podría tener un impacto significativo en la diferencia de las respuestas de los tejidos y/o especies frente a la exposición a un compuesto xenobiótico. En efecto, las diferencias observadas entre los tejidos y/o especies en la respuesta a los compuestos xenobióticos y en su toxicidad están ligadas por una parte importante a las variaciones de actividad y de especificidad implicadas en el metabolismo de estos substratos por las FMOs. Factores genéticos y especificidad tisular en la expresión de las FMOs son importantes factores de estas variaciones.
En relación con los factores genéticos, se ha descrito por ejemplo la trimetilaminuria, patología presente en el 1% de los sujetos blancos británicos y que se manifiesta por un fuerte olor a pescado estropeado en el aire expirado, el sudor o la orina, está ligada a una deficiencia de origen genético del funcionamiento de una FMO hepática.
Por las razones aducidas anteriormente, existe por lo tanto actualmente una necesidad importante de identificar nuevas isoformas de FMO así como los polimorfismos genéticos eventualmente asociados, que presentan especificidades en cuanto a sus substratos y/o su perfil de expresión tisular, que podrían estar implicadas en el metabolismo de medicamentos o de sustancias exógenas presentes en el medioambiente como por ejemplo los pesticidas, o incluso podrían estar implicadas en una función fisiológica. Este es precisamente el objetivo de la presente invención.
Varios genes de la familia de las FMOs humanas han sido localizados en la región lq23-25 del cromosoma 1 por hibridación in situ del cromosoma en metafase.
Desde que tal región candidata se define, es necesario tener acceso al fragmento del genoma que cubre el intervalo en el que se sitúa(n) el(los) gen(es) buscado(s). Esta etapa pasa por el establecimiento de un mapa físico, es decir el recubrimiento de la región por un conjunto de fragmentos clonados y ordenados. En la actualidad, gracias a los datos del mapa integrado CEPH/Génethon del genoma humano, aproximadamente el 80% del genoma está recubierto por clones de YACs, sub-clonados en BACs cuya localización en los cromosomas se hace por medio de marcadores polimorfos y genéticamente ordenados (Chumakov et al., 1995). Este mapa físico-genético permite ganar un tiempo considerable, principalmente por la utilización de la secuenciación exhaustiva de las regiones de interés.
Así, según la presente invención, se ha establecido, después de la localización del BAC 123H04M en el locus genético lq24-25 anteriormente citado, que la inserción que lleva contiene las partes 3' de hFMO3, 5' de hFMO1, así como la secuencia completa de hFMO2, y la de otro nuevo gen miembro de la familia FMO, el hFMOx.
Además, gracias a la utilización de bancos de etiquetas 5', se puede verificar la expresión de los genes candidatos identificados como antes: la identificación de una etiqueta que híbrida a una de las secuencias candidatas indica, ya que ésta resulta de un banco de ADNc, la presencia de ARNm y por lo tanto de una expresión de las secuencias en cuestión en los tejidos considerados.
La presente invención describe principalmente un polinucleótido aislado, cuya secuencia SEQ ID Nº 1 está parcialmente representada en la Figura 2, y que codifica para un polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 3 representada en la Figura 1.
La presente invención describe igualmente un polinucleótido aislado, cuya secuencia SEQ ID Nº 4 está parcialmente representada en la Figura 10, y que codifica para un polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 6.
Estas dos secuencias nucleotídicas son las de dos genes que codifican para nuevas enzimas de la familia de las mono-oxigenasas de flavina (FMO) humanas, respectivamente hFMO2 y hFMOx. Esto se ha establecido por comparación de las secuencias identificadas con las secuencias ya conocidas de FMO: homologías estructurales muy fuertes entre las dos secuencias estudiadas y las de las FMO, homologías muy fuertes entre la primera secuencia y las FMO2 conocidas, principalmente la de macaco (FMO2 de macaco: secuencia GeneBank U59453), así como una homología no suficiente de la segunda secuencia con ninguna de las FMO ya catalogadas en el hombre, han sido las conclusiones alcanzadas.
La estructura exónica de los genes de la familia FMO ya conocidos se conserva totalmente en la secuencia nucleotídica hFMO2 según la invención. Las secuencias de cada uno de los 9 exones del polinucleótido según la invención (Figura 3) presentan grados de homología que varían del 95% al 98% del ADN con la secuencia correspondiente del ARN mensajero de la FMO2 de macaco (Figura 4). Las divergencias entre las dos secuencias nucleotídicas, así como su significación para con la secuencia peptídica, están presentes en la Figura 5. La secuencia polinucleotídica SEQ ID Nº 1 según la invención codifica para un polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 3 de 535 aminoácidos (Figura 1); la secuencia SEQ ID Nº 2 del ARN mensajero anteriormente mencionada, así como la secuencia polipeptídica de la proteína humana son homologas al 97% con las de la FMO2 de macaco (Figuras 6 y 7), lo que ha permitido la identificación del polipéptido según la invención como la FMO2 humana. El polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 3, representado en la Figura 1, presenta también un alto grado de homología con otras flavinas-mono-oxigenasas 2 de mamíferos; sus grados de homología con otras proteínas de la familia de las flavinas-mono-oxigenasas son menos grandes.
Tal como se ha mencionado anteriormente, la ausencia de homología suficiente entre las secuencias correspondientes a la hFMOx -secuencias genómica (SEQ ID Nº 4), de ARN mensajero (SEQ ID Nº 5), y peptídica (SEQ ID Nº 6)- y las secuencias de las FMOs conocidas, ha permitido concluir que se trata de una nueva isoforma de la FMO.
La presente invención describe por lo tanto las secuencias de ADN o de ARN, pudiendo ser el ADN genómico, ADN complementario o sintético, de las FMOs, principalmente de hFMO2 y hFMOx, así como las proteínas correspondientes.
La presente invención describe además vectores de clonación y/o de expresión que contienen dichas secuencias nucleotídicas, células transformadas por estos vectores o animales que contienen dichas células, así como métodos de preparación de dichos polipéptidos en forma de polipéptidos recombinantes.
La invención también describe métodos de selección de un compuesto capaz de modular la actividad FMO.
La invención describe igualmente métodos de diagnóstico de predisposición a trastornos ligados a la FMO así como composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento y/o a la prevención de estos trastornos.
Un primer ejemplo de dichos trastornos podría ser el glaucoma primario de ángulo abierto (GPAO). En efecto, por una parte Sunden et al. (1996), así como los inventores (Belmouden et al., 1996), han identificado la región cromosómica GLC1A, que contiene entre otras secuencias de genes las conocidas de la familia de las FMOs, en lq23-25, como ligada a la aparición del GPAO juvenil (GPAO-J). Por otra parte, se ha sugerido anteriormente (Schwartzman et al.,1987) un posible papel de las mono-oxigenasas en la etiología del glaucoma. En efecto, metabolitos de reacciones de oxidación, que inhiben la actividad Na+, K+ ATPasa en la córnea, contribuirían a la regulación de la transparencia de la córnea y de la secreción humoral ocular; ahora bien, una opacidad de la córnea y una hipertensión ocular son los dos criterios principales de diagnóstico del glaucoma.
Así, los inventores han identificado un sitio de heterocigosis, que presenta una segregación de orden genotípico en una familia estudiada por la presencia en su seno de numerosos miembros que padecen la GPAO-J, en el exón 8 del polipéptido hFMO2 según la invención.
Prosiguiendo con la investigación de los polimorfismos presentes en poblaciones elegidas de forma adecuada, y situados en secuencias correspondientes a las contenidas en la inserción del BAC 123H04M, o más generalmente en las secuencias FMOs, se podrán identificar principalmente las mutaciones asociadas a las patologías o trastornos ligados a una alteración de la FMO.
Las diferentes isoformas de las FMOs parecen distinguirse menos por la especificidad tisular de su expresión que por los substratos cuya transformación catalizan. Como se ha indicado anteriormente, la expresión de las FMOs se ha puesto en evidencia en el hígado, los pulmones, los riñones o el cerebro.
El efecto patógeno de un déficit funcional de una FMO podría resultar de una capacidad reducida de los tejidos donde se manifiesta a resistir al estrés oxidativo.
Más generalmente, por su papel en el metabolismo oxidativo y su función de detoxificación, las FMOs podrían estar implicadas en cualquier patología degenerativa o tóxica, demostrada o por probar, principalmente aquellas en las que puede ponerse en evidencia una muerte celular programada y en las enfermedades degenerativas del sistema nervioso central.
De forma general, las patologías ligadas al funcionamiento de las FMOs, se recogen bajo el nombre de "trastornos ligados a la FMO".
Entre los trastornos ligados a la FMO, se pueden citar por ejemplo, pero sin limitarse a ellos:
-
oxidación de medicamentos, substratos de FMO, en derivados menos activos, que implican una pérdida de eficacia de dicho medicamento;
-
no metabolización de medicamentos activos en forma de metabolitos, pérdida de eficacia de dicho medicamento;
-
no metabolización de xenobióticos tóxicos y/o carcinógenos, de ellos sustancias exógenas presentes naturalmente en la alimentación, tales como alcaloides vegetales, o sustancias tóxicas presentes en el medioambiente, tales como los pesticidas o los herbicidas;
-
metabolización de medicamentos en intermedios que pueden ser más reactivos, implicando una sobredosificación con posibilidad de efecto secundario;
-
metabolización de xenobióticos, de ellos medicamentos u otras sustancias exógenas, en intermedios que pueden ser potencialmente tóxicos; y/o
-
alteración de la función fisiológica en la que está implicada la FMO; en particular, la alteración del funcionamiento de FMO, podría estar implicada en la sintomatología del glaucoma.
Por "FMO", se entiende la designación de una cualquiera de las FMOs humanas conocidas, FMO1, FMO3, FMO4 y FMO5, o nuevamente descritas en la presente solicitud de patente, es decir FMO2 o FMOx.
Algunos de estos trastornos podrían tener un origen multigénico pero para todos, las modificaciones de una o varias FMOs contribuyen a la aparición del trastorno o a su agravación.
Las secuencias nucleotídicas
La presente invención se refiere, en primer lugar, a una secuencia nucleotídica aislada, caracterizada porque codifica para la variante de la proteína FMO2 humana de secuencia SEQ ID Nº 3 que presenta un resto lisina en lugar de un resto ácido glutámico en posición 402 de la secuencia SEQ ID Nº 3.
La presente invención también se refiere a una secuencia nucleotídica aislada según la invención, caracterizada porque codifica para la variante de la proteína FMO2 humana de secuencia SEQ ID Nº 3 que presenta un resto lisina en lugar de un resto ácido glutámico en posición 402 de la secuencia SEQ ID Nº 3 y que comprende una secuencia elegida entre:
a)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 2001 al nucleótido en posición 2056 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
b)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 2405 al nucleótido en posición 2542 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
c)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 10026 al nucleótido en posición 10214 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
d)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 13341 al nucleótido en posición 13503 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
e)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 16036 al nucleótido en posición 16178 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
f)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 20558 al nucleótido en posición 20757 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
g)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 21972 al nucleótido en posición 22327 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
h)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 24411 al nucleótido en posición 24483 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1 en la que el nucleótido en posición 24431 de la secuencia SEQ ID Nº 1 es una adenosina en lugar de una guanina,
i)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 25487 al nucleótido en posición 25899 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
j)
la secuencia nucleica SEQ ID Nº 1 en la que el nucleótido en posición 24431 es una adenosina en lugar de una guanina, y
k)
la secuencia nucleica SEQ ID Nº 2 en la que el nucleótido en posición 1266 es una adenosina en lugar de una guanina.
\newpage
La invención comprende además una secuencia nucleotídica aislada, caracterizada porque se elige entre las secuencias que codifican para un polipéptido que comprende el polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 3 que presenta un resto lisina en lugar de un resto ácido glutámico en posición 402, o complementario de una secuencia según la presente invención.
Se debe comprender que la presente invención no se refiere a las secuencias nucleotídicas genómicas en el estado natural, se trata de secuencias que han sido aisladas, es decir que han sido extraídas directa o indirectamente, por ejemplo por copia (ADNc), habiendo sido modificado su entorno al menos parcialmente.
Así, se puede tratar tanto de ADNc como de ADN genómico parcialmente modificado o contenido en secuencias al menos parcialmente diferentes de las secuencias que los contienen de forma natural.
Estas secuencias también podrían ser calificadas de "no naturales".
Por "secuencia nucleica", se entiende un fragmento de ADN y/o de ARN natural aislado, o de síntesis, designando una cadena precisa de nucleótidos, modificados o no, que permiten definir un fragmento, segmento o región de un ácido nucleico.
Por "alelos", se entiende designar las secuencias mutadas naturales correspondientes a polimorfismos que pueden existir en el ser humano y, principalmente, los que pueden conducir al desarrollo de trastornos ligados a la FMO.
Por "variante proteica", se entiende designar el conjunto de proteínas mutadas que pueden existir en el ser humano, que corresponden principalmente a truncamientos, sustituciones, deleciones y/o adiciones de restos de aminoácidos, así como las variantes artificiales que sin embargo se llamarán también "variantes proteicas". En el caso presente, las variantes están ligadas en parte a la aparición de trastornos ligados a la FMO.
Según la invención, los fragmentos de secuencias nucleicas pueden codificar principalmente para dominios de la proteína o bien se pueden utilizar como sonda o como iniciador en procedimientos de detección o de identificación o de amplificación. Estos fragmentos presentan un tamaño mínimo de 10 bases y se preferirán fragmentos de 20 bases, y preferentemente 30 bases.
Según la invención, la homología es únicamente de tipo estadístico, y significa que las secuencias presentan como mínimo el 80%, y preferentemente 90% de nucleótidos en común.
La Figura 1 representa la secuencia SEQ ID Nº 3, la Figura 2 representa parcialmente la secuencia SEQ ID Nº 1 de la FMO2, la Figura 10 representa parcialmente la secuencia SEQ ID Nº 4 de la FMOx, tal como han sido secuenciadas en un genoma de un individuo que no presentaba trastornos FMO visibles.
La estructura del gen de la hFMO2 se ha identificado en la Figura 3.
La secuencia SEQ ID Nº 4 de la FMOx está parcialmente representada en la Figura 10.
La invención también describe fragmentos de estas secuencias, en particular secuencias que codifican para polipéptidos que han guardado todo o parte de la actividad de la proteína FMO.
Algunas de estas secuencias se pueden identificar remitiéndose principalmente a la Figura 3 que esquematiza la organización de hFMO2.
Estas secuencias parciales se pueden utilizar en numerosas aplicaciones, tal como se va a describir más adelante, principalmente para efectuar construcciones proteicas de tipo FMO o de tipos diferentes, pero también para realizar por ejemplo proteínas similares a la FMO.
Si las secuencias descritas son, en general, las secuencias normales, la invención se refiere así a una secuencia mutada que comprende una mutación puntual.
La presente invención se refiere así a una secuencia nucleotídica mutada en la que la mutación puntual es no silenciosa, es decir que conduce a una modificación del aminoácido codificado en relación con la secuencia normal. La invención describe que algunas mutaciones se pueden fijar en aminoácidos que estructuran las proteínas FMO o los fragmentos correspondientes a éstas, principalmente en las regiones correspondientes a los sitios catalíticos, a los sitios reguladores o a los sitios de fijación de los cofactores; las mutaciones también se pueden fijar en las secuencias implicadas en el transporte y el direccionamiento; también pueden en particular suprimir las cisteínas o, por el contrario, hacerlas aparecer, pero también cambiar el carácter de la proteína, bien en el plano de la carga, o bien el plano de la hidrofobicidad.
Estas mutaciones también pueden intervenir en las secuencias de iniciación y/o reguladoras de los genes FMO humanos, que pueden tener efectos sobre la expresión de la proteína, principalmente en su tasa de expresión.
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Entre los fragmentos nucleotídicos que pueden ser interesantes, principalmente para el diagnóstico, hay que mencionar también las secuencias genómicas intrónicas del gen FMO, por ejemplo las secuencias de empalme entre los intrones y los exones.
La invención comprende así las secuencias nucleotídicas según la invención, caracterizadas porque comprenden al menos la mutación G.1263mac.A, tal como se definirá más adelante en los ejemplos.
La invención comprende igualmente las secuencias nucleotídicas como iniciador nucleico caracterizadas porque dichas secuencias se eligen entre las secuencias SEQ ID Nº 7, SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 9 y SEQ ID Nº 10.
La invención se refiere además a las secuencias nucleotídicas como sonda específica, caracterizadas porque dichas secuencias se eligen entre las secuencias SEQ ID Nº 11, SEQ ID Nº 12, SEQ ID Nº 13 y SEQ ID Nº 14.
Los polipéptidos codificados por las secuencias nucleotídicas según la invención, principalmente el polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 3, que presenta un resto lisina en lugar de un resto ácido glutámico en posición 402, forman por supuesto parte de la invención.
En la presente descripción, los términos de proteína, polipéptido o péptido son intercambiables.
La presente invención cita también las secuencias nucleotídicas que pueden comprender nucleótidos no naturales, principalmente azufrados o de estructura \alpha o \beta.
Se ha dicho en la presente invención que las secuencias se refieren, por supuesto, tanto a las secuencia de ADN como de ARN, así como a las secuencias que se hibridan con ellas, lo mismo que los ADN de doble cadena correspondientes.
Entre los fragmentos de ácidos nucleicos interesantes, hay que citar en particular los oligonucleótidos anti-sentido, es decir cuya estructura asegura, por hibridación con la secuencia blanco, una inhibición de la expresión del producto correspondiente. También hay que citar los oligonucleótidos sentido que, por interacción con proteínas implicadas en la regulación de la expresión del producto correspondiente, inducirán bien una inhibición, o bien una activación de esta expresión.
Como esto se describirá más adelante, para ciertas aplicaciones, puede ser necesario prever construcciones mixtas, proteína/ADN/compuesto químico, principalmente por ejemplo la utilización de agentes intercalantes.
Las proteínas, polipéptidos o péptidos correspondientes a las secuencias mencionadas anteriormente, están en forma no natural, es decir que no se han tomado en su medioambiente natural sino que se han podido obtener por purificación a partir de fuentes naturales o bien obtenidas por recombinación genética, como se describirá más adelante.
La invención cita también los mismos polipéptidos o proteínas obtenidos pos síntesis química y que pueden comprender aminoácidos no naturales.
La presente invención cita las proteínas recombinantes así obtenidas tanto en forma glicosilada como no glicosilada y que pueden presentar o no la estructura terciaria natural.
Los vectores y las células
La presente invención también se refiere a vectores de clonación y/o de expresión que comprenden una secuencia nucleotídica según la invención.
Estos vectores de clonación y de expresión podrían comprender elementos que aseguren la expresión de la secuencia en una célula huésped, principalmente secuencias de iniciación y secuencias de regulación eficaces en dicha célula.
El vector que se trata podría ser de replicación autónoma o bien estar destinado a asegurar la integración de la secuencia en el seno de los cromosomas de la célula huésped.
En el caso de sistemas de replicación autónoma, en función de la célula huésped, procariota o eucariota, se utilizarán preferentemente sistemas de tipo plasmídico o sistemas virales, virus vectores que pueden ser principalmente adenovirus (Perricaudet et al., 1992), retrovirus, poxvirus o virus herpéticos (Epstein et al., 1992). El profesional conoce las tecnologías utilizables para cada uno de estos virus.
Así, se conoce la utilización como vector viral de los virus defectivos cuyo cultivo se efectúa en células de complementación, lo que evita los riesgos eventuales de proliferación de un vector viral infeccioso.
Cuando se desee la integración de la secuencia en los cromosomas de la célula huésped, será necesario prever por una y otra parte de la secuencia nucleotídica que se va a integrar una o varias secuencias procedentes de la célula huésped para asegurar la recombinación. Se trata aquí de procedimientos que están ampliamente descritos en la técnica anterior. Se podrán, por ejemplo, utilizar sistemas de tipo plasmídico o viral; dichos virus serán, por ejemplo, retrovirus (Temin 1986) o los AAV, Adenovirus Associated Virus (Carter 1993).
La invención se refiere también a las células procariotas o eucariotas transformadas por un vector según la invención y ello con el objetivo de asegurar la expresión de una proteína FMO natural o variante o bien, por ejemplo, de uno de sus dominios.
Los animales, caracterizados porque contienen una célula transformada según la invención, forman también parte de la invención.
La invención comprende además un procedimiento de producción de un polipéptido según la invención, caracterizado porque se cultiva una célula según la invención y porque se recupera la proteína producida.
Tal como se ha indicado anteriormente, la presente invención se refiere también a los polipéptidos, obtenidos por cultivo de células así transformadas y la recuperación del polipéptido manifestado, pudiendo realizarse dicha recuperación de forma intracelular o bien de forma extracelular en el medio de cultivo cuando el vector ha sido previsto para asegurar la secreción del polipéptido por el desvío, por ejemplo, de una secuencia "líder", manifestándose la proteína en forma de una pre-proteína o pre-pro-proteína. Las construcciones que permiten la secreción de los polipéptidos son conocidas, tanto para sistemas procariotas como para sistemas eucariotas. Algunos polipéptidos FMO podrían llevar su propio sistema de secreción o de inserción de membrana.
Entre las células utilizables para la producción de estos polipéptidos, hay que señalar por supuesto las células bacterianas (Olins y Lee, 1993) pero también las células de levadura (Buckholz, 1993), lo mismo que las células de animales, en particular los cultivos de células de mamíferos (Edwards y Aruffo, 1993) y también las células de insectos en las que se pueden utilizar procedimientos utilizando por ejemplo baculovirus (Luckow, 1993).
Las células así obtenidas pueden permitir preparar polipéptidos naturales o variantes FMO, y también fragmentos de estos polipéptidos, principalmente polipéptidos que pueden responder a los diferentes dominio que se tratan.
La invención también comprende los anticuerpos mono- o policlonales dirigidos contra los polipéptidos según la invención, preferentemente, caracterizados porque se obtienen por reacción inmunológica de un organismo humano o animal con un agente inmunógeno constituido por un polipéptido según la invención, principalmente un polipéptido recombinante o sintético según la invención.
La invención se refiere igualmente a los anticuerpos según la invención, caracterizados porque se trata de anticuerpos marcados, principalmente para análisis por imagen.
Estos anticuerpos monoclonales o policlonales marcados y correspondientes principalmente a toda o parte de las proteínas mutadas se podrán utilizar por ejemplo como agente de imaginería, in vivo o ex vivo en muestreos biológicos (imaginería mediante anticuerpos acoplados a una molécula detectable en imaginería de tipo PET-scan, por ejemplo).
Los modelos celulares
En el marco de la presente invención, las células transformadas o animales no humanos, según la invención, también podrían utilizarse como modelo para la selección in vitro de productos implicados directamente o indirectamente en la actividad de la FMO2 mutada, esto con el fin de estudiar las diferentes interacciones consideradas. Podrían utilizarse también para la selección in vitro de productos que interactúan con la FMO2 mutada, como agonista, principalmente de activador enzimático, o como antagonista, principalmente de inhibidor enzimático.
Otra aplicación potencial de la caracterización de estos genes es, por lo tanto, la posibilidad de identificar compuestos, principalmente proteicos, que interaccionan con estas FMOs. Se puede tratar tanto de inhibidores como de activadores, de substratos o de cofactores, por ejemplo. Su identificación permitirá su utilización en función de sus interacciones con la proteína normal o la proteína variante. En particular, se podrá buscar el aislamiento de los agentes que tengan efectos diferentes sobre las FMOs normales y variantes.
También se ha descrito que se podrán utilizar estos modelos celulares para estudiar el metabolismo de xenobióticos, medicamentos u otros, por una FMO, normal o variante. Esto se podría realizar en la identificación del poder tóxico de algunos compuestos, en la selección y el desarrollo de compuestos de toxicidad reducida, o de actividad incrementada, o en el de FMOs modificadas, que tengan un mejor poder de metabolización de los compuestos de interés.
Este tipo de modelo celular se puede realizar utilizando técnicas de ingeniería genética. Se trata, según el tipo de células que se deseen utilizar, de clonar el gen en cuestión en su forma normal o en su forma mutada en un vector de expresión, se trate de un vector de replicación autónoma o de un vector de integración, llevando dicho vector el conjunto de elementos que permitan la expresión del gen en la célula que se trata, o teniendo ésta el conjunto de elementos que permitan la expresión de la secuencia que se trata.
Se obtienen así células eucariotas o procariotas que manifiestan la o las proteínas FMO, normales o variantes, que podrán entonces constituir modelos que permitan ensayar a la vez las interacciones de diferentes productos con las proteínas FMO o sus variantes, o ensayar compuestos, principalmente productos químicos de síntesis, que pueden interaccionar con el producto del gen FMO, normal o mutado, y ello añadiéndoles al medio de cultivo de dichas células.
Hay que señalar, en particular, que los productos en cuestión podrían ser tanto agentes de actividad antagonista como agonista.
La utilización de modelos celulares para ensayar compuestos farmacéuticos es bien conocida, por lo que no hay lugar para detallar este tipo de modelo. Sin embargo, se pueden citar, entre las técnicas utilizadas, la "Phage Display" (Allen et al., 1995), y los métodos de doble-híbrido (Luban y Goff., 1995).
Estos modelos pueden ser de tipo in vitro, por ejemplo cultivos de células humanas, bien en cultivo normal, o bien opcionalmente en forma de órgano aislado.
La presente invención describe también organismos tales como los animales, en particular ratones, que manifiestan el fenotipo correspondiente a la FMO normal o variante de origen humano. Aquí también, estos animales se podrían utilizar como animales modelos para ensayar la eficacia de ciertos productos farmacéuticos.
La presente invención se refiere a métodos de diagnóstico de predisposición a un glaucoma juvenil en un paciente, caracterizados porque se determina a partir de una toma de muestra biológica de dicho paciente la presencia de la mutación G.24431A en al menos una secuencia que codifica para FMO2 por análisis de toda o parte de una secuencia nucleica correspondiente a dicho gen, siendo la presencia de al menos una tal mutación indicativo de una predisposición de dicho paciente al glaucoma juvenil ligado a la FMO2.
Es importante precisar que la presente invención no describe en detalle más que la hFMO2 y hFMOx, pero se describe aquí que los métodos de diagnóstico y las composiciones con objetivos terapéuticos descritos se refieren tanto a las FMOs anteriores como a la FMO1, FMO3, FMO4 y FMO5. En efecto, las FMOs en general intervienen en el metabolismo de los xenobióticos y trastornos a los que están asociados, tales como, por ejemplo, los xenobióticos y los trastornos ligados a la FMO citados anteriormente.
La mutación que se investiga para la invención es la mutación G.1263mac.A. (localizada en la Figura 6).
Las secuencias de ácidos nucleicos analizadas podrán ser tanto del ADN genómico, un ADNc o un ARNm.
Tal como se ha descrito anteriormente, entre los trastornos ligados a la FMO que se pueden poner en evidencia, se entienden más particularmente las patologías asociadas al metabolismo de xenobiótico tales como las citadas anteriormente, o asociadas a la función biológica de la FMO, pero pueden existir otros trastornos que se podrían ligar a una anomalía de las FMOs.
Los instrumentos de diagnóstico basados en la presente invención, aunque puedan permitir un diagnóstico positivo y diferencial en un paciente tomado de forma aislada, serán preferentemente interesantes para un diagnóstico presintomático en el sujeto de riesgo, especialmente con antecedente familiar, y también es posible prever un diagnóstico ante-natal.
Además, la prueba de una mutación específica puede permitir un diagnóstico evolutivo, principalmente en cuanto a la intensidad del trastorno o a la época de su aparición.
Los métodos que permiten poner en evidencia la mutación en un gen en relación al gen natural son, por supuesto, muy numerosos. Esencialmente se pueden dividir en dos grandes categoría, el primer tipo de método es aquel en el que la presencia de una mutación se detecta por comparación de la secuencia mutada con la secuencia correspondiente natural no mutada, y el segundo tipo en el que la presencia de la mutación se detecta de forma indirecta, por ejemplo por la puesta en evidencia de apareamientos anómalos debidos a la presencia de la mutación.
En los dos casos, se preferirán en general los métodos en los que toda o parte de la secuencia evidencia la mutación, pudiendo realizarse estos métodos de amplificación por métodos llamados PCR o similares a la PCR (PCR-like). Por similares a la PCR se entenderá la designación de cualquier método que utilice reproducciones directas o indirectas de las secuencias de ácidos nucleicos, o bien en las que los sistemas de marcado se han amplificado, estas técnicas son, por supuesto, conocidas, en general se trata de la amplificación del ADN por una polimerasa; cuando la muestra de origen es un ARN conviene previamente efectuar una transcripción inversa. Actualmente existen numerosos procedimientos que permiten esta amplificación, por ejemplo los métodos llamados NASBA "Nucleic Acid Sequence Based Amplification" (Compton 1991), TAS "Transcription Based Amplification System" (Guatelli et al., 1990), LCR "Ligase Chain Reaction" (Landegren et al., 1988), "Endo Run Amplification" (ERA), "Cycling Probe Reaction" (CPR), y SDA "Strand Displacement Amplification" (Walker et al., 1992), bien conocidos por el profesional.
La Tabla 1 presenta secuencias de iniciadores utilizables para amplificar las secuencias que interesan a la mutación G.1263mac.A.
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El reactivo utilizado para detectar y/o identificar una mutación del gen FMO en una muestra biológica comprende una sonda llamada de captura y/o una sonda llamada de detección, comprendiendo al menos una de estas sondas una secuencia según la presente invención descrita anteriormente.
Investigación de mutaciones puntuales
De forma general, se pueden aplicar o adaptar varios métodos de detección, si es necesario, después de la amplificación de secuencias de interés por PCR. A modo de ejemplos, se pueden citar:
1)
Secuenciación: comparación de las secuencias de varios individuos y/o determinación de un sitio de heterocigosis en un solo individuo.
2)
"Single nucleotide primer extensión" (Syvanen et al., 1990). Ejemplos de iniciadores utilizables para detectar la mutación G.1263mac.A. por este método figuran en la Tabla 2.
3)
RFLP "Restriction Fragment Length Polymorphism". Un ejemplo de enzima de restricción utilizable para detectar la mutación G.1263mac.A. por RFLP se presenta en la Tabla3.
4)
Investigación de "Single Strand Conformation Polymorphism" (SSCP).
5)
Métodos basados en la escisión de las regiones mal apareadas (escisión enzimática por la S1 nucleasa, escisión química por diferentes compuestos tales como la piperidina o el tetróxido de osmio, etc.).
6)
Poner en evidencia heterodúplex en electroforesis.
7)
Métodos basados en la utilización en hibridación de sondas oligonucletídicas específicas de alelos: "Allele Specific Oligonucleotide" (ASO) (Stoneking et al., 1991). Ejemplos de sondas utilizables para la detección de la mutación G.1263mac.A. por ASO figuran en la Tabla 4.
8)
Método OLA "Dual Color Oligonucleotide Ligation Assay" (Samiotaki et al, 1994).
9)
Método ARMS "Amplification Refractory Mutation System" o ASA "Allele Specific Amplication", o PASA "PCR Amplification of Specifi Allele" (Wu et al., 1989).
Esta lista no es exhaustiva, y se pueden utilizar otros métodos bien conocidos.
Investigación de modificaciones, por ejemplo de tipo deleciones
Otros métodos bien conocidos y basados en las técnicas de hibridación mediante sondas genómicas, sondas de ADNc, sondas oligonucleotídicas o de ribosondas se pueden utilizar para la investigación de este tipo de modificaciones.
Así, también forman parte de la invención los métodos de diagnóstico de una predisposición a un glaucoma juvenil ligado a la FMO2 mutada en un paciente según la invención, caracterizadas porque dicho análisis se realiza por hibridación, siendo realizada dicha hibridación preferentemente mediante al menos una sonda oligonucleotídica específica de alelo, o porque la presencia de una mutación se detecta por comparación con la secuencia correspondiente natural no mutada, o porque dicho análisis se realiza por secuenciación, o por migración electroforética, y más particularmente por SSCP o DGGE, o porque dicho análisis se realiza por una metodología dirigida a detectar un truncamiento de la proteína.
Forman parte de la invención, los métodos de diagnóstico de una predisposición a un glaucoma juvenil ligado a la FMO2 mutada en un paciente según la invención, caracterizados porque toda o parte de la secuencia nucleica del gen FMO se amplifica previamente a evidenciar la o las mutaciones, preferentemente la amplificación se realiza mediante PCR o similares a la PCR, siendo elegidos los iniciadores preferentemente para realizar la amplificación entre los iniciadores según la invención.
Los reactivos para detectar y/o identificar la mutación del gen FMO2 humano en una muestra biológica, caracterizados porque comprenden una sonda llamada de captura y/o una sonda llamada de detección, comprendiendo al menos una de estas sondas una secuencia según la invención, o un anticuerpo según la invención, también forman parte de la invención.
Métodos basados en la detección del producto del gen
La mutación del gen FMO2 humano es responsable de una modificación del producto de este gen, modificación utilizable para una aproximación diagnóstica. En efecto, las modificaciones de antigenicidad pueden permitir poner a punto anticuerpos específicos. Todas estas modificaciones se pueden utilizar en aproximación diagnóstica, gracias a varios métodos bien conocidos basados en la utilización de anticuerpos mono- o policlonales que reconozcan la proteína normal o variantes mutados, por ejemplo el método RIA o ELISA.
Finalmente, se describe aquí que también es posible diagnosticar una predisposición a trastornos ligados a la FMO, en un paciente, midiendo la actividad enzimática de la (o de las) FMO a partir de muestras biológicas de dicho paciente. La medida de esta (de estas) actividad(es), por comparación con un patrón, interno o externo, será en efecto indicativo de una predisposición a uno de los trastornos anteriormente citados.
Composiciones terapéuticas
La presente invención describe también los tratamientos terapéuticos, curativos o preventivos, de trastornos ligados a la FMO.
Se podrán utilizar los compuestos implicados directa o indirectamente en la actividad FMO, resultantes de la utilización de los modelos celulares descritos anteriormente.
En particular, se podrán utilizar los compuestos capaces de interaccionar con las FMOs, normales o variantes, como agonista o antagonista principalmente.
La presente invención describe igualmente composiciones terapéuticas que comprenden como principio activo un compuesto capaz de modular la actividad FMO, se puede tratar de compuestos de actividad pro-FMO, principalmente tales como se han descrito anteriormente, o compuestos de actividad anti-FMO.
De forma general, se entenderá por compuesto de "actividad pro-FMO" un compuesto que inducirá la actividad FMO, al contrario un compuesto anti-FMO tendrá tendencia a reducir la actividad FMO. El efecto real de estos tipos de actividades dependerá del tipo de enzima manifestado, normal o patológico.
De forma preferida, se podrán utilizar composiciones terapéuticas cuya actividad será diferente en relación con las enzimas FMOs normales y variantes.
En primer lugar es posible prever un tratamiento de sustitución, es decir composiciones terapéuticas caracterizadas porque comprenden como principio activo un compuesto de actividad pro-FMO; se podrá tratar principalmente de todo o parte de polipéptidos tales como se han descrito anteriormente, o bien de un vector de expresión de estos mismos polipéptidos, o bien incluso compuestos químicos o biológicos que tengan una actividad pro-FMO, una actividad similar a la FMO o que induzcan la producción de FMO.
También es posible utilizar composiciones terapéuticas en las que el principio activo tendrá una acción anti-FMO, en particular anti-FMO variante. En este caso se trata de un tratamiento supresor. Se podrá tratar, por ejemplo, de compuestos que interaccionan con dichas enzimas, principalmente compuestos proteicos, y en particular anticuerpos anti-FMO, principalmente cuando estos anticuerpos reconozcan las proteínas variantes. Se podrá tratar también de productos químicos que tengan una actividad anti-FMO, principalmente antagonistas de FMO variante.
Entre los numerosos compuestos farmacéuticos utilizables, hay que señalar muy particularmente, las secuencias anti-sentido que interaccionan con el gen FMO normal o mutado, o bien las secuencias sentido que actúan sobre la regulación de la expresión de estos genes, pudiendo estos productos interaccionar también en dirección 3' de los productos de expresión inducidos por las FMOs.
También es necesario mencionar los anticuerpos monoclonales que inhiben las FMOs, en particular las FMOs mutadas, y/o que inhiben los ligandos correspondientes y/o los productos inducidos por la actividad FMO, que pueden por lo tanto tener actividades pro- o anti-.
Es igualmente posible prever la expresión de proteínas o sus fragmentos in vivo, principalmente por la distorsión de la terapia génica y utilizando los vectores que han sido descritos anteriormente.
En el marco de la terapia génica, también es posible prever la utilización de las secuencias de los genes o de los ADNc anteriormente descritos "desnudos", esta técnica ha sido desarrollada principalmente por la sociedad Vical, que ha demostrado que era posible, en estas condiciones, manifestar la proteína en algunos tejidos sin recurrir al soporte de un vector viral principalmente.
Siempre en el marco de la terapia génica, también es posible prever la utilización de células transformadas ex vivo, que a continuación se podrán reimplantar, bien como están, o bien en el seno de sistemas de tipo organoide, tal como se conoce también en el estado de la técnica (Danos et al., 1993). También se puede considerar la utilización de agentes que faciliten el reconocimiento de un tipo celular determinado, la penetración en las células o el transporte hacia el núcleo.
Así, la invención describe también una composición terapéutica, caracterizada porque comprende como principio activo al menos un compuesto capaz de modular la actividad FMO, preferentemente la actividad FMO2 y/o
FMOx.
La invención describe igualmente una composición terapéutica caracterizada porque comprende como principio activo al menos un principio activo capaz de interaccionar con la FMO, preferentemente capaz de interaccionar con la FMO2 y/o la FMOx, o una composición terapéutica caracterizada porque presenta una actividad diferente sobre la FMO normal y la FMO patológica.
La presente invención comprende una composición terapéutica, caracterizada porque comprende como principio activo al menos un agonista de la FMO2 humana mutada elegido entre los siguientes compuestos:
a)
una proteína o un polipéptido según la invención,
b)
un vector de expresión según la invención,
c)
una secuencia nucleotídica según la invención, caracterizada porque dicha secuencia es una secuencia sentido que induce la expresión de dicha FMO2 mutada.
La invención se refiere además a una composición terapéutica, caracterizada porque comprende como principio activo un antagonista de la FMO2 humana mutada, elegido entre los siguientes compuestos:
a)
un anticuerpo anti-FMO según la invención,
b)
una secuencia nucleotídica según la invención, caracterizada porque dicha secuencia es una secuencia antisentido que inhibe la expresión de dicha FMO2 mutada,
c)
una secuencia nucleotídica según la invención, caracterizada porque dicha secuencia es una secuencia sentido que inhibe la expresión de dicha FMO2 mutada.
La invención también describe una composición terapéutica según la invención, caracterizada porque el principio activo es una secuencia soluble que interacciona con FMO.
La invención tiene igualmente como objetivo la utilización de un principio activo capaz de modular la actividad de la FMO2 humana mutada para realizar un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención del glaucoma juvenil, caracterizado porque dicho principio activo se elige entre los compuestos agonistas o antagonistas de las composiciones terapéuticas de la invención.
Bajo otro aspecto, la invención describe también un procedimiento de biodegradación o de biosíntesis de un compuesto orgánico o inorgánico, caracterizado porque utiliza un polipéptido o una célula según la invención.
Los polipéptidos de actividad FMO podrían en efecto ser utilizados ventajosamente para biodegradar según las reacciones de oxidación, tales como se han descrito por ejemplo por Ziegler (Ziegler et al. , 1993), los compuestos substratos de FMO, en particular los compuestos tal como se han citado en la presente descripción, o ser utilizados para la biosíntesis del compuesto de interés a partir de dichos compuestos substratos de FOM, principalmente para la biosíntesis de un medicamento, aditivo alimentario, pesticida o herbicida.
Se citan aquí procedimientos de elaboración del compuesto de interés, caracterizados porque utilizan un polipéptido o una célula según la invención. Los polipéptidos o células según la invención, podrían en efecto utilizarse ventajosamente in vitro para determinar la metabolización potencial del compuesto de interés y para analizar los metabolitos eventualmente obtenidos, su toxicidad y/o su actividad. Los resultados obtenidos permitirán confirmar el compuesto o reformularlo de forma que resulte o no un substrato de FMO, o de forma que los metabolitos formados sean diferentes.
Finalmente, la invención describe aquí la utilización de un polipéptido o de una célula según la invención para la detoxificación de un compuesto xenobiótico, substrato de FMO. Estos compuestos xenobióticos pueden estar presentes en el medioambiente, tales como pesticidas o herbicidas, presentes naturalmente en las plantas como ciertos alcaloides, o pueden corresponder a compuestos farmacéuticos.
Otras características y ventajas de la presente invención aparecerán con la lectura de los ejemplos que siguen, realizada refiriéndose a los siguientes dibujos anexos:
- Figura 1: Secuencia polipeptídica correspondiente a la secuencia SEQ ID Nº 3 anteriormente mencionada de hFMO2, homologa humana de la FMO2 de macaco.
- Figura 2: Secuencia nucleotídica correspondiente parcialmente a la secuencia SEQ ID Nº 1 del gen que codifica para la hFMO2, homologa humana de la FMO2 de macaco.
En vista de las homologías de los ARN mensajeros conocidos de genes de la familia de las mono-oxigenasas de flavina, estos genes comparten la misma estructura exón/intrón:
exón 1: no traducido, variable en tamaño y en secuencia,
exón 2: principio de la región que codifica, código para los aminoácidos 1-44,
exón 3: aminoácidos 45-107,
exón 4: aminoácidos 108-161,
exón 5: aminoácidos 162-209,
exón 6: aminoácidos 210-275,
exón 7: aminoácidos 276-394,
exón 8: aminoácidos 395-419,
exón 9: aminoácidos 420-535, fin del codificador y región no traducida 3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Los intrones son variables en tamaño y en complejidad.
Se han aislado en primer lugar la secuencia de tres fragmentos del BAC 123H04M que contienen la totalidad de los exones de este homólogo.
Fragmento 1: que contiene los exones 1 y 2,
Fragmento 2: que contiene el exón 3,
Fragmento 3: que contiene los exones 4 a 9.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se han completado las secuencias de dos intrones.
- Figura 3:
Figura 3A: Descripción de la estructura exón/intrón del gen que codifica para hFMO2, homóloga humana de la FMO2 de macaco.
Se indican las posiciones de los comienzos y finales de exones en las secuencias nucleotídicas SEQ ID Nº 1 y Nº 2.
Figura 3B: Descripción de la estructura exón/intrón del gen que codifica para hFMOx.
Se indican las posiciones de dichos comienzos y finales de los exones en las secuencias nucleotídicas SEQ ID Nº 4 y Nº 5.
- Figura 4: Homología entre el gen FMO2 de macaco y su homólogo humano tal como el representado en la figura 2.
La región 5' no traducida diverge ligeramente de la secuencia de macaco tal como se ha presentado en la figura 2.
- Figura 5: Determinación de las posiciones variantes de la secuencia del ARNm de hFMO2 humana en relación a la secuencia homóloga de macaco; influencia de las variaciones en la secuencia proteica.
- Figura 6: Homologías entre las secuencias de ARNm de la FMO2 de macaco y de su homólogo humano.
La posición de la mutación G.1263mac.A está señalada por una flecha vertical.
- Figura 7: Homologías entre las secuencias peptídicas de la FMO2 de macaco y de su homólogo humano.
- Figura 8: Análisis de la segregación del polimorfismo G.1263mac.A en la familia estudiada.
El ADN genómico de los individuos 3, 4 y 7 a 14 se ha amplificado por PCR, y la secuencia de los fragmentos obtenidos se ha analizado para detectar sitios de heterocigosis que se segregan con la enfermedad.
Los símbolos llenos indican los individuos afectados por GPAO juvenil. Los símbolos tachados indican individuos no genotipados. Los individuos 11 y 12 son gemelos.
G/G = homocigotos para la base en posición homóloga de la posición 1263 del ARNm de la FMO2 de macaco.
G/A = heterocigotos para la base en posición homóloga de la posición 1263 del ARNm de la FMO2 de macaco.
- Figura 9: Localización cromosómica del BAC123H04M por hibridación in situ fluorescente.
(A) Se observa una señal específica en los dos cromosomas 1. En la foto (8) se representa solo uno de los dos cromosomas 1. En (C), solo se observan las bandas R de este cromosoma, demostrando que la señal de la sonda 123H04M se localiza en la banda lq23.
- Figura 10: Secuencia nucleotídica correspondiente parcialmente a la secuencia SEQ ID Nº 4 del gen que codifica para la isoforma hFMOx humana.
Este gen presenta una tasa de homología del 75% en ADN y del 70% en aminoácidos con los ARNs mensajeros de mono-oxigenasas de flavina presentes en el BAC 123H04M.
En esta figura preliminar se presenta en cuatro fragmentos:
fragmento 1: código para el exón 2 (primer exón código),
fragmento 2: exón 3,
fragmento 3: exones 4 a 8,
fragmento 4: exón 9.
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Ejemplos Aislamiento del BAC 123H04M
Para identificar un gen que codifica para una nueva FMO, se ha aislado un BAC ("Bacterial Artificial Chromosome") correspondiente a la región candidata anteriormente localizada en el cromosoma 1. Se ha preparado un banco de BACs que cubre el genoma humano completo a partir del ADN de una línea linfoblástica humana derivada del individuo nº 8445 de las familias del CEPH. Esta línea se ha utilizado como fuente de ADN de alto peso molecular. El ADN ha sido digerido parcialmente por la enzima de restricción BamH1, y luego se ha clonado en el sitio BamH1 del plásmido pBeloBacII. Los clones así obtenidos han sido mezclados ("pool") y seleccionados según un procedimiento de análisis tridimensional anteriormente descrito para la selección de los bancos de YACs ("Yeast Artificial Chromosome") (Chumakov et al., 1992). Las mezclas tridimensionales obtenidas han sido seleccionadas por PCR mediante iniciadores que incorporan el marcador D1S3423(WI-10286). Este STS ("Sequence Tagged Site") había sido localizado anteriormente en la región candidata. Se ha asilado así un clon del BAC 123H04M.
Después de la digestión por la enzima de restricción NotI, el tamaño del inserto contenido en este BAC se ha determinado en un gel de agarosa 0,8% después de migración por electroforesis en campo alterno (CHEF) (4 horas a 9 volts/cm, con un ángulo de 100º, a 11ºC en tampón 0,5xTAE). Así se ha demostrado que el BAC 123H04M contiene un inserto de 180 kb.
Localización cromosómica del BAC 123H04M por hibridación in situ fluorescente (FISH)
La localización cromosómica del BAC en la región candidata lq23-q25 se ha confirmado por hibridación in situ fluorescente (FISH) en cromosomas metafásicos, según el método descrito por Cherif et al., 1990. El BAC 123H04M ha sido localizado más precisamente en la banda lq23 del cromosoma 1 (Figura 9).
Secuenciación del inserto del BAC 123H04M
Para secuenciar el inserto del BAC 123H04M, se han preparado tres bancos diferentes de sub-clones a partir del ADN sometido a ultrasonidos de este BAC.
Después de incubación durante una noche, las células resultantes de tres litros de cultivo se tratan mediante lisis alcalina según técnicas clásicas. Después de centrifugación del producto en un gradiente de cloruro de cesio, se purifican 52 \mug de ADN del BAC 123H04M. 7 \mug de ADN se han sometido a ultrasonidos en tres condiciones diferentes, para obtener fragmentos cuyos tamaños se distribuyen de forma uniforme de 1 a 9 kb. Los fragmentos obtenidos se han tratado en un volumen de 50 \mul con 2 unidades de Polimerasa Vent durante 20 minutos a 70ºC, en presencia de 4 deoxitrifosfatos (100 \muM). Los fragmentos en los extremos libres que resultan de esta etapa se han separado por electroforesis en gel 1% de agarosa de bajo punto de fusión (60 voltios durante 3 horas). Los fragmentos agrupados según sus tamaños se han extirpado y las bandas obtenidas se han tratado con agarosa. Después de la extracción con cloroformo y diálisis en columnas Microcon 100, el ADN en disolución se ha ajustado a una concentración de 100 ng/\mul. Se ha efectuado un ligamiento, una noche de incubación, poniendo en presencia 100 ng del ADN fragmentado del BAC 123H04M y 20 ng de ADN del vector linearizado por digestión enzimática, y tratado con fosfatasa alcalina. Esta reacción se ha realizado en un volumen final de 10 \mul en presencia de 40 unidades/\mul de T4 ADN ligasa (Epicentro). Los productos de ligamiento sirvieron a continuación para transformar mediante electroporación, bien una cepa XL-Blue (para los plásmidos multicopias), o bien una cepa D10HB (para los sub-clones resultantes del BAC). Los clones lacZ^{-} y resistentes al antibiótico se han transplantado individualmente en microplacas para almacenamiento y secuenciación.
Así se han obtenido:
-
864 sub-clones resultantes de la inserción de fragmentos de 2 a 3 kb en el sitio SmaI del plásmido puc18;
-
1728 sub-clones que corresponden a la inserción de fragmentos de 1,5 a 2 kb en el sitio BamHI (que se convierte en libre) del plásmido BluescriptSK;
-
288 sub-clones que contienen fragmentos de 4 a 7 kb insertados en el sitio PmlI de un vector BAC modificado.
Las inserciones de estos sub-clones se han amplificado por PCR en cultivos bacterianos incubados una noche utilizando los iniciadores de los vectores que flanquean las inserciones. La secuencia de los extremos de estas inserciones (en promedio 500 bases de cada lado) se ha determinado por secuenciación automática fluorescente en secuenciador ABI 377, equipado con un programa ABI Prism DNA Sequencing Analysis (versión 2.1.2).
Los fragmentos de secuencia que provienen de las sub-BACs se han recogido en el programa Gap4 de R. Staden (Bonfield et al., 1995). Este programa permite la reconstrucción de una secuencia completa a partir de fragmentos de secuencias. La secuencia de dicho alineamiento de los diferentes fragmentos es la secuencia consenso.
Finalmente, se han utilizado técnicas de secuenciación dirigida (movimiento sistemático del iniciador) para completar las secuencias y enlazar los contiguos.
Análisis de las secuencias
Los exones potenciales del BAC 123H04M se han detectado por investigación de homología en los bancos públicos de proteínas, de ácidos nucleicos y de EST (Expressed Sequence Tags).
Bancos de datos
Se han utilizado refusiones locales de los principales bancos públicos. El banco de proteínas utilizado está constituido por la fusión no redundante de los bancos Genpept (traducción automática de GenBank, NCBI; Benson et al., 1996); Swissprot, (George et al., 1996); y PIR/NBRF (Bairoch et al., 1996). Las repeticiones han sido eliminadas por el programa "nrdb" (dominio público, NCBI; Benson et al., 1996). Las repeticiones internas se han ocultado a continuación por el programa "xnu" (dominio público, NCBI; Benson et al., 1996). El banco resultante, llamado NRPU (No-Redundante-Proteína-Única) ha servido de referencia para las investigaciones de las homologías proteicas. Las homologías encontradas con este banco han permitido localizar regiones que codifican potencialmente para un fragmento de proteína al menos emparentado con una proteína conocida (exones códigos). El banco de EST utilizado está compuesto por sub-secciones "gbest" (1-9) de Genbank (NCBI; Benson et al., 1996). Contiene fragmentos de tránscritos públicos.
Las homologías encontradas con este banco han permitido localizar regiones potencialmente transcritas (presentes en el ARN mensajero).
El banco de ácidos nucleicos (diferentes a los EST) utilizado contiene cualquier otra sub-sección de Genbank y de EMBL (Rodriguez-Tome et al.,1996) cuyas repeticiones se han eliminado como antes.
Programas
Se ha utilizado el conjunto del programa BLAS (dominio público, Altschul et al., 1990) de investigación de homologías entre una secuencia y bancos de datos proteicos o nucleicos. Los umbrales de significación dependen de la longitud y la complejidad de la región ensayada así como del tamaño del banco de referencia. Se han ajustado y adaptado a cada análisis.
Identificación de polimorfismos genéticos asociados a la FMO en relación a un polimorfismo fenotípico asociado a la aparición del glaucoma juvenil GPAO-J, enfermedad de transmisión autosomal dominante (locus GLC1a) Detección de Polimorfismos/Mutaciones 1) Extracción del ADN
El ADN se extrae de la sangre venosa periférica después de lisis celular, digestión proteica, partición orgánica y finalmente precipitación alcohólica.
La sangre (20 ml) se extrae por punción venosa periférica en un tubo que contiene EDTA.
Se diluye con un volumen de agua bidestilada. Después de 10 minutos, las células se recogen por centrifugación a 1.600 g durante 10 minutos. Esta manipulación se repite.
Las células blancas son lisadas en presencia de 20 ml de tampón CLB (Tris 10 mM pH 7.6, 5 mM MgCl_{2}, sacarosa 0,32 M, Triton X-100 1% (v/v). Los núcleos se recogen por centrifugación a 1.600 g durante 10 minutos. Esta manipulación se repite.
Los núcleos se lavan una vez en el tampón RSB (Tris 10 mM pH 8, NaCl 10 mM, EDTA 10 mM). El precipitado se vuelve a poner en suspensión en 2 ml de tampón RSB al que se ha añadido lauril sulfato de sodio (1%) y la proteinasa K (200 mg/ml). La mezcla se incuba a 55ºC durante al menos 3 horas y regularmente agitado.
La disolución de ADN así obtenida se extrae a continuación con un volumen de fenol equilibrado con un tampón 50 mM Tris pH 8. Esta operación se repite y completa mediante una extracción con un volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1 v/v).
El ADN se precipita con un volumen de isopropanol, se lava con etanol (70%), se seca y finalmente se vuelve a suspender en 1 ml de tampón TE (Tris 10 mM pH 8, EDTA 0,5 mM). La concentración de ADN se evalúa midiendo la absorbancia a 260 nm utilizando la equivalencia de 50 \mug/ml de ADN por una unidad de absorbancia. La concentración de ADN se ajusta entonces a 200 \mug/ml.
2) Amplificación del ADN genómico
Los iniciadores oligonucleotídicos utilizados para la amplificación genómica de las secuencias exónicas derivadas del BAC 123H04M, tal como se han mencionado anteriormente para análisis informático, se han definido mediante un programa OSP (Hillier et al., 1991).
Todos estos iniciadores contienen, en dirección 5' de las bases específicamente dirigidas por la amplificación, una cola oligonucleotídica común, destinada a permitir la secuenciación de los fragmentos amplificados (PU para los iniciadores en dirección 5' y RP para los iniciadores en dirección 3'; secuencias expuestas en la Tabla 5).
Los iniciadores oligonucleotídicos se han sintetizado según el método de las fosforamiditas, en un sintetizador GENSET UFPS 24.1.
La amplificación de cada secuencia exónica anteriormente mencionada se ha realizado mediante reacción de amplificación en cadena por polimerasa (PCR), en las siguientes condiciones:
Volumen final 50 \mul
ADN genómico 100 ng
MgCl_{2} 2 mM
dNTP (para cada uno) 200 \muM
Iniciador (para cada una) 7,5 pmoles
AmpliTaq Gold DNA polimerasa (Perkin) 1 unidad
*Tampón de PCR 1 X
*: (10X = Tris HCl 0,1M pH 8,3, KCl 0,5M)
La amplificación se realiza en un termociclador Perkin Elmer 9600 o MJ Research PTC200 con tapa calentadora. Después de calentamiento a 94ºC durante 10 minutos, se efectúan 35 ciclos. Cada ciclo comprende: 30 segundos a 94ºC, 1 minuto a 55ºC y 30 segundos a 72ºC. Un segmento final de elongación de 7 minutos a 72ºC termina la amplificación.
La cantidad de productos de amplificación obtenida se determina en microplaca de 96 pozos, mediante fluorimetría, utilizando el agente intercalante Picogreen (Molecular Probes).
3) Detección de los polimorfismos/mutaciones - Secuencia
Los productos de la amplificación genómica mediante PCR se han secuenciado en un secuenciador automático ABI 377, utilizando iniciadores fluorescentes marcados por los fluorocromos ABI (Joe, Fam, Rox y Tamra) y la ADN polimerasa Thermosequanase (Amersham).
Las reacciones se han realizado en microplacas de 96 pozos, en termociclador Perkin Elmer 9600, en las condiciones clásicas de ciclos de temperatura:
-
8 ciclos: desnaturalización: 5 seg. a 94ºC; hibridación: 10 sg.; elongación: 30 seg. a 72ºC, luego
-
13 ciclos: desnaturalización: 5 seg. a 94ºC; elongación: 30 seg. a 72ºC.
Se han utilizado 6 unidades de Thermosequanase, y 5-25 ng de producto de amplificación mediante reacción de secuencia.
Después de los ciclos de amplificación, los productos de las reacciones de secuencia se precipitan en etanol, se vuelven a poner en suspensión en un tampón de carga que contiene formamida, se desnaturalizan, y se depositan en geles de acrilamida 4%; las electroforesis (2 horas 30 a 3.000 Voltios) se realizan en secuenciadores ABI 377 equipados con programas informáticos ABI de colección y de análisis (ABI Prism DNA Sequencing Analysis Software, versión 2.1.2.).
- Análisis de las secuencias
Siendo el GPAO-J una enfermedad dominante, los datos de secuencia obtenidos se han analizado para detectar la presencia de sitios de heterocigosis entre los pacientes que padecen glaucoma juvenil. Los sitios de heterocigosis se han confirmado después de comparar secuencias de dos hebras de ADN genómico de cada individuo afectado. Un sitio de heterocigosis se retiene como mutación candidata responsable de la aparición de trastornos ligados a la FMO si está presente en la población de miembros de una misma familia, mientras está ausente en general en los controles no emparentados con la familia.
- Resultados
Entre todos los fragmentos de amplificación derivados del BAC 123H04M estudiados, uno entre ellos presenta un sitio de heterocigosis que se segrega con la aparición del glaucoma juvenil en una genealogía representada en la Figura 8.
Este sitio de heterocigosis (G/A) está presente en 7 pacientes afectados de GPAO-J mientras que está ausente de 3 pacientes sanos homocigotos (G/G), todos procedentes de la misma familia. Además, 99 controles no emparentados son asimismo homocigotos (G/G) para este sitio, indicando que la frecuencia de alelo A en la población general es inferior a 0,005.
El sitio está contenido en el exón 8 del gen que codifica para la proteína hFMO2 según la invención; la mutación descrita transforma el ácido glutámico en posición 402 de la secuencia SEQ ID Nº1 de la hFMO2 en lisina (Figura 1).
Es sorprendente observar que el cálculo de los resultados lod que integran los datos anteriores para diferentes hipótesis de frecuencias de cada alelo en la población general, indica una probabilidad superior a 100 contra 1 de que la heterocigosis (G/A) descrita esté ligada al GPAO-J (Tabla 6). Esta probabilidad es significativa debido a que el análisis se refiere a una sola familia.
Los iniciadores que han permitido la amplificación del fragmento de ADN que contiene este sitio de heterocigosis se describen en la Tabla 1.
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TABLA 1 Secuencias de los iniciadores utilizados para amplificar la región exónica derivada del BAC 123H04M y que contiene un sitio de heterocigosis ligado al GPAO juvenil 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
Locus del fragmento: FMO2/Exón 8
\quad
Tamaño del fragmento amplificado: 420
\quad
Iniciadores:
\hskip1.5cm En dirección 5':
\hskip1.5cm PU (SEQ ID Nº 7): 5'TCACATAGAGTGCTATGGGGG
\hskip1.5cm En dirección 3':
\hskip1.5cm RP (SEQ ID Nº 8): 5'CTTAGGAA GAAGATAAAAATGCAAC
TABLA 2 Ejemplos de iniciadores para detectar la mutación G.1263mac.A mediante "Single Nucleotide Primer Extensión"
a) SEQ ID Nº 9: 5' AATGTCCATCATCATAGTTCTCT 3' (antisentido)
y/o
b) SEQ ID Nº 10: 5' TAGGCTTGTAGCCTGCCCTCA 3' (sentido) 
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\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 Identificación de la mutación G.1263mac.A mediante RFLP
1 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 Ejemplo de sondas para la detección de la mutación G.1263mac.A por la técnica ASO 
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5 Secuencia de los iniciadores utilizados para la secuencia de los fragmentos de amplificación a partir de ADN genómico
\quad
PU 5' TGTAAAACGACGGCCAGT
\quad
RP 5' CAGGAAACAGCTATGACC
TABLA 6 Resultados lod entre el polimorfismo G.1263mac.A y el GPAO juvenil en la familia estudiada en función de la frecuencia de dos alelos en la población general
3
Lista de secuencias
SEQ ID Nº 1
SEQ ID Nº 2
SEQ ID Nº 3
SEQ ID Nº 4
SEQ ID Nº 5
SEQ ID Nº 6
SEQ ID Nº 7
SEQ ID Nº 8
SEQ ID Nº 9
SEQ ID Nº 10
SEQ ID Nº 11
SEQ ID Nº 12
SEQ ID Nº 13
SEQ ID Nº 14
\vskip1.000000\baselineskip
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(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
DEPOSITARIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: GENET
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 24 RUE ROYALE
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: PARÍS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CÓDIGO POSTAL: 75008
\vskip0.800000\baselineskip
ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SECUENCIA NUCLEOTÍDICA QUE CODIFICA PARA UNA FLAVINA MONOOXIGENASA, PROTEÍNA CORRESPONDIENTE Y SUS APLICACIONES EN EL CAMPO DEL DIAGNÓSTICO Y TERAPÉUTICA.
\vskip0.800000\baselineskip
iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
iv)
FORMA DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: DISQUETE
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC COMPATIBLE
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release #1.0 Versión #1,30 (OEB)
\vskip0.800000\baselineskip
vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
NÚMERO DE SOLICITUD: FR 9615032
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-AGOSTO-1996
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ. ID. NO. 1
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26.016 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº 1
\vskip1.000000\baselineskip
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ. ID. NO. 2:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1731 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ. ID. Nº 2
21 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ. ID. NO. 3:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 535 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ. ID. Nº 3
\vskip1.000000\baselineskip
23
24
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ. ID. NO.4:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25464 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ. ID. Nº 4
\vskip1.000000\baselineskip
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ. ID. NO. 5:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
LONGITUD: 1.605 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
NÚMERO DE HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ. ID. Nº 5
\vskip1.000000\baselineskip
43
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ. ID. NO. 6:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 532 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ. ID. Nº 6
45
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ. ID. NO. 7:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
ii)
TIPO DE MOLÉCULA: distinta de ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ. ID. Nº 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCACATAGAG TGCTATGGGG G 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ. ID. NO. 8:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
ii)
TIPO DE MOLÉCULA: distinta de ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ. ID. Nº 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTAGGAAGA AGATAAAAAT GCAAC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ. ID. NO. 9:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
ii)
TIPO DE MOLÉCULA: distinta de ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ. ID. Nº 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATGTCCATC ATCATAGTTC TCT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ. ID. NO. 10:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
ii)
TIPO DE MOLÉCULA: distinta de ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ. ID. Nº 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGGCTTGTG TAGCCTGCCC TCA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ. ID. NO. 11:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
ii)
TIPO DE MOLÉCULA: distinta de ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ. ID. Nº 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTCAGAGAG AACTAT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ. ID. NO. 12:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
ii)
TIPO DE MOLÉCULA: distinta de ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ. ID. Nº 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAGTCTCTC TTGATA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ. ID. NO. 13:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
ii)
TIPO DE MOLÉCULA: distinta de ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ. ID. Nº 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTCAAAGAG AACTAT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ. ID. NO. 14:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
ii)
TIPO DE MOLÉCULA: distinta de ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ. ID. Nº 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAGTTTCTC TTGATA 
\hfill

Claims (40)

1. Secuencia nucleotídica aislada, caracterizada porque codifica para la variante de la proteína FMO2 humana de secuencia SEQ ID Nº 3 que presenta un resto lisina en lugar de un resto ácido glutámico en posición 402 de la secuencia SEQ ID Nº 3.
2. Secuencia nucleotídica aislada según la reivindicación 1, caracterizada porque codifica para la variante de la proteína FMO2 humana de secuencia SEQ ID Nº 3 que presenta un resto lisina en lugar de un resto ácido glutámico en posición 402 de la secuencia SEQ ID Nº 3 y que comprende una secuencia elegida entre:
a)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 2001 al nucleótido en posición 2056 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
b)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 2405 al nucleótido en posición 2542 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
c)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 10026 al nucleótido en posición 10214 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
d)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 13341 al nucleótido en posición 13503 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
e)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 16036 al nucleótido en posición 16178 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
f)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 20558 al nucleótido en posición 20757 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
g)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 21972 al nucleótido en posición 22327 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
h)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 24411 al nucleótido en posición 24483 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1 en la que el nucleótido en posición 24431 de la secuencia SEQ ID Nº 1 es una adenosina en lugar de una guanina,
i)
la secuencia nucleotídica que va del nucleótido en posición 25487 al nucleótido en posición 25899 de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1,
j)
la secuencia nucleica SEQ ID Nº 1 en la que nucleótido en posición 24431 es una adenosina en lugar de una guanina, y
k)
la secuencia nucleica SEQ ID Nº 2 en la que el nucleótido en posición 1266 es una adenosina en lugar de una guanina.
3. Secuencia nucleotídica aislada, caracterizada porque se elige entre las secuencias que codifican para un polipéptido que comprende el polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 3 que presenta un resto lisina en lugar de un resto ácido glutámico en posición 402 o complementario de una secuencia según la reivindicación 1 ó 2.
4. Iniciador nucleico, caracterizado porque su secuencia se elige entre las secuencias SEQ ID Nº 7, SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 9 y SEQ ID Nº 10.
5. Sonda nucleica, caracterizada porque su secuencia se elige entre las secuencias SEQ ID Nº 11, SEQ ID Nº 12, SEQ ID Nº 13 y SEQ ID Nº 14.
6. Polipéptido codificado por una secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 1 a 3.
7. Polipéptido según la reivindicación 6 de secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 3 que presenta un resto lisina en lugar de un resto ácido glutámico en posición 402.
8. Vector de clonación y/o de expresión en una célula huésped apropiada de una secuencia nucleotídica, caracterizado porque comprende una secuencia según una de las reivindicaciones 1 a 3.
9. Vector según la reivindicación 8, caracterizado porque comprende los elementos que permiten la expresión y/o secreción de dichas secuencias en dicha célula huésped.
10. Vector según una de las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizado porque se trata de un vector de replicación autónoma.
11. Vector según una de las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizado porque se trata de un vector de integración cromosómico.
12. Vector según una de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque se trata de un vector viral.
13. Vector según la reivindicación 12, caracterizado porque el vector se realiza sobre la base de un adenovirus, de un AAV, de un retrovirus, de un poxvirus o de un virus herpético.
14. Célula transformada por un vector según una de las reivindicaciones 8 a 13.
15. Célula según la reivindicación 14, caracterizada porque se trata de una célula procariota.
16. Célula según la reivindicación 14, caracterizada porque se trata de una célula eucariota.
17. Animal no humano, caracterizado porque contiene una célula según una de las reivindicaciones 14 a 16.
18. Procedimiento de producción de un polipéptido según las reivindicaciones 6 y 7 recombinante, caracterizado porque se cultiva una célula según una de las reivindicaciones 14 a 16 y porque se recupera la proteína producida.
19. Anticuerpos anti-FMO2 mutada humana policonales o monoclonales específicamente dirigidos contra un polipéptido según una de las reivindicaciones 6 ó 7 que comprende la mutación lisina en posición 402 de la secuencia SEQ ID Nº 3.
20. Anticuerpos policlonales o monoclonales según la reivindicación 19, caracterizados porque se obtienen por reacción inmunológica de un organismo humano o animal con un agente inmunógeno constituido por un polipéptido según una de las reivindicaciones 6 ó 7 que comprende la mutación lisina en posición 402 de la secuencia SEQ ID
Nº 3.
21. Anticuerpos según una de las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizados porque se trata de anticuerpos marcados.
22. Utilización de un anticuerpo según la reivindicación 21, para la preparación de una composición destinada al análisis por imagen.
23. Utilización de células según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 o de un animal según la reivindicación 17 para la selección in vitro de productos implicados directa o indirectamente en la actividad de la FMO2 mutada.
24. Utilización de células según una de las reivindicaciones 14 a 16 o de un animal según la reivindicación 17 para selección in vitro de productos que interaccionan con la FMO2 mutada.
25. Método de diagnóstico de una predisposición al glaucoma juvenil en un paciente, caracterizado porque se determina a partir de una muestra biológica de dicho paciente la presencia de la mutación G24431A en el gen FMO2 por análisis de toda o parte de una secuencia nucleica correspondiente a dicho gen, siendo la presencia de al menos dicha mutación indicativa de una predisposición de dicho paciente al glaucoma juvenil.
26. Método según la reivindicación 25, en el que la secuencia de ácido nucleico analizada es un ADN genómico, un ADNc o un ARNm.
27. Método según una de las reivindicaciones 25 ó 26, caracterizado porque dicho análisis se realiza por hibridación.
28. Método según una de las reivindicaciones 25 a 27, caracterizado porque la presencia de una mutación se detecta por comparación con la secuencia correspondiente natural no mutada.
29. Método según la reivindicación 27, caracterizado porque dicha hibridación se realiza mediante al menos una sonda oligonucleotídica específica del alelo.
30. Método según una de las reivindicaciones 25 ó 26, caracterizado porque dicho análisis se realiza por secuenciación.
31. Método según una de las reivindicaciones 25 ó 26, caracterizado porque dicho análisis se realiza por migración electroforética, y más específicamente por SSCP o DGGE.
32. Método según una de las reivindicaciones 25 a 31, caracterizado porque toda o parte de la secuencia nucleica del gen FMO2 mutada se amplifica previamente a la demostración de la mutación.
33. Método según la reivindicación 32, caracterizado porque la amplificación se realiza por PCR o por un método elegido entre el método NASBA (Nucleic Acid Sequence based Amplification), TAS (Transcription based Amplification System), LCR (Ligase Chain Reaction), ERA (Endo Run Amplification), CPR (Cycling Probe Reaction) y SDA (Strand Displacement Amplification).
34. Método según una de las reivindicaciones 32 ó 33, caracterizado porque los iniciadores elegidos para realizar la amplificación se eligen entre los iniciadores definidos según la reivindicación 4.
35. Reactivo para detectar y/o identificar la mutación G24431A de la secuencia SEQ ID Nº 1 del gen FMO2 humano en una muestra biológica, caracterizado porque comprende una sonda denominada de captura y/o una sonda denominada de detección, comprendiendo al menos una de estas sondas una secuencia según la reivindicación 5, o porque comprende un anticuerpo según una de las reivindicaciones 19 a 21.
36. Método de diagnóstico de una predisposición al glaucoma juvenil en un paciente, caracterizado porque se determina a partir de una muestra biológica de dicho paciente la presencia de la FMO2 mutada correspondiente a la mutación G24431A de la secuencia SEQ ID Nº 1 del gen FMO2 por medio de un anticuerpo mono- o policlonal según una de las reivindicaciones 19 a 21.
37. Métodosegún la reivindicación 36, caracterizado porque la detección se efectúa mediante un procedimiento ELISA o RIA.
38. Composición terapéutica caracterizada porque comprende como principio activo al menos un agonista de la FMO2 humana mutada correspondiente a la mutación G24431A de la secuencia SEQ ID Nº 1, eligiéndose dicho agonista entre los siguientes compuestos:
a)
un polipéptido según la reivindicación 6 ó 7,
b)
un vector de expresión según una de las reivindicaciones 8 a 13,
c)
una secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicha secuencia es una secuencia sentido que induce la expresión de dicha FMO2 mutada.
39. Composición terapéutica, caracterizada porque comprende como principio activo un antagonista de la FMO2 humana mutada correspondiente a la mutación G24431A de la secuencia SEQ ID Nº 1, eligiéndose dicho antagonista entre los siguientes compuestos:
a)
un anticuerpo anti-FMO2 mutada, según una de las reivindicaciones 19 a 22,
b)
una secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicha secuencia es una secuencia antisentido que inhibe la expresión de dicha FMO2 mutada,
c)
una secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicha secuencia es una secuencia sentido que inhibe la expresión de dicha FMO2 mutada.
40. Utilización de un principio activo capaz de modular la actividad de la FMO2 humana mutada correspondiente a la mutación G24431A de la secuencia SEQ ID Nº 1, para realizar un medicamento destinado al tratamiento y/o a la prevención del glaucoma juvenil, caracterizada porque dicho principio activo se elige entre un agonista o un antagonista tal como se han definido en las reivindicaciones 38 y 39.
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